KR20200046059A - 그룹 a 스트렙토코쿠스에 대한 면역원성 펩티드 - Google Patents

그룹 a 스트렙토코쿠스에 대한 면역원성 펩티드 Download PDF

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마이클 에프. 굿
마니샤 판데이
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Abstract

포유동물 예컨대 인간에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아에 대한 점막 면역 반응을 유발하는데 사용하기 위한 증진된 점막 면역원성을 갖는 변형된 p145 펩티드. 상기 변형된 p145 펩티드의 근육내 투여가 특히 효과적일 수 있다. S2 펩티드 또는 변이체가 면역 반응을 증진시키기 위해 상기 변형된 p145 펩티드와 공동-투여될 수 있다.

Description

그룹 A 스트렙토코쿠스에 대한 면역원성 펩티드
본 발명은 그룹 A 스트렙토코쿠스 (group A streptococcus) 스트렙토코쿠스-관련 질환 및 병태를 예방 및 치료하기 위한 면역원성 펩티드에 관한 것이다.
수 많은 비-감염성 질환뿐만 아니라 감염성 질환을 예방 및 방어하기 위한 백신으로서 합성 및 재조합 펩티드가 개발되고 있다. 이들의 유용성은 외래 또는 숙주 단백질에 대한 네이티브 에피토프를 모방하고, 방어적 또는 유해한 면역 반응을 특히 활성화 또는 조절하는 능력에 있다. 암, 알레르기, 다발성 경화증, 및 고혈압, 당뇨병 및 알츠하이머병과 같은 만성 질환을 포함하는 많은 비-감염성 질환에 대해 상당한 진전이 이루어졌다 (1). 그러나, 이들의 가장 큰 유망함은 감염성 질환을 예방하는 백신에 있다. 이들의 작은 크기는 다수의 표적 항원으로부터의 에피토프를 혼입한 다-성분 백신 (multi-component vaccines) (2), 다수의 대립유전자 형태로 존재하는 유기체로의 감염을 예방할 수 있는 백신 (3), 및 유기체가 면역 반응을 자연적으로 유도하지 않지만, 일단 백신에 의한 유도 시에 유기체에는 치명적인 면역 반응의 생성을 초래하는 히든 (hidden) 또는 크립틱 (cryptic) 에피토프를 표적으로 할 수 있는 백신 (4)의 디자인에 매우 용이하다.
B 및 T 세포에 의해 인식되는 에피토프는 크기가 작고, 그 크기로 인해 쉽고 저렴하게 합성될 수 있다. 그러나, 이들의 크기가 작기 때문에, 이들이 자극하는 B 또는 T 세포의 래퍼토리는 매우 제한적이며, 이러한 이유로 인간에게 사용하기 위한 펩티드-기반 백신이 아직 개발되거나 라이센스되지 않았다.
스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (the Lancefield group A streptococcus: GAS)에 대한 백신은 상기 박테리아에 의해 야기되는 소모성 질환 (debilitating diseases), 특히 류마티스 열 및 류마티스 심장병으로 인해 오랫동안 연구되어 왔다. 류마티스 열은 대부분의 선진국에서는 오늘날 드문 질환이지만, 개발도상국에서는 어린이, 청소년 및 청년층에서 후천성 심장병의 주된 원인으로 남아 있다. 또한, 침습적 GAS 질환은 어린이 및 성인에서 종종 패혈증의 원인이 되며, 고-증례 치사율 (high-case fatality rate)을 갖는다. 또한 GAS 질환의 부담에 추가로 스트렙토코쿠스 감염후 사구체신염 (post-streptococcal glomerulonephritis)이 있고, 이는 아마도 많은 GAS 발병 지역에서 말기 신부전이 높은 비율로 발생되는 원인이 된다. 매년 GAS 감염 중 GAS 인두염 (pharyngitis) 및 농가진 (impetigo)이 가장 많은 절대적 숫자를 차지한다. GAS 인두염은 연간 학령기 어린이의 약 8%-15%에 영향을 주며, GAS 농가진은 어린이에서 10-50%의 유병율의 매우 일반적인 감염증이다. GAS-관련 질환은 개발도상국에서 심각한 문제일뿐만 아니라 심지어 선진국에서 조차도 표준 항생제 요법에 내성이 있고 중증 괴사근막염 (severe necrotizing fasciitis)과 같은 소모성 질환을 일으키는 특히 전염성인 강한 GAS 균주가 출현하였다.
그룹 A 스트렙토코쿠스에 대한 펩티드-기반 백신은 p145, J8 및 J14 펩티드와 같은 M 단백질-유래 펩티드에 초점을 두고 있다. 현재, 효모-유래 나선형 펩티드 (GCN4) 아미노산 서열에 내포된 p145 내의 12개의 아미노산 최소 에피토프를 포함하는 J8 펩티드는 선두의 백신 후보체이다 (12). 상기 GCN4 아미노산 서열은 면역계에 대한 최소 에피토프의 디스플레이를 최적화하기 위해 펩티드 나선도 (helicity)의 유지를 돕는다. 상기 백신 후보체는 또한 피부 질환에 대한 방어를 유도하기 위해 3회 용량을 필요로 한다 (19).
놀랍게도, 본 발명자는 p145 펩티드의 면역원성이 p145의 아미노산 서열의 표적화된 변형에 의해 실질적으로 증가될 수 있다는 것을 발견하였다. 다수의 면역화보다는, 변형된 p145 펩티드의 단회 용량에 의한 면역화가 CovR/S 돌연변이체 균주와 같은 고독성 균주 (hypervirulent strains)에 의한 그룹 A 스트렙토코쿠스 감염까지도 방어할 수 있다. 예상치 못하게, 상기 변형된 p145 펩티드, 단편 또는 변이체는 포유동물에의 투여 시에 점막 면역 반응 (mucosal immune response)을 유발한다. 상기 점막 면역 반응은 IgG의 생성을 특징으로 하며, 반면에 IgA 생성은 생성된 IgG의 수준과 비교하여 실질적으로 부재하거나 또는 상대적으로 감소된 수준이다.
본 발명은 광범위하게는 특히 점막 면역 반응을 유발시키기 위해 면역원성을 실질적으로 향상 또는 증진시키는 하나 이상의 아미노산 서열 변형을 포함하는 p145 펩티드에 관한 것이다. 바람직한 일 형태에서, 상기 펩티드는 서열번호:1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 양상은 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 서열번호:3의 잔기 13 및 17의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질; 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편; 또는 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 단리된 핵산을 상기 포유동물에게 투여하여 이에 의해 면역 반응을 유발하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염에 대한 면역을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 서열번호:3의 잔기 13 및 17의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질; 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편; 또는 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 단리된 핵산을 상기 포유동물에게 투여하여 이에 의해 상기 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염에 대한 면역을 유도하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 일 양상은 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 서열번호:3의 잔기 13 및 17의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질; 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편; 또는 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 단리된 핵산을 상기 포유동물에게 투여하여 이에 의해 상기 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염을 예방 또는 치료하는 단계를 포함한다.
상기 변형된 p145 펩티드, 단편 또는 변이체는 적절하게는 잔기 13에서 아스파라긴 (N) 아미노산 및 잔기 17에서 아르기닌 (R) 아미노산을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 변형된 p145 펩티드, 그의 단편 또는 변이체는 서열번호:1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 변형된 p145 펩티드 단편은 서열번호:2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 상기 변형된 p145 펩티드, 단편 또는 변이체는 포유동물에게 투여 시에 점막 면역 반응을 유발한다.
적절하게, 상기 점막 면역 반응은 IgG의 생성을 특징으로 한다. 전형적으로, IgA 생성은 생성된 IgG 수준과 비교하여 실질적으로 부재하거나 또는 상대적으로 감소된 수준이다.
바람직하게, 상기 변형된 p145 펩티드, 단편 또는 변이체는 포유동물에게 근육내 투여 시에 점막 면역 반응을 유발한다.
바람직하게, 상기 양상의 포유동물은 인간이다.
상기 양상의 특정한 일 구체예에서, 상기 변형된 p145 펩티드, 단편 또는 변이체는 SpyCEP 단백질의 면역원성 단편과 조합하여 투여될 수 있다. 바람직하게, 상기 SpyCEP의 단편은 S2 펩티드 (서열번호:23) 또는 변이체 예컨대 K4S2 펩티드 (서열번호:24)이거나 또는 이를 포함한다.
그러므로 본 발명의 관련 양상은 하기를 포함하는 조성물을 제공한다: 서열번호:3의 잔기 13 및 17의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질, 그의 단편 또는 변이체, 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편 또는 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 단리된 핵산; 및 SpyCEP 단백질의 면역원성 단편 또는 그의 변이체, 상기 SpyCEP 면역원성 단편 또는 그의 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편 또는 상기 SpyCEP 면역원성 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 단리된 핵산.
적절하게, 상기 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열은 잔기 13에서 아스파라긴 (N) 아미노산 및 잔기 17에서 아르기닌 (R) 아미노산을 포함하며, 바람직하게는 서열번호:1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 변형된 p145 펩티드의 단편은 서열번호:2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 SpyCEP의 단편은 서열번호:23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 S2 펩티드 또는 그의 변이체이거나 또는 이를 포함한다. 상기 변이체는 서열번호:24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 K4S2 펩티드일 수 있다.
본원에서 사용되는, 부정관사 'a' 및 'an'은 단수 또는 복수의 요소 또는 특징을 나타내거나 또는 포함하는데 사용되며, "하나 (one)" 또는 "단일 (single)" 요소 또는 특징을 의미하거나 또는 정의하는 것으로 간주되어서는 안된다.
문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함한다 (comprise)", "포함하다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)", 또는 유사 용어들은, 요소 또는 특징의 열거 목록이 명시 또는 열거된 요소만을 포함하는 것이 아니라, 명시 또는 열거되지 않은 다른 요소 또는 특징도 포함할 수 있는, 비배타적 포함 (non-exclusive inclusion)을 의미한다.
아미노산 서열과 관련하여 "필수적으로 구성되는 (consisting essentially of)"이라 함은 열거된 아미노산 서열과 N-말단 또는 C-말단에서 추가의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산을 함께 갖는 것을 의미한다.
도 1: 펩티드 라이브러리 디자인: (A) p145 항혈청에 의한 다양한 p145 변이체 펩티드의 인식 : (A) p145의 86개의 변이체로 구성된 펩티드 라이브러리를 p145 항혈청으로 스크리닝하였다. 상기 p145 항혈청을 B10.D2 마우스에서 생성하고, 각 펩티드에 결합하는 p145 항혈청의 능력은 ELISA를 사용하여 결정하였다. 상기 p145내에서 최소 에피토프 서열은 그래프 상단에 있으며, 여기서 각 아미노산에서 돌연변이를 겪고 있는 펩티드 서열 번호는 하기에 괄호로 표시하였다. 수직선은 동일한 위치의 돌연변이에 기반하여 펩티드를 분리하였다. 상기 펩티드 87은 비-특이적 대조군 펩티드 (pNS)이다. ( B) p145 변이체 라이브러리 내의 면역우 세 펩티드의 확인: 펩티드-저해 ELISA를 수행하여 p145 변이체 풀 (pool) 내에 면역우세 (immunodominant) 펩티드를 확인하였다. 농도 0.25 μg/ml의 선택된 펩티드를 p145 항혈청과 인큐베이션하였다. 그 다음에 상기 혈청을 고정된 p145에 대해 ELISA에서 사용하였다. 항원 (p145)-특이적 혈청을 과-면역화된 (hyper-immunised) B10.D2 마우스로부터 수집하였다. 각 막대에 대한 데이터는 평균 ± SEM이다. (C) 2개의 변경을 갖는 펩티드 라이브러리 2 (L2) 디자인 : 상기 선택된 7개의 펩티드를 활용하여, 모체 p145의 면역원성을 증진시키기 위해 확인된 위치에서 2개의 아미노산 치환을 갖는 신규한 펩티드 라이브러리를 디자인하였다. p145 최소 에피토프 내에 다양한 위치에서 돌연변이를 나타내는 결과의 펩티드를 도시하였다.
도 2: 이중 돌연변이된 펩티드에 대한 면역 반응 : (A) 면역화 펩티드에 대한 ELISA 역가를 나타내는 outbred Quackenbush 마우스에서 선택된 펩티드의 면역원성: 마우스 코호트를 아쥬반트로 제제화된 펩티드 항원으로 0일, 21일 및 28일에 피하로 면역화하였다. 1000 이하의 항원 특이적 역가를 가진 코호트의 마우스에게 35일에 추가 부스트 (boost)를 주었다 ("로 표시함). 상기 마우스로부터 20일, 27일, 34일 및 41일에 채혈하였다. 대조군 마우스에게 원래의 p145 또는 PBS를 투여하였다. 항원-특이적 혈청 IgG 역가는 ELISA를 사용하여 결정하고, 펩티드 1-5 (1 i), 6-12 (ii) 및 13-18 (iii)에 대한 평균 ± SEM을 나타내었다. ( B) 항-펩티드 IgG의 고정된 p145에의 결합: 친화도-정제된 펩티드-특이적 혈청 IgG가 증가하는 농도의 p145 펩티드에 결합하는 능력을 ELISA로 결정하였다. ELISA 플레이트 상에 고정된 펩티드 p145를 outbred Quackenbush 마우스로부터의 상이한 펩티드 특이적 정제된 혈청 IgG와 인큐베이션하였다. 농도 5 μg /ml에서 항체 결합을 (i) 펩티드 1-5 및 (ii) 펩티드 6-10 (iii) 펩티드 11-13 및 (iv) 펩티드 15-18에 대해 나타내었다. 평균 흡광도 (450nm) ± SEM을 나타내었다. Holm-Sidak 다중 비교 테스트에 의한 ANOVA를 사용하여 p145와 비교한 유의성을 계산하였다.
도 3: 펩티드 특이적 항체의 GAS 표면에의 결합 효율: 상기 펩티드-특이적 혈청 IgG가 전체 박테리아에 결합하는 능력을 결정하기 위해, 유세포측정 분석을 2개의 GAS 균주인 (A) 2031 (emm1) 및 (B) 88/30 (emm97)을 사용하여 수행하였다. 항-펩티드 항체와 인큐베이션 후에, FITC 접합된 항-마우스 IgG를 사용하여 항체의 GAS에의 결합을 결정하였다. 결과는 각 그룹의 3회 복제 (replicates)로 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity: MFI)의 평균 ± SEM으로 나타내었다. 본 도면에서 수평선은 p145 IgG와 비교하여 다양한 펩티드-특이적 IgG의 p145에의 상대 결합을 나타내었다. Tukey's post hoc 방법에 의한 ANOVA를 사용하여 p145와 비교한 유의성을 결정하였다. (C) p*17-특이적 IgG의 GAS 2031, 88/30 및 JRS145 (M-네가티브 GAS 균주)에의 결합을 나타내는 대표적인 히스토그램을 도시하였다.
