KR20210010882A

KR20210010882A - 연쇄구균 독성 쇼크 증후군

Info

Publication number: KR20210010882A
Application number: KR1020207035598A
Authority: KR
Inventors: 마이클 굿; 마니샤 판데이
Original assignee: 그리피스 유니버시티
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2021-01-28
Also published as: CA3100212A1; CN112449603A; MX2020012245A; AU2019268417A1; SG11202011348YA; BR112020023128A2; JP2021523908A; EP3806896A4; EP3806896A1; WO2019218022A1; US20210292398A1

Abstract

본원에서는 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체 또는 이들에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편 및 임의적으로 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체 또는 이들에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 투여하여 대상에서 연쇄구균 독성 쇼크 증후군에 대해 면역화하거나, 이를 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

Description

연쇄구균 독성 쇼크 증후군

본 발명은 A 군 연쇄구균으로 인한 질병의 예방 및 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 A 군 연쇄구균 관련 독성 쇼크 증후군을 치료 또는 예방하기 위한 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.

A 군 연쇄구균 (Streptococcus pyogenes, GAS) 감염은 전 사회 부문에서 매우 널리 퍼져 있으며 6 억 건 이상의 연쇄구균 인두염 사건 사례와 1 억 6 천만 건 이상의 연쇄구균 농피증 만연 사례가 추정된다. 대부분의 경우는 양성이며 항생제와 기본적인 건강 관리로 성공적으로 치료할 수 있다. 그러나, 연쇄구균 질병은 인후와 피부를 넘어 진행되어 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)을 포함한 침습성 GAS ('iGAS') 질병을 유발할 수 있다. 또한, 치료되지 않은 감염은 류마티스성 심장질환 및 사구체 신염을 비롯한 연쇄구균 후 후유증을 유발할 수 있다. iGAS 질병과 연쇄구균 후 후유증은 특히 원주민 및 토레스 해협 섬 주민 인구와 전 세계적으로 사회적으로 불리한 환경에 처한 인구에 만연해 있다.

전 세계적으로 이들 상태는 연간 500,000 명 이상의 생명을 잃는 원인이 된다. 낮춰잡은 추정치로 현재 GAS를 전 세계적으로 감염 관련 사망의 (HIV, 결핵 및 폐렴 구균에 이어) 네 번째로 가장 흔한 원인으로 잡고 있다. 이 숫자는 선진국과 저개발국 모두에서 iGAS 질병이 최근 유행하고 있어 '빙산의 일각'으로 간주된다.

STSS는 주로 인간 MHC II 분자 (펩티드 결합 그루브 외부) 및 T-세포 수용체 가변 쇄에 비특이적으로 결합하는 초항원 독소에 의해 발생하여 종종 CD4+ T-세포의 >20%가 활성화되어 폴리클로날성 T-세포 활성화로 이어진다. 이로 인해 저혈압 및 다기관 부전 (간, 신장, 응고 시스템 및 호흡기 시스템 포함)의 원인의 인과 관계로 제기되는 Th1 사이토카인 폭풍이 발생한다.

마우스 모델에서 초항원 매개 사망률에 T 세포가 필요하다는 것이 밝혀졌다. 포도상구균 초항원 (SEB)을 사용한 모델에서, 항-TNF 전처리가 독성 쇼크의 치사율을 차단할 수 있음이 밝혀졌다 [2]. STSS는 사망률이 매우 높고 심지어는 고소득 국가에서도 50%를 초과할 수 있다. 이 상태는 연쇄구균 감염 후에 발생할 수 있지만 가장 흔하게는 피부 감염 후 발생한다. 보통은 괴사성 근막염, 근염 또는 깊은 타박상과 관련이 있다. 수두, 봉와직염 및 직접적인 피부 천자가 중요한 보조 요인일 수 있다.

초항원 (SAgs)은 모든 병원성 GAS 및 황색포도상구균 균주에 의해 분비되는 저 분자량 엑소-단백질이다. GAS에는 11 개의 혈청학적으로 상이한 초항원이 있다. 11 개 중 9 개는 박테리오파지에 존재하는 유전자에 있다. 이들은 일차 T 세포를 활성화할 수 있으며 항원 처리를 필요로 하지 않는다. 초항원은 인간 MHC II β 쇄에 대해 높은 친화성 결합과 TCR β 쇄에 대해 상대적으로 낮은 친화성 결합을 입증하였다. 마우스 MHC에 대한 초항원의 친화성은 인간 MHC에 대한 것보다 몇 배 더 낮기 때문에 [3], 정상 마우스는 초항원-매개-질병 연구에 적합한 모델이 아니다. GAS에 존재할 수 있는 11 가지 초항원 중 대부분의 STTS 사례는 연쇄구균 발열성 외독소 (Spe) A 또는 SpeC 중 하나에 의해 발생한다 [4].

STTS 예방을 위한 백신 개발 노력은 제한적이다. 한 그룹은 SpeA 및 SpeC에 대한 톡소이드를 개발했으며 토끼의 백신접종으로 독소를 중화하고 미니 삼투 펌프를 통해 투여되는 천연 독소로부터 토끼를 보호하는 항체로 이어질 수 있음을 보여주었다. 토끼는 연쇄구균 감염에 노출되지 않았다 [4, 5]. 이 백신 접근법은 연쇄구균 질병의 한 측면만을 보호하기 위해 여러 톡소이드로 백신접종을 해야만 한다.

HLA 유전자이식 마우스가 황색포도상구균 유래 초항원의 정의된 무독성 초항원 단편을 사용하여 후보 백신을 개발하기 위한 모델로 사용되었다 [3]. 이들 마우스는 유기체가 아니라 재조합 초항원으로 챌린지되었다.

수동 면역요법이 STSS를 치료하기 위한 수단으로 연구되었다. 정맥 내 면역글로불린 (IVIG)은 STSS의 치사율 사례를 상당히 감소시키는 것으로 나타났다 [6]. 이 연구는 과거 대조군을 사용했지만 전향적 대조군이 있는 67 명의 질환자를 대상으로 한 보다 최근의 스웨덴 연구에서 사망률은 항생제 단독 치료를 받은 44 명의 질환자에서 22 명 (50%), IVIG와 항생제로 치료된 그룹에서 23 명 중 사망률이 3 명 (13%)이었다. (P<0.01) [7]. 그러나 IVIG에서 >40의 초항원 항체 역가가 임상적 혜택을 위해 필요한 것으로 추정되고 있다. 이것은 IVIG에서 발견되는 특이 항체의 대략적인 양이며 따라서 IVIG의 다중 용량이 권장된다. IVIG의 높은 비용, 배치 간 변동 [8] 및 공급 어려움이 대체 보조 요법의 필요성을 분명히 한다.

요약

놀랍게도, 본 발명자들은 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질 단편 또는 이의 변이체에 결합하는 항체 또는 항체 단편이 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단편 또는 이의 변이체에 결합하는 항체 또는 항체 단편의 존재 또는 부재하에 연쇄구균 독성 쇼크 증후군과 같은 A 군 스트렙토코쿠스-관련 질병, 장애 또는 상태에 대해 놀라울 정도의 효능이 있음을 발견하였다.

따라서 본 발명은 광범위한 형태로 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)을 포함한 침습 GAS (iGAS) 질병과 같은 A 군 연쇄구균 관련 질병 장애 또는 상태에 대해 수동적 면역화거나, 이를 치료하거나 예방하기 위한, A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하는 항체 또는 항체 단편 및 임의적으로 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 이의 유도체에 결합하는 항체 또는 항체 단편의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 광범위한 형태로 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)을 포함한 침습성 GAS (iGAS) 질병과 같은 A 군 연쇄구균 관련 질병 장애 또는 상태에 대해 백신접종하거나, 면역화거나, 이를 치료하거나 예방하기 위한, A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체 및 임의적으로 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 한 측면은 연쇄구균 독성 쇼크 증후군에 대해 포유동물을 수동 면역화하는 방법을 제공하며, 이 방법은 포유동물에게 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 투여하여 포유동물에서 연쇄구균 독성 쇼크 증후군을 수동적으로 면역화하는 단계를 포함한다.

전술한 측면의 한 특정 실시양태에서, 방법은 A 군 스트렙토코쿠스 초항원에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 포유동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 포유동물에서 연쇄구균 독성 쇼크 증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 포유동물에게 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체 및/또는 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 투여하여 포유동물에서 연쇄구균 독성 쇼크 증후군을 치료하거나 예방하는 단계를 포함한다.

전술한 측면의 한 특정 실시양태에서, 방법은 포유동물에게 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체 및/또는 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 추가 측면은 포유동물에게 투여하기에 적합한 조성물을 제공하며, 이 조성물은 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

본 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 추가로 포함한다.

전술한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 적합하게는 모노클로날 항체 또는 항체 단편이다. 전술한 측면의 한 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 재조합 인간화 모노클로날 항체 또는 이의 단편이다.

관련 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 투여하기에 적합한 조성물에 관한 것이며, 이 조성물은 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체 및 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다.

본 발명의 추가 관련 측면은 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대한 모노클로날 항체 또는 이의 단편; 및/또는 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 제공한다.

바람직하게는, 모노클로날 항체 또는 단편은 재조합 인간화 모노클로날 항체 또는 이의 단편이다.

이 측면은 또한 재조합 인간화 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 단리된 핵산, 상기 단리된 핵산을 포함하는 유전자 작제물 및/또는 유전자 작제물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

전술한 측면의 특정 실시양태에서, M 단백질 단편은 M 단백질의 보존된 영역이거나 이를 포함한다. 한 실시양태에서, M 단백질 단편은 p145 펩티드이거나, 이를 포함하거나, 그 안에 함유된다.

하나의 특정 실시양태에서, M 단백질 단편은 J8 펩티드, 이의 단편, 변이체 또는 유도체이거나, 그 안에 함유되거나, 이를 포함한다.

또 다른 특정 실시양태에서, 단편은 p17 펩티드, 이의 단편, 변이체 또는 유도체이거나 그 안에 함유되거나, 이를 포함한다.

전술한 측면의 또 다른 특정 실시양태에서, 초항원은 연쇄구균 발열성 외독소 (Spe) A 또는 SpeC이다.

적합하게는, 전술한 측면에 따르면 포유동물은 인간이다.

본원에서 사용되는, 부정관사 'a' 및 'an'은 단수 또는 복수의 요소 또는 특징을 나타내거나 포함하기 위해 사용되며, "하나 (one)" 또는 "단일 (single)" 요소 또는 특징을 의미하거나 또는 정의하는 것으로 간주되어서는 안된다.

문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함한다 (comprise)", "포함하다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)", 또는 유사 용어들은, 요소 또는 특징의 열거 목록이 명시 또는 열거된 요소만을 포함하는 것이 아니라, 명시 또는 열거되지 않은 다른 요소 또는 특징도 포함할 수 있는, 비배타적 포함 (non-exclusive inclusion)을 의미한다.

아미노산 서열과 관련하여 "필수적으로 구성되는 (consisting essentially of)"이라 함은 열거된 아미노산 서열과 N-말단 또는 C-말단에서 추가의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산을 함께 갖는 것을 의미한다.

