ES2809216T3 - Vacuna de ADN contra pseudotuberculosis en peces marinos - Google Patents
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Abstract
Una vacuna de ADN para peces, caracterizada por: - impartir inmunidad contra la pseudotuberculosis causada por Photobacterium damselae subsp. piscicida - que comprende, como ingrediente activo: un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico contra Photobacterium damselae subsp. piscicida; un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos preparada modificando la secuencia basada en el uso de un codón en la platija japonesa; o un vector de expresión que comprende el ADN, en la que el polipéptido inmunogénico es: (1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o (3) un polipéptido homólogo con inmunogenicidad contra Photobacterium damselae subsp. piscicida, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o un fragmento parcial inmunogénico de uno cualquiera de los polipéptidos (1) a (3), por medio del cual la longitud del fragmento parcial no está limitada, siempre que un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos parcial pueda inducir inmunidad, incluyendo inmunidad humoral e inmunidad celular, contra Photobacterium damselae subsp. piscicida en el cuerpo vivo.
Description
DESCRIPCIÓN
Vacuna de ADN contra pseudotuberculosis en peces marinos
Campo técnico
La presente invención se refiere a una vacuna de ADN para inducir inmunidad protectora contra una infección a peces por Photobacterium damselae subsp. piscicida, que es una bacteria causante de la pseudotuberculosis. El término "pseudotuberculosis" como se usa en la presente memoria significa pseudotuberculosis causada por la infección de P. damselae subsp. piscicida. Por lo tanto, no solo la pseudotuberculosis se desarrolló en Amberjacks, sino que también se desarrolló pasteurelosis causada por la misma bacteria causante en peces que no son colas amarillas [por ejemplo, peces que pertenecen a Perciformes (porgy negro japonés, pargo rojo, mero rojo y similares), peces que pertenecen a Osmeriformes (ayu de agua dulce, y similares), y se incluye el pescado que pertenece a Tetraodontiformes (scraper negro, y similares)].
Técnica Antecedente
En la industria de la acuicultura de muchos organismos acuáticos, como peces y mariscos, las enfermedades virales y bacterianas en un área de acuicultura, que es un sistema cerrado, se han convertido en serios problemas, ya que los individuos están presentes en una alta densidad y, por lo tanto, el impacto de estas infecciones es bastante grande.
La pseudotuberculosis (también conocida como pasteurelosis) fue reportada por primera vez como causa de enfermedad de una mortalidad masiva de la perca blanca (Roccus americanus) en la bahía de Chesapeake, EE. UU. en 1963 (Literatura de No Patente 1). En Japón, su aparición se observó en el rabo amarillo acuícola (peces de 0 años) en el suroeste de Shikoku en 1968, y se propagó en el rabo amarillo acuícola en la mayor parte del oeste de Japón al año siguiente, en 1969. Además, se produjo pseudotuberculosis en varios peces, como el porgy negro japonés, el besugo rojo, el mero rojo, el ayu de agua dulce y el scraper negro, así como el rabo amarillo, y dado que esta enfermedad tiene un nivel de contagio muy alto, se ha convertido en un problema que amenaza la acuicultura marina (Literatura de No Patente 1).
P. damselae subsp. piscicida pertenece al género Photobacterium, y es una bacteria gramnegativa, anaeróbica facultativa, no móvil, con forma de varilla corta (0,6 a 1,2 pm * 0,8 a 2,6 pm). Su temperatura óptima de crecimiento es de 25 a 30 °C, su pH óptimo es de 7,5 a 8,0 y su concentración óptima de cloruro de sodio es de 2 a 3%. Es sensible a la ampicilina, al ácido oxolínico, al florfenicol y similares. Los síntomas de esta enfermedad se caracterizan por una formación de pequeñas manchas blancas que tienen un diámetro de aproximadamente 1 mm en el riñón y el bazo. Las colonias de la bacteria se colocan en pequeñas manchas blancas, y muchas de ellas forman nódulos rodeados de tejido fibroso. La formación de estas colonias bacterianas se basa en una formación de bolas bacterianas en capilares o tejido intersticial, al resistir la digestión intracelular por los fagocitos y causar el crecimiento dentro de los fagocitos (Literatura de No Patente 2).
Una vacuna inactivada contra la enfermedad ya ha sido aprobada en Japón, pero la vacuna activada es difícil de inducir inmunidad celular. Sin embargo, el desarrollo de vacunas que tienen una alta inducibilidad de inmunidad celular no está progresando (Literaturas de Patente 1 y 2).
En general, las vacunas se usan para la prevención o el tratamiento de infecciones bacterianas. Las vacunas incluyen vacunas inactivadas (encefalitis japonesa, enfermedad de Weil y similares), toxoides (tétanos, difteria y similares), vacunas atenuadas (BCG, polio y similares), vacunas recombinantes (virus de la hepatitis B y similares), y similares. Las vacunas inactivadas y los toxoides preparados mediante la desintoxicación de una exotoxina inducen anticuerpos contra estas vacunas, y son vacunas relativamente seguras. Las vacunas recombinantes no contienen impurezas y, por lo tanto, se cree que son vacunas más seguras, en comparación con las vacunas inactivadas.