도 4: 다양한 GAS 균주에 의한 표재 피부 감염에 대한 방어에 있어서 p145-DT 및 그의 변이체 p*17-DT의 면역원성 및 방어 효능: BALB/c 마우스 코호트 (각 n=10 마우스)를 30 μg의 p145-DT 또는 p*17-DT 또는 PBS-Alum 제제로 0일차에 피하로 면역화하였다. p145 특이적 IgG 반응을 평가하기 위해 면역화 후 1일 및 20일에 혈청 샘플을 수집하였다. 일부 대표적인 마우스 (n=5)로부터의 데이터를 도시하였다 (A). 21일차에, 상기 마우스를 GAS 2031 (B 및 C) 또는 GAS 88/30 (D 및 E)으로 피부 감염 경로를 통해 챌린지하였다 (challenged). 감염 후 3일 및 6일차에, 그룹당 5마리의 마우스를 희생시키고, 피부 (B 및 D) 및 혈액 (C 및 E) 중에 GAS 박테리아 부담을 결정하기 위해 샘플을 수집하였다. 각 시점에서 각 그룹의 5마리의 마우스에 대한 결과를 평균 ± SEM으로 나타내었다. Tukey's post hoc 방법에 의한 ANOVA를 사용하여 각 시점에서 모든 처리된 코호트와 대조군 코호트 사이의 유의성을 결정하였다. *p<0.05, ***p< 0.001.
도 5: p145 및 p*17 펩티드의 구조: 잔기 3 내지 13의 CA에 기반하여 정렬된 50 ns MD 시뮬레이션으로부터 수득된 p145 (자홍색) 및 p*17 (녹색)의 대표적인 구조의 오버레이 (C-말단 아미노산은 적색으로 나타내고, N-말단 아미노산은 청색으로 나타냄) (A). Lys-13 13은 p145에서 나선형 특성을 파괴한다. 상기 펩티드가 나선형 입체형태를 채택할 가능성을 (B)에 도시하였고, 이는 p145가 p*17과 비교하여 나선형 입체형태를 형성할 가능성이 유의하게 낮음을 나타낸다. p*17과 비교하여 p145의 제곱 평균 변동 (Root mean square fluctuations: RMSF)을 (C)에 도시하였다. p145는 p*17과 비교하여 유의하게 더 높은 변동을 보여주었다. p*17에서 Asn-13과 비교하여 p145에서 Lys-13에 대해 유연성의 최대 차이를 볼 수 있다.
도 6: p145 변이체 라이브러리 내의 면역우세 펩티드의 확인: 펩티드-저해 ELISA를 수행하여 p145 변이체 풀내에서 면역우세 펩티드를 확인하였다. 농도 2.5 μg/ml의 선택된 펩티드를 p145 항혈청과 인큐베이션하였다. 그 다음에 상기 혈청을 고정된 p145에 대해 ELISA에서 사용하였다. 항원 (p145)-특이적 혈청을 과-면역화된 B10.D2 마우스로부터 수집하였다. 각 막대에 대한 데이터는 평균 ± SEM이다.
도 7: 펩티드 항혈청의 인간 단백질과의 교차-반응성: ELISA를 사용하여 이중 돌연변이된 펩티드 (L2) 항혈청의 인간 유래 단백질 (a) 트로포미오신 (tropomyosin), (b) 미오신 (myosin) 및 (c) 케라틴 (keratin)의 교차-반응성을 결정하였다. 평균 흡광도 (450nm) ± SEM을 도시하였다.
도 8: BALB /c 마우스에서 1, 2 또는 3회의 면역화 후에 p145-DT의 방어 효능: BALB/c 마우스 코호트 (10 마우스/그룹)에게 0일, 21일 및 28일에 p145-DT 또는 PBS와 아쥬반트로 1, 2 또는 3회 피하 주사하였다. 88/30 GAS로 피부 챌린지 후에 백신의 효능을 평가하였다. 마우스 코호트에 대해 감염 후 3일 및 6일 동안 피부 (A) 및 혈액 (B) 중에 박테리아 부담을 도시하였다. 단회 면역화 후에 p*17-DT의 방어 효능: (C) BALB/c 마우스 코호트 (10 마우스/그룹)를 0일에 p*17-DT, 열 사멸된 GAS (2031) 또는 PBS와 아쥬반트로 단회 면역화하였다. 항원-특이적 IgG 역가를 면역화 후 20일에 결정하였다. 열-사멸된 GAS 1로 면역화된 마우스에 대한 역가를 ELISA 플레이트에 고정된 재조합 M1 단백질에 대해 테스트하였다. Mann-Whitney 테스트를 사용하여 2개의 백신화된 그룹 사이의 유의성을 결정하였고, 여기서 **p< 0.01이다. (D) 면역 후 21일차에, 마우스를 피부 감염 경로를 통해 CovR/S 돌연변이체 5448AP GAS로 챌린지하였다. 감염 후 3일차 및 6일차에 박테리아 부담에 대해 피부 샘플을 평가하였다. PBS 대조군 코호트와 비교하여 p*17-DT 또는 열 사멸된 GAS 면역화된 코호트에서 박테리아 수의 감소 퍼센트를 도시하였다. Tukey's post hoc 방법에 의한 ANOVA를 사용하여 각 시점에서 모든 백신화된 코호트와 대조군 코호트 사이의 유의성을 결정하였다. **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 9: 근육내 면역화 계획. 마우스를 p*17-DT+K4S2-DT/Alum으로 3회 면역화하고, 5448AP (CovR/S MT 균주)로 비강내 챌린지하였다.
도 10: p*17-기반 백신에 의한 i.m. 면역화 후에 면역원성. BALB/c 마우스 (n=15/그룹; 암컷, 4-6주령)를 0일, 21일 및 42일에 p*17-DT/Alum, p*17-DT+K4S2-DT/Alum 및 PBS/Alum으로 i.m. 면역화하였다. 최종 부스트하고 1주일 후에, 혈청 및 타액 샘플을 수집하고, p*17-특이적 IgG (A & C) 및 IgA (B & D) 항체 반응을 ELISA로 측정하고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. PBS/Alum 단독만이 제공된 대조군 코호트와 역가를 비교하였다.
도 11: 비강내 감염 후에 방어. 최종 백신 부스트하고 2주 후에, 상기 마우스를 covR/S 돌연변이체 GAS (5448AP)로 비강내 감염시켰다. 1-3일차에 코 흘림 (nasal shedding: NS)을 수집하였다. 5% 탈섬유소 말-혈액 (defibrinated horse-blood)을 함유하는 CBA (columbia blood agar) 플레이트 상에 각 마우스의 외비공 (nares)을 눌러서 NS 중에 박테리아 부담을 결정하고, 날숨 입자 (exhaled particles)를 스트리킹하였다 (streaked out). 1-3일차에 NS를 수집하고, 각 개별 일자로부터 로그 변환된 평균 ± SEM (A) 및 조합된 3일 모두로부터의 누적 CFU (B)로 표시하였다. o는 체중이 15% 이상 손실되고 2일 후에 마우스를 도살한 것을 나타낸다.
도 12: 코 흘림에서 박테리아 부담의 감소 퍼센트. 각 개별 일자로부터 PBS/Alum 대조군의 총 평균과 비교하여 감소 퍼센트 (A) 및 조합된 3일 모두로부터의 누적 감소 (B)를 계산하였다. o는 체중이 15% 이상 손실되고 2일 후에 마우스를 도살한 것을 나타낸다.
도 13: 비강내 감염 후에 방어. 1-3일차에 NS 이외에, 인후 도말 (throat swabs: TS)을 수집하였다. 인후 도말을 위해, 면봉 어플리케이터 (swab applicators)를 멸균 PBS에 넣어 적시고, 그 다음에 마우스를 고정하고, 인후를 도말하였다. 그 다음에 면봉 어플리케이터를 PBS에 현탁시키고, 연속하여 희석하고, 5% 탈섬유소 말-혈액을 함유하는 CBA 플레이트 상에 이중으로 도트-플레이트하였다 (dot-plated). 1-3일차에 NS를 수집하고, 각 개별 일자로부터의 로그 변환된 평균 cfu/ml ± SEM (A) 및 조합된 3일 모두로부터의 누적 CFU (B)로 표시하였다. o는 체중이 15% 이상 손실되고 2일 후에 마우스를 도살한 것을 나타낸다.
도 14: 인후 도말에서 박테리아 부담의 감소 퍼센트. 각 개별 일자로부터의 PBS/Alum 대조군의 총 평균과 비교한 감소 퍼센트 (A) 및 조합된 3일 모두로부터의 누적 감소 (B)를 계산하였다. o는 체중이 15% 이상 손실되고 2일 후에 마우스를 도살한 것을 나타낸다.
도 15: 비강내 감염 후에 방어. 감염 3일 후에 모든 살아 있는 마우스를 안락사시키고, NALT, 폐, 비장 및 혈액 샘플을 수집하여 GAS 박테리아 부담을 결정하고, 데이터는 로그 변환된 평균 cfu/ml ± SEM (A) 및 PBS/Alum 대조군과 비교한 감소 퍼센트 (B)로 표시하였다. o는 체중이 15% 이상 손실되고 2일 후에 마우스를 도살한 것을 나타낸다.
도 16: J8 펩티드, p145 및 p*17의 구조 비교. (A) 나선도 퍼센트 및 (B) RMS 변동 측면에서 p*17 및 J8 펩티드의 구조를 비교한 MD 시뮬레이션.
서열의 간단한 설명
서열번호:1 LRRDLDASREAKNQVERALE
서열번호:2 SREAKNQVERAL
서열번호:3 LRRDLDASREAKKQVEKALE
서열번호:4 SREAKKQVEKAL
서열번호:5 LRRDLDAENEAKKQVEKALE
서열번호:6 LRRDLDAEDEAKKQVEKALE
서열번호:7 LRRDLDAEREAKNQVEKALE
서열번호:8 LRRDLDAEREAKKQVERALE
서열번호:9 LRRDLDAEREAKKQVEMALE
서열번호:10 LRRDLDAVNEAKKQVEKALE
서열번호:11 LRRDLDAVDEAKKQVEKALE
서열번호:12 LRRDLDAVREAKNQVEKALE
서열번호:13 LRRDLDAVREAKKQVERALE
서열번호:14 LRRDLDAVREAKKQVEMALE
서열번호:15 LRRDLDASNEAKNQVEKALE
서열번호:16 LRRDLDASNEAKKQVERALE
서열번호:17 LRRDLDASNEAKKQVEMALE
서열번호:18 LRRDLDASDEAKNQVEKALE
서열번호:19 LRRDLDASDEAKKQVERALE
서열번호:20 LRRDLDASDEAKKQVEMALE
서열번호:21 LRRDLDASREAKNQVEMALE
서열번호:22 LRRDLDA
서열번호:23 NSDNIKENQFEDFDEDWENF
서열번호:24 KKKKNSDNIKENQFEDFDEDWENF
서열번호: 25-111 표 3 펩티드 1에서 펩티드 87까지 각각 내림차순의 펩티드 라이브러리.
서열번호:112: SGSGLRRDLDASREAKKQVEKALE
본 발명은 p145 펩티드의 특정 아미노산을 변형시켜서 그룹 A 스트렙토코쿠스에 대한 면역원성을 실질적으로 향상시킬 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 전제되어 있다. 다수의 면역화보다는, 변형된 p145 펩티드에 의한 단회 면역화는 CovR/S 돌연변이체 균주와 같은 고독성 균주에 의해서도 그룹 A 스트렙토코쿠스 감염을 방어할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 변형된 p145 펩티드는 IgA 보다 IgG의 생성을 특징으로 하는, 점막 면역을 유도할 수 있다. 점막 면역은 상기 펩티드의 근육내 투여 후에 유발될 수 있다.
본 발명의 광범위한 양상은 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염에 대한 면역을 유도 또는 유발하기 위해, 본원에서 "p*17 펩티드"로 언급되는, 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 단리된 펩티드는 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염에 대한 점막 면역을 유도한다.
일부 구체예에서, 상기 p*17 펩티드는 SpyCEP 단백질의 단편과 조합하여 투여될 수 있다. 상기 SpyCEP 단편은 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 것과 같은 "S2" 펩티드, 또는 서열번호:24에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 변이체일 수 있으며, 이는 이후에 보다 상세하게 기재될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "그룹 A 스트렙토코쿠스 (group A Streptococcus)", "그룹 A 스트렙토코시 (Group A Streptococci)", "그룹 A 스트렙토코칼 (Group A Streptococcal)", "그룹 A 스트렙 (Group A Strep)" 및 약어 "GAS"는 Lancefield 혈청군 A의 스트렙토코쿠스 박테리아를 나타내며, 이는 스트렙토코쿠스 피오게네스 종의 그람 양성 β-용혈성 박테리아이다. GAS의 중요한 발병 인자는 M 단백질이며, 이는 강한 항포식작용을 하고, 혈청 인자 H에 결합하여 C3-컨버타제 (C3-convertase)를 파괴하고 C3b에 의한 옵소닌화 (opsonization)를 방지한다. 이는 또한 전염성 "돌연변이체" 예컨대 CovR/S 또는 CovRS 돌연변이체 예컨대 Graham et al., 2002, PNAS USA 99 13855에 기재된 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
그룹 A 스트렙토코쿠스에 의해 야기되는 질환 및 병태는 연조직염 (cellulitis), 얕은연조직염 (erysipelas), 농가진 (impetigo), 성홍열 (scarlet fever), 인후 감염증 (throat infections) 예컨대 급성 인두염 (acute pharyngitis) ("패혈성 인두염 (strep throat)"), 세균혈증 (bacteremia), 독성 쇼크 증후군 (toxic shock syndrome), 괴사근막염 (necrotizing fasciitis), 급성 류마티스열 (acute rheumatic fever) 및 급성 사구체신염 (acute glomerulonephritis)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 목적에 있어서, "단리된 (isolated)"은 그의 자연 상태로부터 분리된 물질 또는 그 외의 방법으로 인간 조작이 가해진 물질을 의미한다. 단리된 물질은 그의 자연 상태에서 통상적으로 수반되는 성분들이 실질적으로 또는 본질적으로 존재하지 않거나 또는 그의 자연 상태에서 통상적으로 수반되는 성분들과 함께 인공 상태에 있도록 조작될 수 있다. 단리된 물질은 자연적, 화학합성 또는 재조합 형태일 수 있다.
