ES2627529T3 - Composiciones para tratamiento de glioblastoma - Google Patents

Abstract

Una partícula vírica aislada para su uso en el tratamiento de un cáncer cerebral, teniendo la partícula vírica un genoma que comprende fases abiertas de lectura que codifican: una proteína que tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 3, o una secuencia variante que es al menos 75 % idéntica a SEQ ID NO: 3; una proteína que tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 4, o una secuencia variante que es al menos 75 % idéntica a SEQ ID NO: 4; una proteína que tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 5, o una secuencia variante que es al menos 75 % idéntica a SEQ ID NO: 5; una proteína que tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 6, o una secuencia variante que es al menos 75 % idéntica a SEQ ID NO: 6; y una proteína que tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 7, o una secuencia variante que es al menos 75 % idéntica a SEQ ID NO: 7.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

15

25

35

45

55

65

SEQ ID NO: 12, o una variante conservativa de la misma; y promotores de las mismas.

La variante conservativa de una secuencia de nucleótidos puede ser una secuencia que es al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a la secuencia de referencia de nucleótidos. La variante conservativa puede ser una secuencia que comprende una o más sustituciones silenciosas.

Una partícula vírica aislada de acuerdo con la presente divulgación puede usarse para el tratamiento de cáncer. El cáncer puede ser un cáncer cerebral. El cáncer cerebral puede ser un glioblastoma. La partícula vírica aislada puede usarse para el tratamiento de cáncer infectando una célula con el virus y la célula infectada puede usarse para suministrar el virus a un paciente. Se analizan técnicas para infectar una célula con un virus y usar la célula infectada para suministrar el virus, por ejemplo en: Power AT, et al. Carrier cell-based delivery of an oncolytic virus circumvents antiviral immunity. Mol Ther. ene 2007; 15(1):123-30; y Tyler MA, et al. Neural stem cells target intracranial glioma to deliver an oncolytic adenovirus in vivo. Gene Ther. feb 2009; 16(2); 262-78.

Una partícula vírica aislada de acuerdo con la presente divulgación puede usarse para inducir una respuesta inmunogénicas en una persona a la que se administra el virus. La respuesta inmunogénicas puede ser una respuesta antineoplásica. La partícula vírica aislada puede usarse para inducir una respuesta inmunogénica infectando una célula con el virus y la célula infectada puede usarse para suministrar el virus a la persona.

La partícula vírica aislada puede formularse para suministro directo al sistema nervioso central, fuera de la barrera hematoencefálica, dentro de la barrera hematoencefálica o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo la partícula vírica aislada puede formularse para administración mediante inyección intratecal, intravenosa o intracraneal.

Una partícula vírica aislada de acuerdo con la presente divulgación puede usarse en un método para tratamiento del cáncer, en el que el método incluye administrar una partícula vírica aislada de acuerdo con la presente divulgación a un paciente que tenga cáncer. El cáncer puede ser un cáncer cerebral. El cáncer cerebral puede ser un glioblastoma. La partícula vírica aislada puede administrarse al paciente directamente al sistema nervioso central, fuera de la barrera hematoencefálica, dentro de la barrera hematoencefálica o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, la partícula vírica aislada puede administrarse por vía intratecal, por vía intravenosa o mediante inyección intracraneal. La partícula vírica aislada puede administrarse directamente al paciente o puede administrarse al paciente infectando una célula con el virus y administrando la célula infectada al paciente.

Una partícula vírica aislada de acuerdo con la presente divulgación puede usarse en un método para inducir una respuesta inmunogénica en un paciente, en el que el método incluye administrar una partícula vírica aislada de acuerdo con la presente divulgación al paciente. La partícula vírica aislada puede administrarse al paciente directamente al sistema nervioso central, fuera de la barrera hematoencefálica, dentro de la barrera hematoencefálica o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, la partícula vírica aislada puede administrarse por vía intratecal, por vía intravenosa o mediante inyección intracraneal.

Una partícula vírica aislada de acuerdo con la presente divulgación puede incluirse en un kit para el tratamiento de cáncer en un paciente, incluyendo el kit: la partícula vírica aislada de acuerdo con la presente divulgación; e instrucciones para administración de la partícula vírica aislada al paciente. El cáncer puede ser un cáncer cerebral. El cáncer cerebral puede ser un glioblastoma. La partícula vírica aislada puede formularse para suministro directo al sistema nervioso central, fuera de la barrera hematoencefálica, dentro de la barrera hematoencefálica, o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo la partícula vírica aislada puede formularse para administración mediante inyección intratecal, intravenosa o intracraneal.

Un ejemplo de un rhabdovirus que se ha determinado que es eficaz en la destrucción de líneas celulares tumorales del SNC conservando al mismo tiempo la atenuación en astrocitos humanos normales y neuronas postmitóticas fue el rhabdovirus de Farmington (FMT). Véase Ejemplo 1 y Figura 1 para un análisis de los componentes genéticos del FMT. Resulta interesante que el FMT muestra poca o ninguna homología de secuencia con otros rhabdovirus de los seis géneros actuales y por lo tanto puede constituir un séptimo género en los Rhabdoviridae. Se ha determinado que este virus muestra neurotoxicidad reducida después de administración intracraneal (véase Ejemplo 2 y Figura 2). El virus FMT también demostró selectividad tumoral in vitro (véase Ejemplo 3 y Figura 3), y seguridad y eficacia después de administración intracraneal o sistémica en modelos de ratón singénicos y de xenoinjerto de glioblastoma (véase Ejemplo 4 y Figura 4).

Como se ha analizado anteriormente, se determinó que varios virus, incluyendo Maraba (MRB), Farmington (FMT) y Carajas (CRJ), tenían fuerte capacidad de destrucción contra una diversidad de líneas celulares cancerosas del panel de células NC60. También se determinó que estos virus tenían la capacidad de erradicar líneas celulares tumorales del SNC. Estos virus se ensayaron con respecto a su seguridad y eficacia in vitro e in vivo.

También se sabe que virus previos, tales como las cepas de tipo silvestre y atenuada de VSV, son fuertes destructores de líneas celulares del SNC. Sin embargo, son notablemente neurotóxicos y el tratamiento con dichos virus da como resultado con frecuencia pérdida de peso rápida y parálisis tras inyección intracerebral a dosis muy

imagen6

15

25

35

45

55

65

adicional añadida al genoma de virus FMT de tipo silvestre fue proteína verde fluorescente (GFP). Se demostró que el “virus rec-FMT-GFP” mutado resultante bloqueaba la respuesta de interferón de tipo I humano e infectaba de forma productiva células tanto cancerosas como no cancerosas.

También se demostró que el virus FMT inducía muerte celular de una manera dependiente del umbral antiapoptótico de las células infectadas y no de la productividad de la infección vírica dentro de la célula infectada (véase Ejemplo 7 y Figura 7). La infección vírica FMT de una célula parece iniciar la activación (escisión) de caspasa 8, caspasa 9, dominio de interacción con BH3 y polimerasa Poli(ADP-ribosa) en células tumorales.

En resumen, FMT es un virus oncolítico ejemplar de acuerdo con la presente divulgación, y que se ha demostrado que tiene un índice terapéutico alto contra líneas celulares de cáncer cerebral humano y muestras de pacientes in vitro, y que ha demostrado fuerte eficacia cuando se usa para tratar modelos preclínicos de cáncer cerebral. En consecuencia, se espera que puedan usarse partículas víricas aisladas de acuerdo con la presente divulgación para tratar el cáncer, tal como cáncer cerebral (por ejemplo glioblastoma). También se espera que puedan usarse partículas víricas aisladas de acuerdo con la presente divulgación para inducir una respuesta inmunogénica, tal como una respuesta antineoplásica, en una persona a la que se administra el virus.

