CN106794236B - A群链球菌疫苗 - Google Patents

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Abstract

提供在哺乳动物中引发对A群链球菌细菌的免疫应答的方法和组合物，其包括向所述哺乳动物施用M蛋白的片段，其变体或衍生物以及SpyCEP蛋白或肽片段，或者针对所述SpyCEP蛋白或片段的抗体，以促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性。还提供了SpyCEP的免疫优势肽片段。

Description

A群链球菌疫苗
技术领域
本发明涉及感染性疾病的预防和治疗。更具体而言，本发明涉及用于治疗或预防A群链球菌属链球菌相关的疾病和病况的疫苗。
发明背景
由于由酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(兰斯菲尔德A群链球菌；GAS)引起的衰弱性疾病，特别是风湿热和风湿性心脏病，长期以来一直寻求针对所述细菌的疫苗。现今，在大多数发达国家中，风湿热是一种罕见疾病，但是在发展中国家，其仍是儿童、青少年和青壮年中后天性心脏病的主要原因。此外，侵入性GAS疾病是儿童和成人中的脓毒病的常见原因且病死率高。进一步增加GAS疾病的负担的是链球菌感染后肾小球肾炎，其可能导致许多GAS流行地区的高晚期肾衰竭率。GAS咽炎和脓疱病是每年最大绝对数量的GAS感染。每年，GAS咽炎影响大约8％–15％的学龄儿童，以及GAS脓疱病是儿童中十分常见的感染，患病率为10-50％。严重的GAS相关疾病不仅是发展中国家的问题，而且甚至是发达国家的问题，具体地，已出现了有毒的GAS菌株，其对标准的抗生素疗法具有抗性且引起衰弱性疾病，如严重的坏死性筋膜炎。
GAS的重要毒力因子是M蛋白，其强烈地抗吞噬且与血清H因子结合，破坏C3-转化酶并通过C3b阻止调理作用。已开发出了含有来自M蛋白的保守C重复部分的免疫原性肽，如来自C重复区域的T细胞和B细胞表位的疫苗，或者含有来自该C重复区域的单一最小的B细胞表位的J8和J14肽疫苗。
发明概述
意外地，本发明的发明人发现，J8-肽诱导的对A群链球菌的免疫的重要因素是嗜中性粒细胞的活性。虽然体外的调理作用分析使用全血作为嗜中性粒细胞和补体的来源，但是体内保护需要嗜中性粒细胞是未知的。而且，调理作用分析显示了CFU的相对适度减少(通常少于10倍)，而J8在体内诱导的保护可以导致细菌生物负载的数个对数级的减少。更具体而言，目前，发明人发现，嗜中性粒细胞抑制剂(如使嗜中性粒细胞趋化性物质白介素8失活的SpyCEP)在诱导对A群链球菌的免疫方面针对J8起作用。
以广泛的形式来说，本发明因而涉及恢复或增强嗜中性粒细胞的活性，从而帮助M蛋白诱导的对A群链球菌的免疫。
本发明的一个方面提供在哺乳动物中引发对A群链球菌细菌的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物施用M蛋白的片段、其变体或衍生物；以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质；从而在哺乳动物中引发对A群链球菌细菌的免疫应答的步骤。
本发明的另一方面提供使哺乳动物对A群链球菌细菌免疫的方法，所述方法包括向哺乳动物施用M蛋白，其片段、变体或衍生物；以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质，从而使哺乳动物对A群链球菌细菌免疫的步骤。
而本发明的另一方面提供治疗或预防哺乳动物中的A群链球菌细菌感染的方法，所述方法包括向哺乳动物施用M蛋白的片段，其变体或衍生物，或者它们的抗体或抗体片段；以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质；从而治疗或预防哺乳动物中的A群链球菌细菌感染的步骤。
本发明的又一方面提供适合于向哺乳动物施用的组合物，所述组合物包含：M蛋白的片段、其变体或衍生物，或者它们的抗体或抗体片段；以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质。
本发明的相关方面提供编码M蛋白的片段、其变体或衍生物以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质的一种或多种分离的核酸的施用，或者包含所述一种或多种分离的核酸的组合物的施用。
在具体实施方案中，M蛋白的片段是M蛋白的保守区域或者包含M蛋白的保守区域。在一个实施方案中，所述片段是包含p145肽的免疫原性片段，或者包含于p145肽内的免疫原性片段。在具体实施方案中，免疫原性片段在J8肽或其变体内，或者包含J8肽或其变体。在某些实施方案中，所述变体包含选自以下的氨基酸序列或者其片段或变体，基本上由选自以下的氨基酸序列或者其片段或变体组成，由选自以下的氨基酸序列或者其片段或变体组成：SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQ ID NO:59)；SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQ ID NO:60)；SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:61)；以及SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:62)。
在一个宽泛的实施方案中，促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是通常直接或间接地抑制或阻抑嗜中性粒细胞或嗜中性粒细胞活性的蛋白或其片段。适当地，所述蛋白或其片段的施用引发对所述蛋白和/或对A群链球菌的免疫应答。
在另一宽泛的实施方案中，促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是与通常直接或间接地抑制或阻抑嗜中性粒细胞或嗜中性粒细胞活性的蛋白或其片段结合的抗体或抗体片段。
在具体实施方案中，所述蛋白是SpyCEP或其片段。
在优选的实施方案中，所述片段包含氨基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ IDNO:18)。
本发明的另一其它方面提供分离的肽，其包含选自以下的氨基酸序列或者其片段或变体，基本上由选自以下的氨基酸序列或者其片段或变体组成，由选自以下的氨基酸序列或者其片段或变体组成：NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)；SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQ ID NO:59)；SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQ IDNO:60)；SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:61)；以及SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:62)。
相关方面提供编码上述方面的分离的肽的分离的核酸，包含所述分离的核酸的遗传构建体和/或包含所述遗传构建体的宿主细胞。
又一相关方面提供抗体或抗体片段，其与上述方面的分离的肽结合，或者由上述方面的分离的肽诱发。
本发明的又一方面提供包含前面方面的分离的肽、分离的核酸、遗传构建体、宿主细胞和/或抗体或抗体片段的组合物。
本文使用的不定冠词‘一个/一种(a)’和‘一个/一种(an)’在此用来指或者涵盖单数或复数的元素或特征，并且不应当被认为意指或限定“一个/一种(one)”或“单个/单种(single)”元素或特征。
除非上下文另有要求，术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”或者类似的术语旨在意指非排他性的包含，以使元素或特征的所述列表不仅仅包括那些规定或列出的元素，而且可以包括未列出或规定的其它元素或特征。
在氨基酸序列的背景中，通过“基本上由…组成”，意指所叙述的氨基酸序列以及位于N-端或C-端的另外一个、两个或三个氨基酸。
附图简述
图1：J8-DT/Alum疫苗接种的保护功效。
图2：J8-DT介导的免疫中的嗜中性粒细胞。E：表皮；D：真皮；SC：皮下层(sub-cutlayer)
图3：嗜中性粒细胞的耗竭和J8-DT疫苗接种的功效。
图4：CovR/S突变体GAS的M1T1分离物中升高的基因表达的概览。
图5：J8-DT保护免受5448AP的功效。
图6：不同GAS菌株对IL-8的降解。
图7：不同GAS菌株对MIP-2的降解。
图8：不同GAS菌株对KC的降解。
图9：不同GAS分离物对趋化因子的趋化能力的影响。
图10：通过用J8-DT-rSpyCEP/Alum进行免疫，保护免受GAS5448AP菌株。
图11：如通过抗原特异性IgG的产生所测量的J8-DT-SpyCEP的免疫原性。
图12：rSpyCEP抗血清对SpyCEP的IL-8降解活性的抑制。
图13：横跨SpyCEP的残基35-587的重叠的20聚体肽(10个氨基酸重叠)(降序排列的SEQ ID NO:1-55)的表位作图。加粗的肽是通过表位作图选择的肽。
图14：抗重组SpyCEP的抗血清与各肽表位的反应性。使用肽阵列进行SpyCEP的B-细胞表位作图(553个氨基酸)。用rSpyCEP抗血清探测如图13中所示的有10个氨基酸重叠的20聚体肽。
图15：与抗重组SpyCEP的抗血清显示强反应性的六(6)个表位的鉴定。S1＝SEQ IDNO:15；S2＝SEQ ID NO:18；S3＝SEQ ID NO:19；S4＝SEQ ID NO:24；S5＝SEQ ID NO:30；以及S6＝SEQ ID NO:54。
图16：免疫原性以及SpyCEP表位的抗血清对亲本肽的识别。
图17：SpyCEP表位的抗血清对IL-8降解的抑制。
图18：针对自体肽的鼠α-p145-DT和α-J8-DT的滴度以及交叉识别ELISA。
图19：针对自体肽的鼠α-J8i变体-DT的滴度。
图20：交叉识别ELISA。