"단백질 (protein)"은 아미노산 폴리머를 의미한다. 상기 아미노산은 당분야에 잘 이해되는 바와 같이 천연 또는 비천연 아미노산, D-아미노산 또는 L-아미노산일 수 있다.
용어 "단백질 (protein)"은 전형적으로 50개 이하의 아미노산을 갖는 단백질을 서술하는데 사용되는 "펩티드 (peptide)"와, 전형적으로 50개 초과의 아미노산을 갖는 단백질을 서술하는데 사용되는 "폴리펩티드 (polypeptide)"를 포함 및 포괄한다.
본 발명자는 "야생형" 또는 "비변형된" p145 펩티드 아미노산 서열의 변형으로 상기 펩티드의 면역원성을 실질적으로 향상 또는 증진시키는 것을 보여주었다. 전형적으로, 변형은 p145 펩티드의 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다.
이는 상기 펩티드의 원하는 알파-나선형 구조를 유지하기 위해 이종의 GCN4 아미노산 서열을 p145 펩티드에 부가할 필요가 없게 한다. 이론에 국한되지 않고, 분자 동역학 시뮬레이션 (molecular dynamic simulation)으로 본원에 개시된 변형된 p145 펩티드는 야생형 또는 비변형된 p145와 대조적으로 그의 구조에 "킨크 (kink)"를 갖지 않는 것으로 밝혀졌고, 이는 그의 향상된 면역원성에 대해 적어도 부분적으로 책임이 있을 수 있다.
적절하게, "야생형" 또는 비변형된 p145 펩티드는 아미노산 서열 LRRDLDASREAKKQVEKALE (서열번호:3)를 포함한다. 최소 P145 에피토프 서열은 SREAKKQVEKAL (서열번호:4)이다.
바람직하게, 변형된 p145 펩티드는 서열번호:3의 잔기 13에 해당하는 N 잔기 및 서열번호:3의 잔기 17에서 R 아미노산을 포함한다.
바람직하게, 변형된 p145 최소 에피토프는 서열번호:1의 잔기 6에 해당하는 N 잔기 및 서열번호:1의 잔기 10에서 R 아미노산을 포함한다.
일 구체예에서, p*17 펩티드는 아미노산 서열 LRRDLDASREAKNQVERALE (서열번호:1)를 포함한다.
일 구체예에서, p*17의 변형된 최소 에피토프는 아미노산 서열 SREAKNQVERAL (서열번호:2)을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 변형된 p145 펩티드의 단편을 제공한다.
"단편"은 상기 단백질의 아미노산 서열의 100% 미만으로 이루어진, 단백질 또는 펩티드의 세그먼트, 도메인, 부분 또는 영역 (예컨대 서열번호:1, 서열번호:2, SpyCEP, 서열번호: 23 또는 서열번호:24)이다. 상기 단편은 단일 단편일 수도 있고, 단독으로 또는 다른 단편과 함께 반복될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일반적으로, 단편은 최대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 연속하는 아미노산을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나 또는 구성될 수 있다 (예컨대 서열번호:1, 서열번호:2, SpyCEP, 서열번호:23 또는 서열번호: 24). 일 구체예에서, 상기 단편은 서열번호:1의 잔기 13에 해당하는 N 잔기 및 서열번호:1의 잔기 17에서 R 아미노산을 포함한다. 단편의 비제한적인 예로는 아미노산 서열 SREAKNQVERAL (서열번호:2)을 포함한다.
적절하게, 상기 단편은 면역원성 단편이다. 본 발명과 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "면역원성 (immunogenic)"은 포유동물에 면역원성 단편의 투여 시에, 그룹 A 스트렙 또는 그 분자 성분, 예컨대 M 단백질 또는 p145에 해당하는 M 단백질 에피토프에 대한 면역 반응을 일으키거나 또는 유발할 수 있는 능력 또는 가능성을 나타낸다. 바람직하게, 상기 면역원성 단편에 의해서 유발된 면역 반응은 점막 면역 반응이다.
"면역반응 유발"은 세포 면역계, 항체 및/또는 천연 면역계를 포함하는 면역계의 하나 이상의 요소들의 생성 또는 활성을 발생 또는 자극하는 것을 의미한다. 적절하게, 상기 면역계의 하나 이상의 요소는 B 림프구, 항체 및 호중구를 포함한다. 바람직하게, 상기 면역 반응은 점막 면역 반응이다. 전형적으로, 점막 면역 반응은 IgG와 같은 다른 항체 이소형의 생성은 최소로 하면서 IgA의 생성을 특징으로 한다. 놀랍게도, 본원에 개시된 p*17 펩티드에 의해 유발된 점막 면역 반응은 IgG의 생성을 특징으로 한다. IgA 생성은 IgG 생성과 비교하여 상대적으로 감소되거나 또는 실질적으로 부재한다.
본원에서 사용되는, 단백질 "변이체"는 참조 아미노산 서열과 정의가능한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 관계를 공유한다. 상기 참조 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호:1 또는 서열번호:2 또는 서열번호:23의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 "변이체" 단백질은 참조 아미노산 서열 중 하나 또는 복수의 아미노산이 결실되거나 또는 상이한 아미노산에 의해서 치환될 수 있다. 일부 아미노산은 면역원성 단편 및/또는 단백질의 활성을 변경하지 않고 치환 또는 결실될 수 있다는 것이 당분야에서 잘 이해된다 (보존적 치환). 바람직하게, 단백질 변이체는 적어도 70% 또는 75%, 바람직하게는 적어도 80% 또는 85%, 또는 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 참조 아미노산 서열과 공유한다.
특정 구체예에서, 상기 변이체는 하기를 포함할 수 있다: 서열번호:1의 잔기 13에 해당하는 N 잔기 및 서열번호:1의 잔기 17에 해당하는 R 아미노산; 또는 서열번호:2의 잔기 6에 해당하는 N 잔기 및 서열번호:2의 잔기 10에 해당하는 R 아미노산. 따라서, 서열번호:1 또는 서열번호: 2의 하나 이상의 다른 잔기는 상기 변이체가 서열번호:1 또는 서열번호:2의 면역원성을 실질적으로 보유하도록 보존적으로 변형될 수 있다 (예: 아미노산 치환 또는 결실에 의함). 이와 관련하여, 서열번호:1의 잔기 13 및 17 이외의 아미노산의 변형 및 면역원성에 있어서 그의 효과를 기재한 실시예 및 표 2를 참조한다.
특정 일 구체예에서, 변이체 단백질 또는 펩티드는 그 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 또는 복수의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 상기 복수의 리신 잔기 (예: 폴리리신)는 선형의 리신 잔기 서열일 수 있거나 또는 분지형의 리신 잔기 서열일 수 있다. 이들 추가의 리신 잔기는 펩티드 가용성의 증가를 촉진할 수 있다. 이러한 변이체의 비제한적인 예를 "K4S2"로 지정한다 (서열번호:24).
각 단백질들과 핵산들 사이의 서열 관계를 서술하기 위해 본원에서 일반적으로 사용된 용어는 "비교 창 (comparison window)", "서열 동일성 (sequence identity)", "서열 동일성 퍼센트 (percentage of sequence identity)" 및 "실질적 동일성 (substantial identity)"을 포함한다. 각 핵산들/단백질들은 (1) 핵산들/단백질들에 의해서 공유되는 전체 핵산/단백질 서열의 하나 이상의 부분, 및 (2) 핵산들/단백질들 사이에서 벗어나는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있기 때문에, 서열 비교는 전형적으로 서열 유사성 (sequence similarity)의 국소 영역을 확인 및 비교하기 위해 "비교 창"에 대해 서열들을 비교함으로써 수행된다. "비교 창"은 참조 서열과 비교되는 전형적으로 6개, 9개 또는 12개의 연속하는 잔기의 개념적 세그먼트 (conceptual segment)를 나타낸다. 상기 비교 창은 각 서열의 최적 배열을 위해 참조 서열과 비교하여 약 20% 이하의 부가 또는 결실 (즉, 갭 (gaps))을 포함할 수 있다. 비교 창을 배열하기 위한 서열의 최적 배열은 알고리즘의 컴퓨터 구현에 의해서 수행될 수 있거나 (Geneworks program by Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA, 참조로 본원에 포함됨) 또는 선택된 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해서 생성되는 최선의 배열 및 검사 (즉, 비교 창에 대해서 최대 퍼센트의 상동성을 초래함)에 의해서 수행될 수 있다. 예를 들면 Altschul et al, 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389에 기재된 바와 같은 프로그램의 BLAST 패밀리를 참조할 수 있으며, 이는 참조로 본원에 포함된다. 서열 분석에 대한 상세한 토의는 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999)의 유닛 19.3에서 찾을 수 있다.
용어 "서열 동일성"은 표준 알고리즘을 사용한 적절한 배열과 관련하여, 또한 서열이 비교 창에 대해 동일한 정도와 관련하여, 정확히 부합되는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수를 포함하는 것으로 광의적으로 본원에서 사용된다. 그러므로, "서열 동일성 퍼센트"는, 비교 창에 대해 2개의 최적으로 배열된 서열들을 비교하고, 동일한 핵산 염기 (예: A, T, C, G, I)가 두 서열 모두에서 나타나는 위치의 수를 결정하여 부합되는 위치의 수를 산출하고, 부합된 위치의 수를 비교 창에서 전체 위치의 수 (즉, 창 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 퍼센트를 수득함으로써 산출된다. 예를 들면 "서열 동일성"은 DNASIS 컴퓨터 프로그램 (Version 2.5 for windows; available from Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA)에 의해서 산출되는 "부합 퍼센트 (match percentage)"를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 변형된 p145 펩티드의 유도체를 제공한다. 적절하게, 상기 변형된 p145 펩티드는 서열번호:1 또는 서열번호:2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 "유도체"는 당 분야에서 이해되는 바와 같이 다른 화학적 모이어티와의 접합 (conjugation) 또는 착화 (complexing)에 의해, 번역후 변형 (예: 인산화, 아세틸화 등), 글리코실화의 변형 (예: 글리코실화를 부가, 제거 또는 변경), 지질화 (lipidation) 및/또는 추가 아미노산 서열의 포함에 의해서 변경되는 단백질, 그 단편 또는 변이체와 같은 분자이다. 특정 일 구체예에서, 추가의 아미노산 서열은 그의 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 또는 복수의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 복수의 리신 잔기 (예: 폴리리신)는 선형의 리신 잔기 서열일 수 있거나 또는 분지형 리신 잔기 서열일 수 있다. 상기 추가의 리신 잔기는 펩티드 가용성의 증가를 촉진할 수 있다. 다른 특정 유도체는 상기 펩티드의 디프테리아 독소 (diphtheria toxin: DT)에의 접합에 의한 것이다. 이는 C-말단 시스테인 잔기의 부가에 의해 촉진될 수 있다.
추가의 아미노산 서열은 융합 단백질을 형성하는 융합 파트너 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 파트너 아미노산 서열은 단리된 융합 단백질의 검출 및/또는 정제에 도움을 줄 수 있다. 비제한적인 예로는 금속-결합 (예: 폴리히스티딘) 융합 파트너, 말토스 결합 단백질 (MBP), 단백질 A, 글루타티온 S-트란스퍼라제 (GST), 형광 단백질 서열 (예: GFP), 에피토프 태그 예컨대 myc, FLAG 및 헤마글루티닌 태그 (haemagglutinin tags)를 포함한다.
다른 추가의 아미노산 서열은 디프테리아 톡소이드 (diphtheria toxoid: DT) 또는 그의 단편과 같은 담체 단백질, 또는 국제공개공보 WO2017/070735에 기재된 바와 같은 CRM 단백질 단편일 수 있다.
본 발명에 의해서 고려되는 다른 유도체는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 측쇄에의 변형, 펩티드 또는 단백질 합성 중에 비천연 아미노산 및/또는 이의 유도체의 혼입, 및 본 발명의 면역원성 단백질, 단편 및 변이체에 입체형태적 강제 (conformational constraints)를 부과하는 가교제 및 다른 방법의 사용을 포함한다.
이와 관련하여, 당업자는 단백질의 화학적 변형과 관련된 보다 광범위한 방법론에 있어서 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2008)의 제15장을 참고할 수 있다.
본 발명의 단리된 면역원성 단백질, 단편 및/또는 유도체는 화학 합성, 재조합 DNA 기술 및 펩티드 단편을 제조하기 위한 단백질분해 절단 (proteolytic cleavage)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아닌, 당 분야에 알려져 있는 임의의 수단에 의해서 제조될 수 있다.
화학 합성은 고상 (solid phase) 및 용액상 (solution phase) 합성을 포함한다. 이러한 방법은 당분야에 잘 알려져 있으며, SYNTHETIC VACCINES Ed. Nicholson (Blackwell Scientific Publications)의 제9장 및 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al, (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008)의 제15장에서 제공되는 화학합성 기술의 예들을 참고할 수 있다. 이와 관련하여, 국제공개공보 WO 99/02550 및 국제공개공보 WO 97/45444를 참고할 수 있다.
재조합 단백질은 예를 들면 Sambrook et al, MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), 특히 섹션 16 및 17; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al, (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008), 특히 제10장 및 제16장; 및 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al, (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008), 특히 제1장, 제5장 및 제6장에 기재된 바와 같은 표준 프로토콜을 사용하여 당업자가 편리하게 제조할 수 있다. 전형적으로, 재조합 단백질 제조는 적절한 숙주 세포에서 단백질을 코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함한다.
본 발명의 추가적 양상은 서열번호:1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 면역원성 펩티드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
적절하게, 상기 항체 또는 항체 단편은 특히 서열번호:1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 면역원성 펩티드 또는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 단편에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 p145 펩티드 또는 서열번호:3 또는 서열번호:4에 제시된 것과 같은 최소 에피토프 서열에, p145 펩티드에 대해 생성된 항체보다 실질적으로 더 높은 친화도로 결합한다. 본 문맥에서, "실질적으로 더 높은 친화도"는 p145 펩티드의 특정 농도에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 더 높은 친화도를 의미한다.
