KR20220132641A

KR20220132641A - 보호성 스타필로코커스 외독소 백신

Info

Publication number: KR20220132641A
Application number: KR1020227030419A
Authority: KR
Inventors: 마르타 엠. 아이블; 니나 모델; 군터 할러
Original assignee: 비오메디찌니쉐 포르슝 운트 바이오-프로듀테 아게
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2022-09-30
Also published as: CN115427433A; US20230104241A1; BR112023003815A2; EP4081534C0; EP4081534A1; EP4081534B1; WO2022128243A1; JP2023512344A

Abstract

스타필로코커스 외독소 B(SEB) 독소 서열 서열번호 1의 아미노산 위치 21 내지 25에 적어도 2개의 점 돌연변이를 포함하도록 돌연변이된 해독된 SEB 독소로서, 상기 적어도 2개의 점 돌연변이가 aa21-22, aa22-23, aa23-24, aa24-25, aa21-23, aa22-24 또는 aa23-25 중 어느 하나의 결실, 또는 서열번호 1과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 임의의 다른 천연 SEB 독소 서열의 상응하는 위치에서의 결실을 포함하는, 해독된 스타필로코커스 외독소 B(SEB) 독소.

Description

보호성 스타필로코커스 외독소 백신

본 발명은 보호성 스타필로코커스 외독소 백신에 관한 것이다. 본 발명은 특히 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 감염 또는 외독소 노출에 대한 보호 면역 및 스타필로코커스 외독소 유도 패혈증 상태(Staphylococcal exotoxin-induced sepsis condition)에 대한 보호를 유도하는 신규 백신 항원 및 백신에 관한 것이다.

스타필로코커스 아우레우스는 포유류 숙주에서 농양(abscesses) 및 농가진(impetigo)과 같은 표재성 피부 감염으로부터 폐 질환(pulmonary disease), 골수염(osteomyelitis) 및 심내막염(endocarditis)과 같은 심각한 침습성 감염뿐만 아니라 급성 및 잠재적으로 치명적인 독성 쇼크 증후군(toxic shock syndrome; TSS) 및 패혈성 쇼크 증후군(septic shock syndrome)에 이르는 다양한 중증도의 질환을 콜론화하고 일으키는 능력에 기여하는 다양한 외부 단백질을 생산한다.

스타필로코커스 아우레우스는 발열성 독소 초항원으로 공지된 외독소를 발현했다. 스타필로코커스 엔테로톡신 B는 스타필로코키(staphylococci)의 초항원 외독소 중 하나이며, 스타필로코커스 외독소 B(Staphylococcal Exotoxin B; SEB)로서 이해되기도 한다. 종래의 항원과는 달리, 초항원은 펩티드 결합 홈 외부의 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 II 분자에 결합하고 T-세포 수용체(TCR)의 Vβ 쇄에 결합함으로써 T-세포를 활성화한다. 초항원은 종래의 항원보다 훨씬 더 강력하며 전체 T-세포 집단의 최대 30%를 유발할 수 있다. 그들은 T-세포의 대규모 증식과 사이토카인의 통제되지 않은 방출을 일으킨다. 초항원은 공칭 항원보다 훨씬 낮은 농도에서 T-세포를 활성화한다. 초항원에 의한 활성화는 마이크로그램 이상의 공칭 항원에 의해 피코그램에서 낮은 나노그램 농도로 검출될 수 있다. 따라서, 차이는 5 내지 8 로그 단계이다. 세포 표면 상의 IL-2 수용체의 클론 확장 및 상향조절은 항원 제시 세포 상의 MHC 클래스 II와 CD4⁺ 세포 상의 TCR의 가교결합의 결과이다. 사이토카인의 대량 방출은 SEB 독성의 기초이다. SEB는 또한 심한 설사(severe diarrhoea), 메스꺼움(nausea) 및 장 경련(intestinal cramping)을 일으키는 식중독(food poisoning)의 일반적인 원인이다. 매우 안정적이기 때문에, 독소는 오염성 박테리아가 사멸한 후에도 활성 상태를 유지할 수 있다.

SEB는 TSS(독소 쇼크 증후군)의 원인 제제로서 중추적인 역할을 한다. 초항원의 실험적 적용은 쇼크(shock) 및 다기관 부전(multi organ failure)을 초래하는 염증성 사이토카인의 통제되지 않은 방출로 압도적인 염증 반응을 유도한다(참조: Ulrich et al. Vaccine 1998, 16(19):1857-1864).

에스. 아우레우스(S. aureus) SEB의 구조와 기능적 관계에 대한 정보에 기초하여, 특정 면역원성과 보호성을 손상되지 않은 상태로 남기면서 독성과 초항원성 특성을 근절하기 위한 목적으로 다중 돌연변이체가 확립되었다(참조: Lowell et al. Infection and Immunity 1996, 64(5):1706-1713; LeClaire et al. Infection and Immunity 2002, 770(5):2278-2281).

문헌[참조: Kappler et al. (J. Exp. Med. 1992, 175:387-396)]은 초항원 SEB의 기능적 영역을 정의하는 돌연변이를 기재한다.

문헌[참조: Fries et al. (Microbiol Spectr. 2013,1(2): 2013)]은 SEB의 특이적 결합 영역을 개시하고, 에스. 아우레우스 임상 단리물로부터 유래된 SEB의 아미노산 서열의 서열 정렬을 제공한다.

US6713284는 유전적으로 약독화된 초항원 독소 백신, 특히 MHC 클래스 II 수용체 및 T-세포 항원 수용체에 대한 결합이 변경되도록 특정 아미노산 위치가 변경된 SEB를 개시한다.

문헌[참조: Woody et al. (Vaccine 1997, 15(2):133-139)]은 N23K 또는 F44S 돌연변이를 갖는 SEB 돌연변이체를 개시하고 마우스 모델에서 백신 잠재력을 기재한다.

문헌[참조: Jeong et al. (Acta Cryst. 2017, F73, 595-600)]은 제거된 초항원 활성을 나타내는 4개의 돌연변이(N23A, Y90A, R110A 및 F177A)를 갖는 SEB 백신 후보를 개시한다.

문헌[참조: Bagnoli et al. (PNAS 2015, 112(12):3680-3685)]은 수산화알루미늄 또는 명반(alum)에 흡착된 톨-유사 수용체 7-의존성(TLR7) 작용제(SMIP.7-10)와 제형화된 조합된 백신 항원 α-헤몰리신(alpha-hemolysin)(Hla), ess 세포외 A(EsxA) 및 ess 세포외 B(EsxB) 및 2개의 표면 단백질 제2철 하이드록사메이트 흡수 D2 및 보존된 스타피로코커스 항원 1A를 기재한다.

JP4571586B2(EP1661911에 상응함)는 임의의 다른 아미노산에 의한 위치 97에서 리신의 치환 및 위치 98에서 리신의 치환을 포함하는, 독성이 감소된 프로테아제 내성인 변형된 SEB를 개시한다. 또한, 위치 23에서 아스파라긴의 티로신으로의 치환이 개시되어 있다.

WO99/40935(EP1055429에 상응함)는 T-세포 활성화에 대한 억제 활성을 부여하기 위해, 예를 들어, 위치 9, 23, 41 또는 44에서 하나 이상의 아미노산 치환인 변형을 포함하는 SEB를 개시한다.

WO2014/205111은 스타필로코커스 아우레우스 항원 또는 이의 돌연변이체, 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 다가 펩티드 올리고펩티드를 개시하며, 이는 SEB, SECI-3, SEE, SEH, SEI, SEK, TSST-1, SpeC, SED, 또는 SpeA, 또는 이의 임의의 돌연변이체, 단편, 변이체, 또는 유도체, 또는 이들의 임의의 조합을 임의의 순서로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 올리고펩티드는 아미노산 치환 L45R/Y89A/Y94A를 포함하는 약독화된 톡소이드 SEB인 SEB 돌연변이체를 포함하는 것으로 개시되어 있다.

본 발명의 목적은 보호성 면역 반응을 유발하는 새로운 SEB 백신 항원을 제공하는 것이다. 상기 목적은 본 청구범위의 주제에 의해 그리고 본원에 추가로 기재된 바와 같이 해결된다.

본 발명은 보호성 면역을 부여하는, 특히 전문 항원 제시 세포(APC) 또는 구성적으로 MHC 클래스 II를 발현하는 선천적 및/또는 적응성 면역계의 세포를 표적으로 하는 백신 항원을 제공한다.

본 발명은 스타필로코커스 외독소 B(SEB) 독소 서열 서열번호 1의 아미노산 위치 21 내지 25, 또는 임의의 다른 천연 SEB 독소 서열의 상응하는 아미노산 위치에 적어도 2개 또는 적어도 3개의 점 돌연변이(point mutation)를 포함하도록 돌연변이된 해독된 SEB 독소, 해독된 SEB 독소의 적어도 하나의 분자를 포함하는 보호성 백신 항원, 보호성 백신, 및 의료 목적을 위한 이러한 백신의 용도를 제공한다.

본원에 기재된 해독된 SEB 독소는 또한 해독된 SEB 또는 해독된 스타필로코커스 외독소로서 이해된다.

특정 측면에 따르면, 본 발명은 SEB 독소 서열 서열번호 1에서 아미노산 위치 21 내지 25(즉, "aa21-25 내", "aa21-25의 영역에서"로서 지칭되기도 함)에 적어도 2개 또는 적어도 3개의 점 돌연변이를 포함하도록 돌연변이된 해독된 스타필로코커스 외독소 B(SEB) 독소를 제공하고, 여기서 상기 적어도 2개 또는 3개의 점 돌연변이는 aa21-22, aa22-23, aa23-24, aa24-25, aa21-23, aa22-24, 또는 aa23-25의 결실 또는 서열번호 1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 임의의 다른 천연 SEB 독소 서열 중의 상응하는 아미노산 위치에서의 결실을 포함한다. 구체적으로, 이러한 천연 SEB 독소는 각각의 해독성 돌연변이를 통합하도록 조작되지 않는 한 스타필로코커스 초항원으로서 기능적이다.

구체적으로, 서열번호 1에 의해 동정된 야생형 SEB 독소는 에스. 아우레우스(ATCC 14458)로부터 유래된다. 다른 천연 SEB 독소 서열은 T-세포 수용체(α/β) 결합 영역 이외의 영역(서열번호 1의 aa21-25; "MENMK", 서열번호 37; 위치 M21, E22, N23, M24, 및 K25를 동정함) 또는 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 영역, 예를 들어, MHC 클래스 II 수용체 결합 영역, 특히 항원 결합 홈의 내부, 인접 또는 외부에 결합하는 영역(예: 서열번호 1의 aa42-47; "DQFLYF", 서열번호 38; 위치 D42, Q43, F44, L45, Y46, 및 F47을 동정함; 또는 서열번호 1의 aa89-91; 또는 서열번호 1의 aa66-68)에서 가변성을 갖고 상이한 에스. 아우레우스 공급원(또는 단리물)으로부터 유래된다. 이러한 영역은 본원에서 "코어 영역"으로 지칭된다. 구체적으로, aa21-25 및 aa42-47 중 어느 하나 또는 둘 다, 및 임의로 aa89-91 또는 aa66-68 중 어느 하나 또는 둘 다. SEB 독소 서열 내의 임의의 다른 영역은 본원에서 SEB의 "비코어 영역"으로 지칭된다.

