CN106102768B - 分枝杆菌抗原组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用作分枝杆菌疫苗的抗原组合物，该组合物包括(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包括与SEQ ID NO:6,12,2,18,8,10,16,4氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性多肽序列，或具有其至少50个连续氨基酸的其片段；或(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，或其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包括选自SEQ ID NO:5,11,1,17,7,9,15,3的多核苷酸序列。

Description

分枝杆菌抗原组合物
技术领域
本发明涉及分枝杆菌多核苷酸和多肽，涉及其片段或变异体，涉及与其结合的抗体，涉及载体和微生物载体，涉及治疗性组合物例如针对分枝杆菌感染的疫苗，并涉及检测分枝杆菌感染的组合物和方法。
诸如沙门氏菌(Salmonella)、耶尔森菌(Yersinia)、志贺氏菌(Shigella)、空肠弯曲菌(Campylobacter)、衣原体(Chlamydia)和分枝杆菌(Mycobacterium)物种的微生物能够引起细胞内感染。这些感染可以是仅仅细胞内的，或者可以包括细胞内和细胞外组分。通常，这些微生物不在体内自由循环(如在血液内)并且一般不适于药物治疗方案。
多重耐药性微生物的发展加剧了与治疗细胞内感染相关的难度。由于接近病原体的困难在于宿主防御能力，疫苗疗法对于细胞内微生物已经不奏效。
结核分枝杆菌(MTB)和密切相关的物种组成了分枝杆菌的小群体，被称为结核分枝杆菌复合群(MTC)。该群体包括5个不同的种：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、牛分枝杆菌(M.bovis)、坎纳分枝杆菌(M.caneti)和非洲分枝杆菌(M.africanum)。鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium subsp.paratuberculosis)在反刍动物体内引发约内氏病(Johne's disease)，牛分枝杆菌在牛体内引发结核病，鸟分枝杆菌(M.avium)和胞内分枝杆菌(M.intracellulare)在免疫功能低下的病人(例如AIDS病人，和骨髓移植病人)体内引发结核病，以及麻风分枝杆菌(M.leprae)在人体内引发麻风病。另一个重要的分枝杆菌种为母牛分枝杆菌(M.vaccae)。
作为结核病感染的病因，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)在世界范围内是由细菌感染疾病引起的死亡的主要原因——潜在的感染影响了多达三分之一的世界人口。世界卫生组织(WHO)估计每年在全球范围发生超过800万的新的肺结核(TB)病例，以及超过100万死亡。2005年最大数目的新的TB病例发生在东南亚(全球新发病例的34％)，在撒哈拉以南非洲的估计发病率为将近每10万人口350个病例。然而，TB感染不限于发展中国家：英国自20世纪80年代后期以来出现过结核病的复现，目前每年有超过8000个新的病例——比率为每10万人口14.0例。大约40％的新病例发生在伦敦地区，其中感染比率为每10万人口44.8例。
最佳的病人管理需要早期开始药物治疗以及尽快隔离感染个体。如果不治疗，带有活性TB疾病的每人平均将每年感染10-15个人。通常通过6个月的抗生素疗程来治疗TB感染；然而，病人对长期药物治疗依从性是不同的，病人经常在症状消失时停止治疗。不完成治疗可促使多重耐药性分枝杆菌的发展。
术语“潜伏”等同于“持续性”，是指低代谢活性的可逆状态，其中分枝杆菌细胞能够以有限的细胞分裂或没有细胞分裂存活一段时间。在潜伏(即潜伏感染)期间，与分枝杆菌感染相关的临床症状不会变得明显。然而，环境刺激可诱导潜伏分枝杆菌的重新激活。在活动性感染期间，分枝杆菌显示了高的代谢活性并迅速复制，导致了具有临床症状的活动性感染的发展。
体外研究已经表明，分枝杆菌例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)能够在营养贫瘠和氧气贫瘠的环境下适应并生存，并且能够在一定范围的营养可用性和氧气张力下生长。在体外适应于碳饥饿和/或低溶解氧气张力可引发向非复制持续状态的转换，该非复制持续状态类似于体内的潜伏。分枝杆菌的细胞内生存和增殖被怀疑是分枝杆菌疾病进展的主要的支持性因素。分枝杆菌潜伏感染的大量的无症状个体的存在是控制分枝杆菌感染的主要问题，尤其是结核分枝杆菌感染。另外，通过皮肤测试检测潜伏分枝杆菌感染的传统方法可受到BCG疫苗接种和暴露于环境分枝杆菌的损害。
疫苗预防结核分枝杆菌的有效性已经广泛变化。目前结核分枝杆菌疫苗BCG是牛结核杆菌的减毒株。它对于儿童中严重的TB并发症是有效的，但是在不同国家的成人中其有效性变化很大，特别是不同的种族。BCG疫苗用于预防结核性脑膜炎并辅助预防结核分枝杆菌向肺外部位扩散，但是并不预防感染。BCG的有限的效力以及TB的全球流行引导着世界范围内努力生产新的、更加有效的疫苗。反过来，这需要鉴别新的疫苗候选物。由于结核分枝杆菌的日益增长的威胁和全球流行，需要新的策略来更加有效的预防、治疗和诊断分枝杆菌感染。
本发明提供了抗原组合物，包括分枝杆菌抗原，其中所述抗原包括：
(i)与选自SEQ ID NOs:2,4,6,8,10.12,14,16和18的多肽的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少50个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码根据(i)的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ ID NOs:1,3,5,7,9,11,13,15和17的多核苷酸的核苷酸序列具有至少70％核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少150个连续核苷酸的其片段。
如本文所用术语“分枝杆菌的(mycobacterial)”或“分枝杆菌(mycobacterium)”涵盖了以下的物种：草分枝杆菌(M.phlei)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、坎纳分枝杆菌(M.caneti)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、海洋分枝杆菌(M.marinum)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、瘰疠分枝杆菌(M.scrofulaceum)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、日内瓦分枝杆菌(M.genavense)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、猿分枝杆菌(M.simiae)、斯氏分枝杆菌(M.szulgai)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、牦牛分枝杆菌(M.vaccae)、坎纳分枝杆菌(M.caneti)、石氏分枝杆菌(M.shimoidei)。特别感兴趣的是MTC成员，例如结核分枝杆菌。
术语抗原指能被免疫系统识别和/或刺激免疫应答的任何物质。例如，抗原可刺激细胞介导的免疫应答和/或可刺激抗体的生成。
在一个实施方案中，本发明的分枝杆菌抗原提供了针对涉及免疫细胞例如T细胞(CD4+和/或CD8+ T细胞)的感染的细胞介导的应答，和/或用Th1型细胞因子例如IFN-γ应答的能力。在一个实施方案中，分枝杆菌抗原诱导IFN-γ分泌细胞(如主要是CD4+ T细胞)。在这方面，目前的研究认为免疫细胞应答(特别是在诸如肺中的T细胞免疫应答)对于针对肺分枝杆菌疾病的保护可能是关键的。
在一个实施方案中，本发明的分枝杆菌抗原提供了针对分枝杆菌例如结核分枝杆菌的攻击的保护(比如长期保护)。通过举例，本发明的分枝杆菌抗原可以诱导“记忆T细胞”，其能够长期的(例如数十年)持续刺激保护性免疫。记忆免疫应答已归因于长期存在的、抗原特异性的T淋巴细胞的再激活，该T淋巴细胞由分化的效应T细胞直接产生并且以静息状态持续存在。记忆T细胞是异质的；至少两个亚群已被鉴别，它们具有不同的迁移能力和效应子功能。第一亚群的记忆T细胞被称为“效应记忆T细胞”(TEM)，由于其类似于初次应答生成的效应T细胞，在初次应答中它们缺失用于迁移到发炎组织的淋巴结归巢受体。一旦再次遭遇抗原，TEM迅速产生IFN-γ或IL-4，或释放预存的穿孔素(perforin)。第二亚群的记忆T细胞(被称为“中枢记忆细胞”(TCM))表达L-选择素和CCR7，并缺失即时的效应功能。TCM具有低的活性阈值并且当次级淋巴器官内被再次刺激时增殖并分化为效应子。
在一个实施方案中，分枝杆菌抗原提供了对于分枝杆菌(例如结核分枝杆菌)感染的中和抗体应答。在一个实施方案中，本发明抗原组合物中的每一分枝杆菌抗原独立诱导有效的免疫应答(例如细胞介导的免疫应答或抗体应答)。因此，根据本实施方案，在向受试者施用抗原组合物之后，随后在受试者中诱导针对抗原组合物中的每一分枝杆菌抗原的免疫应答。
在一个实施方案中，分枝杆菌抗原包括多肽序列(例如由多肽序列组成)。可选地，或另外，分枝杆菌抗原包括多核苷酸(如DNA或RNA)序列。
由SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16和18表示的分枝杆菌多肽的特定亚组(sub-set)是“潜伏-调节多肽”。由SEQ ID NOs:1,3,5,7,9,11,13,15和17表示的分枝杆菌多核苷酸的特定亚组是“潜伏-调节多核苷酸”。
在一个实施方案中，“潜伏-调节多肽”是由“潜伏-调节多核苷酸”编码的。通过示例的方式，潜伏调节多肽SEQ ID NO:2是由潜伏调节多核苷酸SEQ ID NO:1编码的；SEQ IDNO:4是由SEQ ID NO:3编码的；SEQ ID NO:6是由SEQ ID NO:5编码的；SEQ ID NO:8是由SEQID NO:7编码的；SEQ ID NO:10是由SEQ ID NO:9编码的；SEQ ID NO:12是由SEQ ID NO:11编码的；SEQ ID NO:14是由SEQ ID NO:13编码的；SEQ ID NO:16是由SEQ ID NO:15编码的；以及SEQ ID NO:18是由SEQ ID NO:17编码的。
潜伏-调节多肽或多核苷酸的表达或活性是响应于分枝杆菌潜伏而被调节的——例如响应于在诱导或保持分枝杆菌潜伏的环境下分枝杆菌(如MTB)的生长。
在一个实施方案中，潜伏-调节多肽或多核苷酸的表达或活性的“调节”响应于分枝杆菌潜伏的环境意指所述表达或活性响应于潜伏而被诱导或上调。因此，潜伏调节多肽或多核苷酸可以是“潜伏-诱导的”或“潜伏-上调的”多肽或多核苷酸。
例如，相比于非潜伏环境，潜伏-上调多肽或多核苷酸的表达或活性在潜伏环境下可上调至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、或50倍。可选的，本发明的多肽/多核苷酸的疫苗效力可通过小鼠脾细胞干扰素γ(IFN-γ)释放来测量——例如，所述多肽/多核苷酸展示了至少380个、至少400个、至少420个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个或更高的点形成单位/106(小鼠脾细胞IFN-γ释放)——见图1。可选的，本发明的多肽/多核苷酸的疫苗效力可通过相对于单独BCG的保护效力(％)来测量(即作为加强向BCG初免疫苗施用)——例如，所述多肽/多核苷展示了保护效力提高了至少120％、至少150％、至少180％、至少200％、至少220％、至少250％、至少300％，如通过细菌负荷(诸如在小鼠脾脏和/或肺脏中)测量的——参见图2和图3。
可在分枝杆菌天然环境中的潜伏期间，在体内诱导或上调潜伏-诱导的和潜伏-上调的多肽和多核苷酸的表达或活性。因此，本发明人相信潜伏-诱导或潜伏-上调的分枝杆菌多肽和多核苷酸代表了用于预防疾病的建立、传播和重激活的良好疫苗候选物和/或成为用于潜伏感染的良好的诊断工具。
在一个实施方案中，分枝杆菌抗原包括以下(或由以下组成)：与选自SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16和18的多肽的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性(例如至少75,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,99或100％氨基酸序列同一性)的多肽序列，或具有其至少50个连续氨基酸的其片段。SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16和18在下表1中定义：
表1
SEQ ID No. 多肽名称
2 Rv0982
4 Rv1462
6 Rv1937
8 Rv2500c
10 Rv2504c
12 Rv3270
14 Rv3537
16 Rv3608c
18 Rv3879c
因此，在本发明上下文中，“Rv0982多肽抗原”包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:2(或本文所定义的序列的“变异体”或“片段”)；“Rv1462多肽抗原”包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:4(或本发所定义的序列的“变异体”或“片段”)；“Rv1937多肽抗原”包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:6(或本发所定义的序列的“变异体”或“片段”)；“Rv2500c多肽抗原”包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:8(或本发所定义的序列的“变异体”或“片段”)；“Rv2504c多肽抗原”包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:10(或本发所定义的序列的“变异体”或“片段”)；“Rv3270多肽抗原”包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:12(或本发所定义的序列的“变异体”或“片段”)；“Rv3537多肽抗原”包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:14(或本发所定义的序列的“变异体”或“片段”)；“Rv3608c多肽抗原”包括以下或由以下组成：SEQID NO:16(或本发所定义的序列的“变异体”或“片段”)；“Rv3879c多肽抗原”包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:18(或本发所定义的序列的“变异体”或“片段”)。
在一个实施方案中，氨基酸序列同一性存在于长度为至少50个连续氨基酸残基(例如长度为至少75个、100个、150个、200个、250个、300个连续氨基酸残基)的多肽序列的区域。用于确定氨基酸序列同一性的常规方法随后将在说明书中进行详细讨论。
在第一分支杆菌抗原情形中，多肽的片段包括以下(或由以下组成)：该多肽的至少50个连续的氨基酸残基(例如该多肽的至少75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个连续的氨基酸残基)。该片段包括该多肽的至少一种抗原表位。多肽的片段具有的序列长度是全长多肽的序列长度的至少25％、50％、60％、70％、80％或90％。
在一个实施方案中，在第一分枝杆菌抗原的情形中，多肽的片段包括以下(或由以下组成)：所述多肽的截短形式。例如，多肽的片段可具有N末端截短(与所述多肽相比)，或多肽的片段可具有C末端截短(与所述多肽相比)。
在一个实施方案中，在第一分枝杆菌抗原的情形中，多肽的片段包括以下(或由以下组成)：多肽的成熟形式。例如，多肽可包括信号序列(即分泌/靶向序列)(例如在N末端)，以及多肽的片段可缺失这个信号序列。在一个实施方案中，片段是通过从多肽中切割信号序列而形成的。
在一个实施方案中，多肽SEQ ID NO:2的片段是SEQ ID NO:2的N末端截短的形式。在一个实施方案中，相比于SEQ ID NO:2的氨基酸序列，多肽SEQ ID NO:2的片段具有至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸残基的N末端截短。在一个实施例中，SEQ ID NO:2的片段至少包括SEQ ID NO:2的C末端50个、100个、150个、200个或250个氨基酸序列。类似的，在一个实施方案中，多肽SEQ ID NO:4,6,8,10,12,14,16,18的片段(分别)为SEQ IDNO:4,6,8,10,12,14,16,18的N末端截短形式。在一个实施例中，SEQ ID NO:4,6,8,10,12,14,16,18的片段是成熟的多肽序列，其通过(分别)去除N末端信号序列而不同于SEQ IDNO:4,6,8,10,12,14,16,18的序列。在一个实施方案中，相比于SEQ ID NO:4,6,8,10,12,14,16,18的氨基酸序列，多肽SEQ ID NO:4,6,8,10,12,14,16,18的片段(分别)具有5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、100个、150个、200个或250个氨基酸残基的N末端截短。在一个实施方案中，SEQ ID NO:4,6,8,10,12,14,16,18的片段(分别)至少包括SEQID NO:4,6,8,10,12,14,16,18的C末端50个、100个、150个、200个或250个氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的分枝杆菌抗原包括与选自SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16,18的多肽具有共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物活性的多肽或其片段。如本文所使用的，“共同的抗原交叉反应性”意指本发明的分枝杆菌多肽或片段和选自SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16,18的潜伏-调节多肽共享共同的诱导诸如T淋巴细胞(如CD4+、CD8+、效应T细胞或记忆T细胞如TEM或TCM)的免疫细胞的“回忆应答”的能力，其中该免疫细胞之前已经暴露于分枝杆菌感染的抗原组分。在过去的10多年里，已经建立了用于测量和定量免疫细胞应答(如T细胞应答)的新的免疫测定方法。例如，由于来自抗原-特异免疫细胞如T细胞的IFN-γ的分泌与针对结核分枝杆菌的保护良好相关，因此干扰素γ(IFN-γ)ELISPOT测定可用作免疫学读出。进一步，ELISPOT测定是非常可再现的并灵敏的方法，用于定量抗原特异性免疫细胞例如T细胞分泌的的IFN-γ数目。可选的，或另外，“共同的抗原交叉性反应”意指能够结合到本发明的分枝杆菌多肽或片段的抗体也将能够结合到相应的潜伏-调节多肽(SEQ ID NO:2,4,6,8,10,12,14,16,18)。
在一个实施方案中，分枝杆菌抗原包括以下，或由以下组成：编码上述定义的相应分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
因此，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包括以下(或由以下组成)：编码多肽的多核苷酸序列，该多肽包括(或由组成)与选自SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16,18的潜伏-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性(例如至少75、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、99或100％氨基酸序列同一性)的氨基酸序列，或具有其至少50个连续氨基酸的其片段(如上述所定义)。在一个实施方案中，分枝杆菌抗原包括(或由组成)与选自SEQ ID NOs:1,3,5,7,9,11,13,15,17的潜伏调节多核苷酸的核苷酸序列具有至少70％核苷酸序列同一性(至少75,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,99或100％核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列，或具有其至少150个连续核苷酸的其片段。使用中，所述多核苷酸为提供相应分枝杆菌抗原多肽/蛋白的形式(如载体)。因此，在一个实施方案中，分枝杆菌抗原是上述所定义的“分枝杆菌多核苷酸”(或片段)。SEQ ID NOs:1,3,5,7,9,11,13,15和17在下述表2中定义：
表2
SEQ ID No. 多核苷酸名称
1 Rv0982
3 Rv1462
5 Rv1937
7 Rv2500c
9 Rv2504c
11 Rv3270
13 Rv3537
15 Rv3608c
17 Rv3879c
因此，在本发明的上下文中，“Rv0982多核苷酸抗原”包含或由其组成：SEQ ID NO：1(或其“变异体”序列或如本文所定义的“片段”)；“Rv1462多核苷酸抗原”包含或由其组成：SEQ ID NO：3(或其“变异体”序列或如本文所定义的“片段”)；“Rv1937多核苷酸抗原”包含或由其组成：SEQ ID NO：5(或其“变异体”序列或如本文所定义的“片段”)；“Rv2500c多核苷酸抗原”包含或由其组成：SEQ ID NO：7(或其“变异体”序列或如本文所定义的“片段”)；“Rv2504c多核苷酸抗原”包含或由其组成：SEQ ID NO：9(或其“变异体”序列或如本文所定义的“片段”)；“Rv3270多核苷酸抗原”包含或由其组成：SEQ ID NO：11(或其“变异”序列或如本文所定义的“片段”)；“Rv3537多核苷酸抗原”包含或由其组成：SEQ ID NO：13(或其“变异体”序列或如本文所定义的“片段”)；“Rv3608c多核苷酸抗原”包含或由其组成：SEQ IDNO：15(或其“变异体”序列或如本文所定义的“片段”)；“Rv3879c多核苷酸抗原”包含或由其组成：SEQ ID NO：17(或其“变异体”序列或如本文所定义的“片段”)。
在一个实施例中，核苷酸序列同一性存在于长度为至少150个连续核苷酸残基(例如，长度为至少200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750个连续核苷酸残基)的多核苷酸序列的区域。用于确定核苷酸序列同一性的常规方法随后将在说明书中更加详细讨论。
在分枝杆菌抗原的情况下，该多核苷酸片段包括以下(或由以下组成)：所述多核苷酸的至少150个连续核苷酸残基(如该多核苷酸的至少200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750个连续核苷酸残基)。在一个实施方案中，多核苷酸片段的序列长度为该多核苷酸序列长度的至少25％、50％、60％、70％、80％或90％。
在一个实施方案中，分枝杆菌抗原的情况下，多核苷酸的片段包括(或由其组成)所述多核苷酸的截短形式。在一个实施方案中，相比于全长多核苷酸序列，多核苷酸的片段在5'端和/或3'末端截短。在一个实施方案中，多核苷酸的片段编码所述多肽的截短形式。例如，多核苷酸片段可编码N末端截短的和/或C-末端截短的多肽(与全长多核苷酸编码的多肽相比)。在一个实施方案中，在第一分枝杆菌抗原的情况下，多核苷酸的片段编码包括(或由其组成)成熟多肽的多肽。例如，全长多肽包括信号序列(即分泌/靶向序列)(如在N末端)，以及多核苷酸片段编码缺失这个信号序列的成熟多肽。
在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:1的片段是SEQ ID NO:1的5'截短形式。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:1的核苷酸序列相比，多核苷酸SEQ ID NO:1的片段具有100、200或300个核苷酸残基的5’截短。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:1的片段编码SEQ ID NO:2的N末端截短形式。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，多核苷酸SEQ ID NO:1的片段编码具有50、100、150、200或250个氨基酸残基的N末端截短的多肽。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:1的核苷酸序列相比，SEQ ID NO:1的片段包括3’端100、200或300个核苷酸残基。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:1的片段编码至少包括SEQ ID NO:2的C末端50、100、150、200、250或300个氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:3,5,7,9,11,13,15,17的片段(分别)是SEQ ID NO:3,5,7,9,11,13,15,17的5’截短形式。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:3,5,7,9,11,13,15,17的核苷酸序列相比，多核苷酸SEQ ID NO:3,5,7,9,11,13,15,17的片段(分别)具有25、50、75、100或125个核苷酸残基的5’截短。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ IDNO:3,5,7,9,11,13,15,17的片段(分别)编码SEQ ID NO:4,6,8,10,12,14,16,18的N末端截短形式。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:3,5,7,9,11,13,15,17的片段编码成熟多肽序列，其通过(分别)移除N末端信号序列而区别于SEQ ID NO:SEQ ID NO:4,6,8,10,12,14,16,18的序列。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:4,6,8,10,12,14,16,18的氨基酸序列相比，多核苷酸SEQ ID NO:3,5,7,9,11,13,15,17的片段(分别)编码具有5,10,15,20,25,30,35,40,50,100,150,200or 250个氨基酸残基的N末端截短的多肽。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:3,5,7,9,11,13,15,17核苷酸序列相比，SEQ ID NO:3,5,7,9,11,13,15,17的片段(分别)包括3’末端150、300、450、600或750个核苷酸残基。在一个实施方案中，SEQ IDNO:3,5,7,9,11,13,15,17的片段(分别)编码至少包括SEQ ID NO:4,6,8,10,12,14,16,18的C末端50、100、150、200或250个氨基酸序列多肽。
在一个实施方案中，该分枝杆菌多核苷酸或其片段，编码与选自SEQ ID NOs:2,4,6,8,10,12,14,16,or 18的潜伏-调节多肽具有共同抗原交叉反应性和/或基本上相同体内生物活性的多肽。例如，该第一分枝杆菌抗原可包括(或由其组成)多核苷酸序列，其编码能够诱发针对分枝杆菌感染的保护性免疫细胞应答(如T细胞应答)的多肽序列。举例来说，由第一分枝杆菌多核苷酸或片段编码的多肽与潜伏-调节多肽，共享有诱导诸如T淋巴细胞(如CD4+、CD8+、效应T细胞或记忆T细胞例如TEM或TCM)的免疫细胞“回忆应答”的共同的能力，其中该免疫细胞先前已经暴露于分枝杆菌感染的抗原组分。在这方面，来自诸如T细胞的抗原特异性免疫细胞的IFN-γ与针对结核分枝杆菌的保护良好相关。因此，干扰素γ(IFN-γ)ELISPOT测定是有用的免疫学读出，并能够可重现且灵敏的定量分泌IFN-γ的抗原特异性免疫细胞例如T细胞。可选的，或另外，能够结合到本发明分枝杆菌多核苷酸或片段编码的多肽的抗体也能够结合到潜伏-调节多肽(SEQ ID NO:2,4,6,8,10,12,14,16或18)。