항체 및 항체 단편은 다클론 (polyclonal) 또는 단클론(monoclonal), 천연 (native) 또는 재조합 (recombinant)일 수 있다. 항체 단편은 Fc, Fab 또는 F(ab)2 단편을 포함하고 및/또는 단쇄 Fv 항체 (scFvs)를 포함할 수 있다. 이러한 scFv는 예를 들면 미국특허 제5,091,513호, 유럽특허 제239,400호, 또는 논문 Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293에 기재된 각 방법에 따라서 제조될 수 있다. 항체는 복수의 scFv를 포함하는 다가 (multivalent) 재조합 항체 단편, 예컨대 디아바디 (diabodies), 트리아바디 (triabodies) 및/또는 테트라바디 (tetrabodies)뿐만 아니라 이량체화-활성화된 데미바디 (demibodies)를 포함할 수 있다 (예: WO/2007/062466). 예를 들면, 이러한 항체는 Holliger et al, 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 6444; 또는 Kipriyanov, 2009 Methods Mol Biol 562 177에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 항체 제조, 정제 및 사용에 적용가능한 잘-알려진 프로토콜은 예를 들면 Coligan et al, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994)의 제2장 및 Harlow, E. & Lane, D. Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, Cold Spring Harbour Laboratory, 1988에서 찾을 수 있다.
다클론 항체를 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 사용할 수 있는 예시되는 프로토콜은 예를 들면 Coligan et al, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra, 및 Harlow & Lane, 1988, supra에 기재되어 있다. 특정 일 구체예에서, 항-SpyCEP 다클론 항체는 그룹 A 스트렙에 노출되거나 또는 감염된 개체 유래의 인간 혈청으로부터 수득되거나 또는 정제될 수 있다. 대안으로서, 다클론 항체는 말과 같은 생산 종 (production species)에서, 정제 또는 재조합 SpyCEP 또는 그 면역원성 단편에 대해서 생성되고 연이어 정제한 후에 투여될 수 있다.
단클론 항체는 예를 들면 논문 Koehler & Milstein, 1975, Nature 256, 495에 기재된 표준 방법, 또는 예를 들면 Coligan et al, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra에 기재된 이의 최신 변형 방법을 사용함으로써 제조될 수 있는 바, 본 발명의 하나 이상의 단리된 단백질, 단편, 변이체 또는 유도체로 접종되어진 생산 종으로부터 유래된 불멸화 비장 (immortalizing spleen) 또는 다른 항체 생산 세포에 의해서 제조될 수 있다. 소정의 구체예에서, 상기 단클론 항체 또는 그의 단편은 재조합 형태일 수 있다. 이는 상기 단클론 항체가 인간이 아닌 포유동물의 비장 세포에 의해서 초기에 생산되는 경우, 상기 단클론 항체 또는 단편을 "인간화 (humanizing)"하기에 특히 유리할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항체 단편을 포유동물에게 투여하여 그룹 A 스트렙토코쿠스 감염에 대한 "수동" 면역을 제공할 수 있다.
본 발명의 소정의 추가의 양상 및 구체예는 하기를 위해 서열번호:1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 면역원성 펩티드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 하나 이상의 핵산의 투여에 관한 것이다:
(i) 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아에 대한 면역 반응을 유발하기 위해;
(ii) 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아에 대해 포유동물을 면역화하기 위해; 및/또는
(iii) 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위해.
본원에서 사용되는 용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 및 RNA를 나타낸다. DNA는 게놈성 (genomic) DNA 및 cDNA를 포함한다. RNA는 mRNA, RNA, RNAi, siRNA, cRNA 및 자가촉매 (autocatalytic) RNA를 포함한다. 핵산은 또한 DNA-RNA 하이브리드 (hybrids)일 수 있다. 핵산은 A, G, C, T 또는 U 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 전형적으로 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러나, 뉴클레오티드 서열은 변형된 퓨린 (예를 들면 이노신, 메틸이노신 및 메틸아데노신) 및 변형된 피리미딘 (예를 들면 티오우리딘 및 메틸시토신)과 같은 다른 염기를 포함할 수 있다.
바람직한 일 형태에서, 상기 면역원성 펩티드, 그의 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 단리된 핵산은 인간과 같은 포유동물에게 투여하기에 적합한 유전자 구조체의 형태이다. 바람직하게, 상기 유전자 구조체는 인간과 같은 포유동물의 DNA 백신화에 적합하다.
적절하게, 상기 유전자 구조체는 당분야에서 잘 이해되는 바와 같이 플라스미드, 박테리오파아지, 코스미드, 효모 또는 박테리아 인공 염색체의 형태이거나 또는 이의 유전자 성분을 포함한다. 유전자 구조체는 또한 재조합 DNA 기술에 의한 조작을 위해서, 박테리아 또는 다른 숙주 세포 중에 단리된 핵산을 유지 및 증식하기에 적합할 수 있다.
단백질 발현을 위해, 상기 유전자 구조체는 발현 구조체이다. 적절하게, 상기 발현 구조체는 발현 벡터에서 하나 이상의 추가 서열에 작동가능하게 연결된 (operably linked) 하나 이상의 핵산을 포함한다. "발현 벡터"는 플라스미드와 같은 자기-복제하는 염색체외 벡터 (self-replicating extra-chromosomal vector), 또는 숙주 게놈에 통합되는 벡터일 수 있다.
"작동가능하게 연결된 또는 결합된"은 전사를 개시, 조절 또는 제어하기 위해서 상기 추가의 뉴클레오티드 서열(들)이 본 발명의 핵산에 대해 위치하는 것을 의미한다.
조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현을 필요로 하는 숙주세포 또는 조직에 적합할 것이다. 다양한 숙주 세포에 대한 수많은 타입의 적합한 발현 벡터 및 적절한 조절 서열이 당 분야에 알려져 있다.
전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 선두 또는 신호 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 (enhancer) 또는 활성인자 (activator) 서열을 포함할 수 있다. 당 분야에 알려져 있는 항시성 (constitutive) 또는 유도성 (inducible) 프로모터도 본 발명에 포함된다. 또한, 상기 발현 구조체는 융합 파트너 (전형적으로 발현 벡터에 의해서 제공됨)를 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 본 발명의 재조합 단백질이 전술한 바와 같이 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
적절하게, DNA 백신화는 하나 이상의 플라스미드 DNA 발현 구조체에 의해 수행된다. 플라스미드는 전형적으로 바이러스 프로모터 (예컨대 SV40, RSV 또는 CMV 프로모터)를 포함한다. 인트론 A는 mRNA 안정성을 향상시켜서 단백질 발현을 증가시키기 위해서 포함될 수 있다. 플라스미드는 다중 클로닝 부위, 강한 폴리아데닐화/전사 종결 신호, 예컨대 소 성장 호르몬 또는 토끼 베타-글로불린 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 플라스미드는 HIV rev 증가된 엔벨로프 발현 (envelope expression)을 갖거나 또는 갖지 않는 Mason-Pfizer 원숭이 바이러스 cis-작용 전사 요소 (Mason-Pfizer monkey virus cis-acting transcriptional elements: MPV-CTE)를 추가로 포함할 수 있다. 발현을 향상시킬 수 있는 추가적 변형은 인핸서 서열, 합성 인트론, 아데노바이러스 삼부 리더 (adenovirus tripartite leader: TPL) 서열의 삽입 및/또는 폴리아데닐화에의 변형 및/또는 전사 종결 서열을 포함한다. DNA 백신 플라스미드의 비제한적인 예로는 Invivogen에서 상업적으로 입수가능한 pVAC이다.
DNA 백신학을 서술하는 유용한 참고문헌으로는 DNA Vaccines, Methods and Protocols, Second Edition (Volume 127 of Methods in Molecular Medicine series, Humana Press, 2006)이 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 본 발명은 포유동물에서 그룹 A 스트렙-관련 질환, 장애 또는 병태에 대한 면역화, 예방 또는 치료하는 조성물, 백신 및/또는 방법을 제공한다. 적절하게, 그룹 A 스트렙-관련 질환, 장애 또는 병태에 대한 면역화, 예방 또는 치료하는 조성물, 백신 및/또는 방법은 포유동물에게 투여 시에 점막 면역 반응을 유발한다. 바람직하게, 상기 점막 면역 반응은, 더 낮은 수준 또는 부재하는 IgA와 비교하여, IgG의 생성을 특징으로 한다.
본원에서 일반적으로 사용되는 용어인 "면역화", "백신화" 및 "백신"은 그룹 A 스트렙에 대한 방어 면역 반응을 유발함으로써, 그룹 A 스트렙에 의한 후속 감염을 적어도 일부 예방 또는 최소화시키는, 방법 및/또는 조성물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 그룹 A 스트렙-관련 질환, 장애 또는 병태가 발병한 이후에 그 증상 또는 병리학적 징후를 적어도 일부 개선, 제거 또는 감소시키는 치료적 개입을 나타낸다. 치료가 대상에게 절대적으로 유익할 필요는 없다. 상기 유익한 효과는 당업자에게 알려져 있는 방법 또는 표준을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 "예방하는", "예방하다" 또는 "예방"은 감염을 예방 및/또는 증상 및 병리학적 징후를 감소시키기 위하여 그룹 A 스트렙에 감염 또는 노출되기 전에 및/또는 그룹 A 스트렙-관련 질환, 장애 또는 병태의 증상 또는 병리학적 징후의 발병 전에 시작된 활동 과정을 나타낸다. 이러한 예방이 대상에게 절대적으로 유익할 필요는 없다고 이해되어야 한다. "예방적" 치료는 그룹 A 스트렙-관련 질환, 장애 또는 병태의 증상 또는 병리학적 징후가 발전될 위험을 감소시킬 목적으로, 그룹 A 스트렙-관련 질환, 장애 또는 병태의 징후를 나타내지 않거나 또는 초기 징후만을 나타내는 대상에게 투여하는 치료이다.
본 발명의 문맥에서, "그룹 A 스트렙 -관련 질환, 장애 또는 병태"는 그룹 A 스트렙에 의한 감염으로부터 기인하는 임의의 임상 병리를 의미하며, 연조직염, 얕은연조직염, 농가진, 성홍열, 인후 감염증 예컨대 급성 인두염 ("패혈성 인두염"), 세균혈증, 독성 쇼크 증후군, 괴사근막염, 급성 류마티스열 및 급성 사구체신염을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
소정의 양상 및 구체예에서, 본원에 개시된 p*17 펩티드, 단편, 변이체 또는 유도체, 단리된 핵산, 유전자 구조체, 항체 및/또는 항체 단편을 포유동물에게 개별적으로, 또는 조합하여 조성물 형태로 투여할 수 있다.
바람직한 일 형태에서, 상기 조성물은 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
"허용가능한 담체 , 희석제 또는 부형제"는 전신 투여에서 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 특정 투여 경로에 따라서, 당 분야에 잘 알려져 있는 다양한 담체, 희석제 및 부형제를 사용할 수 있다. 이는 당, 전분, 셀룰로스 및 그 유도체, 맥아, 젤라틴, 탈크, 칼슘 설페이트, 식물성 오일, 합성 오일, 폴리올, 알긴산, 인산염 완충 용액, 유화제, 등장 식염수 및 염, 히드로클로라이드, 브로마이드 및 설페이트를 포함하는 무기산염, 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트를 포함하는 유기산, 물 및 발열성 물질 제거수 (pyrogen-free water)를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
허용가능한 담체, 희석제 및 부형제를 서술한 유용한 참고문헌으로는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)가 있고, 이는 참조로 본원에 포함된다.
바람직하게, 면역 반응을 유발하기 위해, 소정의 면역 제제 (immunological agent)가 p*17 펩티드, 단편, 변이체 또는 유도체와 조합하여 사용될 수 있다.
용어 "면역 제제"는 그 범위 내에서 당분야에 잘 알려져 있는 담체, 전달 제제 (delivery agents), 면역자극제 및/또는 아쥬반트를 포함한다. 당 분야에서 이해되는 바와 같이, 면역자극제 및 아쥬반트는 조성물의 면역원성 및/또는 효능을 증진시키는 하나 이상의 물질을 나타내거나 또는 이를 포함한다. 적당한 면역자극제 및 아쥬반트의 비제한적인 예로는 스쿠알란 및 스쿠알렌 (또는 식물 기원 또는 동물 기원의 다른 오일); 블록 코폴리머 (block copolymers); 세제, 예컨대 Tween®-80; Quil® A, 미네랄 오일, 예컨대 드라케올 (Drakeol) 또는 마르콜 (Marcol), 식물성 오일, 예컨대 땅콩유; 코리네박테리움-유래 아쥬반트 (Corynebacterium-derived adjuvants), 예컨대 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum); 프로피오니박테리움-유래 아쥬반트 (Propionibacterium-derived adjuvants), 예컨대 프로피오니박테리움 액니 (Propionibacterium acne); 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis) (Bacille Calmette 및 Guerin 또는 BCG); 보르데텔라 페르 투시스 (Bordetella pertussis) 항원; 테타누스 톡소이드 (tetanus toxoid); 디프테리아 톡소이드; 표면활성 물질, 예컨대 헥사데실아민, 옥타데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 리소레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N', N'비스(2-히드록시에틸-프로판디아민), 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루로닉 폴리올 (pluronic polyols); 폴리아민, 예컨대 피란, 덱스트란 설페이트, 폴리 IC 카르보폴; 펩티드, 예컨대 무라밀 디펩티드 및 유도체, 디메틸글리신, 투프트신 (tuftsin); 오일 에멀젼; 및 미네랄 겔, 예컨대 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 히드록시드 또는 알룸 (alum); 인터루킨, 예컨대 인터루킨 2 및 인터루킨 12; 모노킨 (monokines), 예컨대 인터루킨 1; 종양 괴사 인자; 인터페론, 예컨대 감마 인터페론; 면역자극 DNA, 예컨대 CpG DNA, 조합물, 예컨대 사포닌-알루미늄 히드록시드 또는 퀼(Quil)-A 알루미늄 히드록시드; 리포좀 (예: 국제공개공보 WO2017/070735); ISCOM® 및 ISCOMATRIX® 아쥬반트; 미코박테리아 (mycobacterial) 세포벽 추출물; 합성 글리코펩티드, 예컨대 무라밀 디펩티드 또는 기타 유도체; 아브리딘 (Avridine); 지질 A 유도체; 덱스트란 설페이트; DEAE-덱스트란 단독 또는 알루미늄 포스페이트와의 조합체; 카르복시폴리메틸렌, 예컨대 카르보폴 (Carbopol)' EMA; 아크릴 코폴리머 에멀젼, 예컨대 네오크릴 (Neocryl) A640(예: 미국특허 제5,047,238호); 유중수형 유화제, 예컨대 몬타니드 (Montanide) ISA 720; 폴리오바이러스, 박시니아 (vaccinia) 또는 동물 폭스바이러스 (poxvirus) 단백질; 또는 그 혼합물을 포함한다.