예시적인 천연 SEB 야생형 변이체는 각각 동일한 코어 영역을 포함하고, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성을 갖는 비코어 영역에서 가변성을 포함하는 서열번호 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 29를 포함하거나 이로 이루어진다. 서열번호 1의 천연 SEB 야생형 변이체의 비코딩 영역 내의 점 돌연변이의 수는 1, 2, 3, 4 또는 5개일 수 있다.

해독된 SEB 독소는 구체적으로 본원에 추가로 기재된 바와 같이 T-세포 수용체 결합 영역 및 임의로 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 영역에서의 해독성 점 돌연변이를 특징으로 한다.

구체적으로, 해독성 점 돌연변이는 SEB의 T-세포 수용체 결합 영역 내, 보다 구체적으로 aa21-25 내에 있다. 구체적으로, 해독성 점 돌연변이는 aa21-25의 영역에 있으며, 적어도 2개 또는 3개의 아미노산의 결실을 포함한다. 구체적으로, aa21-25의 영역에서 해독성 점 돌연변이는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산만의 결실로 이루어지고, 바람직하게는 적어도 N23의 결실 및 N23에 인접한 하나 또는 둘 모두의 아미노산의 결실을 포함한다. aa21-25 내의 점 돌연변이의 수는 2, 3, 4 또는 5개일 수 있고, 구체적으로 여기서 점 돌연변이는 aa21-22, aa22-23, aa23-24, aa24-25, aa21-23, aa22-24 또는 aa23-25와 같은 적어도 2개 또는 3개의 연속적 (인접) aa 위치이다. 대안적으로, 위치 aa23에서의 점 돌연변이는 aa21 및/또는 aa25에서와 같은 하나 이상의 비연속적 (비인접) 돌연변이와 조합된다.

특정 측면에 따르면, aa21-25의 영역에서의 돌연변이는 적어도 N23 및/또는 E22 및/또는 M24 및/또는 M21 및/또는 K25의 결실을 포함하는 적어도 2, 3 또는 4개의 아미노산의 결실, 예를 들어, aa22-23, aa23-24, aa21-23, aa22-24 또는 aa23-25 중 적어도 어느 하나의 결실 또는 치환, 특히 aa22-24만의 결실이다.

특히 바람직한 측면에 따르면, 아미노산 위치 21-25에서의 상기 점 돌연변이는 아미노산 22-24 및/또는 21-23의 결실을 포함하거나 이로 이루어진다.

구체적으로, 해독된 SEB 독소는 L45, Q43, 또는 F44, 바람직하게는 L45R, Q43P, F44P, 또는 F44S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 하나 이상의 추가 점 돌연변이를 포함하고, 바람직하게는 상기 해독된 SEB 독소는 서열번호 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나, 또는 아미노산 위치 21 내지 25에서 상기 적어도 2개의 점 돌연변이, 바람직하게는 aa22-24의 결실, 및 전술한 것 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 전술한 것 중 어느 하나의 해독된 SEB 변이체 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

특정 측면에 따르면, 해독된 SEB 독소는 그의 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 영역, 바람직하게는 aa42-47의 영역에서 하나 이상의 추가(추가의) 점 돌연변이(즉, aa21-25의 영역 내의 것들 이외)를 특징으로 하고, 여기서 상기 하나 이상의 추가 점 돌연변이는 L45, Q43 또는 F44, 바람직하게는 L45R, Q43P, F44P, 또는 F44S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 위치, 바람직하게는 L45R과 같은 위치 L45에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.

일반적으로, 서열(예: 본원에 기재된 아미노산 서열)에서 이루어거나 동정된 돌연변이는 참조 (또는 야생형) 서열, 즉 돌연변이를 함유하지 않는 서열과 관련하여 넘버링된다. 따라서, 달리 명시적으로 기재되지 않는 한, 해독된 SEB 독소 내의 아미노산의 위치는, 예를 들어, 서열번호 1에 의해 동정된 각각의 야생형 독소의 위치이다. 해독된 SEB 독소는 T-세포 수용체 결합 영역에 하나 이상의 아미노산의 결실을 포함할 수 있지만, 임의의 이러한 결실에 이어지는 위치는 여전히 야생형 단백질에서와 같이 넘버링될 것이다. 예를 들어, aa22-24를 결실시키는 결실 돌연변이체에서, L45에서의 점 돌연변이는 여전히 aa45로 넘버링된 위치에 있지만, 이러한 결실 돌연변이체의 서열은 3개의 아미노산에 의해 단축되었다.

특정 측면에 따르면, 해독된 SEB 독소는 서열번호 3, 또는 아미노산 위치 21-25에 상기 적어도 2개 또는 상기 적어도 3개의 점 돌연변이 및 서열번호 3에 대한 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성을 포함하는 이의 해독된 SEB 변이체 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

구체적으로, 해독된 SEB 독소는 aa22-24의 결실에서 서열번호 1과 상이한 서열번호 3, 또는 aa22-24의 상기 결실 및 서열번호 3에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 이의 해독된 SEB 변이체 서열(즉, 서열번호 3의 변이체 SEB 서열)을 포함하거나 이로 이루어진다.

구체적으로, 서열번호 3의 상기 해독된 SEB 변이체 서열은 서열번호 3에 포함된 aa22-24의 상기 결실; 및

a) 이의 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 영역 내, 바람직하게는 aa42-47 내(즉, 영역 내)에 하나 이상의 추가 점 돌연변이, 및/또는

b) SEB 서열의 다른 영역에서, 예를 들어, 비코어 영역에서 자연적으로 발생하는 하나 이상의 추가 점 돌연변이, 예를 들어, SEB 야생형 변이체에서 자연적으로 발생하는, 예를 들어, 서열번호 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 29 중 어느 하나에서 발생하는 하나 이상의 점 돌연변이, 특히 다음 점 돌연변이: K7N, S14A, V82L, T133S, K141E, T150I, S225F 중 하나 이상; 및/또는

c) 서열번호 3 또는 서열번호 3의 상응하는 비코어 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성을 포함한다.

특정 구현예는 서열번호 3의 SEB 독소 변이체 서열을 포함하며, 이는 본원에 기재된 해독성 변이체를 포함하며, 서열번호 3의 각각의 영역에 대해, 특히 서열번호 3의 모든 상응하는 영역의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성 중 어느 하나를 특징으로 한다.

특정 구현예는 서열번호 3의 SEB 독소 변이체 서열을 포함하며, 이는 본원에 기재된 해독성 변이체를 포함하며, 특히 서열번호 3의 상응하는 영역과 비교하여, 각각의 비코어 영역에 대해, 특히 모든 상응하는 비코어 영역의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성 중 어느 하나를 특징으로 한다.

특정 구현예에 따르면, 해독된 SEB 독소는 서열번호 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나, 또는 아미노산 위치 21 내지 25에 상기 적어도 2개 또는 상기 적어도 3개의 점 돌연변이 및 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성을 포함하는 전술한 것 중 임의의 것의 해독된 SEB 변이체 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

구체적으로, 서열번호 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나의 상기 해독된 SEB 변이체 서열은 아미노산 위치 21-25에서 각각의 서열번호 5, 7, 9 또는 11에 포함되는 상기 적어도 2개 또는 적어도 3개의 점 돌연변이; 및

a) 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 영역 내, 바람직하게는 aa42-47 내의 하나 이상의 추가 점 돌연변이, 및/또는

c) 각각의 서열번호 5, 7, 9 또는 11 또는 각각의 서열번호 5, 7, 9 또는 11의 상응하는 비코어 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성을 포함한다.

특정 구현예는 서열번호 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나의 해독된 SEB 변이체 서열을 포함하며, 이는 본원에 기재된 해독성 돌연변이를 포함하며, 특히 전술한 해독된 SEB 독소 서열 중 어느 하나의 각각의 비코어 영역에 대해, 특히 전술한 해독된 SEB 독소 서열 중 어느 하나의 모든 상응하는 비코어 영역의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성 중 어느 하나를 특징으로 한다.

특정 구현예는 서열번호 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나의 해독된 SEB 변이체 서열을 포함하며, 이는 본원에 기재된 해독성 돌연변이를 포함하며, 특히 전술한 해독된 SEB 독소 서열 중 어느 하나의 각각의 영역에 대해, 특히 전술한 해독된 SEB 독소 서열 중 어느 하나의 모든 상응하는 비코어 영역의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성 중 어느 하나를 특징으로 한다.

T-세포 수용체 결합 영역 중의 하나 이상의 점 돌연변이에도 불구하고, 본 발명의 SEB는 해독될 뿐만 아니라, 놀랍게도 백신 항원으로서 사용될 때 효과적인 면역 반응을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 면역 반응은 보호적인 것으로 밝혀졌고, T-세포 수용체에 결합하는 야생형 SEB의 능력을 표적으로 하여 억제할 수 있었고, 이로써 야생형 SEB 및 염증성 면역 반응의 LPS 유발제로 도전시 각각의 면역 반응 및 염증 반응을 예방한다.

따라서, 본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 해독된 SEB 독소의 적어도 하나의 분자를 포함하거나 이로 이루어진 보호성 백신 항원을 제공한다.

구체적으로, 백신 항원은 상기 해독된 SEB 독소 분자와 동일하거나 상이한 스타필로코커스 백신 항원과 조합하여 상기 적어도 하나의 해독된 SEB 독소 분자를 포함하거나 이로 이루어지고, 바람직하게는 여기서 상기 조합은 서로 결합되고/되거나 담체에 결합되어 복합체를 형성하는 상기 분자 및 항원을 포함하는 융합체(fusion), 혼합물, 또는 복합체(complex)로서 제공된다.

예시적인 조합은 비독성 또는 해독된 SEB 분자의 융합체이며, 여기서 상기 SEB 분자 중 적어도 하나 (또는 2개)는 본원에 기재된 점 돌연변이를 포함하는 해독된 SEB이다.

구체적으로, 상기 적어도 하나의 해독된 SEB 독소 분자는 임의로 링커 서열을 포함하는 다른 해독된 SEB 독소 분자에 융합된다. 적절하게 사용되는 특정 링커는, 예를 들어, 일련의 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커이다. 구체적으로, 분자의 융합체는 링커의 유무에 관계없이 펩티드 결합에 의해 임의의 순서로 이루어진다.

특정 측면에 따르면, 융합체는 본원에 기재된 상기 해독된 SEB 독소의 적어도 두 개의 동일한 분자, 또는 본원에 기재된 바와 같은 해독성 점 돌연변이 중 적어도 하나에서 상이한 본원에 기재된 상기 해독된 SEB 독소의 적어도 2개의 분자를 포함한다. 적어도 2개의 분자, 특히 2개의 동일한 분자의 융합체는 링커의 유무에 관계없이 본원에서 "탠덤 작제물"로서도 지칭된다.

융합은 각각의 펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 분자의 재조합에 의해 또는 그렇지 않으면 코딩 핵산 분자 또는 융합된 (폴리)펩티드 서열을 합성함으로써 달성될 수 있다.

구체적으로, 링커는 바람직하게는 임의의 천연 아미노산, 바람직하게는 임의의 Gly, Ser, His, Met, Lys, Leu 및 Thr로부터 선택된 것과 같은 다수의 연속적인 아미노산 잔기로 구성된 펩티드 링커일 수 있다. 링커는 인접한 펩티드가 서로에 대해 자유롭게 이동하도록 글리신 및 세린과 같은 가요성 잔기로 구성될 수 있다. 본원에 기재된 2개의 해독된 SEB 독소 분자를 융합하기 위해, 짧은 링커, 예를 들어, 2 내지 10개의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 예를 들어, Lys-Leu, His-Met, Gly-Thr 및 Gly-Gly-Gly로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 펩티드 링커가 충분하다. 예를 들어, 2개의 인접한 분자가 서로 입체적으로 간섭하지 않음을 보장하는 데 필요한 경우, 10개보다 긴 아미노산과 같은 더 긴 링커가 사용될 수 있다.