Secuencias polinucleotídicas y de aminoácidos

Se proporcionan polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN y ARN) y secuencias de aminoácidos (por ejemplo, proteínas) que pueden usarse en una diversidad de métodos y técnicas conocidos por los expertos en la materia de la biología molecular. Estos incluyen formas aisladas, purificadas y recombinantes de las secuencias enumeradas e incluyen además formas completas o parciales de las secuencias enumeradas. Los usos no limitantes de secuencias de aminoácidos incluyen preparación de anticuerpos para proteínas o péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos desveladas. Los usos no limitantes de las secuencias polinucleotídicas incluyen preparación de sondas de hibridación, como cebadores para su uso en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para mapeo de cromosomas y genes, y similares. Pueden usarse secuencias de aminoácidos o polinucleótidos completas o parciales en dichos métodos y técnicas.

La presente divulgación presenta la identificación de secuencias polinucleotídicas, incluyendo secuencias génicas y secuencias de ácido nucleico codificantes, y secuencias de aminoácidos. Además de las secuencias proporcionadas expresamente en el listado de secuencias adjunto, también se incluyen secuencias polinucleotídicas que están relacionadas estructural y/o funcionalmente. También se incluyen secuencias polinucleotídicas que hibridan en condiciones rigurosas con cualquiera de las secuencias polinucleotídicas en el listado de secuencias, o una subsecuencia de las mismas (por ejemplo, una subsecuencia que comprende al menos 100 nucleótidos contiguos). Las secuencias polinucleotídicas también incluyen secuencias y/o subsecuencias configuradas para la producción y/o traducción de ARN, por ejemplo, ARNm, ARN antisentido, ARN con sentido, silenciamiento de ARN y configuraciones de interferencia, etc.

Pueden usarse secuencias polinucleotídicas que son sustancialmente idénticas a las proporcionadas en el listado de secuencias en las composiciones y los métodos desvelados en el presente documento. Se definen secuencias polinucleotídicas sustancialmente similares o sustancialmente idénticas como secuencias polinucleotídicas que son idénticas, nucleótido a nucleótido, con al menos una subsecuencia de un polinucleótido de referencia. Dichos polinucleótidos pueden incluir, por ejemplo, inserciones, supresiones y sustituciones en relación con cualquiera de los enumerados en el listado de secuencias. Por ejemplo, dichos polinucleótidos son típicamente al menos aproximadamente 70 % idénticos a un polinucleótido de referencia seleccionado de los del listado de secuencias, o una subsecuencia del mismo. Por ejemplo, al menos 7 de 10 nucleótidos dentro de una ventana de comparación son idénticos a la secuencia de referencia seleccionada. Además, dichas secuencias pueden ser al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o al menos aproximadamente 99,5 %, idénticas a la secuencia de referencia. Las subsecuencias de estos polinucleótidos pueden incluir al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 500, aproximadamente 1000 o más, nucleótidos contiguos o subsecuencias complementarias. Dichas subsecuencias pueden ser, por ejemplo, oligonucleótidos, tales como oligonucleótidos sintéticos, oligonucleótidos aislados o genes de longitud completa o ADNc. Se incluyen secuencias polinucleotídicas complementarias de cualquiera de las secuencias descritas.

Las secuencias de aminoácidos incluyen las secuencias de aminoácidos representadas en el listado de secuencias, y subsecuencias de las mismas. También se incluyen secuencias de aminoácidos que están muy relacionadas estructural y/o funcionalmente. Por ejemplo, además de las secuencias de aminoácidos en el listado de secuencias, pueden usarse secuencias de aminoácidos que son sustancialmente idénticas en las composiciones y los métodos desvelados. Las secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas o sustancialmente similares se definen como secuencias de aminoácidos que son idénticas aminoácido a aminoácido, con al menos una subsecuencia de una secuencia de aminoácidos de referencia. Dichas secuencias de aminoácidos pueden incluir, por ejemplo,

10

15

20

25

30

35

40

45

50

inserciones, supresiones y sustituciones en relación con cualquiera de las secuencias de aminoácidos en el listado de secuencias. Por ejemplo, dichos aminoácidos son típicamente al menos aproximadamente 70 % idénticos a una secuencia de aminoácidos de referencia, o una subsecuencia de la misma. Por ejemplo, al menos 7 de 10 aminoácidos dentro de una ventana de comparación son idénticos a la secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada. Frecuentemente, dichas secuencias de aminoácidos son al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o al menos aproximadamente 99,5 %, idénticas a la secuencia de referencia. Las subsecuencias de las secuencias de aminoácidos pueden incluir al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 500, aproximadamente 1000 o más, aminoácidos contiguos. También son posibles variantes conservativas de secuencias o subsecuencias de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos pueden ser inmunogénicas, enzimáticamente activas, enzimáticamente inactivas y similares.

Cuando las secuencias polinucleotídicas se traducen para formar un polipéptido o subsecuencia de un polipéptido, los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la intercambiabilidad de restos que tienen cadenas laterales funcionalmente similares. Se conocen bien en la técnica tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. La Tabla 1 expone ejemplos de seis grupos que contienen aminoácidos que son “sustituciones conservativas” entre sí. Están disponibles en la técnica otros diagramas de sustituciones conservativas, y pueden usarse de una manera similar.

Tabla 1

Grupo de Sustitución Conservativa

1

Alanina (A) Serina (S) Treonina (T)

2

Ácido aspártico (D) Ácido glutámico (E)

3

Asparagina (N) Glutamina (Q)

4

Arginina (R) Lisina (K)

5

Isoleucina (I) Leucina (L) Metionina (M) Valina (V)

6

Fenilalanina (F) Tirosina (I) Triptófano (W)

Un experto en la materia apreciará que muchas sustituciones conservativas producen construcciones funcionalmente idénticas. Por ejemplo, como se ha analizado anteriormente, debido a la degeneración del código genético, las “sustituciones silenciosas” (es decir, sustituciones en una secuencia polinucleotídica que no dan como resultado una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implícita de cada secuencia polinucleotídica que codifica un aminoácido. De forma similar, “sustituciones de aminoácidos conservativas” en uno

o algunos aminoácidos en una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 % o más) se sustituyen con aminoácidos diferentes con propiedades muy similares, y también se identifican fácilmente como muy similares a una construcción desvelada. Dichas variaciones conservativas de cada secuencia desvelada también se contemplan.