면역 제제는 담체, 예컨대 티로글로불린 (thyroglobulin) 및 디프테리아 톡소이드 (DT); 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 파상풍, 디프테리아, 백일해, 슈도모나스 (Pseudomonas), 대장균 (E. coli), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 및 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 유래의 독소, 톡소이드 또는 상기 독소의 돌연변이 교차반응성 물질 (CRM); 폴리아미노산, 예컨대 폴리(리신:글루탐산); 인플루엔자; 로타바이러스 VP6, 파르보바이러스 (Parvovirus) VP1 및 VP2; B형 간염 바이러스 코어 단백질; B형 간염 바이러스 재조합 백신 등을 포함할 수 있다. 대안으로서, 담체 단백질 또는 다른 면역원성 단백질의 단편 또는 에피토프를 사용할 수 있다. 예를 들면, 박테리아 독소, 톡소이드 또는 CRM의 T 세포 에피토프를 사용할 수 있다. 이러한 점에서, 미국특허 제5,785,973호를 참고할 수 있으며, 이는 참조로 본원에 포함된다. 다른 면역 제제는 M 단백질 이외에 그룹 A 스트렙 단백질 유래의 면역원성 펩티드, 예를 들어 국제공개공보 WO2015/157820에 기재된 바와 같은 SpyCEP 펩티드를 포함할 수 있다.
백신 조성물을 제조하는데 적합한 임의의 절차를 고려할 수 있다. 예시되는 절차는 예를 들면 New Generation Vaccines (1997, Levine et al, Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong)에 기재된 것을 포함하며, 이는 참조로 본원에 포함된다.
일부 구체예에서, 조성물 및 백신은 포유동물에게 p*17 펩티드, 단편, 변이체 또는 유도체 및/또는 호중구 활성의 회복 또는 증진을 촉진하는 제제를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있는 약독화되거나 또는 불활성화된 박테리아의 형태로 투여될 수 있다. 약독화된 박테리아의 비제한적인 예로는 살모넬라 종 (Salmonella species), 예를 들면 살모넬라 엔테리카 변종 티피무리움 (Salmonella enterica var. Typhimurium) 또는 살모넬라 티피 (Salmonella typhi)를 포함한다. 대안으로서, 다른 장내 병원체, 예컨대 시겔라 (Shigella) 종 또는 대장균을 약독화된 형태로 사용할 수 있다. 약독화된 살모넬라 균주는 방향족 아미노산 생합성 경로에서 유전자를 불활성화시킴으로써 (Alderton et al, Avian Diseases 35 435), 방향족 아미노산 생합성 경로에서 (예컨대 미국특허 제5,770,214호에 기재됨) 또는 다른 유전자 예컨대 htrA (예컨대 미국특허 제5,980,907호에 기재됨)에서 또는 외부 멤브레인 단백질을 코딩하는 유전자, 예컨대 ompR (예컨대 미국특허 제5,851,519호에 기재됨)에서 2개의 유전자로 돌연변이를 도입함으로써 제조되었다.
경구, 직장, 비경구, 설하, 버칼 (buccal), 정맥내, 관절내, 근육내, 피부내, 피하, 흡입, 안구내, 복강내, 뇌실내, 국소, 점막 및 경피 투여를 포함하는, 임의의 안전한 투여 경로를 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 특정 구체예에서, 예컨대 1회 이상의 근육내 주사에 의한 근육내 투여이다. 전형적으로, 비강내 투여는 점막 면역을 유도하는데 최적인 것으로 고려된다. 놀랍게도, p*17 펩티드의 근육내 투여는 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아에 대한 점막 면역 반응을 유발한다.
투여 제형 (dosage forms)은 정제, 분산액, 현탁제, 주사제, 액제, 시럽제, 트로키제, 캡슐, 비강 분무제, 좌약, 에어로졸, 경피 패치 등을 포함한다. 상기 투여 제형은 또한 상기 목적을 위해서 특별히 디자인된 주사 또는 이식 제어방출 장치 또는 상기 형태로 추가로 작용하도록 변형된 다른 이식 형태를 포함할 수 있다. 제어 방출은 아크릴 수지, 왁스, 고급 지방산 알콜, 폴리락트산 및 폴리글리콜산을 포함하는 소수성 폴리머 및 소정의 셀룰로스 유도체, 예컨대 히드록시프로필메틸 셀룰로스로 코팅함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 제어 방출은 다른 폴리머 매트릭스, 리포좀 및/또는 마이크로스피어를 사용함으로써 수행될 수 있다.
조성물은 예컨대 본 발명의 하나 이상의 치료제의 미리 정해진 양을 함유하는 각 캡슐, 사셰 (sachet), 기능성 식품/사료 또는 정제와 같은 개별 단위로서, 분말 또는 과립으로서, 또는 수성액, 비수성액, 수중유형 에멀젼 또는 유중수형 액체 에멀젼 중에 용액 또는 현탁제로서 제공될 수 있다. 상기 조성물은 제약 방법에 의해서 제조될 수 있지만, 모든 방법은 하나 이상의 필수 성분으로 이루어진 담체와 전술한 하나 이상의 제제를 회합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물은 본 발명의 제제와 액체 담체 또는 미분화된 고체 담체 또는 이들 모두와 균일하고 밀접하게 혼합하고, 그 다음에 필요하다면 상기 산물을 목적하는 제형으로 성형함으로써 제조된다.
상기 조성물은 투여 제제에 적합한 방식 및 유효량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 문맥에서 환자에게 투여되는 용량은 적당한 기간에 걸쳐서 환자에서 유익한 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 투여될 제제(들)의 양은 대상의 연령, 성별, 체중 및 일반적인 건강 상태, 임상의 판단에 따라 달라질 수 있는 요인을 포함하여 치료될 대상에 따라 다를 수 있다.
상기 방법 및 조성물의 특정 구체예에서, 상기 변형된 p145 펩티드, 단편 또는 변이체는 SpyCEP 단백질의 면역원성 단편과 조합하여 투여될 수 있다. 상기 SpyCEP 단백질 단편은 호중구의 생성, 이동 및/또는 화학주성 (chemotaxis) 및/또는 호중구의 하나 이상의 면역학적 활성을 직접 또는 간접적으로 적어도 부분적으로 증가, 증진 또는 회복시킴으로써, 호중구 활성의 회복 또는 증진을 촉진하는 제제로서 작용할 수 있다는 것을 알 수 있다. 전형적으로, 상기 SpyCEP 단편은 인터루킨 8을 단백질분해로 절단하는 SpyCEP 세린 프로테아제에 대한 저해 면역 반응을 유발한다. SpyCEP는 인간 병원체 스트렙토코쿠스 피오게네스의 표면에서 발현되는 170-kDa의 멀티도메인 (multidomain) 세린 프로테아제이며, 이는 호중구 화학유인물질인 인터루킨-8의 절단 및 불활성화를 촉매화함으로써 감염에서 중요한 역할을 한다. SpyCEP 아미노산 서열의 비제한적인 예는 수탁번호 (accession number) YP597949.1 및 (S. pyogenes MGAS10270) 및 YP596076.1 (S. pyogenes MGAS9429)에서 찾을 수 있다. 바람직하게, 상기 SpyCEP의 단편은 S2 펩티드 (서열번호:23) 또는 변이체 예컨대 K4S2 펩티드 (서열번호:24)이거나 또는 이를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 변형된 p145 펩티드, 단편 또는 변이체 및 상기 S2 펩티드, 단편 또는 변이체는 단일, 키메라 펩티드로서 제공될 수 있다. 상기 구체예에서, 상기 변형된 p145 펩티드는 상기 S2 펩티드의 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
본원에서 일반적으로 사용되는 용어 "환자", "개체" 및 "대상"은 본원에 개시된 조성물 또는 치료의 임의의 포유동물 수용체의 문맥에서 사용된다. 따라서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 의학적 및/또는 수의학적 적용을 가질 수 있다. 바람직한 일 형태에서, 상기 포유동물은 인간이다.
본 발명을 완전히 이해하고 실제적 효과를 나타내기 위해서, 하기 비제한적인 실시예를 참고한다.
실시예
도입
소 (small) 펩티드 에피토프의 면역원성을 증진시키는 능력은 백신 개발을 크게 촉진시킬 것이다. 지금까지 항체 생성을 위해 면역원성을 향상시키려고 수행되었던 접근법은 에피토프를 고유 구조에 보다 더 유사하게 하는 신규한 폴딩 기술 (예: (5)) 또는 항원 제시 세포 (예: (6, 7)) 또는 헬퍼 T 세포 (8, 9)를 활성화시키는 펩티드에 추가의 분자를 혼입시키는 전략에 중점을 두었다.
펩티드의 서열을 변경하여 이의 면역원성을 향상시키려는 접근법이 또한 고려되고 있다. T 세포에 대한 면역원성을 증진시키기 위해 불규칙 변화성 펩티드 (Heteroclitic peptides)를 테스트하였다 (10). 그러나, 거의 모든 백신은 방어 항체의 생성에 의존하며, 여기서 변형된 펩티드는 대부분이 무시되었지만, 최소 4-아미노산 에피토프 이외의 아미노산 변형은 단클론 항체에 의한 펩티드 인식을 개선할 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 상기 접근법이 백신 개발에 유용할 수 있다는 것을 시사한다 (11). 면역원성을 향상시키기 위해 복합 에피토프의 서열 변형 및 최소 에피토프 내의 변형이 효능을 증진시키는 방식으로서 테스트되진 않았다.
스트렙토코쿠스 피오게네스의 M 단백질로부터 유래한 보존된 펩티드 에피토프는 방어 항체를 유도하는 증진된 복합 펩티드 면역원을 합리적으로 디자인 및 테스트하는 전략을 개발할 수 있는 이상적인 초점과 기회를 제공한다. 상기 M 단백질은 보존된 카르복실 말단 영역을 가지며, 알파 나선형 구조를 갖는 20-아미노산 펩티드인, 'p145'는 광범위한 균주-방어 항체를 유도할 수 있다고 기재되어 있다 ((12)에 검토). 12개의 아미노산을 갖는 최소 B 세포 에피토프가 p145 내에 존재한다. 그러나, 최소 에피토프의 나선형 폴딩을 유지하는데 전체 20개의 아미노산을 필요로 한다. 상기 에피토프는 유기체에 대해 크립틱하다.
S. 피오게네스에의 노출은 통상 p145에 대한 항체의 생성을 초래하지 않지만 (13), (14); 그러나 백신화에 의해 최소 에피토프에 대해 유도된 항체는 유기체를 죽일 수 있다. 면역은 다수의 라운드의 백신화를 필요로 하며, 방어는 면역 반응의 크기와 관련이 있다 (15).
본 연구에서, 최소 B 세포 에피토프 내에 표적화된 아미노산 치환의 반복되는 라운드를 수행하여 p145 변이체를 형성하였다. 결과적으로, p145 및 스트렙토코쿠스에 결합하는 펩티드-항혈청의 면역원성 및 능력은 유의하게 증가되고, 백신 효능이 증진되어 면역을 유도하기 위해 단일 면역화만이 1회 요구되었다. 본 발명자는 모체 펩티드로 백신화된 대조군 마우스와 비교하여 침습성 스트렙토코쿠스 질환으로부터 방어 수준이 10,000-배 증진된 것을 관찰하였다.
물질 및 방법
펩티드
상기 펩티드는 Mimotopes Pty Ltd (Victoria, Australia)로부터 입수하였다. 상기 펩티드 라이브러리 (p145를 포함하는 87개의 펩티드)는 N5 말단에 커플링된 바이오틴을 갖는 절단된 PepSet로서 구입하였고, 4개의 아미노산 (SGSG)을 갖는 링커를 상기 펩티드와 바이오틴 사이에 부가하였다. 리간드 결합에 의한 간섭을 최소화하기 위해 N-말단을 통해 상기 펩티드를 바이오티닐화하였다. p*1-p*18 펩티드는 최소 >90 %의 순도를 갖는 맞춤형 펩티드로서 수득되었다. 추가의 시스테인 잔기는 각 펩티드에 대해 N-말단에 부가되어 Gel Spin 컬럼에 커플링할 수 있게 하였다 (하기 참조). ELISA에서 코팅에 사용된 p145는 QIMR Berghofer Medical Research Institute, DNA and Peptide Unit 또는 China peptides에서 합성되었다. C-말단 시스테인 잔기를 갖는 p*17 펩티드는 China peptides에서 합성되고, 본원에 기재된 바와 같이 DT에 접합되었다 (16).
항혈청
펩티드 스크리닝에 사용된 항혈청은 J8-면역화된 B10.BR, J8-DT-면역화된 BALB/c, 또는 p145-면역화된 BALB/c, Quackenbush 및 B10.D2 마우스로부터 유래하였다.
박테리아
GAS 균주인, 2031 (emm1)은 Prague reference center로부터의 단리물이고, 8830 (emm97)은 Northern Territory of Australia로부터의 임상적 단리물이다 (17). 두 균주 모두는 Menzies School of Health Research (MSHR)로부터 입수하였고; 인 비보 연구를 위해 마우스를 적응시키고, 스트렙토마이신 내성 (200 μg/mL)을 가졌다. JRS145는 M-단백질 네가티브 돌연변이체이다.
효소-연결된 면역흡착 분석법 (ELISA)
바이오티닐화 펩티드에 의한 ELISA를 제조사에 의해 권장되는 바와 같이 수행하였다 (Mimotopes, Australia). 간단하게, 수중 5 μg/ml의 최종 농도의 스트렙타비딘 (Sigma-Aldrich, Australia)의 100 μl 알리코트 (aliquots)를 Oltrack 활성화된 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Concentrack, Netherlands)에 부가하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 웰을 RT에서 1시간 동안, 0.05% Tween 20 및 1 % 소듐 카제이네이트 (Sodium caseinate)를 함유하는 200 μl PBS, pH 7.2로 차단하고, 그 후에 PBS/Tween 20으로 세척하였다. 상기 펩티드를 0.1 % 소듐 아지드를 갖는 PBS/Tween 20에서 작업 농도 20 μg/ml로 희석시키고, 각 100 μl를 상기 웰에 부가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 철저하게 세척한 후에, 뮤린 (murine) p145 또는 J8 항혈청을 부가하였다. 상기 플레이트를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, HRP-접합된 염소 항-마우스-IgG (Bio-Rad, Australia) (1/3000)를 RT에서 또 다른 20분 동안 부가하였다. 추가 세척 후에, OPD 기질 (Sigma-Aldrich)을 부가하고, OD450에서 측정하였다. 역가 (Titre)는 동일한 희석에서 정상 마우스 혈청을 함유하는 대조군 웰의 평균 OD보다 높은 3개 초과의 표준 편차 (SD)로 판독되는 광학 밀도 (OD)를 제공하는 최대 희석으로 정의되었다 (19).
