BR112020003734A2 - métodos para provocar uma resposta imune da mucosa às bactérias estreptocócicas do grupo a e para induzir imunidade na mucosa, método de tratamento ou prevenção de uma infecção e composição - Google Patents

Abstract

  Um peptídeo p145 modificado com imunogenicidade aumentada da mucosa para uso na indução de uma resposta imune da mucosa a bactérias estreptocócicas do grupo A em um mamífero como um humano. A administração intramuscular do peptídeo p145 modificado pode ser particularmente eficaz. Um peptídeo ou variante S2 pode ser co-administrado com o peptídeo p145 modificado para melhorar a resposta imune.

Description

“MÉTODOS PARA PROVOCAR UMA RESPOSTA IMUNE DA MUCOSA ÀS BACTÉRIAS ESTREPTOCÓCICAS DO GRUPO A E PARA INDUZIR IMUNIDADE NA MUCOSA, MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE UMA INFECÇÃO E COMPOSIÇÃO” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um peptídeo imunogênico para prevenção e tratamento de doenças e condições associadas ao estreptococo do estreptococo do grupo A.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Peptídeos sintéticos e recombinantes estão sendo desenvolvidos como vacinas para prevenir e proteger contra numerosas doenças infecciosas e não infecciosas. Sua utilidade reside em sua capacidade de imitar epítopos nativos em proteínas estranhas ou hospedeiras e de ativar ou modular especificamente respostas imunes protetoras ou prejudiciais. Progresso significativo foi feito para muitas doenças não infecciosas incluindo câncer, alergias, esclerose múltipla e doenças crônicas como hipertensão, diabetes e doença de Alzheimer (1). No entanto, sua maior promessa está nas vacinas para prevenir doenças infecciosas. Aqui, seu tamanho pequeno facilita muito o design de vacinas multicomponentes que incorporam epítopos de vários antígenos alvo (2), vacinas que podem prevenir infecções por organismos que existem em várias formas alélicas (3) e vacinas que podem atingir epítopos ocultos ou crípticos resultando na produção de respostas imunes que não são induzidas naturalmente pelo organismo, mas que são letais para o organismo uma vez induzido pela vacina (4).

[003] Os epítopos reconhecidos pelas células B e T são pequenos e podem, devido ao seu tamanho, ser sintetizados de maneira fácil e barata. No entanto, por serem pequenos, o repertório de células B ou T que eles estimulam é muito limitado e é principalmente por esse motivo que nenhuma vacina baseada em peptídeos foi desenvolvida e licenciada para uso humano.

[004] As vacinas contra Streptococcus pyogenes (os estreptococos do grupo A de Lancefield; GAS) têm sido há muito tempo procuradas devido às doenças debilitantes causadas pela bactéria, particularmente febre reumática e doença cardíaca reumática. A febre reumática é hoje uma doença rara na maioria dos países desenvolvidos mas continua a ser a principal causa de doença cardíaca adquirida em crianças, adolescentes e jovens adultos no mundo em desenvolvimento. Além disso, a doença invasiva GAS é uma causa frequente de sepse em crianças e adultos e tem uma alta taxa de mortalidade. Um aumento adicional da carga da doença GAS é a glomerulonefrite pós-estreptocócica, que provavelmente contribui para as altas taxas de insuficiência renal em estágio terminal em muitas regiões endêmicas do GAS. A faringite e o impetigo por GAS são responsáveis pelo maior número absoluto de infecções por GAS a cada ano. A faringite por GAS afeta aproximadamente 8% a 15% das crianças em idade escolar por ano e o impetigo por GAS é uma infecção muito comum em crianças com prevalência de 10 a 50%. Não são apenas as doenças graves associadas ao GAS é um problema nos países em desenvolvimento, mas mesmo nos países desenvolvidos surgiram cepas particularmente virulentas de GAS que são resistentes às terapias antibióticas padrão e causam doenças debilitantes, como a fasceíte necrosante grave.

[005] As vacinas à base de peptídeo contra o estreptococo do grupo A focaram-se em peptídeos derivados da proteína M, como os peptídeos p145, J8 e J14. Atualmente, o peptídeo J8 que compreende um epítopo com um mínimo de doze aminoácidos dentro de p145 incorporado em uma sequência de aminoácidos de peptídeo helicoidal derivado de levedura (GCN4) é um dos principais candidatos a vacina (12). A sequência de aminoácidos GCN4 auxilia na manutenção da forma helicoidal do peptídeo, a fim de otimizar a exibição do epítopo mínimo para o sistema imunológico. Esse candidato a vacina também requer três doses para induzir proteção contra doenças de pele (19).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[006] De forma surpreendente, os presentes inventores descobriram que a imunogenicidade de um peptídeo p145 pode ser substancialmente aumentada por modificação direcionada da sequência de aminoácidos de p145. A imunização com uma dose única do peptídeo P145modificado, ao invés de de múltiplas imunizações, pode proteger contra infecção por estreptococos do grupo A mesmo por cepas hipervirulentas tais como a cepa mutante COVR/S. Inesperadamente, o peptídeo, fragmento ou variante de p145 modificado provoca uma resposta imune da mucosa após administração ao mamífero. A resposta imune da mucosa é caracterizada pela produção de IgG, enquanto a produção de IgA está substancialmente ausente ou em um nível relativamente reduzido em comparação com o nível de IgG produzido.

[007] A invenção é amplamente direcionada a um peptídeo p145 compreendendo uma ou mais modificações na sequência de aminoácidos que melhoram substancialmente ou aumentam a imunogenicidade, particularmente para provocar respostas imunes da mucosa. Em uma forma preferida, o peptídeo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.

[008] Um aspecto da invenção fornece um método para obter uma resposta imune às bactérias estreptocócicas do grupo A em um mamífero, o referido método inclui a etapa de administrar: uma proteína isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos de peptídeo p145 modificada compreendendo uma substituição de aminoácidos dos resíduos 13 e 17 de SEQ ID NO: 3; um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ou um ácido nucleico isolado que codifica a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ao mamífero para assim provocar a resposta imune.

[009] Outro aspecto da invenção fornece um método para induzir imunidade contra uma infecção bacteriana estreptocócica do grupo A em um mamífero, o referido método incluindo a etapa de administrar: uma proteína isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos de peptídeo p145 modificada compreendendo uma substituição de aminoácidos dos resíduos 13 e 17 de SEQ ID NO: 3; um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ou um ácido nucleico isolado que codifica a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ao mamífero para assim induzir imunidade contra a infecção bacteriana estreptocócica do grupo A no mamífero.

[0010] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana estreptocócica do grupo A em um mamífero, o referido método incluindo a etapa de administrar: uma proteína isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos de peptídeo p145 modificada compreendendo uma substituição de aminoácidos dos resíduos 13 e 17 de SEQ ID NO: 3; um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ou um ácido nucleico isolado que codifica a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ao mamífero para assim prevenir ou tratar a infecção bacteriana estreptocócica do grupo A no mamífero.

[0011] O peptídeo, fragmento ou variante p145 modificado compreende adequadamente um aminoácido asparagina (N) no resíduo 13 e um aminoácido arginina (R) no resíduo 17.