Sin embargo, aunque estas vacunas pueden inducir la producción de anticuerpos, es una desventaja que la inmunidad celular es difícil de inducir. Además, con respecto a las vacunas inactivadas y las vacunas atenuadas, es industrialmente necesario obtener una gran cantidad de proteína como antígeno, y es esencial cultivar un patógeno apropiado. Además, los efectos inmunitarios adquiridos por las vacunas atenuadas a menudo se mantienen durante un largo período de tiempo, pero se señalan los efectos secundarios y los riesgos. Con respecto a las vacunas inactivadas y las vacunas recombinantes, se cree que la persistencia del antígeno es corta en un huésped, y necesita un adyuvante y similares. Con respecto a estas vacunas convencionales, dado que el almacenamiento refrigerado es necesario durante un período desde la fabricación hasta la inoculación en los sujetos, existe el problema de que se produce un aumento en el costo y una disminución en la potencia. Con el progreso reciente en la investigación y el desarrollo de vacunas, se ha desarrollado un nuevo tipo de
vacuna (vacuna de ADN), que brinda inducción inmunitaria mediante la administración de un ADN plasmídico que codifica una proteína inmunogénica, y ha ido mejorando las desventajas de las vacunas convencionales, como se describe a continuación. Es decir, las ventajas de la vacuna de ADN son: dado que puede inducir fuertemente no solo la respuesta inmunitaria humoral, sino también la inmunidad celular, puede impartir una actividad protectora contra enfermedades infecciosas; que puede ser altamente purificado; que, dado que es estable a temperatura ambiente o incluso a altas temperaturas, el almacenamiento refrigerado no es esencial y puede almacenarse durante un largo período de tiempo; que puede modificarse fácilmente mediante técnicas de ingeniería genética; que el tiempo dedicado al desarrollo de la vacuna puede acortarse; y similares.
Se sabe que una respuesta inmunitaria en la trucha arcoíris y la platija puede ser estimulada por inyección intramuscular de un gen que codifica la glucoproteína, como proteína constituyente, de los rabdovirus (Literatura de No Patente 3). Además, hay un reporte acerca de vacunas de ADN para trucha arcoíris y platija (Literatura de No Patente 4). Sin embargo, no hay reportes acerca de vacunas de ADN en otros peces.
La Literatura de Patente 3 describe un derivado de una proteína extracelular de 55 kDA de Photobacterium damselae subsp. Piscicida es la base de una vacuna contra la infección por Photobacterium y, por lo tanto, protege a los peces de la pasteurelosis.
La Literatura de Patente 4 describe un procedimiento de inmunización de especies acuícolas mediante la introducción de sistemas de expresión de ADN en las especies acuícolas.
La Literatura de No Patente 5 describe dos clones diferentes de codificación de proteínas antigénicas (PPA1 y PPA2) que fueron aislados usando suero de conejo anti-Pasteurella piscicida a partir de una biblioteca de ADN genómico de la cepa KP9038 de P. piscicida.
Lista de citas
Literatura de Patente
[Literatura de Patente 1] JP H09-176043 A
[Literatura de Patente 2] JP 2002-003400 A
[Literatura de Patente 3] WO 2005/014629 A2
[Literatura de Patente 4] EP 1538210 A2
Literatura de No Patente
[Literatura de No Patente 1] S. F. Snieszko et al., Bacteriology, (USA), 1964, vol. 88, p. 1814-1814.
[Literatura de No Patente 2] Hisashi Wakabayashi y Kiyokuni Muroga ed., Gyokai-rui no KansenshoKiseichu-sho (Infectious and parasitic diseases of fish and shellfish [Enfermedades infecciosas y parasitarias de peces y mariscos]), (KOUSEISHA KOUSEIKAKU Co., Ltd.), 2004, p.206-211.
[Literatura de No Patente 3] P. Boudinot et al., Virology, (USA), 1998, vol. 249, p.297-306.
[Literatura de No Patente 4] McLauchlan et al., Fish and Shellfish Immunology (Inmunología de peces y mariscos), (Reino Unido), 2003, vol. 15, p. 39-50.
[Literatura de No Patente 5] Ikuo Hirone et al. "Identification of major antigenic proteins of Pasteurella piscicidal (Identificación de las principales proteínas antigénicas de Pasteurella piscicida)", Microbial Pathogenesis, 1 de enero de 1997, p. 371-380.
Sumario de la invención
Problema técnico
Un objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna de ADN para peces para inducir inmunidad protectora contra la pseudotuberculosis. La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier otro aspecto o realización establecido en la presente memoria que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones únicamente tiene fines informativos.
Solución al problema
Los inventores de la presente invención llevaron a cabo estudios intensivos sobre vacunas eficaces contra la pseudotuberculosis en peces marinos y, como resultado, se administraron ADN plasmídicos que contienen un gen que codifica una lipoproteína (ppa1: SEQ ID NO: 1), una serina proteasa DegQ (ppa2: SEQ ID NO: 3), o un precursor de la proteína A de la membrana externa (ppars1: SEQ ID NO: 5) de P. damselae subsp. piscicida, como una mezcla o por separado, a la platija japonesa (Japanese flounder) y al pez limón (Greater amberjack), y se descubrió que estos ADN tenían efectos inmunitarios contra la pseudotuberculosis en los peces marinos y que aumentaban los niveles de expresión de los genes relacionados con el sistema inmunitario. Además, estas
secuencias fueron modificadas de acuerdo con el uso de codones en platija para preparar genes artificiales (SEQ ID NO: 7, 9 y 11), y los ADN plasmídicos que contienen estas secuencias fueron administrados de manera similar. Como resultado, se confirmó que cada uno exhibía altos efectos de protección inmunológica, y se completó la presente invención.