除了第一分枝杆菌抗原外，本发明的抗原组合物可包括至少第二分枝杆菌抗原。第二分枝杆菌抗原可以是上述分枝杆菌抗原中的任一，并且优选是不同于该第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原能够诱发针对分枝杆菌感染的保护性免疫应答(例如T细胞应答)。在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括(如由其组成)多肽序列。在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括(如由其组成)多核苷酸序列例如DNA或RNA序列，或分枝杆菌糖脂，例如分枝杆菌磺基糖脂。在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括(如由其组成)分枝杆菌碳水化合物抗原，例如分枝杆菌糖或多糖。任选的，糖可以连接到(如化学缀合到)载体(如多肽)上以增强免疫原性。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原和第一分枝杆菌抗原之间的“区别”是通过针对第一和第二分枝杆菌抗原的免疫应答的特异性所定义。例如，在一个实施方案中，每一第一和第二抗原诱导基本上对该抗原具有特异性的免疫应答。第二分枝杆菌抗原和第一分枝杆菌抗原的“区别”可通过第一和第二分枝杆菌抗原之间的共同抗原交叉反应性的基本上缺少(如缺失)来定义。第二分枝杆菌抗原和第一分枝杆菌抗原之间的“区别”可选择性地(或另外地)定义为第一和第二分枝杆菌抗原之间基本上缺少(如缺失)共同的体内生物活性。
例如，在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原可显示(基本上)没有共同的抗原交叉反应性。在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原可显示(基本上)没有共同的体内生物活性。例如，第一和第二分枝杆菌抗原诱导不同的免疫应答和/或具有不同的体内生物活性。
在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原包括多肽(如本文所定义)，第二分枝杆菌与第一分枝杆菌抗原基本上不具有共同的抗原交叉反应性和/或与第一分枝杆菌抗原具有基本上不同的体内生物活性。在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原包括多核苷酸(如本文所定义)，第二分枝杆菌抗原编码多肽，其与第一分枝杆菌抗原编码的多肽基本上不具有共同的抗原交叉反应性。在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原包括多核苷酸(如本文所定义)，第二分枝杆菌抗原具有与第一分枝杆菌抗原基本上不同的体内生物活性和/或编码与第一分枝杆菌抗原编码的多肽具有基本上不同体内生物活性的多肽。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包括多肽以及第二分枝杆菌抗原包括多核苷酸(如本文所定义)，第二分枝杆菌抗原或其编码的多肽基本上不具有与第一分枝杆菌抗原大体上共同的抗原交叉反应性和/或具有与第一分枝杆菌抗原基本上不同的体内生物活性。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包括多核苷酸，以及第二分枝杆菌抗原包括多肽(如本文所定义的)，和第二分枝杆菌抗原基本上不具有与第一分枝杆菌抗原或其编码的多肽共同的抗原交叉反应性，和/或具有与第一分枝杆菌抗原或其编码的多肽基本上不同的体内生物活性。举例来说，在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原不共享有共同的诱导诸如T淋巴细胞(如CD4+、CD8+、效应T细胞或记忆T细胞如TEM或TCM)的免疫细胞“回忆应答”的能力，该免疫细胞以前已经接触到分枝杆菌感染的抗原组分。换言之，在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原是“不同的”，原因在于它们在不同的免疫细胞中(如T细胞)诱导回忆应答。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌多肽包括(或由其组成)抗原分枝杆菌多肽——即能够诱发针对分枝杆菌感染的保护性T细胞应答的分枝杆菌多肽。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括选自如上讨论的与第一分枝杆菌抗原相关的相同组多肽的多肽(优选第二分枝杆菌多肽不同于第一分枝杆菌多肽)。
因此，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括(或由其组成)与选自SEQ IDNOs:2,4,6,8,10,12,14,16,18的潜伏-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性(例如至少75,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,99或100％氨基酸序列同一性)的多肽序列，或具有其至少50个连续氨基酸(如至少75,100,125,150,175,200,225或250个连续氨基酸残基)的其片段。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括不选自如上讨论的与第一分枝杆菌抗原相关的相同组多肽中的多肽。例如，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括(或由其组成)与选自SEQ ID NOs:19-41的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性(例如至少75,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,99或100％氨基酸序列同一性)的多肽序列，或具有其至少50个连续氨基酸的其片段。SEQ ID NOs:19-41在下面表3中进行阐明：
表3
Figure BDA0001082709250000091
Figure BDA0001082709250000101
由本申请SEQ ID NO:19(Accession Nos.CAA17868和BX842584)表示的多肽“Ag85A”是蛋白质家族(“Ag85A复合物”)的成员，该蛋白质家族还包括Ag85B(本申请的SEQID NO:20)和Ag85C。该蛋白质家族是由结核分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG和许多其他分枝杆菌种分泌的。Ag85A在所有的分枝杆菌物种中是高度保守的，且在动物和人类研究中是免疫显性的。
由SEQ ID NOs:30和36-41表示的多肽被包含在DosR调节子(也称为DevR调节子)之内，所述调节子包括由Rv2623-2631和Rv3126-3134表示的多肽。这些多肽的表达是通过DosR(DevR)调节的。由SEQ ID NOs:31-35表示的多肽是多肽RPF家族的成员(分别为RPFA,RPFB,RPFC,RPFD和RPFE)。
在一个实施方案中，氨基酸序列同一性存在于长度为至少50个连续氨基酸残基(例如长度为至少75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个或250个连续氨基酸残基)的多肽序列的区域。在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情况下，所述多肽的片段包括该多肽序列的至少50个连续氨基酸残基。在一个实施方案中，所述片段包括(或由其组成)所述多肽序列的至少75,100,125,150,175,200,225或250个连续氨基酸残基。在一个实施方案中，多肽的片段是分枝杆菌多肽长度的至少20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％或90％。多肽的片段包括所述多肽的至少一种抗原表位。
在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情况下，多肽的片段包括(或由其组成)所述多肽的截短形式。例如，多肽的片段可具有N末端截短(与所述多肽相比较)，或者多肽的片段可具有C末端截短(与所述多肽相比较)。在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情况下，多肽的片段包括(或由其组成)多肽的成熟形式。例如，多肽可包括信号序列(即分泌/靶向序列)(如在N末端)，以及多肽的片段可缺失这个信号序列。在一个实施方案中，所述片段是通过从所述多肽中切割信号序列而形成的。
在一个实施方案中，多肽SEQ ID NO:19-41的片段是SEQ ID NO:19-41的N末端截短形式。在一个实施方案中，SEQ ID NO:19-41的片段是成熟多肽序列，其通过移除N末端信号序列而区别于SEQ ID NO:19-41序列。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:19-41氨基酸序列相比，多肽SEQ ID NO:19-41的片段具有10、20、30或40个氨基酸残基的N末端截短。在一个实施方案中，SEQ ID NO:19-41的片段至少包括SEQ ID NO:19-41的C末端50、100、150、200或250个氨基酸序列。在一个实施方案中，第二分枝杆菌多肽或其片段与选自SEQ IDNO:19-41的多肽具有共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物活性。在一个实施方案中，“共同的抗原交叉反应性”意指第二分枝杆菌多肽或片段，与选自SEQ ID NO:19-41的多肽共享有共同的诱导诸如T淋巴细胞的免疫细胞“回忆应答”的能力，该免疫细胞之前已经被暴露于分枝杆菌感染的抗原组分。例如，干扰素γ(IFN-γ)ELISPOT测定用作免疫学读出，原因在于来自于抗原特异性免疫细胞如T细胞的IFN-γ的分泌与针对结核分枝杆菌进行保护良好相关。进一步的，ELISPOT测定是对分泌IFN-γ的抗原特异性免疫细胞如T细胞的数目进行定量的非常可再现、灵敏的方法。可选的，或另外地，“共同的抗原交叉反应性”意指能够结合到第二分枝杆菌多肽或其片段的抗体也将能够结合到选自SEQ ID NOs:19-41的多肽。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌多核苷酸包括(或由其组成)抗原分枝杆菌多核苷酸，其能够(在翻译之后)引发针对分枝杆菌感染的保护性免疫细胞应答(如T细胞应答)。在一个实施方案中，第二分枝杆菌多核苷酸编码抗原分枝杆菌多肽，其能够引发针对分枝杆菌感染的保护性免疫细胞应答(如T细胞应答)。因此，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原是如上所定义的“第二分枝杆菌多核苷酸”(或片段)。在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括选自上述所讨论的与第一分枝杆菌抗原相关联的多核苷酸(尽管优选与第一分枝杆菌多核苷酸不同)。
因此，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括(或由其组成)编码选自上述所讨论的与第一分枝杆菌抗原相关的多肽的多核苷酸序列(尽管第二分枝杆菌多核苷酸编码的多肽与第一分枝杆菌多核苷酸编码的多肽不同)。因此，所述第二分枝杆菌多核苷酸包括编码如上所定义的本发明第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列(如作为载体或质粒)。
在一个实施方案中，所述被编码的第二分枝杆菌多肽包括与SEQ ID NO:2.4.6,8,10,12,14,16,18氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少50个连续氨基酸的其片段。在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括(或由其组成)与以下具有至少70％核苷酸序列同一性(例如至少75,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,99或100％核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列：选自SEQ ID NOs:1,3,5,7,9,11,13,15,17的潜伏调节多核苷酸的核酸序列，或其具有至少150个连续核苷酸(如至少200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700or 750个连续核苷酸)的片段。在一个实施方案中，第二分枝杆菌多肽包括(或由其组成)与SEQ ID NO:1,3,5,7,9,11,13,15,17的核酸序列具有至少70％核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少150个连续核苷酸的其片段。在一个实施方案中，上述所讨论的关于第一分枝杆菌多肽的限制同等适用于第二分枝杆菌多肽的实施方案。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括不选自如上讨论的与第一分枝杆菌抗原相关的相同组多核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括多核苷酸，其编码不选自如上讨论的与第一分枝杆菌抗原相关的相同组多肽的多肽。在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括编码如上定义的第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
因此，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括(或由其组成)多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码如下的多肽：所述多肽包括(或由其组成)与选自SEQ ID NOs:19-41的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性(例如至少75,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,99or 100％氨基酸序列同一性)的氨基酸序列，或具有其至少50个连续氨基酸残基的其片段。在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包括(或由其组成)与选自SEQ ID NOs:42-64的核酸序列具有至少70％核苷酸序列同一性(例如至少75,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,99or 100％核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列，或具有其至少150个连续核苷酸的其片段。SEQ ID NOs:42-64如下在表4中列出：
表4
Figure BDA0001082709250000121
Figure BDA0001082709250000131
由本申请SEQ ID NO:42表示的多核苷酸“Ag85A”(登记号CAA17868和BX842584)是基因家族(“Ag85组合物”)的成员，该基因家族还包括Ag85B(本申请SEQ ID NO:43)和Ag85C。该基因家族编码由结核分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG和分枝杆菌的许多其他物种分泌的蛋白。Ag85A在所有的分枝杆菌物种之间是高度保守的，且在动物和人类研究中是免疫显性的。
由SEQ ID NOs:53和59-64表示的多核苷酸被包含在DosR调节子(也被称为DevR调节子)之内，该调节子包括由Rv2623-2631和Rv3126-3134表示的多核苷酸。这些多核苷酸的表达是通过DosR(DevR)调节的。由SEQ ID NOs:54-49表示的多核苷酸是多核苷酸RPF家族的成员(分别为RPFA,RPFB,RPFC,RPFD和RPFE)。
在一个实施方案中，核苷酸序列同一性存在于长度为至少150个连续核苷酸残基的多核苷酸序列的区域(例如，长度至少为200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700或750个连续核苷酸残基)。
在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情况下，多核苷酸的片段包括所述多核苷酸的至少150个连续核苷酸残基。在一个实施方案中，片段包括(或由其组成)所述多核苷酸序列的至少200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700或750个连续核苷酸残基。在一个实施方案中，所述多核苷酸片段是该多核苷酸长度的至少20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％或90％。
在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情况下，多核苷酸的片段包括(或由其组成)该多核苷酸的截短形式。例如，与多核苷酸相比，多核苷酸的片段可具有5’截短和/或3’截短。在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情况下，多核苷酸的片段编码与全长多核苷酸编码的多肽相比截短的多肽。例如，多核苷酸片段可编码与全长多核苷酸编码的多肽相比N末端截短和/或C末端截短的多肽。在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情况下，多核苷酸的片段编码成熟的多肽。例如，多肽可包括信号序列(即分泌/靶向序列)(如在N末端)，以及多核苷酸片段可编码缺失这个信号序列的多肽片段。
在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:42-64的片段(分别)是SEQ ID NO:42-64的5’截短形式。在一个实施方案中，与核苷酸序列SEQ ID NO:42-64相比，多核苷酸SEQ IDNO:42-64的片段(分别)具有25、50、75、100或125个核苷酸残基的N末端截短。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:42-64的片段(分别)至少包括SEQ ID NO:42-64的C末端150、300、450、600或750个核苷酸残基。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:42-64的片段(分别)编码SEQ ID NO:42-64的N末端截短形式。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:42-64的片段编码成熟的多肽序列，其通过移除N末端信号序列而(分别)区别于SEQ ID NO:42-64的序列。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:42-64的片段(分别)编码SEQ IDNO:42-64的多肽片段，该多肽片段与SEQ ID NO:42-64的氨基酸序列相比(分别)具有在N末端截短10,20,30,40,50,100,150个氨基酸残基。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO:42-64的片段(分别)编码SEQ ID NO:42-64的多肽片段，该多肽片段(分别)至少包括SEQ IDNO:42-64的C末端50、100、150、200或250个氨基酸残基。在一个实施方案中，由第二分枝杆菌多核苷酸或片段编码的多肽与选自SEQ ID NOs:19-41的多肽具有共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物学活性。举例来说，由第二分枝杆菌多核苷酸编码的多肽与选自SEQ ID NOs:19-41的多肽共享有共同的诱导诸如T淋巴细胞的免疫细胞“回忆应答”的能力，该免疫细胞之前已经暴露于分枝杆菌感染的抗原组分。例如，干扰素γ(IFN-γ)ELISPOT测定用作免疫学读出，原因在于来自于诸如T细胞的抗原特异性免疫细胞的IFN-γ的分泌与针对结核分枝杆菌进行保护的良好相关。进一步，ELISPOT测定是用于将分泌IFN-γ的抗原特异性免疫细胞如T细胞的数目进行定量的非常可重现的、灵敏的方法。可选的，或另外地，能够结合到第二分枝杆菌多核苷酸或片段编码的多肽的抗体，也将能够结合到选自SEQ ID NOs:19-41的多肽。
在一个实施方案中，抗原组合物包括Rv0111抗原(抗原多肽或多核苷酸)和Rv0198抗原(抗原多肽或多核苷酸)二者。
在一个实施方案中，其中有多个附加分枝杆菌抗原(如2个或更多个附加分枝杆菌抗原，以及第一和第二分枝杆菌抗原)，每个所述附加分枝杆菌抗原是彼此不同的。在一个实施方案中，附加分枝杆菌抗原与第一和第二分枝杆菌抗原之间的“区别”是由对分枝杆菌抗原免疫应答的特异性来定义的。例如，在一个实施方案中，每个第一、第二和附加抗原诱导基本上对该抗原特异性的免疫应答。第一、第二和附加分枝杆菌抗原之间的“区别”可通过分枝杆菌抗原之间的共同抗原交叉反应性的基本上缺少(如缺失)来定义。第一、第二和附加分枝杆菌抗原之间的“区别”可选择性地(或另外地)定义为分枝杆菌抗原之间共同的体内生物学活性的基本上缺少(如缺少)。例如，在一个实施例中，第一、第二和附加分枝杆菌抗原(如第一、第二和附加分枝杆菌抗原多肽，或第一、第二和附加分枝杆菌抗原多核苷酸或其编码的多肽)可显示(基本上)没有共同的抗原交叉反应性。
在一个实施方案中，第一、第二和附加分枝杆菌抗原(如第一、第二和附加分枝杆菌抗原多肽，或第一、第二和附加分枝杆菌抗原多核苷酸或其编码的多肽)显示(基本上)没有共同的体内生物学活性。例如，第一、第二和附加分枝杆菌抗原(如第一、第二和附加分枝杆菌抗原多肽，或第一、第二和附加分枝杆菌抗原多核苷酸或其编码的多肽)可各自诱导不同的免疫应答和/或各自具有不同的体内生物学活性。举例来说，在一个实施方案中，第一、第二和附加分枝杆菌抗原(如第一、第二和附加分枝杆菌抗原多肽，或第一、第二和附加分枝杆菌抗原多核苷酸或其编码的多肽)不共享有诱导诸如T淋巴细胞(如CD4+,CD8+、效应T细胞或记忆T细胞——TEM或TCM)的免疫细胞“回忆应答”的共同的能力，该免疫细胞之前已经暴露于分枝杆菌感染的抗原组分。换言之，在一个实施例中，第一、第二和附加分枝杆菌抗原是“有区别的”，原因在于它们在不同的免疫细胞内(如不同的T细胞)诱导回忆应答。
在一个实施方案中，与第一和/或第二分枝杆菌抗原相比，一种或多种附加分枝杆菌抗原在不同的培养环境和/或分枝杆菌感染状态下被表达或上调。在一个实施方案中，与第一和/或第二分枝杆菌抗原相比，在不同的培养环境和/或分枝杆菌感染状态下，一种或多种附加分枝杆菌抗原的活性被上调。因此，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原的表达或活性在分枝杆菌潜伏期环境期间内被上调，而第二和/或附加分枝杆菌抗原的表达或活性在活动性分枝杆菌感染期间或当从潜伏状态重新激活时被上调(和/或在分枝杆菌潜伏环境期间被下调)。在一个实施方案中，其中具有多附加分枝杆菌抗原(例如2个或更多个附加分枝杆菌抗原，以及第一和第二分枝杆菌抗原)，每一附加分枝杆菌抗原在分枝杆菌感染的不同阶段被表达/上调，或者每一附加分枝杆菌抗原的活性在分枝杆菌感染的不同阶段被上调。
在一个实施方案中，一种或多种附加分枝杆菌抗原来自于除了结核分枝杆菌之外的分枝杆菌。例如，一种或多种附加分枝杆菌抗原可来自于MTC的另一成员，如田鼠分枝杆菌、牛分枝杆菌、坎纳分枝杆菌和非洲分枝杆菌，或者非MTC分枝杆菌如鸟胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海洋分枝杆菌(M.marinum)或溃疡分枝杆菌。
在一个实施方案中，除了以上所讨论的第一和第二分枝杆菌抗原之外，抗原组合物还包括至少1个、2个、3个、4个或5个进一步的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，每一所述的至少1个、2个、3个、4个或5个附加分枝杆菌抗原均彼此不同，且不同于第一和第二分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，抗原组合物包括多达约10个不同的分枝杆菌抗原(如包括以上所讨论的第一和第二分枝杆菌抗原)。在一个实施方案中，抗原组合物包括1个附加分枝杆菌抗原，并因此包括总计3个不同的分枝杆菌抗原(即抗原组合物为三聚体)。在一个实施方案中，抗原组合物包括2个附加分枝杆菌抗原，并因此包括总计4个不同的分枝杆菌抗原(即该抗原组合物为四聚体)。在一个实施方案中，抗原组合物包括3个附加分枝杆菌抗原，并因此包括总计5个不同的分枝杆菌抗原(即该抗原组合物为五聚体)。在一个实施方案中，抗原组合物包括多达8个附加分枝杆菌抗原，并因此包括多达总计10个不同的分枝杆菌抗原(即该抗原组合物为多达十聚体)。
在一个实施方案中，一种或多种附加分枝杆菌抗原包括(或由其组成)与选自SEQID NOs:1,3,5,7和56的潜伏-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少150个连续氨基酸的其片段，如上述关于第一分枝杆菌抗原所定义的那样(只要该一种或多种附加分枝杆菌抗原不同于第一分枝杆菌抗原)。可选的，或另外地，一种或多种附加分枝杆菌抗原可包括(或由其组成)与选自SEQ ID NOs:19-41的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少50个连续氨基酸的其片段，如上述的关于第二分枝杆菌抗原所定义的那样(只要该一种或多种附加分枝杆菌抗原不同于第二分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，一种或多种附加分枝杆菌抗原包括(或由其组成)多核苷酸序列，该核苷酸序列编码如上所描述的关于第一分枝杆菌抗原多肽的多肽序列(优选不同于第一分枝杆菌抗原)。在一个实施方案中，一种或多种附加分枝杆菌抗原包括(或由其组成)多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码如上所描述的关于第二分枝杆菌抗原多肽的多肽序列(优选不同于第二分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，一种或多种附加分枝杆菌抗原包括(或由其组成)与选自SEQID NOs:1,3,5,7,9,11,13,15,17的潜伏-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少150个连续核苷酸的其片段，如上关于第一分枝杆菌抗原所描述的(只要该一种或多种附加分枝杆菌抗原不同于第一分枝杆菌抗原)。可选地，或另外地，一种或多种附加分枝杆菌抗原包括(或由其组成)与选自SEQ ID NOs:42-64的核苷酸序列具有至少70％核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少150个连续核苷酸的其片段，如上关于第二分枝杆菌抗原所描述的(只要该一种或多种附加分枝杆菌抗原不同于第二分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，抗原组合物中的至少2个分枝杆菌抗原包括(或由其组成)多肽序列，并且所述至少2个多肽序列任选地连接到一起以形成融合蛋白。通过示例的方式，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原每一均包括(或由其组成)如上所定义的多肽序列，并且所述第一和第二多肽序列任选地连接到一起以形成融合蛋白。