도 1: (A-B) HLA-B6 마우스에서 GAS SN1의 감염성. 나이브 HLA-B6 및 B6 마우스 (n=10/그룹)가 피부를 통해 GAS SN1로 감염되었다. 감염 후 6 일째에 마우스를 희생시키고 피부 박테리아 부하를 평가하였다 (A). 감염 후 3, 4, 5 및 6 일에 혈액 샘플을 플레이팅하여 전신 감염의 존재를 평가하였다 (B) ^***p <0.001. (CD). SN1 감염 마우스 유래 혈청의 웨스턴 블롯 분석. SN1 감염 BALB/c (C) 및 SN1 및 NS33 (초항원을 발현하지 않는 C 군 연쇄구균) 감염 HLA-B6 및 B6 마우스 (D)에서 수집된 혈청 샘플을 분석하여 혈청 중 SpeC의 존재를 검출하였다. 샘플을 4-15% SDS-PAGE 겔에서 실행시켰다. 겔에서 단백질 전달 후, 막을 일차 항체인 토끼 항-SpeC IgG로 프로브한 뒤, 양 항-토끼 IgG-AP로 검출하고 BCIP/NBT 기질을 사용하여 전개하였다. SN1 감염 마우스의 혈청 샘플에서 ~26 KDa의 밴드는 양성 대조군 샘플의 rSpeC에 해당한다.
도 2: (A) 뮤린 모델에서 SpeC의 유사분열촉진 활성. SN1 SpeC에 대한 반응으로 비장 세포 증식. HLA-B6 및 B6 마우스 유래 비장 세포를 SN1 GAS에 감염된 마우스의 멸균 여과된 SpeC 함유 혈청 또는 rSpeC를 사용하여 시험관 내에서 자극하였다. 대조군으로, 초항원 음성 GAS 균주 (NS33) 및 ConA로 감염된 마우스의 멸균 여과된 혈청을 포함시켰다. 비장 세포의 증식을 72 시간 후 평가하고 데이터를 자극 지수 (SI)로 표시하였다. 혈청 및 rSpeC에 대한 반응으로 비장 세포의 증식을 억제하는 항 rSpeC 항체를 첨가하여 반응 특이성을 확인하였다. (B-C). 비장 세포 증식에 따른 사이토카인 프로파일. HLA-B6 및 B6 마우스의 비장 세포에서 사이토카인 반응을 다양한 자극제와 함께 인큐베이션한 후 72 시간에 측정하였다. 배양 상등액 중 TNF (B) 및 IFN-γ (C)의 농도를 CBA 키트를 사용하여 측정하였다. 항-rSpeC 항체를 첨가하여 반응 특이성을 확인하였다. 터키 사후 검정 (Tukey's post-hoc) 방법과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 다양한 그룹 간의 유의성을 계산하였다. ^*p<0.05 및 ^**p<0.01.
SI는 항원 존재시 분당 카운트/항원 부재시 분당 카운트로 정의되었다.
도 3. (A). GAS SN1 감염에 대한 J8-DT의 보호 효능. HLA-B6 마우스를 0 일, 21 일 및 28 일에 J8-DT 또는 PBS로 백신접종하였다. 면역화 2 주 후 마우스를 피부를 통해 GAS SN1로 감염시켰다. 감염 후 6 일째에 마우스를 희생시키고 피부 (CFU/병변), 혈액 (cfu/mL) 및 비장 (CFU/비장)에서 박테리아 부하를 나타내었다. (B). 혈청에서 독소를 검출하기 위한 웨스턴 블롯 분석. SN1 감염 후 6 일째에 수집된 백신 및 대조군 코호트로부터의 풀링된 혈청 샘플을 4-15% SDS-PAGE 겔에서 실행시켰다. 겔로부터의 단백질 전달 후, 막을 토끼 항-SpeC IgG로 프로브한 후 양 항-토끼 IgG-AP로 검출하고 BCIP/NBT 기질을 사용하여 전개하였다. PBS 마우스의 혈청 샘플에서 26 KDa의 밴드는 양성 대조군 샘플의 rSpeC에 해당한다. (C-D). 백신접종된 감염된 마우스로부터의 혈청에 의해 유도된 증식 평가. 두마리 다른 개체로부터의 PBMC를 SN1 감염-백신접종 (J8-DT+SN1) 또는 백신접종되지 않은 대조군 (PBS+SN1) 마우스로부터의 사전 최적화된 농도의 혈청으로 자극하였다. PHA 및 rSpeC를 자극을 위한 대조군으로 사용하였다. 다양한 양의 rSpeC 항혈청을 첨가하여 반응 특이성을 평가하였다. 나이브 혈청의 존재하에 PBMC를 중화 특이성에 대한 대조군으로 사용하였다. 증식을 72 시간 후 [³H] 티미딘 흡수로 측정하였다. 데이터는 각 실험에서 3 중복물의 평균±SEM이며 실험은 2 회 반복되었다. 두 개체의 대표 데이터가 표시된다. 터키 사후 검정 방법과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 유의성을 계산하였다. ^*p <0.05, ^**p <0.01 및 ^***p <0.001.
도 4. (A-C). rSpeC 항혈청에 의한 rSpeC의 중화. 다양한 양의 rSpeC 항혈청의 존재 또는 혈청 부재하에 세마리 다른 개체의 PBMC를 서로 다른 농도의 rSpeC로 자극하였다. PHA를 대조군으로 사용하였다. 증식을 72 시간 후 [³H] 티미딘 흡수로 측정하였다. 데이터는 각 실험에서 3 중복물의 평균±SEM이며 실험은 2 회 반복되었다. 자극 지수 (SI)는 항원 존재시 분당 카운트/항원 부재시 분당 카운트로 정의되었다. 터키 사후 검정 방법과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 유의성을 계산하였다. ^*p <0.05 및 ^***p <0.001.
도 5. (A) J8-DT 항혈청과 함께 인큐베이션된 GAS를 사용한 챌린지 연구. GAS 2031 (emm1) 균주를 1:50 희석된 J8-DT 항혈청과 함께 4 ℃에서 1 시간 동안 회전하에 인큐베이션하였다. 세척 후 세균 접종물을 SCID 마우스에 복강 내 주사하였다. 48 시간 후, 마우스를 희생시키고 혈액을 수확하였다. 개별 마우스에서의 박테리아 부하가 표시된다. (B) rSpeC 항혈청에 의한 SpeC의 생체 내 중화. SN1 감염 BALB/c 마우스를 감염 후 5 일에 항-rSpeC 또는 나이브 혈청을 복강 내로 투여하였다. 생체 내 SpeC 중화를 평가하기 위해, 혈청 샘플을 항혈청 투여 전 (0 시간) 및 투여 후 6 시간 및 24 시간에 수집하였다. 다양한 시점에서 마우스 혈청에서의 SpeC의 존재가 표시된다. (C) 피부 세균 부하에 대한 rSpeC 항혈청 치료의 효과. SN1 감염 BALB/c 마우스를 감염 후 5 일에 항-rSpeC 또는 나이브 혈청을 복강 내로 투여하였다. 처리 후 24 시간에 마우스를 희생시키고 박테리아 부하를 평가하였다. 처리된 마우스와 처리되지 않은 마우스에 대한 피부의 박테리아 부하가 표시된다. 두 그룹을 비교하기 위해 비모수, 비대응 맨-휘트니 (unpaired Mann-Whitney) U-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. ^**p <0.01.
도 6. (A-B) 뮤린 피부 감염 모델에서 인간 단리물의 독성. BALB/c 마우스의 코호트를 피부 감염 경로를 통해 GAS SN1 또는 GAS NS33 균주로 감염시켰다. 챌린지 3, 6 또는 9 일 후, 마우스를 희생시키고 피부 생검 (A) 및 비장 (B) 샘플을 수집하여 박테리아 부하를 결정하였다. 결과를 박스 및 휘스커 플롯으로 나타내었는데, 여기서 박스 내 선은 중앙값을 나타내고, 박스 끝은 상한 및 하한 사분위수를 표시하고 휘스커는 최소값에서 최대값을 나타낸다. (C) 6 일차 수집으로부터 개별 마우스 혈청 샘플에서 SpeC 검출. SN1/NS33 감염 후 6 일째에 각각의 개별 마우스로부터의 혈청 샘플을 또한 기술된 바와 같이 SpeC의 존재에 대해 평가하였다. 대표 이미지가 표시된다. ^*는 양성 비장 배양물을 가지는 마우스를 나타낸다. 각 시점에서 두 그룹을 비교하기 위해 비모수, 비대응 맨-휘트니 U-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. ^**p <0.01 및^***p <0.001.
도 7. (A) 뮤린 모델에서 SpeC의 유사분열촉진 활성. SN1 SpeC에 대한 반응으로 비장 세포 증식. HLA-B6 및 B6 마우스의 비장 세포를 SN1 GAS 감염 마우스의 멸균 여과된 SpeC 함유 혈청 또는 rSpeC로 시험관 내에서 자극하였다. 대조군으로 초항원 음성 GAS 균주 (NS33) 및 ConA로 감염된 마우스의 멸균 여과된 혈청을 포함시켰다. 72 시간 후 비장 세포의 증식을 평가하고 데이터를 자극 지수 (SI)로 표시하였다. 혈청 및 rSpeC에 대한 반응으로 비장 세포의 증식을 억제하는 항 rSpeC 항체를 첨가하여 반응 특이성을 확인하였다. (B-C). 비장 세포 증식에 따른 사이토카인 프로파일. HLA-B6 및 B6 마우스로부터의 비장 세포에서 사이토카인 반응을 다양한 자극제와 함께 인큐베이션한 후 72 시간에 측정하였다. 배양 상등액 중 TNF (B) 및 IFN-γ (C)의 농도를 CBA 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 측정하였다. 항-rSpeC 항체를 첨가하여 반응 특이성을 확인하였다. 터키 사후 검정 방법과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 다양한 그룹 간 유의성을 계산하였다. ^*p <0.05 및 ^**p <0.01. SI는 항원 존재시 분당 카운트/항원 부재시 분당 카운트로 정의되었다. (D-F). GAS SN1 또는 GAS NS33 감염 마우스의 혈청 자극에 대한 인간 PBMC의 증식. 세마리 다른 개체로부터의 PBMC를 GAS SN1 또는 GAS NS33으로 감염 후 다양한 시점에서 수집된 혈청의 존재하에 배양하였다. 72 시간 후 [³H] 티미딘 흡수로 증식을 측정하였다. 데이터는 각 실험에서 3 중복물의 평균±SEM이며 실험은 2 회 반복되었다.
도 8. (A-B). HLA-B6 마우스에서 GAS SN1의 생체 내 감염성. 나이브 HLA-B6 및 B6 마우스 (n=10/그룹)를 복강 내 GAS 감염 경로를 통해 GAS SN1로 감염시켰다. 마우스에 10⁶, 10⁷또는 10⁸ CFU의 SN1을 투여하였다. 감염 후 24 시간에 마우스를 임상 증상에 대해 점수를 매겨 질병의 중증도를 평가하였다. HLA-B6 및 B6 마우스 모두에 대한 임상 점수가 표시된다. (B) 점수를 매긴 후 마우스를 희생시키고 혈액 및 비장에서의 박테리아 부하를 평가하였다. 결과를 박스 및 휘스커 플롯으로 나타내었는데, 여기서 박스 내 선은 중앙값을 나타내고, 박스 끝은 상한 및 하한 사분위수를 표시하고 휘스커는 최소값에서 최대값을 나타낸다. 터키 사후 방법과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 대조군과 시험 그룹 간의 유의성을 계산하였다. (C) SN1 감염 HLA-B6 및 B6 마우스로부터의 혈청에 대한 웨스턴 블롯 분석. SN1 감염 마우스에서 수집한 혈청 샘플을 분석하여 혈청에서 독소를 검출하였다. 샘플을 4-15% SDS-PAGE 겔에서 실행시켰다. 겔에서 단백질 전달 후, 막을 일차 항체인 토끼 항-SpeC IgG로 프로브한 후, 양 항-토끼 IgG-AP로 검출하고 BCIP/NBT 기질을 사용하여 전개하였다. rSpeC 단백질을 양성 대조군으로 실행시켰다. (D-F) SN1로 복막 내 감염 후 HLA-B6 마우스의 혈청 사이토카인 프로파일. SN1로 감염된 마우스를 감염 후 24 시간에 희생시켰다. CBA 키트를 사용하여 SN1의 최고 용량 (1×10⁸ CFU)이 투여된 코호트로부터 수집한 혈액 샘플에서 혈액 사이토카인 수준을 측정하였다. TNF, IFN-γ 및 IL-2 반응이 표시된다. 터키 사후 검정 방법과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 다양한 그룹 간의 유의성을 계산하였다. ^*p <0.05 및^**p <0.01. SI는 항원 존재시 분당 카운트/항원 부재시 분당 카운트로 정의되었다.
도 9. (A-B). HLA-B6 마우스에서 GAS SN1의 감염성. 나이브 HLA-B6 및 B6 마우스 (n=10/그룹)를 피부를 통해 GAS SN1 또는 GAS NS33으로 감염시켰다. 감염 후 6 일째에 마우스를 희생시키고 피부 박테리아 부하를 평가하였다 (A). 감염 후 3 일, 4 일, 5 일 및 6 일에 혈액 샘플을 플레이팅하여 전신 감염의 존재를 평가하였다 (B). 결과를 박스 및 휘스커 플롯으로 나타내었는데, 여기서 박스 내 선은 중앙값을 나타내고, 박스 끝은 상한 및 하한 사분위수를 표시하고 휘스커는 최소값에서 최대값을 나타낸다. (C) SN1 또는 NS33 감염 마우스로부터의 혈청에 대한 웨스턴 블롯 분석. SN1 또는 NS33 감염 HLA-B6 및 B6 마우스에서 수집한 혈청 샘플을 분석하여 혈청에서 SpeC의 존재를 검출하였다. 샘플을 4-15% SDS-PAGE 겔에서 실행시켰다. 겔에서 단백질 전달 후, 막을 일차 항체인 토끼 항-SpeC IgG로 프로브한 후 양 항-토끼 IgG-AP로 검출하고 BCIP/NBT 기질을 사용하여 전개하였다. SN1 감염 마우스로부터의 혈청 샘플에서 26 KDa의 밴드는 양성 대조군 샘플의 rSpeC에 해당한다. (D-F). 피부 감염 후 HLA-B6 및 B6 마우스의 혈청에서 사이토카인 반응. HLA-B6 및 B6 마우스로부터의 혈청에서 사이토카인 반응을 SN1 또는 NS33으로 감염 후 6 일째에 측정하였다. TNF (C), IFN-γ (D) 및 IL-2의 농도를 CBA 키트를 사용하여 측정하였다. 터키 사후 검정 방법과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 다양한 그룹 간의 유의성을 계산하였다.^***p <0.001.
도 10. (A). GAS SN1 감염에 대한 J8-DT의 보호 효능. HLA-B6 마우스를 0, 21 및 28 일에 J8-DT 또는 PBS로 백신접종하였다. 면역화 2 주 후 마우스를 피부를 통해 GAS SN1로 감염시켰다. 감염 후 6 일째에 마우스를 희생시키고 피부 (CFU/병변), 혈액 (cfu/mL) 및 비장 (CFU/비장)에서 박테리아 부하를 표시하였다. (B). 혈청에서 독소를 검출하기 위한 웨스턴 블롯 분석. SN1 감염 후 6 일째에 수집된 백신 및 대조군 코호트로부터의 풀링된 혈청 샘플을 4-15% SDS-PAGE 겔에서 실행시켰다. 겔로부터의 단백질 전달 후, 막을 토끼 항-SpeC IgG로 프로브한 후 양 항-토끼 IgG-AP로 검출하고 BCIP/NBT 기질을 사용하여 전개하였다. PBS 마우스의 혈청 샘플에서 26KDa의 밴드는 양성 대조군 샘플의 rSpeC에 해당한다. (C-D). 피부 감염 후 HLA-B6 마우스의 혈청에서 사이토카인 반응. 백신접종된 마우스 및 대조군 HLA-B6 마우스로부터의 혈청에서 사이토카인 반응을 SN1로 감염 후 6 일에 측정하였다. IL-4 및 IL-10 (C) 및 TNF 및 IFN-γ (D)의 농도를 CBA 키트를 사용하여 측정하였다. 터키 사후 검정 방법과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 다양한 그룹 간의 유의성을 계산하였다.^***p <0.001. (E-G). 백신접종/대조군 감염 마우스로부터의 혈청에 의해 유도된 증식 평가. 3 마리 다른 개체로부터의 PBMC를 백신접종된 SN1 감염 (J8-DT+SN1) 또는 백신접종되지 않은 SN1 감염 (PBS + SN1) 마우스로부터의 사전 최적화된 농도의 혈청으로 자극하였다. PHA 및 rSpeC를 자극을 위한 대조군으로 사용하였다. 다양한 양의 rSpeC 항혈청을 첨가하여 반응 특이성을 평가하였다. 나이브 혈청의 존재하에 PBMC를 중화의 특이성에 대한 대조군으로 사용하였다. 72 시간 후 [³H] 티미딘 흡수로 증식을 측정하였다. 데이터는 각 실험에서 3 중복물의 평균±SEM이며 실험은 2 회 반복되었다. 두 개체의 대표 데이터가 표시된다. 터키 사후 검정 방법과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 유의성을 계산하였다. ^*p <0.05, ^**p <0.01 및 ^***p <0.001.
도 11. 백신접종 및 대조군 혈청으로 자극 후 PBMC의 사이토카인 반응. 세 마리 다른 개체로부터의 PBMC를 백신접종된 SN1 감염 또는 대조군 SN1 감염 마우스의 사전 최적화된 농도의 혈청으로 자극하였다. 최적 농도의 rSpeC 및 PHA를 자극을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 사전 최적화된 양 (20 μL)의 rSpeC 항혈청을 백신접종된 SN1 감염 또는 대조군-SN1 감염된 혈청 또는 rSpeC를 포함하는 선택된 웰에 첨가하여 rSpeC 항혈청의 억제 효과를 평가하였다. 배지 단독 웰을 음성 대조군으로 사용하였다. 72 시간의 시험관 내 배양 후 CBA 키트를 사용하여 사이토카인 반응을 측정하였다. 데이터는 각 실험에서 3 중복물의 평균±SEM이며 실험은 2 회 반복되었다. 두 그룹을 비교하기 위해 비모수, 비대응 맨-휘트니 U-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. ^*p <0.05, ^**p <0.01 및 ^***p <0.001.
도 12. (A) rSpeC 항혈청에 의한 SpeC의 생체 내 중화. HLA-B6 마우스를 피부를 통해 GAS SN1로 감염시켰다. 감염 후 5 일째에 마우스에게 항-rSpeC 또는 나이브 혈청을 복강 내 투여하였다. 생체 내 SpeC 중화를 평가하기 위해, 항혈청 투여 전 (0 시간) 및 이후 6 시간 및 24 시간에 혈청 샘플을 수집하였다. 다양한 시점에서 처리 및 처리되지 않은 HLA-B6 마우스 혈청에서의 SpeC의 존재가 표시된다. (B) rSpeC 항혈청의 치료 잠재성. rSpeC 항혈청의 치료 가능성을 평가하기 위해, 지정된 수의 마우스를 혈청 투여 후 6 및 24 시간에 희생시켰다. 처리된 마우스와 처리되지 않은 마우스의 피부와 혈액 중의 박테리아 부하가 표시된다. 결과를 박스 및 휘스커 플롯으로 나타내었는데, 여기서 박스 내 선은 중앙값을 나타내고, 박스 끝은 상한 및 하한 사분위수를 표시하고 휘스커는 최소값에서 최대값을 나타낸다. NS p >0.05.
도 13. 조합 면역요법의 치료 잠재성 (A) 및 감염 및 치료 프로토콜의 시간-선 (B) HLA-B6 마우스 (n=3-5/그룹)의 4 개 코호트를 사전 최적화된 용량의 GAS SN1로 복강 내 감염시켰다. 감염 18 시간 후 마우스를 임상 증상에 대해 점수를 매기고, 항-J8-DT, 항-rSpeC, 항-J8-DT와 항-rSpeC의 조합 또는 나이브 혈청 200 μL를 정맥 내 투여하였다. 치료 24 시간 후 (감염 후 42 시간) 마우스를 임상 점수에 대해 평가한 다음 희생시켰다. 혈액 및 비장 샘플을 수확, 처리 및 플레이팅하여 박테리아에 대해 정량화하였다. 마우스의 혈액과 비장 중의 박테리아 부하가 표시된다. (C) 모든 마우스를 치료 전후의 임상 증상에 대해 점수를 매겨 질병 중증도를 평가하였다. 항혈청 처리 전 (0 시간) 및 후 (24 시간) 모든 코호트에 대한 임상 점수가 표시된다. (D-G) 생체 내 SpeC 중화를 평가하기 위해, 모든 코호트의 혈청 샘플을 항혈청 투여 전 (0 시간) 및 24 시간 후 수집하였다. 치료 전후에 J8-DT 항혈청 (D), rSpeC 항혈청 (E) J8-DT+rSpeC 항혈청 (F) 또는 PBS 항혈청 (G) 혈청으로 처리된 HLA-B6 마우스에서 SpeC의 존재가 표시된다. 맨-휘트니 검정을 수행하여 각 그룹을 대조군 PBS 처리 그룹과 비교하였다. ^*p <0.05,^**p <0.01, ^***p <0.001 및 NS p >0.05.
도 14. StrepA 항원 및 다양한 항혈청에 대한 반응으로 비장 세포 증식 및 억제. (A) SN1 감염 혈청에 대한 증식 및 항혈청에 의한 억제 평가. J8-DT, rSpeC, J8-DT+rSpeC 또는 PBS 항혈청의 존재 또는 부재하에 SN1 GAS 감염 마우스로부터의 SpeC 함유 혈청에 대한 반응으로 비장 세포 증식을 평가하였다. (B) rSpeC, rM1 또는 rSpeC+rM1로 자극된 비장 세포를 대조군으로 포함시켰다. 차단제 J8-DT로 rSpeC 또는 J8-DT+rSpeC 항혈청을 사용하였다. 비장 세포의 증식을 72 시간 후 평가하고 데이터를 자극 지수 (SI)로 표시하였다. ^**p <0.01, ^***p <0.001 및 NS p >0.05.
도 15. Sigma의 GenElute 박테리아 gDNA 추출 키트를 사용하여 하룻밤 고정상 배양물에서 게놈 DNA를 추출하였다. Nanodrop1000을 사용하여 gDNA를 정성화한 다음 2 ug의 gDNA를 초항원 증폭에 사용하였다. 그런 다음 이미지 범례에 따라 겔을 실행시켰다.
도 16. 뮤린 혈액에서 GAS 인간 단리물의 시험관 내 성장. GAS 단리물을 1% 네오펩톤과 THB에서 O/N으로 성장시켰다. 각각의 단리물을 10^-6까지 연속 희석시키고, 1:3의 비율로 신선한 헤파린화 뮤린 혈액과 함께 인큐베이션하였다. 37 ℃에서 3 시간 인큐베이션한 후 뮤린 혈액에서의 세균 성장을 측정하고 출발 배양시 CFU 수와 비교하였다. CFU가 20 배 이상 증가한 단리물을 뮤린 모델에서 전신 연쇄구균 감염을 일으킬 가능성이 더 높은 단리물로 정의하였다. 표시된 데이터는 각 분리에 대한 평균±SEM이다.
도 17. GAS NS1 또는 GAS NS33 감염 마우스로부터의 혈청 자극에 대한 반응으로 인간 PBMC의 증식 반응. 세 마리 다른 개체로부터의 PBMC를 GAS SN1 또는 GAS NS33로 감염된 마우스로부터 수집한 상이한 부피의 혈청으로 자극하였다. PHA를 대조군으로 사용하였다. 72 시간 후 [³H] 티미딘 흡수로 증식을 측정하였다. 데이터는 각 실험에서 3 중복물의 평균±SEM이며 실험은 2 회 반복되었다. 터키 사후 검정 방법과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 다양한 그룹 간의 유의성을 계산하였다. ^*p <0.05, ^**p <0.01 및 ^***p <0.001.