저해 분석을 위해, 마이크로타이터 플레이트를 75 mM 소듐 카르보네이트, pH 9.6 중에 최종 농도 5 μg/ml의 100 μl의 정제된 p145로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척 버퍼 (0.05 % Tween 20을 갖는 PBS, pH 7.2)로 세척하고, 5% 탈지유가 공급된 세척 버퍼 (차단 버퍼)로 37℃에서 90분 동안 차단하였다. 항-p145 혈청을 펩티드 라이브러리로부터 선택된 다양한 농도 (0.25 μg/ml - 2.5 μg/ml)의 펩티드와 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에 테스트 항혈청을 차단된 플레이트에 부가하고, 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 4회 세척하고, HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG (Biorad, Australia) (1/3000)를 부가하고, 37℃에서 또 다른 90분 동안 인큐베이션하였다. 추가 세척 후에, 상기 플레이트를 상기에 기재된 바와 같이 발색시키고, OD450에서 측정하였다.
인간 심장 단백질과의 교차-반응성에 대한 분석에서, 5 μg/ml의 트로포미오신, 미오신 또는 케라틴 (Sigma-Aldrich, Australia)을 마이크로타이터 플레이트에 고정시켰다. 상기에 기재된 바와 같이 차단 및 세척 후에, 상기 플레이트를 각 항-펩티드 (p*1-p*18) 혈청 (1/100)과 삼중으로 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 2차 항체 및 기질을 상기에 기재된 바와 같이 부가하였다.
마우스의 면역화
모든 프로토콜은 Australian National Health and Medical Research (NHMRC)의 지침에 따라 QIMR Berghofer Medical Research Institute의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았다. 0일차에, Quackenbush 마우스 (Animal Resources Centre, Australia) (그룹당 n = 3)의 꼬리 기저 (tail base)에 총 부피 50 μl의 완전 Freund 아쥬반트 (complete Freund's adjuvant: CFA)로 1:1로 유화된 상이한 펩티드 30 μg를 피하로 (s.c.) 접종하였다. 대조군 마우스에게는 CFA 중 멸균-여과된 PBS를 주었다. 1차 면역화 3주 후에, 마우스에게 매주 간격 (21일 및 28일)으로 면역원의 2회의 부스터 면역화 (멸균-여과된 PBS 중 각 30 μg)하였다. 1000 미만의 항체 역가를 가진 마우스 그룹에게 불완전 Freund 아쥬반트 (incomplete Freund's adjuvant)로 1:1로 유화된 3차 부스터를 제공하였다. 열-사멸된 GAS 2031 (emm1)을 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다 (18). 피부 챌린지 연구 (skin challenge studies)를 위해, BALB/c 마우스 (n=10/그룹)의 꼬리 기저에 알룸 (Alum)에서 제제화된 30 μg의 p145-DT 또는 p*17-DT 또는 열 사멸된 2031 GAS 제제로 1회 s.c.로 면역화하였다. p145 용량-범위 연구를 위해, 0일차에 p145-DT/Alum으로 1차 면역화 후에, 특정 코호트에게 21일 및 28일차에 1 또는 2회 부스트를 투여하였다. 대조군 마우스에게는 아쥬반트 만을 제공하였다. 부스트 1일 전 및 최종 면역화 1주 후에 각 마우스로부터 혈액을 수집하였다. 상기 혈액을 4 ℃에서 적어도 4시간 동안 응고시키고, 1000 g로 10분 동안 원심분리 후에 혈청을 수집하였다. 혈청은 -20 ℃에서 저장하였다.
혈청의 친화도 정제
펩티드 특이적 혈청의 정제를 위해, Microlink 펩티드 커플링 키트 (Pierce, USA)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 간단하게, 각 펩티드를 커플링 버퍼 (coupling buffer)에서 0.6 mg/ml로 희석시키고, Ultralink 요오도아세틸 겔 스핀 컬럼 (Pierce, USA)에 고정시켰다. 상기 컬럼을 커플링 버퍼로 철저하게 세척하고, L-시스테인 HCl (10 mg/ml)로 차단하였다. 그 후에, 상기 컬럼을 세척 버퍼 그 다음에 PBS로 세척하였다. 친화도 정제를 위해, 300 μl의 상이한 Quackenbush 혈청을 각 컬럼에 부가하고, 4℃에서 회전시키면서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 컬럼을 PBS로 3회 세척하고, 항체를 100 μl의 용출 버퍼로 용출시켰다. 그 후에, 상기 컬럼을 상기에 기재된 바와 같이 다시 세척 및 차단하고, 추가의 혈청을 부가하였다. 상기 용출된 면역글로불린 (Ig) 농도는 Nanodrop (Thermo Scientific, USA)을 사용하여 추정하였다. 농도 5 μg/ml의 정제된 IgG 제제를, 이어서 2배 연속 희석하고, 다양한 농도의 p145에의 결합에 대해 평가하였다.
유세포 분석
펩티드 항체의 S. 피오게네스에의 결합을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 1% 네오펩톤 (neopeptone)을 갖는 Todd-Hewitt 브로스 (THB)에서 박테리아를 밤새 성장시키고, PBS에서 2회 세척하였다. 그 후에, 박테리아 (3x107 콜로니 형성 유닛; cfu)를 100 μl의 Fc 차단제와 RT에서 15분 동안 사전-인큐베이션하고, 그 후에 10 mg/ml 농도의 펩티드 항체를 부가하였다. RT에서 30분 인큐베이션한 후에, 상기 박테리아를 PBS에서 2회 세척하고, 그 후에 FITC-접합된 항-마우스 IgG (2% BSA를 갖는 PBS 중에 1/50으로 희석)와 인큐베이션하고, 총 부피 100 μl를 RT에서 또 다른 30분 동안 부가하였다. 상기 박테리아를 세척하고, 300 μl의 1 % 포름알데히드 (PBS 중)에서 RT에서 15분 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 FACS Calibur Flow Cytometer 1 (Becton Dickinson, USA)에서 판독할 때까지 얼음으로 옮겼다.
FITC-접합된 항-마우스 IgG를 분석된 각 균주에 대해 네가티브 대조군으로서 각각 부가하고, 또한 비-특이적 마우스 IgG는 대조군으로서 포함되었다.
GAS 피부 챌린지 절차
S. 피오게네스 2031 (emm1), 88/30 (emm97) 및 5448AP (emm1)를 1% 네오펩톤 함유 THB (THBN)에서 밤새 배양하고, THBN에서 2회 세척하고, 원래 부피의 25% 중에 재현탁하였다. 접종물 용량 (CFU/ml)을 600 nm에서 광학 밀도로 결정하고, 2% 말 혈액 THB 아가 상에 박테리아 현탁액의 10배 희석물을 도말하였다. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후에, 콜로니 계수를 결정하였다. 최종 면역화하고 2주 후에, 면역화된 대조군 마우스를 이전에 기재된 바와 같이 피부 감염 경로를 통해 선택된 GAS 균주로 챌린지하였다 (19).
분자 동역학 (MD) 시뮬레이션
펩티드 p*17 및 P145의 분자 동역학 (Molecular dynamics: MD) 시뮬레이션을 수행하여 이들의 면역원성의 가능한 분자적 기초를 조사하였다. C-말단에 시스테인이 부착된 이들 서열을 PEP-FOLD 서버에 제출하여 (20) 초기 구조적 모델을 구축하였다. 이들 모델을 MD 시뮬레이션에 대한 출발점으로 사용하였고, 이는 GROMACS 5에서 수행하였다 (21). 모든 잔기를 Amber ff14SB force field (22)로 파라미터화하였다 (parameterized). 각 펩티드를 용질과 상자 가장자리 사이에 최소 거리 1.2 nm로 12면체 상자에 넣고, 그 후에 TIP3P 물 분자로 용매화하였다 (23). 그 다음에 시스템에서 이온 전하의 균형을 맞추기 위해 염 이온을 0.15 M의 농도로 부가하였다. 임의의 원자에서 500 kJ mol- 1 nm-1 미만의 최대 힘을 달성하기 위해 연속적으로 최급 강하 적분기 (steepest descent integrator) 및 콘쥬게이트 구배 알고리즘 (conjugate gradient algorithm)으로 에너지 최소화를 수행하였다. Verlet 컷오프 방식 (24)을 사용하여 반 데르 발스 및 정전기적 상호작용이 0.8 nm에서 절단된, 단-범위, 비-결합 상호작용 (short-range, non-bonded interactions)을 평가하였다. 장-범위 정전기적 상호작용 (Long-range electrostatic interactions)은 PME (particle mesh Ewald) 방법으로 처리되었다 (25, 26). 0.1 ps의 커플링 상수를 갖는 속도 재조정 온도조절기 (velocity rescaling thermostat) (27)를 사용하여 온도를 298 K로 유지하였고, 압력은 1 ps의 커플링 상수를 갖는 Berendsen barostat (28)를 사용하여 1.0 atm으로 유지하였다.
시뮬레이션은 2 fs의 시간 단계로 수행하였고, 수소 원자를 포함하는 모든 결합은 P-LINCS (parallel linear constraint solver)에 의해 구속되었다 (29). 각 시스템은 100 ps에 대한 일정 부피 (NVT) 앙상블 및 100 ps에 대한 일정 압력 (NPT) 앙상블 하에 평형화되었다. 1000 kJ mol- 1 nm-2의 힘 상수를 갖는 고조파 위치 제약 (harmonic position restraint)을 비-용매 분자의 모든 중 원자 (heavy atoms)에 적용하였다. 평형화 후에, 생산 MD 시뮬레이션을 임의의 제약 없이 각 시스템에 대해 100 ns 동안 수행하였다. 초기 속도 생성을 위해 랜덤 시드 (random seed)를 가변하여 각 시스템에 대해 3회의 복제 MD 실행을 수행하였다. MD 궤도 분석은 평형을 허용하기 위해 각 100-ns 실행의 최종 40 ns에 대해 GROMACS 5의 내장 프로그램에 의해 수행되었다.
통계 분석
평균 및 표준 오차는 표준 공식을 사용하여 계산하였다. Mann-Whitney 테스트를 사용하여 2개 그룹 사이의 항체 역가를 비교하였다. 달리 언급하지 않는 한, P 값은 다중 비교를 위해 Bonferroni 방법을 사용하여 보정되었다. Tukey's post hoc 방법에 의한 ANOVA를 사용하여 각 시점에서 모든 처리된 코호트와 대조군 코호트 사이의 유의성을 결정하였다.
결과
본 발명의 목표는 p145 내에 최소 12개의 아미노산 에피토프 내에서 돌연변이체 서열 선택의 반복 라운드를 사용하여 p145와 비교하여 GAS에 대해 우수한 펩티드 면역원을 디자인하는 것이다 (표 1). 처음에, 본 발명자는 p145의 항원성이 단일 돌연변이로 증가될 수 있는지를 묻는 돌연변이체 펩티드 라이브러리 (L1)를 디자인하였다. 본 발명자는 항원성을 증진시키지만 알려져 있는 인간 단백질과 유사한 서열을 형성하지 않는 돌연변이를 동정하고자 하였다.
L1에서, 하나의 아미노산을 한번에 변경하고, 상기 펩티드가 알파 나선형으로 폴딩을 유지하는 것과 관련된 물리화학적 특성에 기반하여 아미노산 치환을 선택하였다 (5,11 30). 결과의 라이브러리는 86개의 p145 변이체와 원래의 p145로 구성되었다 (표 3). 또한, 비-특이적 펩티드 (pNS [# 87],)를 대조군으로서 포함하였다. p145 항혈청의 각 펩티드에의 결합은 ELISA를 사용하여 분석하였다. 이들 연구에서, 각 펩티드의 동일한 양을 상기 플레이트에 결합하도록 보장하기 위해서, 본 발명자는 바이오티닐화 펩티드를 사용하였고, 이는 스트렙타비딘을 통해 상기 플레이트에 부착되었다. 4개의 아미노산 펩티드 링커를 돌연변이체 펩티드와 바이오틴 사이에 넣어 항체 인식을 위한 충분한 공간을 보장하였다. 항혈청은 p145-면역화된 B10.D2, BALB/c 및 outbred Quackenbush 마우스로부터 수득하였다. 3가지의 상이한 마우스 균주 각각에 대해, 항혈청의 변이체 펩티드에의 결합의 범위는 이의 p145에의 결합과 비교하여 최소 내지 약간 증가하였다 (도 1a). 대부분의 치환은 결합 감소를 초래하였다. 또한, 각 B10.BR 또는 BALB/c 마우스로부터 채취된 J8 또는 J8-DT 항혈청에서도 유사한 결과를 수득하였다 (데이터는 개시되지 않음).
비-특이적 펩티드는 모든 펩티드의 웰에서 최소로 인식되었다. 본 발명자는 p145-특이적 항혈청이 p145와 유사하거나 또는 더 우수한 결합을 나타내는 17개의 펩티드를 동정하였고, p145-특이적 항혈청의 모체 p145 펩티드에의 결합을 용액 중의 이들 펩티드가 저해할 수 있는지를 확인하였다. 이들 펩티드를 저해 ELISA에서 테스트하는 경우, 이들은 2개의 상이한 농도 (0.25 μg/ml 및 2.5 μg/ml)에서, 용량 의존성 반응을 나타내었다 (도 1b 및 도 6). 상기 농도 모두에서, 펩티드는 아마도 p145와 유사한 폴딩을 유지했기 때문에, 용액 중 항-p145 항체의 p145에의 결합을 유사한 정도로 저해하였지만, 명백하게 우수하지는 않았다 (도 1b 및 도 6).
인간 특이적 항체의 유도를 피하기 위해, 본 발명자는 바이오인포매틱스 프로그램 (BLASTP 및 Clustal Omega)을 사용하여 아미노산 치환으로 인간 단백질과 밀접한 관련이 있는 서열을 초래하였는지 여부를 분석하였다. 루틀틴 (rootletin) (섬모 뿌리 코일형-코일 단백질), Dynactin 1, B-세포 수용체 관련 단백질 29, 미세소관-액틴 교차 연결 인자 1 및 미오신 (중쇄 폴리펩티드 7B, 심장근, 베타, Isoform CRA_c)을 포함하는 인간 단백질과의 유사성 (>50% 서열 동일성)으로 인한 추가적 고려사항으로 3개의 펩티드 (2, 9 및 41)를 제거하였다. 그러므로, 1차 스크린 결과 7개의 펩티드를 도출하였고 (5, 6, 11, 13, 40, 66 및 72), 이는 p145 최소 에피토프 내에 4개의 위치에서 돌연변이 S1E, S1V, R2N, R2D, K6N, K10R 및 K10M을 포함하였다 (도 1c).