在一个实施方案中，所述融合蛋白进一步包括任选地连接到所述第一和/或第二多肽序列的至少一种附加分枝杆菌抗原多肽序列，其中每一所述的进一步分枝杆菌抗原均彼此不同且不同于第一和第二分枝杆菌抗原。例如，除了所述第一和第二分枝杆菌抗原之外，融合蛋白可包括至少1,2,3,4或5个附加分枝杆菌抗原，其中每一所述的附加分枝杆菌抗原均彼此不同，且不同于第一和第二分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，融合蛋白可包括多达约10个不同的分枝杆菌抗原(如包括第一和第二分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，抗原组合物包括至少一种附加分枝杆菌抗原(如至少1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个附加分枝杆菌抗原)，并且第一分枝杆菌抗原和所述的至少一种附加分枝杆菌抗原每一均包括(或由其组成)如上所定义的多肽序列，以及所述的多肽序列任选地连接到一起以形成融合蛋白。在一个实施方案中，抗原组合物包括至少一种附加分枝杆菌抗原(如至少1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个附加分枝杆菌抗原)，并且第二分枝杆菌抗原和所述的至少一种附加分枝杆菌抗原每一均包括(或由其组成)如上所定义的多肽序列，以及所述多肽序列任选地连接到一起以形成融合蛋白。可选地，在一个实施方案中，抗原组合物包括至少两种附加分枝杆菌抗原(例如至少2,3,4,5,6,7,8,9or 10种附加分枝杆菌抗原)，且每一所述至少两种附加分枝杆菌抗原包括(或由其组成)如上所定义的多肽序列，且所述多肽序列任选地连接到一起以形成融合蛋白。
在一个实施方案中，重组融合蛋白可通过表达编码所述融合蛋白的重组多核苷酸序列来产生。通过示例的方式，编码本发明分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列可位于表达载体内启动子下游的相同的阅读框内，从而允许通过多核苷酸序列的转录并翻译成一种蛋白产物。在一个实施方案中，插入的“接头”序列位于对于每一多肽抗原的多核苷酸序列之间，由于包含限制性位点而产生。通常，由这些接头序列编码的氨基酸对得到的融合蛋白的免疫原性是无害的，且甚至可以是有益于免疫原性。可选的，本发明的融合蛋白可通过表达不用插入核苷酸连接的多核苷酸序列而作为抗原表位串(epitope string)生产。插入接头序列的缺失避免了不必要核酸和/或氨基酸物质的出现。可选的，本发明的融合蛋白可通过化学缀合本发明的分枝杆菌抗原多肽而制备。通过示例的方式，本发明的第一和/或第二和/或附加分枝杆菌多肽可使用常规的化学缀合技术而彼此耦合。
在一个实施方案中，抗原组合物中的至少两种分枝杆菌抗原包括(或由其组成)多核苷酸序列，并且所述至少两种多核苷酸序列任选地连接到一起以形成多顺反子的的核苷酸序列。通过示例的方式，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原每一均包括(或由其组成)如上所定义的多核苷酸序列，并且所述第一和第二多核苷酸序列任选地连接到一起以形成多顺反子的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述多顺反子核苷酸序列包括以下或由以下组成(以从5’到3’的任何顺序)：
(i)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包括(或由其组成)如前文所定义的多核苷酸序列；和
(ii)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包括(或由其组成)如前文所定义的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述多顺反子序列进一步包括连接到所述第一和第二多核苷酸序列的至少一种附加分枝杆菌抗原多核苷酸序列。可选的，在一个实施方案中，抗原组合物包括至少一种附加分枝杆菌抗原，并且第一分枝杆菌抗原和至少一种附加分枝杆菌抗原每一均包括(或由其组成)如上所定义的多核苷酸序列，并且所述多核苷酸序列连接到一起以形成多顺反子核苷酸序列。可选的，在一个实施方案中，抗原组合物包括至少一种附加分枝杆菌抗原，并且第二分枝杆菌抗原和至少一种附加分枝杆菌抗原每一均包括(或由其组成)如上所定义的多核苷酸序列，以及所述多核苷酸序列连接到一起以形成多顺反子核苷酸序列。可选的，在一个实施方案中，抗原组合物包括至少两种附加分枝杆菌抗原，并且所述至少两种附加分枝杆菌抗原每一均包括(或由其组成)如上所定义的多核苷酸序列，以及所述多核苷酸序列连接到一起以形成多顺反子核酸序列。
在一个实施方案中，本发明的多顺反子核酸序列位于载体(例如如下所讨论的表达载体或病毒载体)中框内启动子的下游，因此允许通过多核苷酸序列的转录并任选的翻译成一种“融合蛋白”产物。因此，在一个实施方案中，多顺反子核酸序列编码如上所讨论的融合蛋白。可选的，在一个实施方案中，多顺反子核酸序列编码如上所讨论的单独的分枝杆菌抗原多肽序列。在一个实施方案中，多顺反子核酸序列可操作地连接至编码标签多肽的核酸序列，这样当翻译时，编码的标签共价地连接至编码的抗原多肽。该标签可便于检测抗原多肽的表达，或便于检测表达抗原的克隆，和/或可引起抗原效力的提高。合适的标签多肽包括PK标签、FLAG标签、MYC标签、多组氨酸标签或任何可检测的标签(例如可被抗体诸如单克隆抗体检测的标签)。对于本领域技术人员来说，标签的其他示例将是清楚的。编码标签多肽的核酸序列可位于这样的位置，即，在翻译之后，标签位于表达的抗原多肽的C末端(即以如下顺序：抗原多肽——标签)。编码标签多肽的核酸序列可位于这样的位置，即，在翻译之后，标签位于表达的抗原多肽的N末端(即以如下顺序：抗原多肽——标签)。可选的，编码标签多肽的核苷酸序列可位于这样的位置，即，在翻译之后，标签位于表达的抗原多肽内部，或位于编码的融合蛋白的表达抗原多肽之间。
编码接头序列的核苷酸可插入到编码抗原多肽的多顺反子核酸序列和编码标签多肽的核酸序列之间。在一个实施方案中，接头序列编码氨基酸序列Gly-Ser-Ile。在一个实施方案中，编码的接头序列位于表达的抗原多肽和标签多肽之间(即以如下的顺序：抗原多肽——接头——标签，或标签——接头——抗原多肽)。在一个实施方案中，编码标签多肽的核酸序列和编码接头序列的核酸位于这样的位置，即，在翻译之后，接头序列(如Gly-Ser-Ile)位于表达的抗原多肽的C末端，并且标签位于表达的接头序列的C末端(即以如下的顺序：抗原多肽——接头——标签)。插入“接头”序列可备选地(或另外地)位于多顺反子序列的分枝杆菌多核苷酸序列之间，由于包含限制性位点而产生(例如以如下形式：分枝杆菌多核苷酸——接头——分枝杆菌多核苷)。然而，为避免出现不必要的核苷酸和/或氨基酸物质，可不用插入核苷酸而对多核苷酸序列进行连接。
在一个实施方案中，多顺反子核酸序列可操作地连接至前导序列。例如，该前导序列可被融合到多顺反子序列的N末端(即以如下的形式：前导——多顺反子序列)或连接到多顺反子序列的C末端(即以如下的形式：多顺反子序列——前导)。前导序列可影响初级DNA转录物到mRNA的加工，和/或可影响mRNA的稳定性或翻译效率。在一个实施方案中，前导序列确保了编码的多肽抗原被导向宿主细胞的分泌机制(secretory machinery)。在一个实施方案中，前导序列提高抗原的表达和/或免疫原性。可通过常规的测定来确定增强的表达，例如使用抗体(如单克隆抗体)来检测生产的蛋白的量。可使用常规的测定来确定增强的免疫原性，例如培养的或体外ELISPOT测定。在一个实施方案中，当与所表达的不具有前导序列的抗原多肽相比较时，前导序列的存在将分枝杆菌抗原多肽的表达和/或免疫原性提高了2倍、3倍或更多。合适的前导序列的示例为t-PA(组织型纤溶酶原激活剂)。
因此，在一个实施方案中，编码所述分枝杆菌抗原多肽的多顺反子核酸序列可操作地连接至前导序列和标签序列。例如，前导序列可融合至多顺反子序列的N末端并且标签序列可融合至多顺反子序列的C末端(即以如下的形式：前导——多顺反子序列——标签)。在一个实施方案中，接头序列位于多顺反子序列和编码标签的核酸序列之间(即以如下的形式：前导——多顺反子序列——接头——标签)。在一个实施方案中，前导序列为t-PA前导序列和/或标签序列为PK标签序列(即以如下的形式：t-PA前导——多顺反子序列——PK标签)。在一个实施方案中，接头序列位于多顺反子序列和编码标签的核酸序列之间(即以如下的形式：t-PA前导——多顺反子序列——接头——PK标签)。在一个实施方案中，插入的前导序列位于多顺反子序列的一种或多种分枝杆菌多核苷酸序列之间(即以如下形式：分枝杆菌多核苷酸——前导——分枝杆菌多核苷酸)。在一个实施方案中，编码分枝杆菌抗原多肽的多顺反子核酸序列可操作地连接至N末端前导序列、内部前导序列和标签序列(即以如下形式：前导——第一分枝杆菌多核苷酸——前导——第二分枝杆菌多核苷酸——标签)。在一个实施方案中，接头序列位于多顺反子序列和编码标签的核酸序列之间(即以如下形式：前导——第一分枝杆菌多核苷酸——前导——第二分枝杆菌多核苷酸——接头——标签)。在一个实施方案中，前导序列为t-PA前导序列和/或标签序列为PK标签序列(即以如下形式：t-PA前导——第一分枝杆菌多核苷酸——t-PA前导——第二分枝杆菌多核苷酸——PK标签)。在一个实施方案中，接头序列位于多顺反子序列和编码标签的核酸序列之间(即以如下形式：t-PA前导——第一分枝杆菌多核苷酸——t-PA前导——第二分枝杆菌多核苷酸——接头——PK标签)。在一个实施方案中，多顺反子核酸序列进一步包括聚腺苷酸化信号，如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号。
在一个实施方案中，抗原组合物包括一种或多种细胞，其中所述细胞包括至少一种分支杆菌抗原。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞包括如上所定义的第一分支杆菌抗原和/或第二分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞包括如上所定义的一种或多种所述的附加分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，一种或多种所述的附加分枝杆菌抗原包括如上所定义的多肽序列。在一个实施方案中，一种或多种所述的附加分枝杆菌抗原包括如上所提及的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述至少一种分枝杆菌抗原(如多肽)至少部分地暴露于细胞表面。在备选的实施方案中，该细胞在体内降解，这样至少部分分枝杆菌抗原(如多肽)暴露于宿主细胞的免疫系统。在一个备选的实施方案中，该细胞将分枝杆菌抗原(如多肽)至少部分地释放(如分泌或输出)到细胞外面，这样其暴露于宿主的免疫系统。在一个实施方案中，所述抗原组合物包括个体细胞，其中所述细胞包括至少两种所述分枝杆菌抗原。通过示例的方式，在一个实施方案中，所述抗原组合物包括单独的细胞，其中所述细胞包括所述第一分枝杆菌抗原和所述第二分枝杆菌抗原两者。在一个实施方案中，所述个体细胞进一步包括一种或多种所述附加分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包括个体细胞，其中所述细胞包括所述第一分枝杆菌抗原和所述一种或多种附加分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述抗原组合物包括个体细胞，其中所述细胞包括所述第二分枝杆菌抗原和所述一种或多种附加分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述抗原组合物包括个体细胞，其中所述细胞包括所述至少两种所述附加分枝杆菌抗原。在备选的实施方案中，抗原组合物包括至少第一和第二细胞，其中所述第一细胞包括所述第一分枝杆菌抗原(如上所定义的)和其中所述第二细胞包括所述第二分枝杆菌抗原(如上所定义的)。在这个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原不存在于相同的细胞内；更确切的说，第一和第二分枝杆菌抗原在不同的细胞内。在一个实施方案中，所述抗原组合物进一步包括至少第三细胞，其中所述细胞包括如上所定义的附加分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述至少一种细胞为减毒的微生物载体。减毒的载体为不能够在动物受试者体内，通常为哺乳动物受试者诸如人、牛、猪或马受试者，引起显著病理性效果的细胞(如细菌细胞)。减毒微生物载体的适当的示例包括减毒的沙门氏菌、减毒的结核分枝杆菌或减毒的牛分枝杆菌(如BCG菌株)。
在一个实施方案中，抗原组合物包括一种或多种载体，其中所述载体包括至少一种分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述一种或多种载体包括如上所定义的第一分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原包括如上所定义的多肽序列。在一个实施方案中，所述一种或多种载体包括如上所定义的第二分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述载体包括所述第一分枝抗原和所述第二(和任选地附加)分枝杆菌抗原。通过示例的方式，所述载体可包括本文所定义的第一分枝杆菌多核苷酸和本文所定义的第二(和任选地附加)分枝杆菌多核苷酸。在一个实施方案中，所述载体包括：
(i)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包括(或由其组成)前文所定义的多核苷酸序列；和任选地
(ii)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包括(或由其组成)前文所定义的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述一种或多种载体包括如上所定义的一种或多种所述附加分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，一种或多种所述附加分枝杆菌抗原包括如上所定义的多肽序列。在一个实施方案中，一种或多种所述附加分枝杆菌抗原包括如上提及的多核苷酸序列。
载体的示例包括DNA载体(如痘苗病毒载体，例如MVA)和RNA载体(如Sinbis或Semiliki Forest病毒载体)。术语“载体”涵盖了表达载体(其可用于制备本发明的分枝杆菌抗原)和病毒载体(其可用于复制和/或递送本发明的分枝杆菌抗原)。任选地，该载体包括适当的控制序列，例如启动子和/或终止子。在一个实施方案中，该载体包括一种或多种编码所述分枝杆菌抗原的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列可操作地连接至编码标签多肽的核酸序列，这样当翻译时编码的标签共价地连接至抗原。标签可便于检测抗原表达，或检测表达抗原的克隆，和/或可引起抗原效力的提高。合适的标签多肽包括PK标签、FLAG标签、MYC标签、多组氨酸标签或任何可检测的标签(如可被抗体诸如单克隆抗体检测的标签)。编码标签多肽的核苷酸序列可位于这样的位置，即，在翻译之后，该标签位于表达的抗原的C末端。可选地，编码标签多肽的核酸序列可位于这样的位置，即，在翻译之后，标签位于表达的抗原的N末端。可选地，编码标签多肽的核酸序列可位于这样的位置，即，在翻译之后，标签位于表达的抗原的内部。编码接头序列的核苷酸可插入到编码表达抗体的多核苷酸和编码标签多肽的核酸序列之间。在一个实施方案中，编码的接头序列位于表达的抗原多肽和标签多肽之间。在一个实施方案中，编码标签多肽的核酸序列和编码接头序列的核苷酸可位于这样的位置，即，在翻译之后，接头序列位于表达的抗原的C末端，标签位于表达的接头序列的C末端。
在一个实施方案中，该载体包括一种或多种编码分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可操作地连接至前导序列。前导序列可影响初级转录本至mRNA的加工，和/或可影响mRNA稳定性或翻译效率。在一个实施方案中，前导序列确保了所编码的多肽抗原被导向宿主细胞的分泌机制。在一个实施方案中，前导序列提高了抗原的表达和/或免疫原性。可使用常规的测定来确定增强免疫原性，例如培养的或体外ELISPOT测定。可通过常规的测定来确定增强的表达，例如使用抗体(如单克隆抗体)来检测所生产蛋白的量。在一个实施方案中，当与所表达的不具有前导序列的抗原相比较时，前导序列的存在将分枝杆菌抗原的表达和/或免疫原性提高了2倍、3倍或更多。合适的前导序列的示例为t-PA(组织型纤溶酶原激活剂)。在一个实施方案中，载体包括编码所述融合到t-PA前导序列的分枝杆菌抗原的C末端截短的多核苷酸。在一个实施方案中，载体包括编码所述融合到t-PA前导序列和PK标签序列的分枝杆菌抗原的C末端截短的多核苷酸。例如，前导序列可融合到编码抗原的多核苷酸的N末端，以及标签序列可融合到编码抗原的多核苷酸的C末端。在一个实施方案中，接头序列(如Gly-Ser-Ile)位于编码抗原的多核苷酸和编码标签的核酸序列之间。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包括个体载体，其中所述载体包括所述第一分枝杆菌抗原和所述第二分枝杆菌抗原两者。在一个实施方案中，所述个体载体进一步包括一种或多种所述附加分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述抗原组合物包括个体载体，其中所述载体包括所述第一分枝杆菌抗原和所述一种或多种附加分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述抗原组合物包括个体载体，其中所述载体包括所述第二分枝杆菌抗原和所述一种或多种附加分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述抗原组合物包括个体载体，其中所述细胞包括一种或多种附加分枝杆菌抗原。在一个备选的实施方案中，抗原组合物包括至少第一和第二载体，其中所述第一载体包括所述第一分枝杆菌抗原(如上所定义的)以及其中所述第二载体包括所述第二分枝杆菌抗原(如上所定义的)。在这个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原不存在于相同的载体内；确切地说，第一和第二分枝杆菌抗原存在于不同的载体内。在一个实施方案中，所述抗原组合物进一步包括至少一种第三载体，其中所述第三载体包括如上所定义的(一种或多种)附加分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，该载体(或至少一种所述载体)是病毒载体。病毒载体通常是非复制型或复制缺陷型载体，这意味着病毒载体不能够在正常细胞内(如正常的人细胞)以任何显著的程度复制，如通过常规的方式测量——例如通过测量DNA合成和/或病毒滴度(viral titre)。非复制型或复制缺陷型载体可以天然(即从自然界中按原样分离)或人工地(如通过体外繁殖或基因操作)变成这样。通常存在复制缺陷型病毒载体能够在其中生长的至少一种细胞类型，——例如，修饰的安卡拉痘苗(modified vaccinia Ankara)(MVA)能够在CEF细胞内生长。通常，病毒载体不能够在动物受试者内，通常为哺乳动物受试者如人、牛、猪或马患者，引起显著的感染。可用于这种情形的病毒载体的示例包括减毒的痘苗病毒载体例如修饰的安卡拉痘苗(MVA)和NYVAC，或源自于其的菌株。其他的合适的病毒载体包括痘病毒载体(poxvirus vectors)，例如鸟痘病毒(avipox)载体，例如减毒的鸡痘病毒载体(如FP9)或金丝雀痘载体(如ALVAC和由其起源的菌株)。用于本发明的备选病毒载体包括腺病毒载体(如非人类腺病毒载体)、甲病毒载体、黄病毒载体、疱疹病毒载体、流感病毒载体和逆转录病毒载体。
在一个实施方案中，该载体(或至少一种所述载体)为表达载体。表达载体为包括编码目的多肽的一种或多种多核苷酸序列的核酸分子(线性的或环状的)，该编码目的多肽的一种或多种多核苷酸序列可操作地连接至其表达所需的附加调控元件。在这点上，表达载体通常包括启动子和终止子序列，并且任选地一种或多种增强子序列、聚腺苷酸化信号等。表达载体还可包括合适的翻译调控元件，包括核糖体结合位点和翻译起始和终止序列。本发明表达载体中所使用的转录和翻译调控元件在用于表达的宿主细胞内是有功能的，并且可包括与分枝杆菌基因天然相关的那些。
选择合适的启动子、终止子、选择标记和其他的元件是本领域普通技术人员水平之内的常规设计。启动子，如trp,lac和噬菌体启动子、tRNA启动子和糖解酶启动子可用于原核宿主内。有用的酵母启动子包括关于下述的启动子区域：金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶或其他的糖解酶如烯醇酶或甘油醛-3-磷酸脱氢酶、用于负责麦芽糖和半乳糖利用的酶以及其他。适当的非天然哺乳动物启动子可包括来自SV40的早期和晚期启动子，或源自Moloney小鼠白血病病毒、小鼠乳腺瘤病毒、禽类肉瘤(avian sarcoma)病毒、腺病毒II、牛乳头瘤病毒或多瘤病毒的启动子。在一个实施方案中，表达载体包括CMV启动子。
通常，“可操作地连接”意指被连接的核酸序列为相邻的且这样排列，以便为意欲的目的协同行使功能——例如，转录在启动子内启动并通过编码多核苷酸片段继续进行直至终止子。在需要连接两个蛋白编码区域的地方，多核苷酸编码序列应当是相邻的且在阅读框内。
在一个实施方案中，本发明提供了包括如上所定义的本发明的抗原组合物的宿主细胞。从而宿主细胞包括本发明的第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原，其中所述分枝杆菌抗原可包括多肽和/或多核苷酸序列，如上所讨论的。
因此，在一个实施方案中，宿主细胞包括含有第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原的抗原组合物；其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i)前文所定义的第一分枝杆菌多肽序列；和任选地
(ii)前文所定义的第二(和任选地附加)分枝杆菌多核苷酸序列；
和其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述宿主细胞包括以下任一：
(i)前文所定义的第一分枝杆菌抗原多肽；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
以及任选地以下任一：
(iii)前文所定义的第二分枝杆菌抗原多肽；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
本发明的抗原组合物、多核苷酸或多肽可通过使用标准分子生物学方法(如Sambrook et al.1989,Molecular Cloning a Laboratory Manual,Second Edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；通过引用并入本文)在兼容的原核或真核宿主细胞内的载体或其他的表达媒介(expression vehicle)内表达本发明的多核苷酸序列来制备。
尽管可使用其他的原核生物，例如枯草杆菌(B.subtilis)或假单胞菌(Pseudomonas)，最常用的原核宿主为大肠杆菌(E.coli)菌株。哺乳生物或其他的真核宿主细胞，例如那些酵母菌、丝状真菌、植物、昆虫、两栖动物或禽鸟类，也可用于本发明。哺乳动物细胞在培养基内的繁殖本身是已知的。常用的哺乳动物宿主细胞系的示例为VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和WI38、BHK和COS细胞系，尽管其他的细胞系可能适用于如提供较高的表达。如本文所使用的，“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其他的表示作为单细胞实体培养的微生物或更高的真核细胞系的此类术语，指的是能够或者已经用作重组载体或其他转移DNA的受体且包括已转化的原始细胞的后代的细胞。可以被理解的是，由于天然的、意外的或刻意的突变，单一亲代细胞的后代可能在形态学或者在基因组或总DNA互补物(complement)上与原始亲代未必完全相同。
目的多核苷酸序列可在体外转录，并且将得到的RNA引入宿主细胞内(如通过注射)，或者通过依细胞宿主的类型而不同的方法将多核苷酸序列直接引入到宿主细胞内，所述方法包括电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE葡聚糖或其他的物质进行转染；基因枪法；脂质体转染；感染(其中载体为感染原，例如逆转录病毒基因组)。“转化”指的是将外源多核苷酸插入到宿主细胞内，而不考虑用于插入的方法，例如直接摄入(directuptake)、转导、f-交配或电穿孔。
载体可自主复制，或可通过插入到宿主细胞的基因组而复制，在这种情况下它们包括插入序列。表达和克隆载体可包含选择标记，即编码用所述载体转化的宿主细胞的生存或生长所必需的蛋白的基因。这个基因确保了仅那些表达插入物的宿主细胞的生长。常规的选择基因编码以下的蛋白：(a)赋予对抗生素或其他毒性物质例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤等的抗性的蛋白；(b)补充营养缺陷的蛋白；或(c)提供不能从复合培养基得到的关键营养的蛋白，例如编码对杆菌属的D-丙氨酸消旋酶的基因。选择合适的选择标记取决于宿主细胞。转化的宿主细胞可根据已知的方法进行培养，表达的多肽可以使用常规的方案进行回收和分离(如从培养基中)。
在一个方面，本发明提供了用于生产包括如上所定义的(至少)第一分枝杆菌抗原和任选地第二分枝杆菌抗原的抗原组合物的方法；所述方法包括：
(a)表达如上所定义的编码所述至少第一和任选地第二分枝杆菌抗原的多核苷酸序列；或
(b)培养如上所描述的宿主细胞，借此所述细胞生成所述至少第一和任选地第二分枝杆菌抗原；
以及回收所表达的抗原。
本发明还涉及结合如上所定义的第一分枝杆菌抗原(如多肽)和如上所定义的第二分枝杆菌抗原(如多肽)的抗体。因此，在一个实施方案中，本发明提供了免疫原性组合物，包括第一抗体和任选地第二抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原，以及所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原；
其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i)如前文所定义的多肽序列；或
(ii)编码如前文所定义的多肽序列(i)的多核苷酸序列；
和其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，免疫原性组合物包括第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，和所述第二抗体结合如上所定义的第二分枝杆菌抗原多肽，。任选地，所述免疫原性组合物进一步包括至少第三抗体(如至少3、4、5、6、7、8种附加抗体)，其中所述第三抗体结合不同于第一和第二分枝杆菌抗原的第三分枝杆菌抗原。
术语“抗体”涵盖了包括抗原结合片段或抗原结合结构域的任何多肽。示例包括但不限于多克隆的、单克隆的、特异性的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、人的、单链的、嵌合的、亲合体、合成的、重组的、杂交的、突变的、移植的和体外生产的抗体。除非前面有词语“完整的”，术语“抗体”包括抗体片段，如Fab,F(ab')2,Fv,scFv,Fd,dAb和其他保留有抗原结合功能的抗体片段。在一个实施方案中，抗体属于IgG,IgM或IgA同种型家族。对IgA同种型的称谓包括这种抗体的分泌形式(即sIgA)。可在体外或体内添加sIgA的分泌组分(SC)。对于后者，可利用患者的天然SC标记机制。在一个实施方案中，抗体特异性结合所讨论的分枝杆菌抗原。“特异性结合”意指两个或多个分子之间形成在生理环境下相对稳定的复合物。特异性结合由高亲和力和中低度能力表征，其区别于通常具有低亲和力和中高度能力的非特异性结合。通常，当结合常数KA高于106M 1时则认为抗体和抗原之间的结合是特异性的。如果需要的话，可通过改变结合条件来降低非特异性结合，而基本上不影响特异性结合。技术人员可使用常规技术对适当的结合条件，如抗体浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、封闭剂(如血清白蛋白，乳酪蛋白)的浓度等进行优化。在一个实施方案中，所述第一和第二抗体已经被提出分别针对如本文所描述的本发明的第一和第二分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述第一和第二抗体已经被提出分别针对如本文所描述的本发明的第一和第二分枝杆菌抗原多肽。在一个实施方案中，本发明提供了从已经被本发明的抗原组合物免疫的动物中分离的抗血清。如本文所使用的，术语“抗血清”指的是血清中对特定抗原拥有可检测的结合的抗体，如通过ELISA或流式细胞仪。制备免疫血清的方法是本领域已知的。例如，本发明的第一和第二抗体(和任选的附加抗体)，或本发明的免疫原性组合物，能够施用到动物(如哺乳动物——诸如马或人)直至产生对第一和第二分枝杆菌抗原的抗体应答(比如中和抗体应答)。