图21：recSpyCEP中的免疫优势表位的鉴定。为了鉴定recSpyCEP中的免疫优势表位，进行肽抑制ELISA。在第0天，第21天和第28天，用SpyCEP表位-DT缀合物或SpyCEP对BALB/c小鼠(4-6周)组进行皮下免疫。最后刺激之后一周，经下颌出血使小鼠流血，并且收集抗血清。将表位抗血清与5μg/ml或0.5μg/ml浓度的自体肽孵育，并评估自体肽识别的抑制(A)。还将肽抗血清与5μg/ml或0.5μg/ml浓度的SpyCEP孵育。然后将血清用于针对固定化肽的ELISA(B)。最后，将SpyCEP抗血清与5μg/ml或0.5μg/ml浓度的各肽(S1-S6)或者与recSpyCEP孵育，并且评估其与各对应的肽或SpyCEP的结合(C)。各柱的数据是平均值±SEM。使用双因素方差分析，用Bonferroni的多重比较检验进行统计分析，以确定组间的显著性。*p<0.05和**p<0.01，***p<0.001。ns是p<0.05。
图22：SpyCEP和SpyCEP表位的抗血清与不同GAS菌株的结合功效。为了测定recSpyCEP或SpyCEP表位抗血清对不同GAS菌株的特异性，进行流式细胞术。分析通过FITC缀合的IgG测量了与SpyCEP抗血清相比表位抗血清(S1-S6)的结合。显示了5448和其动物传代的衍生物(A)，BSA10和其动物传代的衍生物(B)以及咽喉分离物(pM1)和皮肤分离物(88/30)的结合(C)。各柱的数据是平均值±SEM。使用双尾t-检验进行统计分析以确定与PBS对照相比的显著性。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
图23：J8-DT+S2-DT保护免受GAS的保护功效。在第0天、第21天和第28天，用J8-DT、J8-DT+SpyCEP、J8-DT+S2-DT、SpyCEP或PBS制剂对BALB/c小鼠(4-6周)组进行皮下免疫。在最后的刺激之后两周，用GAS 5448AP经皮肤感染途径感染小鼠(A和B)。在感染后第6天，处死5只小鼠/组，并且收集样本以测定皮肤(A)和血液(B)中的GAS生物负载。数据代表两次或更多次的独立实验，并且结果显示为各组中4-5只小鼠的平均值±SD。使用双因素方差分析来确定疫苗接种组和对照组之间的显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。ns是p<0.05。
图24：J8-DT+S2-DT保护免受GAS的保护功效。在第0天、第21天和第28天，用J8-DT、J8-DT+SpyCEP、J8-DT+S2-DT、SpyCEP或PBS制剂对BALB/c小鼠(4-6周)组进行皮下免疫。在最后的刺激之后两周，用GAS NS22.8经皮肤感染途径感染小鼠(A、B和C)。在感染后第3天和第6天，处死5只小鼠/组，并且收集样本以测定皮肤(A)、血液(B)和脾脏(C)中的GAS生物负载。结果显示为各组中4-5只小鼠的平均值±SD。使用双因素方差分析来确定免疫接种组和对照组之间的显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。ns是p<0.05。
发明详述
本发明至少部分基于这样的发现：嗜中性粒细胞的活性对于用J8肽进行针对A群链球菌的成功免疫是重要的。更具体而言，已经意识到，A群链球菌的某些蛋白酶(如SpyCEP)通过使嗜中性粒细胞趋化性物质白介素8蛋白水解失活来发挥对嗜中性粒细胞的有害或抑制作用。因此提出，通过用J8肽或其它M蛋白的片段，以及SpyCEP进行免疫，将引起对SpyCEP的免疫应答，其至少部分减弱SpyCEP使白介素8失活从而抑制嗜中性粒细胞的应答的能力。因此，这将协同地增强J8免疫的免疫效果。在相关实施方案中，可以治疗性地施用抗SpyCEP抗体，从而引发对J8肽的增强的免疫应答。而且，已鉴定出SpyCEP的免疫优势表位。在具体的形式中，本发明可以适合于治疗或预防由A群链球菌的特别毒的菌株或分离物导致的感染，所述A群链球菌的特别毒的菌株或分离物对用于A群链球菌感染的典型的抗生素治疗具有抗性。这些菌株或分离物通常引起皮肤的严重感染(例如坏死性筋膜炎)，并且在某些情况下可能含有CovR/SCovR/S突变。
因此，本发明的某些方面涉及向哺乳动物施用M蛋白的片段、其变体或衍生物以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质，从而在哺乳动物中引发免疫应答。
出于本发明的目的，“分离的”意指已从其天然状态移出或以其它方式进行人工操作的材料。分离的材料可以大体上或基本上不含其天然状态中通常伴有的组分，或者可以进行操作以使其与其天然状态中通常伴有的组分一同处于人工状态下。分离的材料可以是天然的、化学合成的或重组的形式。
如在本领域众所周知的，“蛋白”意指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或非天然的氨基酸、D-氨基酸或L-氨基酸。
术语“蛋白”包括且涵盖“肽”和“多肽”，所述“肽”通常用于描述具有不超过五十(50)个氨基酸的蛋白，所述“多肽”通常用于描述具有超过五十(50)个氨基酸的蛋白。
“片段”是蛋白(如M蛋白、p145、J14或J8或SpyCEP或者SpyCEP的肽或表位)的区段、结构域、部分或区域，其由少于所述蛋白的100％的氨基酸序列组成。将理解，所述片段可以是单个片段或者可以单独重复或与其它片段一起重复。
通常，片段可以包含全长蛋白的多至5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600个氨基酸，基本上由全长蛋白的多至5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600个氨基酸组成或者由全长蛋白的多至5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600个氨基酸组成。
适当地，所述片段是免疫原性片段。在本发明的背景中，当向哺乳动物施用免疫原性片段时，本文使用的术语“免疫原性”表示产生或引发如对A群链球菌或其分子组分(如M蛋白)的免疫应答的能力或潜能。优选地，由免疫原性片段引发的免疫应答是保护性的。
“引发免疫应答”意指导致或刺激免疫系统(包括细胞免疫系统、抗体和/或天然免疫系统)的一个或多个元件的产生或活性。适当地，免疫系统的一个或多个元件包括B淋巴细胞、抗体和嗜中性粒细胞。
本文通常使用的术语“使…免疫”、“接种疫苗”和“疫苗”指引发针对A群链球菌的保护性免疫应答，由此至少部分预防A群链球菌的后续感染或使之最小化的方法和/或组合物。
本文使用的术语“A群链球菌(group A streptococcus)”、“A群链球菌(Group AStreptococci)”、“A群链球菌(Group A Streptococcal)”、“A群链球菌(Group A Strep)”以及缩写“GAS”指兰斯菲尔德血清型A的链球菌细菌，其为物种酿脓链球菌的革兰氏阳性β溶血细菌。GAS的重要毒力因子是M蛋白，其强烈地抗吞噬并与血清因子H结合，破坏C3-转化酶并阻止C3b的调理作用。这些还包含有毒的“突变体”，例如Graham等人，2002,PNAS USA99 13855中所描述的，如CovR/S或CovRS突变体，尽管不限于这些。
由A群链球菌引起的疾病和病况包括蜂窝组织炎、丹毒、脓疱病、猩红热、咽喉感染如急性咽炎(“链球菌性喉炎”)、菌血症、中毒性休克综合征、坏死性筋膜炎、急性风湿热和急性肾小球肾炎，尽管不限于这些。
本文使用的“嗜中性粒细胞(neutrophil)”或嗜中性粒细胞(Neutrophilgranulocyte)是与嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞一起形成多形核细胞家族(PMN)的一部分的细胞。嗜中性粒细胞是由骨髓干细胞形成的相对短寿的吞噬细胞，并且通常构成哺乳动物中40％至75％的白细胞。以及作为吞噬细胞，嗜中性粒细胞释放可溶的抗微生物剂(例如颗粒蛋白)并产生嗜中性粒细胞胞外杀菌网络(neutrophil extracellular trap)。嗜中性粒细胞响应诸如白介素-8(IL-8)、C5a、fMLP和白三烯B4的分子，所述分子促进损伤部位和/或急性炎症部位的嗜中性粒细胞的趋化性。
本文使用的“促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质”是直接或间接至少部分增加、增强或恢复嗜中性粒细胞的产生、迁移和/或趋化性和/或嗜中性粒细胞的一种或多种免疫性活性的分子。在一个实施方案中，所述物质引发对嗜中性粒细胞抑制剂的免疫应答。在另一实施方案中，所述物质结合嗜中性粒细胞抑制剂并使之至少部分失活。嗜中性粒细胞抑制剂可以是源自或源于A群链球菌细菌的分子。在一种具体形式中，嗜中性粒细胞抑制剂是蛋白水解性地切割白介素8的丝氨酸蛋白酶或其片段。在一个具体实施方案中，嗜中性粒细胞抑制剂是SpyCEP或其片段。SpyCEP是在人类病原体酿脓链球菌表面表达的170-kDa的多结构域丝氨酸蛋白酶，其通过催化嗜中性粒细胞趋化物白介素-8的切割和失活而在感染中发挥重要作用。SpyCEP氨基酸序列的非限制性实例可以在登录号YP597949.1(酿脓链球菌MGAS10270)和YP596076.1(酿脓链球菌MGAS9429)下找到。因此，在一个具体实施方案中，促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是SpyCEP或其免疫原性片段。在另一实施方案中，促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是与SpyCEP结合的抗体或抗体片段。SpyCEP片段的具体实施方案在图13中示出(SEQ ID NO:1-55)。优选的SpyCEP片段是SEQ IDNO:18中所示的氨基酸序列(NSDNIKENQFEDFDEDWENF)，或者包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列(NSDNIKENQFEDFDEDWENF)。如将在以下更详细描述的，抗SEQ ID NO:18肽的抗血清可以和抗rSpyCEP抗体同样有效地阻断IL8的降解。因此，提出，SEQ ID NO:18是可以诱导功能性抗体的SpyCEP上的优势表位，或者包含可以诱导功能性抗体的SpyCEP上的优势表位。