이들 펩티드에서 단일 돌연변이로 p145-항혈청에 의해 약간 증가된 인식을 초래한 것을 추론한 후에, 본 발명자는 상기에서 확인된 7개의 아미노산 돌연변이로부터 2개의 돌연변이의 모든 가능한 조합을 포함하는 18개의 펩티드를 함유하는 제2 라이브러리, L2를 디자인하였다. 이로 인해 p*1-18로 지정된 펩티드를 얻었다 (표 2).
본 발명자는 outbred (Quackenbush) 마우스에서 이들 이중 돌연변이된 펩티드의 면역원성을 조사하였다. 상기 펩티드의 면역원성은 다양하지만, p*14 및 p*16을 제외한 모두는 면역화 펩티드에 대해 항체를 생성하였고, 여기서 대부분은 3회의 면역화 후에 1 105 내지 106의 역가를 제공하였다 (도 2a). p*14, p*15 및 p*16을 제외한 모든 펩티드는 p145보다 유의하게 더 면역원성이었다. 가장 면역원성인 펩티드는 p*17이었다. 그 다음에 p*14 및 p*16을 제외한 모든 펩티드에 대한 항체는 면역화 펩티드를 사용하여 친화도-정제하였고, 본 발명자는 플라스틱에 고정된 p145 펩티드의 적정 (titrating) 농도에 대한 각 항체의 상대 결합을 확인하였다. 각 플레이트를 5 μg/ml의 정제된 항체와 인큐베이션하였다.
7개의 펩티드 (p*2, p*4, p*6, p*10, p*13, p*17 및 p*18)에 의해 유도된 항체는 p145-유도된 항체보다 고정된 p145에 유의하게 더 강력하게 결합하여 더 높은 친화도를 나타내었다 (도 2b). 본 발명자는 이들 7개의 펩티드 중 5개의 펩티드 (p*4, p*10, p*13, p*17 및 p*18)가 K10 돌연변이를 갖는 것을 주목하였다. 그 다음에 본 발명자는 유세포 분석을 사용하여 동일한 농도에서 각 친화도-정제된 항체의 상이한 emm 단백질 - 2031 (emm1) 및 88/30 (emm97)을 발현하는 스트렙토코쿠스의 표면에의 결합을 조사하였고, 이들 모두는 정확하게 동일한 p145 서열을 함유한다.
p*2, p*4, p*17 및 p*18에 대한 항체는 p145-유도된 항체와 비교하여 훨씬 더 높은 정도로 GAS 균주 모두에 결합하였고 (도 3의 A-B), 항-p*17 IgG는 최대 결합을 나타내었다. 대부분의 펩티드 항혈청의 경우, p145에의 결합과 박테리아 표면에의 결합 사이에 상관관계가 있으며, p*17에 대한 항혈청은 p145 및 스트렙토코쿠스 모두에 대해 가장 강한 결합을 나타내었다 (도 2b 및 3). 상기 항혈청을 또한 emm-네가티브 균주 (JRS145)에 대해 테스트하였다. 이들 균주에 대한 결합은 관찰되지 않았으며 (도 3의 C), 이는 상기 항체가 M 단백질 내에 에피토프를 인식하고 있음을 확인하였다.
가장 효과적인 펩티드 (p*2, p*4, p*17 및 p*18) 중에, 펩티드 *2 및 *4는 이들 펩티드에 대한 항체가 알파 나선형 코일 인간 단백질을 인식했기 때문에 추가적으로 고려되지 않았다 (도 7). 그러므로, 2개의 펩티드, p*17 및 p*18을 추가적으로 고려하였고, 본 발명자는 이의 우수한 면역원성으로 인해 p*17에 주목하였다.
p*17이 p145보다 더 면역원성이므로, p*17에 대한 항체는 p145 자체에 의해 유도된 항체보다 p145에 더 높은 친화도를 나타내었고, 이들은 p145에 의해 유도된 항체보다 상이한 스트렙토코쿠스 균주에 더 강하게 결합하는 것으로 밝혀졌고, 본 발명자는 p*17이 p145보다 우수한 백신일 수 있음을 확인하였다. 디프테리아 톡소이드에 접합된 p145 (p145-DT)는 스트렙토코쿠스 피부 챌린지에 대해 방어할 수 있지만, 3회 용량의 백신을 필요로 한다 (보조 도 3의 A 및 B). 따라서, p*17을 디프테리아 톡소이드에 접합시키고, p145-DT를 이용하지만 단일 용량의 백신만을 사용하는 직접 비교 연구 (head-to-head study)에서 비교하였다. 본 발명자는 항-펩티드 반응에 대해 유사한 정도의 T-세포 도움을 제공하는 접합된 펩티드를 사용하여, B 세포에 대한 펩티드의 면역원성들을 직접 비교할 수 있게 하였다.
BALB/c 마우스를 알룸으로 제제화된 각 p*17-DT, p145-DT 또는 PBS로 피하로 면역화하였다. 상기 면역원을 DT에 접합시켰지만, 본 발명자는 백신화 3주 후에 측정할 때 p*17-DT에 의해 유도된 p145-특이적 항체 역가가 p145-DT에 의해 유도된 것보다 유의하게 더 높다는 것을 주목하였다 (도 4의 A). 그 다음에, 마우스를 GAS의 2031 (emm1) 또는 88/30 (emm97) 균주로 피부 경로를 통해 챌린지하여 백신 효능을 결정하였다. 다시, 2031 또는 88/30 GAS에 대한 p145-DT의 단일 용량에 의한 백신화에 의해 방어를 제공하지 않았다 (도 4의 B 및 D). 그러나, p*17-DT에 의한 백신화 결과 p145-DT로 백신화된 마우스와 비교하여 챌린지 6일 후에 피부 박테리아 부담에서 100-1000배 감소되었다 (도 4의 B 및 D). 더욱이, p*17-DT 백신화로 마우스에서 2031 GAS로 인해 세균혈증으로부터 무균 방어를 초래하였다 (p145-DT로 백신화된 마우스와 비교하여 혈중 박테리아 부담에서 >10,000-배 감소) (도 4의 C). 또한, p*17-DT 백신화된 코호트는 감염 후 6일까지 88/30으로 인한 전신 감염을 완전히 해결한 반면에, p145 및 PBS 면역화된 코호트는 여전히 상당히 높은 세균혈증을 가졌다 (도 4의 E).
p*17-DT의 방어 능력은 CovR/S 돌연변이체 균주를 이용한 하나의 다른 연구에서 추가적으로 입증되었다. p*17-DT에 의한 단일 백신화는 높은 펩티드 특이적 역가를 유도하였고 (도 8의 C), PBS 대조군 코호트와 비교하여 피부 박테리아 부담에서 >90% 감소를 초래하였다 (도 8의 D). 더욱이, 방어 수준은 열-사멸된 GAS에 의해 제공되는 것과 비교하여 상당히 우수했다 (도 8의 D).
따라서, p145의 비천연 유도체인 p*17은 p145 자체보다 역가 및 친화도 측면에서 p145에 대한 우수한 항체 반응성을 유도할 수 있고, 스트렙토코쿠스를 인식하고 이에 대해 방어하는 항체 유도의 관점에서 p145보다 상당히 우수한 면역원이다. 상기 불일치를 설명할 수 있는 p145와 p*17 사이에 유의한 구조적 차이가 존재하는지를 묻기 위해, 본 발명자는 상기 펩티드를 분석하기 위해 분자 동역학 (MD) 시뮬레이션을 사용하였다. 상기 시뮬레이션으로 p145에서 나선은 위치 12와 14 사이를 파손한 것으로 나타났으며, 아마도 위치 12 및 13에서 양으로 하전된 Ks의 파괴적 효과 (disruptive effect) 때문일 것이다 (도 5a). p*17은 나선의 폴딩을 용이하게 하는 위치 13에서 하전되지 않은 (non-charged) 아스파라긴 (N)을 갖는다. 상기 데이터는 또한 p145 펩티드가 p*17보다 나선형 구조를 채택할 가능성이 적고 (나선도 퍼센트 <50 대 <80; 도 5b), 또한 더 큰 유연성 (RMS 변동; 도 5c)을 나타내는 것을 입증하였다.
도 9의 계획에 따른 추가적 실험에서, p*17 단독 또는 S2 펩티드와 함께 근육내 면역화를 조사하였다. 마우스를 p*17-DT+K4S2-DT/Alum으로 3회 면역화하고, 5448AP (CovR/S MT 균주)로 비강내 챌린지하였다. 도 10은 p*17-기반 백신으로 i.m. 면역화 후에 면역원성을 나타내었다. BALB/c 마우스 (n=15/그룹; 암컷, 4-6주령)를 0일, 21일 및 42일에 p*17-DT/Alum, p*17-DT+K4S2-DT/Alum 및 PBS/Alum으로 i.m. 면역화하였다. 최종 부스트하고 1주일 후에, 혈청 및 타액 샘플을 수집하고, p*17-특이적 IgG (A & C) 및 IgA (B & D) 항체 반응을 ELISA로 측정하고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. 역가는 PBS/Alum 만을 투여한 대조군 코호트와 비교하였다.
도 11은 비강내 감염 후 방어를 나타낸다. 최종 백신 부스트하고 2주 후에, 상기 마우스를 covR/S 돌연변이체 GAS (5448AP)로 비강내 감염시켰다. 1-3일차에, 코 흘림 (NS)을 수집하였다. NS에서 박테리아 부담은 5% 탈섬유소 말-혈액을 함유하는 CBA (columbia blood agar) 플레이트 상에 각 마우스의 외비공을 눌러서 결정하였고, 날숨 입자를 스트리킹하였다. 1-3일차에, NS를 수집하고, 각 개별 일자로부터 로그 변환된 평균 ± SEM (A) 및 조합된 3일 모두로부터의 누적 CFU (B)로 표시하였다. 코 흘림에서 박테리아 부담의 감소 퍼센트는 도 12에 도시하였다.
도 13은 비강내 감염 후 방어를 나타낸다. 1-3일차에 NS 이외에 인후 도말 (TS)을 수집하였다. 인후 도말을 위해, 면봉 어플리케이터를 멸균 PBS에 넣어 적시고, 그 다음에 마우스를 고정하고, 인후를 도말하였다. 그 다음에 면봉 어플리케이터를 PBS에 현탁시키고, 연속하여 희석하고 5% 탈섬유소 말-혈액을 함유하는 CBA 플레이트 상에 이중으로 도트-플레이트하였다. 1-3일차에 NS를 수집하고, 각 개별 일자로부터의 로그 변환된 평균 cfu/ml ± SEM (A) 및 조합된 3일 모두로부터의 누적 CFU (B)로 표시하였다. 도 14는 인후 도말에서 박테리아 부담의 감소를 나타내었다.
도 15는 비강내 감염 후 방어를 나타낸다. 감염 후 3일차에, 모든 살아있는 마우스를 안락사시키고, NALT, 폐, 비장 및 혈액 샘플을 수집하여 GAS 박테리아 부담을 결정하고, 데이터는 로그 변환된 평균 cfu/ml ± SEM (A) 및 PBS/Alum 대조군과 비교한 감소 퍼센트 (B)로 표시하였다.
본 발명자는 p*17-DT/Alum에 의한 3x i.m. 면역화가 GAS에 의한 비강내 챌린지에 대해 방어하는지를 추가적으로 관찰하였다. 각 코 흘림 및 인후 도말에서 박테리아 부하가 70%-90% 감소하였다. 또한 전신 박테리아 부담은 70% 이상 감소하였다. 이러한 사실에도 불구하고, 이들 마우스는 혈청 또는 타액 IgA를 유도하지 않았다. 흥미롭게도, 본 발명자는 i.m. 면역화 후에 타액 IgG의 유도를 관찰하였다. 항체 반응의 결정을 위해, 본 발명자는 종점 역가로서 정의되는 반-정량적 분석 (ELISA)을 수행하였다. p*17-DT (K4S2의 존재 또는 부재)에 의한 근육내 백신화를 활용하는 실험에서, 점막　IgA 반응은 검출되지 않은 반면에 점막 IgG 반응은 적어도 10배 더 높았다.
p*17의 증진된 면역원성을 추가적으로 뒷받침하는 J8과 p*17 펩티드 사이의 차이를 제시하는 J8 펩티드, p145 및 p*17의 구조 비교를 수행하였다. J8은 28-mer인 반면에 p*17은 20-mer 펩티드이다. 상기 2개의 펩티드는 10개의 아미노산을 공유하며, 이는 진하게 표시된 스트렙토코쿠스 아미노산인 네이티브 펩티드 p145 (도 16)로부터 유래된다. J8과 p*17을 비교하는 MD 시뮬레이션 연구에서 두 펩티드가 나선형으로 폴딩되지만, J8은 p*17과 비교하여 더 유연한 것을 입증하였다. 본 발명자는 p*17의 전체 3차 구조가 이를 더 안정하게 만들어서, 숙주 분자와의 보다 우수한 상호작용을 촉진시킨다고 믿었다. 더욱이, p*17의 아미노산 조성물 (J8보다 스트렙 서열에 더 유사함)은 J8보다 유기체의 네이티브 구조를 더 잘 인식하는 항체를 유도할 가능성이 있다.
토의
펩티드 백신 개발은 펩티드의 면역원성을 증가시키는 기술에 의해 크게 촉진될 것이다. 면역원성을 변형시키기 위해 선택적 아미노산 치환을 사용한 연구는 거의 없었으며, 테스트하는 경우 CD8+ T 세포의 자극을 증가시키기 위한 에피토프 변형에 초점을 두었으며, 결과들을 혼합하였다. 본원에서, 본 발명자는 S. 피오게네스 유래의 복합 12-아미노산 나선형 합성 펩티드의 면역원성을 유의하게 증진시키는 전략을 서술하였다. 다수의 이중 변형된 펩티드는 일부 항혈청을 가진 모체 펩티드 및 면역화 펩티드에 대한 항체를 유도하는 측면에서 유의하게 증진된 면역원성을 나타내었고 또한 스트렙토코쿠스 표면에의 증진된 결합을 보여주었다. 모체 펩티드 및 유기체 (항-p*17) 모두에 가장 강하게 결합된 항혈청을 가진 펩티드를, 스트렙토코쿠스 감염을 예방하기 위한 백신으로서 테스트하였고, 여기서 본 발명자는 단일 면역화 결과 피부 및 침습성 질환으로부터 유의하게 증진된 방어를 관찰하였다 (피부 스트렙토코쿠스의 바이오-부담에서 100-배 이상 감소 및 혈중 박테리아-부담에 대해 >10,000-배 감소).