[0012] Em uma forma de realização, o peptídeo, fragmento ou variante p145 modificado compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.

[0013] Em uma forma de realização, o fragmento de peptídeo p145 modificado compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

[0014] De preferência, o peptídeo, fragmento ou variante p145 modificado provoca uma resposta imune da mucosa após administração ao mamífero.

[0015] Adequadamente, a resposta imune da mucosa é caracterizada pela produção de IgG. Tipicamente, a produção de IgA está substancialmente ausente ou a um nível relativamente reduzido em comparação com o nível de IgG produzido.

[0016] De preferência, o peptídeo, fragmento ou variante p145 modificado provoca uma resposta imune da mucosa após administração intramuscular ao mamífero.

[0017] De preferência, o mamífero dos aspectos acima mencionados é um humano.

[0018] Em uma forma de realização particular dos aspectos mencionados acima, o peptídeo, fragmento ou variante p145 modificado pode ser administrado em combinação com um fragmento imunogênico de uma proteína SpyCEP. De preferência, o fragmento de SpyCEP é ou compreende um peptídeo S2 (SEQ ID NO: 23) ou uma variante como um peptídeo K4S2 (SEQ ID NO: 24).

[0019] Um aspecto relacionado da invenção, portanto, fornece uma composição compreendendo: uma proteína isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos do peptídeo p145 modificada compreendendo uma substituição de aminoácidos dos resíduos 13 e 17 de SEQ ID NO: 3, um fragmento ou variante do mesmo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma ou um ácido nucleico isolado que codifica a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; e um fragmento imunogênico de uma proteína

SpyCEP ou variante da mesma, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra o fragmento imunogênico SpyCEP ou variante da mesma ou um ácido nucleico isolado que codifica o fragmento imunogênico SpyCEP ou variante da mesma.

[0020] Adequadamente, a sequência de aminoácidos do peptídeo p145 modificada compreende um aminoácido asparagina (N) no resíduo 13 e um aminoácido arginina (R) no resíduo 17, compreendendo preferencialmente a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. De preferência, o fragmento do peptídeo p145 modificado compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

[0021] Em uma forma de realização preferida, o fragmento de SpyCEP é, ou compreende um peptídeo S2 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 23, ou uma variante do mesmo. A variante pode ser um peptídeo K4S2 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 24.

[0022] Conforme usado aqui, os artigos indefinidos ‘um’ e ‘uma’ são usados aqui para se referir ou abranger elementos ou características singulares ou plurais e não devem ser tomados como significado ou definição de um ou elemento ou característica “um” ou “único”.

[0023] A menos que o contexto exija de outra forma, os termos “compreendem”, “compreende” e “compreendendo” ou termos semelhantes devem significar uma inclusão não exclusiva, de modo que uma lista recitada de elementos ou características não inclua os elementos declarados ou listados apenas, mas pode incluir outros elementos ou características que não estão listados ou declarados.

[0024] Por “consistindo essencialmente em” no contexto de uma sequência de aminoácidos, entende-se a sequência de aminoácidos recitada juntamente com um, dois ou três aminoácidos adicionais no terminal N ou C.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] Figura 1: Desenho de bibliotecas de peptídeos: (A) Reconhecimento de vários peptídeos variantes P145 por anti-soros P145: (A) uma biblioteca de peptídeo que consiste em 86 variantes de P145 foi rastreada com anti-soros P145. O anti-soro p145 foi produzido em camundongos B10.D2 e a capacidade do anti-soro p145 de se ligar a cada peptídeo foi determinada usando ELISA. A sequência mínima do epítopo de dentro do p145 está no topo do gráfico, com o número de sequências peptídicas sofrendo mutação em cada aminoácido e está representado nos parênteses abaixo. As linhas verticais separam os peptídeos com base na mutação na mesma posição.

O peptídeo 87 é um peptídeo de controle não específico (pNS). (B) Identificação de peptídeos imunodominantes na biblioteca de variantes p145: ELISAs de inibição de peptídeos foram realizados para identificar os peptídeos imunodominantes dentro do conjunto de variantes p145. Os peptídeos selecionados a uma concentração de 0,25 µg/ml foram incubados com anti-soros p145. O soro foi então usado em um ELISA contra o p145 imobilizado. O soro específico do antígeno (p145) foi coletado de camundongos B10.D2 hiperimunizados. Os dados para cada barra são Médias ± SEM. (C) Desenho da biblioteca de peptídeos 2 (L2) com duas alterações: Os 7 peptídeos selecionados foram utilizados para projetar uma nova biblioteca de peptídeos com duas substituições de aminoácidos nas posições identificadas para aumentar a imunogenicidade do p145 parental. São mostrados os peptídeos resultantes que demonstram mutações em várias posições dentro do epítopo mínimo de p145.

[0026] Figura 2: Respostas imunes a peptídeos duplamente mutados: (A) Imunogenicidade de peptídeos selecionados em camundongos Quackenbush que mostram títulos de ELISA para o peptídeo imunizante: coortes de camundongos foram imunizadas subcutaneamente com antígeno de peptídeo formulado com adjuvante nos dias 0, 21 e 28. Os camundongos em coortes com títulos específicos de antígeno inferiores a 1000 foi dado um reforço adicional no dia 35 (indicado como “). os camundongos foram sangrados nos dias 20, 27, 34 e 41. Os camundongos controle receberam o P145 original ou PBS. Os títulos de IgG do soro específico para antígeno foram determinados usando ELISA e a Média ± SEM para os peptídeos 1-5 (1 i), 6-12 (ii) e 13-18 (iii) são mostrados. (B): Ligação da IgG anti-peptídeo ao p145 imobilizado: a capacidade de afinidade da IgG do soro específico ao peptídeo purificado para se ligar a concentrações crescentes de peptídeo P145 foi determinada por ELISA. O peptídeo P145, imobilizado em placas de ELISA, foi de incubado com diferentes IgG do soro específico ao peptídeo purificado a partir de camundongos Quackenbush. A ligação do anticorpo em uma concentração de 5 µg/ml são mostradas para (i) peptídeos 1-5 e (ii) peptídeos 6-10 (iii) peptídeos 11-13 e (iv) peptídeos 15-18. Absorbância média (450nm) ± SEM é mostrada. O ANOVA com os testes de comparação múltipla de Holm-Sidak foi usado para calcular a significância em comparação com p145.

[0027] Figura 3: Eficiência de ligação de anticorpos específicos do peptídeo à superfície do GAS: Para determinar a capacidade da IgG do soro específico ao peptídeo de se ligar a bactéria inteira, a análise por citometria de fluxo foi realizada usando duas cepas de GAS (A) 2031 (emm1) e (B) 88/30 (emm97). Após a incubação com anticorpos antipeptídeos, foi utilizada IgG anti-camundongo conjugada com FITC para determinar a ligação de anticorpos ao GAS. Os resultados são mostrados como Média ± SEM da intensidade média de fluorescência (MFI) para 3 repetições em cada grupo. A linha horizontal na figura indica a ligação relativa de várias IgG específicas do peptídeo a p145 em comparação com IgG de p145. O ANOVA com o método post hoc de Tukey foi usado para determinar a significância em comparação com p145. (C) São mostrados histogramas representativos que demonstram a ligação de IgG específica para p*17 ao GAS 2031, 88/30 e JRS145 (uma cepa de GAS M-negativa).