本文使用的“M蛋白的片段”是GAS M蛋白的任意片段，其是免疫原性的和/或能够与抗体或抗体片段结合。通常，所述片段是GAS M蛋白的C-重复区域或其片段的氨基酸序列，包含GAS M蛋白的C-重复区或其片段的氨基酸序列，或者包含于GAS M蛋白的C-重复区或其片段的氨基酸序列内。非限制性实例包括p145，其是具有氨基酸序列LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO:56)的20聚体。就这点而言，p145氨基酸序列的片段可以存在于J14或J8肽中。
本文使用的“J14肽”可以包含氨基酸序列KQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDRVK(SEQID NO:57)或其片段或变体，一种具有p145内的最小B细胞表位和T细胞表位的肽，其被鉴定为GAS M蛋白C-区域的肽，其不含可能有害的T细胞自身表位，但是含有调理性的B细胞表位。J14是嵌合肽，其含有来自M蛋白C-区域的14个氨基酸(加粗显示)且侧面是酵母来源的GCN4序列，所述酵母来源的GCN4序列是维持所述肽的正确螺旋折叠和构象结构所必需的。
本文使用的“J8肽”是包含至少部分源自或者对应于GAS M蛋白C-区域肽的氨基酸序列的肽。J8肽适当地包含B-细胞构象表位且缺少可能有害的T-细胞自身表位。优选的J8肽氨基酸序列是QAEDKVKQ
Figure BDA0001159833390000101
KQLEDKVQ(SEQ ID NO:58)或其片段或变体，其中加粗的残基对应于GAS M蛋白的残基344至355。在该实施方案中，J8是还包含侧面的GCN4DNA-结合蛋白序列的嵌合肽，所述序列协助维持J8肽的正确螺旋折叠和构象结构。
本文使用的蛋白“变体”与参照氨基酸序列共有可确定的核苷酸或氨基酸序列关系。参照氨基酸序列可以是如以上所描述的M蛋白、SpyCEP或它们的片段的氨基酸序列。“变体”蛋白可以是参照氨基酸序列中的一个或多个氨基酸缺失或被不同的氨基酸置换。本领域众所周知的是，一些氨基酸可以被置换或缺失，而不改变免疫原性片段和/或蛋白的活性(保守置换)。优选地，蛋白变体与参照氨基酸序列共有至少70％或75％，优选地至少80％或85％，或者更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，变体蛋白或肽在其N端和/或C端可以包含一个或多个赖氨酸残基。所述多个赖氨酸残基(例如聚赖氨酸)可以是赖氨酸残基的直链序列，或者可以是赖氨酸残基的支链序列。这些另外的赖氨酸残基可以促进增加的肽的溶解度。
J8肽变体的非限制性实例包括：
S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q V E K A L C(SEQ ID NO：59)
S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K C(SEQ ID NO：60)
S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K K Q V E K A L C(SEQ ID NO：61)
S R E A K K Q V E K A L D A S R E A K K Q V E K A L C(SEQ ID NO：62)
其它变体可以基于如Cooper等，1997所描述的七残基(heptads)。
举例来说，如果已知表位位于a-螺旋蛋白的结构构象内，则可以合成模型肽以折叠成该构象。基于GCN4亮氨酸拉链的结构(O’Shea等，1991)，我们设计了模型的α-螺旋卷曲的卷曲肽。第一七残基含有序列MKQLEDK(SEQ ID NO:63)，其包含见于稳定卷曲的卷曲七残基重复基元(a-b-c-d-e-f-g)n中的数种特征(Cohen&Parry，1990)。这些特征包括位于a位和d位的大的非极性残基，位于e位和g位的酸/碱对(Glu/Lys)(通常有利于链间的离子相互作用)，以及位于b、c、f位的极性基团(与Lupas等(1991)的预测一致)。GCN4肽在a位还含有共有的缬氨酸。还注意到，当a位和d位被V和L占据时，有助于卷曲的卷曲二聚体(Harbury等，1994)。模型七残基重复来源于具有形成α-螺旋卷曲的卷曲的潜能的GCN4亮氨酸拉链肽(VKQLEDK；SEQ ID NO:64)的这些共有特征。该肽成为框架肽。将在研究中的构象表位的重叠片段嵌入模型的卷曲的卷曲肽内，以产生嵌合肽。每当在螺旋模型肽和表位序列二者中发现相同的残基时，就将设计以确保正确螺旋卷曲的卷曲构象的氨基酸置换(Cohen&Parry,1990)并入嵌合肽中。通常使用下述置换：a位，V置换为I；b位，K置换为R；c位，Q置换为N；d位，L置换为A；e位，E置换为Q；f位：D置换为E；g位，K置换为R。在卷曲的卷曲蛋白中，所有这些替换的残基均常见于其各自位点上(Lupas等，1991)。
本文通常用于描述各蛋白和核酸之间的序列关系的术语包括“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“基本相同(substantial identity)”。由于各核酸/蛋白可以各自(1)仅包含所述核酸/蛋白共有的完整的核酸/蛋白序列的一个部分或多个部分，以及(2)包含核酸/蛋白之间不同的一个或多个部分，因此通常通过在“比较窗口”比较序列来进行序列比较，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。“比较窗口”指与参照序列进行比较的通常为6、9或12个连续残基的概念上的区段。为了各序列的最佳比对，比较窗口可以包含相比于参照序列约20％或更少的添加或缺失(即，空位)。可以通过算法(Intelligenetics的Geneworks程序；威斯康星遗传学软件包7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA，通过引用并入本文)的计算机化实施或者通过检验以及由选择的各种方法中任一种所产生的最佳比对(即，在比较窗口上产生最高的同源性百分比)进行用于对齐比较窗口的最佳序列比对。还可以参考如例如Altschul等，1997,Nucl.Acids Res.25 3389所公开的BLAST程序家族，将其通过引用并入本文。序列分析的详细讨论可见于Ausubel等人编著的《最新分子生物学实验方法汇编》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(John Wiley&Sons Inc NY,1995-1999)的第19.3单元。
术语“序列同一性”在本文以其最广泛的含义使用，以包括精确的核苷酸或氨基酸匹配数，其涉及使用标准算法的适当对齐、涉及比较窗口中序列的同一性程度。因此，通过以下计算“序列同一性百分比”：在比较窗口比较两条最佳对齐的序列，确定两条序列上均存在的相同的核酸碱基(如，A、T、C、G、I)的位置数目以得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100以得到序列同一性百分比。例如，“序列同一性”可以理解为意指通过DNASIS计算机程序(对于windows，版本2.5；可获自Hitachi Software engineering Co.,Ltd.,South San Francisco,California,USA)计算的“匹配百分比”。
如本领域所理解的，本文使用的“衍生物”是诸如例如通过以下而被改变的蛋白、其片段或变体的分子：与其它化学部分结合或络合，翻译后修饰(例如磷酸化、乙酰化等)，糖基化修饰(例如添加、移除或改变糖基化)和脂化修饰和/或包含另外的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，另外的氨基酸序列在其N端和/或C端可以包含一个或多个赖氨酸残基。所述多个赖氨酸残基(例如聚赖氨酸)可以是赖氨酸残基的直链序列，或者可以是赖氨酸残基的支链序列。这些另外的赖氨酸残基可以促进增加的肽的溶解度。
Olive等，2002，Infect&Immun.70 2734中所描述的一种具体的J8肽衍生物是“脂质核心肽”。在一个实施方案中，脂质核心肽可以包含多个J8肽(例如四个J8肽)，所述J8肽被直接地合成在与亲脂性锚耦合的支链聚赖氨酸核心的各赖氨酸的两个氨基上。
另外的氨基酸序列可以包含融合伴侣(fusion partner)的氨基酸序列，其生成融合蛋白。举例来说，融合伴侣的氨基酸序列可以帮助检测和/或纯化分离的融合蛋白。非限制性实例包括金属结合融合伴侣(例如聚组氨酸)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、蛋白A、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、荧光蛋白序列(例如GFP)、表位标签(如myc、FLAG和血凝素标签)。
本发明考虑的其它衍生物包括但不限于：对侧链的修饰，在肽或蛋白合成期间并入非天然氨基酸和/或它们的衍生物，以及使用交联剂和对本发明的免疫原性蛋白、片段和变体强加构象限制的其它方法。
就这点而言，对于涉及蛋白质化学修饰的更广泛方法学，技术人员参考Coligan等人编著的《最新蛋白质科学实验指南》(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)(JohnWiley&Sons NY1995-2008)的第15章。
可以通过本领域已知的任何方法产生本发明的分离的免疫原性蛋白、片段和/或衍生物，所述方法包括但不限于：化学合成、重组DNA技术以及蛋白水解切割以产生肽片段。
化学合成包括固相合成和液相合成。此类方法在本领域众所周知，尽管参考如Nicholson编著的《合成疫苗》(SYNTHETIC VACCINES)(Blackwell ScientificPublications)的第9章和Coligan等人编著的《最新蛋白质科学实验指南》(CURRENTPROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)(John Wiley&Sons,Inc.NY USA 1995-2008)的第15章中提供的化学合成技术的实例。就这点而言，还参考国际公开WO 99/02550和国际公开WO 97/45444。