특정 측면에 따르면, 항원은, 예를 들어, 폴리펩티드의 구조 또는 안정성을 향상시키기 위해 링커 이외에 하나 이상의 펩티드 스페이서를 포함할 수 있다.

구체적으로, 본원에 기재된 펩티드 융합체는 생체접합, 화학적 접합 또는 가교결합에 의해 서로 편리하게 결합되는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원은 펩티드 접합체를 포함할 수 있다. 특정 구현예는 일련의 펩티드를 고정화하기 위해 적절하게 사용되는 나노구조물 또는 비드와 같은 다량체화 도메인, 담체, 또는 장치를 사용할 수 있다.

또한, 항원은 공유 결합 또는 비공유 결합을 통해 결합된 둘 이상의 폴리펩티드 쇄로 구성된 분자 또는 분자 복합체로서 제공될 수 있거나 항원성 조성물을 수득하기 위해 혼합될 수 있다.

특정 구현예에 따르면, 백신 항원은 서열번호 13, 31, 33, 또는 35 중 어느 하나, 또는 아미노산 위치 21 내지 25에 상기 적어도 2개의 점 돌연변이 및 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성을 포함하는 전술한 것 중 어느 하나의 백신 항원 변이체 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.

구체적으로, 서열번호 13, 31, 33 또는 35 중 어느 하나의 상기 백신 항원 변이체 서열은 아미노산 위치 21-25에 각각의 서열번호 13, 31, 33 또는 35에 포함되는 상기 적어도 2개 또는 적어도 3개의 점 돌연변이를 포함하고;

b) SEB 서열의 다른 영역에, 예를 들어, 비코어 영역에서 자연적으로 발생하는 하나 이상의 추가 점 돌연변이, 예를 들어, SEB 야생형 변이체에서 자연적으로 발생하는, 예를 들어, 서열번호 17, 19, 21, 23, 25, 27 또는 29 중 어느 하나에서 발생하는 하나 이상의 점 돌연변이, 특히 다음의 점 돌연변이: K7N, S14A, V82L, T133S, K141E, T150I, S225F 중 하나 이상; 및/또는

c) 각각의 서열번호 13, 31, 33 또는 35, 또는 각각의 서열번호 13, 31, 33 또는 35의 상응하는 비코어 영역에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 서열 동일성을 포함한다.

특정 구현예는 서열번호 13, 31, 33, 또는 35의 백신 항원 변이체 서열을 포함하며, 이는 본원에 기재된 해독성 돌연변이를 포함하며, 특히 전술한 서열 중 어느 하나의 각각의 비코어 영역에 대해, 특히 전술한 서열 중 어느 하나의 모든 상응하는 비코어 영역의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성 중 어느 하나를 특징으로 한다.

특정 구현예는 서열번호 13, 31, 33, 또는 35의 백신 항원 변이체 서열을 포함하며, 이는 본원에 기재된 해독성 돌연변이를 포함하며, 특히 전술한 서열 중 어느 하나의 각각의 영역에 대해, 특히 전술한 서열 중 어느 하나의 모든 상응하는 영역의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 서열 동일성 중 어느 하나를 특징으로 한다.

본원에 기재된 백신 항원에 포함되는 또 다른 조합은 복합체이며, 여기서 상기 분자는 백신 제제를 제형화하는 데 사용하기에 적합한 것들과 같은 리포좀, 나노입자 또는 고체 담체에 흡착, 부착되거나, 그렇지 않으면 고정화되거나 결합된다.

대안적인 조합은 소정의 비율 또는 투여량으로 백신 제형에 제공되는 것과 같은 분자의 혼합물, 예를 들어, 보조제(adjuvant) 화합물, 예를 들어, 불용성 금속 염, 예를 들어, 명반, 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄 상에 제형화된 혼합물이다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 항원을 포함하고, 예를 들어, 면역원성 제형에 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 제제를 제공한다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 항원 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 보호성 백신 제제를 제공한다.

백신 제제의 특정 구현예는, 예를 들어, 인간 백신 제제에 적절하게 사용되는 보조제를 포함한다.

보조제의 특정 예는 불용성 금속 염, 글루코피라노실 지질 A 보조제, AS01, AS03 또는 AS04와 같은 선천적 면역 자극제인 보조제 시스템, MF59, TCR 자극제, 예를 들어, 톨-유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist) 또는 CpG 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 명반, 수산화알루미늄, 또는 인산알루미늄으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

구체적으로, 백신은 프라임 부스트 전략을 사용하여 유효량으로 대상체, 특히 인간 대상체에게 투여될 수 있다.

구체적으로, 백신 항원의 유효량은 투여당 0.0001 내지 1mg의 범위이고, 바람직하게는 투여당 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900ng 중 적어도 어느 하나 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100μg 중 적어도 어느 하나이다.

구체적으로, 본원에 기재된 백신 제제는 인간 사용을 위한 제형으로 제공된다. 특정 구현예는 근육내 또는 피하와 같은 비경구, 비강내, 점막, 경구, 미세바늘 피부(microneedle skin), 경피, 설하, 에어로졸 또는 흡입 투여용 제형으로 제공된다. 바람직하게는, 치료는 각각의 투여 경로에 의한 본원에 기재된 백신의 투여를 포함한다.

백신은 피하, 점막 위장, 피부 또는 근육내 부위 중 하나 이상에서와 같은 SEB 노출 또는 독성 부위에서 특이적으로 보호성이다.

특정 측면에 따르면, 백신 제제는 바람직하게는 TSST-1, 알파-헤몰리신, 감마-헤몰리신, 베타-헤몰리신, 스타필로코커스 외독소 또는 엔테로톡신, 예를 들어, 엔테로톡신 A(SEA), C(SEC), I(SEI) 및 K(SEK)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 스타필로코커스 초항원 톡소이드 항원과 조합된 상기 백신 항원을 포함하는 다가 백신이다.

특정 측면에 따르면, 구체적으로, 본원에 기재된 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원은 의학적, 진단적 또는 분석적 사용을 위해 제공된다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 해독된 SEB 독소, 백신 항원 또는 백신 제제의 의학적 용도, 특히 대상체, 예를 들어, 인간 대상체 또는 환자를 치료하기 위한, 특히 특정 질환 상태 또는 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 제제, 예를 들어, 백신 제제의 생산 방법에서 이러한 물질의 용도를 제공한다.

구체적으로, 의학적 용도는 면역요법, 예를 들어, 활성 면역요법을 포함한다. 특정 면역요법은 면역 반응을 유도, 증강, 억제하거나, 그렇지 않으면 변형시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 질환을 앓았거나 걸릴 위험에 있거나 앓고 있거나 질환이 재발된 대상체의 치료를 위해 제공한다.

구체적으로, 백신 제제는 스타필로코커스 초항원 발현 박테리아 감염; 및/또는 스타필로코커스 초항원 독소에 대한 노출에 의해 직접 또는 간접적으로 매개되는 질환 상태의 예방 또는 치료에 사용하기 위해 제공된다. 구체적으로, 질환 상태는 표적 스타필로코커스 종에 의해 유도되거나 유발된다.

구체적으로, 백신 제제는 스타필로코커스 종에 의한 감염을 예방하기 위한 예방적 치료, 특히 백신접종을 위해 대상체를 백신접종하고, 이를 필요로 하는 대상체를 면역화하기 위해 제공된다.

특정 측면에 따르면, 백신 제제는 스타필로코커스 종의 성장의 억제 및 감소가 유익할 수 있는 임의의 질환, 질환 상태 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.

특정 측면에 따르면, 백신 제제는 SEB와 같은 스타필로코커스 독소에 대한 직접적 또는 간접적 노출과 관련된 임의의 질환, 질환 상태 또는 장애를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 점막 또는 피부 접촉을 통해 또는 스타필로코커스 독소의 흡입에 의해 접촉시 식중독 또는 중독으로부터 발생할 수 있는 것과 같은, 이러한 독소에 의한 중독의 예방 또는 치료 방법에서 지시될 수 있다.

특정 측면에 따르면, 백신 제제는 그람 양성 박테리아, 바이러스 또는 진균성 병원체 또는 독소의 미생물 매개체에 의해 유도된 패혈증 상태인 질환 상태를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 패혈증 상태는 패혈증, 독성 쇼크 증후군(TSS) 또는 패혈성 쇼크이다.

LPS와 같은 미생물 독소 또는 그람 양성 박테리아, 바이러스 또는 진균성 병원체의 유사한 독소는, 예를 들어, 스타필로코커스 독소와의 이전 접촉시 스타필로코커스 합병증의 소인 또는 스타필로코커스 감염을 갖는 대상체에서 심각한 패혈증 상태를 유발할 수 있다.

특정 측면에 따르면, 백신 제제는 수술적 개입(surgical intervention) 또는 질환의 침습적 치료(invasive treatment) 후에 스타필로코커스 합병증의 위험이 있는 환자를 백신 제제로 면역화하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 수술적 개입 또는 침습적 치료 전에 이러한 환자를 면역화하면 스타필로코커스 합병증의 위험을 감소시킬 것이다.

본 발명은 추가로

a) 백신 제제를 생산하거나, 또는

b) SEB 독소를 특이적으로 인식하는 항체를 생산하는 방법에서 본원에 기재된 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원의 용도를 제공한다.

백신 제제는 단백질 또는 서브유닛 백신을 생산하기 위해 적절하게 사용되는 방법에 의해 생산될 수 있다. 구체적으로, 백신 제제는 선택된 투여 경로에 적절하게 사용되는 백신 제형으로 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원을 제형화함으로써 생산된다.

본 발명은 또한 재조합 숙주 세포(recombinant host cell) 내에서 각각의 독소 또는 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키고, 각각의 독소 또는 항원을 단리시키고, 임의로 정제함으로써 본원에 기재된 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원을 생산하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본원에 기재된 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원은 재조합 발현 기술에 의해 생산되는 것과 같은 재조합 단백질로서 제공된다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자는 역돌연변이의 위험이 감소되도록, 또는 원핵 또는 진핵 또는 곤충 숙주 세포, 예를 들어, 이.콜라이(E. coli) 또는 포유류 발현 시스템에서 서열을 발현하는 것을 개선시키기 위해 코돈 최적화될 수 있다.

특정 구현예는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, 34, 또는 36 중 어느 하나, 또는 이의 코돈 최적화된 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 핵산 분자를 지칭한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는, 재조합 숙주 세포에서 본원에 기재된 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원을 생산하기 위한 재조합 발현 작제물(expression construct)을 제공한다. 이러한 발현 작제물은, 예를 들어, 벡터 또는 플라스미드 내에 적어도 발현 카세트를 포함하거나 숙주 세포 게놈에 염색체 혼입을 위해 제공된다.

특정 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포에 의해 생체외 세포 배양에서 본원에 기재된 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원을 생산하기 위한 발현 시스템을 추가로 제공한다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 핵산 분자 또는 발현 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.

적합한 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포, 예를 들어, 이. 콜라이뿐만 아니라 포유류, 곤충 또는 효모 세포, 예를 들어, 많은 것들 중에서, HEK293 세포, CHO 세포, NS0 세포, Sf9 세포, 하이 파이브(High Five) 세포, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세페비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

특정 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원을 생산하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 본원에 기재된 재조합 숙주 세포는 상기 항원을 생산하는 조건하에서 배양되거나 유지된다.