[0028] Figura 4: Imunogenicidade e eficácia protetora de p145- DT e sua variante p*17-DT na proteção contra infecção superficial da pele com várias cepas de GAS: coortes de camundongos BALB/c (n = 10 camundongos cada) foram imunizadas subcutaneamente com 30 μg de formulações de p145-DT ou p*17-DT ou PBS-Alume no dia 0. As amostras de soro foram coletadas no 1 dia 20 após a imunização para avaliar a resposta de IgG específica de p145. Dados de alguns camundongos representativos (n = 5) são mostrados (A). No dia 21, os camundongos foram desafiados pela via cutânea de infecção com GAS 2031 (B e C) ou GAS 88/30 (D e E). Nos dias 3 e 6 após a infecção, 5 camundongos/ grupo foram sacrificados e as amostras foram coletadas para determinar a carga bacteriana de GAS na pele (B e D) e no sangue (C e E). Os resultados são mostrados como média ± SEM para 5 camundongos em cada grupo em cada momento. O ANOVA com o método post hoc de Tukey foi usado para determinar a significância entre todas as coortes tratadas e controle em cada momento. *p < 0,05, ***p < 0,001.

[0029] Figura 5: Estruturas dos peptídeos p145 e p*17: Sobreposição de estruturas representativas de p145 (magenta) e p*17 (verde) obtidas a partir de simulações de 50 ns MD com alinhamento baseado em CA dos resíduos 3 a 13 (aminoácidos C-terminais mostrados em vermelho, aminoácidos N-terminais em azul (A). Lys-13 13 quebras no caráter helicoidal em p145. A probabilidade dos peptídeos adotarem uma conformação helicoidal é mostrada em (B) revelando que p145 é significativamente menos provável que forme uma conformação helicoidal em comparação com p*17. As flutuações da raiz quadrada média (RMSF) de p145 e p*17 em comparação são mostradas em (C). p145 mostra flutuações significativamente maiores em comparação com p*17. A maior diferença na flexibilidade pode ser vista para Lys-13 em p145 em comparação com Asn-13 em p*17.

[0030] Figura 6: Identificação de peptídeos imunodominantes na biblioteca de variantes p145: ELISAs de inibição de peptídeos foram realizados para identificar os peptídeos imunodominantes dentro do conjunto de variantes p145. Os peptídeos selecionados a uma concentração de 2,5 µg/ml foram incubados com anti-soros p145. O soro foi então usado em um ELISA contra o p145 imobilizado. O soro específico do antígeno (p145) foi coletado de camundongos B10.D2 hiperimunizados. Os dados para cada barra são médias ± SEM.

[0031] Figura 7: Reatividade cruzada dos anti-soros de peptídeo com proteínas humanas: o ELISA foi usado para detectar a reatividade cruzada dos anti-soros do peptídeo duplamente mutado (L2) às proteínas derivadas de humanos (a) tropomiosina, (b) miosina e (c) queratina.

Absorbância média (450nm) ± SEM mostrado.

[0032] Figura 8: Eficácia protetora de p145-DT em camundongos BALB/c após 1, 2 ou 3 imunizações: Coortes de camundongos BALB/c (10 camundongos/ grupo) receberam 1, 2 ou 3 injeções subcutâneas de p145-DT ou PBS com adjuvante nos dias 0, 21 e 28. A eficácia da vacina após desafio cutâneo com 88/30 de GAS foi avaliada. A carga bacteriana na pele (A) e no sangue (B) nos dias 3 e 6 pós-infecção, respectivamente, para coortes de camundongos é mostrada. Eficácia protetora de p*17-DT após imunização única: (C) coortes de camundongos BALB/c (10 camundongos/ grupo) receberam uma única imunização com p*17-DT, GAS morto pelo calor (2031) ou PBS com adjuvante nos dias 0. Os títulos de IgG específicas para o antígeno foram determinados no dia 20 após a imunização. Os títulos para camundongos imunizados com GAS 1 mortos pelo calor foram testados contra a proteína M1 recombinante imobilizada na placa ELISA. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para determinar a significância entre os dois grupos vacinados em que **p <

0,01. (D) No dia 21 após a imunização, os camundongos foram desafiados com o Cov48/S mutante 5448AP de GAS através da via cutânea da infecção. As amostras de pele foram avaliadas quanto à carga bacteriana nos dias 3 e 6 após a infecção. É mostrada uma redução percentual nas contagens bacterianas na coorte imunizada com p*17-DT ou com GAS mortos por calor em comparação com a coorte controle com PBS. O ANOVA com o método post hoc de Tukey foi usado para determinar a significância entre todas as coortes vacinadas e controle em cada momento. **p < 0,01, ***p < 0,001.

[0033] Figura 9: Programa de imunização intramuscular. Os camundongos foram imunizados três (3) vezes com p*17-DT + K4S2-DT/Alume e desafio intranasal com 5448AP (cepa CovR/S MT).

[0034] Figura 10: Imunogenicidade após imunização i.m. com vacinas à base de p*17. Camundongos BALB/c (n = 15/ grupo; fêmeas, 4 a 6 semanas de idade) foram imunizados i.m. com p*17-DT/Alume, p*17-DT + K4S2- DT/Alume e PBS/Alume nos dias 0, 21 e 42. Uma semana após o último reforço, amostras de soro e saliva foram coletadas e respostas de anticorpos IgG (A & C) e IgA (B & D) específicas para p*17 foram medidas por ELISA e estão representadas como média ± SEM. Os títulos são comparados à coorte controle que recebeu apenas PBS/Alume.

[0035] Figura 11: Proteção após infecção intranasal. Duas semanas após o último reforço da vacina, os camundongos foram infectados por via intranasal com GAS mutante covR/S (5448AP). Nos dias 1-3, o derramamento nasal (SN) foi coletado. A carga bacteriana em NS foi determinada pressionando as narinas de cada camundongo em placas de ágar de sangue de columbia (CBA) contendo 5% de sangue de cavalo desfibrinado e partículas exaladas. Nos dias 1-3, a NS foi coletada e representada como a média transformada logarítmica ± SEM de cada dia individual (A) e como CFUs cumulativas dos três dias combinados (B). o indica camundongos selecionados no dia 2 após 15% ou mais de perda de peso.

[0036] Figura 12: Redução percentual na carga bacteriana do derramamento nasal. A redução percentual foi calculada em comparação com a média total do controle PBS/Alume de cada dia individual (A) e como redução cumulativa de todos os três dias combinados (B). o indica camundongos selecionados no dia 2 após 15% ou mais de perda de peso.