상세한 설명

본 발명은 A 군 스트렙토코쿠스 (GAS) 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 이의 유도체에 결합하는 항체 또는 항체 단편이 있거나 없이 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 이의 유도체에 결합하는 항체 또는 항체 단편이 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)을 포함한 침습 GAS (iGAS) 질병과 같은 A 군 연쇄구균 관련 질병 장애 또는 상태에 대해 놀라울 정도의 효능이 있다는 발견에 적어도 부분적으로 전제되어 있다.

본원에 사용된 용어 "A 군 스트렙토코쿠스", "A 군 Strep토콕시", "A 군 연쇄구균", "A 군 Strep" 및 약어 "GAS"는 Streptococcus pyogenes 종의 그람 양성 β-용혈성 박테리아인 랜스필드 (Lancefield) 혈청군 A의 연쇄구균 박테리아를 지칭한다. GAS의 중요한 독성 인자는 M 단백질로 강력한 항식균성이며 혈청 인자 H에 결합하여 C3-전환효소를 파괴하고 C3b에 의한 옵소닌화를 방지한다. 이들은 또한 [Graham et al., 2002, PNAS USA 99 13855]에 기재된 것과 같은 CovR/S 또는 CovRS 돌연변이 등의 악성 "돌연변이"를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

A 군 연쇄구균에 의해 유발되는 질병, 장애 및 상태에는 봉와직염, 단독, 농가진, 성홍열, 급성 인두염 ("패혈성 인두염")과 같은 인후 감염, 균혈증, 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)과 같은 침습성 GAS 질병, 괴사성 근막염, 급성 류마티스 열 및 급성 사구체신염이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 질병 또는 상태는 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)이거나, 이를 포함한다.

"단백질"은 아미노산 중합체를 의미한다. 아미노산은 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 천연 또는 비천연 아미노산, D- 또는 L-아미노산일 수 있다.

용어 "단백질"은 전형적으로 50 개 이하의 아미노산을 갖는 단백질을 서술하는데 사용되는 "펩티드"와, 전형적으로 50 개 초과의 아미노산을 갖는 단백질을 서술하는데 사용되는 "폴리펩티드"를 포함 및 포괄한다.

"단편"은 단백질의 아미노산 서열의 100% 미만으로 이루어진, 단백질의 세그먼트, 도메인, 부분 또는 영역 (예컨대 M 단백질, p145, p17, J8 또는 J14 또는 이에 대항하거나 이에 대한 초항원 또는 항체)이다. 단편은 단일 단편일 수도 있고, 단독으로 또는 다른 단편과 함께 반복될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

일반적으로, 단편은 전장 단백질의 최대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 100, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 또는 1600 개까지의 아미노산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성될 수 있다.

적합하게는, 단편은 "면역원성"이며, 이는 단편이 포유동물에 투여시 항체 반응을 유발할 수 있음을 의미한다.

본원에서 일반적으로 사용되는 "항체"는 IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE와 같은 동형 및 IgG₁, IgG_2a 등과 같은 아형을 포함하는 면역글로불린 유전자 복합체의 단백질 산물이거나 그로부터 유래되지만, 이에 제한되지는 않는다. 항체 및 항체 단편은 폴리클로날 또는 모노클로날, 천연 또는 재조합일 수 있다. 항체 단편은 Fc, Fab 또는 F(ab)2 단편을 포함하고/거나 단일 쇄 Fv 항체 (scFv)를 포함할 수 있다. 이러한 scFv는 예를 들어 미국 특허 제5,091,513호, 유럽 특허 제239,400호 또는 [Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293]의 잡지에 각각 설명된 방법에 따라 제조될 수 있다. 항체는 또한 복수의 scFv를 포함하는 디아바디, 트리아바디 및/또는 테트라바디와 같은 다가 재조합 항체 단편뿐만 아니라 이량체화 활성화된 데미바디를 포함할 수 있다 (예: WO/2007/062466). 예를 들어, 이러한 항체는 [Holliger et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 6444]; 또는 [Kipriyanov, 2009 Methods Mol Biol 562 177]에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 항체 생산, 정제 및 사용에 적용할 수 있는 잘 알려진 프로토콜은 예를 들어 [Chapter 2 of Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994) 및 Harlow, E. & Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에서 찾을 수 있다.

폴리클로날 항체를 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 사용할 수 있는 예시되는 프로토콜은 예를 들면 Coligan et al, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra, 및 Harlow & Lane, 1988, supra에 기재되어 있다. 특정 일 실시양태에서, 폴리클로날 항체는 A 군 Strep에 노출되거나 또는 감염된 개체 유래의 인간 혈청으로부터 수득되거나 또는 정제될 수 있다. 대안으로서, 폴리클로날 항체는 말과 같은 생산 종 (production species)에서, 정제, 화학적 합성 또는 재조합 M 단백질, 초항원 또는 그 면역원성 단편 또는 변이체에 대해서 생성되고 연이어 정제한 후에 투여될 수 있다.

모노클로날 항체는 예를 들면 논문 Koehler & Milstein, 1975, Nature 256, 495에 최초 기재된 표준 방법, 또는 예를 들면 Coligan et al, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra에 기재된 이의 최신 변형 방법을 사용함으로써 제조될 수 있는 바, 본 발명의 하나 이상의 단리된 단백질, 단편, 변이체 또는 유도체로 접종되어진 생산 종으로부터 유래된 불멸화 비장 (immortalizing spleen) 또는 다른 항체 생산 세포에 의해서 제조될 수 있다. 모노클로날 항체 또는 그의 단편은 재조합 형태일 수 있다. 이는 상기 모노클로날 항체가 인간이 아닌 포유동물의 비장 세포에 의해서 초기에 생산되는 경우, 상기 모노클로날 항체 또는 단편을 "인간화 (humanizing)"하기에 특히 유리할 수 있다.

일 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 M 단백질, 이의 단편 또는 변이체에 결합 및/또는 이에 대해 발생한다.

본원에 사용된 "M 단백질 단편"은 면역원성이고/거나 항체 또는 항체 단편에 의해 결합될 수 있는 GAS M 단백질의 임의의 단편이다. 일반적으로, 단편은 GAS M 단백질의 C-반복 영역의 아미노산 서열 또는 이의 단편이거나, 이를 포함하거나, 그 내에 포함된다. 비제한적 예는 아미노산 서열 LRRDLDASREAKKQVEKALE (서열 번호 1)을 갖는 20 mer인 p145를 포함한다. 최소 p145 에피토프 서열은 SREAKKQVEKAL (서열 번호 5)이다.

특정 실시양태에서, M 단백질 단편은 서열 번호 5의 최소 p145 에피토프 또는 이의 변이체 또는 유도체이거나, 이를 포함한다.

이와 관련하여, p145 아미노산 서열의 단편은 p17, J14 또는 J8 펩티드에 존재할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, M 단백질 단편, 이의 변이체 또는 유도체는 p17 펩티드, J14 펩티드 또는 J8 펩티드로 구성되거나, 본질적으로 구성되거나, 이를 포함한다.

본 발명 이전에 수행된 작업에서, p145 펩티드에 대한 특정 변형은 A 군 연쇄구균에 대한 면역원성을 실질적으로 향상시킬 수 있다. 일 실시양태에서, p17 펩티드는 서열 번호 1의 잔기 13에 상응하는 N 잔기 및 서열 번호 1의 잔기 17에 R 아미노산을 포함하는 변형된 p145 펩티드이다.

바람직하게는, p17은 서열 번호 5의 잔기 6에 상응하는 N 잔기 및 서열 번호 1의 잔기 10에 R 아미노산을 포함하는 변형된 p145 최소 에피토프를 포함한다.

일 실시양태에서, p17 펩티드는 아미노산 서열 LRRDLDASREAKNQVERALE (서열 번호 2)를 포함한다.

일 실시양태에서, p17 펩티드는 아미노산 서열 SREAKNQVERAL (서열 번호 6)을 포함하는 변형된 p145 최소 에피토프 단편을 포함한다.

추가 p145 펩티드 변이체는 PCT/AU2018/050893에 요약되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 예시적인 p145 변이체가 아래에 제공된다.

p145 LRRDLDA SREAKKQVEKAL E (서열 번호 1)

p*1. LRRDLDA ENEAKKQVEKAL E (서열 번호 13)

p*2. LRRDLDA EDEAKKQVEKAL E (서열 번호 14)

p*3. LRRDLDA EREAKNQVEKAL E (서열 번호 15)

p*4. LRRDLDA EREAKKQVERAL E (서열 번호 16)

p*5. LRRDLDA EREAKKQVEMAL E (서열 번호 17)

p*6. LRRDLDA VNEAKKQVEKAL E (서열 번호 18)

p*7. LRRDLDA VDEAKKQVEKAL E (서열 번호 19)

p*8. LRRDLDA VREAKNQVEKAL E (서열 번호 20)

p*9. LRRDLDA VREAKKQVERAL E (서열 번호 21)

p*10. LRRDLDA VREAKKQVEMAL E (서열 번호 22)

p*11. LRRDLDA SNEAKNQVEKAL E (서열 번호 23)

p*12. LRRDLDA SNEAKKQVERAL E (서열 번호 24)

p*13. LRRDLDA SNEAKKQVEMAL E (서열 번호 25)

p*14. LRRDLDA SDEAKNQVEKAL E (서열 번호 26)

p*15. LRRDLDA SDEAKKQVERAL E (서열 번호 27)

p*16. LRRDLDA SDEAKKQVEMAL E (서열 번호 28)

p*17 LRRDLDA SREAKNQVERAL E (서열 번호 6)

p*18. LRRDLDA SREAKNQVEMAL E (서열 번호 29)

본원에 사용된 "J14 펩티드"는 아미노산 서열 KQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDKVK (서열 번호 3) 또는 그 단편 또는 변이체를 포함할 수 있고, p145 내에 최소 B 및 T 세포 에피토프를 갖는 펩티드는 잠재적으로 유해한 T 세포 오토에피토프 (autoepitopes)가 없지만, 옵소닌 B 세포 에피토프를 함유하는 GAS M 단백질 C-영역 펩티드로 확인되었다. J14는 M 단백질 C-영역으로부터 14개의 아미노산을 함유하는 키메라 펩티드 (chimeric peptide)이며 (굵게 표시함), 상기 펩티드의 올바른 나선형 접힘 및 입체형태적 구조를 유지하는데 필요한 효모-유래 GCN4 서열에 인접한다 (flanked).

본원에 사용된 "J8 펩티드"는 GAS M 단백질 C-영역 펩티드로부터 적어도 일부 유래하거나 또는 이에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. J8 펩티드는 입체형태적 B-세포 에피토프를 적당하게 포함하며, 잠재적으로 유해한 T-세포 오토에피토프는 갖지 않는다. 바람직한 J8 펩티드 아미노산 서열은 QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ (서열 번호 4) 또는 그 단편 또는 변이체이며, 여기서 굵게 표시된 잔기는 GAS M 단백질의 잔기 344 내지 355에 해당한다. 본 실시양태에서, J8은 상기 J8 펩티드의 올바른 나선형 접힘 및 입체형태적 구조 유지를 보조하는 GCN4 DNA-결합 단백질 서열을 인접하여 추가로 포함하는 키메라 펩티드이다.

다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 GAS 초항원에 결합 및/또는 이에 대해 발생한다.

본원에 사용된 "초항원"은 병원성 GAS 균주의 전부 또는 상당 부분에 의해 분비되는 저 분자량 엑소-단백질이다. GAS에는 Spe-A, Spe-C, Spe-G, Spe-H, Spe-I, Spe-J, Spe-K, Spe-L, Spe-M, SSA 및 SMEZ로 지정된 11 개의 혈청학적으로 구별되는 초항원이 있다. 연쇄구균 초항원은 인간 MHC II β 쇄에 대해 높은 친화성 결합과 TCR β 쇄에 대해 상대적으로 낮은 친화성 결합을 나타낸다. 연쇄구균 초항원 단백질 구조는 보존된 2-도메인 구조와 분자의 중심에 걸쳐 있는 긴 용매 접근 가능한 α-나선의 존재를 나타낸다. N-말단 도메인은 올리고뉴클레오티드/올리고당 결합 (OB) 접힘을 갖는 혼합 β-배럴이다. 더 큰 C-말단 도메인은 β-파지 접힘이며 4 가닥의 역평행 뒤틀린 시트에 대해 패킹되는 중앙 α4-나선으로 덮인 뒤틀린 β-시트로 구성된다. 연쇄구균 초항원은 열과 산에 의한 변성에 저항하는 매우 안정적인 단백질이며 이는 N- 및 C-말단 도메인의 밀착 패킹에 의해 달성된다. 구조는 C-말단 도메인의 상단 위로 확장되는 N-말단의 섹션에 의해 더욱 안정화된다. 특히, 모든 연쇄구균 초항원 중 가장 보존된 부분은 α4-나선과 N-말단 OB-접힘 도메인의 내부 사이의 인터페이스를 구축하는 영역이다. GAS에 존재할 수 있는 11 가지 초항원 중 대부분의 STTS 사례는 연쇄구균 발열성 외독소 (Spe) A 또는 SpeC 중 하나에 의해 발생한다.

본원에 사용된, 단백질 "변이체"는 참조 아미노산 서열과 한정가능한 아미노산 서열 관계를 공유한다. 상기 참조 아미노산 서열은 전술한 바와 같이 M 단백질, 초항원 또는 이들의 단편의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 "변이체" 단백질은 결실 또는 상이한 아미노산에 의해서 치환된 하나 또는 복수의 참조 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부의 아미노산은 면역원성 단편 및/또는 단백질의 활성을 변경하지 않고 치환 또는 결실될 수 있다는 것이 당분야에 잘 알려져 있다 (보존적 치환). 바람직하게, 단백질 변이체는 적어도 70% 또는 75%, 바람직하게 적어도 80% 또는 85%, 또는 더 바람직하게 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 참조 아미노산 서열과 공유한다.

p17 및/또는 p145 펩티드 변이체의 비제한적인 예는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 US2009/0162369호에 기재되어 있다.