针对本文所公开的抗原片段(如多肽片段)的抗体可具有识别全长抗原(如全长多肽)的特性，其中所述抗原片段是由全长抗原衍生的。在这方面，多肽片段具有可通过常规免疫测定检测的抗原决定簇。一种或多种抗原决定簇是由本发明的全长抗原和其片段共享的，因此针对抗原片段的抗体还可结合本发明的相应的全长抗原。在一个实施方案中，抗体以分离的形式提供。该抗体可标记有可检测的或功能性的标签。这些标签包括放射性标记(例如1311或99Tc)、酶标记(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)，和其它化学基团(例如生物素)。
当在暴露于分枝杆菌诸如结核分枝杆菌之前或者之后很快将其施用到哺乳动物例如人时，以上描述的抗体可提高存活率。因此，本发明的第一和第二抗体(和任选的附加抗体)(或本发明的免疫原性的、包含抗体的组合物)能够用作被动免疫血清用于预防分枝杆菌感染，或用于治疗暴露于分枝杆菌(如结核分枝杆菌)的患者。在一个实施方案中，抗体与本发明的分枝杆菌抗原的结合可引发表达所述抗原的分枝杆菌的包被(coating)。分枝杆菌的包被优选导致其调理作用，该调理作用导致了细菌被破坏。抗体的调理作用可通过预防或调节受体-介导的进入和在巨噬细胞内复制而影响吞噬细胞和非吞噬细胞中的分枝杆菌的细胞进入和扩散。不受任何理论约束，本发明人相信巨噬细胞裂解可导致杆菌释放。在这一阶段据认为分枝杆菌是最易受抗体攻击的。因此，本发明的抗体可作用于释放的杆菌上，并发挥了感染后效果。因此，下述是可能的：通过增强本发明的抗体针对分枝杆菌上抗原的可达性而促进了被动保护(即递送本发明的抗体)，以及抗体结合可通过空间位阻或其其低聚结构的破坏而阻碍巨噬细胞感染。因此，作用于由被杀死的、感染的巨噬细胞释放的分枝杆菌属杆菌上的抗体可干扰再次感染传播到新巨噬细胞。这一假设牵扯了抗体和在感染之后初期起作用的细胞毒性T细胞如NK T细胞之间的协同作用，但也可随后牵扯CD8和CD4细胞毒性T细胞。
在以下讨论的治疗用途和方法的上下文中，“受试者”是得益于针对分枝杆菌如结核分枝杆菌的免疫应答的刺激的任何动物受试者。通常动物受试者为哺乳动物，例如人、牛、猪、绵羊、山羊、马、乌鸦、犬科或猫科受试者。在一个实施方案中，受试者为人、牛、猪或马。
根据本发明的一个方面，提供了第一分枝杆菌抗原和(任选地)第二分枝杆菌抗原用于生产刺激受试者体内例如哺乳动物(如人、牛、猪或马受试者)免疫应答的药剂的用途；其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i)前文所定义的多肽序列；或
(ii)前文所定义的编码根据(i)的多肽序列的多核苷酸序列；
以及其中所述任选的第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
本发明还提供了第一分枝杆菌抗原和(任选地)第二分枝杆菌抗原，用于刺激受试者体内，例如哺乳动物受试者(如人、牛、猪或马受试者)的免疫应答；其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i)前文所定义的多肽序列；或
(ii)前文所定义的编码根据(i)的多肽序列的多核苷酸序列；
以及其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包括或由以下组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，例如(i)或(ii)所定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，本发明提供了(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和任选地(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸，用于在受试者体内刺激免疫应答，其中
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；
(ii)前文所定义的所述第一分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的核苷酸序列；
(iii)前文所定义的所述任选的第二分枝杆菌抗原多肽；和
(iv)前文所定义的所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包括编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和任选地(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸，用于在受试者体内刺激免疫应答；其中
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；
(ii)前文所定义的所述第一分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的核苷酸序列；
(iii)所述任选的第二分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；和
(iv)前文所定义的所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包括编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，通过体内存活测定法中的保护效应来测量免疫刺激。在一个实施方案中，通过对疫苗内抗原特异性的免疫细胞如T淋巴细胞的提高的频率——即免疫细胞应答(如T细胞免疫应答)来测量免疫刺激。在一个实施方案中，免疫刺激是记忆T细胞免疫应答，如中心记忆T细胞应答(如CCR7+应答)。在一个实施方案中，通过抗体效价(antibody titer)的提高来测量免疫刺激，该抗体效价对疫苗内抗原是特异性的。
在一个实施方案中，所述药剂进一步包括如本文所描述的一种或多种附加分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，如本文所描述的一种或多种附加分枝杆菌抗原还可与所述第一和第二分枝杆菌抗原一起使用。在这个治疗用途的一个实施方案中，所述第一和任选的第二(和任选的附加分枝杆菌抗原)是以本文多描述的抗原组合物的形式提供的。在一个实施方案中，一种或多种所述第一、第二和/或任选的附加分枝杆菌抗原可包括在本文所描述的一种或多种载体或细胞内。在这个治疗用途的一个实施方案中，所述第一和任选的第二分枝杆菌抗原(和任选的附加分枝杆菌抗原)用于基本上同时或者顺序地施用到受试者。同时的或顺序的给药方案将在下文更加详细讨论。
本发明还提供了第一分枝杆菌抗原和任选的第二分枝杆菌抗原用于生产治疗或预防受试者，例如哺乳动物受试者(如人、牛、猪或马受试者)，的分枝杆菌感染(如结核分枝杆菌感染)的药剂的用途；其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i)前文所定义的多肽序列；或
(ii)前文所定义的编码根据(i)的多肽序列的多核苷酸序列；
以及其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
本发明还提供了第一分枝杆菌抗原和任选地第二分枝杆菌抗原，用于治疗或预防受试者，例如哺乳动物受试者(如人、牛、猪或马受试者)的分枝杆菌感染(如结核分枝杆菌感染)；其中所述第一分枝杆菌抗原包括：、
(i)前文所定义的多肽序列；或
(ii)编码根据(i)的前文的多肽序列的多核苷酸序列；
和其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包括以下或由以下组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，例如在(i)或(ii)所定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，本发明提供了(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和任选地(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸，用于治疗或预防受试者分枝杆菌感染(如结核分枝杆菌感染)；其中：
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；
(ii)前文所定义的所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包括编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述任选的第二分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；和
(iv)前文所定义的所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包括编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
例如，所述用途或药剂可保护受试者避免感染分枝杆菌如结核分枝杆菌。例如，合适的受试者包括人、牛、猪或马受试者。在一个实施方案中，所述药剂进一步包括如本文所描述的一种或多种附加分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，如本文所描述的一种或多种附加分枝杆菌抗原，还可与所述第一和第二分枝杆菌抗原一起使用。
在这个治疗用途的一个实施方案中，以本文所描述的抗原组合物的形式提供所述第一和第二(和任选的附加分枝杆菌抗原)。在一个实施方案中，一种或多种所述的第一、第二和/或任选的附加分枝杆菌抗原可包括在本文所描述的一种或多种载体或细胞内。在这个治疗用途的一个实施方案中，所述第一和第二分枝杆菌抗原(和任选的附加分枝杆菌抗原)用于基本上同时地或顺序地施用到受试者。
相关的方面包括刺激受试者体内免疫应答的方法，包括向受试者，例如哺乳动物(如人、牛、猪或马受试者)施用有效量的第一分枝杆菌抗原和任选的第二分枝杆菌抗原；
其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i)前文所定义的多肽序列；或
(ii)编码前文所定义的根据(i)的多肽序列的多核苷酸序列；
和其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述任选的第二分枝杆菌抗原包括以下或由以下组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，例如在(i)或(ii)所定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，本发明提供了刺激受试者体内免疫应答的方法，包括向所述受试者施用：(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和任选地(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中：
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；
(ii)前文所定义的所述第一分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；和
(iv)前文所定义的所述第二分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，通过体内存活测定中的保护效果来测量免疫刺激。在一个实施方案中，通过免疫细胞诸如T淋巴细胞提高的频率——即免疫细胞应答(如T细胞免疫应答)来测量免疫刺激，该免疫细胞对疫苗内抗原是特异性的。在一个实施方案中，免疫刺激为记忆T细胞免疫应答，如中心记忆T细胞应答(如CCR7+应答)。在一个实施方案中，通过抗体效价的提高来测量免疫刺激，该抗体效价对疫苗内抗原是特异性的。在一个实施方案中，所述方法进一步包括施用本文所描述的一种或多种附加分枝杆菌抗原。在这个治疗方法的实施方案中，以本文所描述的抗原组合物或制剂的形式提供所述第一和任选的第二(和任选的附加分枝杆菌抗原)。在一个实施方案中，一种或多种所述第一、第二和/或任选的附加分枝杆菌抗原可包括在本文所描述的一种或多种载体或细胞内。在这个治疗方法的一个实施方案中，本文所描述的与所述第一和/或第二分枝杆菌抗原(和/或任选的附加分枝杆菌抗原)相关的任何限制同样适用于其治疗用途。在一个实施方案中，该方法包括向受试者基本上同时地或顺序地施用所述第一和第二分枝杆菌抗原。同时的和顺序的给药方案将在下文更加详细地讨论。
在相关的方面，提供了治疗或预防分枝杆菌感染(如结核分枝杆菌感染)的方法，包括向受试者，例如哺乳动物(比如人、牛、猪或马受试者)施用有效量的第一分枝杆菌抗原和任选的第二分枝杆菌抗原；
其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i)前文所定义的多肽序列；或
(ii)编码根据(i)的多肽序列的前文所定义的多核苷酸序列；
以及其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包括以下或由以下组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，例如在(i)或(ii)所定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。在一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防受试者分枝杆菌感染(如结核分枝杆菌感染)的方法；包括向所述受试者施用(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌都核苷酸，和任选地(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中：
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；
(ii)前文所定义的所述第一分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；和
(iv)前文所定义的所述第二分枝杆菌多核苷酸。
例如，所述方法可保护受试者避免感染分枝杆菌比如结核分枝杆菌。例如，所述方法可治疗受试者TB。在一个实施方案中，所述方法可保护受试者避免分枝杆菌比如结核分枝杆菌的早期感染。早期分枝杆菌感染在上文中被定义。在一个实施方案中，所述方法进一步包括施用本文所描述的一种或多种附加分枝杆菌抗原。在这个治疗方法的一个实施方案中，以本文所描述的抗原组合物的形式提供所述第一和任选的第二(和任选的附加分枝杆菌抗原)。在一个实施方案中，一种或多种所述第一、第二和/或任选的附加分枝杆菌抗原可包括在本文所描述的一种或多种载体或细胞内。在一个实施方案中，该方法包括将所述第一和第二分枝杆菌抗原基本上同时地或顺序地施用至受试者。在相关的方面，本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原、抗原组合物、抗体、免疫原性组合物或药剂，如本文所定义的，可用于治疗(包括预防性治疗)一系列的分枝杆菌疾病，不限于肺结核(TB)、麻风病、禽分枝杆菌感染(M.avium infection)、牛分枝杆菌感染、副结核分枝杆菌感染、溃疡分枝杆菌感染(如伯鲁利溃疡)或其他的非肺结核分枝杆菌感染。
本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原、抗原组合物、抗体、免疫原性组合物或药剂可用于诱导一系列的免疫应答并因而可用于治疗一系列疾病的方法。在一个实施方案中，本发明的第一和任选的第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原、抗原组合物或药剂用于治疗或预防其中涉及分枝杆菌的一系列的非分枝杆菌疾病。例如，得益于本发明的药剂的疾病包括炎症疾病，例如自身免疫病、癌症(如膀胱癌)、炎症性肠道疾病、克隆氏病(Crohn’s Disease)、副结核病(Johne’s Disease)、麻风病(Hansen’s Disease)、骨髓炎、淋巴腺炎、天花或猴痘。
如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”涵盖了治疗性的或预防性/预防的措施，并包括感染后治疗和改善/抑制分枝杆菌感染。如本文所使用的，术语“预防”包括预防分枝杆菌感染的起始和/或减少分枝杆菌感染的严重性和强度。如本文所使用的，术语“疫苗效力”描述了疫苗保护受试者(通常为哺乳动物受试者如人、牛、猪或马受试者)避免分枝杆菌比如结核分枝杆菌的攻击的能力。通过示例的方式，“疫苗效力”可指疫苗在预防分枝杆菌感染的启动和/或降低分枝杆菌感染的严重性/强度中的效力。
治疗性/预防性组合物或药剂可被施用至已经具有分枝杆菌感染、与分枝杆菌感染相关的病症或症状的受试者(通常为哺乳动物受试者如人、牛、猪或马受试者)以治疗或预防所述分枝杆菌感染。在一个实施方案中，受试者被怀疑已与分枝杆菌接触，或者已知已与分枝杆菌接触，但是还未表现出暴露的症状。在一个实施方案中，受试者具有早期感染。当向已经具有分枝杆菌感染或疾病的或者正在表现与分枝杆菌感染相关的症状的受试者(如哺乳动物比如人、牛、猪或马受试者)施用时，该治疗性组合物/药剂能够治愈、延缓、降低严重性，或者改善一种或多种症状，和/或使受试者的存活延长超过在没有此类治疗时所预期的存活期。可选地，治疗性/预防性组合物或药剂可被施用到最终可能获得分枝杆菌感染的受试者(例如哺乳动物比如人、牛、猪或马受试者)以预防、治愈、延缓、降低严重性，或者改善一种或多种所述分枝杆菌感染的症状，或以使受试者的存活延长超过在没有此类治疗时预期的存活期。在一个实施方案中，受试者之前已经暴露于分枝杆菌。例如，受试者在过去可能已经具有分枝杆菌感染(但是任选地不是目前感染分枝杆菌)。受试者可能处于分枝杆菌潜伏感染。可选地，或另外地，受试者可能在过去已经接种针对分枝杆菌感染的疫苗(如受试者之前已经接受BCG疫苗接种)。
本发明的治疗和预防性治疗法适用于各种不同年龄的不同受试者。在人类的情况下，治疗法适用于儿童(如婴儿、5岁以下的儿童、较大的儿童或青少年)和成年人。在其他动物受试者的情况下(如哺乳动物比如牛、猪或马受试者)，治疗法适用于不成熟的受试者(如牛犊、猪崽、马驹)和成熟/成年受试者。本发明的治疗和预防性治疗法适用于免疫功能不全的或免疫抑制的受试者(如具有HIV或AIDS的人类患者，或具有可比的免疫缺陷疾病的其他的动物患者)，已经历器官移植、骨髓移植的受试者，或者具有遗传性免疫缺陷的受试者。
本发明提供了治疗性制剂、药剂和预防性制剂(如疫苗)，包括药物可接受的载体、如上所定义的本发明的第一分枝杆菌抗原和如上所定义的本发明的第二分枝杆菌抗原，(和任选地本发明的如上所描述的一种或多种附加分枝杆菌抗原)。在一个实施方案中，本发明提供了治疗性或预防性制剂(如疫苗)，包括药物可接受的载体和：
(a)第一分枝杆菌抗原，其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i)前文所定义的多肽序列；或
(ii)前文所定义的编码根据(i)的多肽序列的多核苷酸序列；
和任选地
(b)第二分枝杆菌抗原，其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原；
其中所述制剂用于同时的或顺序的施用所述第一和第二分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包括以下或由以下组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，例如在(i)或(ii)所定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，所述治疗性或预防性制剂(如疫苗)包括(a)药物可接受的载体；(b)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸；和任选地(c)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中：
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；
(ii)前文所定义的所述第一分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；和
(iv)前文所定义的所述第二分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列；
其中所述制剂用于同时的或顺序的施用所述第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸和所述第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的所述治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)包括如上所定义的本发明的抗原组合物。在一个实施方案中，所述治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)包括含有如上所描述的一种或多种载体或细胞的抗原组合物，其中所述载体或细胞包括至少一种分枝杆菌抗原。在所述治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)的一个实施方案中，本文所描述的关于所述第一和/或第二(或附加)分枝杆菌抗原的任何限制同样适用于所述治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)。在一个实施方案中，本发明的疫苗为包括如上所描述的一种或多种载体的“载体疫苗”。
在一个实施方案中，本发明的治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)用于同时施用所述第一和第二(和/或任选的附加)分枝杆菌抗原。在备选的实施方案中，本发明的治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)用于顺序地施用所述第一和第二(和/或任选的附加)分枝杆菌抗原。本发明的治疗性制剂、药剂和预防性制剂(如疫苗)包括药物可接受的载体，和任选地一种或多种盐、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。在一个实施方案中，本发明的治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)可包括一种或多种选自如免疫球蛋白、抗生素、白细胞介素(如IL-2,IL-12)和/或细胞因子(如IFN-γ)的免疫调节剂。在一个实施方案中，本发明的治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)可包括一种或多种抗菌化合物，例如常规的抗结核药物(如利福平，异烟肼，乙胺丁醇或吡嗪酰胺)。
因此，在一个方面，本发明提供了生产治疗性或预防性制剂(如疫苗)的方法，该方法包括将药物可接受的载体与以下相结合：如上所定义的本发明的第一分枝杆菌抗原；和如上所定义的本发明的第二分枝杆菌抗原(和任选地如上上定义的一种或多种附加分枝杆菌抗原)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了生产治疗性或预防性制剂(如疫苗)的方法，该方法包括将药物可接受的载体与以下相结合：
(a)第一分枝杆菌抗原，其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i)前文所定义的多肽序列；或
(ii)前文所定义的编码根据(i)的多肽序列的多核苷酸序列；
和任选地
(b)第二分枝杆菌抗原，其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌包括以下或由以下组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，例如在(i)或(ii)所定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，本发明提供了生产治疗性或预防性制剂(如疫苗)的方法，该方法包括：
将药物可接受的载体与以下的任一结合：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多核苷酸序列；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包括前文所定义的编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
和任选地与以下任一结合：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包括前文所定义的多肽序列；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中前文所定义的所述第二分枝杆菌多核苷酸包括编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述分枝杆菌抗原是以本发明的如上所定义的抗原组合物的形式。在一个实施方案中，该方法进一步包括将所述药物可接受的载体和分枝杆菌抗原(或抗原组合物)与一种或多种盐、赋形剂、稀释剂、佐剂、免疫调节剂和/或抗菌化合物相结合。
如本文所使用的，“疫苗”是制剂，当将其施用至动物受试者例如哺乳动物(如人、牛、猪、绵羊、山羊、马、乌鸦、犬科或猫科受试者)时，可刺激针对分枝杆菌感染的保护性免疫应答。免疫应答可以是体液和/或细胞介导的免疫应答(如T细胞应答)。本发明的疫苗能用于，例如，保护动物免受分枝杆菌感染(如结核分枝杆菌感染)比如早期感染的效果。本发明的第一和第二分枝杆菌抗原(如多肽)的表位免疫原性可通过如下方法增强：通过在哺乳动物或酵母系统中与颗粒形成蛋白诸如例如与乙肝表面抗原相关的颗粒形成蛋白融合或装配而制备。在一个实施方案中，疫苗包括至少一种已被化学改良剂(如甲醛)处理的分枝杆菌多肽，从而提供改善效力的疫苗。
本发明的多肽和/或多核苷酸可以配制呈中性或盐形式的疫苗。药物可接受的盐包括酸加成盐，其与无机酸比如，诸如盐酸或磷酸，或者与有机酸比如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成。与游离羧基形成的盐也可由以下得到：无机碱，比如，诸如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，和有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