La presente invención se refiere a:
[1] Una vacuna de ADN para peces, caracterizada por:
- impartir inmunidad contra la pseudotuberculosis causada por Photobacterium damselae subsp.
piscicida;
- que comprende, como ingrediente activo:
un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico contra Photobacterium damselae subsp. piscicida un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos preparada modificando la secuencia basada en un uso de codón en platija japonesa; o un vector de expresión que comprende el ADN,
en el que el polipéptido inmunogénico es:
(1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; o
(3) un polipéptido homólogo con inmunogenicidad contra. Photobacterium damselae subsp. piscicida, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; o
un fragmento parcial inmunogénico de cualquiera de los polipéptidos (1) a (3), por medio del que la longitud del fragmento parcial no está limitada, siempre que un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos parcial pueda inducir inmunidad, incluyendo inmunidad humoral e inmunidad celular, contra Photobacterium damselae subsp. piscicida en el cuerpo vivo.
[2] la vacuna de ADN para peces de acuerdo con [1], en la que la secuencia de nucleótidos es:
(1) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o 7; o
(2) una secuencia de nucleótidos que tiene una homología del 80% o más con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o 7, y que codifica un polipéptido con inmunogenicidad contra Photobacterium damselae subsp. piscicida o un fragmento parcial inmunogénico de cualquiera de las secuencias de nucleótidos (1) y (2), por lo que la longitud del fragmento parcial no está limitada, siempre que un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos pueda inducir inmunidad, incluyendo inmunidad humoral e inmunidad celular, contra Photobacterium damselae subsp. piscicida en el cuerpo vivo.
[3] la vacuna de ADN para peces de acuerdo con [1], en la que el vector de expresión es un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o 7.
[4] una vacuna de ADN para peces de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3] para su uso en un procedimiento de prevención de pseudotuberculosis, en la que el procedimiento se caracteriza por administrar la vacuna de ADN para peces de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] a peces.5
[5] la vacuna de ADN para peces para uso de acuerdo con [4], en la que el pescado es pescado que pertenece a Perciformes, Tetraodontiformes u Osmeriformes.
Además, la presente invención se refiere a:
un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico contra Photobacterium damselae subsp. piscicida, o un vector de expresión que comprende el ADN, para una vacuna de ADN para peces, o para la prevención de pseudotuberculosis, y el uso de un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico contra Photobacterium damselae subsp. piscicida, o un vector de expresión que comprende el ADN, en la fabricación de una vacuna de ADN para peces.
Efectos ventajosos de la invención
De acuerdo con la vacuna de ADN para peces de la presente invención, se puede impartir la inmunidad contra la pseudotuberculosis causada por P. damselae subsp. piscicida. Más particularmente, la vacuna de ADN para
peces de la presente invención puede inducir una respuesta inmunitaria (que incluye una respuesta inmunitaria humoral y una respuesta inmunitaria celular) contra enfermedades infecciosas de P. damselae subsp. piscicida o pseudotuberculosis causada por la infección de P. damselae subsp. piscicida y, por lo tanto, es eficaz en la prevención de la infección de P. damselae subsp. piscicida, o la prevención de pseudotuberculosis. Por ejemplo, los plásmidos que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o 7, que pueden usarse como ingrediente activo de la vacuna de ADN para peces de la presente invención, son eficaces para el ingrediente activo de la vacuna de ADN, sobre la base de una prueba de protección contra la infección de P. damselae subsp. piscicida en peces marinos, y los resultados en los que se confirmaron incrementos notables en los niveles de expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario y, por lo tanto, se puede esperar que los plásmidos prevengan la infección de P. damselae subsp. piscicida en peces marinos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura1 es un gráfico que muestra, con una mortalidad acumulada después del desafío de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02 (inmersión a 1,0*105 ufc/ml), el cambio en una tasa de mortalidad acumulativa en platija japonesa tratada con vacunas de ADN (ppal-salvaje, ppa2-salvaje o pparsl-salvaje), en un grupo de inmersión a 1,0*105 ufc/ml.
La Figura2 es un gráfico que muestra, con una mortalidad acumulada después del desafío de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02 (inmersión a 1,0*105 ufc/ml), el cambio en una tasa de mortalidad acumulativa en platija japonesa tratada con vacunas de ADN (ppal-salvaje u opt-ppa1), en un grupo de inmersión a 1,0*105 ufc/ml.
La Figura3 es un gráfico que muestra, con una mortalidad acumulada después del desafío de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02 (inmersión a 1,0*105 ufc/ml), el cambio en una tasa de mortalidad acumulativa en platija japonesa tratada con vacunas de ADN (ppa2-salvaje u opt-ppa2), en un grupo de inmersión a 1,0*105 ufc/ml.
La Figura4 es un gráfico que muestra, con una mortalidad acumulada después del desafío de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02 (inmersión a 1,0*105 ufc/ml), el cambio en una tasa de mortalidad acumulada en platija japonesa tratada con vacunas de ADN (ppa3-salvaje u opt-ppa3), en un grupo de inmersión a 1,0*105 ufc/ml.
Descripción de realizaciones
La vacuna de ADN para peces de la presente invención no está limitada, siempre que se trate de un constructo de ADN que comprende al menos una (es decir, una o más) secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico contra P. damselae subsp. piscicida. Ejemplos de la vacuna de ADN para peces de la presente invención incluyen:
(a) un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico contra P. damselae subsp. piscicida, y
(b) un vector de expresión que comprende el ADN (a).