[0037] Figura 13: Proteção após infecção intranasal. Em adição a NS nos dias 1-3, esfregaços de garganta (TS) foram recolhidas. Para esfregaços de garganta, aplicadores de esfregaço foram colocados em PBS estéril para umedecer, os camundongos foram então imobilizados e as gargantas foram esfregadas. O aplicador de esfregaço foi então suspenso em PBS, diluído em série e semeado em pontos (dot-plated) em duplicata em placas CBA contendo sangue de cavalo desfibrinado a 5%. Nos dias 1-3, a NS foi coletada e representada como a média transformada logarítmica ufc/ml ± SEM de cada dia individual (A) e como CFUs cumulativas dos três dias combinados (B). o indica camundongos selecionados no dia 2 após 15% ou mais de perda de peso.

[0038] Figura 14: Redução percentual da carga bacteriana nos esfregaços de garganta. A redução percentual foi calculada em comparação com a média total do controle PBS/Alume de cada dia individual (A) e como redução cumulativa dos três dias combinados (B). o indica camundongos selecionados no dia 2 após 15% ou mais de perda de peso.

[0039] Figura 15: Proteção após infecção intranasal. No dia 3 pós-infecção, todos os camundongos sobreviventes foram sacrificados e amostras de NALT, pulmão, baço e sangue foram coletadas para determinar a carga bacteriana do GAS, dados representados como média transformada logarítmica ufc/ml ± SEM (A) e a porcentagem de redução em comparação com controle de PBS/Alume (B). o indica camundongos selecionados no dia 2 após

15% ou mais de perda de peso.

[0040] Figura 16: Comparações estruturais do peptídeo J8, p145 e p*17. Simulações de MD comparando a estrutura do peptídeo p*17 e J8 em termos de (A) porcentagem de forma helicoidal e (B) flutuação de RMS.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 LRRDLDASREAKNQVERALE SEQ ID NO: 2 SREAKNQVERAL SEQ ID NO: 3 LRRDLDASREAKKQVEKALE SEQ ID NO: 4 SREAKKQVEKAL SEQ ID NO: 5 LRRDLDAENEAKKQVEKALE SEQ ID NO: 6 LRRDLDAEDEAKKQVEKALE SEQ ID NO: 7 LRRDLDAEREAKNQVEKALE SEQ ID NO: 8 LRRDLDAEREAKKQVERALE SEQ ID NO: 9 LRRDLDAEREAKKQVEMALE SEQ ID NO: 10 LRRDLDAVNEAKKQVEKALE SEQ ID NO: 11 LRRDLDAVDEAKKQVEKALE SEQ ID NO: 12 LRRDLDAVREAKNQVEKALE SEQ ID NO: 13 LRRDLDAVREAKKQVERALE SEQ ID NO: 14 LRRDLDAVREAKKQVEMALE SEQ ID NO: 15 LRRDLDASNEAKNQVEKALE SEQ ID NO: 16 LRRDLDASNEAKKQVERALE SEQ ID NO: 17 LRRDLDASNEAKKQVEMALE SEQ ID NO: 18 LRRDLDASDEAKNQVEKALE SEQ ID NO: 19 LRRDLDASDEAKKQVERALE SEQ ID NO: 20 LRRDLDASDEAKKQVEMALE SEQ ID NO: 21 LRRDLDASREAKNQVEMALE SEQ ID NO: 22 LRRDLDA SEQ ID NO: 23 NSDNIKENQFEDFDEDWENF

SEQ ID NO: 24 KKKKNSDNIKENQFEDFDEDWENF

[0041] SEQ ID NOS: 25 - 111 Tabela 3 - biblioteca de peptídeos em ordem numérica decrescente do peptídeo 1 ao peptídeo 87, respectivamente.

[0042] SEQ ID NO: 112: SGSGLRRDLDASREAKKQVEKALE.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0043] A presente invenção é, pelo menos, em parte baseada na descoberta de que determinado amino ácido do peptídeo P145 pode ser modificado para melhorar substancialmente a imunogenicidade contra estreptococos do grupo A. Uma única imunização com o peptídeo p145 modificado, em vez de múltiplas imunizações, pode proteger contra a infecção por estreptococos do grupo A, mesmo por cepas hipervirulentas, como a cepa mutante CovR/S. Mais especificamente, o peptídeo p145 modificado pode induzir imunidade da mucosa, caracterizada pela produção de IgG em vez de IgA. A imunidade da mucosa pode ser provocada após administração intramuscular do peptídeo.

[0044] Um aspecto amplo da invenção é direcionado ao uso de um peptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, aqui referida como um “peptídeo p*17” para induzir ou provocar imunidade à infecção bacteriana estreptocócica do grupo A. De preferência, o peptídeo isolado induz imunidade da mucosa à infecção bacteriana estreptocócica do grupo A.

[0045] Em algumas formas de realização, o peptídeo p*17 pode ser administrado em combinação com um fragmento de uma proteína SpyCEP. O fragmento SpyCEP pode ser um peptídeo “S2”, tais como compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, ou uma variante compreendendo uma sequência de aminoácidos tal como exposta em SEQ ID NO: 24, como será descrito em mais detalhes a seguir.

[0046] Como aqui utilizado, o termos “estreptococos do grupo A”, “Streptococci do Grupo A”, “Streptocócico do Grupo A”, “Strep do Grupo A” e a abreviatura “GAS” referem-se a bactérias estreptocócicas do serogrupo A de Lancefield que são bactérias gram positivas -hemolíticas da espécie Streptococcus pyogenes. Um importante fator de virulência do GAS é a proteína M, que é fortemente antifagocítica e se liga ao fator sérico H, destruindo a C3- convertase e impedindo a opsonização por C3b. Isso também inclui “mutantes” virulentos, tais como CovR/S ou mutantes CovRS, como descrito em Graham et al., 2002, PNAS USA 99 13855, embora sem limitação aos mesmos.

[0047] Doenças e condições causadas por estreptococos do grupo A incluem celulite, erisipela, impetigo, escarlatina, infecções da garganta, tais como faringite aguda (“garganta inflamada”), bacteremia, síndrome do choque tóxico, fascite necrosante, febre reumática aguda e glomerulonefrite aguda, embora sem limitação a isso.

[0048] Para os fins desta invenção, por “isolado” entende-se material que foi removido de seu estado natural ou que foi submetido à manipulação humana. O material isolado pode estar substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham em seu estado natural, ou pode ser manipulado de modo a estar em um estado artificial juntamente com componentes que normalmente o acompanham em seu estado natural. O material isolado pode estar na forma nativa, química sintética ou recombinante.

[0049] Por “proteína” entende-se um polímero de aminoácido. Os aminoácidos podem ser aminoácidos naturais ou não naturais, aminoácidos D ou L, como são bem entendidos na técnica.

[0050] O termo “proteína” inclui e abrange “peptídeo”, que é normalmente usado para descrever uma proteína com não mais que cinquenta (50) aminoácidos e “polipeptídeo”, que é normalmente usado para descrever uma proteína com mais de cinquenta (50) aminoácidos.