J8 펩티드 변이체의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:

S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q V E K A L C (서열 번호 7)

S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K C　(서열 번호 8)

S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K K Q V E K A L C (서열 번호 9)

S R E A K K Q V E K A L D A S R E A K K Q V E K A L C (서열 번호 10)

다른 변이체는 본원에 참조로 포함되는 Cooper et al., 1997에 기술된 바와 같이 헵타드 (heptad)에 기반할 수 있다.

예를 들면, 에피토프가 α-나선형 단백질 구조적 형태 내에 존재하는 것이 알려져 있다면, 모델 펩티드를 합성하여 이러한 형태로 접히도록 할 수 있다. 본 발명자들은 GCN4 류신 지퍼 (leucine zipper)의 구조에 기반하여 모델 α-나선형 코일드 코일 (coiled coil) 펩티드를 고안하였다 (O'Shea et al., 1991). 제1 헵타드는 서열 MKQLEDK (서열번호 11)를 포함하며, 이는 안정한 코일드 코일 헵타드 반복 모티프 (a-b-c-d-e-f-g)n에서 발견되는 몇몇 특성들을 포함한다 (Cohen & Parry, 1990). 이러한 특성들에는 a 및 d 위치에서 커다란 비극성 잔기, e 및 g 위치에서 산/염기 쌍 (Glu/Lys)(통상 쇄간 이온결합에 유리함), 및 b, c, f 위치에서 극성기가 포함된다 (Lupas et al. (1991)의 예측과 일치됨). 상기 GCN4 펩티드는 상기 a 위치에서 공통되는 발린을 또한 포함한다. a 및 d 위치에 V 및 L이 존재하면, 코일드 코일 이량체가 선호된다고 알려져 있다 (Harbury et al., 1994). 모델 헵타드 반복 (heptad repeat)은 이러한 GCN4 류신 지퍼 펩티드: (VKQLEDK; 서열번호 12)의 공통된 특성으로부터 유래되며, α-나선형 코일드 코일을 형성할 수 있는 포텐셜을 갖는다. 상기 펩티드는 골격 펩티드 (framework peptide)가 된다. 연구 중인 입체형태적 에피토프의 중첩된 단편을 상기 코일드 코일 펩티드 모델내에 끼워넣음으로써 키메라 펩티드를 제조하였다. 올바른 나선형 코일드 코일 형태가 되도록 고안된 아미노산 치환 (Cohen & Parry, 1990)은 동일한 잔기가 나선형 모델 펩티드와 에피토프 서열 양쪽에서 발견될 때마다 키메라 펩티드로 포함된다. 하기의 치환이 일반적으로 사용된다: a위치에서 V를 I로 치환; b위치에서 K를 R로 치환; c위치에서 Q를 N으로 치환; d위치에서 L을 A로 치환; e위치에서 E를 Q로 치환; f위치에서 D를 E로 치환; g위치에서 K를 R로 치환. 상기 모든 대체 잔기는 코일드 코일 단백질내 이들 각각의 위치에서 일반적으로 발견된다 (Lupas et al., 1991).

각각의 단백질과 핵산 사이의 서열 관계를 기술하기 위하여 본원에 일반적으로 사용된 용어는 "비교 창", "서열 동일성", "서열 동일성의 백분율" 및 "실질적 동일성 (substantial identity)"을 포함한다. 각각의 핵산/단백질은 (1) 핵산/단백질에 의해서 공유되는 완전한 핵산/단백질 서열의 하나 또는 그 이상의 일부분, 및 (2) 핵산/단백질 사이에서 벗어나는 하나 또는 그 이상의 일부분을 포함할 수 있으며, 서열 비교는 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 "비교 창"에 대한 서열들을 비교함으로써 통상적으로 수행된다. "비교 창"은 참조 서열과 비교되는 일반적으로 6개, 9개 또는 12개의 연속하는 잔기의 개념적인 분절 (conceptual segment)을 나타낸다. 상기 비교 창은 각각의 서열의 최적 배열에 있어서 참조 서열과 비교하여 약 20% 이하의 추가 또는 결실(즉, 갭 (gap))을 포함할 수 있다. 비교 창을 배열하기 위한 서열의 최적 배열은 알고리즘의 컴퓨터 구현에 의해서 실시할 수 있거나 (Geneworks program by Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA, 참조에 의해서 본원에 포함됨) 또는 선택된 다양한 방법들 중 임의의 것에 의해서 생성되는 최선의 배열 및 검사 (즉, 비교 창에 대해서 최고 백분율의 상동성을 야기함)에 의해서 실시할 수 있다. 예를 들면 Altschul et al, 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389에 기술된 바와 같은 프로그램의 BLAST 패밀리를 참조할 수 있으며, 이는 참조에 의해서 본원에 포함된다. 서열 분석에 대한 상세한 설명은 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999)의 유닛 19.3에서 찾을 수 있다.

용어 "서열 동일성"은 광의로는, 표준 알고리즘을 사용한 적절한 배열면에서, 또한 비교 창에 걸쳐서 동일한 서열 면에서, 정확히 부합되는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수를 포함한다. 그러므로, "서열 동일성의 백분율"은, 비교 창에 걸쳐서 2개의 최적으로 배열된 서열들을 비교하고, 양 서열 모두에서 동일한 핵산 염기 (예컨대, A, T, C, G, I)가 나타나는 위치의 수를 결정함으로써 부합되는 위치의 수를 알아내며, 부합된 위치의 수를 비교 창에서 전체 위치의 수(즉, 창 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 산출한다. 예를 들면 "서열 동일성"은 DNASIS 컴퓨터 프로그램 (Version 2.5 for windows; available from Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA)에 의해서 산출되는 "부합 백분율 (match percentage)"을 의미하는 것으로 이해할 수 있다.

본원에 사용된 "유도체"는 당분야에서 알려져 있는 바와 같은 다른 화학적 잔기와 접합 (conjugation) 또는 복합화 (complexing)에 의하거나, 해독후 변형 (post-translational modification) (예컨대, 인산화, 아세틸화 등), 글리코실화의 변형 (예컨대 글리코실화를 추가, 제거 또는 대체), 지질화 및/또는 추가적인 아미노산 서열의 포함에 의해서 변화되는 단백질, 그 단편 또는 변이체와 같은 분자이다. 특정 일 실시양태에서, 추가적인 아미노산 서열은 그 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 또는 복수의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 복수의 리신 잔기 (예컨대, 폴리리신)는 선형의 리신 잔기 서열일 수 있거나 또는 분지쇄형 리신 잔기 서열일 수 있다. 상기 추가의 리신 잔기는 펩티드 가용성의 증가를 촉진할 수 있다. 또 다른 특정 유도체는 펩티드를 디프테리아 독소 (DT)에 접합시키는 것이다. 이것은 C-말단 시스테인 잔기의 첨가에 의해 촉진될 수 있다.

부가의 아미노산 서열은 융합 단백질을 형성하는 융합 파트너 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 파트너 아미노산 서열 (fusion partner amino acid sequences)은 단리된 융합 단백질의 검출 및/또는 정제에 도움을 줄 수 있다. 비제한적인 예로는 금속-결합 (예컨대, 폴리히스티딘) 융합 파트너, 말토스 결합 단백질 (MBP), 단백질 A, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 형광 단백질 서열 (예컨대, GFP), 에피토프 태그 (tag), 예컨대 myc, FLAG 및 헤마글루티닌 태그를 포함한다.

다른 추가 아미노산 서열은 디프테리아 톡소이드 (DT) 또는 이의 단편과 같은 담체 단백질 또는 국제 공개 WO2017/070735호에 기술된 바와 같은 CRM 단백질 단편일 수 있다.

본 발명에 의해서 의도되는 기타 유도체는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 측쇄에의 변형, 펩티드 또는 단백질 합성 중의 비천연 아미노산 및/또는 이들의 유도체의 도입, 및 본 발명의 면역원성 단백질, 단편 및 변이체에 입체형태적 강제를 부과하는 가교제 및 기타 방법의 사용을 포함한다.

이와 관련하여, 당분야의 통상의 지식을 가진자는 단백질의 화학적 변형과 관련된 더 광범위한 방법론에 있어서 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2008)의 제15장을 참고할 수 있다.

간리된 M 단백질, 초항원 단백질, 단편 및/또는 유도체는 펩티드 단편을 생성하기 위한 화학적 합성, 재조합 DNA 기술 및 단백질 분해 절단을 포함하나 이에 제한되지 않는 당 업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다.

화학적 합성은 고상 및 용액상 합성을 포함한다. 상기 방법은 당분야에 잘 알려져 있으며, SYNTHETIC VACCINES Ed. Nicholson (Blackwell Scientific Publications)의 제9장 및 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al, (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008)의 제15장에 제공되는 화학적 합성 기술의 예들을 참고할 수 있다. 이러한 관점에서, 국제공개공보 WO 99/02550 및 국제공개공보 WO 97/45444를 참고할 수 있다.

재조합 단백질은 예를 들면 Sambrook et al, MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), 특히 섹션 16 및 17; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al, (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008), 특히 제10장 및 제16장; 및 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al, (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008), 특히 제1장, 제5장 및 제6장에 기술된 바와 같은 표준 프로토콜을 사용하여 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에 의해서 편리하게 제조할 수 있다. 전형적으로, 재조합 단백질 제제는 적합한 숙주 세포에서 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 포함한다.

본 발명의 특정 측면 및 실시양태는 STSS와 같은 상태의 A 군 연쇄구균 관련 질병에 대한 수동 면역화를 위해 포유동물에 투여하기 위한 M 단백질, 초항원 단백질, 단편 및/또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 재조합 항체 및 항체 단편에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 재조합 항체 및 항체 단편은 전술한 바와 같이 "인간화"된다. 따라서, 본 발명의 일부 측면은 M 단백질, 초항원 단백질, 단편 및/또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 재조합 항체 및 항체 단편을 코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산을 제공한다.

본원에 사용된 용어 "핵산"은 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 및 RNA를 나타낸다. DNA는 게놈성 DNA 및 cDNA를 포함한다. RNA는 mRNA, RNA, RNAi, siRNA, cRNA 및 자기촉매 (autocatalytic) RNA를 포함한다. 핵산은 또한 DNA-RNA 하이브리드 (hybride)일 수 있다. 핵산은 A, G, C, T 또는 U 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 통상적으로 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러나, 뉴클레오티드 서열은 변형된 퓨린 (예를 들면 이노신, 메틸이노신 및 메틸아데노신) 및 변형된 피리미딘 (예를 들면 티오우리딘 및 메틸사이토신)과 같은 다른 염기들을 포함할 수도 있다.

바람직한 형태에서, M 단백질 단편, 그 변이체 또는 유도체를 코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산 및 호중구 활성의 회복 또는 증대를 촉진하는 제제는 유전자 작제물의 형태이다.

적합하게는, 상기 유전자 작제물는 당분야에 잘 이해되는 바와 같이 플라스미드, 박테리오파아지, 코스미드, 효모 또는 박테리아성 인공 염색체의 형태이거나 또는 그 유전자 성분들을 포함한다. 유전자 작제물는 재조합 DNA 기술에 의한 조작을 위해서, 박테리아 또는 다른 숙주 세포 중에 단리된 핵산을 유지 및 증식하기에도 적당할 수 있다.

단백질 발현에 있어서, 상기 유전자 작제물는 발현 구조체이다. 적합하게는, 상기 발현 구조체는 발현 벡터에서 하나 이상의 부가적인 서열, 예컨대 이종 서열에 작동가능하게 연결된 (operably linked) 하나 이상의 핵산을 포함한다. "발현 벡터"는 자기-복제 염색체외 벡터 (self-replicating extra-chromosomal vector), 예컨대 플라스미드이거나, 또는 숙주 게놈에 통합되는 벡터일 수 있다.

"작동가능하게 연결된"은 전사를 개시, 조절 또는 기타 제어를 위해서 본 발명의 핵산에 대해서 부가적인 뉴클레오티드 서열(들)이 위치하는 것을 의미한다.

조절 뉴클레오티드 서열은 발현이 요구되는 숙주 세포 또는 조직에 대해 일반적으로 적당할 것이다. 수많은 형태의 적당한 발현 벡터 및 적당한 조절형 서열이 다양한 숙주 세포에 대해서 당분야에 알려져 있다.

전형적으로, 상기 하나 이상의 조절형 뉴클레오티드 서열은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 해독 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 (enhancer) 또는 활성자 (activator) 서열을 포함할 수 있다. 당분야에 알려져 있는 항시성 (constitutive) 또는 유도성 (inducible) 프로모터도 본 발명에 포함된다. 상기 발현 구조체는 융합 파트너 (전형적으로 발현 벡터에 의해서 제공됨)를 코딩하는 부가적인 뉴클레오티드 서열을 포함함으로써, 본 발명의 재조합 단백질이 전술한 바와 같이 융합 단백질로서 발현된다.

바람직한 형태에서, 유전자 작제물은 본원에 기재된 M 단백질 및/또는 초항원을 코딩함으로써 인간과 같은 포유동물의 DNA 백신접종에 적합하다. 이와 관련하여, M 단백질 및 초항원 단백질은 백신접종 목적을 위해 동일하거나 상이한 유전자 작제물 상에 코딩될 수 있음을 이해할 것이다.

적합하게는, 유전자 작제물은 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드, 효모 또는 박테리아 인공 염색체의 형태이거나 그 유전적 성분을 포함한다. 유전자 구조는 또한 재조합 DNA 기술에 의한 조작을 위해 박테리아 또는 기타 숙주 세포에서 분리된 핵산의 유지 및 증식에 적합할 수 있다.

적합하게는, DNA 백신접종은 하나 이상의 플라스미드 DNA 발현 구조체에 의해 달성된다. 플라스미드는 전형적으로 바이러스성 프로모터 (예컨대 SV40, RSV 또는 CMV 프로모터)를 포함한다. 인트론 A는 mRNA 안정성을 향상시킴으로써 단백질 발현을 증가시키기 위해서 포함될 수도 있다. 플라스미드는 다중 클로닝 부위, 강한 폴리아데닐화/전사 종결 신호, 예컨대 소 성장 호르몬 또는 토끼 베타-글로불린 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 플라스미드는 HIV rev 증가된 엔벨로프 발현 (envelope expression)을 갖거나 또는 갖지 않는 Mason-Pfizer 원숭이 바이러스 cis-작용 전사인자 (MPV-CTE)를 추가로 포함할 수 있다. 발현을 향상시킬 수 있는 부가적인 변형은 인핸서 서열, 합성 인트론, 아데노바이러스 삼부 리더 (adenovirus tripartite leader: TPL) 서열의 삽입 및/또는 폴리아데닐화로의 변형 및/또는 전사 종결 서열을 포함한다. DNA 백신 플라스미드의 비제한적인 예로는 Invivogen에서 상업적으로 이용가능한 pVAC이다.

DNA 백신학을 기술하는 유용한 참고문헌으로는 DNA Vaccines, Methods and Protocols, Second Edition (Volume 127 of Methods in Molecular Medicine series, Humana Press, 2006)이 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 포유동물에서 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)과 같은 A 군 Strep 관련 질병, 장애 또는 상태를 예방 또는 치료하는 조성물, 백신 및/또는 방법을 제공한다.

본 발명의 맥락에서, "A 군-스트렙 관련 질병, 장애 또는 상태"는 A 군 strep에 의한 감염으로 인한 임의의 임상 병리를 의미하며 봉와직염, 단독, 농가진, 성홍열, 급성 인두염 ("패혈성 인두염")과 같은 인후 감염, 균혈증, 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)과 같은 침습성 GAS 질병, 괴사성 근막염, 급성 류마티스 열 및 급성 사구체신염이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

적합하게는, 조성물 및/또는 방법은 A 군 Strep에 대해, 또는 더욱 특히 STSS에 대해 포유동물을 "수동적으로 면역화"시킨다. 따라서, A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질 단편 또는 이의 변이체에 결합하는 항체 또는 항체 단편 및 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단편 또는 이의 변이체에 결합하는 항체 또는 항체 단편의 조합의 투여는 A 군 Strep에 의한 후속 감염에 대해 적어도 부분적인 수동 면역을 부여하거나, 기존 A 군 Strep 감염에 최소한 부분적인 수동 면역을 부여, 제공 또는 촉진할 수 있다. 또한 "수동 면역"은 보체 캐스케이드 요소의 유도, 대식세포 및 기타 식세포와 같은 선천적 면역계 요소의 유도 및/또는 사이토카인, 성장 인자, 케모카인 및/또는 기타 염증 유발 분자의 유도와 같은 숙주 포유동물 면역 반응의 적어도 일부 요소의 유도를 배제하지 않는다는 것이 인식될 것이다.