도 1은 본원에서 언급된 서열을 도시한다.
도 2. SEB 독소는 10mg 내지 1pg의 범위로 3H-티미딘 혼입에 의해 검출된 바와 같이 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 높은 T-세포 증식을 유도한다.
도 3. SEB del 22-24로 자극된 인간 PMNC의 증식: 돌연변이체 SEB del 22-24는 매우 감소되지만 부재는 아닌 T-세포 증식을 유도한다.
도 4 내지 6은 SEB del L45R과 비교하여 SEB del 22-24의 개선을 보여준다. 데이터는 다음으로 확인된다
도 4. SEB 및 SEB 돌연변이체, T-세포 의존 매개체로 자극된 PBM의 상청액 중의 IL-2 단백질 농도: SEB 독소는 용량 의존적 높은 T-세포 활성화를 유발하고, 결과적으로 높은 IL-2 사이토카인 방출을 일으킨다. 이중 돌연변이체 변이체 L45R 및 결실 22-24는 고농도에서도 T-세포를 활성화하지 않으며, Il-2 사이토카인 방출은 자극되지 않은 세포와 비교하여 증가되지 않는다.
도 5. SEB 및 SEB 변이체, 염증성 매개체로 자극된 PBMC의 상청액에서 IL-6 단백질 농도: 생체내 인간에서 익히 공지된 염증성 반응; 인간 PBMC에서 투여량 의존적 IL-6 방출의 검출.
도 6. SEB 및 SEB 돌연변이체로 자극된 PBMC의 상청액 중의 TNF α 단백질 농도. 효과는 투여량 의존적이다. 변이체 L45R 및 결실 돌연변이체 22-24는 자극되지 않은 대조군 위에 TNF α 방출을 나타내지 않는다.
도 7. 4회 면역화 후 래빗 혈청에 의한 T-세포 활성화의 억제.
도 8. 4회 면역화 후 래빗 혈청에 의한 T-세포 활성화의 억제: SEB 야생형에 대한 항혈청과 비교하여 SEB del 22-24 L45R에 대한 항혈청.
도 9. 4회 면역화 후 래빗 혈청에 의한 T-세포 활성화의 억제: SEB 야생형에 대한 항혈청과 비교하여 융합 (탠덤) SEB del 22-24 L45R 작제물에 대한 항혈청.
도 10. SEB del 22-24 L45R로 자극된 인간 PBMC의 증식. 인간 PBMC에서 T-세포 증식은 크게 감소된다.
도 11. SEB 야생형 및 SEB del 22-24 L45R에 의한 자극 후 IL-2 유전자 활성화. IL-2 유전자 활성화는 이중 돌연변이체에 의해 크게 감소된다.
도 12. 100μg 탠덤 SEB del 22-24 L45R 작제물 + 1mg AL(OH)₃으로 면역화 후 ELISA 역가(평균 n = 8).
도 13: 인간 MNC의 증식, wtSEB, rSEB(del22-24), rSEB(N23L, L45R, Y91P, Q210L) 및 rSEB(del22-24, L45R, Y91P, Q210L)의 비교.

본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 특정 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다.

본원에서 사용되는 용어 "포함하다", "함유하다", "갖다" 및 "포함하다"는 동의어로 사용될 수 있으며, 추가 구성원 또는 부분 또는 요소를 허용하는 개방된 정의로서 이해되어야 한다. "이루어지는"은 이루어지는 정의 특성의 추가 요소 없이 가장 가까운 정의로 간주된다. 따라서, "포함하는"은 더 넓고 "이루어지는" 정의를 함유한다.

본원에서 사용되는 용어 "항원"은 특히 가능하게는 항체의 결합 부위에 의해 인식될 수 있는 임의의 항원성 결정인자를 지칭한다. 구체적으로, 바람직한 항원은 이미 면역학적으로 또는 치료적으로 관련되는 것으로 입증되었거나 관련될 수 있는 분자 또는 구조들, 특히 임상 효과가 시험된 것들이다. 본원에 사용된 용어는 특히 면역접근가능하고 면역관련 에피토프를 포함하는 항원, 특히 하나 이상의 종 또는 혈청형에서 발견되는 보존된 항원으로부터 선택된 분자 또는 구조를 포함할 것이다. 면역접근가능한 바이러스 에피토프는 전형적으로 비리온의 외부 표면 또는 감염된 세포의 표면에서 발현되는 항원에 의해 제시되거나 항원에 포함된다.

본원에 기재된 선택된 에피토프 및 펩티드는 각각 항원 및 표적 박테리아에 대한 중화 항체를 유도하도록 생체내에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 이것은 항원에 의한 활성 면역화시 효과적인 보호를 제공한다. 폴리펩티드 항원은 세포성 면역 반응과 체액성 면역 반응을 모두 유도하는 그들의 고유한 능력으로 인해 바람직한 항원이다.

본원에서 언급된 보호 항원은 보호성 면역 반응을 유도하는 것으로 이해된다.

용어 "보호성 면역 반응" 또는 "보호성 면역"은 본원에서 다음과 같이 이해된다: 보호성 면역은 대상체의 반응이 각각의 항원 또는 병원체의 도전적인 투여량, 심지어 그렇지 않으면 면역화되지 않은 대상체에서 독성이거나 치명적인 투여량, 또는 어떤 반응이 바람직하지 않거나 통제되지 않은 염증 및/또는 면역 세포의 활성화를 억제하는 투여량을 생존시키거나 중화하기에 충분하도록 면역화에 의해 생성된 면역 반응에 의해 부여된 대상체의 상태이다. SEB와 같은 스타필로코커스 독소는 항원 제시 세포 및/또는 T-세포의 활성화 및 기관, 예를 들어, 위장, 호흡기, 비뇨생식기, 점막 또는 뇌를 손상시킬 수 있거나 심지어 치명적일 수 있는 통제되지 않은 염증 반응을 일으킬 수 있다. 본원에 기재된 대상체 백신은 구체적으로 이러한 염증 반응을 예방하거나 감소시키기 위해 보호성 면역을 제공하도록 설계된다. 보호성 면역은 항원 제시 세포의 바람직하지 않은 자극 및/또는 T-세포 활성화의 억제를 결정하는 시험관내 또는 생체내 검정에 의해 결정될 수 있다. 생체내 검정은 바람직하게는 적어도 2개의 상이한 종, 예를 들어, 마우스 및 래빗 모델에서 적합한 동물 모델을 사용한다.

본원에 기재된 항원은 자연적으로 발생하지만 특정 해독성 돌연변이를 도입하도록 변형된 선형의 비분지된 아미노산 서열을 특이적으로 포함하는 단백질 항원으로서 이해되며, 이는, 예를 들어, 돌연변이 또는 화학적 유도체화에 의해, 예를 들어, 인산화, 메틸화, 아세틸화, 아미드화, 피롤리돈 카복실산의 형성, 이성체화, 하이드록실화, 황산화, 플라빈 결합, 시스테인 산화 및 니트로실화에 의해 추가로 변형될 수 있다.

본원에서 사용되는 해독된 독소 및 백신 항원은 구체적으로 대상체에서 면역 반응을 유발하도록 설계되었으며, 특히 항체의 결합 부위에 의해 가능하게 인식될 수 있거나 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 분자 또는 다른 항원 제시 분자, 예를 들어, CD1의 펩티드 홈에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원성 결정인자를 포함하고, 그 자체가 특정 T-세포의 자극제로서 작용할 수 있다. 백신 항원은 구체적으로 본원에서 대상체의 면역계 및/또는 각각의 항체에 의해 인식되는 구조물로서 이해되는 하나 이상의 면역학적으로 관련된 에피토프를 포함한다. 에피토프는, 예를 들어, B-세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프, 예를 들어, CD4+ T-세포 에피토프 또는 CD8+ T-세포 에피토프일 수 있다.

면역 반응 또는 각각의 중화 항체의 중화 활성은 세포-기반 검정 및 생체내에서 시험될 수 있다. 중화 항체는, 예를 들어, 항체의 존재하에 박테리아 역가를 열거함으로써 및/또는 세포-기반 감염 검정에서 세포변성 효과를 검출함으로써 결정될 수 있다.

보호성 면역 반응은 스타필로코커스 감염의 생체내 모델을 사용하여 측정될 수 있다.

용어 "발현"은 다음과 같은 방식으로 이해된다. 예를 들어, 본원에 기재된 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원과 같은 발현 산물의 목적하는 코딩 서열, 및 조절 서열, 예를 들어, 작동 가능한 연결의 프로모터를 함유하는 핵산 분자가 발현 목적으로 사용될 수 있다. 이들 서열로 형질전환되거나 형질감염된 숙주는 인코딩된 단백질을 생산할 수 있다. 형질전환을 수행하기 위해, 발현 시스템이 벡터에 포함될 수 있지만, 관련 DNA는 또한 숙주 세포 염색체에 통합될 수 있다. 구체적으로, 상기 용어는, 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 위한 적절한 조건하에서 숙주 세포 및 상용성 벡터를 지칭한다.

코딩 DNA는 특정 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 코딩 DNA의 발현을 개시, 조절 또는 달리 매개하거나 조절하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA 및 코딩 DNA는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자로부터 유래될 수 있고, 동일하거나 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어, 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.

본원에서 사용된 "벡터"는 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사 및 적절한 숙주 유기체에서 mRNA의 번역에 필요한 DNA 서열로서 정의된다.

"발현 카세트"는 정의된 제한 부위에서 벡터에 삽입될 수 있는 발현 산물을 코딩하는 DNA 코딩 서열 또는 DNA의 세그먼트를 지칭한다. 카세트 제한 부위는 적절한 판독 프레임에 카세트의 삽입을 보장하도록 설계되었다. 일반적으로, 외래 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에 삽입된 다음, 벡터에 의해 전달 가능한 벡터 DNA와 함께 숙주 세포로 운반된다. 발현 벡터와 같은 DNA가 삽입되거나 부가된 DNA의 세그먼트 또는 서열은 또한 "DNA 작제물"로 지칭될 수 있다.

발현 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 추가로 일반적으로 숙주 세포 또는 게놈 통합 부위에서 자율 복제을 위한 기원, 하나 이상의 선택 가능한 마커(예: 아미노산 합성 유전자 또는 제오신, 카나마이신, G418 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적절한 프로모터 서열 및 전사 종결자를 포함하며, 이 성분은 함께 작동 가능하게 연결된다. 본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 뉴클레오티드 서열 및 게놈 통합 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적인 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 일반적으로 추가 (외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고, 적절한 숙주 세포에 쉽게 도입될 수 있는 이중 가닥 DNA의 자가 함유 분자이다. 플라스미드 벡터는 종종 코딩 DNA 및 프로모터 DNA를 함유하며 외래 DNA의 삽입에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 구체적으로, 용어 "벡터" 또는 "플라스미드"는 DNA 또는 RNA 서열(예: 외래 유전자)이 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예: 전사 및 번역)을 촉진시키기 위해 숙주 세포로 도입될 수 있는 비히클을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 특정 재조합 단백질을 생산하도록 형질전환된 1차 대상체 세포 및 이의 임의의 자손을 지칭한다. 모든 자손이 부모 세포와 정확하게 동일하지는 않지만(고의적이거나 부주의한 돌연변이 또는 환경의 차이로 인해), 자손이 원래 형질전환된 세포의 것과 동일한 작용성을 유지하는 한, 이러한 변경된 자손은 이러한 용어에 포함된다는 것이 이해되어야 한다. 용어 "숙주 세포주"는 재조합 단백질을 생산하기 위해 재조합 유전자를 발현시키기 위해 사용되는 숙주 세포의 세포주를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "세포주"는 장기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 지칭한다. 이러한 숙주 세포 또는 숙주 세포주는 세포 배양에서 유지되고/되거나 배양되어 재조합 폴리펩티드를 생산할 수 있다.