El ADN (a) puede contener además varias secuencias reguladoras requeridas para la expresión del polipéptido inmunogénico, y el vector de expresión (b) también puede contener tales secuencias reguladoras.
El término "polipéptido inmunogénico contra pseudotuberculosis" como se usa en la presente memoria significa un polipéptido capaz de inducir inmunidad (incluyendo inmunidad humoral e inmunidad celular) contra P. damselae subsp. piscicida en el cuerpo vivo.
El polipéptido inmunogénico contra P. damselae subsp. piscicida no está limitado, siempre que sea un polipéptido capaz de inducir inmunidad (incluyendo inmunidad humoral e inmunidad celular) contra P. damselae subsp. piscicida en el cuerpo vivo. El polipéptido inmunogénico es un polipéptido codificado por ppal de P. damselae subsp. piscicida, o su fragmento parcial, y un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o su fragmento parcial.
Ejemplos del polipéptido inmunogénico además incluyen:
(1) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
(2) un polipéptido modificado con inmunogenicidad contra Photobacterium damselae subsp. piscicida, que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se delecionan, sustituyen o añaden en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y
(3) un polipéptido homólogo con inmunogenicidad contra Photobacterium damselae subsp. piscicida, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y un fragmento parcial de cualquiera de los polipéptidos (1) a (3).
La vacuna de ADN para peces de la presente invención puede ser una vacuna de ADN capaz de inducir solo un polipéptido inmunogénico (ppa1 o solo el polipéptido modificado u homólogo del mismo), o una vacuna de ADN capaz de inducir dos o más polipéptidos inmunogénicos (preferentemente una combinación de ppa1 o el polipéptido modificado u homólogo del mismo con uno o más polipéptidos seleccionados de los polipéptidos codificados por ppa1, ppa2 y ppars1, y los polipéptidos modificados u homólogos del mismo). Ejemplos de estos últimos incluyen una combinación de la proteína ppa1 (o su polipéptido modificado u homólogo) y la proteína ppa2 (o su polipéptido modificado u homólogo), una combinación de la proteína ppa1 (o su polipéptido modificado u homólogo) y la proteína ppars1 (o su polipéptido modificado u homólogo), y una combinación de la proteína ppa1 (o su polipéptido modificado u homólogo), la proteína ppa2 (o su polipéptido modificado u homólogo) y la proteína ppars1 (o su polipéptido modificado u homólogo).
El "polipéptido modificado" como se usa en la presente memoria significa una proteína en la que uno o más (por ejemplo, 1 a varios, preferentemente 1 a 10, más preferentemente 1 a 5, aún más preferentemente 1 a 3, aún más preferentemente 1 a 2, y lo más preferentemente 1) aminoácidos son modificados (por ejemplo, se delecionan, sustituyen y/o agregan) en la secuencia de aminoácidos de un cierto número de SEQ ID, y la inmunidad todavía puede ser impartida al pez al que se puede aplicar la presente invención.
El término "identidad en secuencias de aminoácidos", como se usa en la presente memoria, significa una identidad calculada comparando y analizando dos secuencias de aminoácidos usando un software de análisis informático (software SDC), y considerando las dos secuencias de aminoácidos como iguales cuando un mismo tipo de aminoácido se encuentra en la misma posición.
Como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico, que se puede usar en la presente invención, se pueden ejemplificar las secuencias de nucleótidos mencionadas anteriormente que codifican cada polipéptido inmunogénico. Ejemplos de la secuencia de nucleótidos incluyen los polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, los polipéptidos modificados o los polipéptidos homólogos, y fragmentos parciales de los mismos.
Como la secuencia de nucleótidos:
(1) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, o
(2) una secuencia de nucleótidos que tiene una homología del 80% o más con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, y que codifica un polipéptido con inmunogenicidad contra Photobacterium damselae subsp. piscicida;
o un fragmento parcial de cualquiera de las secuencias de nucleótidos (1) y (2) es preferible.
El término "homología en secuencias de nucleótidos", como se usa en la presente memoria, significa un valor calculado comparando y analizando dos secuencias de nucleótidos usando un software de análisis informático (software SDC), y considerando las dos secuencias de nucleótidos como iguales cuando el mismo tipo de nucleótido se encuentra en la misma posición.
La longitud del fragmento parcial no está limitada, siempre que un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos parcial pueda inducir inmunidad (incluyendo inmunidad humoral e inmunidad celular) contra P. damselae subsp. piscicida en el cuerpo vivo.
La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico puede ser una secuencia natural, una secuencia completamente sintética o una secuencia parcialmente sintética que utiliza una secuencia natural. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico (por ejemplo, una lipoproteína), que puede usarse en la presente invención, puede obtenerse, por ejemplo, a partir de P. damselae subsp. piscicida Como un procedimiento típico para obtener la secuencia de nucleótidos usada en la presente invención, se puede ejemplificar un procedimiento convencional en el campo de la ingeniería genética, por ejemplo, un procedimiento de detección que usa una sonda de ADN apropiada diseñada con base en la información de una secuencia de aminoácidos parcial.