Se conocen ampliamente en la técnica métodos para obtener variantes conservativas, así como versiones más divergentes de las secuencias polinucleotídicas y de aminoácidos. Además de homólogos de origen natural que pueden obtenerse, por ejemplo, explorando bibliotecas genómicas o de expresión de acuerdo con cualquiera de una diversidad de protocolos bien establecidos, véase, por ejemplo, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (suplementado hasta 2004) John Wiley and Sons, Nueva York (“Ausubel”); Sambrook et al. Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (“Sambrook”) y Berger y Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, California (“Berger”), pueden producirse variantes adicionales por cualquiera de una diversidad de procedimientos de mutagénesis. Muchos de dichos procedimientos se conocen en la técnica, incluyendo mutagénesis dirigida, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos y muchos otros. Por ejemplo, se describe la mutagénesis dirigida, por ejemplo, en Smith (1985) “In mutagenesis in vitro” Ann, Rev. Genet. 19: 423-462, y referencias en la misma, Botstein y Shortle (1985) “Strategies and applications of mutagenesis in vitro” Science 229: 1193-1201; y Carter (1986) “Site-directed mutagenesis” Biochem. J. 237: 1-7. Se describe la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, por ejemplo, en Zoller y Smith (1982) “Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment” Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500). Se describe la mutagénesis usando bases modificadas, por ejemplo, en Kunkel (1985) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 488-492, y Taylor et al. (1985) “The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioatemodified DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787. Se describe la mutagénesis usando ADN bicatenario con huecos,

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

por ejemplo, en Kramer et al. (1984) 'The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction” Nucl. Acids Res. 12: 9441-9460). Se describe la mutagénesis de desapareamiento puntual, por ejemplo, en Kramer et al. (1984) “Point Mismatch Repair” Cell 38: 879-887). Se describe la mutagénesis de rotura bicatenaria, por ejemplo, en Mandecki (1986) “Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis” Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181, y en Arnold (1993) “Protein engineering for unusual environments” Current Opinión in Biotechnology 4: 450-455). Se describe la mutagénesis usando cepas hospedadoras deficientes en reparación, por ejemplo, en Carter et al. (1985) “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors” Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443. Se describe la mutagénesis por síntesis génica total, por ejemplo, en Nambiar et al. (1984) “Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein” Science 223: 1299-1301. Se describe la redistribución de ADN, por ejemplo, en Stemmer (1994) “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling” Nature 370: 389-391, y Stemmer (1994) “DNA shuffling by random fragmentaron and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751.

Muchos de los métodos anteriores se describen adicionalmente en Methods in Enzymology Volumen 154, que también describe controles útiles para dificultades en la resolución de problemas con diversos métodos de mutagénesis. También están disponibles en el mercado kits para mutagénesis, construcción de bibliotecas y otros métodos de generación de diversidad. Por ejemplo, están disponibles kits de, por ejemplo, Amersham International pie (Piscataway, N. J.) (por ejemplo, usando el método de Eckstein anterior), Bio/Can Scientific (Mississauga, Ontario, CANADÁ), Bio-Rad (Hercules, Calif.) (por ejemplo, usando el método de Kunkel descrito anteriormente), Boehringer Mannheim Corp. (Ridgefield, Connecticut), Clonetech Laboratories of BD Biosciences (Palo Alto, CA), DNA Technologies (Gaithersburg, Md), Epicenter Technologies (Madison, Wis.) (por ejemplo, el kit 5 prima 3 prima);Genpak Inc. (Stony Brook, NY), Lemargo Inc (Toronto, CANADÁ), Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.), Pharmacia Biotech (Peapack, N. J.), Promega Corp. (Madison, Wis.), QBiogene (Carlsbad, Calif.) y Stratagene (La Jolla, Calif.) (por ejemplo, kit de mutagénesis dirigida QuickChange.TM. y kit de mutagénesis dirigida, bicatenaria, Chameleon.TM.).

Determinación de relaciones de secuencias

Pueden determinarse objetivamente secuencias similares por cualquier variedad de métodos, por ejemplo, porcentaje de identidad, hibridación, inmunológicamente, y similares. Están disponibles y se conocen en la técnica una diversidad de métodos para determinar relaciones entre dos o más secuencias (por ejemplo, identidad, similitud y/u homología). Los métodos incluyen alineamiento manual, alineamiento de secuencias asistido por ordenador y combinaciones de los mismos, por ejemplo. Un experto en la materia puede producir varios algoritmos (que se implementan generalmente por ordenador) para realizar alineamiento de secuencias, o están estos ampliamente disponibles. Estos métodos incluyen, por ejemplo, el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Mates. 2: 482; el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 85: 2444; y/o por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics Versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.).

Por ejemplo, se describe software para realizar análisis de identidad de secuencias (y similitud de secuencias) usando el algoritmo BLAST en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Este software está públicamente disponible, por ejemplo, a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica en Internet en ncbi.nlm.nih.gov. Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden con o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabra adyacente. Estos aciertos de palabra adyacentes iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabras se extienden después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, en la medida en que pueda aumentarse la puntuación de alineamiento acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización para restos desapareados; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulada desciende en la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de una de las secuencias. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un punto de corte de 100, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP (BLAST de Proteínas) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati Acad Sci. USA 89: 10915).

imagen7

imagen8

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

De acuerdo con estos aspectos, el vector puede ser, por ejemplo, un vector plasmídico, un vector de fago mono o bicatenario, o un vector vírico de ARN o ADN mono o bicatenario. Dichos vectores pueden introducirse en células como polinucleótidos, preferentemente ADN, por técnicas bien conocidas para introducir ADN y ARN en células. Los vectores, en el caso de vectores de fagos y víricos, también pueden introducirse y preferentemente se introducen en células como virus envasados o encapsidados por técnicas bien conocidas para infección y transducción. Los vectores víricos pueden ser competentes en replicación o defectuosos en replicación. En el último caso, la propagación vírica se producirá en general solamente en células hospedadoras complementarias.

En algunos ejemplos, los vectores incluyen los útiles para expresión de polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención. En general, dichos vectores comprenden regiones de control de acción en cis eficaces para expresión en un hospedador, unidas operativamente con el polinucleótido para expresar. Los factores de acción en trans apropiados los provee el hospedador, los provee un vector complementario o los provee el vector en sí mismo tras la introducción al hospedador.

En ciertos ejemplos a este respecto, los vectores proporcionan expresión de proteínas. Dicha expresión preferida puede ser expresión inducible, expresión temporalmente limitada o expresión restringida predominantemente a ciertos tipos de células, o cualquier combinación de las anteriores. Algunas realizaciones de vectores inducibles pueden inducirse por expresión por factores ambientales que son fáciles de manipular, tales como temperatura y aditivos nutrientes. Los expertos en la materia conocen bien y emplean rutinariamente una diversidad de vectores adecuados para este aspecto, incluyendo vectores de expresión constitutiva e inducible para su uso en hospedadores procariotas y eucariotas. Dichos vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como rhabdovirus, baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos y binarios usados para transformaciones mediadas por Agrobacterium.

Los vectores pueden incluir un marcador seleccionable y un gen indicador. Para facilitar la obtención de suficientes cantidades de vector, puede usarse un origen bacteriano que permita la replicación en E. coli. Los siguientes vectores, que están disponibles en el mercado, se proporcionan como ejemplo. Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias están pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK2333, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia. Entre los vectores eucariotas preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Los vectores binarios vegetales útiles incluyen BIN19 y sus derivados disponibles de Clontech. Estos vectores se enumeran solamente como ilustración de los muchos vectores disponibles en el mercado y bien conocidos que están disponibles para los expertos en la materia. Se apreciará que puede usarse cualquier otro plásmido o vector adecuado para, por ejemplo, introducción, mantenimiento, propagación o expresión de uno o más polinucleótidos y/o polipéptidos como se proporcionan en el listado de secuencias presente, incluyendo variantes de los mismos como se describe, en un hospedador.