본원에서 사용되는 해독된 독소 및 백신 항원은 단리된 단백질로서 구체적으로 제공된다. 단백질과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "단리된" 또는 "단리"는 그것이 "정제된" 또는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하기 위해 자연적으로 관련될 환경으로부터 충분히 분리된 이러한 화합물을 지칭한다. 그러나, "단리된"은 반드시 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 융합체 또는 혼합물의 배제, 또는 기본적인 활성을 방해하지 않고, 예를 들어, 불완전한 정제로 인해 존재할 수 있는 불순물의 배제를 의미하는 것은 아니다. 단리된 화합물은 이의 제제를 생성하기 위해 추가로 제형화될 수 있고, 여전히 실용적인 목적을 위해 단리될 수 있고 - 예를 들어, 단백질의 혼합물 또는 본원에 기재된 각각의 융합 단백질은 분석적, 진단적, 예방적 또는 치료적 적용에 적합한 것들을 포함하는 약제학적으로 허용되는 담체, 또는 진단, 의학적 치료에 또는 분석적 목적을 위해 사용되는 경우 부형제와 혼합될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "정제된"은 적어도 50%(w/w 총 단백질), 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 화합물(예: 본원에 기재된 키메라 항원)을 포함하는 제제를 지칭한다. 고도로 정제된 산물은 본질적으로 오염성 단백질을 함유하지 않으며, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 심지어 적어도 95%, 최대 100%의 순도를 갖는다. 순도는 화합물에 적합한 방법(예: 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정된다. 본원에 기재된 단리된 정제된 단백질은 숙주 세포 불순물을 감소 또는 제거하기 위해 세포 배양 상청액에서 생성물을 발현하는 숙주 세포 배양물로부터 또는 세포 파편으로부터 정제함으로써 수득된 재조합 생성물로서 수득될 수 있다.

정제 단백질을 수득하기 위한 단리 및 정제 방법으로서는, 염석 및 용매 침전과 같은 용해도의 차이를 이용하는 방법, 한외여과 및 겔 전기영동과 같은 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 이용하는 방법, 친화성 크로마토그래피과 같은 특정 친화성을 이용하는 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 소수성의 차이를 이용하는 방법, 및 등전점 집속과 같은 등전점의 차이를 이용하는 방법이 사용될 수 있다. 표준 방법, 예를 들어, 미세여과 또는 접선 유동 필터(TFF) 또는 원심분리에 의한 세포 (파편) 분리 및 세척, 침전 또는 열 처리에 의한 단백질 정제, 효소 소화에 의한 단백질 활성화, 이온 교환(IEX), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 친화성 크로마토그래피, 크기 배제(SEC) 또는 HPLC 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피에 의한 단백질 정제, 단백질 농축 침전 및 한외여과 단계에 의한 세척이 사용될 수 있다. 단리되고 정제된 단백질은 통상적인 방법, 예를 들어, 웨스턴 블롯, HPLC, 활성 검정, 또는 ELISA에 의해 동정될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA(예를 들어, cDNA를 포함) 또는 RNA(예를 들어, mRNA를 포함) 분자를 지칭한다. 분자는 5'로부터 3' 말단까지 판독된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중 가닥 중합체일 수 있다. 상기 용어는 코딩 서열, 예를 들어, 유전자, 각각의 폴리펩티드 서열을 발현하는 발현 작제물에 포함된 것과 같은 인공 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본원에 기재된 해독된 SEB 분자 또는 백신 항원을 인코딩하는 핵산 분자는 천연 SEB 독소 서열의 돌연변이유발(돌연변이)에 의해 특이적으로 제공된다. 특정 아미노산을 결실시키는 돌연변이유발은 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 하나의 특정 아미노산을 치환하기 위한 돌연변이유발은 적어도 하나 또는 두 개의 뉴클레오티드의 치환을 포함할 수 있고, 여기서 상기 치환된 뉴클레오티드를 포함하는 코돈은 치환된 아미노산을 인코딩한다. 뉴클레오티드가 치환되는 경우, 바람직하지 않은 자발적 역 돌연변이의 위험을 감소시키기 위해 코돈 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 교환하는 것이 바람직하다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 분자의 코돈 최적화는 돌연변이체의 안정성을 개선하고/하거나 단지 하나의 자발적인 뉴클레오티드 교환에 의해 역 돌연변이를 피하는 것과 같이 코돈 내의 치환된 뉴클레오티드의 수를 증가시키는 것을 포함할 수 있다

임의의 서열 또는 축퇴 서열의 조합으로 축퇴되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 숙주에서의 발현을 개선하기 위한 코돈 최적화 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자가 사용될 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이 코돈 최적화 서열이 사용될 수 있다. 특정 RNA 분자는 각각의 RNA 백신을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 기재된 발현 시스템, 유전자 작제물 또는 변형은 문헌[참조: J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)]에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 도구, 방법 및 기술을 사용할 수 있다. 발현 벡터는 클로닝 벡터, 변형된 클로닝 벡터 및 구체적으로 고안된 플라스미드를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 바람직한 발현 벡터는 박테리아 또는 진핵 숙주 세포에서 재조합 유전자의 발현에 적합한 발현 벡터이며, 숙주 유기체에 따라 선택된다. 적합한 발현 벡터는 전형적으로 진핵 숙주 세포에서 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA를 발현하기에 적합한 조절 서열을 포함한다. 조절 서열의 예는 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 및 전사 및 번역 개시 및 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 조절 서열은 전형적으로 발현되는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된다.

본원에서 사용되는 용어 "천연"은 네이티브, 야생형 유기체에 의해 발현되거나 이에서 발견되는 요소, 서열 또는 생성물을 지칭한다. 구체적으로, 본원에 기재된 해독된 독소 또는 백신 항원은 비천연 돌연변이, 즉 인공적("인위적")이지만, 예를 들어, 돌연변이유발 기술을 사용하여 생산된 인공 돌연변이체인 돌연변이를 포함한다.

재조합 핵산은 비천연인 서열을 갖거나 그렇지 않으면 분리된 두 개의 서열 세그먼트의 인공 조합에 의해 생산된 서열을 갖는 것일 수 있다. 이러한 인공 조합은 종종 화학적 합성에 의해 또는 보다 일반적으로 핵산의 단리된 세그먼트의 인공적인 조작에 의해, 예를 들어, 당업계에 익히 공지된 유전 공학 기술에 의해 달성된다. 예를 들어, 핵산은 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 하이브리드화시 형성되는 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 천연 뉴클레오티드 또는 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.

본원에 기재된 해독성 돌연변이를 포함하는 것과 같은 단백질의 돌연변이체는, 예를 들어, 부모 aa 서열에 특정 수의 점 돌연변이를 도입함으로써 제공될 수 있다. 구체적으로, 돌연변이유발 방법을 사용하여 하나 이상의 점 돌연변이를 도입한다.

본원에서 사용되는 용어 "해독성 돌연변이"는 천연 (야생형) SEB 독소의 T-세포 수용체 결합 영역 또는 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 영역 중 하나 또는 둘 모두에서 하나 이상의 점 돌연변이(들)를 지칭한다. 이러한 영역은 또한 본원에서 "코어 영역"으로서 지칭된다. SEB 독소의 임의의 다른 영역은 또한 본원에서 "비코어 영역"으로서 지칭된다. 해독성 돌연변이는 단백질의 독성을 감소, 약화 또는 폐지하여 대상체에게 투여시 안전성을 향상시킨다.

본원에 기재된 점 돌연변이는 전형적으로 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열 내의 특정의 정의된 위치에서 하나(단지 하나)의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환을 달성하기 위한 뉴클레오티드 서열 내의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및/또는 치환 중 적어도 하나이다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "점 돌연변이"는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 돌연변이를 지칭할 것이다. 구체적으로, 바람직한 점 돌연변이는 치환, 특히 비보존적 또는 보존적 치환이다. 보존적 치환은 측쇄와 화학적 성질과 관련된 아미노산 계열 내에서 일어나는 것들이다. 이러한 계열의 예는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비극성 지방족 측쇄, 비극성 방향족 측쇄, 비하전된 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등을 갖는 아미노산이다. 이와 관련하여, 아미노산은 64개의 삼중항 코돈에 의해 인코딩된 20개의 천연 아미노산을 지칭한다. 이러한 20개의 아미노산은 중성 전하, 양전하 및 음전하를 갖는 것들로 나눌 수 있다. 바람직한 점 돌연변이는 상이한 극성 및/또는 전하의 아미노산의 교환을 지칭한다.

특정 돌연변이유발 방법은 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드의 점 돌연변이, 일부 구현예에서, 부모 분자의 뉴클레오티드 서열 내의 적어도 2, 3, 4, 또는 5개 또는 심지어 그 이상의 인접 뉴클레오티드를 변화시키는 것과 같은 탠덤 점 돌연변이를 제공한다.

본원에서 사용되는 용어 "돌연변이유발"은 코딩 서열에 적어도 하나의 변화를 갖는 이의 변이체를 수득하기 위해, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 및/또는 치환을 통해 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 각각의 단백질의 돌연변이체를 생산하거나 제공하는 방법을 지칭한다. 돌연변이유발은 부위 지시된 무작위 또는 반무작위를 통해서일 수 있다. 돌연변이유발 방법은 핵산을 조작하거나 각각의 부모 서열 정보를 주형으로 사용하여 뉴클레오티드 서열을 새로 합성하는 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 라이브러리는 선택된 부모 뉴클레오티드 서열의 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다. 변이체의 라이브러리가 생성될 수 있고, 적절한 돌연변이체 단백질 서열이 구체적으로 목적하는 유전자형 또는 표현형에 따라 선택될 수 있다.

특정 구현예에 따르면, 본원에 사용된 임의의 해독된 독소 및 백신 항원은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 것과 같은 재조합 단백질로서 생산될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "재조합"은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 분자 또는 작제물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 2개 이상의 천연 서열을 함유한다. 재조합 단백질은 재조합 핵산에 의해 인코딩되고/되거나 발현되는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, "재조합 세포"는 세포의 네이티브(즉, 비재조합) 형태 내에서 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하고/하거나 그렇지 않으면 비정상적으로 과발현되거나, 과소발현되고/되거나 고의적인 인간 개입으로 인해 전혀 발현되지 않는 네이티브 유전자를 발현한다. 재조합 세포는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 함유한다. "재조합", "재조합하는" 및 "재조합된" 핵산의 생성은 일반적으로 적어도 2개의 핵산 단편의 어셈블리를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "재조합"은 구체적으로 "유전 공학에 의해, 또는 그 결과로 생산됨", 즉 인간 개입에 의해 생산됨을 의미한다. 재조합 뉴클레오티드 서열은 부모 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 점 돌연변이를 도입함으로써 조작될 수 있고, 이러한 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 각각 이러한 발현 카세트 및 숙주 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드는 또한 "재조합"으로 지칭된다. 본원에 기재된 목적을 위해, 당업계의 기술 내의 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 본원에 기재된 특정 구현예는 키메라 항원의 생산, 및 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 발현 카세트, 발현되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 플라스미드, 및 임의의 이러한 수단을 포함하는 숙주 세포를 포함하는, 이러한 생산을 위한 재조합 수단을 지칭한다. 적절한 표준 재조합 DNA 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 특히 문헌[참조: Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989), 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory press)]에 기재된다.