施用治疗性制剂、药剂和预防性制剂(如疫苗)通常通过常规途径，如静脉内、皮下、腹膜内或粘膜(例如鼻内)的途径。该施用可通过肠胃外注射，比如皮下或肌肉注射。包含有中和抗体的制剂可特别适用于静脉、肌肉、皮内或皮下给药。因此，本发明的治疗性制剂、药剂和预防性制剂(如疫苗)通常制备为可注射的液体溶液或悬浮液。备选地也可制备为适合在注射之前溶解在或悬浮在液体中的固体形式。制剂还可被乳化，或将肽包封于脂质体或微胶囊中。活性免疫原性成分时常与药学上可接受的并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如果需要，疫苗可包含少量的辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、和/或增强疫苗效力的佐剂。通常，载体为药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的非限制性示例包括水、盐水和磷酸缓冲盐水。在一些实施方案中，然而，组合物是以冻干的形式，在该情况下其可包括稳定剂比如BSA。在一些实施方案中，为促进长期储存可能需要用防腐剂比如硫柳汞或叠氮化钠来配制制剂。有效的佐剂的示例包括但不限于弗氏完全佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IVA)、皂苷、皂苷的纯化提取级分比如Quil A、皂苷的衍生物比如QS-21、基于皂苷的脂质颗粒比如ISCOM/ISCOMATIX、大肠杆菌热不稳定毒素(LT)突变体比如LTK63和/或LTK72、氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637,称为nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1-'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和RIBI，其包含以2％角鲨烯/Tween 80乳液从细菌提取的三种组分，单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。缓冲剂的示例包括但不限于，琥珀酸钠(pH 6.5)、磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 6.5and 7.5)。适合于其他给药模式的另外制剂包括栓剂，以及在某些情况下，口服制剂或适于分配为气雾剂的制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括，例如，聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)或甘油三酯；此类栓剂可由包含约0.5％至10％，优选1％-2％的范围内的活性成分的混合物形成。口服制剂包括普通使用的赋形剂比如，例如，药学级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物表现为溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式。
在分枝杆菌呼吸道感染(比如结核分枝杆菌感染)的情况下，治疗性/预防性组合物或药物有效传送到肺中的感染位点可通过口服或鼻内给药(i.n.)实现。这些递送模式对应于结核分枝杆菌感染的递送路径。在基于抗体组合物的情况下，这些递送模式确保了抗体存在于感染位点，以便在细菌进入细胞内之前以及在细菌在细胞之间传播期间将其消灭。用于鼻内给药的制剂可以是鼻腔滴剂或鼻腔喷雾的形式。鼻内制剂可包括滴剂，该滴剂具有约100-5000μm范围比如500-4000μm、1000-3000μm或100-1000μm的直径。可选地，在体积上，该滴剂可在约0.001-100μl的范围，比如0.1-50μl或1.0-25μl，或者比如0.001-1μl。可选地，治疗性/预防性制剂或药剂可以是喷雾制剂。该喷雾制剂可以是粉末、悬浮液或溶液的形式。喷雾颗粒的尺寸与喷雾的递送能力相关。相比于较大的颗粒，较小的颗粒可从呼吸道进一步向下行进至肺泡。在一个实施方案中，喷雾颗粒具有便于沿着支气管、细支气管和肺泡的整个长度进行传递的直径分布。可选地，可选择颗粒的直径分布以便靶向呼吸道的特定部分，例如肺泡。在药剂喷雾递送的情况下，颗粒可具有约0.1-50μm范围内的直径,优选地1-25μm，更优选地1-5μm。喷雾颗粒可使用雾化器(如通过口腔)或鼻内喷雾用于递送。喷雾制剂可任选地包括推进剂和/或表面活性剂。以下是可能的：在分枝杆菌抗原或抗体的鼻内递送之后，粘膜分泌物的逆流有利于该抗原或抗体到肺的通道，尽管认为呼吸道内的粘液纤毛作用是将粘液中的颗粒从肺中带出。在肺冲洗液中相对较长的保存期，从胆汁中快速清除和缺乏一些抗体向唾液的传输表明了粘膜位点特异性机制的作用。通过将滴剂/颗粒的尺寸控制在本发明定义的范围内，可避免(或最小化)向肺泡的非故意的抗原递送，并从而避免了肺泡相关的病理学问题比如炎症和肺的纤维化疤痕。鼻内疫苗接种使得在鼻腔和支气管内的T和B细胞二者介导的效应机制与粘膜组织相关联，其不同于其他的粘膜相关的淋巴组织。鼻内给药途径唤起的保护机制可包括：通过优选的肺归巢激活T淋巴细胞；上调协同刺激分子(eg.B7.2)；和/或激活巨噬细胞或分泌性IgA抗体。抗原的鼻内递送可有助于唤起粘膜抗体应答，T细胞应答向有助于抗体生产的Th2表现型转换对其有利。粘膜应答是由增强的IgA生产来表征的，并且Th2应答是由增强的IL-4生产来表征的。本发明分枝杆菌抗原的鼻内传递允许抗原靶向呼吸系统的亚粘膜B细胞。这些B细胞是哺乳动物体内主要的局部IgA生产细胞，并且通过这些针对分枝杆菌抗原的细胞鼻内传递促进了IgA产量的快速提高。在一个实施方案中，本发明的治疗性/预防性制剂或药剂刺激粘膜和/或Th2免疫应答。在另一个实施方案中，IgA抗体产量被刺激，并且IgA抗体结合到分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原或抗体用于同时给药。因此，在一个实施方案中，本发明的方法/用途包括将第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原同时给药。同时给药意指(基本上)在相同时间给药。例如，在一个实施方案中，第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原彼此在5分钟之内，比如彼此在4、3、2或1分钟之内，例如彼此在30秒之内被施用至受试者。在一个实施方案中的“同时给药”，本发明的至少两种组分(如抗原)被组合成为一种组合物(如本文所定义的本发明的单一抗原组合物或免疫原性组合物)。这种组合物被施用至受试者(如哺乳动物——比如人、牛、猪、绵羊、山羊、马、乌鸦，犬科或猫科受试者)，从而向受试者同时提供两种组分。在备选的实施方案中“同时给药”，本发明的至少两种组分(如抗原)彼此分别提供给受试者，但是在(基本上)相同的时间施用至受试者(如哺乳动物——比如人、牛、猪、绵羊、山羊、马、乌鸦，犬科或猫科受试者)。所述单独组合物的并行/平行给药在(基本上)相同的时间向受试者提供两种组分。通过示例的方式，本发明的治疗性或预防性制剂(如疫苗)可包括在第一组合物中的第一分枝杆菌抗原和在第二组合物中的第二分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原用于在(基本上)相同的位点同时给药。因此，在一个实施方案中，本发明的方法/用途包括将第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌在(基本上)相同的位点同时给药。在这方面，以下被认为是有利的：将常规多价疫苗的每一不同抗原组分施用至受试者身体的不同位点，以便刺激不同的淋巴结。将常规多价疫苗的不同抗原组分施用至不同位点也被认为是有利的，以便减少或避免不良的抗原竞争。
在一个实施方案中，本发明有利地避免了将每一不同的抗原成分施用至受试者身体的不同部位/位置的需求。在这方面，在一个实施方案中，与关于已知的多价疫苗组合物可能已经预测到的竞争效果相比较，本发明的第一和第二(和任选的附加)抗原(基本上)不互相竞争，或者与相对低水平的抗原竞争相关。假如本发明的至少两种成分(如抗原)结合成为单一的组合物(例如如本文所定义的本发明的单一抗原组合物或免疫原性组合物)，则明显的是本发明的所有成分在相同的部位施用至受试者。在一个实施方案中，假如本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原是彼此分开提供，用于在(基本上)相同的时间同时的、平行的施用至受试者，则所述分开的组合物在受试者上/中相同的(或基本上相同的)部位施用。
在一个实施方案中，在受试者上/中(基本上)相同的部位施用意指本发明每一分枝杆菌抗原施用的部位在本发明其他分枝杆菌抗原施用部位的附近或者紧挨着。备选地，在受试者上/中(基本上)相同的部位施用意指本发明每一分枝杆菌抗原施用的部位准确地位于本发明的其他分枝杆菌抗原施用的部位。通过示例的方式，本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原可用于施用至受试者的相同的静脉、动脉或肌肉，或通过受试者的同一鼻孔施用；或施用至受试者的相同肢体(如手臂)上(例如施用至受试者的相同上臂)；或本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原可全部用于口服或舌下施用。在一个实施方案中，本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原可全部用于在相同的淋巴结或紧邻相同的淋巴结施用。可选地，本发明的分枝杆菌抗原用于顺序地(即一种接一种)施用至受试者(例如人、牛、猪、绵羊、山羊、马、乌鸦、犬科或猫科受试者)。在这个实施方案中，本发明的至少两种成分(如抗原)是彼此分开提供的，并顺序地施用至受试者。通过示例的方式，本发明的治疗性或预防性制剂(如疫苗)可包括第一组合物中的第一分钟杆菌抗原和第二组合物中的第二分枝杆菌抗原。所述第一和第二组合物的顺序施用将两种成分一种接一种地提供给受试者。因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括施用第一分枝杆菌抗原，并然后施用第二分枝杆菌抗原。可选地，可施用第二分枝杆菌抗原，然后施用第一分枝杆菌抗原。任何附加分枝杆菌抗原可与第一和/或第二分枝杆菌抗原共同施用。可选地，任何附加分枝杆菌抗原可在第一和/或第二分枝杆菌抗原之前或之后施用。
在一个实施方案中，抗原的每一顺序给药是立即一种接一种进行的。在一个实施方案中，在一个或多个给药之间(如每个之间)存在时间间隔或暂停。顺序给药之间的时间间隔或暂停可以是至少5、10、15或30分钟，或可以是至少1、2、5、12、18或24个小时，或者可以是至少1、2或5天，或者可以是至少1或2周。在一个实施方案中，本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原是在(基本上)相同的位点顺序给药。因此，在一个实施方案中，本发明的方法/用途包括将第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原在(基本上)相同的位点顺序给药。在一个实施方案中，在受试者上/内(基本上)相同的部位用药意指本发明的每一分枝杆菌抗原给药的部位与本发明的其他分枝杆菌抗原给药的部位临近或很靠近。可选地，在受试者上/内(基本上)相同的部位给药意指本发明的每一分枝杆菌抗原给药的部位是本发明的其他分枝杆菌抗原给药部位的确切位点。通过示例的方式，本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原可施用至受试者相同的静脉、动脉或肌肉，或通过受试者的相同鼻孔；或至受试者相同的肢臂(如手臂)(如至受试者的同一上臂)；或者本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原可全部用于口服或舌下给药。在一个实施方案中，本发明的第一和第二(和任选的附加)分枝杆菌抗原可全部施用于同一淋巴结或与其很靠近的淋巴结。
本发明的治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)可以以单剂量方案给予(即基本上一次给予全部剂量)。可选地，本发明的治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)可以以多剂量方案给予。多剂量方案是以下方案：初次处理(如疫苗接种)过程可用1-6个单独剂量，随后在需要的随后时间间隔给予其他剂量以维持和/或加强免疫应答，例如(用于人受试者)，在1-4个月时给予第二剂量，并且如果需要，在进一步1-4个月之后给予随后剂量。剂量方案还将至少部分地依个体的需要并取决于医师(如医生或兽医)的判断来确定。在一个实施方案中，可将本发明的疫苗作为“加强免疫”接种方案的部分而进行给药。
初免-加强接种方案包括：初免——即将受试者暴露于一种或多种抗原或疫苗；并随后：加强——即将受试者暴露于一种或多种抗原或疫苗。“加强”抗原/疫苗通常不同于“初免”抗原/疫苗(称作“异源”加强免疫)。在这方面，相比于用相同的疫苗进行同源加强，异源加强免疫策略已被表明诱导受试者体内更高水平的免疫细胞应答(如效应T细胞应答)。例如，使用常规的疫苗比如BCG进行重复接种并没有显现针对TB进一步增强保护。然而，将BCG合并到异源初免-加强方案中可保持BCG的保护效果。因此，在一个实施方案中，本发明提供了针对分枝杆菌感染的接种方法包括：通过施用异源常规疫苗(如BCG疫苗)来“初免”受试者的免疫系统，并随后通过施用本发明的疫苗来“加强”受试者的免疫系统。在一个实施方案中，本发明提供了针对分枝杆菌感染的疫苗接种方法，包括：通过施用异源常规疫苗(例如BCG疫苗)“初免”受试者的免疫系统，然后通过施用本发明的疫苗“加强”受试者的免疫系统。在一个实施方案中，本发明提供了针对分枝杆菌感染的疫苗接种方法，包括：将本发明的疫苗施用至受试者，该受试者已经预先暴露于异源常规疫苗如BCG。可选地，受试者的免疫系统可通过施用本发明的疫苗而进行“初免”，然后通过施用异源常规疫苗(如BCG疫苗)而进行“加强”。因此，在一个实施方案中，疫苗被使用至受试者，该受试者随后暴露于异源常规疫苗如BCG。“初免”步骤可对任何年龄的受试者进行——在哺乳类受试者的情况下(如人，牛，猪，绵羊，山羊，马，鹿，犬科或猫科受试者)，使用BCG通常是对初生儿，或者婴儿、青少年或成人期间进行初免。“加强”步骤可在“初免”步骤之后的任何时间进行。在哺乳类受试者(如人，牛，猪，绵羊，山羊，马，鹿，犬科或猫科受试者)的情况下，在初免步骤至少约1,2,3,4,5,6,7,8,9或10周之后，或者在初免步骤至少约3,6,8或12个月之后，或者在加强步骤至少约2,5,10,15,20,25,30,35,或40或更多年之后进行加强步骤。在一个实施方案中，对于人受试者，初免步骤是在婴儿期进行的，且加强步骤是在青少年期间进行的。在一个实施方案中，本发明的治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)可连同(同时地或顺序地)一种或多种免疫调节剂施用至受试者，比如哺乳动物(如人，牛，猪，绵羊，山羊，马，鹿，犬科或猫科受试者)，其中该一种或多种免疫调节剂选自，例如，免疫球蛋白、抗生素、白细胞介素(例如，IL-2、IL-12)、和/或细胞因子(例如，IFNγ)。在一个实施方案中，本发明的治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)可连同(同时地或顺序地)以下的一种或多种抗菌化合物施用至受试者比如哺乳动物(如人，牛，猪，绵羊，山羊，马，鹿，犬科或猫科受试者)：例如常规的抗结核药物(如利福平，异烟肼，乙胺丁醇或吡嗪酰胺)。
治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)可包括5％至95％的活性成分，比如至少10％或25％的活性成分，或至少40％的活性成分或至少50、55、60、70或75％的活性成分。治疗性制剂、药剂或预防性制剂(如疫苗)以与所述剂量制剂相容的方式并以预防上和/或治疗上有效的量来施用。在这方面，如本文所使用的，“有效的量”是足够实现期望的生物学成果的剂量或数量。如本文所使用的，“治疗上有效的量”是在单剂量或多剂量施用至受试者(如哺乳动物——如人、牛、猪，绵羊，山羊，马，乌鸦，犬或猫科受试者)时对以下是有效的：治疗、预防、治愈、延缓、降低严重性，缓解至少一种病症或复发病症的症状、或延长受试者的存活期超出在没有此类治疗时的预期。因此，待施用的活性成分的量，通常在5微克至250微克抗原/剂的范围内(或者如果口服传递或以病毒载体的形式更高)，取决于待治疗的受试者、受试者的免疫系统生成保护性免疫应答的能力以及所期望保护的程度。所需施用的活性成分的精确的量可取决于医师的判断，并且对每个受试者可能是特定的。
根据本发明的进一步方面，本发明的第一和第二分枝杆菌抗原(和任选的附加分枝杆菌抗原)，如本文所描述的，用于免疫测定以便检测测试样品中针对所述第一和第二分枝杆菌抗原的抗体的存在。在一个实施方案中，所述第一和第二分枝杆菌抗原(和任选的附加抗原)是以抗原组合物的形式使用的，如本文所描述的。根据本发明的另一方面，本发明的第一和第二抗体(和任选的附加抗体)，如本文所描述的，用于免疫测定以便检测测试样品中所述第一和第二分枝杆菌抗原的存在。在一个实施方案中，所述第一和第二抗体(和任选的附加抗体)是以包含免疫原性抗体的组合物形式使用的，如本文所描述的。
测试样品可以是生物学样品比如临床样品或环境样品。如本文所使用的，“临床样品”指的是从个体分离的组织或流体的样品，包括但不限于，例如血浆，血清，脊髓液，淋巴液，皮肤的外部部分，呼吸道，肠和泌尿生殖道，泪液，唾液，乳汁，血细胞，肿瘤，器官，以及在体外细胞培养成分的样品(包括但不限于在细胞培养基中细胞生长得到的条件培养基、、推定感染的细胞、重组细胞和细胞成分)。在下面讨论的诊断方法的上下文中，“受试者”是受益于分枝杆菌感染如结核分枝杆菌感染的检测的任何动物受试者。典型动物受试者是哺乳动物，例如，人，牛，猪，绵羊，山羊，马，乌鸦，犬或猫科。在一个实施方案中，受试者是人，牛，猪或马。
免疫测定的设计是进行很多变化的，并且许多形式是本领域已知的。方案可基于，例如，竞争、直接反应或夹层式测定。方案还可，例如，使用固定载体，或可使用免疫沉淀。大部分测定涉及使用标记抗体或多肽；该标记可以是，例如，酶的、荧光的、化学发光的、放射性的或燃料分子。包括信号扩增的测定也是已知的；例如，使用生物素和抗生物素蛋白的测定，或者酶标记或介导的免疫测定，例如ELISA测定。在本发明的一个方面，本发明的第一和第二分枝杆菌抗原(或抗原组合物)用于检测患者体内T淋巴细胞的存在，该细胞先前已暴露于分枝杆菌感染抗原组分。因此，在一个实施方案中，本发明提供了诊断分枝杆菌感染的体外方法，例如早期分枝杆菌感染，包括将包含来自受试者(如哺乳动物如人、牛、猪或马受试者)的免疫细胞如T淋巴细胞的测试样品与以下共同温育(“攻击”)：本文所定义的本发明的第一分枝杆菌抗原和本发明的第二分枝杆菌抗原；或者本文所定义的本发明的抗原组合物；和检测所述免疫细胞(如T淋巴细胞)的激活。所述免疫细胞的激活表明了受试者体内的分枝杆菌感染。
在所述体外方法的一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原选自：(i)第一分枝杆菌抗原多肽，包括与SEQ ID NO:1或7氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少50个连续氨基酸的其片段；或(ii)第一分枝杆菌多核苷酸序列，包括编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的第一分枝杆菌多核苷酸序列。在所述体外方法的一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原选自：(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，包括与SEQ ID NO:5氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或(iv)第二分枝杆菌多核苷酸序列，包括编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
先前已暴露于第一和第二分枝杆菌抗原其中一种或两者的免疫细胞，如T淋巴细胞，在随后由相同的抗原攻击时将会“激活”。正因如此，所述免疫细胞(如T淋巴细胞)的激活表明了受试者体内分枝杆菌感染，并提供了用于鉴别分枝杆菌感染正向诊断的方法。相反，之前没有暴露于特定抗原的免疫细胞(如T淋巴细胞)不会实现相同的激活。免疫细胞(如T淋巴细胞)的上述“激活”有时被称为“回忆应答”，且可通过以下测量：例如，通过确定从激活的免疫细胞(如T淋巴细胞)释放的干扰素(如IFN-γ)。因此，患者分枝杆菌感染的存在可通过检测免疫细胞(如T淋巴细胞)的激活来确定，该免疫细胞响应于本发明第一和第二分枝杆菌抗原(或抗原组合物)的体外攻击——如通过在攻击后定义的时间段之后检测来自免疫细胞(如T淋巴细胞)释放的干扰素的最低浓度。上述免疫细胞(如T淋巴细胞)诊断测定可进一步包括抗原递呈细胞(APC)，其表达由正在讨论的患者所表达的至少一种主要组织相容性复合体(MHC)II类分子。APC可在生物样品中被固有提供，或外源添加。在一个实施方案中，T淋巴细胞为CD4 T淋巴细胞。
用于针对分枝杆菌感染的备选免疫测定取决于针对本发明第一和第二分枝杆菌抗原(如多肽)的抗体的检测。此类测定可包括以下步骤：将疑似含有抗体的测试样品(如生物学样品)与本发明所述第一和第二抗原(或抗原组合物)温育。因此，本发明还提供了诊断分枝杆菌感染例如分枝杆菌早期感染的体外方法，该方法包括：将来自受试者(如哺乳动物比如人、牛、猪或马受试者)的测试样品与以下温育：如本文所定义的本发明的第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原；或如本文所定义的本发明的抗原组合物；其中所述温育是在允许所述第一和第二分枝杆菌抗原与样品内的抗体相结合以形成抗原-抗体复合物的环境下进行的；然后检测此类复合物的形成。抗原-抗体复合物的存在表明了受试者体内分枝杆菌感染。
在所述体外方法的一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原选自：(i)第一分枝杆菌抗原多肽，包括如前文所定义的多肽序列；或(ii)第一分枝杆菌多核苷酸序列，包括如前文所定义的编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；和任选地所述第二分枝杆菌抗原选自：(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，包括如前文所定义的多肽序列；和(iv)如前文所定义的第二分枝杆菌多核苷酸序列，包括编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。抗原-抗体复合物(或，在竞争性测定的情况下，竞争抗体的量)可通过许多已知技术的检测，取决于其格式。例如，复合物中未标记的抗体可使用络合有标签(如酶标)的抗异种基因Ig的缀合物进行检测。免疫测定可以是标准的或竞争性的类型。在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原结合于一种或多种固相支持物以便于在温育之后样品从抗体中分离。可使用的固体载体的示例为硝基纤维素(例如以膜或微量滴定孔的形式)，聚氯乙烯(例如片或微量滴定孔)，聚苯乙烯胶乳(例如在小珠或微量滴定板，聚偏二氟乙烯(称为Immulon)，重氮化纸，尼龙膜，活化珠和蛋白A珠。例如，可以使用Dynatech公司Immulon微量滴定板或60mm直径的聚苯乙烯珠(精密塑料球)。通常在将其与测试样品分离之后和在检测结合抗体之前，对包含第一和第二分枝杆菌抗原的固相支持物进行清洗。本发明还涵盖了用于检测测试样品(如生物样品)中本发明的第一和第二分枝杆菌抗原(如多肽)的存在的免疫测定。在此类方法中，疑似包含所述分枝杆菌抗原的测试样品可与针对第一和第二分枝杆菌抗原的抗体一起温育。
因此，本发明提供了诊断分枝杆菌感染如分枝杆菌早期感染的体外方法，包括：将来自受试者(如哺乳动物比如人、牛、猪或马受试者)的测试样品与以下一起温育：本文所定义的本发明的第一抗体和第二抗体；或本文所定义的免疫原性组合物；其中所述温育是在允许所述第一和第二抗体与样品中抗原结合以形成抗原-抗体复合物的环境下进行的；以及然后检测此类复合物的形成，其中抗原-抗体复合物的存在表明了受试者体内分枝杆菌感染。在所述体外方法的一个实施方案中，所述第一抗体与第一分枝杆菌抗原多肽结合；以及所述任选的第二抗体与第二分枝杆菌抗原多肽结合。可能期望在测试之前处理生物样品，以便释放假定细菌组分。各种格式都可以使用。例如，“夹心测定”可被使用，其中结合到固相支持物的抗体与测试样品一起温育；清洗；与针对第一和第二抗原的第二、标记抗体一起温育，以及再次清洗支持物。通过确定第二抗体是否结合到支持物来检测第一和第二分枝杆菌抗原。在竞争性格式中，测试样品通常与抗体和标签一起温育，竞争性抗体也被温育，同时地或顺序地。
在一个方面，本发明提供了免疫测定试剂盒，包括：本发明的抗原组合物，或针对所述第一和第二分枝杆菌抗原的抗体。免疫测定试剂盒可进一步包括缓冲液。贯穿本说明书的术语“多肽”与术语“寡肽”、“肽”、和“蛋白”是同义的。这些术语可交换使用，并且不指产物的特定长度。这些术语涵盖了翻译后修饰如糖基化、乙酰化和磷酸化。在一个实施方案中，本发明的分离的多肽基本上不含与其共生产的其他蛋白，并且基本上不含其他的污染物。例如，分离的多肽基本上不含有来自由其衍生的细胞、细菌或组织源的材料或其他蛋白。
本发明涵盖了与基于任一本申请所鉴定的参考SEQ ID Nos(包括其片段)的多肽基本上同源的多肽。术语“序列同一性”和“序列同源性”在本说明书中被认为是同义的。通过示例的方式，目的多肽可包括与参考多肽的氨基酸序列具有至少70,75,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,99或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
有许多可用来对比两个氨基酸序列建立的算法。通常，一个序列作为将测试序列可与其比较的参考序列。序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性，基于指定的程序参数。用于比较的氨基酸序列比对可以进行，例如通过计算机实现的算法(如GAP,BESTFIT,FASTA or TFASTA),BLAST and BLAST 2.0algorithms,or BLOSUM62-Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919,1992；通过引用并入本文)。在同源比较中，同一性可以在长度为至少50个氨基酸残基的区域上存在(如至少75,100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,600或650个氨基酸残基的长度——如多达参考序列的整个长度)。基本上同源的多肽具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。在许多实施方案中，那些变化是较不重要的，例如，仅仅包括保守氨基酸取代。保守取代是用以下基团中的另一个氨基酸替换一个氨基酸来实现的：碱性的：精氨酸、赖氨酸、组氨酸；酸性的：谷氨酸、天冬氨酸；极性：谷氨酰胺、天冬酰胺；疏水性：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；芳香：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸；小型：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸。基本上同源的多肽还涵盖了那些包括不显著影响多肽的折叠或活性的其他取代；小型(small)缺失，通常1个至约30个氨基酸(如1-10或1-5个氨基酸)；和小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基，多达约20-25个残基小接头肽，或亲和标签。
本发明的多肽还可包括非天然存在的氨基酸残基。在这方面，除了20个标准氨基酸之外，非标准氨基酸(如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可取代本发明分枝杆菌多肽的氨基酸残基。有限的数目的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、和非天然氨基酸可取代分枝杆菌多肽氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基包括，但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟基乙基半胱氨酸、羟基乙基高-半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯基丙氨酸、3-氮杂苯基-丙氨酸、4-氮杂苯基-丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