En general, las construcciones de expresión contendrán sitios para inicio y terminación de la transcripción y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para traducción cuando la construcción codifica un polipéptido. La parte codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirá una AUG de inicio de la traducción en el inicio y un codón de terminación situado apropiadamente al final del polipéptido para traducir. Además, las construcciones pueden contener regiones de control que regulan así como generan expresión. En general, de acuerdo con muchos procedimientos practicados habitualmente, dichas regiones actuarán controlando la transcripción, tal como factores de transcripción, sitios de unión a represores y señales de terminación, entre otros. Para secreción de una proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, al espacio periplásmico o al ambiente extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas al polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas del polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

La transcripción del ADN (por ejemplo, que codifica los polipéptidos) de la presente invención por eucariotas superiores puede aumentarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Son potenciadores elementos de acción en cis del ADN, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb que actúan para aumentar la actividad transcripcional de un promotor en un tipo de célula hospedadora dado. Los ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador de SV40, que se localiza en el sitio tardío del origen de replicación en pb 100 a 270, el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Los potenciadores adicionales útiles en la invención para aumentar la transcripción del segmento de ADN introducido incluyen, entre otros, potenciadores víricos tales como los que están dentro del promotor de 35S, como se muestra en Odell et al., Plant Mol. Biol. 10: 263-72 (1988), y un potenciador de un gen de opina como se describe en Fromm et al., Plant Cell 1: 977 (1989). El potenciador puede afectar a la especificidad tisular y/o especificidad temporal de expresión de secuencias incluidas en el vector.

15

25

35

45

55

65

Las regiones de terminación también facilitan la expresión eficaz por terminación de la transcripción en puntos apropiados. Los terminadores útiles incluyen, pero sin limitación, pinll (véase An et al., Plant Cell 1(1)115-122 (1989)), glbl (véase Referencia de Genbank n.º L22345), gz (véase terminador gzw64a, Referencia de Genbank n.º S78780) y el terminador nos de Agrobacterium. La región de terminación puede ser nativa con la secuencia de nucleótidos del promotor, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés, o puede derivar de otra fuente. Por ejemplo, otras regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Véase también: Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Bailas et al. 1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

Entre los promotores eucariotas conocidos adecuados para expresión generalizada están el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de timidina quinasa del VHS, los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores de LTR retrovíricas, tales como los del virus del sarcoma de Rous (“VSR”), promotores de metalotioneína, tales como el promotor de metalotioneína l de ratón y diversos promotores vegetales, tales como globulina 1. También pueden usarse los promotores nativos de las secuencias polinucleotídicas enumeradas en el listado de secuencias. Los representantes de promotores procariotas incluyen el promotor PL de fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli por nombrar solamente algunos de los promotores bien conocidos.

También se contemplan virus aislados o recombinantes, células infectadas por virus o células que incluyen una o más partes de las presentes secuencias polinucleotídicas y/o que expresan una o más partes de las presentes secuencias de aminoácidos.

Un polinucleótido, que codifica opcionalmente la secuencia estructural heteróloga de una secuencia de aminoácidos como se desvela, se insertará en general en un vector usando técnicas convencionales de modo que esté unido operativamente con un promotor para expresión. Unido operativamente, como se usa en el presente documento, incluye referencia a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en el que la secuencia promotora inicia y media en la transcripción del ADN correspondiente a la segunda secuencia. En general, unido operativamente significa que la secuencia polinucleotídica que se une es contigua y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contigua y en la misma fase de lectura. Cuando se pretende que el polinucleótido sea para expresión de un polipéptido, el polinucleótido se situará de modo que el sitio de inicio de la transcripción se localice aproximadamente 5’ de un sitio de unión a ribosoma. El sitio de unión a ribosoma estará 5’ del AUG que inicia la traducción del polipéptido para expresar. En general, no habrá ninguna otra fase abierta de lectura que comience con un codón de inicio, habitualmente AUG, y quede entre el sitio de unión a ribosomas y el codón de inicio. También, en general, habrá un codón de terminación de la traducción al final del polipéptido y habrá una señal de poliadenilación en construcciones para su uso en hospedadores eucariotas. También pueden incluirse en la construcción polinucleotídica señales de terminación de la transcripción dispuestas apropiadamente en el extremo 3’ de la región transcrita.

Para construcciones de ácido nucleico diseñadas para expresar un polipéptido, los casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias líder 5’. Dichas secuencias líder pueden actuar para potenciar la traducción. Se conocen en la técnica líderes de traducción e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo: líder de EMCV (región no codificante 5’ de Encefalomiocarditis), Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130; líderes de potivirus, por ejemplo, líder de TEV (Virus del Grabado del Tabaco), Allison et al. (1986); líder de MDMV (Virus del Mosaico Enano del Maíz), Virology 154: 9-20; proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP), Macejaket al. (1991) Nature 353: 90-94; líder no traducido del ARNm de proteína de cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4), Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV), Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256; y líder de virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385. Véase también Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology

84: 965-968. El casete también puede contener secuencias que potencian la traducción y/o estabilidad de ARNm, tales como intrones. El casete de expresión también puede incluir en el extremo 3’ de la secuencia de nucleótidos aislada de interés, una región de terminación de la traducción.

En los casos en los que sea deseable tener el producto expresado de la secuencia polinucleotídica dirigida a un orgánulo particular o secretada en la superficie de la célula el casete de expresión puede comprender además una secuencia codificante para un péptido de tránsito. Dichos péptidos de tránsito se conocen bien en la técnica e incluyen, pero sin limitación: el péptido de tránsito para la proteína transportadora de acilo. La subunidad pequeña de la RUBISCO, EPSP sintasa de planta y similares.

En la preparación de un casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse para proporcionar las secuencias polinucleotídicas en la orientación apropiada y, según sea apropiado, en la fase de lectura apropiada. Para este fin, pueden emplearse adaptadores o enlazadores para unir fragmentos de ADN o pueden estar implicadas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, retirada de ADN superfluo, retirada de sitios de restricción o similares. Para este fin, pueden emplearse mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, digestiones de restricción, hibridación y resustituciones tales como transiciones y transversiones.

imagen9

15

25

35

45

55

65

Determinación de la toxicidad in vivo: para la vía de administración (vda) intracraneal (IC), se proporcionó a grupos de ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (n = 5/grupo) una única infusión IC de los virus indicados en incrementos logarítmicos por grupo que variaba de 102 a 107 ufp. Para la vda intravenosa (IV), se proporcionó a grupos de cinco ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad una única inyección IV de los virus indicados en la vena de la cola, en incrementos semilogarítmicos por grupo que variaba de 3 x 106 a 3 x 109 ufp, diluido en 100 μl por inyección. Después de inyecciones IC o IV, los ratones se supervisaron diariamente con respecto a señales de malestar incluyendo pérdida de peso, piloerección, parálisis de las extremidades posteriores y dificultad respiratoria. La dosis mediana letal (DL50) se calculó usando el método de Spearman Karber, mientras que la dosis tolerable máxima (DTM) se indicó como la dosis más alta que no da como resultado la muerte de un solo animal.

Imágenes de glioblastoma en un modelo animal: se adaptaron células U87MG y CT2A para captura de imágenes bioluminiscentes transduciendo con lentivirus que contenía luciferasa de luciérnaga (FLUC) y transfectando con plásmido de FLUC, respectivamente. Se inyectaron células U87MG FLUC y CT2A FLUC IC en CD1 desnudos y C57BL/6 respectivamente. Los animales con tumores que expresaban FLUC se supervisaron con respecto a progresión tumoral usando el sistema de captura de imágenes en vivo IVIS Xenogen 200 después de una inyección IP de luciferina (Gold Biotechnology Inc). Los animales se supervisaron con respecto a señales de malestar incluyendo supervivencia, pérdida de peso, morbilidad, piloerección, parálisis de las extremidades posteriores y dificultad respiratoria.