본원에서 용어 "대상체"는 가축 동물, 반려 동물 및 실험실 동물, 특히 특정 질환 상태를 앓고 있는 환자 또는 건강한 대상체인 인간을 포함하는 인간 또는 포유류 대상체를 포함하는 것으로 이해된다. 용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 다른 포유류 대상체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "환자"는 항상 건강한 대상체를 포함한다.

특히, 본원에 기재된 치료 및 의학적 용도는 스타필로코커스 감염 및/또는 오염과 관련된 질환 상태의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 적용된다. 구체적으로, 치료는 스타필로코커스 종이 상태의 원인 제제인 질환 상태의 병인을 방해함으로써 이루어질 수 있다. 대상체는 이러한 질환 상태의 위험이 있거나 질환을 앓고 있는 대상체일 수 있다.

스타필로코커스 아우레우스 박테리아 또는 독소에 의해 유발되는 몇몇 일반적인 질환 상태 또는 장애의 비제한적인 예는 화상(burns), 봉와직염(cellulitis), 피부 괴사(skin necrosis), 눈꺼풀 감염(eyelid infections), 식중독(food poisoning), 관절 감염(joint infections), 폐렴(pneumonia), 피부 감염(skin infections), 수술 상처 감염(surgical wound infection), 열상 피부 증후군(scalded skin syndrome) 및 독성 충격 증후군(toxic shock syndrome)을 포함한다. 질환 상태의 일부는 세포 기능 및 세포 손상 또는 용해에 대한 독소의 직접적, 간접적 또는 2차 영향과 관련될 수 있다.

특정 측면에 따르면, 본원에 기재된 백신에 의해 표적화된 스타필로코커스 종은 인간 병원성 스타필로코커스 종 또는 인간에서 감염을 일으키는 스타필로코커스 종으로부터 선택된다. 구현예에서, 스타필로코커스 종은 특히 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스와 같은 항생제 내성 종을 포함하며, 감염 동안 진화할 수 있는 돌연변이체 병원체, 또는 인공적으로 진화되는 돌연변이체를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis) 및/또는 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus)를 포함한다.

특정 구현예에서, 대상체에서 스타필로코커스 종에 의한 감염을 예방하고/하거나 스타필로코커스 합병증의 위험이 있는 대상체에서 발생할 수 있는 질환 상태를 개선하기 위한 치료 방법이 제공된다. 본원에 기재된 백신 제제는 구체적으로 스타필로코커스 감염, 특히 피부 감염, 봉와직염, 폐렴, 수막염(meningitis), 요로 감염, 독성 쇼크 증후군, 심내막염, 심막염(pericarditis), 골수염, 균혈증(bacteremia) 또는 패혈증을 포함하는, 항생제 내성 종에 의한 감염과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 백신 제제는 또한 심장 박동기, 인공 심장 판막, 관절 임플란트, 또는 보철물의 이식을 포함하는 수술과 같은 수술 절차 동안 또는 이후에 발생할 수 있는 스타필로코커스 감염 및/또는 스타필로코커스 합병증을 예방하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 보철물은 팔 또는 다리와 같은 보철 사지일 수 있다. 특정 구현예에서, 보철물은 고관절 대체술일 수 있다. 특정 구현예에서, 보철물은 안구 보철물, 실리콘 손, 손가락, 유방, 발, 발가락, 또는 안면 임플란트 와 같지만 이에 제한되지 않는 미용 보철물일 수 있다. 일부 구현예에서, 외과적 절차를 받았거나 받을 예정인 대상체가 치료되고, 여기서 대상체는 스타필로코커스 감염 및/또는 스타필로코커스 합병증이 발병할 위험이 있다.

스타필로코커스 합병증은 구체적으로 스타필로코커스 아우레우스 균혈증 또는 중독과 관련된 것들이다. 대부분의 스타필로코커스 감염은 심각하지 않지만, 에스. 아우레우스는, 예를 들어, 급성 합병증(예: 패혈증, 독성 쇼크 증후군(TSS), 패혈성 쇼크, 성인 호흡 곤란 증후군(adult respiratory distress syndrome), 파종성 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation) 등) 또는 만성(재발 포함) 질환(예: 골수염, 심내막염, 내주 장치의 감염 및 상처 감염)을 포함하여, 혈류 감염, 폐렴, 또는 뼈 및 관절 감염과 같은 심각한 감염을 일으킬 수 있다. 스타필로코커스 아우레우스 감염의 합병증 위험이 있는 환자는 혈액 투석을 받고 있는 환자, 주사 약물 사용자, 당뇨병 환자 및 에스. 아우레우스, 특히 메티실린 내성 에스. 아우레우스의 비강 수송 환자, 및/또는 기존 심장 상태 또는 기타 합병증이 있는 환자를 포함한다.

특정 질환 상태의 "위험이 있는"이라는 용어는, 예를 들어, 특정 소인, 스타필로코커스 박테리아 또는 독소에 대한 노출에 의해 잠재적으로 이러한 질환 상태를 발전시키는 대상체 또는 다양한 단계에서 각각의 질환 상태로 이미 고통받고 있는, 특히 바이러스 감염의 결과로 이어지는 다른 원인성 질환 상태 또는 다른 상태 또는 합병증과 관련이 있는 대상체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "치료"는 항상 예방 목적(즉, 감염 및/또는 질환 상태를 예방하기 위해) 또는 치료 목적(즉, 병인에 관계없이 질환을 치료하기 위해)을 위해 대상체를 치료하는 것을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "예방"은 병인 발병의 예방 또는 병인의 위험을 감소시키기 위한 예방적 조치를 포함하도록 의도된 예방적 조치를 지칭한다.

대상체를 치료하는 것과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "치료"는 질환, 병리학적 상태 또는 장애를 치유, 개선, 안정화, 발병률 감소, 또는 예방하려는 의도를 갖는 대상체의 의학적 관리를 지칭하며, 이는 개별적으로 또는 함께 "질환 상태"로서 이해된다.

본원에 기재된 백신은 구체적으로 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원을 유효량으로 포함하며, 이는 본원에서 구체적으로 "면역학적 유효량"으로 이해된다. "면역학적 유효량"은 단일 투여량으로 또는 일련의 투여량의 일부로서 대상체에게 그 양을 투여하는 것이 치료적 또는 예방적 치료 목적에 기초하여 효과적이라는 것을 의미한다. "예방적 유효량"은 표적 스타필로코커스 박테리아 감염 또는 스타필로코커스 합병증을 예방하거나, 스타필로코커스 박테리아 또는 독소에 의해 직접 또는 간접적으로 유발된 질환을 억제하는 것과 같은 목적하는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 용량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 이 양은 치료받는 대상체의 건강과 신체 상태, 연령, 항체를 합성하는 대상체의 면역계의 능력, 목적하는 면역 반응의 유형 및 정도, 백신의 제형 및 다른 상태에 따라 달라질 것이다.

유효량 또는 용량은 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 성인 인간 대상체에게 투여되는 백신 항원의 0.0001 내지 2mg, 예를 들어, 0.001 내지 2mg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 백신 항원의 유효 용량은, 예를 들어, 면역화 후 1 내지 3개월에 하나 이상의 표적 스타필로코커스 박테리아 또는 독소에 결합하고 중화하는 유효 수준의 항체 역가의 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 효능은 대상체로부터 채취된 혈액 샘플에서 각각의 항체 역가에 의해 검정될 수 있다.

일부 구현예에서, 유효량은 특정 투여 섭생의 일부, 예를 들어, 단일 투여 또는 "부스팅" 섭생에서와 같은 일련의 투여로서 투여되는 경우에 유익한 효과와 상관관계되는 것이다. 치료를 위해, 본원에 기재된 백신은 한 번에 투여될 수 있거나, 개별 성분 및/또는 시간 간격으로 투여되는 다수의 더 적은 투여량으로 분할될 수 있다. 전형적으로, 본원에 기재된 백신의 첫 번째 주사에 의해 대상체를 프라이밍하는 경우, 하나 이상의 부스터 주사는 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 일정 기간 동안 수행될 수 있다. 다수의 주사가 사용되는 경우, 후속 주사는, 예를 들어, 이전 주사의 1 내지 52주 이내에 수행될 수 있다.

본원에 기재된 백신은 면역원성 제형에 해독된 SEB 독소 또는 백신 항원을 포함할 수 있다. 특정 구현예는 하나 이상의 보조제 및/또는 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함한다.

특정 투여 수단을 촉진하는데 적합한 약제학적 담체는 당업계에 익히 공지되어 있다. 특정 구현예는 체액성(B-세포, 항체) 또는 세포독성(T-세포) 면역 반응을 유발하는, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제를 포함하는 면역원성 제형을 지칭한다. 보조제는 구체적으로 백신의 효능을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 보조제는 백신 조성물에 직접 첨가될 수 있거나, 백신 항원의 투여와 동시에 또는 그 직전에 또는 후에 개별적으로 투여될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "보조제"는 구체적으로, 항원과 함께 투여될 때 항원에 대한 면역 반응을 증강시키고/시키거나 재지시되지만, 단독으로 투여되는 경우 항원에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 지칭한다. 보조제는 림프구 동원, B-세포 및/또는 T-세포의 자극 및 대식세포의 자극을 포함하는 여러 메커니즘에 의해 면역 반응을 증강시킬 수 있다.

보조제의 "유효량"은 본원에 기재된 백신에 사용될 수 있으며, 이는 구체적으로, 예를 들어, 면역원성 조성물의 더 낮은 용량 또는 더 적은 용량이 특정 면역 반응 및 박테리아 감염, 중독 또는 질환을 예방하거나 퇴치하는 각각의 효과를 생성하는 데 필요하도록 면역원에 대한 면역학적 반응을 증진시키는 양으로 구체적으로 이해된다.

용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 완충액, 방부제, 상용성 담체 및 임의로 다른 첨가제 또는 캡슐화 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 활성 성분을 방해하지 않는 생물학적 활성의 하나 이상의 비독성 물질의 효과를 나타낸다. 용어 "담체"는 적용을 용이하게 하기 위해 담체와 조합된 천연 또는 합성 유기 또는 무기 성분 및 활성 성분을 나타낸다. 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 본 발명에 의해 제공된 항체 또는 관련 조성물 또는 조합과 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 적합한 용매, 분산 배지, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 특정 예는 멸균수, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 등 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용되는 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd revised edition (Allen Jr, LV, ed., Pharmaceutical Press, 2012)]에 기재되어 있다. 액체 제형은 용액, 에멀젼 또는 현탁액일 수 있고, 현탁제, 가용화제, 계면활성제, 방부제 및 킬레이트화제와 같은 부형제를 포함할 수 있다. 예시적인 담체는 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드 및 CRM₁₉₇로부터 선택되는 것과 같은 담체 단백질, 또는 리포좀 또는 양이온성 펩티드이고; 예시적인 보조제는 명반, 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄, MF59 또는 CpG 올리고뉴클레오티드이다. 추가의 보조제는 (불)완전 프로인트의 보조제, 비. 퍼투시스(B. pertussis) 또는 이의 독소, 또는 IC31을 포함한다.

바람직한 제제는 적어도 1년 또는 2년의 저장 수명을 갖는 즉시 사용 가능한 저장 안정성 형태이다. 본 발명은 또한 전달 장치, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 백신이 미리 충전된 주사기를 제공한다.