El vector de expresión usado en la presente invención no está limitado, siempre que sea un vector capaz de expresarse en células de peces. El vector de expresión usado en la presente invención puede construirse sobre la base de un vector autorreplicante, tal como un plásmido, que existe como un cuerpo independiente extracromosómico y no depende de la replicación cromosómica. El vector de expresión puede ser uno que puede incorporarse al genoma de un microorganismo huésped, cuando se transforma con el vector de expresión, y que puede replicarse junto con el cromosoma en el que se incorpora. El vector de expresión, que puede usarse en la presente invención, puede construirse de acuerdo con procedimientos y métodos ampliamente utilizados en el campo de la ingeniería genética.
Como la secuencia reguladora de la transcripción, que puede usarse en la presente invención, por ejemplo, se puede ejemplificar un promotor constitutivo, un promotor inducible o regulador, un promotor específico de tejido, un promotor derivado del gen de un antígeno expresado, o similares, pero la secuencia reguladora de la transcripción no se limita a estos promotores, siempre que pueda expresarse en células de peces. Los ejemplos del promotor constitutivo incluyen una secuencia promotora derivada del citomegalovirus (CMV), o promotores fuertes como el virus del sarcoma de Rous (RSV), el virus simio 40 (SV-40), el promotor de p-actina muscular, el virus del herpes simple (HSV), o similar. Como promotor específico de tejido, por ejemplo, puede ejemplificarse un promotor de timidina quinasa. Ejemplos del promotor inducible o regulador incluyen un promotor regulador de la hormona del crecimiento, un promotor que está bajo el control de una secuencia de operón lac, o un promotor de metalotioneína inducible por zinc. La secuencia reguladora de la transcripción puede estar operativamente unida a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico (es decir, para regular la expresión de la secuencia de nucleótidos).
La secuencia reguladora puede contener una secuencia reguladora de la expresión que incluye la secuencia de ADN del promotor (por ejemplo, el promotor inducible o constitutivo) y, si se desea, una copia o más copias seleccionadas de un elemento mejorador, una secuencia de intrones para empalmar una señal de transcripción o poliadenilación (por ejemplo, virus simio-40 (SV-40) o derivado de la hormona de crecimiento bovina), o una secuencia de ADN inmunoestimulante conocida como motivo CpG.
El vector de expresión puede contener, si se desea, por ejemplo, una secuencia de origen de replicación bacteriana, o un marcador de selección para la detección, tal como un gen con resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina) o un gen sin resistencia a antibióticos (por ejemplo, un gen de p-galactosidasa).
Se sabe que un oligonucleótido que contiene nucleótidos CpG no metilados activa el sistema inmunitario (A. Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549). Un determinado motivo CpG es inmunoestimulador contra una respuesta de células B o células T, dependiendo de una secuencia de flanqueo, y preferentemente estimula una determinada especie. La copia del motivo CpG en el vector de expresión de ADN funciona como un adyuvante que induce una respuesta inmunitaria contra la proteína expresada. El motivo CpG, es decir, una porción de alargamiento de ADN que contiene el dinucleótido CpG en la secuencia especificada, se puede seleccionar de longitudes de aproximadamente 5 a 40 pares de bases. Se pueden insertar motivos plurales en regiones no codificantes del vector de expresión. En el caso donde se desea una respuesta humoral, es preferible un motivo CpG que estimule la secreción de citocinas que se sabe que estimulan una respuesta de células T CD8+.
El pescado al que se aplica la presente invención no está limitado, siempre que pueda estar infectado con P. damselae subsp. piscicida. Ejemplos de los peces incluyen peces que pertenecen a Perciformes (cola amarilla, pez limón, porgy negro japonés, pargo rojo, mero rojo y similares), peces que pertenecen a Osmeriformes (ayu de agua dulce y similares) y peces que pertenecen a Tetraodontiformes (scraper negro y similares).
Ejemplos de un procedimiento para inocular la vacuna de ADN incluyen una administración oral, una inyección intramuscular, una inyección intraperitoneal, una administración que usa una pistola de genes y una inmersión, y es preferible la inyección intramuscular o la administración que usa una pistola de genes. La administración usando una pistola de genes es un procedimiento en el cual las partículas de oro que tienen un diámetro de aproximadamente 1 pm se recubren con el plásmido, y las partículas se inyectan en la piel, las células o el tejido de un sujeto con un instrumento específico, utilizando gas helio de alta presión, a la manera de una pistola de aire. La administración con una pistola de genes tiene características superiores, en comparación con la inyección intramuscular, de que se pueden lograr efectos inmunitarios equivalentes con el ADN en una cantidad de 1/100 a 1/1000, y que tiene una reproducibilidad superior a la inyección intramuscular.
Un adyuvante mejora una reacción inmunitaria contra un antígeno mediante la estimulación del sistema inmunitario, y generalmente se agrega a la vacuna como auxiliar. Por ejemplo, un compuesto de aluminio, un polinucleótido, un componente bacteriano de bacterias y similares son conocidos por los adyuvantes típicos, pero muchos de ellos no son suficientes para obtener los efectos de la presente invención. En particular, dado que la acción de los adyuvantes es ampliamente efectiva en las sustancias antigénicas, existe el riesgo de que aumente la estimulación antigénica de las impurezas contenidas en los antígenos o que aumenten los efectos secundarios nocivos, y existe un problema que es necesario considerar suficientemente a la pureza del antígeno utilizado. Bajo estas circunstancias, se ha reportado que, por ejemplo, IL-1p es eficaz como adyuvante (J. Y. Scheerlinck, Genetic Adjuvants for DNA Vaccine (Adyuvantes genéticos para vacuna de ADN), 19, 2647-2656, 2001). En la presente invención, se puede preparar un plásmido en el que se introduce un gen IL-1p para que pueda expresarse en el cuerpo vivo de los peces (por ejemplo, platija), y los peces pueden inocularse con el plásmido junto con la vacuna. de la presente invención.