Modelos tumorales de glioblastoma singénico de ratón: se establecieron tumores cerebrales por una única inyección estereotáctica con células de glioma de ratón CT-2A en animales C57BL/6 de 6-8 semanas de edad. Cinco días después de la inyección-El día 19 los ratones C57BL/6 que portaban tumores CT-2A se trataron IV con 6 dosis de FMT (5 x 108 ufp/dosis tres veces por semana) o se les inyectó por vía estereotáctica FMT (2 x 107 en un volumen de 50 μl) usando una bomba de infusión (velocidad = 3 μl/min). Algunos animales C57BL/6 se sacrificaron el día 19 y se capturaron imágenes en un microscopio de disección Nikon. Los animales restantes se supervisaron para supervivencia.

Modelo de xenoinjerto de glioblastoma humano: se adaptaron células U87MG ováricas humanas para captura de imágenes bioluminiscentes momento en el cual se inyectaron 1e6 células U87MG IC en ratones desnudos CD-1 atímicos de 6-8 semanas de edad. Los animales CD-1 no tratados desarrollan tumores aproximadamente el día 15

21. Los ratones se trataron con una única inyección intravenosa (vena de la cola) realizada el día 14 con FMT (5 x 108), o se trataron IC con los mismos virus a una dosis de 2 x 107 ufp. Los animales se supervisaron con respecto a supervivencia y con respecto a señales de malestar incluyendo pérdida de peso, morbilidad, piloerección, parálisis de las extremidades posteriores y dificultad respiratoria. Se capturaron imágenes tumorales con un sistema Xenogen 200 IVIS (Caliper LS, EE.UU.).

Rotorod: se ensayaron ratones Balb/C con respecto a función/rendimiento motor en un aparato de varilla rotatoria antes de la administración vírica IC. Los ratones se colocaron en un rotorod durante 3 ensayos al día durante 4 días consecutivos. Después de permitir a los animales 0,5 minutos para ajustarse al aparato, se aceleró la varilla de una manera lineal a 0,1 rpm/s. Se midió el tiempo hasta la caída en minutos. Los animales se dividieron en grupos de 3. La función motora una semana después de cirugía en animales tratados IC con PBS y FMT y no inyectados (sin tratamiento previo). Se calculó el error típico de la media.

Secuenciación de ácidos nucleicos: se realizó secuenciación de FMT en el Instituto de Ontario para la investigación del Cáncer (Toronto, Canadá) en ADNc de FMT que se generó usando un enfoque de secuenciación aleatoria con hexámeros aleatorios en ARN de FMT extraído con trizol y purificado por RNeasy.

Secuenciación de proteínas: se amplificó el virus FMT en células Vero hasta alta titulación (~1011 ufp/ml), se purificó y se lisó con tampón de muestra Laemmli 5 x (Tris-CI 60 mM pH 6,8, SDS 2 %, glicerol 10 %, β-mercaptoetanol 5 %, azul de bromofenol 0,01 %) y se separaron en geles de SDS-PAGE 12 %. Los geles de repetición se tiñeron con azul de coomasie o plata, y se extrajeron nueve bandas para secuenciación de péptidos.

Fabricación y rescate de virus FMT recombinante: se produjo FMT recombinante como se ha descrito recientemente para virus Maraba25. Brevemente, se amplificó ADN complementario (ADNc) de virus FMT en tres reacciones de RT-PCR separadas produciendo fragmentos solapantes que se unieron entre sí usando sitios de restricción internos. El ADNc de ~11 Kb de longitud completa se clonó después en un vector LC-KAN modificado (Lucigen, Middleton, Wl) que portaba un promotor T7 cadena arriba de la secuencia líder antigenómica 5’ e inmediatamente cadena abajo del terminador 3’ una ribozima de virus delta de hepatitis modificado y secuencia señal de terminación de polimerasa T7. Se infectaron células de carcinoma de pulmón A549 sembradas a 3,0 x 105 células/pocillo en placas de 6 pocillos 24 horas después con virus vaccinia (moi = 10) que expresaba la ARN polimerasa T7 37 en medio OptiMeM durante 1,5 horas. Después de la retirada del virus vaccinia, cada pocillo se transfectó con LC-KAN FMT (2 μg) junto con construcciones pCI-Neo que codificaban FMT “N” (1 μg), “P” (1,25 μg) y L (0,25 μg) con lipofectamine 2000 (5 μl por pocillo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El reactivo de transfección se retiró 5 horas después y se reemplazó con DMEM que contenía HI-FBS 10 %. A las 48 horas después de la transfección, se recogió el medio (agrupado de dos placas), se filtró (0,2 μm) para retirar el virus vaccinia contaminante y se usó 1 ml para infectar células de glioblastoma SNB19 en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Los efectos citopáticos y la expresión de

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

SEQ ID NO. 5

Rhabdovirus Farmington ORF 3 El promotor está en la posición 2799 a 2813 y la secuencia codificante está en las posiciones 2894 a 3340 de SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO. 6

Rhabdovirus Farmington ORF 4 El promotor está en la posición 3457 a 3469 y la secuencia codificante está en las posiciones 3603 a 5717 de SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO. 7

Rhabdovirus Farmington ORF 5 El promotor está en la posición 5766 a 5780 y la secuencia codificante está en las posiciones 5832 a 12221 de SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 3 está codificada por SEQ ID NO: 8 (es decir la secuencia codificante de las posiciones 206 a 1444 de SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 4 está codificada por SEQ ID NO: 9 (es decir la secuencia codificante de las posiciones 1640 a 2590 de SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 5 está codificada por SEQ ID NO: 10 (es decir, la secuencia codificante de las posiciones 2894 a 3340 de SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 6 está codificada por SEQ ID NO: 11 (es decir la secuencia codificante de las posiciones 3603 a 5717 de SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 7 está codificada por SEQ ID NO: 12 (es decir la secuencia codificante de las posiciones 5832 a 12221 de SEQ ID NO: 1).

La Figura 1 muestra A) Esquema de donde se aisló por primera vez FMT en 1969. B) El Alineamiento de Blastos de Aminoácidos de 5 ORF de FMF no revela ninguna homología de secuencia con ninguna otra secuencia en la base de datos excepto por la proteína L que es ~45 % similar al rhabdovirus vegetal: virus amarillo necrótico de Lechuga (LNYV). C) Gel de SDS PAGE teñido con Coomassie de virus FMT que muestra 4 de las 5 proteínas de ORF de FMT predichas. Estas bandas se escindieron del gel y su identidad se confirmó mediante secuenciación de proteínas por espectrometría de masas en tándem. D) Árbol filogenético derivado de las secuencias de aminoácidos de los genes de polimerasa de diversos rhabdovirus. Se incluyó el paramixovirus de sarampión como un control no familiar. Todos los rhabdovirus oncolíticos previos se han identificado en el género vesiculovirus (VSV, Maraba). Inesperadamente, parece que el virus Farmington se agrupa con los citorhabdovirus e infectan plantas. E) Se ha construido un sistema recombinante para la plataforma de FMT que permite un control completo de la composición genética del virus. Se muestra aquí la generación de una cepa de FMT que expresa GFP completamente replicativa como un ejemplo. F) Microfotografía electrónica de virión en forma de bala de FMT que mide 55 nm x 150 nm (adaptado de Tesh et al. Emerging Infect. Dis. 2002).