적합하게는, 수동 면역화는 포유동물에서 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)을 포함하는 iGAS 질병과 같은 A 군 Strep 관련 질병, 장애 또는 상태를 치료하거나 예방한다.

본원에 사용된 "치료하는", "치료한다" 또는 "치료"는 STSS와 같은 A 군 Strep-관련 질환, 장애 또는 상태가 발병한 이후에 그 증상 또는 병리학적 징후를 적어도 일부 완화, 제거 또는 감소시키는 치료적 개입을 나타낸다. 치료는 대상에 절대적으로 유익할 필요는 없다. 상기 유익한 효과는 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 알려져 있는 방법 또는 표준을 사용하여 측정할 수 있다.

본원에 사용된 "예방하는", "예방한다" 또는 "예방"은 감염을 예방 및/또는 증상 및 병리적 징후를 감소시키기 위하여 A 군 Strep에 감염 또는 노출 이전 및/또는 STSS와 같은 A 군 Strep-관련 질환, 장애 또는 상태의 증상 또는 병리학적 징후의 개시 전에 시작된 일련의 활동을 나타낸다. 이러한 예방은 대상에 절대적으로 유익할 필요는 없다고 이해된다. "예방적 (prophylactic)" 치료는 A 군 Strep-관련 질환, 장애, 또는 상태의 예후를 나타내지 않거나 또는 초기 예후만을 나타내는 대상에 A 군 Strep-관련 질환, 장애 또는 상태의 증상 또는 병리학적 예후가 진전되는 위험을 감소시킬 목적으로 투여하는 치료이다.

특정 측면 및 실시양태에서, A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질 단편 또는 이의 변이체에 결합하는 항체 또는 항체 단편 및 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단편 또는 변이체에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 별도로 또는 조합하여 포유동물에게 투여될 수 있다.

"별도로"라는 것은 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질 단편 또는 이의 변이체에 결합하는 항체 또는 항체 단편 및 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단편 또는 변이체에 동시에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 각각 포함하는 분리된 단위로서, 또는 각각의 항체 또는 항체 단편의 조합 또는 상승 효과를 유지하는 방식으로 시간적으로 떨어져 투여되는 것을 의미한다.

일부 실시양태에서, A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질 단편 또는 이의 변이체에 결합하는 항체 또는 항체 단편 및 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단편 또는 변이체에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 조성물의 형태로 투여될 수 있다.

바람직한 형태에서, 상기 조성물은 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.

"허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 전신 투여에 안전하게 사용할 수 있는 고상 또는 액상 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 특정 투여 경로에 따라서, 당분야에 잘 알려져 있는 다양한 담체, 희석제 및 부형제를 사용할 수 있다. 이는 당, 전분, 셀룰로스 및 그 유도체, 맥아, 젤라틴, 탈크, 칼슘 설페이트, 식물성 오일, 합성 오일, 폴리올, 알긴산, 인산염 완충 용액, 유화제, 등장 식염수 및 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 브로마이드 및 설페이트를 포함하는 무기산염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트를 포함하는 유기산, 물 및 발열성 물질 제거수 (pyrogen-free water)를 포함하는 군으로부터 선택할 수 있다.

허용가능한 담체, 희석제 및 부형제를 서술한 유용한 참고문헌으로는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)가 있고, 이는 참조에 의해서 본원에 포함된다.

적합하게는, 단편, 변이체 및 유도체를 포함하여 본원에 기재된 M 단백질 및/또는 초항원 단백질은 면역원성이다. 본 발명의 맥락에서, 본원에 사용된 용어 "면역원성"은 포유동물에 면역원성 단백질 또는 펩티드의 투여시 A 군 Strep 또는 M 단백질 또는 초항원과 같은 이의 분자 성분에 대한 면역 반응을 생성하거나 유도하는 능력 또는 잠재력을 나타낸다.

"면역 반응을 유도한다"는 것은 세포 면역계, 항체 및/또는 천연 면역계를 포함하는 면역계의 하나 이상의 요소의 생성 또는 활성을 생성하거나 자극하는 것을 의미한다. 적합하게는, 면역계의 하나 이상의 요소는 B 림프구, 항체 및 호중구를 포함한다.

바람직하게는, 면역 반응을 유도하기 위해 특정 면역학적 제제는 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체, 예를 들어 J8 펩티드 및/또는 초항원 단백질, 단편, 변이체 또는 유도체, 예컨대 SpeA 및 SpeC, 또는 이들을 코딩하는 하나 이상의 유전자 작제물와 조합하여 사용될 수 있다.

용어 "면역 제제 (immunological agent)"는 그 범위 내에서 당분야에 잘 알려져 있는 담체, 전달 제제 (delivery agents), 면역자극제 (immunostimulants) 및/또는 아쥬반트를 포함한다. 당분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, 면역자극제 및 아쥬반트는 조성물의 면역원성 및/또는 효능을 향상시키는 하나 이상의 물질을 나타내거나 또는 포함한다. 적당한 면역자극제 및 아쥬반트의 비제한적인 예로는 스쿠알란 및 스쿠알렌 (또는 식물 기원 또는 동물 기원의 기타 오일); 블록 공중합체 (block copolymers); 계면활성제, 예컨대 Tween®-80; Quil® A, 미네랄 오일, 예컨대 드라케올 (Drakeol) 또는 마르콜 (Marcol), 식물성 오일, 예컨대 땅콩유; 코리네박테리움-유래 아쥬반트 (Corynebacterium-derived adjuvants), 예컨대 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum); 프로피오니박테리움-유래 아쥬반트 (Propionibacterium-derived adjuvants), 예컨대 프로피오니박테리움 액니 (Propionibacterium acne); 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis) (Bacille Calmette 및 Guerin 또는 BCG); 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis) 항원; 테타누스 톡소이드 (tetanus toxoid); 디프테리아 톡소이드 (diphtheria toxoid); 표면활성 물질, 예컨대 헥사데실아민, 옥타데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 리소레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N',N'비스(2-하이드록시에틸-프로판디아민), 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루로닉 폴리올 (pluronic polyols); 폴리아민, 예컨대 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC 카르보폴; 펩티드, 예컨대 무라밀 디펩티드 및 유도체, 디메틸글리신, 투프트신; 오일 유화제 (oil emulsions); 및 미네랄 겔, 예컨대 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록시드 또는 알룸 (alum); 인터루킨, 예컨대 인터루킨 2 및 인터루킨 12; 모노킨 (monokines), 예컨대 인터루킨 1; 종양 괴사 인자; 인터페론, 예컨대 감마 인터페론; 면역자극 DNA, 예컨대 CpG DNA, 조합물, 예컨대 사포닌-알루미늄 하이드록시드 또는 퀼 (Quil)-A 알루미늄 하이드록시드; 리포좀; ISCOM® 및 ISCOMATRIX® 아쥬반트; 미코박테리아 (mycobacterial) 세포벽 추출물; 합성 글리코펩티드, 예컨대 무라밀 디펩티드 또는 기타 유도체; 아브리딘 (Avridine); 지질 A 유도체; 덱스트란 설페이트; DEAE-덱스트란 단독 또는 알루미늄 포스페이트와의 조합체; 카복시폴리메틸렌, 예컨대 카르보폴 (Carbopol)' EMA; 아크릴 공중합체 유화제, 예컨대 네오크릴 A640 (예컨대, 미국특허 제5,047,238호); 유중수형 유화제, 예컨대 몬타니드 (Montanide) ISA 720; 폴리오바이러스, 박시니아 (vaccinia) 또는 동물 폭스바이러스 (poxvirus) 단백질; 또는 그 혼합물을 포함한다.

면역 제제는 담체, 예컨대 티로글로불린; 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 파상풍, 디프테리아, 백일해, 슈도모나스 (Pseudomonas), 대장균 (E. coli), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 및 스트렙토코쿠스 (Streptococcus)로부터의 독소, 톡소이드 또는 상기 독소의 돌연변이 교차반응성 물질(CRM); 폴리아미노산, 예컨대 폴리(리신:글루탐산); 인플루엔자; 로타바이러스 VP6, 파르보바이러스 VP1 및 VP2; 간염 B 바이러스 코어 단백질; 간염 B 바이러스 재조합 백신 등을 포함할 수 있다. 대안으로서, 담체 단백질 또는 다른 면역원성 단백질의 단편 또는 에피토프를 사용할 수 있다. 예를 들면, 박테리아성 독소, 톡소이드 또는 CRM의 T 세포 에피토프를 사용할 수 있다. 이러한 점에서, 미국특허 제5,785,973호를 참고할 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.

백신 조성물을 제조하는데 적당한 방법을 고려할 수 있다. 예시적인 방법은 예를 들면 New Generation Vaccines (1997, Levine et al, Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong)에 기술된 것을 포함하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.

안전한 투여 경로로서 경구, 직장, 비경구, 설하, 구강, 정맥내, 관절내, 근육내, 피부내, 피하, 흡입, 안구내, 복강내, 뇌실내, 국소, 점막 및 경피 투여를 포함하여 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

투여 제형 (dosage forms)은 정제, 분산액, 현탁제, 주사제, 액제, 시럽제, 트로키제, 캡슐제, 비강 분무제, 좌약, 에어로졸, 경피 패치 등을 포함한다. 상기 투여 제형은 또한 상기 목적을 위해서 특별히 고안된 주입 또는 이식 제어방출 장치 또는 상기 형태로 추가로 작용하도록 변형된 다른 임플란트 형태를 포함할 수 있다. 제어 방출은 아크릴 수지, 왁스, 고급 지방산 알콜, 폴리락트산 및 폴리글리콜산을 포함하는 소수성 중합체 및 특정 셀룰로스 유도체, 예컨대 하이드록시프로필메틸 셀룰로스로 코팅함으로써 달성될 수 있다. 또한, 상기 제어 방출은 다른 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 마이크로스피어를 사용함으로써 달성될 수 있다.

조성물은 예컨대 본 발명의 하나 이상의 치료제의 미리 정해진 양을 각각 함유하는 캡슐, 사셰, 기능성 식품/사료 또는 정제와 같은 개별 단위로서, 분말 또는 과립으로서, 또는 수성액, 비수성액, 수중유형 유제 또는 유중수형 액상 유제내 액제 또는 현탁제로서 제공할 수 있다. 상기 조성물은 제약 방법에 의해서 제조할 수 있지만, 모든 방법은 하나 이상의 필수 성분을 구성하는 담체와 전술한 하나 이상의 제제를 조합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물은 본 발명의 제제와 액상 담체 또는 미세한 고상 담체 또는 둘다와 균일하고 조밀하게 혼합하고, 그 후 필요하다면 상기 생성물을 목적하는 제형으로 성형함으로써 제조한다.

상기 조성물은 투여 제제와 상용성이 있는 방법 및 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 문맥에서 질환자에게 투여되는 투여량은 적당한 기간에 걸쳐서 질환자에게 유익한 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 투여될 제제(들)의 양은 연령, 성별, 체중 및 일반적인 건강 상태, 임상의 판단에 따라 달라질 수 있는 요소를 포함하여 치료될 질환자에 따라 다를 수 있다.

본원에 일반적으로 사용된 용어 "질환자(patient)", "개체 (individual)" 및 "대상 (subject)"은 전술한 조성물 또는 치료를 포유동물이 수용하는 의미로 사용된다. 따라서, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 의약적 및/또는 수의학적 용도로 사용할 수 있다. 바람직한 형태에서 상기 포유동물은 인간이다.

본 발명을 완전히 이해하고 실제적 효과를 나타내기 위해서 하기 비제한적인 실시예를 참고한다.

실시예

도입

항체 기반 수동 면역요법을 고려할 때, 표면 M 단백질 (및 초항원)에 대한 항체가 침습성 질병을 앓는 개체에서 현저히 낮고 [9], 일반 집단에서 낮은 수준의 항체가 1980 년대에 시작된 침습성 질병의 전염병에 기여 [10, 11]했을 수 있음을 인식하였다. 그러나 침습성 감염 이전에 개체에서 항체가 낮았는지 또는 항체 이화작용의 결과로 감염이 시작된 후 항체가 낮아졌는지 여부를 판단하는 것은 불가능하다. 우리는 이 문제를 해결하기 위한 직접적인 방법이 동물을 백신접종 및 챌린지하거나, 감염 및 치료할 수 있는 STSS 모델을 사용하는 것이라고 추론하였다. 우리는 고도로 보존된 M 단백질 부분을 기반으로 하는 GAS 백신을 개발하였다 ([12]에서 검토됨). 항원은 J8로 알려져 있으며 그 서열은 M 단백질의 C3-반복체의 12 개 아미노산을 카피한다. 디프테리아 톡소이드 (J8-DT)에 결합된 J8로의 백신접종은 M 형에 관계없이 시험관 내에서 GAS를 옵소닌화하는 항체를 유도하고 복강 내 및 피부 공격으로부터 마우스를 보호할 수 있다 [13-16]. 그러나, 정상 마우스는 초항원에 비감수성이기 때문에 (마우스 MHC II 분자가 초항원에 대한 친화성이 매우 낮기 때문에), 이 백신이 STSS를 예방할 수 있는지 여부는 알려지지 않았다. 본원에 개시된 연구는 감염 후 치료 옵션으로서 J8과 SpeA 및 SpeC에 대한 항체를 사용하여 감염 전 예방 조치 및 수동 면역요법으로서 J8 GAS 백신을 시험하기에 적합한 뮤린 모델을 제공한다.

재료 및 방법

SN1→SN4는 2015 년 브리즈번에서 거의 동시에 STSS가 발병한 성인 4 명의 혈액 (×3) 또는 상처 면봉 (×1)에서 채취한 임상 GAS 단리물이다. 4 명의 질환자 중 2 명은 질병으로 사망하였다. 유기체를 예비 데이터 세트 (아래)를 개발하기 위해 사용되는 SN1과 함께 우리 실험실에서 배양하였다. 재조합 SpeC (rSpeC)는 Toxin Tech (USA)에서 상업적으로 구입하여 시험관 내 실험에서 마우스에서 항-SpeC 항체를 생성하는 데 사용하였다. HLA-유전자이식 B6 마우스 ('HLA-B6')는 HLA-DR3 및 HLA-DQ2를 발현한다 [17].

유기체는 모두 emm 89 형이었다. GenElute 박테리아 gDNA 추출 키트 (Sigma)를 사용하여 밤새 고정상 배양물에서 게놈 DNA를 추출하였다. Nanodrop1000을 사용하여 gDNA를 정성화한 다음 2 ㎍의 gDNA를 모든 알려진 초항원 유전자 증폭에 사용하였다. SDS-PAGE는 SN1→4가 모두 SpeC 유전자를 포함하고 있음을 보여주었다. 또한 이들은 SpeG 및 SmeZ에 대해서는 양성이었지만 Spes, A, L, M, H, I, J, K 및 ssa에 대해서는 음성이었다.

결과

우리는 HLA-B6 마우스가 마우스 비적응 GAS 균주로 피부 감염 후 iGAS 질병을 발생할 수 있음을 발견하였다 (도 1A-B). 그에 반해, GAS 균주는 비인간화 정상 마우스에서 iGAS 질병을 유발할 수 있기 전에 연속 계대로 적응되어야 한다. 이것은 초항원이 GAS를 제공하는 생존 이점과 [18] 초항원이 자극을 받기 위한 인간 MHC II 분자의 필요성과 관련이 있을 수 있다. 따라서 HLA-B6 마우스는 STTS 모델링에 이상적이다. 그럼에도 불구하고, SpeC-분비 GAS로 감염된 후, BALB/c (비-HLA-유전자이식) 마우스는 감염 후 6 일에 혈청에서 SpeC 독소의 존재를 나타내었다 (도 1C). 이 독소 함유 혈청을 멸균 여과하고 시험관 내 및 생체 내 분석을 위한 시약으로 사용하였다. HLA-B6 및 야생형 대조군인 C57/BL6 (B6) 마우스를 SN1 및 초항원을 발현하지 않는 C 군 연쇄구균 (NS33)으로 감염시켰다. 감염된 마우스로부터 풀링된 혈청 샘플을 감염 후 6 일에 수집하고 4-15% 구배 SDS-PAGE 겔에서 실행시켰다. 겔에서 단백질을 전달한 후 막을 일차 항체인 토끼 항-SpeC IgG (Toxin-Tech, USA)로 프로브한 다음 양 항-토끼 IgG-AP (Sigma-Aldrich)로 검출하고 BCIP/NBT 기질 (Sigma-Aldrich)을 사용하여 전개하였다. rSpeC 단백질을 양성 대조군으로 실행시켰다. SpeC가 SN1 감염 마우스로부터의 혈청에서 검출된 반면 NS33 감염 마우스로부터의 혈청에서는 독소의 존재를 나타내지 않았다 (도 1D).