El mecanismo inmunitario demuestra una variedad de funciones fisiológicas, mientras que las células que juegan diversos roles regulan mutuamente las funciones. La activación del sistema inmunitario se puede analizar utilizando, como índice, los niveles de expresión de un receptor de antígeno de células T (TCR), un complejo principal de histocompatibilidad (MHC) o una inmunoglobulina (Ig), que está presente en la superficie celular de
células T y células B, que son factores que juegan un papel importante en la defensa biológica. En la presente invención, por ejemplo, después de inocular la platija con la vacuna de ADN contra la pseudotuberculosis, para analizar la activación del mecanismo de defensa biológica en el cuerpo vivo de los peces, por ejemplo, un cambio en los niveles de expresión de TCR, MHC e Ig puede confirmarse cuantitativamente llevando a cabo una PCR en tiempo real, y puede analizarse la activación del sistema inmunitario.
La PCR en tiempo real es una técnica de detección monitorizando el proceso de amplificación génica por PCR en tiempo real, utilizando un dispositivo de detección de fluorescencia y perfilando la curva de reacción de PCR. Cuando una muestra a analizar se amplifica por PCR, se puede calcular la cantidad exacta de ADN examinando el número de ciclos de PCR que alcanzan la curva de aumento exponencial. La PCR en tiempo real se puede llevar a cabo utilizando, por ejemplo, TaqMan (Perkin-Elmer) y iCycler (BioRad).
En la PCR en tiempo real, se usan dos tipos de cebadores, un cebador para PCR en tiempo real (SG) y un cebador para ADN estándar (SG200). El cebador para PCR en tiempo real (SG) está diseñado para que el amplicón sea corto (60 a 100 pb) y el contenido de GC sea bajo. En el caso de que el cebador se diseñe en la porción 3' UTR, se puede diseñar un cebador específico de gen con relativa facilidad y precisión. Además, existe un procedimiento para diseñar el cebador en un ordenador utilizando un software (por ejemplo, primer express: PE Biosystems Japan Ltd.). El cebador para ADN estándar (SG200) está diseñado en el exterior del cebador diseñado en PCR en tiempo real. En el caso en que los genes se comparan entre sí, es preferible ajustar el amplicón.
En la preparación de ADN estándar, se usan cebadores específicos (SG200) correspondientes a cada gen a medir para llevar a cabo la PCR (volumen total: 50 jl) hasta que alcanza una meseta. En la PCR, después de una reacción a 95 °C durante 2 minutos, se repite un ciclo que consiste en reacciones a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos y a 72 °C durante 1 minuto 30 veces. Posteriormente, los productos de PCR resultantes se someten a una columna (por ejemplo, Dispositivos de Filtro Centrífugo Microcon-PCR; MILLIPORE) para eliminar el exceso de cebadores, y se mide la concentración. El número de copias se calcula a partir de la constante de Avogadro (1 mol = 6,022 * 1023 moléculas). A continuación, cada producto de PCR se diluye para preparar una serie de diluciones (21 etapas, número de copia: 1013 a 10-7), y la PCR se llevó a cabo utilizando los cebadores (SG) que están diseñados en el interior. Esta PCR se lleva a cabo en un número de ciclo de 14 ciclos para que la amplificación ocurra exponencialmente. Los resultados de PCR resultantes se someten a electroforesis en agarosa. Dado que la amplificación exponencial se produce en las siguientes 5 etapas después de que las bandas son completamente invisibles, estas 5 etapas se utilizan, como ADN estándar, en la verdadera PCR en tiempo real.
Ejemplos
La presente invención se ilustrará ahora adicionalmente, pero no se limita a los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 1: Aislamiento del gen ppal, el gen ppa2 y el gen pparsl derivados de P. damselae subsp. piscicida
(1) Preparación de cebadores de PCR
Los siguientes cebadores de PCR se prepararon de acuerdo con un procedimiento convencional, basado en las secuencias de nucleótidos de ADN correspondientes a un gen ppa1 (SEQ ID NO: 1), un gen ppa2 (SEQ ID NO: 3) y un gen ppars1 (SEQ ID NO: 5) derivado de P. damselae subsp. piscicida
ppa1-directo = 5'CGGAATTCACCATGAATCGTAAAGTAACTA 3' (SEQ ID NO: 13)
ppa1-inverso = 5'CCGCTCGAGCTTAGTGTAAGAACCAC 3' (SEQ ID NO: 14)
ppa2-directo = 5'CGGAATTCACCATGAGAAAACCTCTGCTTG 3' (SEQ ID NO: 15)
ppa2-inverso = 5'CCGCTCGAGACGCATGATTAAATACA 3' (SEQ ID NO: 16)
ppars1-directo = 5'CGGAATTCACCATGTCTAAAGTTCGTTATG 3' (SEQ ID NO: 17)
ppars1-inverso = 5'CCGCTCGAGTTCAGCAAGAACTTGAG 3' (SEQ ID NO: 18)
(2) Preparación de vacunas de ADN.