利用如例如下述中所述的标准方案，本领域技术人员可以方便地制备重组蛋白：Sambrook等，《分子克隆实验指南》(Cold Spring Harbor Press，1989)，特别是第16部分和第17部分；Ausubel等人编著的《最新分子生物学实验方法汇编》(CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY)(John Wiley&Sons,Inc.NY USA1995-2008)，特别是第10章和第16章；以及Coligan等人编著的《最新蛋白质科学实验指南》(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEINSCIENCE)(John Wiley&Sons,Inc.NY USA 1995-2008)，特别是第1章、第5章和第6章。通常，重组蛋白的制备包括编码所述蛋白的核酸在合适的宿主细胞中的表达。
某些方面和实施方案涉及施用编码M蛋白的片段、其变体或衍生物以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质的一种或多种核酸，或者包含所述一种或多种核酸的组合物，从而引发对GAS的免疫应答和/或针对GAS感染产生免疫。
本文使用的术语“核酸”指单链或双链DNA和RNA。DNA包括基因组DNA以及cDNA。RNA包括mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA和自催化的RNA。核酸还可以是DNA-RNA杂交体。核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列通常包含包括A、G、C、T或U碱基的核苷酸。然而，核苷酸序列可以包含其它碱基，如修饰的嘌呤(例如肌苷、甲肌苷和甲基腺苷)和修饰的嘧啶(例如硫代尿苷和甲基胞嘧啶)。
在优选形式中，编码M蛋白的片段、其变体或衍生物以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质的一种或多种分离的核酸为适于向哺乳动物(如人)施用的遗传构建体的形式。在优选形式中，遗传构建体适合于哺乳动物(如人)的DNA疫苗接种。
适当地，如本领域众所周知的，遗传构建体为质粒、噬菌体、粘粒、酵母或细菌人工染色体的形式，或者包含质粒、噬菌体、粘粒、酵母或细菌人工染色体的遗传组件。遗传构建体还可适合于在细菌或其它宿主细胞中维持和增殖分离的核酸，适合于通过重组DNA技术进行操作。
出于蛋白表达的目的，遗传构建体是表达构建体。适当地，表达构建体包含与表达载体中的一种或多种另外的序列可操作地连接的一种或多种核酸。“表达载体”可以是自我复制的染色体外载体(如质粒)，或者是整合进宿主基因组的载体。
“可操作地连接”意指所述另外的核苷酸序列的定位相对于本发明的核酸，以优选地起始、调控或以其它方式控制转录。
调控性核苷酸序列通常适用于需要表达的宿主细胞或组织。对于各种宿主细胞而言，众多类型的适合的表达载体以及合适的调控序列在本领域是已知的。
通常，所述一种或多种调控性核苷酸序列可以包括但不限于：启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。本发明考虑本领域已知的组成型或诱导型启动子。如以上所描述的，表达构建体还可以包含编码融合伴侣的另外的核苷酸序列(通常由表达载体提供)，以使本发明的重组蛋白表达为融合蛋白。
将理解，编码M蛋白，其片段、变体或衍生物以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质(例如SpyCEP或其免疫原性片段)的分离的核酸可以以单独的表达构建体的方式施用或者可以存在于同一表达构建体中(例如多顺反子表达构建体)。
适当地，DNA疫苗接种是以一种或多种质粒DNA表达构建体的方式。质粒通常包含病毒启动子(如SV40、RSV或CMV启动子)。可以包含内含子A以提高mRNA的稳定性，从而增加蛋白的表达。质粒还可以包含多克隆位点、强的聚腺苷酸化信号/转录终止信号(如牛生长激素或兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列)。质粒还可以包含梅森-菲舍猴病毒顺式作用转录元件(MPV-CTE)，其具有或不具有HIV rev增加的包膜表达。可以增强表达的另外修饰包括增强子序列、合成的内含子序列、腺病毒三联前导(TPL)序列的插入和/或对聚腺苷酸化和/或转录终止序列的修饰。DNA疫苗质粒的非限制性实例是pVAC，其可商购自Invivogen。
描述DNA疫苗学的有用参考是《DNA疫苗：方法和实验指南》，第二版(DNAVaccines,Methods and Protocols,Second Edition)(《分子药学方法系列》第127卷(Volume 127of Methods in Molecular Medicine series)，Humana Press,2006)。
如以上所述，本发明提供预防或治疗哺乳动物中的A群链球菌相关的疾病、病症或病况的组合物和/或方法。
本文使用的“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”指在A群链球菌相关的疾病、病症或病况已开始发展之后，至少部分改善、消除或减轻其症状或病理学征象的治疗性干预。治疗不需要对对象绝对有益。可以利用本领域普通技术人员已知的任何方法或标准确定有益效果。
本文使用的“预防(preventing)”、“预防(prevent)”或“预防(prevention)”指在感染或暴露于A群链球菌之前和/或在A群链球菌相关的疾病、病症或病况的症状或病理学征象发作之前起始的作用过程，以预防感染和/或减轻症状或病理学征象。应当理解，此类预防不需要对对象绝对有益。“预防性(prophylactic)”治疗指出于降低发展A群链球菌相关的疾病、病症或病况的症状或病理学征象的风险的目的，向未显现A群链球菌相关的疾病、病症或病况的征象的对象，或仅显现早期征象的对象施用的治疗。
在本发明的背景中，“A群链球菌相关的疾病、病症或病况”意指由A群链球菌的感染导致的任何临床病理，并且包括蜂窝组织炎、丹毒、脓疱病、猩红热、咽喉感染如急性咽炎(“链球菌性喉炎”)、菌血症、中毒性休克综合征、坏死性筋膜炎、急性风湿热和急性肾小球肾炎，尽管不限于这些。
如以上所述，本文公开的治疗和/或免疫方法包括向哺乳动物单独或者组合施用M蛋白的片段、变体或衍生物以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质，从而引发哺乳动物的免疫应答。可选地，如以上所述，治疗和/或免疫方法包括单独或者组合施用编码M蛋白的片段、其变体或衍生物以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质的一种或多种分离的核酸，从而引发哺乳动物的免疫应答。
如本文所公开的，本发明的其它具体方面和实施方案涉及使用抗体或抗体片段，以如通过靶向感染部位(例如皮肤)的SpyCEP而治疗性地治疗GAS感染。这可以与M蛋白的片段的免疫和/或抗M蛋白的片段的抗体或抗体片段的施用组合进行。
抗体和抗体片段可以是多克隆的或单克隆的、天然的或重组的。抗体片段包含Fc、Fab或F(ab)2片段和/或可以包含单链Fv抗体(scFv)。可以例如根据美国专利第5,091,513号、欧洲专利第239,400号或Winter&Milstein,1991,Nature 349:293的文章中分别描述的方法制备此类scFv。抗体还可以包含含有多个scFv的多价重组抗体片段以及二聚作用活化的demibody(如WO/2007/062466)，所述多价重组抗体片段如双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)和/或四链抗体(tetrabody)。举例来说，可以根据Holliger等，1993Proc NatlAcad Sci USA 90 6444；或者Kipriyanov,2009Methods Mol Biol 562 177中所描述的方法制备此类抗体。适用于抗体的产生、纯化和使用的众所周知的方案可见于，例如Coligan等人的《最新免疫学实验指南》(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)(John Wiley&SonsNY，1991-1994)的第二章和Harlow,E.&Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。
产生多克隆抗体的方法对本领域技术人员而言众所周知。可以使用的示例性方案描述于例如以上Coligan等人的《最新免疫学实验指南》(CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY)和以上Harlow&Lane,1988。在具体实施方案中，抗SpyCEP多克隆抗体可以获自或纯化自来自暴露于或者感染A群链球菌的个体的人血清。可选地，多克隆抗体可以在产生物种如马中由纯化的或重组的SpyCEP或者其免疫原性片段诱发，以及随后在施用之前纯化。
可以使用如例如
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&Milstein,1975,Nature 256,495的文章中最初描述的标准方法，或者通过如例如以上Coligan等人的《最新免疫学实验指南》(CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)中描述的对标准方法的最近的改进，通过使源自产生物种的脾细胞或其它抗体产生细胞永生化来产生单克隆抗体，所述产生物种已接种本发明的分离的蛋白、片段、变体或衍生物中的一种或多种。因此，对于本发明的用途，可以由M蛋白的片段、变体或衍生物和/或促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质(例如SpyCEP)诱发单克隆抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体或其片段可以是重组形式。如果单克隆抗体最初由非人的哺乳动物的脾细胞产生，则重组形式对于使所述单克隆抗体或片段“人源化”可能特别有利。