可执行核苷酸分子的常规缺失分析以得到编码本发明多肽的核苷酸分子的功能片段。作为例证，DNA分子可通过Bal31核酸酶进行酶切以得到一系列的嵌套缺失。随后这些DNA片段被插入到表达载体中合适的阅读框，并且表达多肽被分离并对期望的活性进行测试。核酸外切酶酶切的备选是使用寡核苷酸定向突变以引入缺失，或终止密码子以规定所需片段的生产。可选的，可使用聚合酶链式反应合成特定多核苷酸片段。与参考多肽的序列相比，本发明的多肽的突变体可含有氨基酸的一种或多种衍生物(如非天然氨基酸)，或取代连接(substituted linkage)。在进一步的实施方案中，目的多肽可以是参考多肽的模拟物，其中模拟物复制参考多肽的至少一种表位。本发明的公开的多核苷酸和多肽序列的突变可通过DNA改组生成。简言之，突变DNA是通过体外同源重组生成的：将亲代DNA随机碎片化，随后使用PCR进行重新组装，得到随机引入的点突变。这个技术能够使用亲代DNA的家族进行修饰，以便将附加变异引入到过程中。选择或筛选所需活性，随后诱变和测定的附加迭代，这提供了序列的快速“进化”，通过选择所需诱变并同时淘汰有害变异。上述所公开的诱变方法可与大规模筛选方法结合以检测克隆诱变多肽的活性。编码本发明多肽或其片段的诱变的核苷酸分子可由宿主细胞回收，并使用现代仪器快速测序。这些方法允许快速确定单个氨基酸残基在目的多肽中的重要性，并可被应用于未知结构的多肽。
目的多肽的“片段”包括来自所述多肽序列的一系列连续氨基酸残基。通过示例的方法，目的多肽的“片段”可包括(或由其组成)来自所述多肽序列的至少50个连续氨基酸残基(如所述多肽的至少75,100,125,150,175,200,225,250,275,300个连续氨基酸残基)。一个片段包括目的多肽的至少一种表位。
如本文所使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”可交换使用且不暗含任何长度限制。如本文所使用的，术语“核酸(nucleic acid)”和“核苷酸(nucleotide)”可交换使用。术语“核酸序列”和“多核苷酸”涵盖了DNA(包括cDNA)和RNA序列。本发明的多核苷酸序列包括已经从其天然存在环境中分开的核酸序列、重组或克隆DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。编码所述片段的天然的或合成的DNA片段可合并到能够引入到原核或真核细胞中并复制的重组核酸构建体，通常为DNA构建体。通常DNA构建体适于在单细胞宿主例如酵母菌或细菌中自主复制，然而也可旨在引入和整合到培养昆虫、哺乳动物、植物或其他真核细胞系的基因组。本文所使用的术语“重组”意指基因组、cDNA、半合成的或合成的来源的多核苷酸，借助其来源或操作，其：(1)不与天然结合的多核苷酸的所有或部分相结合；或(2)连接到除了天然所连接多核苷酸之外的多核苷酸；和(3)天然不存在的。当应用于核酸序列时，本发明的情形中，术语“分离的”表示已经从其天然遗传环境中分开的多核苷酸序列，并从而不含有其他外来的或不需要的编码序列(但可能包括天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子)，并且是适于在基因工程蛋白质生产系统中使用的形式。此类分离的分子是那些从其天然环境中分离的。“变异体”核酸序列与参考核酸序列(或其片段)基本上同源或基本上相似。当与其他核酸(或其互补链)优化比对(伴随适当的核苷酸插入或缺失)时，在至少约70％,75％,80％,82,84,86,88,90,92,94,96,98或99％核苷酸碱基具有核苷酸序列同一性，则该核酸序列或其片段与参考序列“基本上同源”(或“基本上同一”)。同源确定是如上文所述的用于多肽而进行的。可选的，假如“变异体”和参考序列能够在严格的(如高度严格的)杂交环境下杂交，则该“变异”核酸序列与参考序列(或其片段)是基本上同源的(或基本上同一的)。核酸序列杂交除了碱基组成、互补链的长度和杂交核酸之间核苷酸碱基错配的数目之外，还受以下环境的影响：例如盐浓度(如NaCl)、温度或有机溶剂，这是本领域技术人员容易理解的。优选使用严格的温度环境，通常包括温度超过30℃，典型地超过37℃，优选地超过45℃。严格的盐环境通常为小于1000mM，典型地小于500mM，优选地小于200mM。pH值通常7.0和8.3之间。参数的组合比任何单一参数更为重要。目的多核苷酸“片段”包括来自所述全长多核苷酸序列的一系列连续氨基酸残基。通过示例的方式，目的多核苷酸“片段”可包括(或由其组成)来自所述多肽序列的至少150个连续核酸残基(如所述多核苷酸的至少200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700或750个连续核酸残基)。片段编码相应目的多肽的至少一种抗原表位。
SEQ ID No.1
atgtggtggttccgccgccgagaccgggcgccgctgcgcgccaccagctcattatccctgcggtggcgggtcatgctgctggcgatgtccatggtcgcgatggtggttgtgctgatgtcgttcgccgtctatgcggtgatctcggccgcgctctacagcgacatcgacaaccaactgcagagccgggcgcaactgctcatcgccagtggctcgctggcagctgatccgggtaaggcaatcgagggtaccgcctattcggatgtcaacgcgatgctggtcaaccccggccagtccatctacaccgctcaacagccgggccagacgctgccggtcggtgctgccgagaaggcggtgatccgtggcgagttgttcatgtcgcggcgcaccaccgccgaccaacgggtgcttgccatccgtctgaccaacggtagttcgctgctgatctccaaaagtctcaagcccaccgaagcagtcatgaacaagctgcgttgggtgctattgatcgtgggtgggatcggggtggcggtcgccgcggtggccggggggatggtcacccgggccgggctgaggccggtgggccgcctcaccgaagcggccgagcgggtggcgcgaaccgacgacctgcggcccatccccgtcttcggcagcgacgaattggccaggctgacagaggcattcaatttaatgctgcgggcgctggccgagtcacgggaacggcaggcaaggctggttaccgacgccggacatgaattgcgtaccccgctaacgtcgctgcgcaccaatgtcgaactcttgatggcctcgatggccccgggggctccgcggctacccaagcaggagatggtcgacctgcgtgccgatgtgctggctcaaatcgaggaattgtccacactggtaggcgatttggtggacctgtcccgaggcgacgccggagaagtggtgcacgagccggtcgacatggctgacgtcgtcgaccgcagcctggagcgggtcaggcggcggcgcaacgatatccttttcgacgtcgaggtgattgggtggcaggtttatggcgataccgctggattgtcgcggatggcgcttaacctgatggacaacgccgcgaagtggagcccgccgggcggccacgtgggtgtcaggctgagccagctcgacgcgtcgcacgctgagctggtggtttccgaccgcggcccgggcattcccgtgcaggagcgccgtctggtgtttgaacggttttaccggtcggcatcggcacgggcgttgccgggttcgggcctcgggttggcgatcgtcaaacaggtggtgctcaaccacggcggattgctgcgcatcgaagacaccgacccaggcggccagccccctggaacgtcgatttacgtgctgctccccggccgtcggatgccgattccgcagcttcccggtgcgacggctggcgctcggagcacggacatcgagaactctcggggttcggcgaacgttatctcagtggaatctcagtccacgcgcgcaacctag
SEQ ID No.2
MWWFRRRDRAPLRATSSLSLRWRVMLLAMSMVAMVVVLMSFAVYAVISAALYSDIDNQLQSRAQLLIASGSLAADPGKAIEGTAYSDVNAMLVNPGQSIYTAQQPGQTLPVGAAEKAVIRGELFMSRRTTADQRVLAIRLTNGSSLLISKSLKPTEAVMNKLRWVLLIVGGIGVAVAAVAGGMVTRAGLRPVGRLTEAAERVARTDDLRPIPVFGSDELARLTEAFNLMLRALAESRERQARLVTDAGHELRTPLTSLRTNVELLMASMAPGAPRLPKQEMVDLRADVLAQIEELSTLVGDLVDLSRGDAGEVVHEPVDMADVVDRSLERVRRRRNDILFDVEVIGWQVYGDTAGLSRMALNLMDNAAKWSPPGGHVGVRLSQLDASHAELVVSDRGPGIPVQERRLVFERFYRSASARALPGSGLGLAIVKQVVLNHGGLLRIEDTDPGGQPPGTSIYVLLPGRRMPIPQLPGATAGARSTDIENSRGSANVISVESQSTRAT
SEQ ID No.3
atgacggctccgggactgacagcagccgtcgaggggatcgcacacaacaagggcgagctgttcgcctcctttgacgtggacgcgttcgaggttccgcacggccgcgacgagatctggcggttcaccccgttgcggcggctgcgtggcctgcacgacggctccgcgcgggccaccggtagcgccacgatcacggtcagcgagcggccgggcgtatacacccagaccgtgcgccgcggcgatccacgactgggcgagggcggcgtacccaccgaccgcgttgccgcccaagcgttttcgtcgttcaactccgcgactctggtcaccgtcgagcgcgacacccaggtcgtcgagccggtaggcatcaccgtgaccgggccgggggagggcgcggtggcctatgggcacctgcaggtgcgtatcgaggagcttggcgaggcggtcgtggtcatcgaccaccggggcggcggaacctacgccgacaacgtcgagttcgttgtcgacgacgccgctcggctgaccgccgtgtggatcgccgactgggccgacaacaccgttcacctcagcgcgcaccatgctcggatcggcaaggacgcggtgctgcgccacgtcaccgtcatgttgggcggcgacgtggtgcgaatgtcggcgggcgtgcggttctgcggtgcgggtggggacgcggaactgctggggctgtatttcgccgacgacggccagcacctggagtcgcggctgctggtggaccacgcccaccccgactgcaagtcgaacgtgctgtataagggtgcactgcaaggtgatccggcgtcgtcgttgcccgacgcacacacggtctgggtgggtgacgtgctgatccgtgcgcaggccaccggcaccgacaccttcgaggtgaaccggaacctggtgctcaccgacggcgcgcgtgccgactcggtgcccaacctggagatcgagaccggcgagatcgtcggcgccggacacgccagcgccaccggtcgcttcgacgatgagcaattgttctacctgcgttcgcgcggtattcccgaagcacaggcccgccggctggtggtccgcggcttcttcggtgagatcatcgccaagatcgcggtgcccgaggtacgcgagcgcctgaccgcagccatcgaacacgagctggaaatcacggaatcaacggaaaagacaacagtctcatga
SEQ ID No.4
MTAPGLTAAVEGIAHNKGELFASFDVDAFEVPHGRDEIWRFTPLRRLRGLHDGSARATGSATITVSERPGVYTQTVRRGDPRLGEGGVPTDRVAAQAFSSFNSATLVTVERDTQVVEPVGITVTGPGEGAVAYGHLQVRIEELGEAVVVIDHRGGGTYADNVEFVVDDAARLTAVWIADWADNTVHLSAHHARIGKDAVLRHVTVMLGGDVVRMSAGVRFCGAGGDAELLGLYFADDGQHLESRLLVDHAHPDCKSNVLYKGALQGDPASSLPDAHTVWVGDVLIRAQATGTDTFEVNRNLVLTDGARADSVPNLEIETGEIVGAGHASATGRFDDEQLFYLRSRGIPEAQARRLVVRGFFGEIIAKIAVPEVRERLTAAIEHELEITESTEKTTVS
SEQ ID No.5
atggcggttcgtcaggtcaccgtcggctattcggacggcacgcacaagacgatgccggtgcggtgcgaccagacggtcctggatgccgccgaggaacacggcgtggccatcgtcaacgaatgccaaagcgggatatgtggcacctgcgtggccacctgcaccgccggccgctaccagatgggacgcaccgagggactgtccgatgtcgagcgggcggcgcgaaagatcctcacctgccagacgtttgttacctccgattgccggatcgagctgcagtatccggtcgacgacaacgccgccctgctggtcaccggtgacggtgtggtgaccgcggtcgagttggtgtcgcccagcaccgccatcctgcgggtggacacctctggcatggccggcgcgctgagataccgggccggccagttcgcccaattgcaggttcccggtaccaacgtatggcgcaactactcctacgcccatccggccgacggccgcggtgagtgcgagttcatcatcaggttgctgccggacggcgtgatgtcgaattatcttcgcgaccgcgcccagcccggtgaccatatcgcgctgcgctgcagcaagggcagcttttatctgcgcccgatcgtgcgaccggtgatcctggtcgccggaggaaccggcctgtcagcgatcctggcgatggcccagagcctggatgccgatgtcgctcacccggtctacctgctctacggggtcgagcgcaccgaagacctgtgcaagctcgacgaactcaccgagctgcgccgccgcgttggccgcctggaggtgcacgtcgtcgtcgctcgcccggaccccgactgggatgggcgcaccgggctggtcaccgacctgctcgacgagcggatgctggcgagcggtgacgccgacgtgtatctgtgcggtccggtcgccatggtcgacgcagcccgaacctggctggaccacaatggctttcaccgtgtcgggttgtactacgagaagttcgtggccagcggggcggcgcgccgccgcaccccggctcggctggattacgcgggcgtggacattgccgaggtgtgccgccgcggccgcggcaccgcggtggtcatcggcggcagcatcgcgggcatcgcggcggcgaaaatgctcagcgagaccttcgatcgcgtcatcgtgctggagaaggacggcccgcaccgtcgccgcgagggcaggccgggcgcggcacagggttggcacctgcaccacctgctgaccgccgggcagatcgagctggagcgcatcttccctggcatcgtcgacgacatggtgcgcgagggagcgttcaaggtcgacatggccgcgcagtaccgtatccggctgggcggcacctggaagaagcccggcactagtgacatcgagatcgtctgcgcgggaaggccgctgctcgaatggtgtgtgcgccgccggctcgacgacgaaccgcgcatcgacttccgctacgaatcggaggtggccgatctcgccttcgaccgcgccaacaatgccatcgtcggcgtcgccgtggacaatggcgacgccgacggaggcgacggtttgcaggtggtgcccgccgagttcgtcgtggacgcgtcgggcaagaacacccgcgtgccggagttcttggagcgtctcggtgttggcgctcccgaggccgagcaggacatcatcaactgcttctactccacgatgcagcaccgggttccgccggagcggcggtggcaggacaaggtgatggtgatctgctatgcgtaccgccctttcgaggatacctacgccgcgcagtactacaccgacagctcccgcaccatcctgtccacctcactggtggcctacaactgctattcgccgccgcgtaccgcccgagaattccgcgcgttcgccgacctgatgccgtccccggtcatcggggagaacatcgacgggctggagccggcatcgcccatctacaatttccgctatcccaacatgctgcggctgcgctacgagaagaagcgcaacctgccgcgggctttgctggcggtgggcgatgcctacaccagcgccgacccggtgtcgggtctgggtatgagcctggcgctcaaggaagttcgggagatgcaggcgctgctggctaaatacggcgccggtcaccgggatctgccgcgccggtactaccgggcgatcgccaagatggccgacacggcctggttcgtgatccgcgagcagaacctgcgcttcgactggatgaaggacgtcgacaagaagcgcccgttctatttcggtgtgctgacctggtacatggaccgcgtgctggagctggtgcatgacgatctcgacgcgtaccgggaattcttggccgtcgtccatctggtcaagccgccgtcggcgctgatgcgacccaggatcgccagccgcgtcctcggcaaatgggcacgaacccgattgtcgggccagaagacgttgattgcccgcaactacgaaaatcatccgataccagccgaacccgcggaccaacttgtaaacgcttag
SEQ ID No.6
MAVRQVTVGYSDGTHKTMPVRCDQTVLDAAEEHGVAIVNECQSGICGTCVATCTAGRYQMGRTEGLSDVERAARKILTCQTFVTSDCRIELQYPVDDNAALLVTGDGVVTAVELVSPSTAILRVDTSGMAGALRYRAGQFAQLQVPGTNVWRNYSYAHPADGRGECEFIIRLLPDGVMSNYLRDRAQPGDHIALRCSKGSFYLRPIVRPVILVAGGTGLSAILAMAQSLDADVAHPVYLLYGVERTEDLCKLDELTELRRRVGRLEVHVVVARPDPDWDGRTGLVTDLLDERMLASGDADVYLCGPVAMVDAARTWLDHNGFHRVGLYYEKFVASGAARRRTPARLDYAGVDIAEVCRRGRGTAVVIGGSIAGIAAAKMLSETFDRVIVLEKDGPHRRREGRPGAAQGWHLHHLLTAGQIELERIFPGIVDDMVREGAFKVDMAAQYRIRLGGTWKKPGTSDIEIVCAGRPLLEWCVRRRLDDEPRIDFRYESEVADLAFDRANNAIVGVAVDNGDADGGDGLQVVPAEFVVDASGKNTRVPEFLERLGVGAPEAEQDIINCFYSTMQHRVPPERRWQDKVMVICYAYRPFEDTYAAQYYTDSSRTILSTSLVAYNCYSPPRTAREFRAFADLMPSPVIGENIDGLEPASPIYNFRYPNMLRLRYEKKRNLPRALLAVGDAYTSADPVSGLGMSLALKEVREMQALLAKYGAGHRDLPRRYYRAIAKMADTAWFVIREQNLRFDWMKDVDKKRPFYFGVLTWYMDRVLELVHDDLDAYREFLAVVHLVKPPSALMRPRIASRVLGKWARTRLSGQKTLIARNYENHPIPAEPADQLVNA
SEQ ID No.7
atgaccacaacgactacaacgatttctggggggatattacccaaggaataccaagatcttcgggatacggtggccgattttgcgcgcaccgtggtcgcgccggtatcggccaaacacgatgcggaacacagcttcccatacgaaattgtcgccaagatgggagagatgggcctgttcgggctgccgtttccggaggagtacggcggcatgggcggcgactacttcgcgctgtcgctggtacttgaggagctgggcaaggttgaccaatcggtagcgatcacgctggaggccgcggtgggcctgggtgcgatgccgatctaccggttcggtaccgaggagcagaaacagaagtggttgcccgacttgacgtctggccgtgcgctcgccggttttggtctcaccgagccgggagcgggatcggacgcgggcagcacccgcaccacggcgcgtctcgaaggtgacgagtggatcatcaacggctccaagcaatttatcaccaactcgggcaccgacatcacatcgctggtcaccgtcactgcggttaccgggaccaccggaaccgctgcggatgccaagaaagagatttcgacgatcatcgtgcccagcggcacaccgggattcaccgtggaaccggtctataacaaggtcggctggaacgcctcggacacccacccactgacatttgccgatgcgcgggtcccgagggagaacctgctgggagcccgggggagcggctatgccaacttcttgtccatcctggacgagggccggattgcgattgcagcgctggccaccggcgcggcgcagggctgtgttgacgagagcgtcaagtacgccaaccagcgtcagtcgtttggccagccgatcggcgcttatcaggcgatcggcttcaagatcgcgcggatggaggcacgcgcccatgttgcccgcacagcgtactatgatgccgccgcaaagatgttggcgggcaagcccttcaagaaggaggcggcgatcgcgaagatgatctcctcggaggcggcgatggacaactcccgcgatgccacccagatacacggcggatacggctttatgaacgaatatccggtggcgcgtcattaccgcgacagcaaggtgctcgagattggtgagggcaccacggaagtgcagctgatgcttatcgcgcgatcgttgggactgcagtga
SEQ ID No.8
MTTTTTTISGGILPKEYQDLRDTVADFARTVVAPVSAKHDAEHSFPYEIVAKMGEMGLFGLPFPEEYGGMGGDYFALSLVLEELGKVDQSVAITLEAAVGLGAMPIYRFGTEEQKQKWLPDLTSGRALAGFGLTEPGAGSDAGSTRTTARLEGDEWIINGSKQFITNSGTDITSLVTVTAVTGTTGTAADAKKEISTIIVPSGTPGFTVEPVYNKVGWNASDTHPLTFADARVPRENLLGARGSGYANFLSILDEGRIAIAALATGAAQGCVDESVKYANQRQSFGQPIGAYQAIGFKIARMEARAHVARTAYYDAAAKMLAGKPFKKEAAIAKMISSEAAMDNSRDATQIHGGYGFMNEYPVARHYRDSKVLEIGEGTTEVQLMLIARSLGLQ
SEQ ID No.9
atggacaaggtggtggccaccgccgcggaggcggtcgcagacatagccaacgggtcgtcgcttgcggttggtggattcgggctttgcggcatccccgaagcactgatcgcagcgttggtggatagcggtgtcaccgacctggaaacagtctcgaacaactgcggaatcgacggtgttggtctgggactattgttgcaacacaagcgaattcgccggacagtctcctcctacgtgggggagaacaaggagttcgcccgccagttcctcgcgggcgagctcgaggtggaactgaccccgcagggcacgctggccgagcggttgcgggccggagggatgggcataccggccttctatacaccggcaggggtcggtacccaggtcgccgacggcgggttgccgtggcgctacgacgcctcgggcggggtggcggtggtgtcgccggccaaggagactcgggagttcgatggtgtcacctatgtcctcgagcgggggatccggaccgacttcgcactggtgcatgcctggcagggggaccggcacggcaacctgatgtaccgccacgccgcggccaacttcaacccggagtgcgcatccgcaggcaggatcacgatcgccgaggtcgagcacttggtcgagccgggtgagatcgaccctgccaccgtacacaccccgggcgtgtttgtgcaccgggtggttcatgtgcccaaccccgccaagaagatcgagagggagacggtgcggcaatga
SEQ ID No.10
MDKVVATAAEAVADIANGSSLAVGGFGLCGIPEALIAALVDSGVTDLETVSNNCGIDGVGLGLLLQHKRIRRTVSSYVGENKEFARQFLAGELEVELTPQGTLAERLRAGGMGIPAFYTPAGVGTQVADGGLPWRYDASGGVAVVSPAKETREFDGVTYVLERGIRTDFALVHAWQGDRHGNLMYRHAAANFNPECASAGRITIAEVEHLVEPGEIDPATVHTPGVFVHRVVHVPNPAKKIERETVRQ
SEQ ID No.11