본원에 기재된 백신은 백신 분야에 공지된 통상적인 경로에 의해, 예를 들어, 점막(예: 안구, 비강내, 폐, 경구, 위, 장, 직장, 질, 또는 요로) 표면에, 비경구(예: 피하, 피내, 근육내, 정맥내, 또는 복강내) 경로를 통해, 또는 국소 투여(예: 패치를 통해)로 투여될 수 있다. 투여 경로의 선택은 폴리펩티드와 관련된 보조제와 같은 다수의 파라미터에 의존한다. 점막 보조제가 사용되는 경우, 비강내, 경구 또는 흡입 경로가 바람직하다. 지질 제형 또는 알루미늄 화합물이 사용되는 경우, 비경구 경로가 바람직하고, 피하 또는 근육내 경로가 가장 바람직하다.

주사 가능한 제제는 피하, 피내 및 근육내 주사 등을 위한 투여 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사 가능한 제제는 공개적으로 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 주사 가능한 제제는, 예를 들어, 주사에 통상적으로 사용되는 멸균 수성 배지 또는 유성 배지에 단백질을 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 생산될 수 있다. 주사를 위한 수성 배지로서, 예를 들어, 생리 식염수, 글루코스 및 기타 보조제를 함유하는 등장성 용액 등이 있고, 이는 적합한 가용화제, 예를 들어, 알코올(예: 에탄올), 폴리알코올(예: 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소화된 피마자유의 폴리옥시에틸렌(50mol) 부가물) 등과 조합하여 사용될 수 있다. 유성 배지로서, 예를 들어, 참기름, 대두유 등이 사용되고, 이는 가용화제, 예를 들어, 벤질 벤조에이트, 벤질 알콜 등과 조합하여 사용될 수 있다. 이렇게 생산된 주사제는 바람직하게는 적절한 앰플에 충전된다.

상기 설명은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 본 발명의 하나 이상의 구현예를 실시하는 방법을 대표하는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 판독되어서는 안 된다.

실시예

실시예 1: SEB 돌연 변이체 , 백신 항원 및 제제의 생산

SEB 독소 유전자는 에스. 아우레우스(ATCC 14458, 독소 서열 서열번호 1; 뉴클레오티드 서열 서열번호 2)로부터 단리되었고, 그의 독성 특성이 손실되도록 유전적으로 변형된다. 면역글로불린 슈퍼패밀리 및 T-세포 수용체에 대한 결합 부위를 결정하는 특정 아미노산은 SEB 단백질이 어느 수용체에도 결합할 수 없도록 DNA 수준에서 변경되었고, 그의 독성 특성이 손실된다.

TCR 결합 부위의 돌연변이유발은 아미노산 22-24의 결실에 의해 수행된다. 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 영역은 아미노산 45를 류신에서 아르기닌으로 교환함으로써 돌연변이된다. SEB 단일 및 이중 돌연변이체를 야생형과 비교했다. 각각의 서열은 도 1에 제공되어 있다.

SEB 야생형 및 그의 돌연변이체는 pET-9d 플라스미드(Novagen)를 사용하여 이. 콜라이 BL21-AI(Invitrogen)에서 발현되었으며, 야생형 SEB와 비교하여 면역원성 및 독성의 결여에 대해 시험되었다. 재조합 단백질은 크로마토그래피로 정제되었고 백신으로서 Al(OH)₃으로 제형화되었다.

1428 뉴클레오티드의 코딩 서열을 초래하는 탠덤 반복 작제물을 생산하여 백신 항원으로 사용되는 재조합 해독된 SEB 탠덤 변이체를 발현시켰다.

SEB의 돌연변이

a) 서열번호 1에서 aa22-24의 결실

9개의 뉴클레오티드의 결실은 목적하는 결실의 역방향 프라이머 결합 업스트림 및 결실의 정방향 프라이머 결합 다운스트림을 사용하여 수행되었다. 2개의 상이한 PCR 반응에서 야생형 DNA를 DNA의 5'-말단에서 결실까지 및 결실에서 3'-말단까지 증폭시켰다. 두 단편을 결찰시켰고, 최종 PCR에서 결실 돌연변이체가 증폭되었다.

생성되는 뉴클레오티드 서열은 단백질 서열 서열번호 3을 인코딩하는 서열번호 4로서 동정된다.

b) 서열번호 1에서 L45R 돌연변이

점 돌연변이 L45R은 코돈 CTA가 AGA로 돌연변이된 내부 역방향 프라이머를 사용하여 생성되었다. 2개의 상이한 PCR 반응에서, 야생형 DNA는 DNA의 5'-말단에서 점 돌연변이까지 및 돌연변이를 넘어 3'-말단까지 증폭되었다. 두 단편을 결찰시켰고, 최종 PCR에서 결실 돌연변이체가 증폭되었다.

생성되는 뉴클레오티드 서열은 단백질 서열 서열번호 16을 인코딩하는 서열번호 15로서 동정된다.

c) 이중 돌연변이체 및 탠덤 돌연변이체: SEB del 22-24 + L45R(SEB del22-24 L45R로서 지칭되기도 함)

다음과 같은 이중 및 탠덤 돌연변이체가 따라서 생산되었다.

SEB del 22-24, L45R

SEB del 22-24, Q43P

SEB del22-24, F44P

SEB del22-24, F44S

다양한 링커 서열을 사용하는 탠덤 SEB del22-24, L45R

탠덤 이중 돌연변이체에서, 2개의 이중 돌연변이체 분자가 링커 서열을 사용하여 융합된다. 예시적인 작제물은 탠덤 반복체 사이에 2개의 아미노산(Lys-Leu)의 링커를 포함하는 서열번호 13을 인코딩한다.

SEB 이중 돌연변이체(del 22-24 및 L45R)의 하기 탠덤 반복 작제물은 각각 rSEB 변이체 백신으로 지칭되는 상이한 링커 서열을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 생성되었다. 작제물 1은 GGG 링커를 포함하고, 작제물 2-4는 각각 His, Met, Lys, Leu, Gly 및 Thr로부터 선택된 2개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 포함한다. 서열은 도 1에 제공된다.

실시예 2: 안전성

독성은 다음 표준 검정에 의해 결정되었다:

a) 3H-티미딘 혼입에 의해 검출된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서의 T-세포 증식.

b) T-세포 활성화 및 그 결과 투여량 의존적 IL-2 사이토카인 방출; 및

c) 인간 PBMC에서의 염증 반응; 투여량 의존적 IL-6 방출 및 TNF α 방출의 검출.

결과는 도 2-6 및 도 10-11에 제공된다. 돌연변이체 SEB del 22-24 및 SEB del 22-24 L45R은 SEB 야생형 독소와 비교하여 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 T-세포 증식을 크게 감소시킨다. 이중 돌연변이체 변이체 SEB del 22-24 L45R 및 SEB del 22-24는 모두 고농도에서조차 T-세포를 활성화시키지 않으며, Il-2 사이토카인 방출은 비자극된 세포와 비교하여 증가되지 않는다. 인간 PBMC에서 IL-6 방출과 TNF α 방출은 투여량 의존적이었고, SEB del 22-24 돌연변이에 의해 크게 감소되었다. 도 4-6은 SEB del L45R과 비교하여 SEB del 22-24의 개선된 독성 프로파일을 나타낸다.

SEB del 22-24 L45R은 최대 10μg/ml의 인간 PBMC에서 T-세포의 활성화를 나타내지 않았으며 IL-2 유전자 활성화도 나타내지 않았다. 래빗에 볼러스 주사로서 투여되었을 때 독성의 징후는 검출되지 않았다.

융합 작제물 1-4 각각은 시험관내 및 생체내 독성 시험에 의해 입증된 바와 같이 비독성이었다: 4개의 작제물 중 어느 것도 최대 10μg/ml의 인간 PBMC의 T-세포 활성화를 유도하지 않았다. 모든 탠덤 작제물은 IL-2 유전자 활성화 및 IL-2 방출을 유도하지 않았으며 전염증성 사이토카인(IFN 감마, IL-6, TNF 알파) 유전자 활성화 또는 분비도 유도하지 않았다. 래빗에 대한 볼루스 주사로서 또는 마우스에 대한 높은 투여량으로서 투여되었을 때 독성의 징후는 검출되지 않았다.

실시예 3: 마우스 및 래빗에서 면역원성 및 보호

래빗은 보조제로서 1mg의 AL(OH)₃을 사용하여 10㎍, 30㎍ 또는 100㎍의 rSEB 변이체 작제물 1 내지 4로 4회 면역화하였다. 혈청을 ELISA로 분석하였고 중화 항체를 중화 검정(래빗 항혈청에 의한 T-세포 활성화의 억제)에 의해 결정하였다.

보호성 면역은 면역화의 래빗 모델에서 유도되었다. 항혈청을 생산하고 표준 검정을 사용하여 보호성에 대해 시험하였다.

결과는 도 7-9에 제시되어 있다.

결합 역가 및 중화 역가는 SEB del 22-24 L45R로 달성되었다. SEB del 22-24 L45R의 면역원성은 시험된 탠덤 반복 작제물 1-4(rSEB 변이체 작제물) 모두에 의해 더욱 개선되었다. 작제물 3은 최상의 결과를 나타냈다.

도 12는 100㎍의 탠덤 SEB del 22-24 L45R 작제물 + 1mg의 AL(OH)₃으로 면역화 후의 ELISA 역가(평균 n = 8)를 나타낸다.

보호는 30㎍ 및 100㎍ SEB 독소로 도전된 3회 또는 4회 면역화 후 SEB del 22-24 L45R 및 rSEB 변이체 작제물로 달성되었다.

마우스 및 래빗에서 보호성 면역

마우스는 rSEB 변이체 작제물의 다양한 투여량(1㎍ 내지 30㎍)으로 2회 또는 3회 면역화되었다. 마지막 면역화 2주 후에, 마우스를 20㎍의 SEB 독소로 도전하였고, 4시간 후에 40㎍의 LPS로 도전했다. 도전된 마우스는 모두 생존하였다(표 3 및 4 참조).

[표 3]

[표 4]

보호는 마우스에서 2회 및 3회 면역화 후 및 SEB 독소와 LPS로 도전된 래빗에서 3회 면역화 후, rSEB 변이체 작제물로 입증되었다. 래빗은 30㎍의 rSEB 변이체 작제물 3 + 1mg AL(OH)₃으로 면역화되었다. 마지막 면역화 10일 후, 래빗은 30㎍의 SEB 독소로 도전되었고, 4시간 후에 10㎍의 LPS로 도전되었다. 세 마리의 래빗은 모두 도전에서 생존하였다.

실시예 4: aa22 -24의 결실을 포함한 rSEB의 개선된 내약성

독성: 다음 중 하나로 자극된 인간 PMNC의 증식 비교:

wtSEB(네이티브 SEB),

SEB N23L L45R Y91P Q210L

SEB del 22-24

SEB del22-24 L45R Y91P Q210L.

도 13을 참조한다.

돌연변이체 SEB del22-24 L45R Y91P Q210L은 아미노산 22-24의 임의의 결실이 없는 사중 점 돌연변이 SEB N23L L45R Y91P Q210L과 비교하여 감소된 독성을 나타낸다. 결실 돌연변이체 del22-24는 SEB del22-24 L45R Y91P Q210L에 필적하는 독성을 나타내며 사중 점 돌연변이체 SEB N23L L45R Y91P Q210L보다 낮은 독성을 나타낸다.