对于涉及治疗性抗体的实施方案，优选的M蛋白的片段可以是p145肽。
SpyCEP的优选片段可以包含氨基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)或者由氨基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)组成。
在某些方面和实施方案中，可以以组合物的形式向哺乳动物单独或者组合施用M蛋白的片段、变体或衍生物以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质，包括如本文所公开的抗体或抗体片段。
在优选形式中，组合物包含可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
“可接受的载体、稀释剂或赋形剂”意指可以安全地用于全身施用的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。根据具体的施用途径，可以使用本领域众所周知的多种载体、稀释剂和赋形剂。这些可以选自包括以下的组：糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水以及诸如无机酸盐(包括盐酸盐、溴酸盐和硫酸盐)和有机酸盐(如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐)的盐、水以及无热原水。
描述可接受的载体、稀释剂和赋形剂的可用参考是《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(Mack Publishing Co.N.J.USA,1991)，将其通过引用并入本文。
优选地，出于引发免疫应答的目的，可以将某些免疫学物质与J8肽、片段、变体或衍生物以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质组合使用，或者与编码这些的一种或多种遗传构建体组合使用。
如本领域众所周知的，术语“免疫学物质”在其范围内包括载体、递送物质、免疫刺激剂和/或佐剂。如本领域所理解的，免疫刺激剂和佐剂指或者包括增强组合物的免疫原性和/或功效的一种或多种物质。合适的免疫刺激剂和佐剂的非限制性实例包括角鲨烷和角鲨烯(或者植物或动物来源的其它油类)；嵌段共聚物；洗涤剂(如
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-80)；
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A、矿物油(如Drakeol或Marcol)、植物油(如花生油)；棒状杆菌来源的佐剂(如短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum))；丙酸杆菌来源的佐剂(如痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacne))；牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(卡介苗或BCG)；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)抗原；破伤风类毒素；白喉类毒素；表面活性物质，如十六胺、十八胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基双十八烷基溴化铵、N,N-dicoctadecyl-N′,N′双(2-羟乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油和复合多元醇；聚胺如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC羧乙烯聚合物(poly IC carbopol)；肽，如胞壁酰二肽和衍生物、二甲基甘氨酸、促吞噬肽(tuftsin)；油性乳状液；以及矿物凝胶，如磷酸铝、氢氧化铝或明矾；白介素，如白介素2和白介素12；单核因子，如白介素1；肿瘤坏死因子；干扰素，如γ干扰素；免疫刺激性DNA(如CpG DNA)、免疫刺激性组合(如皂角苷-氢氧化铝或Quil-A氢氧化铝)；脂质体；
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和
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佐剂；分枝杆菌细胞壁提取物；合成的糖肽，如胞壁酰二肽或其它衍生物；Avridine；脂质A衍生物；硫酸葡聚糖；单独的DEAE-葡聚糖或含有磷酸铝的DEAE-葡聚糖；羧基聚亚甲基，如Carbopol’EMA；丙烯酸共聚物乳状液，如Neocryl A640(例如美国专利第5,047,238号)；油包水乳化剂，如Montanide ISA 720；脊髓灰质炎病毒蛋白、牛痘蛋白或动物痘病毒蛋白；或者它们的混合物。
免疫学物质可以包括载体，如甲状腺球蛋白；白蛋白，如人血清白蛋白；毒素、类毒素或者来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌(Pseudomonas)、大肠杆菌(E.coli)、葡萄球菌(Staphylococcus)和链球菌的毒素的任何突变交叉反应材料(CRM)；聚氨基酸，如聚(赖氨酸：谷氨酸)；流感病毒；轮状病毒VP6，细小病毒VP1和VP2；乙型肝炎病毒核心蛋白；乙型肝炎病毒重组疫苗等。可选地，可以使用载体蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或表位。例如，可以使用细菌毒素、类毒素或CRM的T细胞表位。就这点而言，可以参考美国专利第5,785,973号，将其通过引用并入本文。
考虑用于产生疫苗组合物的任何合适程序。示例性程序包括例如New GenerationVaccines(1997,Levine等，Marcel Dekker,Inc.New York,Basel,Hong Kong)中所描述的那些，将其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，组合物和疫苗可以以减毒或灭活细菌的形式施用至哺乳动物，可以对所述减毒或灭活的细菌进行遗传修饰以表达J8肽、片段、变体或衍生物和/或促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质。减毒细菌的非限制性实例包括沙门氏菌(Salmonella)属物种，例如鼠伤寒肠沙门氏菌变种(Salmonella entericavar.Typhimurium)或伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)。可选地，可以以减毒的形式使用其它肠病原体如志贺氏菌(Shigella)属物种或大肠杆菌。通过以下构建减毒的沙门氏菌属菌株：使芳香族氨基酸生物合成途径中的基因失活(Alderton等，Avian Diseases 35435)，将突变引入芳香族氨基酸生物合成途径中的两个基因(如描述于美国专利5,770,214)或者引入其它基因如htrA(如描述于美国专利5,980,907)或者引入编码外膜蛋白的基因如ompR(如描述于美国专利5,851,519)。
可以采用任何安全的施用途径，包括口服施用、直肠施用、肠胃外施用、舌下施用、口腔施用、静脉内施用、关节内施用、肌肉内施用、皮内施用、皮下施用、吸入施用、眼内施用、腹膜内施用、脑室内施用、局部施用、黏膜以及经皮施用，尽管不限于这些。
剂型包括片剂、分散剂、悬液、注射剂、溶液、糖浆剂、锭剂、胶囊、鼻用喷雾、栓剂、气雾剂、透皮贴剂等。这些剂型还可以包括为该目的特别设计的注入式或植入式控释装置，或者被改进以以该方式另外作用的其它植入物形式。控释可能受疏水聚合物包被的影响，所述疏水聚合物包括丙烯酸树脂、蜡类、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纤维素衍生物(如羟丙基甲基纤维素)。此外，控释可能会受使用其它聚合物基质、脂质体和/或微球体的影响。
组合物可以以以下形式存在：离散单元如胶囊、小袋(sachet)、功能性食物/饲料或片剂，其各自含有预先确定量的本发明的一种或多种治疗剂；粉末或颗粒；或者溶液或在水性液体、非水性液体中的悬浮液，水包油乳状液或水包油液体乳状液。可以通过任何药学方法制备此类组合物，但是所有方法均包括下述步骤：将如上所述的一种或多种物质与构成一种或多种必需成分的载体联合。通常，通过下述来制备组合物：将本发明的物质与液体载体或细分的固体载体或者这两者均匀或紧密混合，然后，如果需要，则将产品塑形成期望的外观。
以上组合物可以以与剂型兼容的方式以及以有效的量施用。在本发明的背景中，向患者施用的剂量应当足以经合适的时间段在患者中产生有益应答。待施用的物质的量可以取决于待治疗的对象，包括年龄、性别、体重及其整体健康状况(为取决于专业人员的判断的因素)。
本文通常使用的术语“患者”、“个体”和“对象”用于本文公开的治疗或组合物的任何哺乳类接受者的背景下。因此，本文公开的方法和组合物可以具有医学和/或兽医学应用。在优选形式中，哺乳动物是人。
为了可以完全地理解本发明并将其投入实际应用，参考下述非限制性实施例。
实施例
材料和方法
动物：BALB/c小鼠(雌性，4-6周龄)获自动物资源中心(ARC,Perth,WesternAustralia)。根据澳大利亚国立健康与医学研究理事会(NHMRC)指南，所有方案均被格里菲斯大学的动物伦理委员会批准。
细菌菌株和培养基：在本研究中采用获自不同来源的大量GAS分离物。酿脓链球菌M1(emm1)、88/30(emm 97)、BSA10(emm 124)和NS27(emm 91)、NS1(emm 100)和90/31(emm57)获自澳大利亚达尔文市曼兹斯卫生研究院(Menzies School of Health Research,Darwin,Australia)。菌株5448AP(emm1)获自Mark Walker教授(昆士兰大学,Brisbane,Australia)的实验室。将所有菌株在小鼠中传代，并且通过将它们连续置于增加浓度的链霉素中使之对链霉素(200μg/ml)有抗性。为了制备激发接种物，使GAS菌株在37℃，在补充有1％新胨蛋白胨(neopeptone,Difco)，含有Todd-Hewitt肉汤(THB；Oxoid,Australia)的液体培养基中生长。为了在感染之后测定细菌生物负载，将样本接种在由以上所述的液体培养基与2％琼脂、200μg/ml链霉素和2％马血组成的血琼脂平板上。