[0051] Os inventores mostraram que a modificação de uma sequência de aminoácidos do peptídeo p145 do tipo selvagem ou “não modificado” melhora substancialmente ou aprimora a imunogenicidade do peptídeo. Tipicamente, a modificação inclui a substituição de um ou mais aminoácidos de um peptídeo p145.

[0052] Isto evita a necessidade de adicionar uma sequência de aminoácidos GCN4 heteróloga ao peptídeo p145 para manter uma estrutura alfa- helicoidal desejada do peptídeo. Embora não deseje estar vinculado pela teoria, a simulação dinâmica molecular mostra que um peptídeo p145 modificado aqui divulgado não possui uma “torção” em sua estrutura, em oposição ao p145 do tipo selvagem ou não modificado, que pode ser pelo menos parcialmente responsável por sua imunogenicidade melhorada.

[0053] Adequadamente, um peptídeo p145 “do tipo selvagem” ou não modificado compreende a sequência de aminoácidos LRRDLDASREAKKQVEKALE (SEQ ID NO: 3). Uma sequência de epítopo mínimo de P145 é SREAKKQVEKAL (SEQ ID NO: 4).

[0054] De preferência, um peptídeo p145 modificado compreende um resíduo N correspondente ao resíduo 13 de SEQ ID NO: 3 e um aminoácido R no resíduo 17 de SEQ ID NO: 3.

[0055] De preferência, um epítopo mínimo de p145 modificado compreende um resíduo N correspondente ao resíduo 6 de SEQ ID NO: 1 e um aminoácido R no resíduo 10 de SEQ ID NO: 1.

[0056] Em uma forma de realização, um peptídeo p*17 compreende a sequência de aminoácidos LRRDLDASREAKNQVERALE (SEQ ID NO: 1).

[0057] Em uma forma de realização, um epítopo mínimo modificado de p*17 compreende a sequência de aminoácidos SREAKNQVERAL

(SEQ ID NO: 2).

[0058] A invenção também fornece um fragmento de um peptídeo p145 modificado aqui divulgado.

[0059] Um “fragmento” é um segmento, domínio, porção ou região de uma proteína ou peptídeo (como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SpyCEP, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24) que constitui menos de 100% da sequência de aminoácidos da proteína. Será apreciado que o fragmento pode ser um fragmento único ou pode ser repetido sozinho ou com outros fragmentos.

[0060] Em geral, os fragmentos podem compreender, consistir essencialmente em ou consistir em até 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 aminoácidos contíguos (tais a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SpyCEP, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24). Em uma forma de realização, o fragmento compreende um resíduo N correspondente ao resíduo 13 de SEQ ID NO: 1 e um aminoácido R no resíduo 17 de SEQ ID NO: 1. Um exemplo não limitativo de um fragmento compreende a sequência de aminoácidos SREAKNQVERAL (SEQ ID NO: 2).

[0061] Adequadamente, o fragmento é um fragmento imunogênico.

No contexto da presente invenção, o termo “imunogênico”, conforme usado aqui, indica a capacidade ou potencial de gerar ou provocar uma resposta imune, como estreptococos do grupo A ou seus componentes moleculares, como a proteína M ou um epítopo da proteína M correspondente a p145, após administração do fragmento imunogênico a um mamífero. De preferência, a resposta imune provocada pelo fragmento imunogênico é uma resposta imune da mucosa.

[0062] Por “provocar uma resposta imune” significa gerar ou estimular a produção ou atividade de um ou mais elementos do sistema imunológico, incluindo o sistema imunológico celular, anticorpos e/ ou sistema imunológico nativo. Adequadamente, os um ou mais elementos do sistema imunológico incluem linfócitos B, anticorpos e neutrófilos. De preferência, a resposta imune é uma resposta imune da mucosa. Tipicamente, as respostas imunes da mucosa são caracterizadas pela produção de IgA, com produção mínima de outros isotipos de anticorpos, como IgG. Surpreendentemente, a resposta imune da mucosa provocada pelo peptídeo p*17 aqui divulgado é caracterizada pela produção de IgG. A produção de IgA é relativamente reduzida em comparação com a produção de IgG ou está substancialmente ausente.

[0063] Como usado aqui, uma proteína “variante” compartilha uma relação de sequência de nucleotídeo ou aminoácido definível com uma sequência de aminoácidos de referência. A sequência de aminoácidos de referência pode ser a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 23, por exemplo. A “variante” de proteínas podem ter uma ou uma pluralidade de aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência deletados ou substituídos por aminoácidos diferentes. É bem entendido na técnica que alguns aminoácidos podem ser substituídos ou deletados sem alterar a atividade do fragmento imunogênico e/ ou proteína (substituições conservativas). De preferência, as variantes de proteína compartilham pelo menos 70% ou 75%, preferencialmente pelo menos 80% ou 85% ou mais preferencialmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de referência.

[0064] Em formas de realização particulares, a variante pode compreender: um resíduo N correspondente ao resíduo 13 de SEQ ID NO: 1 e um aminoácido R correspondente ao resíduo 17 de SEQ ID NO: 1; ou um resíduo N correspondente ao resíduo 6 da SEQ ID NO: 2 e um aminoácido R correspondente ao resíduo 10 de SEQ ID NO: 2. Por conseguinte, um ou mais dos outros resíduos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 podem ser modificados de forma conservativa (por exemplo, por substituição ou deleção de aminoácidos), de modo que a variante retenha substancialmente a imunogenicidade de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. A este respeito, é feita referência à Tabela 2 e aos Exemplos que descrevem modificações de aminoácidos diferentes dos resíduos 13 e 17 de SEQ ID NO: 1 e seus efeitos sobre a imunogenicidade.

[0065] Em uma forma de realização particular, uma proteína ou peptídeo variante pode compreender um ou uma pluralidade de resíduos de lisina em um N- e/ ou C- terminal do mesmo. A pluralidade de resíduos de lisina (por exemplo, polilisina) pode ser uma sequência linear de resíduos de lisina ou pode ser uma sequência de cadeia ramificada de resíduos de lisina. Esses resíduos de lisina adicionais podem facilitar o aumento da solubilidade do peptídeo. Um exemplo não limitativo dessa variante é designado “K4S2” (SEQ ID NO: 24).

[0066] Os termos usados geralmente neste documento para descrever as relações de sequência entre as respectivas proteínas e ácidos nucleicos incluem “janela de comparação”, “identidade de sequência”, “porcentagem de identidade de sequência” e “identidade substancial”. Como os respectivos ácidos nucleicos/ proteínas podem cada um compreender (1) apenas uma ou mais porções de uma sequência completa de ácidos nucleicos/ proteínas que são compartilhadas pelos ácidos nucleicos/ proteínas e (2) uma ou mais porções que são divergentes entre os ácidos nucleicos/ proteínas, as comparações de sequência são normalmente realizadas comparando sequências em uma “janela de comparação” para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma “janela de comparação” refere-se a um segmento conceitual de tipicamente 6, 9 ou 12 resíduos contíguos que é comparado a uma sequência de referência. A janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, lacunas) de cerca de 20% ou menos, em comparação com a sequência de referência para o alinhamento ideal das respectivas sequências. O alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido por implementações computadorizadas de algoritmos (programa Geneworks da Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Release

7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EUA, aqui incorporados por referência) ou por inspeção e o melhor alinhamento (isto é, resultando na maior porcentagem de homologia sobre a janela de comparação) gerada por qualquer um dos vários métodos selecionados. Também pode ser feita referência à família dos programas BLAST, como por exemplo divulgado por Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389, que é aqui incorporado por referência. Uma discussão detalhada da análise de sequência pode ser encontrada na Unit 19.3 de CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999).