논의: 아미노산 21-25, 이 실시예에서 aa22-24 내의 결실을 포함하는 SEB 돌연변이체는 N23L의 치환과 비교하여 내약성을 개선시켰다. 이러한 효과는 위치 45, 91 및 210에서 MHC 클래스 II 수용체 결합 영역 내의 추가 점 돌연변이와 독립적이다.

SEQUENCE LISTING <110> Biomedizinische Forschung & Bio-Produkte AG <120> PROTECTIVE STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B VACCINE <130> BB001P <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 239 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Lys 1 5 10 15 Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His 20 25 30 Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Leu Tyr Phe Asp 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val 50 55 60 Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys 65 70 75 80 Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser 85 90 95 Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg Lys Thr 100 105 110 Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln Leu Asp Lys 115 120 125 Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu Leu 130 135 140 Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu 145 150 155 160 Asp Tyr Leu Thr 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tcagcaataa acgttaaatc tatagatcaa 120 ccgctatact ttgacttaat atattctatt aaggacacta agttagggaa ttatgataat 180 gttcgagtcg aatttaaaaa caaagattta gctgataaat acaaagataa atacgtagat 240 gtgtttggag ctaattatta ttatcaatgt tatttttcta aaaaaacgaa tgatattaat 300 tcgcatcaaa ctgacaaacg aaaaacttgt atgtatggtg gtgtaactga gcataatgga 360 aaccaattag ataaatatag aagtattact gttcgggtat ttgaagatgg taaaaattta 420 ttatcttttg acgtacaaac taataagaaa aaggtgactg ctcaagaatt agattaccta 480 actcgtcact atttggtgaa aaataaaaaa ctctatgaat ttaacaactc gccttatgaa 540 acgggatata ttaaatttat agaaaatgag aatagctttt ggtatgacat gatgcctgca 600 ccaggagata aatttgacca atctaaatat ttaatgatgt acaatgacaa taaaatggtt 660 gattctaaag atgtgaagat tgaagtttat cttacgacaa agaaaaag 708 <210> 11 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant SEB <400> 11 Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Lys 1 5 10 15 Phe Thr Gly Leu Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His Val Ser Ala 20 25 30 Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Ser Leu 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SEB <400> 12 gagagtcaac cagatcctaa accagatgag ttgcacaaat cgagtaaatt cactggtttg 60 atgaaagttt tgtatgatga taatcatgta tcagcaataa acgttaaatc tatagatcaa 120 agcctatact ttgacttaat atattctatt aaggacacta agttagggaa ttatgataat 180 gttcgagtcg aatttaaaaa caaagattta gctgataaat acaaagataa atacgtagat 240 gtgtttggag ctaattatta ttatcaatgt tatttttcta aaaaaacgaa tgatattaat 300 tcgcatcaaa ctgacaaacg aaaaacttgt atgtatggtg gtgtaactga gcataatgga 360 aaccaattag ataaatatag aagtattact gttcgggtat ttgaagatgg taaaaattta 420 ttatcttttg acgtacaaac taataagaaa aaggtgactg ctcaagaatt agattaccta 480 actcgtcact atttggtgaa aaataaaaaa ctctatgaat ttaacaactc gccttatgaa 540 acgggatata ttaaatttat agaaaatgag aatagctttt ggtatgacat gatgcctgca 600 ccaggagata aatttgacca atctaaatat ttaatgatgt acaatgacaa taaaatggtt 660 gattctaaag atgtgaagat tgaagtttat cttacgacaa agaaaaag 708 <210> 13 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant SEB <400> 13 Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Lys 1 5 10 15 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Ala Pro Gly Asp Lys Phe Asp Gln Ser 435 440 445 Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp Ser Lys Asp 450 455 460 Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 465 470 475 <210> 36 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant SEB <400> 36 gagagtcaac cagatcctaa accagatgag ttgcacaaat cgagtaaatt caccggtttg 60 atgaaagttt tgtatgatga taatcatgta tcagcaataa acgttaaatc tatagatcaa 120 tttagatact ttgacttaat atattctatt aaggacacta agttagggaa ttatgataat 180 gttcgagtcg aatttaaaaa caaagattta gctgataaat acaaagataa atacgtagat 240 gtgtttggag ctaattatta ttatcaatgt tatttttcta aaaaaacgaa tgatattaat 300 tcgcatcaaa ctgacaaacg aaaaacttgt atgtatggtg gtgtaactga gcataatgga 360 aaccaattag ataaatatag aagtattact gttcgggtat ttgaagatgg taaaaattta 420 ttatcttttg acgtacaaac taataagaaa aaggtgactg ctcaagaatt agattaccta 480 actcgtcact atttggtgaa aaataaaaaa ctctatgaat ttaacaactc gccttatgaa 540 acgggatata ttaaatttat agaaaatgag aatagctttt ggtatgacat gatgcctgca 600 ccaggagata aatttgacca atctaaatat ttaatgatgt acaatgacaa taaaatggtt 660 gattctaaag atgtgaagat tgaagtttat cttacgacaa agaaaaaggg cggtggatcc 720 gagagtcaac cagatcctaa accagatgag ttgcacaaat cgagtaaatt cactggtttg 780 atgaaagttt tgtatgatga taatcatgta tcagcaataa acgttaaatc tatagatcaa 840 tttagatact ttgacttaat atattctatt aaggacacta agttagggaa ttatgataat 900 gttcgagtcg aatttaaaaa caaagattta gctgataaat acaaagataa atacgtagat 960 gtgtttggag ctaattatta ttatcaatgt tatttttcta aaaaaacgaa tgatattaat 1020 tcgcatcaaa ctgacaaacg aaaaacttgt atgtatggtg gtgtaactga gcataatgga 1080 aaccaattag ataaatatag aagtattact gttcgggtat ttgaagatgg taaaaattta 1140 ttatcttttg acgtacaaac taataagaaa aaggtgactg ctcaagaatt agattaccta 1200 actcgtcact atttggtgaa aaataaaaaa ctctatgaat ttaacaactc gccttatgaa 1260 acgggatata ttaaatttat agaaaatgag aatagctttt ggtatgacat gatgcctgca 1320 ccaggagata aatttgacca atctaaatat ttaatgatgt acaatgacaa taaaatggtt 1380 gattctaaag atgtgaagat tgaagtttat cttacgacaa agaaaaag 1428 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Binding region <400> 37 Met Glu Asn Met Lys 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binding region <400> 38 Asp Gln Phe Leu Tyr Phe 1 5

Claims

스타필로코커스 외독소 B(Staphylococcal Exotoxin B; SEB) 독소 서열 서열번호 1의 아미노산 위치 21 내지 25에 적어도 2개의 점 돌연변이(point mutation)를 포함하도록 돌연변이된 해독된 SEB 독소로서, 상기 적어도 2개의 점 돌연변이가 aa21-22, aa22-23, aa23-24, aa24-25, aa21-23, aa22-24 또는 aa23-25 중 어느 하나의 결실, 또는 서열번호 1과 적어도 95% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 임의의 다른 천연 SEB 독소 서열에서 상응하는 아미노선 위치에서의 결실을 포함하는, 해독된 스타필로코커스 외독소 B(SEB) 독소.
제1항에 있어서, aa22-24의 결실에서 서열번호 1과 상이한 서열번호 3, 또는 aa22-24의 상기 결실, 및 서열번호 3에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 이의 해독된 SEB 변이체를 포함하거나 이로 이루어진, 해독된 SEB 독소.
제1항 또는 제2항에 있어서, L45, Q43, 또는 F44, 바람직하게는 L45R, Q43P, F44P, 또는 F44S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 하나 이상의 추가 점 돌연변이를 포함하고, 바람직하게는 상기 해독된 SEB 독소가 서열번호 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나, 또는 아미노산 위치 21 내지 25에 상기 적어도 2개의 점 돌연변이 및 전술한 것 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 전술한 것 중 어느 하나의 해독된 SEB 변이체 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 해독된 SEB 독소.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 해독된 SEB 독소의 적어도 하나의 분자를, 바람직하게는 상기 해독된 SEB 독소 분자와 동일하거나 상이한 스타필로코커스 백신 항원과 조합하여 포함하는 보호성 백신 항원으로서, 임의로 상기 조합이 서로 결합되고/되거나 담체에 결합되어 복합체를 형성하는 상기 분자 및 항원을 포함하는 융합체(fusion), 혼합물 또는 복합체(complex)로서 제공되는, 보호성 백신 항원.
제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 해독된 SEB 독소 분자가 다른 해독된 SEB 독소 분자에 융합되고, 임의로 링커 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 13, 31, 33 또는 35 중 어느 하나, 또는 아미노산 위치 21 내지 25에 상기 점 돌연변이 및 전술한 것 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 전술한 것 중 어느 하나의 백신 항원 변이체 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 백신 항원.
제4항 또는 제5항의 항원, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 바람직하게는 보조제(adjuvant)를 포함하는, 보호성 백신 제제.
제6항에 있어서, 상기 보조제가 불용성 금속 염, 글루코피라노실 지질 A 보조제, 선천적 면역의 자극제인 보조제 시스템, 예를 들어 AS01, AS03, 또는 AS04, MF59, TCR 자극제, 예를 들어, 톨-유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist) 또는 CpG 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 명반(alum), 수산화알루미늄, 또는 인산알루미늄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 백신 제제.
제6항 또는 제7항에 있어서, 근육내, 피하, 비강내, 점막, 경구, 미세바늘 피부(microneedle skin), 경피, 설하, 에어로졸 또는 흡입 투여용 제형으로 제공되는, 백신 제제.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 TSST-1, α-헤몰리신(alpha-hemolysin), γ-헤몰리신, β-헤몰리신, 및 스타필로코커스 외독소 또는 엔테로톡신, 예를 들어, 엔테로톡신 A(SEA), C(SEC), I(SEI) 및 K(SEK)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 스타필로코커스 초항원 톡소이드 항원과 조합하여 상기 백신 항원을 포함하는 다가 백신인, 백신 제제.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 스타필로코커스 초항원 발현 박테리아 감염 및/또는 스타필로코커스 초항원 독소에 노출됨으로써 직접 또는 간접적으로 매개되는 질환 상태의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 백신 제제.
제10항에 있어서, 질환의 수술적 개입(surgical intervention) 또는 침습적 치료(invasive treatment) 후에 스타필로코커스 합병증의 위험이 있는 환자가 백신 제제로 면역화되고, 바람직하게는 상기 질환 상태가 그램 양성 박테리아, 바이러스 또는 진균성 병원체의 미생물 매개체, 또는 독소에 의해 유도된 패혈증 상태(sepsis condition)이고, 바람직하게는, 상기 패혈증 상태가 패혈증, 독성 쇼크 증후군(toxic shock syndrome; TSS) 또는 패혈성 쇼크(septic shock)인, 백신 제제.
a) 백신 제제를 생산하거나,
b) SEB 독소를 특이적으로 인식하는 항체를 생산하는 방법에서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 해독된 SEB 독소 또는 제4항 또는 제5항의 백신 항원의 용도.
재조합 숙주 세포(recombinant host cell)에서 각각의 독소 또는 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키고, 각각의 독소 또는 항원을 단리시키고 임의로 정제함으로써, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 해독된 SEB 독소 또는 제4항 또는 제5항의 백신 항원을 생산하는 방법.
바람직하게는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, 34 또는 36 중 어느 하나, 또는 전술한 것 중 어느 하나의 코돈 최적화 변이체(codon-optimized variant)를 포함하거나 이로 이루어지는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 해독된 SEB 독소 또는 제4항 또는 제5항의 백신 항원을 인코딩하는 핵산 분자.
발현 작제물(expression construct)에 제14항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포.