감염된 BALB/c 마우스로부터의 SpeC 함유 혈청, 또는 rSpeC를 B6 또는 HLA-B6 마우스의 비장 세포 배양물에 첨가하였다. 우리는 감염된 마우스로부터의 혈청 존재 또는 rSpeC의 존재하에서 HLA-B6 비장 세포 (B6 마우스의 비장 세포는 아님)의 유의한 증식을 관찰했지만, C 군 연쇄구균에 감염된 (NS33) 마우스로부터의 혈청 존재에서는 관찰할 수 없었다 (도 2 A). 증식은 항-rSpeC 항체에 의해 거의 완전히 차단되어 SN1에 존재하는 다른 초항원이 최소한의 활성을 발휘했음을 나타낸다 (도 2A). 우리는 TNF 및 IFN-감마의 분비를 측정하였을 때 유사한 반응을 관찰하였다 (도 2 B 내지 C). 감염된 BALB/c 마우스로부터의 혈청 또는 rSpeC을 3 명의 건강한 성인 지원자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 첨가하였다. 우리는 SN1에 감염된 마우스로부터의 혈청에 대해 용량 반응 방식 (웰당 5 μL까지)으로 모든 공여자에서 림프구의 상당한 증식을 관찰했지만 NS33에 감염된 마우스로부터의 혈청에서는 관찰하지 못했다. 웰당 20 μL의 SN1 혈청에서 림프구 증식은 미토겐인 PHA에 의해 유도된 것과 유사하였다. 증식은 항 rSpeC 항체에 의해 차단되었다. 이러한 데이터는 SN1이 HLA-인간화된 마우스 및 인간으로부터의 림프구를 비특이적으로 활성화할 수 있는 SpeC를 발현하며, STSS의 알려진 병인과 일치함을 입증한다. 데이터는 또한 HLA-B6 마우스가 STSS를 모델링하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.

J8로의 백신접종을 통한 마우스 STSS 예방. J8-DT 백신접종이 STSS를 예방할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 우선 SN1로 인한 피부 및 iGAS 질병을 예방할 수 있는지 알아보았다. J8-DT/Alum을 사용한 HLA-B6 마우스의 근육 내 백신접종 (×3)은 피부, 혈액 및 비장의 박테리아 부하를 10,000 배에서 10,000,000 배까지 감소시켰다 (도 3A). 항원 챌린지 후 6 일째에 취한 혈청의 웨스턴 블롯 분석은 대조군의 혈청 (PBS) 마우스에서 SpeC를 나타내지만 J8-DT-백신접종된 마우스의 혈청에서는 나타내지 않았다 (도 3B).

이어, J8-DT 백신접종된 SN1 감염 마우스로부터의 혈청이 건강한 지원자로부터 채취한 PBMC를 활성화하는지 여부를 시험하였다. 우리는 백신을 접종하지 않은 마우스의 혈청이 3 마리 중 3 마리에서 강력한 (PHA에 의해 유도된 수준의 최대 50%) 증식을 일으켰지만 백신접종된 마우스의 혈청은 현저히 적은 증식을 초래한다는 것을 관찰하였다. 2 마리에 대한 대표적인 데이터를 나타내었다 (도 3 C-D). 유사하게, rSpeC에 대한 항혈청은 SN1 감염 마우스로부터의 혈청으로 인한 증식 반응을 크게 감소시켰다. 그러나 우리는 J8-DT 백신접종 HLA-B6 마우스로부터의 마우스 혈청에 항 rSpeC 항혈청 (10-20 μL)을 첨가하면 배경 수준보다 크지 않은 증식에 이른다는 것을 관찰하였다 (SI~ 1; P <0.05-0.01).

수동 면역요법의 개발. 목표는 SpeA/C에 대한 항체와 J8에 대한 항체로 구성된 조합 수동 면역요법을 개발하는 것이다. 우리의 예비 데이터는 rSpeC로 면역화된 BALB/c 마우스로부터의 혈청이 0.05 μg/ml, 0.5 μg/ml 및 5 μg/ml로 독소를 첨가했을 때 인간 PBMC에서 rSpeC의 유사 분열 효과를 완전히 차단할 수 있음을 보여준다 (도 4). 항혈청은 웰당 5 μL 수준까지 효과적이었다.

본 실시예에서 우리는 또한 STSS의 발생을 제한하는 J8-항혈청의 능력을 입증하였지만, 정상 마우스로부터의 J8-항혈청 (주로 IgG1)이 수용 동물의 박테리아 바이오 부하를 급속히 감소시킬 수 있음을 보여주었다 (도 5A). 그러나 우리의 데이터는 항 SpeC와 항 J8 항체의 조합이 SpeC와 M 단백질을 모두 중화시키고 항-J8 항체를 포함시킴으로써 순환에서 박테리아를 제거한다는 점에서 우수하다는 것을 입증한다. 우리는 또한 감염 5 일 후 BALB/c 마우스에 투여된 항-SpeC 항혈청이 투여 6 시간 이내에 SpeC를 중화시킬 수 있음을 확인하였다 (도 5B). 그러나, 이 치료는 피부 박테리아 부하를 감소시키지 않았다 (도 5C).

추가 제안된 연구

우리는 iGAS 질병이 마우스 비적응 GAS 균주로 감염된 후 HLA-B6 마우스에서 발생할 수 있으며 HLA-B6 마우스의 림프구가 STSS의 병인과 일치하는 방식으로 SN1 GAS의 SpeC에 반응한다는 것을 입증하였다. 연구를 확장하기 위해 먼저 수집품에 있고 게놈 화면에서 SpeC POS로 알고 있는 다른 GAS 균주 (표 1)도 HLA-B6 마우스의 림프구를 활성화할지를 알아보았다. 우리는 웨스턴 블롯을 통해 4 개의 추가 SpeC POS GAS 균주로 감염된 HLA-B6 마우스의 혈청에서 SpeC의 존재를 결정하였다. 비감염 HLA-B6 마우스로부터의 비장 세포 (n=5/GAS 단리물)를 rSpeC 또는 다른 SpeC-POS 균주에 감염된 마우스로부터의 혈청과 함께 배양하였다. 림프구 증식과 분비된 TNF 및 IFN-감마를 위와 같이 측정하였다. 요약하면, 나이브 비장 세포를 SpeC POS GAS에 감염된 마우스로부터의 사전 최적화된 혈청 농도로 자극하였다. 72 시간 후 [³H] 티미딘 흡수로 증식을 측정하였다. 무세포 배양 상등액을 CBA 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 다양한 사이토카인에 대해 시험하였다. 정상 마우스 혈청 (NMS) 및 초항원-NEG NS33 C 군 연쇄구균 감염 마우스로부터의 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다. 실험은 최소 2 회 반복하였다. GAS 임상 샘플도 수집하여 가능하다면 시험하였다.

SpeC는 GAS로부터의 두 가지 주요 초항원 중 하나이며 다른 하나는 SpeA이다. 우리는 HLA-B6 마우스로부터의 비장 세포를 활성화하기 위한 5 가지 상이한 SpeA POS GAS 균주 (표 1)와 새로운 샘플 (STSS 질환자로부터의 GAS 단리물 및 혈청)의 능력을 유사하게 시험하였다.

SpeA는 HLA DR4 및 DQ8에 결합하는 것으로 알려져 있다 [18]; 그러나 DR3 및 DQ2에도 결합하는데 이것은 현재 보유하고 있는 HLA-B6 마우스가 SpeA 함유 GAS를 사용한 STSS 연구에 적합하다는 것을 나타낸다. rSpeA를 양성 대조군으로 사용하였다. 이것은 미국 ToxinTech에서 구매하였다.

우리는 이전에 피부 도전 모델을 개발하였다 [14]. 연쇄구균을 가벼운 찰과 피부에 국소적으로 접종함으로써 이 모델은 인간의 농피종을 밀접하게 복제한다. 대부분의 STTS 사례는 피부에서 시작된다는 점을 감안하면 이상적인 챌린지 모델이다. 마우스를 안락사시키고 균질화된 절제 피부에서 콜로니 수를 추정하여 박테리아 부하를 정확하게 정량화할 수 있다. 침습성 세균 부하는 혈액 및 균질화된 비장 샘플을 플레이팅하여 결정된다. 이 모델을 사용하여 우리는 J8-DT/Alum (×3)으로 정상 마우스의 여러 균주에 대한 근육 내 백신접종이 혈청형에 독립적인 방식으로 GAS 농피종 및 iGAS 질병을 예방할 수 있음을 보여주었다.

HLA-B6 마우스를 0 일, 21 일 및 42 일에 J8-DT/Alum (또는 대조군으로서 PBS/Alum)으로 백신접종하였다 (근육 내 ×3). 백신접종 2 주 후; 마우스에 5 개의 상이한 SpeA POS와 5 개의 상이한 SpeC POS GAS 균주를 피부를 통해 챌린지하였다. 15 마리의 동물 그룹을 사용하였다. 마우스를 9 일 동안 임상 질병의 징후에 대해 관찰하였다. 챌린지 후 3, 6 및 9 일에 지정된 수의 마우스 (n=5 마우스/그룹)를 안락사시켜 피부, 혈액 및 비장의 박테리아 부하를 추정하였다. 다양한 시점에서 수집된 혈액의 혈청 샘플을 웨스턴 블롯을 통해 SpeA 및 SpeC의 존재를 결정하는 데 사용하였다. (간 손상의 지표로서) 상승된 수준의 간 효소의 존재를 이전에 기술된 바와 같이 조사하였다 [19]. 백신접종 및 대조군 마우스의 혈청을 멸균 여과하고 HLA-B6 마우스 및 인간 PBMC의 비장 세포에 의한 림프구 증식 및 사이토카인 분비를 자극하는 능력에 대해 시험하였다. [³H] 티미딘 흡수 분석 및 CBA 키트를 사용하여 각각 증식 및 사이토카인 분비를 측정하였다.

따라서 우리는 STSS로부터 보호하기 위한 다음 세 가지 판독값을 갖게 될 것이다. (ii) 백신접종된 마우스 대 대조군 마우스로부터의 여과된 혈청과 함께 인큐베이션 후 시험관 내에서 HLA-B6 마우스로부터의 비장 세포 자극의 예방; 및 (iii) 백신접종된 마우스 대 대조군 마우스로부터의 여과된 혈청과 함께 인큐베이션 후 정상 인간 지원자로부터의 PBMC 자극의 예방.

IVIG는 STSS의 생존율을 크게 향상시키는 것으로 나타났으며 이는 연쇄구균 초항원에 대한 항체의 존재에 기인한다. 또한, M 단백질 및 초항원에 대한 자연적으로 획득된 항체가 STSS에 대한 보호를 담당하는 것으로 제안되었다.

우리는 HLA-B6 마우스를 SpeA POS GAS 및 SpeC POS GAS로 감염시킨 후 연쇄구균 바이오 부하 및 SpeA/C 매개 림프구 자극으로부터의 보호를 위해 항 SpeA/C 및 항-J8 항체의 조합을 시험하였다. 우선, 항생제 병용 요법없이 실험을 수행하였다. SpeA, SpeC 및 J8에 대한 모노클로날 항체가 생산되었다. 모노클로날 항체 생산을 위해 초항원 단백질 SpeA 및 SpeC를 Toxin Technology Inc. FL USA에서 상업적으로 입수하였다. 우리의 예비 데이터는 항-J8 항혈청 (IgG1 동형)이 48 시간 이내에 수용 마우스의 박테리아 생물 부하를 거의 1000 배 감소시킬 수 있으며 (도 5A), 감염 후 6 일 후에 BALB/c 마우스에 투여된 항 SpeC 항혈청이 투여 6 시간 이내에 SpeC를 중화한다 (도 5B)는 것을 보여준다. 그러나, 항 SpeC 항혈청 치료는 피부 세균 부하를 감소시키지 않았으며, 이는 J8 항체의 옵소닌 활성이 필요함을 시사한다 (도 5C). IgG1 모노클로날 항체를 재조합 초항원 및 J8에 대한 항혈청과 함께 시험하였다. 활성은 감염된 마우스 (초항원 MAb 및 J8 MAb의 경우)로부터의 WB 혈청에서 26 kDa 초항원 밴드의 부재로 정의되고, 처리 24 시간 후 (J8 MAb의 경우) 감소된 바이오 부하로 정의된다. 상당한 SpeA/C 차단 또는 바이오 부하 감소에 필요한 최적의 항체 양이 결정되었다. 가장 활성적인 차단제를 최적으로 결정된 항체 용량을 사용하는 조합 면역요법 연구를 위해 진행할 것이다.

HLA-B6 마우스 (그룹당 10 마리)를 SpeA POS 또는 SpeC POS GAS에 감염시켰다. 그 후 마우스를 항-J8 항체 단독, 항-SpeA/C 항체 단독, 둘 모두의 조합 또는 대조군 동형-매칭 Mab로 정맥 내 경로를 통해 투여하였다. 그런 다음 마우스를 임상 증상 및 매일 채취한 혈액을 관찰하여 박테리아 부하와 혈액 내 SpeA/C의 존재/부재를 추정하였다. 처리 후 다양한 시점에서 수집된 혈청을 HLA-B6 마우스 및 인간 지원자 (초항원의 존재를 나타냄)로부터 림프구를 활성화하는지를 시험하는 데 사용하였다. 혈청은 또한 간 효소 수치를 측정하는 데 사용될 것이다. STSS는 간 기능 장애를 유발하여 저관류 및 순환 독소로 인해 황달과 높은 수준의 아미노 전이 효소를 유발할 수 있다. 모든 매개 변수에서 상당한 개선이 24 시간 이내에 관찰될 것으로 예상된다. 긍정적인 임상적 이점이 있는 치료제를 항생제 치료 (페니실린) [20]를 받을 다른 마우스 코호트에게 투여하여 면역 치료가 회복을 촉진할 수 있는지를 결정하였다.

상기 언급된 다수의 연구가 아래에 요약된 실시예 2에서 수행되었다.

요약

STSS와 iGAS 질병은 매년 증가하고 있으며 사회의 모든 부문에 영향을 미치고 있긴 하지만, 소외 집단에서 집중적으로 확산되고 있다. STSS에 대한 현재 최선의 치료 옵션은 IVIG 및 항생제 치료이다. IVIG는 비싸고 품질이 다양하지만 이것은 항생제와 함께 연쇄구균 특이 항체가 치료에 필요하다는 좋은 증거를 제공한다. 우리의 예비 데이터는 M 단백질과 특정 독소에 대한 항체가 최고의 치료법이 될 것이라는 강력한 증거를 제공한다. J8-특이적 항체는 GAS를 중화시킬 수 있으며, M 단백질의 보존 영역을 표적으로 함으로써 모든 균주에 대해 보호한다는 명확한 이점을 가지고 있다. SpeC 독소 특이적 항체는 독소를 중화시킬 수 있으며 다른 주요 독소에 대한 항체인 SpeA도 마찬가지일 것이라는 원리 증명을 제공한다. 이 두 가지 독소는 대부분의 STSS 사례의 원인이다. 유기체 (항-J8)를 표적으로 하는 면역 반응과 주요 독소 (항-SpeA, 항-SpeC)를 중화시키는 면역 반응의 조합은 이전에 시험 또는 개발되지 않은 혁신적인 단계를 제공하며, 우리는 더 발전시켜 마침내 임상에 이를 상당한 능력과 경험을 가지고 있다.