Ejemplo 2: el virus Farmington no demuestra neurotoxicidad

El FMT demostró atenuación profunda en células no transformadas in vitro. Para determinar si la atenuación observada in vitro se traduce a seguridad in vivo, se inyectaron de forma estereotáctica en el cuerpo estriado derecho del cerebro dosis crecientes de rhabdovirus y se supervisó con respecto a señales de neurotoxicidad (incluyendo pérdida de peso, piloerección, parálisis de las extremidades posteriores, morbilidad y mortalidad). FMT tuvo una DL50 de aproximadamente 1 x 109 en contraste con otros rhabdovirus que presentaban DL50 aproximadamente 102. (Figura 2A). Se determinó que la dosis tolerada máxima (DTM) era la mayor dosis que no daba como resultado morbilidad duradera (Figura 2A). Para FMT la DTM era aproximadamente 1 x 107,5 ufp mientras que para los otros rhabdovirus la DL50 se produjo a una dosis tan baja de virus que fue imposible determinar la DTM. Estos animales presentaron señales clínicas de una infección del SNC con pérdida de peso rápida y progresiva, parálisis de las extremidades posteriores y tuvieron títulos significativos de virus en su cerebro justo antes de su muerte (datos no mostrados).

Aunque no se descubrió ninguna neurotoxicidad aguda a partir del tratamiento IC con FMT, se deseó evaluar la función cognitiva y motora de los ratones varios días después de la infección por virus. Por lo tanto, se evaluó la función motora antes y después del tratamiento con estos virus FMT de tipo silvestre usando un aparato rotorod (Figura 2B). Específicamente, se midió el tiempo que tardaban estos animales en caer de una varilla que aceleraba lentamente. Se mostró que no hubo ninguna diferencia significativa en el tiempo hasta la caída entre los animales infectados por simulación o animales infectados por virus, 1 semana antes y 1 semana después de la inyección (Figura 2B).

Además de la toxicidad intracraneal, se evaluó la toxicidad de FMT cuando se administró por vía intravenosa (IV) en ratones inmunocompetentes con dosis crecientes de virus (Figura 2C). FMT se tolera bien IV y nunca alcanza una DL50 incluso a la mayor dosis de 3 x 109 ufp que es comparable a una versión atenuada de Maraba que describieron los inventores en Brun, J. et al. Identification of Genetically Modified Maraba Virus as an Oncolytic Rhabdovirus. MolTher 18, 1440 (2010). Los animales con dosificación IV de FMT a más de 3 x 108 ufp presentaron pérdida de peso transitoria y piloerección moderada, que se resolvió 5-7 días después del tratamiento (datos no mostrados). No se observó ningún título detectable de homogeneizados cerebrales tomados de animales tratados con FMT 3 meses después del tratamiento IV (Figura 2D). Además, después de la administración de altas dosis de FMT (1 x 107 ufp)

15

25

35

45

55

65

en el cerebro, no se descubrió ninguna señal de muerte celular y respuestas inflamatorias comparables a las de los ratones de control a los que se inyectó solución salina (Figura 2E). Esto difirió drásticamente de animales a los que se inyectó VSV, que presentaron un aumento sorprendente en células inflamatorias, núcleos condensados y una morfología perforada. Debido a su falta de neurotoxicidad y fuerte capacidad de destrucción de tumores del SNC, se eligió continuar con FMT como una plataforma para desarrollar un nuevo oncolítico contra GBM.

La Figura 2 muestra el perfil de seguridad de FMT A) se inyectaron a grupos de 5 ratones Balb/C por vía esterotáctica en el cuerpo estriado derecho del cerebro dosis crecientes de rhabdovirus como se indica y se supervisaron con respecto a señales de malestar incluyendo pérdida de peso, piloerección, parálisis de las extremidades posteriores, morbilidad y mortalidad. Se determinó que la dosis tolerable máxima (DTM) era la dosis más alta que no daba como resultado morbilidad duradera como se midió por comportamiento y peso. Se determinó la DL50 usando el método de Spearman Karber. FMT es único entre los rhabdovirus como un virus no neurotóxico. B) Para detectar cualquier deficiencia cognitiva en el cuerpo estriado, se evaluó la función motora por aparato rotorod que mide el tiempo hasta la caída de una varilla en aceleración. La función motora es indistinguible de los controles después de inyección intracerebral de FMT. C) Se inyectó a grupos de 3-5 ratones Balb/C una vez por vía intravenosa en incrementos semilogarítmicos virus que variaba de 3 x 106 ufp a 3 x 109 ufp. Los animales se supervisaron con respecto a señales de malestar incluyendo pérdida de peso, morbilidad, piloerección, parálisis de las extremidades posteriores y dificultad respiratoria. FMT muestra una DTM muy alta de 1 x 109 ufp cuando se suministra por vía sistémica. D) Los animales sacrificados 3 meses después de la inoculación intracerebral no demuestran ningún virus viable en los homogeneizados cerebrales. El límite de detección es 101. E) Se inocularon ratones Balb/C por vía intracerebral con los virus indicados (1 x 107 ufp) y se sacrificaron 2 días después del tratamiento. No es visible ninguna inflamación o es visible poca inflamación y no es detectable ninguna pérdida celular después de tratamiento con FMT. Esto se diferencia de VSV que muestra una pérdida neuronal significativa (espacios vacíos, inserto).

Ejemplo 3: el virus Farmington destruye de forma fuerte y selectiva células tumorales cerebrales

Los aislados de FMT de tipo silvestre demuestran atenuación en células primarias normales manteniendo al mismo tiempo una fuerte capacidad de destrucción de células de glioma (Figura 3A). Para evaluar la relevancia clínica de los nuevos rhabdovirus oncolíticos de los inventores para tratar el cáncer cerebral, se examinó si FMT podría destruir muestras tumorales recién derivadas de pacientes. Se efectuaron cultivos celulares aislados de 3 pacientes con glioblastoma multiforme primario con FMT y 48 h después, los ensayos de viabilidad demostraron que el virus FMT era fuertemente citotóxico para 2 de 3 explantes tumorales de pacientes (Figura 3A). Para ensayar la capacidad de destrucción de los aislados de FMT se realizaron ensayos de destrucción celular en astrocitos humanos normales (AHN) y 3 líneas celulares tumorales GBM (Figura 3B). Aunque MRB de tipo silvestre fue muy fuerte contra todas las líneas celulares GBM, también fue muy lítico contra ambos astrocitos humanos normales (AHN) primarios. Notablemente, FMT demostró el mayor índice terapéutico, con potencia que rivalizaba MRB en la mayoría de líneas de GBM mientras que permanecía altamente atenuado en líneas celulares primarias NHA y GM38 (Figura 3C). Esto demuestra que el virus FMT es un virus oncolítico fuerte y selectivo cuando se ensaya frente a líneas celulares de cáncer cerebral.

En la Figura 3 se muestra A) Sumario de citotoxicidad in vitro de FMT que muestra fuerte actividad contra muestras de pacientes con glioblastoma primario y líneas celulares tumorales cerebrales humanas y de ratón establecidas, permaneciendo al mismo tiempo atenuado contra células normales. B) FMT es un destructor fuerte y selectivo de líneas celulares de glioblastoma. Se ensayó la viabilidad usando ensayo de Alamar blue 72 horas después del tratamiento. Las barras de error representan ETM de 4 repeticiones biológicas. C) Evaluación detallada de la fuerza de FMT contra células tumorales y normales. CE50 (moi = multiplicidad de infección) representa la relación de virus:célula requerida para destruir 50 % de las células cultivadas en un marco temporal de 72 horas como se mide usando un ensayo de viabilidad de Alamar blue.