肽的合成和疫苗制剂：如别处所描述的(Batzloff等，2003)，合成肽J8并将其与Auspep Pty Ltd(Australia)的DT缀合。重组SpyCEP由GenScript USA Inc表达和纯化。将所有的肽冻干储存或者以溶液的形式于-80℃储存。用30μg/小鼠剂量的J8-DT或重组SpyCEP接种小鼠。对于用组合的蛋白-肽缀合疫苗进行的接种，将每只小鼠30μg肽缀合物J8-DT和30μg重组SpyCEP混合，并且以1:1(v/v)的比例吸附在氢氧化铝(Alhydrogel,alum)上。
浅表皮肤感染模型的建立：为了开发用于GAS的浅表皮肤感染模型，使用近交系的雌性BALB/c以及远交系的Swiss小鼠(4-6周龄)。腹膜内(IP)注射(100μl/10g小鼠)比例为1:1:10的氯胺酮(100mg/ml储液)/Xylazil-20(20mg/ml储液)/水使小鼠麻醉。使用修剪工具和剃须刀移除小鼠后臀部(back haunch)的皮毛。用乙醇拭子将皮肤擦净，然后借助于金属锉刀机械划痕。皮肤擦伤后，使小鼠感染GAS。将含有已知CFU计数的GAS的接种物(20μl)局部应用在划痕皮肤上。一旦接种物被皮肤完全吸收，将受伤部位进行暂时覆盖，并且将小鼠在单独的笼中饲养。除浅表感染的组之外，将肺泡感染的小鼠组用作阳性对照。按照Raeder和Boyle(1993)的方法使这些小鼠感染。根据批准的评分表，每日监测小鼠的感染损伤以及疾病征象。密切监测受伤部位以评价感染的状态。
组织学切片：在感染后第3天，处死有GAS皮肤感染或无GAS皮肤感染的划痕小鼠(每组n＝3)。收集来自感染部位的组织皮肤样本，用福尔马林缓冲液固定，并包埋在石蜡中以用于苏木精&伊红(H&E)染色。然后切成5μm厚的组织切片，并用H&E以及姬姆萨和革兰氏染色剂染色，以显现革兰氏阳性生物体。扫描切片，并使用ImageScope软件在高的放大倍数下读取。对于免疫组织化学，将样本在OCT中冷冻。同时在嗜中性粒细胞和巨噬细胞耗竭之后的不同时间点进行组织学检查。使用ImageJ(国立卫生研究院,Bethesda,MD,USA)，在扫描的玻片的五个区域中对阳性细胞进行计数，并表示为每10,000μm2阳性细胞的平均数。
小鼠免疫和激发方案：在第0天，用30μg J8-DT，30μg rSpyCEP或者60μg制剂(其包含30μg J8-DT和30μg rSpyCEP)在尾根处对BALB/c小鼠进行皮下免疫。将所有在PBS中的抗原制备物配制在作为佐剂的铝胶中。在第21天和第28天刺激小鼠。对照小鼠仅接受佐剂。在最后的免疫之后两周，利用皮肤感染途径用GAS激发小鼠。感染后，密切监测小鼠，并且处死显示疾病征象的任何小鼠(基于评分表，由GU动物伦理委员会批准)。
样本的收集和CFU测定：在感染后的限定时间点(第3天、第6天和第9天)，从各组挑选5只小鼠。经心脏穿刺收集血液样本，并且从位于被感染小鼠的后臀部的感染损伤处切离皮肤组织。将皮肤样本称重并在盐水中均质化。然后将适当的稀释液接种在链霉素血琼脂平板上，一式两份，以测定感染损伤处的细菌负载。在PBS中稀释血液样本，并且将适当的稀释液重复接种在链霉素血琼脂平板上以测定血液中的细菌负载。
细胞耗竭研究：如之前所述的(Goldmann等，2004)，经由卡拉胶(CGN)的IP施用耗竭巨噬细胞。为了耗竭皮肤巨噬细胞，每72小时，皮下注射CGN，这导致皮肤驻留巨噬细胞>95％的耗竭。在用FITC-缀合的抗小鼠Mac-1和APC缀合的F4/80(BD Biosciences,NewJersey,USA)标记之后，利用脾细胞的流式细胞术分析来优化CGN注射的剂量和时间进程。为了耗竭嗜中性粒细胞，如之前所述(Eyles等，2008)，使用抗Ly6G mAb(克隆1A8)。使用CD11b-perCp-cy5.5和Gr-1-APC mAb，通过血液、骨髓和脾细胞的流式细胞术分析来确认嗜中性粒细胞的耗竭。
体外趋化因子降解的分析：如之前所述(Hidalgo-Grass等，2004)，进行IL-8、MIP-2和KC降解，并使用Quantikine试剂盒(R&D systems,Minneapolis,MN,USA)通过ELISA对其进行定量。使用该方法测量与GAS培养上清液(S/N)孵育后未降解的趋化因子(IL-8、MIP-2和KC)的量。简言之，为了收集培养物S/N，使各种GAS菌株生长至对数中期(OD600 0.5)，将其再次接种进新鲜的THB并且于37℃过夜生长。然后将来自各菌株的无细胞GAS培养物S/N与已知浓度的重组趋化因子(IL-8、MIP-2和KC)于37℃孵育。在2小时、4小时、8小时或24小时收集样本，并且如上所述，通过ELISA(R&D Systems)测定未降解的趋化因子的量。
嗜中性粒细胞的分离和transwell迁移分析：使用嗜中性粒细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech,Germany)，从小鼠骨髓分离嗜中性粒细胞。将嗜中性粒细胞(100μl培养基中2.5×105个)添加至transwell系统(Costar 24孔transwell,Corning NY)的上室，然后将其放置在含有单独的培养基或者完整的或降解的趋化因子的下室。作为阳性对照，还使用含有已知浓度的各重组趋化因子的孔。于37℃孵育2小时之后，从上室和下室收集细胞，并使用台盼蓝拒染法测定转移的活的嗜中性粒细胞的数目。通过将迁移的嗜中性粒细胞的数目除以存在的嗜中性粒细胞的总数来计算迁移的嗜中性粒细胞的百分比。
SpyCEP中和分析：为了评估rSpyCEP抗血清的SpyCEP中和能力，在BALB/C小鼠中产生针对rSpyCEP的超免疫血清。使包括90/31、BSA10和5448AP的一组GAS菌株生长至稳定期。将无细胞的GAS培养上清液与重组趋化因子和50％的正常血清或者抗SpyCEP血清于37℃共孵育16小时。使用Quantikine ELISA试剂盒(R&D System)测量未切割的IL-8。
SpyCEP表位作图：在GenScript(Genscript USA Inc)合成肽阵列，所述肽阵列包含来自SpyCEP的N-端区域的553个氨基酸。在总的55种肽(SEQ ID NO：1-55)中，将重叠10个的各20聚体印迹至膜上。按照ELISA方案，用来自被30μg/剂量rSpyCEP/Alum制备物免疫3次的小鼠的抗血清探测膜。取被SpyCEP抗血清最强识别的6种肽用于进一步的研究(SEQ IDNO:15、18、19、24、30和54)。
肽的合成和疫苗制剂：在GenScript，将通过表位作图(如上所讨论的)鉴定的六种肽(各为20聚体)合成为游离的肽或在C-端具有另外的半胱氨酸残基。然后将具有C-端的肽与DT缀合并在小鼠中用于体内免疫原性研究。将所有的肽冻干储存或以溶液的形式于-20℃储存。以30μg/小鼠的剂量，用rSpyCEP或SpyCEP肽(S1-S6)-DT缀合物将小鼠疫苗接种3次。
各肽免疫原性的测定：在各次刺激之前和之后收集血清样本以测定针对免疫肽以及针对亲本蛋白(rSpyCEP)的抗体滴度。为了测定肽特异性的IgG的滴度，用5μg/ml的六种肽(S1-S6)中的每一种包被板。使用由各肽诱发的抗血清的2倍连续稀释液进行ELISA。为了通过rSpyCEP确定SpyCEP肽的识别，使用rSpyCEP抗血清的2倍连续稀释液。最后为了测定肽抗血清的亲本肽的识别，用rSpyCEP包被板，并且使用肽的抗血清评估其与rSpyCEP的结合/识别。
体外IL-8保护分析：为了评估肽抗血清抑制IL-8降解的能力，进行体外IL-8保护分析。将GAS培养上清液(S/N)与已知浓度的重组IL-8和肽抗血清(S1-S6)的1:2稀释液孵育。如前所述(Hidalgo-Grass等，2004)，使用Quantikine试剂盒(R&D systems，Minneapolis，MN，USA)，通过ELISA来定量反应混合物中未降解的IL-8的量。简言之，为了收集培养物S/N，使各种GAS菌株生长至对数中期(OD600 0.5)，再次接种至新鲜的THB，并于37℃过夜生长。然后在来自各肽的抗血清存在或不存在的情况下，将来自各菌株的无细胞GAS培养物S/N与已知浓度的重组趋化因子(IL-8)于37℃孵育。孵育16小时之后收集样本，并且如上所述通过ELISA(R&D Systems)测定未降解的趋化因子的量。
肽抑制ELISA：对于肽抑制ELISA分析，将微量滴定板用100μl终浓度为5μg/ml的肽S1至S6或recSpyCEP(在75mM碳酸钠缓冲液(pH 9.6)中)于4℃包被过夜。将板用缓冲液(含0.05％吐温20的PBS，pH 7.2)洗涤，并且用补充有5％脱脂奶的缓冲液(封闭缓冲液)于37℃封闭90分钟。将抗肽或recSpyCEP血清与5μg/ml或2.5μg/ml的各自体肽或recSpyCEP于37℃预孵育30分钟。其后将测试抗血清添加至封闭板并且于37℃孵育90分钟。将板洗涤四次，并且添加HRP-缀合山羊抗小鼠-IgG(Biorad,Australia)，并于37℃孵育另外90分钟。另外的洗涤之后，如上所述铺板并测量OD450。
流式细胞术分析：通过流式细胞术分析recSpyCEP或SpyCEP表位抗体与GAS细胞表面的结合。使细菌在含有1％新胨蛋白胨的THB中过夜生长，并且在PBS中洗涤。其后，将细菌(1×107个菌落形成单位；cfu)与100μl Fc封阻剂于室温预孵育15分钟，以封闭非特异性结合位点。之后添加1:20稀释度的肽抗血清。室温孵育1小时之后，将细菌在PBS中洗涤两次，随后与FITC-缀合的抗小鼠IgG(在含2％BSA的PBS中以1/50稀释)孵育。最后，洗涤细菌，并且将其在1％甲醛(在PBS中)中于室温孵育15分钟。在CyAn ADP分析仪(Beckman Coulter,Inc.)上分析样本。单独添加FITC-缀合的抗小鼠IgG作为所分析的各菌株的阴性对照，并且此外，将非特异性小鼠IgG作为对照。