P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02 se inoculó en un medio líquido HI suplementado con NaCl al 2% y se cultivó con agitación a 25 °C durante la noche. Las células se recogieron y se suspendieron en un solvente para extracción (SDS al 0,5% y proteasa K 0,01 mg/ml), y se trataron a 37 °C durante 1 hora. Al líquido, se añadieron 100 j l de NaCl 5 mol/l y 84 j l de CTAB/NaCl y se mezclaron bien, y se trataron a 65 °C durante 10 minutos. La mezcla resultante se purificó usando un volumen igual de isopropanol/cloroformo, 600 j l de PCI y 99% de etanol a su vez. El sobrenadante se descartó y el ADN genómico como un gránulo se secó y se disolvió en 30 j l de un tampón TE.
El ADN genómico extraído se usó como plantilla para realizar una PCR, usando reactivos de reacción de PCR
disponibles comercialmente (ADN polimerasa ExTaq; Takara Shuzo Co., Ltd.), de acuerdo con un manual adjunto a los mismos, y los cebadores de PCR preparados en el Ejemplo 1(1), de acuerdo con un procedimiento convencional. En la pCr , se mezclaron 5 j l de 10xtampón añadido, 4 j l de dNTP, 1 j l de cebadores directo e inverso (25 pmol/jil), 0.5 j l de ADN polimerasa (5 unidades/jl), 1 j l de ADN (10 ng) y 37,5 j l de agua estéril para ajustar a 50 jl, y después de calentar a 95 °C durante 5 minutos, un ciclo compuesto de reacciones a 95 °C durante 30 segundos, a 53 °C durante 30 segundos y a 72 °C durante 1 minuto se repitió 30 veces y se realizó una reacción a 72 °C durante 5 minutos. Los productos resultantes se sometieron a electroforesis en gel de agarosa, y se confirmó visualmente que se amplificaron fragmentos de ADN de aproximadamente 0,2, 1,4 y 1,0 kbp.
(3) Análisis de secuencias de nucleótidos de ADN
Los fragmentos de ADN amplificados se insertaron en un vector pGEM-T Eazy (Promega), y las muestras se prepararon mediante un procedimiento didesoxi, usando un cebador M13 marcado fluorescente (Nisshinbo Industries Inc.) y un kit de secuenciación disponible comercialmente (Kit de Secuenciación del Ciclo de Cebador Etiquetado Fluorescente Thermo Sequence con 7-deaza-dGTP; amersham pharmacia bitech), y las secuencias de nucleótidos se determinaron usando un secuenciador de ADN (secuenciador de ADN modelo 4000; LI-COR). DE acuerdo con este análisis, los fragmentos de ADN amplificados por PCR contenían marcos de lectura abiertos que constaban de 249 pb (ppa1), 1356 pb (ppa2) y 996 pb (ppars1), respectivamente (SEQ ID NO: 1, 3 y 5). Las proteínas predichas a partir de estos o Rf tenían 89, 462 y 341 residuos de aminoácidos.
Ejemplo 2: Preparación del gen ppal modificado, el gen ppa2 y el gen pparsl en función del uso de codones en la platija japonesa
(1) Preparación de genes artificiales usando secuencias modificadas
Hay varios codones que especifican un aminoácido en cualquier especie, y los usos de los codones del mismo son diferentes entre sí. Un gen ppa1 (SEQ ID NO: 7), un gen ppa2 (SeQ ID NO: 9) y un gen ppars1 (SEQ ID NO: 11) en el que las secuencias de nucleótidos se modificaron con base en los usos del codón en P. damselae subsp. piscicida y platija japonesa se sintetizaron artificialmente y se insertaron en un plásmido.
Ejemplo 3: Preparación de plásmidos ppa1-salvaje, ppa2-salvaje, ppars1-salvaje, opt-ppa1, opt-ppa2 y opt-ppars1
Los plásmidos que se habían usado en el análisis de secuencias de nucleótidos de ADN en los Ejemplos 1(3) y 2(1) se trataron con EcoRI y XhoI. El gen ppa1, el gen ppa2 y el gen ppars1 derivado de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02, y el gen ppa1 artificial, el gen ppa2 artificial y el gen ppars1 artificial, que se extirparon de cada vector, se insertaron entre los sitios de reconocimiento EcoRI y XhoI de un sitio de clonación múltiple en dirección 3' de una secuencia que codifica una región del promotor de citomegalovirus humano de un vector pcDNA3.1/myc-his (Invitrogen), para preparar plásmidos ppa1-salvaje, ppa2-salvaje, ppars1-salvaje, optppa1, opt-ppa2 y opt-ppars1.
Ejemplo 4: Introducción de ADN plasmídicos a la platija japonesa
Los genes ppa1-salvaje, ppa2-salvaje, el ppars1-salvaje, opt-ppa1, opt-ppa2 y opt-ppars1 (10,0 jg/platija) se administraron en el músculo, junto con 100 j l de solución salina tamponada con fosfato (PBS), usando una jeringa con una aguja 29G.
Ejemplo 5: Prueba de protección contra infección en platija japonesa
Se usaron platijas japonesas jóvenes (longitud total: aproximadamente 8 cm, peso medio de pescado: 10,0 g) en cada grupo de prueba. Los peces de prueba fueron criados a una temperatura promedio de agua de 19.0 °C en un baño de agua de 60 l mientras circulaba agua de mar artificial.
De acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4, se administraron por separado 10,0 jg de ppa1-salvaje, ppa2-salvaje, ppars1-salvaje, opt-ppa1, opt-ppa2 y opt-ppars1 a la platija. Como controles, se administraron por separado 100 j l de PBS y 10,0 jg del vector pcDNA3.1. Después de 30 días de la administración, se obtuvo un medio de cultivo al cultivar P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02 en el medio líquido HI suplementado con NaCl al 2%, de manera similar a la del Ejemplo 1(2), se diluyó a 1,0*105 ufc/ml usando agua de mar artificial y se llevó a cabo una infección por inmersión durante 30 minutos. Los grupos de prueba en los que se realizó una prueba de protección contra la infección fueron los siguientes:
Grupo de prueba 1: ppa1-salvaje 10,0 jg/platija 1,0*105 ufc/ml de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02
Grupo de Prueba Comparativa 2: ppa2-salvaje 10,0 jg/platija 1,0*105 ufc/ml de P. damselae subsp.
piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02
Grupo de Prueba Comparativa 3: pparsl-salvaje 10,0 pg/platija 1,0*105 ufc/ml de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02
Grupo de prueba 4: opt-ppa1 10,0 pg/platija 1,0*105 ufc/ml de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02
Grupo de Prueba Comparativa 5: opt-ppa210,0 pg/platija 1,0*105 ufc/ml de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02
Grupo de Prueba Comparativa 6: opt-pparsl 10,0 pg/platija 1,0*105 ufc/ml de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02
Grupo de prueba 7: vector pcDNA3.1/myc-his 10,0 pg/platija 1,0*105 ufc/ml de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02
Grupo de prueba 8: PBS 100 pl/platija 1,0*105 ufc/ml de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02
Después de la infección de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02, se observaron las platijas durante 14 días y se calculó "una tasa de mortalidad acumulativa de platijas (población de muerte/población de prueba) * 100 (%)" en los grupos de prueba 1 a 8. Los resultados se muestran en las Figuras 1, 2, 3 y 4, y en la Tabla 1. "RPS" en la Tabla es una abreviatura de "supervivencia porcentual relativa", y se calcula mediante la siguiente ecuación:
RPS = {1 -(X /C )} x 100
[El símbolo "X" es "una tasa de mortalidad en cada grupo de vacunación (%)", y "C" es "una tasa de mortalidad en el grupo de control negativo"]
Los efectos de las vacunas se evaluaron por comparación.
Como resultado, las tasas de mortalidad en los grupos de prueba 1 a 6 fueron respectivamente de aproximadamente 17%, 8%, 58%, 8%, 17% y 15%, mientras que las de los grupos de prueba 7 y 8 fueron de 75% y 90% y, por lo tanto, se reveló que los genes ppa1-salvaje, ppa2-salvaje, ppars1-salvaje, opt-ppa1, optppa2 y opt-ppars1 fueron eficaces en la protección contra la infección de P. damselae subsp. piscicida cepa TUMSAT-PPE05-02, es decir, se revelaron los efectos de la vacuna.
Tabla 1
Aplicabilidad industrial
La vacuna de ADN de la presente invención se puede aplicar para la prevención de pseudotuberculosis en peces marinos.
Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a realizaciones específicas, diversos cambios y modificaciones obvios para los expertos en la materia son posibles sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Texto libre en el listado de secuencias
Las características de la "Secuencia Artificial" se describen en el identificador numérico <223> en el Listado de Secuencias. Más particularmente, las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, 9 y 11 son secuencias modificadas derivadas de P. damselae subsp. piscicida. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 es el cebador ppa1-directo. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 14 es el cebador ppa1-inverso. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 15 es el cebador ppa2-directo. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 16 es el cebador ppa2-inverso. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 17 es el cebador ppars1-directo. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18 es el cebador ppars1-inverso.
Claims (5)
1. Una vacuna de ADN para peces, caracterizada por:
- impartir inmunidad contra la pseudotuberculosis causada por Photobacterium damselae subsp. piscicida
- que comprende, como ingrediente activo:
un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico contra Photobacterium damselae subsp. piscicida;
un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos preparada modificando la secuencia basada en el uso de un codón en la platija japonesa; o
un vector de expresión que comprende el ADN,
en la que el polipéptido inmunogénico es:
(1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
(2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o (3) un polipéptido homólogo con inmunogenicidad contra Photobacterium damselae subsp. piscicida, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o
un fragmento parcial inmunogénico de uno cualquiera de los polipéptidos (1) a (3), por medio del cual la longitud del fragmento parcial no está limitada, siempre que un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos parcial pueda inducir inmunidad, incluyendo inmunidad humoral e inmunidad celular, contra Photobacterium damselae subsp. piscicida en el cuerpo vivo.
2. La vacuna de ADN para peces de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos es:
(1) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o 7; o
(2) una secuencia de nucleótidos que tiene una homología del 80% o más con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o 7, y que codifica un polipéptido con inmunogenicidad contra Photobacterium damselae subsp. piscicida; o
un fragmento parcial inmunogénico de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos (1) y (2), por medio del cual la longitud del fragmento parcial no está limitada, siempre que un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos parcial pueda inducir inmunidad, incluyendo inmunidad humoral e inmunidad celular contra Photobacterium damselae subsp. piscicida en el cuerpo vivo.
3. La vacuna de ADN para peces de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el vector de expresión es un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o 7.
4. Una vacuna de ADN para peces de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en un procedimiento de prevención de la pseudotuberculosis, en la que el procedimiento se caracteriza por administrar la vacuna de ADN para peces de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 a peces.
5. La vacuna de ADN para peces para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el pez es un pez que pertenece a Perciformes, Tetraodontiformes u Osmeriformes.
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