JP2011073990A - 海産魚のノカルジア症に対するdnaワクチン及びbcgワクチン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記ワクチンは、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Aをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを含む魚類用DNAワクチン、BCGワクチン、又はそれらの混合ワクチンである。
【選択図】なし
Description
本明細書における「ノカルジア・セリオレ症」とは、ノカルジア・セリオレの感染により引き起こされるノカルジア症を意味し、従って、ブリ属(ブリ、カンパチ、ヒラマサ)において発症したノカルジア症が含まれるだけでなく、ブリ属以外のスズキ目(マダイ、スズキ等)又はカレイ目(ヒラメ、カレイ等)に属する魚種等において発症したノカルジア症が含まれる。
ノカルジア症は、毎年8月から11月頃発生する。いったん発生すると終息まで長期間を要し、翌年の2月まで続くことがある(非特許文献1)。
ノカルジア症の原因菌はノカルジア・セリオレ(Nocardia seriolae)である。本菌は放線菌に分類され、弱抗酸性、グラム陽性の分岐する細菌である。ノカルジア症の病徴発現には2つの型が知られている。それらは躯幹に膿瘍や結節が形成される躯幹結節型と鰓に結節が形成される鰓結節型である。後者は冬季に多発する傾向にある。躯幹結節型では脾臓、腎臓に粟粒状の結節が形成されるのが特徴であるが、多くの場合、心臓、鰾、鰓などにも形成される。また、心臓の結節や鰾内部にはかさぶた様の病巣が見られることがある。本症は1歳以上のブリに発生することが多く、慢性的病気である(非特許文献1)。
しかし、ノカルジア症に対するDNAワクチンの報告はない。
1.ノカルジア属(Nocardia)又はマイコバクテリウム属(Mycobacterium)に由来する、ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原を含むことを特徴とする、魚類用ワクチン、
2.ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、魚類用DNAワクチン、
3.前記免疫原性ポリペプチドが、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質A(fibronectin-binding protein A)又はその部分断片である、上記2に記載の魚類用DNAワクチン、
4.前記ポリペプチドが、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片である、上記3に記載の魚類用DNAワクチン、
5.前記免疫原性ポリペプチドが、(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、若しくは(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチド、又はそれらの部分断片である、上記2に記載の魚類用DNAワクチン、
6.前記ヌクレオチド配列が、(1)配列番号1で表されるヌクレオチド配列、若しくは(2)配列番号1で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの部分配列である、上記2に記載の魚類用DNAワクチン、
7.ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)に由来することを特徴とする、魚類用弱毒ワクチン、
8.ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、BCGである、上記7に記載の魚類用弱毒ワクチン、
9.上記2〜6のいずれかに記載の魚類用DNAワクチンと、上記7又は8に記載の魚類用弱毒ワクチンとを含む、混合ワクチン、
10.前記魚類がスズキ目又はカレイ目に属する魚である、上記1〜9のいずれかに記載のワクチン、
11.上記1〜10のいずれかに記載のワクチンを魚に投与することを特徴とする、海産魚類のノカルジア症の予防又は治療方法、
12.上記1〜10のいずれかに記載のワクチンの、海産魚類のノカルジア症に対する免疫応答の誘発への使用、
13.(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、及び(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチドからなる群から選んだポリペプチド、並びに
14.(1)配列番号1で表されるヌクレオチド配列、及び(2)配列番号1で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる群から選んだヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
に関するものである。
(a)ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は
(b)前記DNA(a)を含む発現ベクター
が含まれる。前記DNA(a)は、免疫原性ポリペプチドの発現に必要な各種の調節配列を更に含むことができ、前記発現ベクター(b)も、前記調節配列を含むことができる。
本明細書において「ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチド」とは、ノカルジア・セリオレに対する免疫(体液性免疫及び細胞性免疫を含む)を生体内で誘導することのできるポリペプチドを意味する。
(1)DNAワクチンの作製
ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質A[fibronectin-binding protein A(fbpA)]遺伝子をCMVプロモーターの下流に組み込んだ組換えプラスミドをDNAワクチンとして用いた。ノカルジア・セリオレfbpA遺伝子のアミノ酸コード領域をはさむように設計したPCRプライマー[フォワード:5’-GGGAAGCTTAACATGCGAGGCGATAGACGTCA-3’(配列番号3)、リバース:5’-GGGGGATCCGCCGATGTTCGTGGACAGGT-3’(配列番号4)]を用いてPCRを行い標的の配列を増幅した。次に、あらかじめプライマーの5’-側末端に付加させておいた制限酵素認識配列(フォワード:HindIII、リバース:BamHI)をそれぞれの酵素を用いて消化した後、CMVプロモーターを有する哺乳類用発現ベクターpcDNA3.1(+) myc-hisベクター(Invitrogen社)に挿入し、fbpA遺伝子のタンパク質発現プラスミド(CMV-fbpA)を作製した。これを大腸菌に形質転換し、培養することでCMV-fbpAを大量に得た。