评估疫苗功效的激发模型：腹膜内(IP)注射(100μl/10g小鼠)比例为1:1:10的氯胺酮(100mg/ml储液)/Xylazil-20(20mg/ml储液)/水，使近交系的雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)麻醉。使用修剪工具和剃须刀移除小鼠颈部的毛发。对皮肤进行浅表划痕后，局部施加含1×106个CFU计数的GAS接种物(20μl)。一旦接种物被皮肤完全吸收，将受伤部位进行暂时覆盖，并且将小鼠放置在单独的笼中饲养。在感染之前24小时向小鼠饲喂链霉素(200μg/ml)水溶液，并且在整个研究进程中保持饲喂链霉素(200μg/ml)水溶液。根据格里菲斯大学IBC批准的评分表，每日监测小鼠的感染损伤以及疾病征象。密切监测受伤部位以评价感染状态。
器官的收集和CFU测定：在感染后不同时间点(第3天、第6天和第9天)，处死来自各组的限定数量的小鼠。经心脏穿刺收集血液样本，移出脾，并获得来自位于颈部感染损伤处的皮肤活检样本。将皮肤和脾样本均质化，然后将适当的稀释液接种在链霉素血琼脂平板上，一式两份。感染后，密切监测小鼠，并处死显示疾病征象的任何小鼠(基于评分表)。
结果
在图1中，通过比较不同GAS菌株M1(咽喉分离物)以及皮肤分离物88/30和BSA10来显示J8-DT/Alum疫苗接种的保护功效。与M1相比，对于两种皮肤分离物，J8-DT/Alum疫苗接种不太有效。如图2所示，与J8免疫的效力相关的是GAS感染小鼠的皮肤中嗜中性粒细胞(PMN)的存在。
因此，进行实验以测量嗜中性粒细胞耗竭对针对J8-DT/Alum的应答的影响，其结果显示于图3中。嗜中性粒细胞耗竭对J8-DT/Alum疫苗接种的功效具有有害影响。
图1-3中的数据显示，嗜中性粒细胞可能在测定针对GAS感染的J8免疫的功效中发挥作用。图4提供了在具有CovR/S突变的GAS分离物(如5448AP(M1T1分离物))中表达上调的细菌基因的概览。如图5中所示，J8-DT/Alum针对GAS分离物5448AP的保护功效相对弱。考虑到嗜中性粒细胞似乎促进对J8肽的免疫应答，在GAS分离物5448AP中高表达的候选细菌基因是SpyCEP(70kD丝氨酸蛋白酶)，其切割并使嗜中性粒细胞趋化性物质白介素8失活(参见图4)。图6显示了实验的结果，其中5448AP呈现特别强的IL-8降解。5448AP分离物对IL-8的鼠功能同源物：CXCL1/MIP-2(图7)和CXCL1/KC(图8)也呈现强烈的降解活性。功能上，该降解与如图9中所示的嗜中性粒细胞趋化性的抑制相关。
图1-9中的数据显示，丝氨酸蛋白酶SpyCEP在CovR/SCovR/S突变体GAS细菌中高表达，其通过蛋白水解降解负调控IL-8，从而抑制或阻抑嗜中性粒细胞的趋化性。因此，进行实验以确定靶向SpyCEP是否将改善、恢复或增加对J8肽的免疫应答。图10中显示的结果表示，用J8-DT-重组SpyCEP/Alum进行的免疫远比用单独地J8-DT肽-缀合物或重组SpyCEP进行的免疫有效，J8肽和重组SpyCEP的组合协同作用以保护免受5448AP GAS细菌的感染。进一步地，图11显示用J8-DT-rSpyCEP进行的免疫导致比用单独的J8-DT或SpyCEP更强的IgG抗体应答。这些数据产生了这样的可能性：针对SpyCEP的抗体可能是有益的治疗剂，其可以被直接施用至GAS感染部位(皮肤)从而治疗感染。如图12中所示，抗SpyCEP抗体(以来自用重组SpyCEP免疫的小鼠的抗血清的形式)抑制SpyCEP的IL-8降解活性。
我们从SpyCEP的残基35-587制备了一系列重叠的20聚体肽(硝酸纤维素膜上的肽阵列)(图13中的SEQ ID NO:1-55)，以确定哪一些被recSpyCEP抗血清识别。从图14中的数据，我们鉴定了具有图15中所示的氨基酸序列的6个推定的肽表位(S1-6；SEQ ID NO:15、18、19、24、30和54)。然后我们制备了那些单独的合成肽并且将每一种与DT缀合。对小鼠进行免疫，并且我们显示了抗血清可以识别recSpyCEP，尽管某些抗血清比其它抗血清更强(图16)。然后我们进行了IL-8保护分析，并且表明抗肽抗体可以不同程度地阻断SpyCEP对IL-8的降解，而且一种肽(S2；SEQ ID NO:18)的抗血清可以与抗recSpyCEP同样有效地阻断IL8的降解(图17)。因此，我们鉴定了SpyCEP上能够诱导功能性抗体的优势表位(SEQ IDNO:18)。
图18-20中显示了测试如下指定的p145、J8和J8肽变体的免疫原性的数据：
●p145 LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO:56)
●J8 QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO:58)
●J8i V1 SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQ ID NO:59)
●J8i V2 SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQ ID NO:60)
●J8i V3 SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:61)
●J8i V4 SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:62)。
根据28天的免疫方案，在4-6周龄的雌性Balb/c小鼠中产生超免疫血清。用30mg于PBS和Alum中的DT缀合肽(J8、p145、J8iV1、J8iV2、J8iV3或J8iV4)对小鼠进行皮下免疫。在第0天、第21天、第28天发生免疫。在第35天、第42天和第49天，使下颌出血以收集血液/血清。
之前我们已观察到，在小鼠和人中，通过用J8-DT疫苗接种所诱导的抗体仅很弱地识别天然序列p145。因此，基于12聚体的J8插入序列，我们设计了4种变体肽，并且设计这样的变体肽以保持疏水和亲水氨基酸的七残基周期，从而维持肽的α-螺旋结构。这些是以上列出的J8iV1、J8iV2、J8iV3和J8iV4肽。
图18(右图)显示，通过J8-DT疫苗接种所诱导的p145-特异性抗体的滴度非常低(平均值为约2000，其中在某些小鼠中低于200)。相比之下，J8-DT疫苗接种后J8-特异性抗体的滴度为约600,000。针对J8的高滴度必定意味着，大多数抗体识别位于J8的氨基端和羧基端区段的非链球菌的侧翼序列，尽管这还未被正式证明。
图19显示，J8iV1、J8iV2、J8iV3和J8iV4均诱导针对自身的高滴度的抗体(大约100,000)。重要的是，全部均诱导针对p145的高滴度(>10,000)，其中J8iV3-DT诱导大约30,000的滴度(图20，右图)。可能的是，新肽针对自身的滴度高于针对p145的滴度，因为p145含有新肽中不存在的其它氨基酸，并且这些中的一些可能掩盖了被针对新变体的抗血清所识别的表位。然而，变体J8肽针对自身的高滴度(大约100,000)是显著的，因为它们专有地来源于链球菌序列。因此，新变体诱导100,000的滴度，其中所有抗体均识别链球菌序列，然而，J8诱导大约2,000的链球菌滴度。
使用肽抑制分析进一步评估S2的免疫优势。将针对recSpyCEP和各表位的抗血清与各免疫抗原预孵育，在此之后，分析它们与抗原的结合。与自体肽预孵育之后，表位抗血清与固定化的自体肽的结合被大大减弱(40-80％的抑制)(图21A)。表位抗血清与recSpyCEP的预孵育还导致固定化自体肽的识别的抑制，其中当将针对S2-DT的抗血清与recSpyCEP孵育时，观察到最高抑制(图21B)，这指示被S2-DT免疫所识别的表位呈现在recSpyCEP的表面。而且，当将针对SpyCEP的抗血清与6种肽中的每一种孵育时，我们观察到肽S2(SEQ ID NO:18)最大程度地抑制结合，并且可以与由recSpyCEP引起的抑制相当(图21C)。这些数据表示，以ELISA的方式，对SpyCEP的免疫应答主要由S2(SEQ ID NO:18)的抗体识别来限定，并且S2(SEQ ID NO:18)可以引发与针对整个recSpyCEP的免疫应答相似的免疫应答。因此，S2(SEQ ID NO:18)是SpyCEP的免疫优势表位。
然后，我们测试了SpyCEP和表位抗血清与各种GAS菌株的结合功效。SpyCEP在GAS的表面表达并且脱落(shed)。为了估计对天然抗原的识别，使用FACS分析来比较不同的表位特异性抗体与各种GAS菌株的结合。将GAS菌株5448与其动物传代的衍生物5448AP(已知高水平表达SpyCEP的CovR/S突变体)一起使用。类似地，将野生型BSA10与其动物传代的衍生物pBSA10(也是CovR/S突变体)并行使用。还包括参照菌株2031(emm1)和澳大利亚北部地区的皮肤分离物88/30。我们的数据表明，在所有的情况下，由recSpyCEP疫苗接种诱导的抗体与GAS分离物的结合可与由S2-DT免疫诱导的抗体与GAS分离物的结合相比较。针对其它表位的抗体显示可变水平的与GAS的结合(图22A、B和C)。此外，如通过平均荧光强度(MFI)数据所测量的，发现在所有测试菌株中，SpyCEP以及S2的表面表达最高(数据未显示)。这些数据证实了天然SpyCEP上的S2表位的免疫优势。然而，数据未表明，针对S2表位的抗体将功能性地损害SpyCEP的CXC趋化因子蛋白酶。
然后，我们询问S2-DT是否可以增强J8-DT疫苗的功效。我们之前已经证明，recSpyCEP与J8-DT的组合导致比单独的J8-DT或单独的recSpyCEP显著更好地针对GAS的CovR/S突变株的侵入性感染的保护(提交的手稿)。将J8-DT和recSpyCEP或S2-DT以1:1的重量比混合，并且在我们最新开发的皮肤激发模型中进行测试(提交的手稿)。用各抗原或PBS疫苗接种对照小鼠。疫苗接种后，用5448AP GAS激发小鼠。用J8-DT+S2-DT进行的疫苗接种导致5448AP感染的小鼠的皮肤以及血液中的细菌生物负载显著减少(图23A和B)。还发现由J8-DT+S2-DT疫苗接种所提供的保护水平与J8-DT+SpyCEP疫苗接种所提供的保护水平相当。为了确认这些发现，用另一CovR/S突变株NS88.2重复激发实验(图24A和B)。再一次，我们发现，与单独的J8-DT相比，用J8-DT+SpyCEP或J8-DT+S2-DT进行的疫苗接种导致显著增强的保护功效。与PBS对照相比，单独用J8-DT或SpyCEP疫苗接种不能提供任何保护。