[0067] O termo “identidade de sequência” é usado aqui em seu sentido mais amplo para incluir o número exato de correspondências nucleotídicas ou de aminoácidos, tendo em vista um alinhamento apropriado usando um algoritmo padrão, levando em conta que as sequências são idênticas em uma janela de comparação. Assim, uma “porcentagem de identidade de sequência” é calculada comparando duas sequências idealmente alinhadas na janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, I) ocorre em ambas as sequências para gerar o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para gerar a porcentagem de identidade de sequência. Por exemplo, “identidade de sequência” pode ser entendida como a “porcentagem de correspondência” calculada pelo programa de computador DNASIS (Versão 2.5 para Windows; disponível na Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San

Francisco, Califórnia, EUA).

[0068] A invenção também fornece um derivado de um peptídeo p145 modificado aqui divulgado. Adequadamente, o peptídeo p145 modificado compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[0069] Como aqui utilizado, “derivados” são moléculas como proteínas, fragmentos ou variantes dos mesmos que foram alteradas, por exemplo, por conjugação ou complexação com outras porções químicas, por modificação pós-tradução (por exemplo, fosforilação, acetilação e similares), modificação de glicosilação (por exemplo, adição, remoção ou alteração da glicosilação), lipidação e/ ou inclusão de sequências de aminoácidos adicionais, como seria entendido na técnica. Em uma forma de realização particular, uma sequência de aminoácidos adicional pode compreender um ou uma pluralidade de resíduos de lisina no seu N- e/ ou C- terminal. A pluralidade de resíduos de lisina (por exemplo, polilisina) pode ser uma sequência linear de resíduos de lisina ou pode ser uma sequência de cadeia ramificada de resíduos de lisina.

Esses resíduos de lisina adicionais podem facilitar o aumento da solubilidade do peptídeo. Outro derivado particular é por conjugação do peptídeo à toxina da difteria (DT). Isto pode ser facilitado pela adição de um resíduo de cisteína C- terminal.

[0070] Sequências de aminoácidos adicionais podem incluir sequências de aminoácidos parceiras de fusão que criam uma proteína de fusão.

A título de exemplo, as sequências de aminoácidos do parceiro de fusão podem auxiliar na detecção e/ ou purificação da proteína de fusão isolada. Exemplos não limitativos incluem parceiros de fusão de ligação a metais (por exemplo, polihistidina), proteína de ligação à maltose (MBP), proteína A, glutationa S- transferase (GST), sequências de proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP), marcadores de epítopos como myc, FLAG e marcadores de hemaglutinina.

[0071] Outras sequências de aminoácidos adicionais podem ser de proteínas transportadoras, como o toxóide da difteria (DT) ou um fragmento do mesmo, ou um fragmento de proteína CRM, como descrito na Publicação Internacional WO 2017/070735.

[0072] Outros derivados contemplados pela invenção incluem, mas não estão limitados a, modificação de cadeias laterais, incorporação de aminoácidos não naturais e/ ou seus derivados durante, síntese de peptídeo ou proteínas e o uso de reticuladores e outros métodos que impõem restrições conformacionais às proteínas imunogênicas, fragmentos e variantes da invenção.

[0073] A esse respeito, o técnico no assunto é referido ao Capítulo 15 dos CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Eds. Coligan et al.

(John Wiley & Sons NY 1995-2008) para uma metodologia mais extensa relacionada à modificação química de proteínas.

[0074] As proteínas imunogênicas isoladas, fragmentos e/ ou derivados da presente invenção podem ser produzidos por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo mas não limitado a síntese química, tecnologia de DNA recombinante e clivagem proteolítica para produzir fragmentos peptídicos.

[0075] A síntese química é inclusiva de fase sólida e a síntese em fase de solução. Tais métodos são bem conhecidos na técnica, embora seja feita referência a exemplos de técnicas de síntese química, conforme fornecido no Capítulo 9 de SYNTHETIC VACCINES ed. Nicholson (Blackwell Scientific Publications) e Capítulo 15 dos CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY EUA 1995-2008). A este respeito, é também feita referência à Publicação Internacional WO 99/02550 e Publicação Internacional WO 97/45444.

[0076] As proteínas recombinantes podem ser convenientemente preparados por um técnico no assunto utilizando protocolos convencionais como, por exemplo, descritos em Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), em particular as seções 16 e 17; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY EUA 1995-2008), em particular os capítulos 10 e 16; CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY EUA 1995-2008), em particular os Capítulos 1, 5 e 6.

Tipicamente, a preparação de proteínas recombinantes inclui a expressão de um ácido nucleico que codifica a proteína em uma célula hospedeira adequada.

[0077] Um aspecto adicional da invenção fornece um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga, ou é produzido contra, um peptídeo imunogênico isolado compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, ou um fragmento, variante ou derivado da mesma.

[0078] Adequadamente, o anticorpo ou fragmento de anticorpo liga-se especificamente a um peptídeo imunogênico isolado compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou a um fragmento compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em algumas formas de realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo liga-se a um peptídeo p145 ou sequência de epítopo mínima, como a apresentada na SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, com uma afinidade substancialmente mais alta do que um anticorpo criado contra o peptídeo p145. Nesse contexto, por “afinidade substancialmente mais alta” significa uma afinidade pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior em uma concentração específica do peptídeo p 145.

[0079] Anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, nativos ou recombinantes. Os fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fc, Fab ou F(ab)2 e/ ou podem compreender anticorpos Fv de cadeia única (scFvs). Tais scFvs podem ser preparados, por exemplo, de acordo com os métodos descritos respectivamente na Patente dos

Estados Unidos No. 5,091,513, Patente Europeia No. 239.400 ou no artigo de Winter & Milstein, 1991, Nature 349: 293. Os anticorpos podem também incluir fragmentos de anticorpos recombinantes multivalentes, tais como diacorpos, triacorpos e/ ou tetracorpos, compreendendo uma pluralidade de scFvs, bem como demicorpos ativados por dimerização (por exemplo, WO 2007/062466). A título de exemplo, esses anticorpos podem ser preparados de acordo com os métodos descritos em Holliger et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 6444; ou em Kipriyanov, 2009 Methods Mol Biol 562 177. Protocolos bem conhecidos aplicáveis à produção, purificação e uso de anticorpos podem ser encontrados, por exemplo, no Capítulo 2 de Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994) e Harlow, E. & Lane, D.

Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

[0080] Os métodos de produção de anticorpos policlonais são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Protocolos exemplificativos que podem ser utilizados são descritos, por exemplo, em Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra, e em Harlow & Lane, 1988, supra. Em uma forma de realização particular, os anticorpos policlonais anti-SpyCEP podem ser obtidos ou purificados a partir de soros humanos de indivíduos expostos ou infectados por estreptococos do grupo A. Alternativamente, os anticorpos policlonais podem ser criados contra SpyCEP purificado ou recombinante, ou um fragmento imunogênico do mesmo, em espécies de produção, como cavalos, e depois purificados subsequentemente antes da administração.

[0081] Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando o método padrão como, por exemplo, originalmente descrito em um artigo de Köhler & Milstein, 1975, Nature 256, 495, ou por modificações mais recentes dos mesmos, como por exemplo, descrito em Coligan et al. CURRENT

PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra, imortalizando células do baço ou outras células produtoras de anticorpos derivadas de uma espécie de produção que foi inoculada com uma ou mais das proteínas, fragmentos, variantes ou derivados isolados da invenção. Em certas formas de realização, o anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo pode estar na forma recombinante. Isso pode ser particularmente vantajoso para “humanizar” o anticorpo ou fragmento monoclonal se o anticorpo monoclonal for inicialmente produzido por células do baço de um mamífero não humano.

[0082] Em algumas formas de realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser administrado a um mamífero para fornecer imunidade “passiva” à infecção estreptocócica do grupo A.

[0083] Certos outros aspectos e formas de realização da invenção referem-se à administração de um ou mais ácidos nucleicos que codificam um peptídeo imunogênico isolado que compreende o conjunto de sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, ou um fragmento, variante ou seu derivado, para: (i) provocar uma resposta imune às bactérias estreptocócicas do grupo A em um mamífero; (ii) imunizar um mamífero contra bactérias estreptocócicas do grupo A; e/ ou (iii) tratar ou prevenir uma infecção bacteriana estreptocócica do grupo A em um mamífero.

[0084] O termo “ácido nucleico”, conforme usado aqui, designa DNA e RNA de fita simples ou dupla. O DNA inclui DNA genômico e cDNA. O RNA inclui mRNA, RNA, RNAi, siRNA, cRNA e RNA autocatalítico. Os ácidos nucleicos também podem ser híbridos DNA-RNA. Um ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que tipicamente inclui nucleotídeos que compreendem uma base A, G, C, T ou U. No entanto, as sequências nucleotídicas podem incluir outras bases, como purinas modificadas (por exemplo inosina, metilinosina e metiladenosina) e pirimidinas modificadas (por exemplo tiouridina e metilcitosina).

[0085] Em uma forma preferida, o ácido nucleico isolado que codifica o peptídeo imunogênico, fragmento, variante ou derivado do mesmo está na forma de uma construção genética adequada para administração a um mamífero como um humano. De um modo preferido, a construção genética é adequada para a vacinação de DNA de um mamífero como um humano.

[0086] Adequadamente, a construção genética está na forma ou compreende componentes genéticos de um plasmídeo, bacteriófago, um cosmídeo, uma levedura ou cromossomo artificial bacteriano, como são bem entendidos na técnica. As construções genéticas também podem ser adequadas para manutenção e propagação do ácido nucleico isolado em bactérias ou outras células hospedeiras, para manipulação pela tecnologia de DNA recombinante.

[0087] Para os propósitos de expressão proteica, a construção genética é uma construção de expressão. Adequadamente, a construção de expressão compreende o um ou mais ácidos nucleicos operacionalmente ligados a uma ou mais sequências adicionais em um vetor de expressão. Um “vetor de expressão” pode ser um vetor extra-cromossômico auto-replicante, como um plasmídeo, ou um vetor que se integra ao genoma do hospedeiro.

[0088] Por “operacionalmente ligado ou conectado” entende-se que a(s) sequência(s) nucleotídica(s) adicional(is) é(são) posicionada(s) em relação ao ácido nucleico da invenção, preferencialmente para iniciar, regular ou de outra forma controlar a transcrição.

[0089] Sequências nucleotídicas reguladoras serão geralmente apropriadas para a célula ou tecido hospedeiro onde a expressão é necessária. São conhecidos na técnica numerosos tipos de vetores de expressão apropriados e sequências reguladoras adequadas para uma variedade de células hospedeiras.

[0090] Tipicamente, as referidas uma ou mais sequências nucleotídicas reguladoras podem incluir, mas não estão limitadas a, sequências promotoras, sequências líder ou de sinal, locais de ligação ribossômica, sequências transcricionais de início e término, sequências traducionais de início e término, e sequências intensificadoras ou ativadoras. Promotores constitutivos ou induzíveis, como conhecidos na técnica, são contemplados pela invenção. A construção de expressão também pode incluir uma sequência nucleotídica adicional que codifica um parceiro de fusão (tipicamente fornecido pelo vetor de expressão), de modo que a proteína recombinante da invenção seja expressa como uma proteína de fusão, como descrito anteriormente.

[0091] Adequadamente, a vacinação de DNA é por meio de uma ou mais construções de expressão de DNA plasmídico. Plasmídeos tipicamente compreendem um promotor viral (como promotores SV40, RSV ou CMV). O íntron A pode ser incluído para melhorar a estabilidade do RNAm e, assim, aumentar a expressão de proteínas. Os plasmídeos podem ainda incluir um local de clonagem múltiplo, um forte sinal de terminação de poliadenilação/ transcrição, como sequências de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino ou de poliadenilação de beta-globulina de coelho. O plasmídeo pode ainda compreender elementos de transcrição ativadores cis do vírus do macaco Mason-Pfizer (MPV-CTE) com ou sem expressão aumentada do envelope de HIV rev. Modificações adicionais que podem melhorar a expressão incluem a inserção de sequências potenciadoras, íntrons sintéticos, sequências líder tripartidas do adenovírus (TPL) e/ ou modificações nas sequências de poliadenilação e/ ou terminação de transcrição. Um exemplo não limitativo de um plasmídeo de vacina de DNA é o pVAC que está comercialmente disponível na Invivogen.

[0092] Uma referência útil que descreve a vacinologia do DNA é

DNA Vaccines, Methods and Protocols, Segunda Edição (Volume 127 de Methods in Molecular Medicine series, Human Press, 2006).

[0093] Como anteriormente descrito, a invenção fornece composições, vacinas e/ ou métodos de imunização contra, preveção ou tratamento de uma um doença, disfunção ou condição associada ao Grupo A de streptococus em um mamífero. Adequadamente, as composições, vacinas e/ ou métodos de imunização contra, prevenção ou tratamento de uma doença, distúrbio ou condição associada ao streptococus do Grupo A provocam uma resposta imune da mucosa após a administração a um mamífero. De preferência, a resposta imune da mucosa é caracterizada pela produção de IgG em comparação com um nível mais baixo de IgA, ou ausente.

[0094] Como geralmente usado aqui, os termos “imunizar”, “vacinar” e “vacina” se referem a métodos e/ ou composições que provocam uma resposta imune protetora contra o Strep do Grupo A, em que a infecção subsequente pelo Strep do Grupo A é pelo menos parcialmente impedida ou minimizada.