참조문헌

도입:

겉보기에 경미한 연쇄구균 감염은 심각한 침습성 감염으로 급속히 악화되어 높은 사망률에 이를 수 있다. 침습성 A 군 연쇄구균 질병 (ISD)에 대해 보고된 전체 발병률은 선진국에서 100,000 명당 2 내지 4 명 사이이다. 그러나 이러한 데이터의 대부분은 1996 년과 2007 년 사이에 수행된 여러 설문 조사에서 수집된 것이다 [1, 2]. 2005 년에서 2012 년 기간 동안 미국에서 실시한 연구에 따르면 100,000 명당 3.8 명의 꾸준한 비율이 나타났다 [3]. 발병률의 주기적인 급증은 이전에 여러 국가에서 기술되었지만, 가장 최근의 보고서에 따르면 특히 2013 년 (캐나다 공중보건국)부터 캐나다 전역에서 발병률이 걱정스럽고 지속적인 증가를 나타낸다고 보고되었다. 앨버타에서는 이 비율이 2003 년 100,000 명당 4.2 명에서 2017 년 100,000 명당 10.2 명으로 급격히 증가하였다 [4]. 청년층과 노인층, 특히 개발도상국에서도 매우 높은 비율이 보고되고 있다. 예를 들어, 피지 토착민의 발병률은 2007 년에 어린 아동의 경우 100,000 명당 약 60 명, 노인의 경우 100,000 명당 75 명으로보고되었다 [2]. 현재 전 세계 실제 발생률은 알려져 있지 않지만 이용 가능한 데이터 포인트는 보고된 것보다 훨씬 더 높다.

사례의 약 20%에서 ISD는 최고 완비 시설에서 조차 40%를 초과하는 다기관 부전 및 사례 사망률과 함께 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)을 동반한다 [5]. 연쇄구균 감염 후에 발생할 수 있지만 가장 흔하게는 피부 감염 후에 발생하며 보통 괴사성 근막염, 근염 또는 깊은 타박상과 관련이 있다. 임신과 산욕기는 특히 개발도상국에서 과도한 위험의 시기이다 [6].

연쇄구균 '초항원'(SAgs)은 STSS의 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 이러한 외독소는 모든 병원성 Streptococcus pyogenes와 Staphylococcus aureus 균주에 의해 분비된다 [7]. 11 개의 연쇄구균 SAg 유전자 중 9 개는 박테리오파지에 있다. 파지 코딩 연쇄구균 발열성 외독소 (Spe) A 및 SpeC는 대부분의 STSS 사례를 담당한다. SAg는 T-세포 수용체 쇄의 보존된 영역 및 인간 MHC (HLA) 클래스 II 분자 (펩티드 결합 그루브 외부)에 대한 비특이적 결합으로 종종 CD4+ T 세포의 >25% 활성화로 폴리클로날 T-세포 활성화로 이어짐으로써 파생되는 엄청난 면역학적 효능을 가지고 있다. 그 결과 발생하는 Th1 사이토카인 폭풍은 STSS를 정의하는 저혈압 및 다기관 부전을 담당하는 인과 관계로 제안된다. 이로 인해 SAgs의 톡소이드가 백신 후보로 제안되었다 [8, 9]. 그러나 STSS의 병인은 완전히 이해되지 않았다. SLO [10], 펩티도글리칸, 리포테이코산 [11, 12] 및 M 단백질 [13]을 포함한 기타 연쇄구균 독성 인자는 시험관 내에서 염증성 사이토카인의 강력한 유도제인 것으로 나타났으며 이들 인자 또는 기타 인자는 STSS에서 중요한 역할을 담당하여 성공적인 백신 및 면역요법 개발의 핵심일 수 있다.

'J8'은 M 단백질의 고도로 보존된 C-3 반복 영역을 기반으로 한 백신 후보이다. 항체 매개 호중구 옵소닌식세포작용 (opsonophagocytosis)를 통해 피부, 점막 및 복강 내 연쇄구균 패혈증으로부터 마우스를 보호할 수 있다 [14-16]. 디프테리아 톡소이드 (DT)에 접합되면 비인간 영장류 [17]와 인간 [18]에서 면역원성이 있으며 현재 면역원성과 효능을 연구하기 위한 추가 임상 시험이 진행 중이다.

본 실시예에서, HLA DR3 DQ2-유전자이식 마우스를 사용하여 STSS를 모델링하고 J8 백신접종이 STSS 유사 질병을 예방할 수 있는지, 그리고 J8 및 SpeC-특이적 항체를 사용한 수동 면역요법이 확립된 STSS를 치료할 수 있는지 여부를 알아보았다. 데이터는 병인에서 SAg 및 M 단백질 둘 다에 대해 중요한 역할을 입증하였고, 협력적으로 작용하는 이 둘 다에 대한 항체가 질병의 임상 징후와 STSS를 앓은 질환자로부터 단리된 Strep A 유기체의 관련된 강력한 유사분열 활성을 완전히 무효화함을 보여주었다.

결과

STSS에 대한 인간화 마우스 모델 설정

SN1은 2015 년 브리즈번에서 STSS를 경험하고 질병에 걸린 질환자의 혈액에서 단리된 S. pyogenes (A 군 연쇄구균)의 emm 89 균주이다. 게놈 분석에 따르면 조사된 모든 알려진 11 개의 연쇄구균 SAg 유전자에서 SN1이 파지 코딩 SpeC 유전자와 염색체로 코딩된 SmeZ 및 SpeG 유전자를 발현함을 보여주었다 (도 15). 유기체는 SpeA에 대해 음성이었다. 또 다른 A 군 연쇄구균 (NS33) (Royal Darwin Hospital로부터 족부 궤양 질환자에서 단리)은 SAg 유전자를 발현하지 않았다.

BALB/c 마우스를 SN1 또는 NS33으로 피부 손상을 통해 감염시켰다. 이들 마우스는 피부 감염이 발생했지만 전신 감염은 발생하지 않았고 질병으로 발전하지 않았다; 그러나, SN1에 감염된 마우스로부터 수집된 혈액 샘플은 웨스턴 블롯 (WB) 분석에 의해 결정된 바에 따르면 SpeC 독소에 대해 양성이었다. NS33에 감염된 마우스의 혈액에서는 SpeC가 검출되지 않았다 (도 6 A 내지 C).

피부를 통해 SN1로 감염된 BALB/c 마우스로부터의 혈청 또는 대장균 단백질로부터의 재조합 SpeC (recSpeC)를 B6 또는 HLA-유전자이식 B6 비장 세포 배양물에 첨가하였다. 우리는 혈청 및 recSpeC 둘 다에 대해 HLA-B6 마우스 (B6 마우스는 아님)로부터의 비장 세포의 상당한 증식을 관찰하였다 (도 7A). 증식은 항-recSpeC 항체에 의해 완전히 차단되지 않았는데, 이는 SN1에 존재하는 다른 분자가 일부 유사 분열 활성을 발휘했음을 나타낸다 (도 7A). 증식 반응은 STSS 병인에 연루된 두 주요 사이토카인 TNF 및 IFN-γ의 생성으로 반영되었다 (도 7B 내지 C). NS33에 감염된 마우스로부터의 혈청은 HLA-B6 또는 B6 마우스의 비장 세포에서 어떠한 증식도 유도하지 않았다.

감염된 BALB/c 마우스 또는 recSpeC로부터의 혈청을 3 명의 건강한 성인 지원자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 첨가하여 이들 반응의 인간 관련성을 확인하였다. 우리는 NS33에 감염된 마우스가 아닌 SN1에 감염된 마우스로부터의 혈청에 대해 용량 반응 방식 (웰당 5 ul까지)으로 모든 공여자에서 림프구의 상당한 증식을 관찰하였다 (도 17). 우리는 또한 SN1에 감염된 마우스로부터의 6 일째 혈청이 인간 림프구의 최대 증식을 일으킨다는 것을 관찰하였으며 (도 7 D 내지 F), 이는 당시 혈청에서 SpeC 독소의 존재와 상관 관계가 있다 (도 6C). 이러한 데이터는 SN1이 HLA-B6 마우스 및 인간 유래 림프구를 비특이적으로 활성화할 수 있는 SpeC를 발현하며, 알려진 STSS의 병인과 일치함을 입증하였다.

다음으로 HLA-B6에서 SN1의 임상 독성을 평가하였다. 마우스를 다양한 용량의 SN1 (10⁶, 10⁷ 또는 10⁸ CFU)로 복강 내 감염시켰다. SpeC가 감염 24 시간 후 1x10⁶CFU로 감염된 마우스로부터의 혈청에서 검출되었다 (도 8A). 이때, 마우스들은 임상 증상을 보였고 (도 8B), 안락사시켰다 (승인된 윤리위원회 프로토콜에 따라). 혈액과 비장에서 세균 부하를 평가하였다 (도 8C). 우리는 박테리아 부하와 직접적으로 관련된 임상 점수로 용량 의존적 감염 결과를 관찰하였다. (도 8B 내지 C). 감염된 마우스로부터의 혈청에서 높은 수준의 TNF, IFN-γ 및 IL-2가 검출되었다 (도 9 D-F).

우리는 HLA-B6 마우스의 피부 감염이 STSS와 유사한 병리를 유발하는지 알아보았다. 1x10⁶CFU로 감염된 6 일째 날에 HLA-B6 마우스는 B6 마우스에 비해 피부 병변에서 훨씬 더 높은 박테리아 부하를 나타내었다 (도 9A). 이들 마우스는 또한 박테리아 부하가 복강 내 경로를 통해 감염된 마우스보다 훨씬 낮았지만 패혈증이 발생하였다 (도 9B). HLA-B6 및 B6 마우스 모두에서 NS33으로 감염되면 패혈증 없이 보통의 국소 감염 (10³-10⁴CFU/피부 병변)이 발생하였다 (도 9 A 내지 B). SpeC가 혈액에서 검출되었으며 (도 9C), TNF, IFN-γ 및 IL-2 수치도 높았다. NS33로 HLA-B6 마우스를 피부 감염시킨 것도 SN1 또는 NS33로 B6 마우스를 피부 감염시킨 것 어느 것에서도 사이토카인 유도를 초래하지 않았다 (도 9D 내지 F).

STSS의 백신 예방

HLA-B6 마우스가 SN1로 표재성 또는 전신 감염 후 STSS와 유사한 병리를 발생하였음을 보이면, 우리는 이것이 디프테리아 톡소이드에 결합된 J8로 백신접종하고 Alum (J8-DT/Alum)을 투여함으로써 이것이 예방될 수 있는지에 대해 알아보았다. 백신접종된 마우스는 SN1으로 피부 공격 감염 후 피부, 혈액 및 비장에서 박테리아 부하가 1000 내지 1,000,000 배 감소한 것으로 나타났다 (P 값, 각각 <0.05, <0.001 및 <0.01) (도 10A). SpeC는 PBS로 백신접종된 대조군 마우스의 혈청에서 검출되었지만 J8-DT로 백신접종된 마우스의 혈청에서는 검출되지 않았다 (도 10B). Th1 사이토카인, IFN-γ 및 TNF는 대조군 마우스의 혈청에서도 검출되었고 반면 Th2 사이토카인 IL-4 및 IL-10은 보호된 마우스의 혈청에서 발견되었다 (도 10C, D).

J8-DT 백신접종 및 감염 마우스, 및 대조군 (PBS 백신접종/감염) 마우스로부터의 여과된 혈청 또는 recSpeC을 3 명의 건강한 개인으로부터의 인간 PBMC의 배양물에 첨가하였다. PBS 백신접종/감염 마우스로부터의 혈청은 모든 개인으로부터의 PBMC에서 강력한 증식을 일으켰다 (PHA에 의해 유도된 수준의 최대 50%). 이는 recSpeC 항혈청의 첨가가 T 세포 활성화 수준을 용량 의존적 방식으로 80-90%까지 감소시켰기 때문에 주로 혈청에 존재하는 박테리아 SpeC에 의한 것이다 (도 10 E 내지 G). J8-DT 백신접종/감염 마우스로부터의 혈청은 PBS 백신접종/감염 마우스로부터의 혈청에 비해 현저히 적은 세포 증식을 일으켰고 (90-95% 감소), 이것은 recSpeC 항혈청의 첨가로 배경 수준으로 더 감소되었다 (자극 지수 ~1 ; p <0.05-0.01) (도 10 E 내지 G). 이것은 비록 이것이 WB의 검사에서 명백하지 않았음에도, J8-DT-백신접종/감염 마우스로부터의 혈청에 여전히 잔류 SpeC가 존재함을 나타내는 것이다 (도 10B). 증식 데이터와 일치하여, J8-DT 백신접종/감염 마우스로부터의 혈청에 의한 염증성 사이토카인 (IFN-γ, TNF, IL-2, IL-6, IL-17)의 PBMC 유도는 PBS 백신접종/감염 마우스로부터의 혈청에 의한 사이토카인의 생성에 비해 상당히 감소하였다 (도 11). PBS 백신접종/감염 혈청에 의해 유도된 반응은 recSpeC에 의해 유도된 반응과 비슷하였다. 따라서 이들 데이터는 연쇄구균 SpeC가 SN1 감염 후 시험관 내에서 관찰된 모든 T 세포 활성화 및 사이토카인 반응의 >90%를 담당하고 이전 J8-DT 백신접종이 혈청 유사 분열 인자의 결과로 발생한 시험관 내 반응을 >90% 예방할 수 있음을 입증한다. 우리는 이전에 J8-DT 백신접종이 챌린지 후 세균 부하를 크게 줄일 수 있음을 보여주었지만, 도 10 및 11에서의 데이터는 SN1의 M 단백질에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 항-J8 항체에 대한 별도의 역할을 배제하지 않고 그것이 가질 수 있는 모든 유사 분열 효과를 차단한다.

STSS에 대한 면역요법

recSpeC 항혈청의 치료 효능을 평가하기 위해, HLA-B6 마우스에 SN1을 피부를 통해 감염시키고 감염 후 5 일에 항혈청 (또는 나이브 혈청)으로 처리하였다. SpeC는 처리 전에 감염된 마우스로부터의 혈청에 존재했지만 6 시간 째에 측정하였을 때 현저하게 감소하였고 24 시간 째에는 존재하지 않았다. 6 시간 및 24 시간 때에 측정하였을 때 대조군 마우스에는 존재하였다 (도 12A). 항-SpeC 항혈청 처리는 나이브 혈청을 투여받은 마우스에 비해 피부나 혈액에서 박테리아 부하를 감소시키지 않았다 (도 12C).

추가 그룹의 HLA-B6 마우스를 1×10⁶SN1 박테리아로 복강 내 감염시켰다. 이들 마우스는 감염 후 18 시간에 더욱 빠르게 악화되었고, 평균 임상 점수가 10 점에 이르렀을 때 [19], SpeC 항혈청 200 μL, 항 J8 항혈청 200 μL, 이 두 조합 또는 나이브 혈청 200 μL를 정맥 내로 투여하였다 (도 13A). J8-DT 및/또는 rSpeC 항혈청을 투여받은 모든 마우스는 임상 점수의 현저한 감소와 함께 24 시간 이내에 회복되었다 (P <0.01 - P <0.001; 도 13B); 그러나, 우리는 항-J8 항체 (단독 또는 항-SpeC 항체와 조합)를 받은 마우스에서만 혈액과 비장에서 세균 제거를 관찰하였고 (P <0.01; 도 13C), 항-rSpeC 항체 (단독 또는 항-J8 항체와 조합)를 받은 마우스에서만 혈액에서 SpeC의 제거를 관찰하였다 (WB 분석 사용) (도 13D 내지 G).

SN1로부터의 M-단백질은 유사 분열 효과를 발휘하고 염증 유발 반응에 기여한다

생체 내에서 STSS 유사 병리를 치료하기 위해 J8-DT 및 SpeC 특이적 항혈청의 능력이 시험관 내 연구에 의해 추가로 밝혀졌다. HLA-B6 비장 세포에서 SN1에 감염된 마우스 유래 혈청의 유사 분열 효과는 항-SpeC 및 항-J8-DT 항혈청에 의해 부분적으로 차단되었지만 두 항혈청의 조합에 의해 완전히 차단되었으며 (도 14B), 이것은 특정 항체가 이 모델에서 STSS 치료에 이중 역할을 함을 제시한다: 이들은 박테리아를 제거하지만 emm89 M 단백질의 유사 분열 효과도 차단한다. 이것은 항-SpeC 혈청과 시너지 효과가 있다. 가능성은 낮지만 SN1 혈청에는 J8 교차 반응 에피토프를 포함하는 다른 유사 분열 인자가 포함될 수 있다. 따라서 우리는 항-J8 항체가 recM1의 유사 분열 효과를 차단하는지 여부를 알아보았다. 도 14C는 recM1과 SpeC가 모두 유사 분열 활성을 갖고 (이전에 나타낸 바와 같이) 둘 다의 효과가 상가적임을 보여준다. 또한 항-J8-DT 항혈청은 recM1의 유사 분열 효과를 완전히 차단한다. 항-J8-DT와 항-SpeC의 조합은 M1 + SpeC의 결합된 유사 분열 활성을 완전히 차단한다. 이들 데이터는 항-J8 항체가 두 상이한 M 단백질의 유사 분열 활성을 차단할 수 있음을 종합적으로 나타낸다. 데이터는 J8 에피토프가 유사 분열 활성을 가지고 있음을 암시하지 않으며, 단순히 J8에 대한 항체가 M 단백질을 중화할 수 있다는 것을 암시한다. 그밖에 M 단백질의 유사 분열 결정자가 단백질의 아미노 말단 절반에 위치한다고 제안되었다.