Ejemplo 4: el virus de Farmington es eficaz en modelos de xenoinjerto y singénicos de glioblastoma

A continuación se intentó determinar la eficacia in vivo de los virus candidatos de los inventores en modelos de glioblastoma de ratón. Después de adaptar células de glioma U87MG humanas para capturar imágenes bioluminiscentes, se estableció un modelo de glioma U87MG intracerebral en ratones atímicos y se examinó la eficacia IV e IC de FMT en este modelo (Figura 4A-B). Específicamente, los animales se trataron con una única dosis IC (1 x 105) o IV (5 x 108 ufp) de FMT 14 días después de la implantación. Tres días después del primer tratamiento se observó una reducción significativa en la carga tumoral con una reducción mayor observada el día 7 (Figura 4A). Resulta interesante que las metástasis espinales en este modelo estaban completamente eliminadas en todos los animales portadores de tumores. Por el contrario, los animales tratados con virus inactivado por UV tuvieron un aumento significativo en la carga tumoral al día 7 en cuyo momento comenzaron a mostrar síntomas neurológicos de sus tumores cerebrales (Figura 4B). Todos los animales tratados IV respondieron al tratamiento con 4 de 11 curados de forma duradera y que sobrevivieron más de 100 días después del tratamiento. La mayoría de animales tratados IC respondieron al tratamiento (10 de 16) con un aumento significativo (~ 2 veces) del tiempo hasta la muerte. Además también se usó microscopía fluorescente para visualizar explantes tumorales de animales infectados por simulación y animales curados de forma duradera. Aunque se detectó un tumor de glioma que

15

25

35

45

55

65

expresaba GFP fuertemente en animales infectados por simulación, hubo una clara ausencia de señal de GFP en animales tratados con FMT (Figura 4C). Para complementar los estudios de los inventores de la eficacia viral en animales inmunocomprometidos, se ensayó FMT en un modelo de glioma singénico CT-2A de ratón. A diferencia de los modelos de xenoinjertos en los que los gliomas humanos crecen de forma expansiva, los gliomas de CT-2A son infiltrativos de forma similar a lo que se observa clínicamente. Se estableció el modelo de glioma de CT-2A inyectando de forma estereotáctica 2 x 105 células en el cuerpo estriado (lóbulo frontal derecho) de ratones C57BL/6. Ya que los tratamientos comienzan típicamente en pacientes humanos después de presentar síntomas clínicos de GBM, se buscó examinar el efecto de FMT exactamente en el momento en que los animales muestran síntomas externos. En el CT-2A los animales comienzan a mostrar síntomas 15-20 días después de la implantación. Estos síntomas incluyen presión intracraneal aumentada, letargia, función motora, piloerección y postura encorvada. En consecuencia, 19 días después de la implantación los animales C57BL/6 se trataron con FMT IV (5 x 108 ufp tres veces por semana durante 2 semanas) o con una única dosis IC de FMT (2 x 107 ufp). La mayoría de los animales respondieron a ambos regímenes de tratamiento, y se obtuvieron curas duraderas en 3 de 11 animales tratados IC y 2 de 10 animales tratados IV en este modelo de exposición de GBM avanzado (Figura 4D). Por lo tanto el virus FMT demuestra eficacia en modelos preclínicos de cáncer cerebral.

La Figura 4 muestra la eficacia in vivo de FMT en modelos preclínicos de glioblastoma A) Se implantaron de forma estereotáctica células de glioblastoma humano U87MG adaptado a bioluminiscencia (1e6) en el cuerpo estriado derecho de ratones desnudos CD-1. Después de 2 semanas los animales se trataron con una única dosis de FMT por vía intravenosa (IV-5 x 108 ufp) o por vía intracraneal (IC-1 x 105 ufp) y se supervisaron por captura de imágenes de bioluminiscencia IVIS. Los tumores diseminados en todos los ratones tratados con FMT retroceden rápidamente en un periodo de 3-7 días y se hacen indetectables en la médula espinal. B) Representación de supervivencia de Kaplan Meir de animales tratados con una única dosis IC (1 x 105 ufp) que da como resultado una duplicación del tiempo medio hasta la muerte (ensayo de rangos logarítmicos p = 0,0001) o IV (5 x 108 ufp) dando como resultado curas duraderas en el 40 % de los animales (Ensayo de rangos logarítmicos p = 0,0001). C) Microfotografía de fluorescencia de un cerebro de ratón infectado por simulación con un tumor U87MG marcado con GFP ortotópico (2 paneles superiores) frente a un cerebro tratado con FMT (2 paneles inferiores). El tumor que expresa GFP es claramente visible en secciones sagitales de ratones no tratados, mientras que el tratamiento con FMT no da como resultado ninguna señal tumoral de GFP detectable, lo que confirma la regresión tumoral. D) Modelo de tumor de glioblastoma de ratón singénico usando la línea celular CT2A. De nuevo aquí se permitió que los tumores se establecieran hasta el punto en que los ratones comenzaron a morir por su carga tumoral. El tratamiento tanto IC (una dosis 2 x 107 ufp) como IV (6 dosis 5 x 108) duplicaron el tiempo medio hasta la muerte y dieron como resultado > 20 % de curas duraderas.

Ejemplo 5: el virus Farmington induce inmunidad antitumoral

Cada vez hay más pruebas que demuestran que el efecto oncolítico de muchos virus, incluyendo rhabdovirus oncolíticos, se debe en parte a la inducción de la inmunidad antitumoral. Para explorar la posibilidad de que el virus FMT induzca múltiples mecanismos para destrucción tumoral in vivo, se planteó si tratar ratones portadores de tumores inmunocompetentes con virus FMT induce inmunidad antitumoral. Para comenzar, se realizó un experimento de “reexposición”, en el que se inyectó a ratones C57/BL6 que previamente albergaban tumores CT-2A que se habían tratado con éxito infusiones de virus FMT IC una segunda vez con células CT-2A directamente en el cerebro. En estos experimentos, los ratones previamente curados rechazaron uniformemente las células (Figura 5A), lo que demuestra que habían adquirido inmunidad de larga duración frente a antígeno o antígenos de CT-2A. A continuación, se examinó el papel de linfocitos T citotóxicos (CTL) en la respuesta antitumoral inducida por virus FMT. Se inoculó a ratones con células CT-2A en su cerebro, y se retiraron después CTL usando anticuerpos dirigidos hacia CD8 junto con tratamiento de virus FMT. De forma coherente con los datos recientes de otros laboratorios que usaron agentes oncolíticos diferentes, estos experimentos mostraron que el virus FMT inducía respuestas completas solamente cuando estaban presentes CTL (Figura 5B). Por lo tanto, además de lisar directamente células MG, estos datos demuestran que el virus FMT induce una respuesta inmunitaria anti MG mediada por CTL fuerte y de larga duración en ratones inmunocompetentes.