atgaccctggaagtggtatcggacgcggccggacgcatgcgggtcaaagtcgactgggtccgttgcgattcccggcgcgcggtcgcggtcgaagaggccgttgccaagcagaacggtgtgcgcgtcgtgcacgcctacccgcgcaccgggtccgtggtcgtgtggtattcacccagacgcgccgaccgcgcggcggtgctggcggcgatcaagggcgccgcgcacgtcgccgccgaactgatccccgcgcgtgcgccgcactcggccgagatccgcaacaccgacgtgctccggatggtcatcggcggggtggcactggccttgctcggggtgcgccgctacgtgttcgcgcggccaccgctgctcggaaccaccgggcggacggtggccaccggtgtcaccattttcaccgggtatccgttcctgcgtggcgcgctgcgctcgctgcgctccggaaaggccggcaccgatgccctggtctccgcggcgacggtggcaagcctcatcctgcgcgagaacgtggtcgcactcaccgtcctgtggttgctcaacatcggtgagtacctgcaggatctgacgctgcggcggacccggcgggccatctcggagctgctgcgcggcaaccaggacacggcctgggtgcgcctcaccgatccttctgcaggctccgacgcggccaccgaaatccaggtcccgatcgacaccgtgcagatcggtgacgaggtggtggtccacgagcacgtcgcgataccggtcgacggtgaggtggtcgacggcgaagcgatcgtcaatcagtccgcgatcaccggggaaaacctgccggtcagcgtcgtggtcggaacgcgcgtgcacgccggttcggtcgtggtgcgcggacgcgtggtggtgcgcgcccacgcggtaggcaaccaaaccaccatcggtcgcatcattagcagggtcgaagaggctcagctcgaccgggcacccatccagacggtgggcgagaacttctcccgccgcttcgttcccacctcgttcatcgtctcggccatcgcgttgctgatcaccggcgacgtgcggcgcgcgatgaccatgttgttgatcgcatgcccgtgcgcggtgggactgtccaccccgaccgcgatcagcgcagcgatcggcaacggcgcgcgccgtggcatcctgatcaagggcggatcccacctcgagcaggcgggccgcgtcgacgccatcgtgttcgacaagaccgggacgttgaccgtgggccgccccgtggtcaccaatatcgttgccatgcataaagattgggagcccgagcaagtgctggcctatgccgccagctcggagatccactcacgtcatccgctggccgaggcggtgatccgctcgacggaggaacgccgcatcagcatcccaccacacgaggagtgcgaggtgctggtcggcctgggcatgcggacctgggccgacggtcggaccctgctgctgggcagtccgtcgttgctgcgcgccgaaaaagttcgggtgtccaagaaggcgtcggagtgggtcgacaagctgcgccgccaggcggagaccccgctgctgctcgcggtggacggcacgctggtcggcctgatcagcctgcgcgacgaggtgcgtccggaggcggcccaggtgctgacgaagctgcgggccaatgggattcgccggatcgtcatgctcaccggcgaccacccggagatcgcccaggttgtcgccgacgaactggggattgatgagtggcgcgccgaggtcatgccggaggacaagctcgcggcggtgcgcgagctgcaggacgacggctacgtcgtcgggatggtcggcgacggcatcaacgacgccccggcgctggccgccgccgatatcgggatcgccatgggccttgccggaaccgacgtcgccgtcgagaccgccgatgtcgcgctggccaacgacgacctgcaccgcctgctcgacgttggggacctgggcgagcgggcagtggatgtaatccggcagaactacggcatgtccatcgccgtcaacgcggccgggctgctgatcggcgcgggcggtgcgctctcgccggtgctggcggcgatcctgcacaacgcgtcgtcggtggcggtggtggccaacagttcccggttgatccgctaccgcctggaccgctag
SEQ ID No.12
MTLEVVSDAAGRMRVKVDWVRCDSRRAVAVEEAVAKQNGVRVVHAYPRTGSVVVWYSPRRADRAAVLAAIKGAAHVAAELIPARAPHSAEIRNTDVLRMVIGGVALALLGVRRYVFARPPLLGTTGRTVATGVTIFTGYPFLRGALRSLRSGKAGTDALVSAATVASLILRENVVALTVLWLLNIGEYLQDLTLRRTRRAISELLRGNQDTAWVRLTDPSAGSDAATEIQVPIDTVQIGDEVVVHEHVAIPVDGEVVDGEAIVNQSAITGENLPVSVVVGTRVHAGSVVVRGRVVVRAHAVGNQTTIGRIISRVEEAQLDRAPIQTVGENFSRRFVPTSFIVSAIALLITGDVRRAMTMLLIACPCAVGLSTPTAISAAIGNGARRGILIKGGSHLEQAGRVDAIVFDKTGTLTVGRPVVTNIVAMHKDWEPEQVLAYAASSEIHSRHPLAEAVIRSTEERRISIPPHEECEVLVGLGMRTWADGRTLLLGSPSLLRAEKVRVSKKASEWVDKLRRQAETPLLLAVDGTLVGLISLRDEVRPEAAQVLTKLRANGIRRIVMLTGDHPEIAQVVADELGIDEWRAEVMPEDKLAAVRELQDDGYVVGMVGDGINDAPALAAADIGIAMGLAGTDVAVETADVALANDDLHRLLDVGDLGERAVDVIRQNYGMSIAVNAAGLLIGAGGALSPVLAAILHNASSVAVVANSSRLIRYRLDR
SEQ ID No.13
atgactgtgcaggagttcgacgtcgtggtggtcggcagcggcgccgccggcatggttgctgcgctggtcgccgctcaccgaggtctctcgacggtagtcgtcgagaaggccccgcactacggcggctccaccgcacgctcgggcggcggcgtctggatccccaacaacgaggtcctcaagcgccgcggcgttcgagatacaccggaggcggcacgcacctatctgcacggcatcgtcggcgaaatcgtcgagccggaacgcatcgatgcttacctcgaccgcgggcccgagatgctgtcgttcgtgctgaagcacacgccgctgaagatgtgctgggtacccggctactccgactactaccccgaggctccgggcggccgcccgggcggacgttcgatcgagccgaaaccgttcaacgcgcgcaagcttggtgccgacatggccgggctggagcccgcgtatggcaaggttccgctcaatgtggttgtgatgcagcaggactacgttcgcctcaatcagctcaaacgtcacccccgtggcgtgctgcgcagcatgaaggtcggcgcccgcacgatgtgggcgaaggcaacaggtaagaacctggtcggcatgggtcgagccctcattgggccgttgcggatcgggttgcagcgcgccggagtgccggtcgaactcaacaccgccttcaccgatcttttcgtcgaaaatggcgtcgtgtccggggtatacgtccgcgattcccacgaggcggaatccgctgagccgcagctgatccgggctcgccgcggcgtgatcctggcctgtggtggtttcgagcataacgagcagatgcgaatcaagtaccagcgggcacccatcaccaccgagtggaccgtgggcgccagcgccaataccggtgacggcattctcgccgccgaaaagctcggcgcagcactggatctgatggatgacgcttggtggggcccgacggtaccgctggtcggcaaaccatggttcgcgctctcggagcgcaactctcccggttcgatcatcgtcaacatgtcaggcaagcgattcatgaacgaatcgatgccatacgtcgaagcctgtcatcatatgtacggcggcgaacacggccaggggcccggaccgggcgagaacattccggcgtggctggtgttcgaccagcgataccgggaccgctacatcttcgcgggactacaaccagggcaacgcattccgagcaggtggctggattccggcgtcatcgtccaggccgatacccttgcggagctggccggcaaggccggtctacccgcggacgaactcactgccaccgtccagcgtttcaacgcattcgcccggtccggtgtcgacgaggactaccaccgcggggaaagtgcctacgatcgctactacggcgacccgagcaacaagcccaatccgaacctcggcgaggtcggccacccgccctattatggcgccaagatggttccgggcgacctggggaccaagggcggtatccgcaccgatgtcaacggacgtgctctgcgggacgacggcagcatcatcgacggcctttacgctgcaggcaatgtcagtgccccagtgatgggacacacctaccccggtccgggcggcacgataggcccggcgatgacgttcgggtacctggcggcgctgcacattgccgatcaggcgggaaagcgctga
SEQ ID No.14
MTVQEFDVVVVGSGAAGMVAALVAAHRGLSTVVVEKAPHYGGSTARSGGGVWIPNNEVLKRRGVRDTPEAARTYLHGIVGEIVEPERIDAYLDRGPEMLSFVLKHTPLKMCWVPGYSDYYPEAPGGRPGGRSIEPKPFNARKLGADMAGLEPAYGKVPLNVVVMQQDYVRLNQLKRHPRGVLRSMKVGARTMWAKATGKNLVGMGRALIGPLRIGLQRAGVPVELNTAFTDLFVENGVVSGVYVRDSHEAESAEPQLIRARRGVILACGGFEHNEQMRIKYQRAPITTEWTVGASANTGDGILAAEKLGAALDLMDDAWWGPTVPLVGKPWFALSERNSPGSIIVNMSGKRFMNESMPYVEACHHMYGGEHGQGPGPGENIPAWLVFDQRYRDRYIFAGLQPGQRIPSRWLDSGVIVQADTLAELAGKAGLPADELTATVQRFNAFARSGVDEDYHRGESAYDRYYGDPSNKPNPNLGEVGHPPYYGAKMVPGDLGTKGGIRTDVNGRALRDDGSIIDGLYAAGNVSAPVMGHTYPGPGGTIGPAMTFGYLAALHIADQAGKR
SEQ ID No.15
gtgagtccggcgcccgtgcaggtgatgggggttctaaacgtcacggacgactctttctcggacggcgggtgttatctcgatctcgacgatgcggtgaagcacggtctggcgatggcagccgcaggtgcgggcatcgtcgacgtcggtggtgagtcgagccggcccggtgccactcgggttgacccggcggtggagacgtctcgtgtcatacccgtcgtcaaagagcttgcagcacaaggcatcaccgtcagcatcgataccatgcgcgcggatgtcgctcgggcggcgttgcagaacggtgcccagatggtcaacgacgtgtcgggtgggcgggccgatccggcgatggggccgctgttggccgaggccgatgtgccgtgggtgttgatgcactggcgggcggtatcggccgataccccgcatgtgcctgtgcgctacggcaacgtggtggccgaggtccgtgccgacctgctggccagcgtcgccgacgcggtggccgcaggcgtcgacccggcaaggctggtgctcgatcccgggcttggattcgccaagacggcgcaacataattgggcgatcttgcatgcccttccggaactggtcgcgaccggaatcccagtgctggtgggtgcttcgcgcaagcgcttcctcggtgcgttgttggccgggcccgacggcgtgatgcggccaaccgatgggcgtgacaccgcgacggcggtgatttccgcgctggccgcactgcacggggcctggggtgtgcgggtgcatgatgtgcgggcctcggtcgatgccatcaaggtggtcgaagcgtggatgggagcggaaaggatagaacgcgatggctga
SEQ ID No.16
VSPAPVQVMGVLNVTDDSFSDGGCYLDLDDAVKHGLAMAAAGAGIVDVGGESSRPGATRVDPAVETSRVIPVVKELAAQGITVSIDTMRADVARAALQNGAQMVNDVSGGRADPAMGPLLAEADVPWVLMHWRAVSADTPHVPVRYGNVVAEVRADLLASVADAVAAGVDPARLVLDPGLGFAKTAQHNWAILHALPELVATGIPVLVGASRKRFLGALLAGPDGVMRPTDGRDTATAVISALAALHGAWGVRVHDVRASVDAIKVVEAWMGAERIERDG
SEQ ID No.17
atgagtattaccaggccgacgggcagctatgccagacagatgctggatccgggcggctgggtggaagccgatgaagacactttctatgaccgggcccaggaatatagccaggttttgcaaagggtcaccgatgtattggacacctgccgccagcagaaaggccacgtcttcgaaggcggcctatggtccggcggcgccgccaatgctgccaacggcgccctgggtgcaaacatcaatcaattgatgacgctgcaggattatctcgccacggtgattacctggcacaggcatattgccgggttgattgagcaagctaaatccgatatcggcaataatgtggatggcgctcaacgggagatcgatatcctggagaatgaccctagcctggatgctgatgagcgccataccgccatcaattcattggtcacggcgacgcatggggccaatgtcagtctggtcgccgagaccgctgagcgggtgctggaatccaagaattggaaacctccgaagaacgcactcgaggatttgcttcagcagaagtcgccgccacccccagacgtgcctaccctggtcgtgccatccccgggcacaccgggcacaccgggaaccccgatcaccccgggaaccccgatcaccccgggaaccccaatcacacccatcccgggagcgccggtaactccgatcacaccaacgcccggcactcccgtcacgccggtgaccccgggcaagccggtcaccccggtgaccccggtcaaaccgggcacaccaggcgagccaaccccgatcacgccggtcacccccccggtcgccccggccacaccggcaaccccggccacgcccgttaccccagctcccgctccacacccgcagccggctccggcaccggcgccatcgcctgggccccagccggttacaccggccactcccggtccgtctggtccagcaacaccgggcaccccagggggcgagccggcgccgcacgtcaaacccgcggcgttggcggagcaacctggtgtgccgggccagcatgcgggcggggggacgcagtcggggcctgcccatgcggacgaatccgccgcgtcggtgacgccggctgcggcgtccggtgtcccgggcgcacgggcggcggccgccgcgccgagcggtaccgccgtgggagcgggcgcgcgttcgagcgtgggtacggccgcggcctcgggcgcggggtcgcatgctgccactgggcgggcgccggtggctacctcggacaaggcggcggcaccgagcacgcgggcggcctcggcgcggacggcacctcctgcccgcccgccgtcgaccgatcacatcgacaaacccgatcgcagcgagtctgcagatgacggtacgccggtgtcgatgatcccggtgtcggcggctcgggcggcacgcgacgccgccactgcagctgccagcgcccgccagcgtggccgcggtgatgcgctgcggttggcgcgacgcatcgcggcggcgctcaacgcgtccgacaacaacgcgggcgactacgggttcttctggatcaccgcggtgaccaccgacggttccatcgtcgtggccaacagctatgggctggcctacatacccgacgggatggaattgccgaataaggtgtacttggccagcgcggatcacgcaatcccggttgacgaaattgcacgctgtgccacctacccggttttggccgtgcaagcctgggcggctttccacgacatgacgctgcgggcggtgatcggtaccgcggagcagttggccagttcggatcccggtgtggccaagattgtgctggagccagatgacattccggagagcggcaaaatgacgggccggtcgcggctggaggtcgtcgacccctcggcggcggctcagctggccgacactaccgatcagcgtttgctcgacttgttgccgccggcgccggtggatgtcaatccaccgggcgatgagcggcacatgctgtggttcgagctgatgaagcccatgaccagcaccgctaccggccgcgaggccgctcatctgcgggcgttccgggcctacgctgcccactcacaggagattgccctgcaccaagcgcacactgcgactgacgcggccgtccagcgtgtggccgtcgcggactggctgtactggcaatacgtcaccgggttgctcgaccgggccctggccgccgcatgctga
SEQ ID No.18
MSITRPTGSYARQMLDPGGWVEADEDTFYDRAQEYSQVLQRVTDVLDTCRQQKGHVFEGGLWSGGAANAANGALGANINQLMTLQDYLATVITWHRHIAGLIEQAKSDIGNNVDGAQREIDILENDPSLDADERHTAINSLVTATHGANVSLVAETAERVLESKNWKPPKNALEDLLQQKSPPPPDVPTLVVPSPGTPGTPGTPITPGTPITPGTPITPIPGAPVTPITPTPGTPVTPVTPGKPVTPVTPVKPGTPGEPTPITPVTPPVAPATPATPATPVTPAPAPHPQPAPAPAPSPGPQPVTPATPGPSGPATPGTPGGEPAPHVKPAALAEQPGVPGQHAGGGTQSGPAHADESAASVTPAAASGVPGARAAAAAPSGTAVGAGARSSVGTAAASGAGSHAATGRAPVATSDKAAAPSTRAASARTAPPARPPSTDHIDKPDRSESADDGTPVSMIPVSAARAARDAATAAASARQRGRGDALRLARRIAAALNASDNNAGDYGFFWITAVTTDGSIVVANSYGLAYIPDGMELPNKVYLASADHAIPVDEIARCATYPVLAVQAWAAFHDMTLRAVIGTAEQLASSDPGVAKIVLEPDDIPESGKMTGRSRLEVVDPSAAAQLADTTDQRLLDLLPPAPVDVNPPGDERHMLWFELMKPMTSTATGREAAHLRAFRAYAAHSQEIALHQAHTATDAAVQRVAVADWLYWQYVTGLLDRALAAAC
SEQ ID NO:19
MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGA
SEQ ID NO:20
MTDVSRKIRAWGRRLMIGTAAAVVLPGLVGLAGGAATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPAFEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYSDWYSPACGKAGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGSAAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSALLDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDPTQQIPKLVANNTRLWVYCGNGTPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAG
SEQ ID NO:21
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA
SEQ ID NO:22
MSQIMYNYPAMLGHAGDMAGYAGTLQSLGAEIAVEQAALQSAWQGDTGITYQAWQAQWNQAMEDLVRAYHAMSSTHEANTMAMMARDTAEAAKWGG
SEQ ID NO:23
MSNSRRRSLRWSWLLSVLAAVGLGLATAPAQAAPPALSQDRFADFPALPLDPSAMVAQVGPQVVNINTKLGYNNAVGAGTGIVIDPNGVVLTNNHVIAGATDINAFSVGSGQTYGVDVVGYDRTQDVAVLQLRGAGGLPSAAIGGGVAVGEPVVAMGNSGGQGGTPRAVPGRVVALGQTVQASDSLTGAEETLNGLIQFDAAIQPGDSGGPVVNGLGQVVGMNTAASDNFQLSQGGQGFAIPIGQAMAIAGQIRSGGGSPTVHIGPTAFLGLGVVDNNGNGARVQRVVGSAPAASLGISTGDVITAVDGAPINSATAMADALNGHHPGDVISVTWQTKSGGTRTGNVTLAEGPPA
SEQ ID NO:24
MVDFGALPPEINSARMYAGPGSASLVAAAQMWDSVASDLFSAASAFQSVVWGLTVGSWIGSSAGLMVAAASPYVAWMSVTAGQAELTAAQVRVAAAAYETAYGLTVPPPVIAENRAELMILIATNLLGQNTPAIAVNEAEYGEMWAQDAAAMFGYAAATATATATLLPFEEAPEMTSAGGLLEQAAAVEEASDTAAANQLMNNVPQALQQLAQPTQGTTPSSKLGGLWKTVSPHRSPISNMVSMANNHMSMTNSGVSMTNTLSSMLKGFAPAAAAQAVQTAAQNGVRAMSSLGSSLGSSGLGGGVAANLGRAASVGSLSVPQAWAAANQAVTPAARALPLTSLTSAAERGPGQMLGGLPVGQMGARAGGGLSGVLRVPPRPYVMPHSPAAG
SEQ ID NO:25
MRTPRRHCRRIAVLAAVSIAATVVAGCSSGSKPSGGPLPDAKPLVEEATAQTKALKSAHMVLTVNGKIPGLSLKTLSGDLTTNPTAATGNVKLTLGGSDIDADFVVFDGILYATLTPNQWSDFGPAADIYDPAQVLNPDTGLANVLANFADAKAEGRDTINGQNTIRISGKVSAQAVNQIAPPFNATQPVPATVWIQETGDHQLAQAQLDRGSGNSVQMTLSKWGEKVQVTKPPVS
SEQ ID NO:26
MAKTIAYDEEARRGLERGLNALADAVKVTLGPKGRNVVLEKKWGAPTITNDGVSIAKEIELEDPYEKIGAELVKEVAKKTDDVAGDGTTTATVLAQALVREGLRNVAAGANPLGLKRGIEKAVEKVTETLLKGAKEVETKEQIAATAAISAGDQSIGDLIAEAMDKVGNEGVITVEESNTFGLQLELTEGMRFDKGYISGYFVTDPERQEAVLEDPYILLVSSKVSTVKDLLPLLEKVIGAGKPLLI IAEDVEGEALSTLVVNKI RGTFKSVAVKAPGFGDRRKAMLQDMAILTGGQVISEEVGLTLENADLSLLGKARKVVVTKDETTIVEGAGDTDAIAGRVAQIRQEIENSDSDYDREKLQERLAKLAGGVAVIKAGAATEVELKERKHRIEDAVRNAKAAVEEGIVAGGGVTLLQAAPTLDELKLEGDEATGAN IVKVALEAPLKQIAFNSGLEPGVVAEKVRNLPAGHGLNAQTGVYEDLLAAGVADPVKVTRSALQNAASIAGLFLTTEAVVADKPEKEKASVPGGGDMGGMDF
SEQ ID NO:27
MAENSNIDDIKAPLLAALGAADLALATVNELITNLRERAEETRTDTRSRVEESRARLTKLQEDLPEQLTELREKFTAEELRKAAEGYLEAATSRYNELVERGEAALERLRSQQSFEEVSARAEGYVDQAVELTQEALGTVASQTRAVGERAAKLVGIELPKKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK
SEQ ID NO:28
VTQTGKRQRRKFGRIRQFNSGRWQASYTGPDGRVYIAPKTFNAKIDAEAWLTDRRREIDRQLWSPASGQEDRPGAPFGEYAEGWLKQRGIKDRTRAHYRKLLDNHILATFADTDLRDITPAAVRRWYATTAVGTPTMRAHSYSLLRAIMQTALADDLIDSNPCRISGASTARRVHKIRPATLDELETITKAMPDPYQAFVLMAAWLAMRYGELTELRRKDIDLHGEVARVRRAVVRVGEGFKVTTPKSDAGVRDISI PPHLIPAIEDHLHKHVNPGRESLLFPSVNDPNRHLAPSALYRMFYKARKAAGRPDLRVHDLRHSGAVLAASTGATLAELMQRLGHSTAGAALRYQHAAKGRDREIAALLSKLAENQEM
SEQ ID NO:29
VIAGVDQALAATGQASQRAAGASGGVTVGVGVGTEQRNLSVVAPSQFTFSSRSPDFVDETAGQSWCAILGLNQFH
SEQ ID NO:30
MATTLPVQRHPRSLFPEFSELFAAFPSFAGLRPTFDTRLMRLEDEMKEGRYEVRAELPGVDPDKDVDIMVRDGQLTIKAERTEQKDFDGRSEFAYGSFVRTVSLPVGADEDDIKATYDKGILTVSVAVSEGKPTEKH IQIRSTN
SEQ ID NO:31
MSGRHRKPTTSNVSVAKIAFTGAVLGGGGIAMAAQATAATDGEWDQVARCESGGNWSINTGNGYLGGLQFTQSTWAAHGGGEFAPSAQLASREQQIAVGERVLATQGRGAWPVCGRGLSNATPREVLPASAAMDAPLDAAAVNGEPAPLAPPPADPAPPVELAANDLPAPLGEPLPAAPADPAPPADLAPPAPADVAPPVELAVNDLPAPLGEPLPAAPADPAPPADLAPPAPADLAPPAPADLAPPAPADLAPPVELAVNDLPAPLGEPLPAAPAELAPPADLAPASADLAPPAPADLAPPAPAELAPPAPADLAPPAAVNEQTAPGDQPATAPGGPVGLATDLELPEPDPQPADAPPPGDVTEAPAETPQVSNIAYTKKLWQAIRAQDVCGNDALDSLAQPYVIG
SEQ ID NO:32
MLRLVVGALLLVLAFAGGYAVAACKTVTLTVDGTAMRVTTMKSRVIDIVEENGFSVDDRDDLYPAAGVQVHDADTIVLRRSRPLQISLDGHDAKQVWTTASTVDEALAQLAMTDTAPAAASRASRVPLSGMALPVVSAKTVQLNDGGLVRTVHLPAPNVAGLLSAAGVPLLQSDHVVPAATAPIVEGMQIQVTRNRIKKVTERLPLPPNARRVEDPEMNMSREVVEDPGVPGTQDVTFAVAEVNGVETGRLPVANVVVTPAHEAVVRVGTKPGTEVPPVIDGSIWDAIAGCEAGGNWAINTGNGYYGGVQFDQGTWEANGGLRYAPRADLATREEQIAVAEVTRLRQGWGAWPVCAARAGAR
SEQ ID NO:33
VHPLPADHGRSRCNRHPISPLSLIGNASATSGDMSSMTRIAKPLIKSAMAAGLVTASMSLSTAVAHAGPSPNWDAVAQCESGGNWAANTGNGKYGGLQFKPATWAAFGGVGNPAAASREQQIAVANRVLAEQGLDAWPTCGAASGLPIALWSKPAQGIKQI INEI IWAGIQASIPR
SEQ ID NO:34
MTPGLLTTAGAGRPRDRCARIVCTVFIETAVVATMFVALLGLSTISSKADDIDWDAIAQCESGGNWAANTGNGLYGGLQISQATWDSNGGVGSPAAASPQQQIEVADNIMKTQGPGAWPKCSSCSQGDAPLGSLTHILTFLAAETGGCSGSRDD