弱毒ワクチン用のウシ型結核菌の弱毒株(Mycobacterium bovis BCG)の標準菌株(ヒト型結核菌青山B株)は1%小川培地に塗抹し、37℃で3週間培養したものを用いた。また、攻撃試験にはノカルジア症罹患ブリより単離されたノカルジア・セリオレを1%小川培地に塗抹し25℃で3週間培養したものを用いた。
1%小川培地上に生育したウシ型結核菌の弱毒株をかきとりガラスホモジナイザーを用いリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に分散させて、菌数が約1.0×108 CFU/mLとなるように調製したものをBCGワクチンとして用いた。また、CMV-fbpAを250μg/mLとなるようにPBSで希釈したものをDNAワクチンとして用いた。さらに、250μg/mLのCMV-fbpA DNAワクチン中にウシ型結核菌の弱毒株を約1.0×108 CFU/mLとなるように調製したものを混合ワクチンとして用いた。
体重約15g、体長約8cmのヒラメ稚魚の背筋に各ワクチンを100μL注射し、60Lの水槽で水温20℃のもと飼育し、免疫期間を4週間設けた。
1%小川培地上に生育したノカルジア・セリオレをかきとりガラスホモジナイザーを用いてPBS中に分散させ菌数が約4.0×105 CFU/mLとなるように調製し、それをワクチン接種魚の筋肉内に100μLずつ投与した。その後、免疫期間と同様の水槽で飼育し、攻撃開始後33日目までの累積死亡率を観察し記録した。
感染防御試験を行った区画は、次の通りである。
試験区1:(BCG 単独処理)+4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ/ヒラメ1尾
試験区2:(BCG+CMV-fbpA 混合ワクチン処理)+4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ/ヒラメ1尾
試験区3:(CMV-fbpA 単独処理)+4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ/ヒラメ1尾
試験区4:(PBS 対照)+4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ/ヒラメ1尾
試験区5:(CMVベクター 対照)+4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ/ヒラメ1尾
配列番号3の配列で表される塩基配列はフォワードプライマーであり、配列番号4の配列で表される塩基配列はリバースプライマーである。
Claims (14)
- ノカルジア属(Nocardia)又はマイコバクテリウム属(Mycobacterium)に由来する、ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原を含むことを特徴とする、魚類用ワクチン。
- ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、魚類用DNAワクチン。
- 前記免疫原性ポリペプチドが、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質A又はその部分断片である、請求項2に記載の魚類用DNAワクチン。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片である、請求項3に記載の魚類用DNAワクチン。
- 前記免疫原性ポリペプチドが、(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、若しくは(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチド、又はそれらの部分断片である、請求項2に記載の魚類用DNAワクチン。
- 前記ヌクレオチド配列が、(1)配列番号1で表されるヌクレオチド配列、若しくは(2)配列番号1で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの部分配列である、請求項2に記載の魚類用DNAワクチン。
- ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)に由来することを特徴とする、魚類用弱毒ワクチン。
- ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、BCGである、請求項7に記載の魚類用弱毒ワクチン。
- 請求項2〜6のいずれか一項に記載の魚類用DNAワクチンと、請求項7又は8に記載の魚類用弱毒ワクチンとを含む、混合ワクチン。
- 前記魚類がスズキ目又はカレイ目に属する魚である、請求項1〜9のいずれかに記載のワクチン。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のワクチンを魚に投与することを特徴とする、海産魚類のノカルジア症の予防又は治療方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のワクチンの、海産魚類のノカルジア症に対する免疫応答の誘発への使用。
- (1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、及び(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチドからなる群から選んだポリペプチド。
- (1)配列番号1で表されるヌクレオチド配列、及び(2)配列番号1で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる群から選んだヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
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