En la Figura 5A, se implantaron en ratones C57/B6 células de glioma murino CT2A en el cuerpo estriado (3 x 105 células). Los ratones se trataron con una única dosis de FMT (2 x 107 ufp) y se curaron posteriormente de su tumor inicial. Después de 6 meses, estos ratones se expusieron a células CT2A implantadas en el cuerpo estriado. Se implantaron en ratones sin tratamiento previo células CT2A como control. La captura de imágenes bioluminiscentes para supervisar el crecimiento tumoral de CT2A mostró que ratones que se habían curado previamente de los tumores rechazaron completamente el crecimiento tumoral CT2A posterior, mientras que los ratones sin tratamiento previo desarrollaron tumores con la cinética esperada. En la figura 5B) se implantaron en ratones C57/B6 células de glioma murino CT2A en el cuerpo estriado (3 x 105 células) y se permitió que desarrollaran tumores durante 14 días. Un grupo de ratones recibió inyecciones de suero policlonal anti CD8 para retirar linfocitos T CD8+ o suero preinmune coincidente como control. Ambos grupos se trataron con una única dosis intracraneal de FMT (2 x 107 ufp) para inducir regresiones tumorales. Todos los ratones respondieron con regresión tumoral como se midió usando captura de imágenes tumorales bioluminiscente (no mostrado), pero los ratones que estaban desprovistos de sus linfocitos T CD8+ volvieron a desarrollar con el tiempo tumores y fracasó la terapia

15

25

35

45

55

65

Ejemplo 6: el virus Farmington infecta de forma productiva células tumorales y normales

Sin excepción, el índice terapéutico asociado con virus oncolíticos existentes se debe a infección y/o productividad diferencial en células tumorales frente a normales. En el caso de rhabdovirus, las cepas oncolíticas actuales pueden “detectar” defectos específicos de cáncer en señalización de IFN de tipo I, que los hace selectivamente productivos en células transformadas. Desafortunadamente, los rhabdovirus oncolíticos actuales son altamente neurotóxicos cuando se suministran de forma local-regional en el SNC. Dado que el virus FMT es seguro cuando se infunde IC y es genéticamente muy distinto de los agentes existentes, se sospecha que su mecanismo para destrucción específica de tumor debe ser distinto de la productividad aumentada secundaria a defectos del IFN en células tumorales. Para comenzar a evaluar esta hipótesis, se infectaron células SNB19 y AHN con virus rec-FMT-GFP y se evaluó la expresión de GFP y la producción de proteína vírica a lo largo del tiempo. La microscopía de fluorescencia y los análisis de inmunotransferencia demostraron claramente que el virus FMT no distingue el tumor de células normales mediante infectividad diferencial o producción de proteína vírica (Figura 6A-B). Específicamente, la expresión de proteína tanto GFP como FMT se hizo fácilmente detectable 6,5-16 horas después de la infección y continuó expresándose fuertemente 72 horas después, independientemente del estado transformado de la línea celular infectada. En paralelo, se realizó evaluación de crecimiento de una etapa de virus FMT en diversas líneas celulares tumorales y normales para examinar la productividad. Estos experimentos mostraron que las partículas de virus FMT infecciosas se producen rápidamente (en un periodo de 6,5 horas) y hasta altos títulos (~108 ufp) en líneas celulares tanto tumorales como normales (Figura 6B). Colectivamente, estos datos demuestran que, en claro contraste con la serie VSV Δ51 y Maraba MG1 de rhabdovirus oncolíticos, el virus FMT es igualmente productivo en células normales en comparación con tumorales.

Se investigó por lo tanto la interacción entre virus FMT y la respuesta de interferón de tipo I. Se añadió virus rec-FMT

o Maraba-Δ51 que expresaba GFP a baja moi a una monocapa celular GM38, y se midió el tamaño de focos infecciosos y placas. Como se esperaba, la infección por Maraba-Δ51 no infectó ni destruyó células GM38 a no ser que la respuesta inmunitaria innata estuviera bloqueada a priori por tratamiento con la proteína B18R inhibidora de interferón de tipo I derivada de virus vaccinia (W-B18R, Figura 6C-D). Por el contrario, el virus FMT formó focos infecciosos de tamaño moderado en las células GM38, pero no las destruyó, y no se vio afectado por el pretratamiento por B18R. Además, a diferencia de Maraba-Δ51, el virus FMT bloqueó completamente la producción de interferón de tipo I en células PC3 como se midió en un bioensayo de interferón (Figura 6E). Colectivamente, estos resultados indican que, a diferencia del arsenal actual de rhabdovirus oncolíticos modificados por ingeniería genética, el virus FMT bloquea de forma fuerte la respuesta de interferón de tipo I humana y puede infectar productivamente líneas celulares tanto normales como tumorales, lo que apunta hacia un mecanismo selectivo de cáncer nuevo para este agente oncolítico.

En la Figura 6 se muestra A) transferencia de Western que demuestra cinética similar de infección por virus FMT y producción de proteínas tanto en células tumorales cerebrales humanas (SNB19) como en astrocitos humanos normales primarios (NHA). B) Curva de crecimiento de una única etapa que muestra replicación de virus idéntica y productividad de virión de células tumorales (SNB19) y normales (NHA) después de infección con FMT. C) Microscopía de fluorescencia de virus rec-FMT o Maraba-Δ51 que expresa GFP añadido a una monocapa de células GM38, y se midieron los tamaños de focos infecciosos y placas lo que mostró que la infección por Maraba-Δ51 no infectaba o destruía células GM38 a no ser que la respuesta inmunitaria innata se bloqueara por tratamiento con la proteína B18R inhibidora de interferón de tipo I derivada de virus vaccinia (W-B18R) mientras que el virus FMT formó focos infecciosos en células GM38 y no se vio afectado por el pretratamiento con B18R. D) Tamaño de focos infecciosos determinado a partir de microscopía de fluorescencia. E) El bioensayo de interferón en células PC3 muestra que a diferencia de Maraba-Δ51, FMT bloquea la producción de interferón de tipo I.

Ejemplo 7: el virus Farmington induce selectivamente apoptosis en células tumorales

Se usó el sistema de células NT2 que consiste en células de teratocarcinoma NT2 transformadas que pueden inducirse para diferenciarse en neuronas postmitóticas con ácido retanoico. Después de infección con VSV o FMT de tipo silvestre se observó que estos virus infectaban y producían descendencia infecciosa en el mismo grado en formas cancerosas o no cancerosas de las células NT2 (Figura 7A). Sin embargo, aunque estos virus eran fuertemente citotóxicos para células NT2 malignas, FMT no mostró casi toxicidad en células NT2 postmitóticas diferenciadas (Figura 7B). Esto indicó que a diferencia de otros rhabdovirus oncolíticos como VSV, el virus FMT parecía tener un mecanismo único de selectividad tumoral que actuaba en el nivel de citotoxicidad.

Los rhabdovirus destruyen células permisivas por apoptosis, activadas mediante degradación mediada por virus de proteínas solamente BH3 clave, un acontecimiento que en última instancia interacciona con las caspasas intracelulares y extracelulares apicales que inician la cascada de muerte celular irreversible. Para determinar si el virus FMT destruye selectivamente células tumorales mediante inducción diferencial de apoptosis, se evaluó el estado de activación de proteínas clave en la jerarquía apoptótica. Como se esperaba, el marcador de apoptosis sustituto PARP así como el efector corriente abajo caspasa 3 se activaron fuertemente en SNB19 pero no células NHA tratadas con virus FMT (Figura 7C), lo que indica la presencia de apoptosis. Además, las caspasas activadoras 8 y 9 interaccionaron en las células tumorales pero no en las células normales. Los datos del sistema celular NT2 son coherentes con estos datos de apoptosis en las líneas celulares transformadas frente a normales lo que muestra

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2