SEQ ID NO:35
LKNARTTLIAAAIAGTLVTTSPAGIANADDAGLDPNAAAGPDAVGFDPNLPPAPDAAPVDTPPAPEDAGFDPNLPPPLAPDFLSPPAEEAPPVPVAYSVNWDAIAQCESGGNWSINTGNGYYGGLRFTAGTWRANGGSGSAANASREEQIRVAENVLRSQGIRAWPVCGRRG
SEQ ID NO:36
MIATTRDREGATMITFRLRLPCRTILRVFSRNPLVRGTDRLEAVVMLLAVTVSLLTIPFAAAAGTAVQDSRSHVYAHQAQTRHPATATVIDHEGVIDSNTTATSAPPRTKITVPARWVVNGIERSGEVNAKPGTKSGDRVGIWVDSAGQLVDEPAPPARAIADAALAALGLWLSVAAVAGALLALTRAILIRVRNASWQHDIDSLFCTQR
SEQ ID NO:37
MTEPAAWDEGKPRIITLTMNPALDITTSVDVVRPTEKMRCGAPRYDPGGGGINVARIVHVLGGCSTALFPAGGSTGSLLMALLGDAGVPFRVIPIAASTRESFTVNESRTAKQYRFVLPGPSLTVAEQEQCLDELRGAAASAAFVVASGSLPPGVAADYYQRVADICRRSSTPLILDTSGGGLQHISSGVFLLKASVRELRECVGSELLTEPEQLAAAHELIDRGRAEVVVVSLGSQGALLATRHASHRFSSIPMTAVSGVGAGDAMVAAITVGLSRGWSLIKSVRLGNAAGAAMLLTPGTAACNRDDVERFFELAAEPTEVGQDQYVWHPIVNPEASP
SEQ ID NO:38
MPDTMVTTDVIKSAVQLACRAPSLHNSQPWRWIAEDHTVALFLDKDRVLYATDHSGREALLGCGAVLDHFRVAMAAAGTTANVERFPNPNDPLHLASIDFSPADFVTEGHRLRADAILLRRTDRLPFAEPPDWDLVESQLRTTVTADTVRIDVIADDMRPELAAASKLTESLRLYDSSYHAELFWWTGAFETSEGIPHSSLVSAAESDRVTFGRDFPVVANTDRRPEFGHDRSKVLVLSTYDNERASLLRCGEMLSAVLLDATMAGLATCTLTHITELHASRDLVAALIGQPATPQALVRVGLAPEMEEPPPATPRRPIDEVFHVRAKDHR
SEQ ID NO:39
MTTARDIMNAGVTCVGEHETLTAAAQYMREHDIGALPICGDDDRLHGMLTDRDIVIKGLAAGLDPNTATAGELARDSIYYVDANASIQEMLNVMEEHQVRRVPVISEHRLVGIVTEADIARHLPEHAIVQFVKAICSPMALASSEQ ID NO:40
MASSASDGTHERSAFRLSPPVLSGAMGPFMHTGLYVAQSWRDYLGQQPDKLPIARPTIALAAQAFRDEIVLLGLKARRPVSNHRVFERISQEVAAGLEFYGNRRWLEKPSGFFAQPPPLTEVAVRKVKDRRRSFYRIFFDSGFTPHPGEPGSQRWLSYTANNREYALLLRHPEPRPWLVCVHGTEMGRAPLDLAVFRAWKLHDELGLNIVMPVLPMHGPRGQGLPKGAVFPGEDVLDDVHGTAQAVWDIRRLLSWIRSQEEESLIGLNGLSLGGYIASLVASLEEGLACAILGVPVADLIELLGRHCGLRHKDPRRHTVKMAEPIGRMISPLSLTPLVPMPGRFIYAGIADRLVHPREQVTRLWEHWGKPEIVWYPGGHTGFFQSRPVRRFVQAALEQSGLLDAPRTQRDRSA
SEQ ID NO:41
MSTQRPRHSGIRAVGPYAWAGRCGRIGRWGVHQEAMMNLAIWHPRKVQSATIYQVTDRSHDGRTARVPGDEITSTVSGWLSELGTQSPLADELARAVRIGDWPAAYAIGEHLSVEIAVAV
SEQ ID NO:42
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SEQ ID NO:43
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SEQ ID NO:44
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SEQ ID NO:45
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SEQ ID NO:46
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SEQ ID NO:47
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SEQ ID NO:48
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SEQ ID NO:49
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SEQ ID NO:50
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SEQ ID NO:51
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SEQ ID NO:52
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SEQ ID NO:53
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SEQ ID NO:54
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SEQ ID NO:55
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SEQ ID NO:56
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SEQ ID NO:57
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SEQ ID NO:58
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SEQ ID NO:59
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SEQ ID NO:60
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SEQ ID NO:61
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SEQ ID NO:62
atgaccaccgcacgcgacatcatgaacgcaggtgtgacctgtgttggcgaacacgagacgctaaccgctgccgctcaatacatgcgtgagcacgacatcggcgcgttgccgatctgcggggacgacgaccggctgcacggcatgctcaccgaccgcgacattgtgatcaaaggcctggctgcgggcctagacccgaataccgccacggctggcgagttggcccgggacagcatctactacgtcgatgcgaacgcaagcatccaggagatgctcaacgtcatggaagaacatcaggtccgccgtgttccggtcatctcagagcaccgcttggtcggaatcgtcaccgaagccgacatcgcccgacacctgcccgagcacgccattgtgcagttcgtcaaggcaatctgctcgcccatggccctcgccagctag
SEQ ID NO:63
atggcaagttctgcgagcgacggcacccacgaacgctcggcttttcgcctgagtccaccggtcttgagcggcgccatgggaccgttcatgcacaccggtctgtacgtcgctcaatcgtggcgcgactatctgggtcaacagcccgataaactgccgatcgcacggcccactattgccttagcggcgcaagcctttcgagacgaaatcgtcctgctgggcctcaaggcacgacgtccggtcagcaatcatcgagtgttcgagcgcatcagccaagaagtggccgctggactggagttctatgggaatcgcagatggctggagaagcctagcggattttttgcccagcccccaccgctcaccgaggtcgcggtccgaaaggtcaaggaccgcagacgctccttttatcgcatcttcttcgacagtgggtttacgccgcatccgggtgaaccgggcagccaacggtggctctcatacactgcgaacaatcgcgagtacgccctgttactgcggcacccagagccgcgtccctggctggtttgtgtacacggcaccgagatgggcagggccccgttggatctcgcggtgttccgcgcctggaagctgcatgacgaactcggcctgaacattgtcatgccggttcttccgatgcatggtccccgcgggcaaggtctgccgaagggcgccgtttttcccggagaagatgttctcgacgatgtgcatgggacggctcaagcggtgtgggatatccggcggctgttgtcctggatacgatcgcaggaggaggagtcgctgatcgggttgaacggtctctcgctgggcggctacatcgcgtcattggtcgccagcctcgaagaaggtctcgcctgcgcgattctcggtgtcccagtggctgatctgatcgagttgttgggccgccactgcggtcttcggcacaaagacccccgccgccacaccgtcaagatggccgaaccgatcggccgaatgatctcgccgctctcacttacgccactggtgcccatgccgggccgctttatctacgcgggcattgccgaccgactcgtgcatccacgcgaacaggtgactcgcctctgggagcactggggcaaacccgaaatcgtgtggtatccaggcggtcacactggcttcttccagtcgcggccggtacgacggtttgtccaggctgcgctggagcagtcgggcctgttggacgcgccacggacacagcgcgaccgttccgcctaa
SEQ ID NO:64
atgtccacgcaacgaccgaggcactccggtattcgggctgttggcccctacgcatgggccggccgatgtggtcggataggcaggtggggggtgcaccaggaggcgatgatgaatctagcgatatggcacccgcgcaaggtgcaatccgccaccatctatcaggtgaccgatcgctcgcacgacgggcgcacagcacgggtgcctggtgacgagatcactagcaccgtgtccggttggttgtcggagttgggcacccaaagcccgttggccgatgagcttgcgcgtgcggtgcggatcggcgactggcccgctgcgtacgcaatcggtgagcacctgtccgttgagattgccgttgcggtctaa
SEQ ID NO:65
LDFATLPPEINSARMYSGAGSAPMLAAASAWHGLSAELRASALSYSSVLSTLTGEEWHGPASASMTAAAAPYVAWMSVTAVRAEQAGAQAEAAAAAYEAAFAATVPPPVIEANRAQLMALIATNVLGQNAPAIAATEAQYAEMWSQDAMAMYGYAGASAAATQLTPFTEPVQTTNASGLAAQSAAIAHATGASAGAQQTTLSQLIAAIPSVLQGLSSSTAATFASGPSGLLGIVGSGSSWLDKLWALLDPNSNFWNTIASSGLFLPSNTIAPFLGLLGGVAAADAAGDVLGEATSGGLGGALVAPLGSAGGLGGTVAAGLGNAATVGTLSVPPSWTAAAPLASPLGSALGGTPMVAPPPAVAAGMPGMPFGTMGGQGFGRAVPQYGFRPNFVARPPAAG
实施例
将通过以下实施例对本发明做进一步的阐明，其旨在仅仅作为本发明的示例而不是限制。
实施例1 包含本发明多肽的亚单位疫苗
为制备包括多肽的亚单位疫苗，首先需要得到大量的多肽以制备疫苗。这可通过从TB培养物纯化目的蛋白，或者通过克隆目的基因和生产重组蛋白来实现。通过PCR扩增目的基因的编码序列，在N末端和C末端插入限制性位点，以允许符合阅读框地克隆到蛋白表达载体例如pET-15b中。基因被插入到诱导性启动子比如lacZ的后面。随后将载体转化到培养基中生长的大肠杆菌。过表达并纯化重组蛋白。一种常用的纯化方法为生产具有N末端纯化标签如His标签的重组蛋白。随后基于His标签对Ni-NTA柱上的金属离子的亲和性纯化该蛋白，之后切割His标签。然后将纯化的蛋白在合适的佐剂中施用给动物。
实施例2 BCG作为微生物载体的用途
通过PCR扩增目的多核苷酸序列。将扩增产物纯化并克隆到质粒中(pMV306)，其在分枝杆菌噬菌体L5的附着位点(attB)特异性位点地整合至分枝杆菌基因组中。通过电穿孔用该质粒转化BCG，其包括使用高电压电脉冲破坏细胞包膜，并导致DNA的摄入。质粒在attB位点整合到BCG染色体中，生成稳定的重组体。选择重组体并通过PCR或Southern blotting检验，以确保基因已经整合进入。随后将重组菌株用于蛋白研究。
实施例3 表达分枝杆菌基因的病毒载体(如减毒牛痘病毒)
Figure BDA0001082709250000581
允许外源或靶基因重组到MVA基因组的方法在本领域公知的[1,2]。靶基因的插入是通过转运DNA介导的，该转运DNA的特性与上述那些特性相似。转运DNA可以是质粒的形式，该质粒可以对于常规克隆方法最优化的细菌株内增殖。靶基因被引入到启动子如Mh5，p7.5或其他的下游的盒。靶基因可包括一种或多种核苷酸Seq IDs 1-18和/或其片段。靶基因还可包括辅助的辅因子例如B7-1或IL-12，如在本领域中已被充分描述的[3]。靶基因位于优化的Kozak序列如GCCACCATGG的下游并且符合阅读框。靶基因还可位于前导序列如tPA的下游并符合阅读框。靶基因可位于符合阅读框的标签如V5,HIS或另一标签的上游。盒向MVA基因组中的转移是通过本领域公知的同源侧翼区如Del I–VI介导的。
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实施例4 制备DNA表达载体
DNA疫苗由克隆到细菌质粒的目的核酸序列组成。质粒载体pVAX1通常用于制备DNA疫苗。该载体设计为促进目的多肽在大肠杆菌内高拷贝数目复制和在大多数哺乳动物细胞内高水平瞬时表达(详见关于pVAX1的制造商方案(产品目录编号V260-20www.invitrogen.com))。
载体包括以下要素：
Figure BDA0001082709250000582
人巨细胞病毒早期瞬时(CMV)启动子，用于在多种哺乳动物细胞内高水平表达；
Figure BDA0001082709250000583
T7启动子/引发位点，以允许在有义方向体外转录和通过该插入物测序(sequencing through the insert)；
Figure BDA0001082709250000584
牛生产激素(BGH)聚腺苷酸化信号，用于mRNA的有效转录终止和聚腺苷酸化；
Figure BDA0001082709250000585
卡那霉素抗性基因，用于在大肠杆菌内筛选；
Figure BDA0001082709250000586
多克隆位点
Figure BDA0001082709250000587
pUC起点，用于在大肠杆菌内高拷贝数目复制和生长
Figure BDA0001082709250000588
BGH反向引发位点，其允许通过插入物进行测序。
可通过本领域已知的标准重组技术的方式来制备载体，例如Sambrook et al.(1989)。制备疫苗的关键步骤如下：
Figure BDA0001082709250000591
将目的多核苷酸通过一个多克隆位点连接到pVAX1；
Figure BDA0001082709250000592
随后将连接混合物转化到感受态大肠杆菌菌株(如TOP10)中，并使用包含50μg/ml卡那霉素的LB平板筛选转化体；
Figure BDA0001082709250000593
选择克隆体并可以测序，以验证目的基因的存在和方向。
Figure BDA0001082709250000594
一旦证实了基因的存在，可将载体用于转染哺乳动物细胞系，从而检查蛋白质表达。用于转染的方法是本领域已知的并包括，例如，电穿孔、磷酸钙和脂转染。
Figure BDA0001082709250000595
一旦确认了多肽的表达，可以由合适的细胞宿主如大肠杆菌中产生并纯化大量的所述载体。
pVAX1不整合到宿主染色体中。所有的非必要序列已被移除，以将整合的可能性最小化。当构建特定载体时，可包括前导序列，以便在真核细胞中表达时指导编码蛋白的分泌。能够使用的载体的其他示例包括V1Jns.tPA和pCMV4。可使用整合到宿主基因组中的表达载体，然而，使用不整合的载体是更常用且更优选的。整合将会导致产生引起其他问题的遗传修饰的宿主。
实施例5 携带分枝杆菌多核苷酸的质粒DNA疫苗
通过PCR扩增目的多核苷酸序列，将其纯化并插入到用于疫苗开发的特定的载体中，例如pVAX1。如上述的(实施例4)，这些载体包括启动子序列(如CMV或SV40启动子)，其可指导引入的多核苷酸(编码候选抗原)在真核细胞中强表达；和聚腺苷酸化信号(例如SV40或牛生长激素)以稳定nRNA转录子。靶基因位于带有优选的Kozak序列如GCCACCATGG的下游，并且符合阅读框。靶基因还可位于前导序列如tPA的下游并符合阅读框。靶基因可位于标签如V5的上游并符合阅读框。将该载体转化到大肠杆菌中，使用质粒编码的标记如卡那霉素抗性来选择转化子。随后从转化菌落中回收质粒，并测序以检查目的多核苷酸存在并且正确编码而没有PCR产生的突变。随后在大肠杆菌中生产大量质粒，使用商业可得的试剂盒(e.g.Qiagen Endofree-plasmid preparation)来回收并纯化质粒。随后将该疫苗在佐剂存在或者不存在的情况下施用到动物(如通过肌肉注射)。
实施例6 RNA疫苗
RNA可直接引入到宿主体内。因此载体构建体可用于在体外生产RNA，然后将纯化的RNA注射到宿主内。然后，RNA在宿主细胞内作为翻译的模板。在这个实施方案中，通常不发生整合。
一种替代的选项是使用感染试剂例如携带与目的基因相应的RNA的逆转录病毒基因组。在这个实施方案中，将发生整合到宿主基因组内。另一选项是使用RNA复制子疫苗，其可来源于病毒载体，如Sindbis病毒或Semliki Forest病毒。这些疫苗是自主复制且自我限制的，并且可作为RNA或DNA施用，随后其在体内转录成RNA复制子。载体最终导致了转染细胞的裂解从而降低了整合到宿主基因组的顾虑。
实施例7 基于评估T细胞应答的诊断测定
对于基于评估T细胞应答的诊断测定，得到来自患者的血液样品是足够了。可使用密度梯度比如Ficoll梯度将单核细胞(单核细胞、T和B淋巴细胞)从血液中分离出来。
尽管比专业的抗原呈递细胞(APCs)比如树突细胞效率低，单核细胞和B淋巴细胞二者均能够呈递抗原。专业的抗原呈递细胞更多定位于淋巴组织。
最简单的方法是将抗原加入到分离的单核细胞并温育一周，然后评估扩增的量。假如个体先前已经通过感染暴露于抗原，则对所述抗原特异性的如T细胞克隆在所述样品中应该是更普遍的，并且应该应答。假如希望控制T细胞对APCs的比率，也可分离不同的细胞群。这种类型测定法的另一变化是测量应答淋巴细胞的细胞因子的产生作为应答的测量。ELISPOT测定是这个测定的合适的示例。
实施例8 检测潜伏分枝杆菌
可通过检测血液样品中抗原特异性抗体或通过检测T细胞来检测潜伏分枝杆菌相关的抗原的存在。
将96孔平板用细胞因子(例如干扰素、IL-2)—特异性抗体包被。然后将外周血单核细胞从患者全血中分离出来，并施加到孔中。添加抗原，以刺激可能存在的特异性T细胞，将平板温育24小时。该抗原刺激T细胞产生结合到特异性抗体的细胞因子。清洗平板，留下抗原特异性T细胞存在的印迹。然后添加与合适检测系统例如酶相偶联的第二抗体，并在添加适当的底物之后，计数点的数目。点的数目，其每一个对应于单一的抗原特异性T细胞，与最初添加的细胞的总数目相关。上面所描述的测定还可用于将TB感染个体从BCG接种个体中区别开。
实施例9 抗原活性
将小鼠用分枝杆菌抗原免疫。递送系统包括但不限于DNA疫苗、重组MVA、辅助蛋白。递送途径包括但不限于皮下、真皮内、肌内或气雾剂给药。免疫法方案有时包括异源初免-加强，如DNA疫苗初免其次是MVA疫苗加强。免疫法方案还可包括多个剂量。
在疫苗接种之后，如2周后，将脾细胞从接种的动物中取出，并用代表免疫抗原的多肽刺激。通过抗原特异性诱导的细胞因子如IFN-y释放可测量免疫应答，其是针对靶抗原免疫的证据。
实施例10 在实验模型中证实疫苗效力
可基于在气雾剂攻击之后6-24周减少肺部和/或脾中的结核分枝杆菌的细菌负担来评估豚鼠或小鼠内的疫苗候选效力——见图1和图2。
分枝杆菌抗原可作为Th1诱导的佐剂如DDA/MPL中亚单位DNA疫苗或蛋白，或通过表达载体比如重组病毒或BCG(见实施例1-4)进行递送。分枝杆菌抗原可作为BCG提供的初免的加强来进行递送。可由DNA、多肽或病毒载体或(较不常见)重组BCG重复接种来提供附加的加强。6-8个动物的组进行免疫，然后在攻击前休息6周。阳性对照动物组进行皮下接种5x 104菌落形成单位(CFU)的BCG Danish(1331)，阴性对照动物组保持未接种。在末次接种6周后，使用包含的Henderson装置，将结核分枝杆菌的细颗粒气雾剂(平均直径2μm；在Collison喷雾器中生成)直接递送到动物鼻腔。在气雾剂攻击后6周，将动物安乐死并移除肺和脾用于CFU测定。将均质样品连续稀释并平铺到Middlebrook 7H11选择性琼脂上，确定对于每个处理组的平均CFU。依据与未接种对照组相比肺和脾中减少的细菌数来评估疫苗效力。测试组细菌负荷的减少可表示为单独BCG实现的减少比例。动物模型中的保护性效力表示分枝杆菌抗原保护人和动物免受致病分枝杆菌感染的能力。
实施例11 在实验模型中表明疫苗效力
可基于在气雾剂攻击之后6-24周减少结核分枝杆菌在肺部和/或脾的细菌负担来评估豚鼠或小鼠内的疫苗候选效力——见图3。
分枝杆菌抗原可作为Th1诱导的佐剂如DDA/MPL中亚单位DNA疫苗或蛋白，或通过表达载体比如重组病毒或BCG(见实施例1-4)进行递送。分枝杆菌抗原可作为BCG提供的初免的加强来进行递送。可由DNA、多肽或病毒载体或(较不常见)重组BCG重复接种来提供附加的加强。6-8个动物的组进行免疫，然后在攻击前休息6周。阳性对照动物组进行皮下接种5x 104菌落形成单位(CFU)的BCG Danish(1331)，阴性对照动物组保持未接种。在末次接种6周后，使用包含的Henderson装置，将结核分枝杆菌的细颗粒气雾剂(平均直径2μm；在Collison nebuliser中生成)直接递送到动物鼻腔。在气雾剂攻击后24周，将动物安乐死并移除肺和脾用于CFU测定。将均质样品连续稀释并平铺到Middlebrook 7H11选择性琼脂上，确定对于每个处理组的平均CFU。依据与未接种对照组相比肺和脾中减少的细菌数来评估疫苗效力。测试组细菌负荷的减少可表示为单独BCG实现的减少比例，或者表示为实现的细菌负载的附加减少。动物模型中的保护性效力表示分枝杆菌抗原保护人和动物免受致病分枝杆菌感染的能力。
Figure IDA0001121223410000011
Figure IDA0001121223410000021
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Figure IDA0001121223410000151

Claims (21)

1.一种抗原组合物，包括：
(i) 第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包括由SEQ ID NO: 8氨基酸序列组成的多肽序列；或
(ii) 第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包括编码由SEQ IDNO: 8氨基酸序列组成的多肽序列的多核苷酸序列；
其中所述抗原组合物用于治疗、抑制或预防受试者的分枝杆菌感染。
2.根据权利要求1所述的抗原组合物，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包括由SEQ IDNO: 7的多核苷酸序列组成的多核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗原组合物，进一步包括至少一种不同于所述第一分枝杆菌抗原多肽的附加分枝杆菌多肽；或至少一种编码第二分枝杆菌抗原多肽的附加分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多肽不同于所述第一分枝杆菌多肽。
4.根据权利要求1所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物包括至少一种载体并且其中所述分枝杆菌多核苷酸被整合到所述至少一种载体内。
5.根据权利要求4所述的抗原组合物，其中所述载体是质粒。
6.根据权利要求4所述的抗原组合物，其中所述载体是表达载体，或者病毒载体。
7.根据权利要求6所述的抗原组合物，其中所述病毒载体为减毒痘苗病毒载体或腺病毒载体。
8.根据前述任一权利要求所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物包括至少一种细胞，其中所述细胞包括至少一种所述分枝杆菌抗原多肽和/或分枝杆菌多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的抗原组合物，其中所述细胞是减毒的微生物载体。
10.根据权利要求9所述的抗原组合物，其中所述减毒的微生物载体为减毒沙门氏菌、减毒牛分枝杆菌或减毒结核分枝杆菌。
11.根据权利要求10所述的抗原组合物，其中所述减毒牛分枝杆菌为BCG株。
12.一种生产用于治疗、抑制或预防受试者分枝杆菌感染的治疗性或预防性制剂的方法，该方法包括将药物可接受的载体与以下的任一结合：
(i) 根据权利要求1的第一分枝杆菌抗原多肽；或
(ii)根据权利要求1的第一分枝杆菌多核苷酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述治疗性或预防性制剂是疫苗。
14.第一分枝杆菌抗原和任选的第二分枝杆菌抗原用于生产刺激受试者免疫应答的药剂的用途；其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i) 根据权利要求1的第一分枝杆菌抗原多肽；或
(ii)根据权利要求1的第一分枝杆菌多核苷酸；
以及其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述哺乳动物受试者为人、牛、猪或马受试者。
17.第一分枝杆菌抗原和任选的第二分枝杆菌抗原用于生产治疗或预防受试者的分枝杆菌感染的药剂的用途；其中所述第一分枝杆菌抗原包括：
(i) 根据权利要求1的第一分枝杆菌抗原多肽；或
(ii)根据权利要求1的第一分枝杆菌多核苷酸；
以及其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述分枝杆菌感染为结核分枝杆菌感染。
19.根据权利要求17或18所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述哺乳动物受试者为人、牛、猪或马受试者。
21.根据权利要求1-11任一的抗原组合物用于生产治疗、抑制或预防受试者分枝杆菌感染的药剂的用途。
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