结论
嗜中性粒细胞的活性似乎是用J8肽进行的疫苗接种的功效的关键因素。SpyCEP是由有毒的GAS细菌(如具有CovR/S突变的那些细菌)高表达的IL-8降解蛋白酶。与单独的J8肽或SpyCEP相比，用J8肽和rSpyCEP的组合进行的免疫对由CovR/S GAS突变体5448AP导致的GAS感染具有协同作用。同样明显的是，抗SpyCEP抗体可以有效地中和SpyCEP的IL-8降解活性，从而为既有的GAS感染提供治疗干预。而且，我们已鉴定了SpyCEP上可以诱导功能性抗体的优势表位(SEQ ID NO:18)。我们当前正在计划用GAS激发进行主动和被动疫苗研究。该表位的优势是，其能够使我们在疫苗中避免使用完整重组SpyCEP蛋白，从而改善了安全性特征。我们相信，最佳的疫苗是J8和该表位的混合物。在该预测的确认中，相比于单独的J8-DT，用J8-DT+SpyCEP或J8-DT+S2-DT进行的疫苗接种导致显著增强的保护功效。而且，已开发了针对它们自身和链球菌的肽p145，诱导高的滴度的变体J8肽，大概是因为它们专有地来源于链球菌p145的氨基酸序列。
在整个说明书中，目标是描述本发明的优选实施方案，而不将本发明限于任一实施方案或者特征的具体集合中。在不脱离本发明的广泛精神和范围的情况下，可以对本文所描述和示例的实施方案作出各种改变和修改。
将本文提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献通过引用整体并入本文。
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Figure IDA0001196661180000021
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Claims (21)

1.M蛋白的片段以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质在制备用于在哺乳动物中引发对A群链球菌细菌的免疫应答的药物中的用途，
其中所述M蛋白的片段是J8变体肽，所述J8变体肽由选自以下的氨基酸序列组成：SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQ ID NO:59)；SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQ IDNO:60)；SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:61)；以及SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:62)；
其中所述促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是SpyCEP蛋白的片段或其抗体，所述SpyCEP蛋白的片段由以下氨基酸序列组成:NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)。
2.M蛋白的片段以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质在制备用于使哺乳动物对A群链球菌细菌免疫的药物中的用途，
其中所述M蛋白的片段是J8变体肽，所述J8变体肽由选自以下的氨基酸序列组成：SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQ ID NO:59)；SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQ IDNO:60)；SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:61)；以及SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:62)；
其中所述促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是SpyCEP蛋白的片段或其抗体，所述SpyCEP蛋白的片段由以下氨基酸序列组成:NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)。
3.M蛋白的片段，或者它的抗体或抗体片段；以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质在制备用于治疗或预防哺乳动物中的A群链球菌细菌感染的药物中的用途，
其中所述M蛋白的片段是J8变体肽，所述J8变体肽由选自以下的氨基酸序列组成：SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQ ID NO:59)；SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQ IDNO:60)；SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:61)；以及SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:62)；
其中所述促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是SpyCEP蛋白的片段或其抗体，所述SpyCEP蛋白的片段由以下氨基酸序列组成:NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其包括编码M蛋白的片段以及编码促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质的一种或多种分离的核酸，或者包含所述一种或多种分离的核酸的组合物。
5.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是SpyCEP蛋白的片段，所述SpyCEP蛋白的片段直接或间接地抑制或阻抑嗜中性粒细胞或嗜中性粒细胞活性。
6.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是SpyCEP蛋白的片段的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段与直接或间接地抑制或阻抑嗜中性粒细胞或嗜中性粒细胞活性的蛋白或其片段结合。
7.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述嗜中性粒细胞活性为嗜中性粒细胞的趋化性。
8.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述SpyCEP蛋白或其片段是使白介素8蛋白水解失活的蛋白酶或其片段。
9.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
10.组合物，其包含M蛋白的片段，或者它的抗体或抗体片段；以及促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质，
其中所述M蛋白的片段是J8变体肽，所述J8变体肽由选自以下的氨基酸序列组成：SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQ ID NO:59)；SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQ IDNO:60)；SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:61)；以及SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:62)；
其中所述促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是SpyCEP蛋白的片段或其抗体，所述SpyCEP蛋白的片段由以下氨基酸序列组成:NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)。
11.如权利要求10所述的组合物，其包含编码所述M蛋白的片段以及编码所述促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质的一种或多种分离的核酸，或者包含所述一种或多种分离的核酸的组合。
12.如权利要求10或11所述的组合物，其中所述促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是SpyCEP蛋白的片段，所述SpyCEP蛋白的片段直接或间接地抑制或阻抑嗜中性粒细胞或嗜中性粒细胞活性。
13.如权利要求10或11所述的组合物，其中所述促进恢复或增强嗜中性粒细胞活性的物质是SpyCEP蛋白的片段的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段与直接或间接地抑制或阻抑嗜中性粒细胞或嗜中性粒细胞活性的蛋白或其片段结合。
14.如权利要求10或11所述的组合物，其中所述嗜中性粒细胞活性为嗜中性粒细胞的趋化性。
15.如权利要求10或11所述的组合物，其中所述SpyCEP蛋白或其片段是使白介素8蛋白水解失活的蛋白酶或其片段。
16.分离的肽，所述分离的肽由以下氨基酸序列组成：NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ IDNO:18)。
17.抗体或抗体片段，其与权利要求16所述的分离的肽结合，或者由权利要求16所述的分离的肽诱发。
18.分离的核酸，其编码权利要求16所述的分离的肽。
19.遗传构建体，其包含权利要求18所述的分离的核酸。
20.宿主细胞，其包含权利要求19所述的遗传构建体。
21.组合物，其包含权利要求16所述的分离的肽；和/或一种或多种权利要求17所述的抗体或抗体片段；和/或权利要求18所述的分离的核酸；和/或权利要求19所述的遗传构建体；和/或权利要求20所述的宿主细胞。
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