검토:

본원에 제시된 데이터는 HLA-인간화 마우스 모델에서 백신접종을 통해 STSS 유사 질병을 예방하고 J8 및 SpeC에 대한 항체를 포함하는 특정 면역요법으로 확립된 질병을 신속하게 치료할 수 있음을 보여준다. J8에 대한 항체는 박테리아를 제거할 뿐만 아니라 M 단백질의 유사 분열 효과를 직접 차단하는 이중 효과를 가지는 반면 SpeC에 대한 항체는 해당 단백질의 활성을 차단한다. 함께하면, 그 효과는 시너지 효과가 있으며 STSS 유사 질병을 완전히 해결할 수 있다.

STTS 예방을 위한 백신 개발 노력은 제한적이다. 한 그룹은 SpeA 및 SpeC에 대한 톡소이드를 개발하였고 토끼의 백신접종로 독소를 중화하고 미니 삼투 펌프를 통해 투여되는 천연 독소로부터 토끼를 보호하는 항체로 이어질 수 있음을 보여주었다. 토끼는 연쇄구균 감염에 노출되지 않았다 [8, 9]. 이 백신 접근법은 유망하지만, 연쇄구균 질병의 한 측면만을 보호하기 위해 다중 톡소이드로 백신접종을 해야 할 필요성이 있다. 우리의 데이터는 이 접근법이 세균성 패혈증을 감소시키지 않을 것임을 제안한다. HLA 유전자이식 마우스가 특정 HLA 유형이 STTS에 더 취약하다는 것을 보여주기 위해 사용되었지만 [20], 연쇄구균 STSS에 대한 백신 또는 치료 개발을 모델링하지는 않는다. 그러나 이들은 Staphylococcus aureus 유래 초항원의 정의된 무독성 단편을 사용하여 후보 백신을 개발하는 데 사용되고 있다 [21]. 이들 마우스는 유기체가 아니라 재조합 SAg로 챌린지되었다.

우리는 고도로 보존된 M 단백질 세그먼트를 기반으로 한 후보 StrepA 백신을 개발하였다 ([22]에서 검토됨). 항원은 J8로 알려져 있으며 그 서열은 M 단백질의 C3-반복의 12 개 아미노산을 카피한다. 디프테리아 톡소이드 (J8-DT)에 결합된 J8 백신접종으로 M-타입에 관계없이 시험관 내에서 StrepA를 옵소닌화하는 항체를 유도하고, 챌린지 후 세균 부하를 줄여서 복강 내, 피부 및 점막 공격으로부터 마우스를 보호할 수 있었다 [14, 16, 23-25]. HLA 인간화 마우스에서 시험되지는 않았지만 이러한 백신 매개 보호가 STSS에 대한 보호까지 확장될 것으로 가정했다. 그러나, sAgs는 질병에서 중심 역할을 하는 것으로 여겨지고 J8에 대한 항체가 혈청 sAgs 수준에 영향을 미칠 것이라고는 제안이 없었기 때문에, 세균 부하가 약간 감소되었다 하더라도 항-J8 항체로의 수동 면역요법이 확립된 질병을 해결할 수 있을 것이라고 가정하지는 않았다. 200 μL의 J8 면역 혈청 (항 SpeC 항혈청 유무에 관계없이)이 사실상 혈액과 비장에서 모든 박테리아 부하를 제거하고 임상 점수를 해결할 수 있다는 사실에 놀랐다. 특히 항-SpeC 항체도 임상 징후를 빠르게 해결할 수 있기 때문에 우리의 데이터는 STSS의 발병 기전에서 SpeC 또는 sAgs에 대한 중요한 역할에 이의를 제기하지 않는다. 그러나 질병 발현이 sAg만이 아니라 더 많은 것을 필요로한다는 것을 분명히 보여준다.

SAgs 외에도, 연쇄구균 M-단백질은 심각한 연쇄구균 감염을 유발하는 전염증 반응과 관련이 있는 것으로 보고되었다 [26-29]. TLR2를 통해 단핵구를 자극함으로써 M-단백질은 다량의 전염증성 사이토카인을 생성할 수 있다. 호중구 유래 헤파린 결합 단백질 (HBP)과의 시너지 작용을 통해 M 단백질은 혈관 누출을 유도하고 심한 연쇄구균 감염에서 나타나는 병태생리학적 결과에 기여한다 [30]. M1, M3 및 M5와 같은 일부 M 단백질은 ISD 및 STSS 발생과 일관되게 연관되어 있다 [31-33]. M1 및 M5와 같은 특정 혈청형에서 M 단백질의 B 반복 영역은 또한 초항원으로 작용하여 염증 반응에 기여할 수 있다 [34]. 특정 연쇄구균 혈청형 (상이한 표면 M 단백질로 균주를 구별함)이 ISD와 관련이 있는 것으로 보고되었지만, 이 연관성은 단순히 그 당시 일반 인구에서 가장 흔한 혈청형을 반영한 것으로 생각된다 [2]. 그럼에도 불구하고, M 단백질은 선천성 면역과 후천성 면역을 모두 하향 조절하고 ISD의 병인에 기여할 수 있다.

emm89 StrepA 및 SpeC와 ISD의 연관성이 최근 여러 보고서 및 일본에서 알려졌으며, 일본에서는 emm89가 STSS 사례에서 발견된 두 번째로 가장 우세한 유전자형이었다 [35].

표면 M 단백질 (및 SAgs)에 대한 항체는 침습성 질병이 발생한 개인에서 현저히 낮은 것으로 알려져 있으며 [36], 일반 인구에서 낮은 수준의 항체가 1980 년대에 시작된 ISD의 유행병에 기여했다고 제안되었다. [37, 38]. 그러나, 감염 전 개인의 항체 수치가 낮았는지, 항체 이화 작용으로 인해 감염이 시작된 후 항체 수치가 낮아지기 시작했는지는 확인할 수 없다. 이 문제를 다루기 위한 직접적인 방법은 동물을 백신접종하고 챌린지 또는 감염시킨 뒤 처리할 수 있는 STSS 모델을 사용하는 것이다.

우리는 독소의 존재가 전신 감염과 무관하다는 것을 발견하였다. SpeC는 검출 가능한 균혈증없이 표재성 피부 감염 후 마우스의 혈액에서 검출되었다. 이들 마우스는 질병의 병리학적 징후를 보였다. 이것은 임상 질병의 일부 사례에서 관찰된다 [39]. 우리는 표재성 피부 감염 후에, 감염 후 6 일 째에 감염된 혈청에서 독소가 검출되었음을 주목하였다. 이것은 감염의 초기 단계에서 독소의 느린 방출을 제안한다. 이 관찰은 감염 후 7 일 째에 높은 수준의 SpeA의 발현이 관찰된 테플론 조직 챔버 모델과 일치한다 [40]. STSS 유동 IP 감염의 급성 발병은 감염 후 24 시간 이내에 감염된 마우스의 혈액에서 독소가 검출되어 높은 임상 점수로 이어지는 것이 매우 분명하였다. 대조적으로 표재성 피부 감염은 감염의 점진적인 발병을 나타낸다.

우리는 마우스와 인간 모두에서 SAgs의 유사 분열 활성과 관련된 전형적인 병리를 입증하였다. 감염된 마우스로부터의 혈청에 포함된 SpeC의 양은 HLA-B6 마우스로부터의 비장 세포를 ConA 또는 rSpeC에 의해 유발된 것과 비슷한 수준 (더 높지 않은 경우)으로 자극할 가능성이 있었다. SN1 감염 혈청에 의한 증식은 rSpeC 단독에 의한 증식보다 높았다; 따라서 SN1 감염 혈청에 존재하는 일부 다른 유사 분열 인자의 관여를 시사한다.

감염된 마우스로부터의 혈청에 항 SpeC 항혈청을 첨가하면 증식 반응을 현저히 억제할 수 있으며, 따라서 증식이 주로 SpeC에 기인함을 확인하였다. 그럼에도 불구하고, 처리 그룹에서 관찰된 잔류 증식은 다른 SAg 또는 M 단백질을 비롯한 StrepA의 다른 독성 인자의 관련을 제시한다.

우리는 HLA-B6 마우스의 백신접종이 STSS 예방에 효과적이라는 것을 주목하였다. 특히 보호 메커니즘은 분비된 SpeC의 특정 중화가 아니라 Strep A의 제거를 포함한다. J8-DT 백신접종은 국소 및 전신 세균 부하를 현저히 감소하여 (> 90%) STSS 관련 병리로부터 마우스를 보호하였다. 더욱이, 백신접종에 감염된 마우스로부터의 혈청도 건강한 개인으로부터 PBMC의 최소 증식을 유발하는 것으로 나타났다. 우리는 이 효과가 SpeC 부족에 기인할 수 있을 뿐만 아니라 일반적으로 StrepA 감염의 결과로 존재하고 전반적인 질병 결과에 기여하는 혈청의 다른 요인이 부족하기 때문이라고 생각한다.

수동 면역요법은 STSS를 치료하는 수단으로 유망하다. 정맥 내 면역글로불린 (IVIG)은 STSS의 사망률을 상당히 감소시키는 것으로 나타났다 [41]. 이 연구는 과거 대조군을 사용했지만 전향적 대조군이 있는 67 명의 질환자를 대상으로 한 보다 최근의 스웨덴 연구에서 사망률은 항생제만 투여한 44 명의 질환자에서 22 명 (50%) 대 IVIG와 항생제로 처리한 그룹에서 23 명 중 3 명 (13%)이었다. (P <0.01) [42]. 그러나 IVIG에서 >40의 초항원 항체 역가가 임상적 이점을 위해 필요한 것으로 추정되었다. 이것은 IVIG에서 발견되는 특정 항체의 대략적인 양이며 그로서 IVIG의 다중 용량이 권장된다. IVIG의 높은 비용, 배치별 변동 [43] 및 공급의 어려움은 대체 보조 요법의 필요성을 강조한다. 모든 StrepA 균주로의 감염을 예방하는 백신이나 항생제를 사용하거나 사용하지 않고 진단시 제공한 특정 항체 면역요법이 훨씬 더 유용할 것이다. 우리는 rSpeC 항혈청을 투여하면 독소를 중화시킬 수 있지만 SN1 감염 HLA-B6 마우스에서 박테리아 부하를 줄일 수 없다는 것을 발견하였다. 이 관찰은 개인을 치료하기 위해 시스템에서 독소가 완전히 제거될 때까지 다중 용량의 항 rSpeC 혈청이 필요하다는 사실을 강조한다. 그러나, 개인이 생 StrepA를 보유하고 있는 한 독소 및 관련 병리에 대한 우려는 없어지지 않을 것이다.

우리는 독소를 중화시키고 시스템에서 StrepA를 제거하는 복합 면역요법이 더 나은 대안이 될 수 있다고 가정하였다. Strep A의 제거는 독소 중화를 위한 지속적인 치료의 필요성을 감소시킬 뿐만 아니라 STSS 병리에 기여하는 다른 독성 요인의 가능성도 제거할 것이다. 이전 보고서와 일치하게, 우리는 HLA-B6 모델에서 StrepA SAgs가 STSS의 병태생리학의 유일한 결정자가 아닐 수 있으며 M-단백질을 포함한 StrepA의 다른 독성 인자가 중요한 역할을 할 수 있음을 입증하였다. emm89 Strep A 단리물을 활용하여 SAg SpeC 및 StrepA M 단백질이 연합하여 작용하고 감염후 보이는 임상 질병에 기여한다는 것을 보여줄 수 있었다. J8-DT 항혈청에 의한 M 단백질의 생체 내 중화는 호중구에서 B2 인테그린을 통한 피브리노겐 및 후속 인식과의 상호 작용을 방지한다. 결과적으로 STSS의 주요 발생인 혈관 누출 매개체의 활성화 및 방출이 없다. M 단백질의 시험관 내 중화는 사이토카인 유도 결여 및 이후 염증 반응과 관련된 상이한 메커니즘을 따랐을 가능성이 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 목적은 본 발명을 어느 한 실시양태 또는 특정 특징들의 집합으로 제한하지 않고 본 발명의 바람직한 실시양태들을 설명하는 것이다. 본 발명의 광범위한 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 설명되고 예시된 실시양태에 대해 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있다.

본원에 언급된 모든 컴퓨터 프로그램, 알고리즘, 특허 및 과학 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

참조문헌:

Claims

포유동물에서 A 군 스트렙토코쿠스 관련 질병, 장애 또는 상태, 바람직하게는 침습성 A 군 연쇄구균 질병 (iGAS), 예컨대 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS)에 대해 수동 면역화하거나, 이를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편 및/또는 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편.
포유동물에서 A 군 스트렙토코쿠스 관련 질병, 장애 또는 상태, 바람직하게는 침습성 A 군 연쇄구균 질병 (iGAS), 예컨대 연쇄구균 독성 쇼크 증후군 (STSS에 대해 수동 면역화하거나, 이를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체 및/또는 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체.
A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 포유동물에 투여하여 포유동물의 연쇄구균 독성 쇼크 증후군에 대해 포유동물을 수동 면역화하는 단계를 포함하는, 포유동물을 연쇄구균 독성 쇼크 증후군에 대해 수동 면역화하는 방법.
제3항에 있어서, A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체 및/또는 A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 포유동물에게 투여하여 포유동물의 연쇄구균 독성 쇼크 증후군을 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 연쇄구균 독성 쇼크 증후군을 치료 또는 예방하는 방법.
제5항에 있어서, A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체 및/또는 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 포유동물에게 투여하기에 적합한 조성물.
제7항에 있어서, A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편을 추가로 포함하는 조성물.
A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체 및 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 포유동물에게 투여하기에 적합한 조성물.
제1항 또는 제2항, 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항 또는 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, M 단백질 단편이 M 단백질의 보존된 영역이거나, 이를 포함하는, 용도, 방법 또는 조성물.
제10항에 있어서, M 단백질 단편이 p145 펩티드이거나, 이를 포함하거나, 그 안에 함유된, 용도, 방법 또는 조성물.
제11항에 있어서, M 단백질 단편이 J8 펩티드, 이의 단편, 변이체 또는 유도체이거나, 이를 포함하거나, 그 안에 함유된, 용도, 방법 또는 조성물.
제11항에 있어서, M 단백질 단편이 p17 펩티드, 이의 단편, 변이체 또는 유도체이거나, 이를 포함하거나, 그 안에 함유된, 용도, 방법 또는 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 초항원이 연쇄구균 발열성 외독소 (Spe) A 또는 SpeC인, 용도, 방법 또는 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편 및/또는 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편이 모노클로날 항체 또는 항체 단편인, 용도, 방법 또는 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편 및/또는 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편이 인간화 모노클로날 항체 또는 항체 단편인, 용도, 방법 또는 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 인간인, 용도, 방법 또는 조성물.
A 군 스트렙토코쿠스 M 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대한 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 모노클로날 항체 또는 이의 단편; 또는 A 군 스트렙토코쿠스 초항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 이에 대해 생성되는 항체 또는 항체 단편.
제18항 또는 제19항에 있어서, 재조합 항체 또는 항체 단편인, 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
제20항에 있어서, 인간화된 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
제22항의 단리된 핵산을 포함하는 유전자 작제물.
제23항의 유전자 작제물을 포함하는 숙주 세포.
(i) 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편; (ii) 제22항의 단리된 핵산; (iii) 제23항의 유전자 작제물; 및/또는 (iv) 제24항의 숙주 세포를 포함하는 조성물.