본 발명자는 각 펩티드에서 하나의 아미노산 변경을 가진 86개 펩티드의 펩티드 라이브러리의 항원성의 초기 관찰에 기반하여 p*17을 디자인하였다. 최소 나선형 에피토프의 12개 아미노산으로부터 4개의 아미노산은 모체 서열뿐만 아니라 최소로 인식하는 펩티드의 구성과 관련이 있었다. 이들 단일 돌연변이된 펩티드가 항-p145 항혈청에 의해 모체 펩티드인 p145에 대해 최소한의 개선된 인식을 보여주었고, 2개의 돌연변이를 갖는 신규한 펩티드는 p145보다 면역원으로서 훨씬 우수하였다. 그러나 더욱 놀랍게도, 이들 이중 돌연변이된 펩티드에 의해 생성된 항체는 p145 자체에 의해 유도된 항체보다 유의하게 더 높은 친화도로 p145를 인식하였다. 또한, 다수의 펩티드 항혈청은 p145 백신화에 의해 유도된 항체보다 스트렙토코쿠스 표면을 더 격렬하게 인식하였다.
더욱이, 하나의 이러한 펩티드인 p*17의 방어 효능은 상기 펩티드가 우수한 백신 후보체임을 나타낸다. p*17에 의한 단일 면역화는 자신 및 p145-특이적 항체의 높은 수준을 유도하며, 이는 다수의 GAS 균주에 대해 방어적이다. 추가로, 상기 펩티드는 또한 전 세계적으로 침습성 감염증을 담당하는 고독성 GAS 균주에 대해 방어적이다. 현재, 효모 나선형 펩티드 내에 표시되고 J8로 언급되는, p145 내의 최소 에피토프는 스트렙토코쿠스에 대한 선두 백신 후보체이다 (12). 상기 백신 후보체는 또한 피부 질환에 대한 방어를 유도하기 위해 3회 용량을 필요로 한다 (19).
MD 시뮬레이션은 p*17이 p145보다 나선으로 폴딩될 가능성이 높고, 더 큰 안정성을 갖는다는 것을 보여주었다. 안정성 증가는 p145보다 더 면역원성일 가능성이 있고, 유기체의 네이티브 구조를 인식하는 항체를 유도할 가능성이 있으며, 여기서 상기 에피토프는 나선으로 유지된다. p145 서열과 구별되는 M 단백질와 함께 다른 에피토프에 p*17 항체의 입체형태학적 결합은 또한 부분적으로 p*17의 증진된 효능을 설명할 수 있다. 그러나, 항-p*17 항체가 p145 자체에 대해 발생된 항체보다 p145를 더 잘 인식하는지를 알고 싶다. 항-p*17 항체는 p145를 나선형으로 폴딩할 수 있다.
본 발명자는 더 높은 역가 및 더 높은 친화도 모두를 갖는 항-p145 항체를 유도하는 7개의 변이체 펩티드 중에, 4개의 펩티드 (p*10, p*13, p*17 및 p*18)는 2개의 위치가 모두 하전된 아미노산에 의해 점유되지 않도록 최소 에피토프 및/또는 위치에서 돌연변이를 함유하는 것을 발견하였다. 상기 최소 에피토프에서 이들 위치는 나선형 펩티드의 친수성 측에서 함께 나오는 헵타드 모티프 (heptad motif)에서 위치 f 및 c에 해당하며; 이는 이들 구조를 더 안정하게 만들 수 있다. 본 발명자는 인간 단백질 (p*17)과 서열 상동성을 공유하지 않는 가장 면역원성인 것에 중점을 두었기 때문에 다른 펩티드에 대한 MD 시뮬레이션은 수행하지 않았다.
본 발명자는 점막 표면에서 방어는 타액 IgG의 유도에 기인하는 것이라고 가정하였다. 점막 표면에서 IgG는 응집에 의해 콜로니화를 방지하여 이로 인해 박테리아를 제거하는 것으로 나타났다 (Roche et. al., Mucosal Immunol, 2015). 또한, p*17-DT가 K4S2-DT와 조합하는 경우 타액 IgG를 유도할 수 있고, 조합 백신은 p*17-DT 단독보다 고독성 CovR/S 돌연변이체 GAS 5448AP에 대한 방어가 상당히 우수했다.
J8과 p*17을 비교하는 MD 시뮬레이션 연구에서 두 펩티드가 나선형으로 폴딩되지만, J8은 p*17과 비교하여 더 유연한 것을 입증하였다. 본 발명자는 p*17의 전체 3차 구조가 이를 더 안정하게 만들어서, 숙주 분자와의 보다 우수한 상호작용을 촉진시킨다고 믿었다. 더욱이, p*17의 아미노산 조성물 (J8보다 스트렙 서열에 더 유사함)은 J8보다 유기체의 네이티브 구조를 더 잘 인식하는 항체를 유도할 가능성이 있다.
결론적으로, 본 발명자는 면역글로불린 수용체에 의한 에피토프의 상호작용하는 잔기의 변형과 관련된 것이 아닌, 에피토프와 B 세포 Ig 수용체 사이의 비-특이적 이온력에 의한 변형과 관련이 있을 수 있는 기전을 통해 유의하게 증진된 면역원성을 가진 펩티드를 디자인하는 전략을 정의하였다. 본 발명자가 서술하는 일반적인 전략은 많은 복합 펩티드 에피토프의 면역원성을 향상시킬 수 있다.
본 명세서를 통해서, 본 발명을 임의의 일 구체예 또는 특성들의 특정 집합에 제한하지 않고 본 발명의 바람직한 구체예를 기재하는데 목적이 있다. 본 발명의 광범위한 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 본원에 기재되고 예시된 구체예에 대한 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있다.
본원에 언급된 모든 컴퓨터 프로그램, 알고리즘, 특허 및 과학 문헌은 이들의 전문이 참조로 본원에 포함된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
p145 및 최소 에피토프
펩티드 서열 펩티드 길이
p145 LRRDLDASREAKKQVEKALE 20개의 아미노산
최소 에피토프 * SREAKKQVEKAL 12개의 아미노산
*p145내에 12-mer 최소 B-세포 에피토프 (31).
표 2. 각 펩티드 서열을 갖는 L2* 라이브러리
p145 LRRDLDA SREAKKQVEKAL E
p*1. LRRDLDA EN EAKKQVEKAL E
p*2. LRRDLDA ED EAKKQVEKAL E
p*3. LRRDLDA E REAK N QVEKAL E
p*4. LRRDLDA E REAKKQVE R AL E
p*5. LRRDLDA E REAKKQVE M AL E
p*6. LRRDLDA VN EAKKQVEKAL E
p*7. LRRDLDA VD EAKKQVEKAL E
p*8. LRRDLDA V REAK N QVEKAL E
p*9. LRRDLDA V REAKKQVE R AL E
p*10. LRRDLDA V REAKKQVE M AL E
p*11. LRRDLDA S N EAK N QVEKAL E
p*12. LRRDLDA S N EAKKQVE R AL E
p*13. LRRDLDA S N EAKKQVE M AL E
p*14. LRRDLDA S D EAK N QVEKAL E
p*15. LRRDLDA S D EAKKQVE R AL E
p*16. LRRDLDA S D EAKKQVE M AL E
p*17. LRRDLDA SREAK N QVE R AL E
p*18. LRRDLDA SREAK N QVE M AL E
*L2 라이브러리에서 각 펩티드는 2개의 아미노산을 변경하여 디자인하였다. 원래의 p145 서열에서 치환된 아미노산은 밑줄로 표시하였다.
표 3. 86개의 p145 변이체를 포함하는 L1* 펩티드 라이브러리
P145. 바이오틴-SGSGLRRDLDASREAKKQVEKAL E (서열번호:113)
1. 바이오틴-SGSGLRRDLDA L REAKKQVEKAL E
2. 바이오틴-SGSGLRRDLDA A REAKKQVEKAL E
3. 바이오틴-SGSGLRRDLDA Y REAKKQVEKAL E
4. 바이오틴-SGSGLRRDLDA M REAKKQVEKAL E
5. 바이오틴-SGSGLRRDLDA E REAKKQVEKAL E
6. 바이오틴-SGSGLRRDLDA V REAKKQVEKAL E
7. 바이오틴-SGSGLRRDLDA I REAKKQVEKAL E
8. 바이오틴-SGSGLRRDLDA S E EAKKQVEKAL E
9. 바이오틴-SGSGLRRDLDA S Q EAKKQVEKAL E
10. 바이오틴-SGSGLRRDLDA S K EAKKQVEKAL E
11. 바이오틴-SGSGLRRDLDA S N EAKKQVEKAL E
12. 바이오틴-SGSGLRRDLDA S T EAKKQVEKAL E
13. 바이오틴-SGSGLRRDLDA S D EAKKQVEKAL E
14. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SR N AKKQVEKAL E
15. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SR K AKKQVEKAL E
16. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SR R AKKQVEKAL E
17. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SR D AKKQVEKAL E
18. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SR Q AKKQVEKAL E
19. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SR A AKKQVEKAL E
20. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SR S AKKQVEKAL E
21. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SR T AKKQVEKAL E
22. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SRE E KKQVEKAL E
23. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SRE K KKQVEKAL E
24. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SRE Q KKQVEKAL E
25. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SRE N KKQVEKAL E
26. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SRE R KKQVEKAL E
27. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SRE D KKQVEKAL E
28. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREA L KQVEKAL E
29. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREA I KQVEKAL E
30. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREA M KQVEKAL E
31. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREA V KQVEKAL E
32. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREA Y KQVEKAL E
33. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREA A KQVEKAL E
34. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREA N KQVEKAL E
35. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREA R KQVEKAL E
36. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAK E QVEKAL E
37. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAK D QVEKAL E
38. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAK Q QVEKAL E
39. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAK A QVEKAL E
40. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAK N QVEKAL E
41. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAK R QVEKAL E
42. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAK T QVEKAL E
43. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKK E VEKAL E
44. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKK D VEKAL E
45. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKK K VEKAL E
46. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKK N VEKAL E
47. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKK R VEKAL E
48. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKK A VEKAL E
49. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKK S VEKAL E
50. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKK T VEKAL E
51. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKK H VEKAL E
52. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQ L EKAL E
53. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQ A EKAL E
54. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQ Y EKAL E
55. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQ M EKAL E
56. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQ E EKAL E
57. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQ I EKAL E
58. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQV Q KAL E
59. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQV K KAL E
60. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQV N KAL E
61. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQV R KAL E
62. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQV T KAL E
63. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQV D KAL E
64. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVE E AL E
65. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVE N AL E
66. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVE R AL E
67. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVE D AL E
68. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVE Q AL E
69. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVE A AL E
70. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVE S AL E
71. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVE T AL E
72. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVE M AL E
73. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEK E L E
74. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEK K L E
75. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEK Q L E
76. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEK N L E
77. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEK R L E
78. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEK D L E
79. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKA I E
80. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKA M E
81. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKA V E
82. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKA Y E
83. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKA K E
84. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKA A E
85. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKA N E
86. 바이오틴-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKA R E
87. 바이오틴-SGSGEGKVSTLPLDIQIIAATMSK
*상기 L1 라이브러리는 86개의 p145 변이체 각각에서 1개의 아미노산을 치환하여 디자인하였다. 치환된 아미노산은 밑줄로 표시하였다. 바이오틴 및 여분의 아미노산 SGSG는 N-말단에 포함되었다. 펩티드 87은 쉬스토소마 (Schistosoma) 유래의 비-특이적 펩티드 (pNS)이다.

Claims (26)

  1. 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 (group A streptococcal bacteria)에 대한 면역 반응을 유발하는 방법으로서, 상기 방법은 서열번호:3의 잔기 13 및 17의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질; 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편; 또는 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 단리된 핵산을 상기 포유동물에게 투여하여 이에 의해 면역 반응을 유발하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염에 대한 면역을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 서열번호:3의 잔기 13 및 17의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질; 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편; 또는 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 단리된 핵산을 상기 포유동물에게 투여하여 이에 의해 상기 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염에 대한 면역을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 서열번호:3의 잔기 13 및 17의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질; 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편; 또는 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 단리된 핵산을 상기 포유동물에게 투여하여 이에 의해 상기 포유동물에서 그룹 A 스트렙토코쿠스 박테리아 감염을 예방 또는 치료하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질, 또는 그의 단편 또는 변이체; 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편; 또는 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 단리된 핵산을 상기 포유동물에게 근육내로 투여하는 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 점막 면역 반응 (mucosal immune response)인 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 점막 면역 반응은 점막 IgG의 생성을 특징으로 하는 것인 방법.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 점막 면역 반응은 점막 IgA의 실질적인 부재 또는 적어도 감소된 IgA의 생성을 특징으로 하는 것인 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열은 잔기 13에서 아스파라긴 (N) 아미노산 및 잔기 17에서 아르기닌 (R) 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열이 서열번호:1에 제시된 것인 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 단편은 서열번호:2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 p145 펩티드, 변이체 또는 단편이 담체 단백질에 접합, 커플링 또는 연결된 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 담체 단백질은 디프테리아 (diphtheria) 독소, CRM 단백질 또는 그의 단편인 것인 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, SpyCEP 단백질의 면역원성 단편의 투여를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 SpyCEP의 단편은 S2 펩티드 (서열번호:23) 또는 그의 변이체이거나 또는 이를 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 변이체는 K4S2 펩티드 (서열번호:24)인 것인 방법.
  16. 서열번호:3의 잔기 13 및 17의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질, 그의 단편 또는 변이체, 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편 또는 상기 단리된 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 단리된 핵산; 및 SpyCEP 단백질의 면역원성 단편 또는 그의 변이체, 상기 SpyCEP 면역원성 단편 또는 그의 변이체에 결합하거나 또는 이에 대해 생성된 항체 또는 항체 단편 또는 상기 SpyCEP 면역원성 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열은 잔기 13에서 아스파라긴 (N) 아미노산 및 잔기 17에서 아르기닌 (R) 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 변형된 p145 펩티드 아미노산 서열이 서열번호:1에 제시된 것인 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 변형된 p145 펩티드의 단편은 서열번호:2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  20. 청구항 16 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 p145 펩티드, 변이체 또는 단편이 담체 단백질에 접합, 커플링 또는 연결된 것인 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 담체 단백질은 디프테리아 독소, CRM 단백질 또는 그의 단편인 것인 조성물.
  22. 청구항 16 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SpyCEP의 단편은 S2 펩티드 (서열번호:23) 또는 그의 변이체이거나 또는 이를 포함하는 것인 조성물.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 변이체는 K4S2 펩티드 (서열번호:24)인 것인 조성물.
  24. 청구항 16 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 아쥬반트 (adjuvant)를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
  25. 청구항 16 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 근육내 투여에 적합한 것인 조성물.
  26. 청구항 16 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 사용하기 위한 것인 조성물.
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