[0095] Conforme usado neste documento, “tratar”, “tratar” ou “tratamento” refere-se a uma intervenção terapêutica que pelo menos parcialmente melhora, elimina ou reduz um sintoma ou sinal patológico de uma doença, distúrbio ou condição associada à estreptococo do Grupo A depois que este começou a se desenvolver. O tratamento não precisa ser absoluto para ser benéfico para o sujeito. O efeito benéfico pode ser determinado usando quaisquer métodos ou padrões conhecidos do especialista na técnica.

[0096] Conforme usado neste documento, “prevenindo”, “prevenir” ou “prevenção” refere-se a um curso de ação iniciado antes da infecção ou exposição a estreptococos do grupo A e/ ou antes do início de um sintoma ou sinal patológico de uma doença, distúrbio ou condição associada ao estreptococos do grupo A, para prevenir a infecção e/ ou reduzir o sintoma ou sinal patológico. Deve ser entendido que tal prevenção não precisa ser absoluta para ser benéfica para um sujeito. Um tratamento “profilático” é um tratamento administrado a um indivíduo que não exibe sinais de uma doença, distúrbio ou condição associada ao strep do grupo A, ou exibe apenas sinais precoces com o objetivo de diminuir o risco de desenvolver um sintoma ou sinal patológico de uma doença, desordem ou condição associada ao strep do grupo A.

[0097] No contexto da presente invenção, por “doença, distúrbio ou condição associada ao estrep do grupo A” significa qualquer patologia clínica resultante de infecção pelo estreptococo do grupo A e inclui celulites, erisipelas, impetigo, febre escarlate, infecções na garganta como como faringite aguda (“garganta inflamada”), bacteremia, síndrome do choque tóxico, fasceíte necrosante, febre reumática aguda e glomerulonefrite aguda, embora sem limitação às mesmas.

[0098] Em certos aspectos e formas de realização, o peptídeo, fragmento, variante ou derivado, ácidos nucleicos isolados, construções genéticas, anticorpos e/ ou fragmentos de anticorpos de p*17, conforme divulgado neste documento, podem ser administrados a um mamífero separadamente, ou em combinação, na forma de uma composição.

[0099] Em uma forma preferida, a composição compreende um veículo, diluente ou excipiente aceitável.

[00100] Por “veículo, diluente ou excipiente aceitável” entende-se uma substância de carga, diluente ou encapsulante sólida ou líquida que pode ser usada com segurança na administração sistêmica. Dependendo da via de administração específica, pode ser utilizada uma variedade de veículos, diluentes e excipientes bem conhecidos na técnica. Estes podem ser selecionados a partir de um grupo incluindo açúcares, amidos, celulose e seus derivados, malte, gelatina, talco, sulfato de cálcio, óleos vegetais, óleos sintéticos, polióis, ácido alginico, soluções tamponadas de fosfato,

emulsionantes, solução salina isotónica e sais tais como sais de ácidos minerais, incluindo cloridratos, brometos e sulfatos, ácidos orgânicos como acetatos, propionatos e malonatos, água e água livre de pirogênio.

[00101] Uma referência útil que descreve veículos, diluentes e excipientes aceitáveis é o Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. NJ EUA, 1991), que é aqui incorporado por referência.

[00102] De preferência, para os fins de provocar uma resposta imune, certos agentes imunológicos podem ser utilizados em combinação com o peptídeo, fragmento, variante ou derivado p*17.

[00103] O termo “agente imunológico” inclui dentro do seu âmbito veículos, agentes de entrega, imunoestimulantes e/ ou adjuvantes, como são bem conhecidos na técnica. Como será entendido na técnica, imunoestimulantes e adjuvantes se referem ou incluem uma ou mais substâncias que aumentam a imunogenicidade e/ ou eficácia de uma composição. Exemplos não limitativos de imunoestimulantes e adjuvantes adequados incluem esqualano e esqualeno (ou outros óleos de origem vegetal ou animal); copolímeros em bloco; detergentes como Tween®-80; Quil® A, óleos minerais como Drakeol ou Marcol, óleos vegetais como óleo de amendoim; adjuvantes derivados de Corynebacterium, tais como Corynebacterium parvum; adjuvantes derivados de Propionibacterium tais como Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis (Bacille Calmette e Guerin ou BCG); Antígenos de Bordetella pertussis; toxóide do tétano; toxóide da difteria; substâncias tensoativas como hexadecilamina, octadecilamina, ésteres de octadecil aminoácidos, lisolecitina, brometo de dimetildioctadecilamônio, N,N-dicoctadecil- N’, N’bis(2-hidroxietil-propanodiamina), metoxihexadecilglicerol, e polióis plurônicos; poliaminas tais como pirano, dextransulfato, poli IC carbopol; peptídeos tais como dipeptídeo muramil e derivados, dimetilglicina, tuftsina; emulsões de óleo; e géis minerais tais como fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio ou alum; interleucinas tais como interleucina 2 e interleucina 12; monocinas como interleucina 1; fator de necrose tumoral; interferons tais como interferon gama; DNA imunoestimulador, como CpG DNA, combinações como saponina-hidróxido de alumínio ou hidróxido de alumínio Quil-A; lipossomas (por exemplo, consulte a Publicação Internacional WO 2017/070735); Adjuvante ISCOM® e ISCOMATRIX®; extrato de parede celular micobacteriana; glicopeptídeos sintéticos tais como dipeptídeos de muramila ou outros derivados; Avridina; Derivados de lípido A; sulfato de dextrano; DEAE-Dextrano sozinho ou com fosfato de alumínio; carboxipolimetileno como Carbopol’ EMA; emulsões de copolímeros acrílicos como Neocryl A640 (por exemplo, Patente US No.

5,047,238); emulsificantes de água em óleo, como o Montanide ISA 720; proteinas de poliovírus, vaccinia ou poxvírus animais; ou misturas dos mesmos.

[00104] Os agentes imunológicos podem incluir veículos como tireoglobulina e toxóide da difteria (DT); albuminas como albumina sérica humana; toxinas, toxóides ou qualquer material reativo cruzado mutante (CRM) da toxina do tétano, difteria, coqueluche, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus e Streptococcus; poliaminoácidos tais como poli(lisina: ácido glutâmico); gripe; Rotavirus VP6, Parvovirus VP1 e VP2; proteína central do vírus da hepatite B; vacina recombinante do vírus da hepatite B e similares. Alternativamente, um fragmento ou epítopo de uma proteína transportadora ou outra proteína imunogênica pode ser usado. Por exemplo, um epítopo de célula T de uma toxina bacteriana, toxóide ou CRM pode ser usado. A este respeito, pode ser feita referência à Patente US No. 5,785,973, que é incorporada aqui por referência.

Outros agentes imunológicos podem incluir peptídeos imunogênicos das proteínas estreptocócicas do grupo A diferentes da proteína M, por exemplo, um peptídeo SpyCEP como descrito na Publicação Internacional WO 2015/157820.

[00105] Qualquer procedimento adequado é contemplado para a produção de composições de vacina. Procedimentos exemplificativos incluem, por exemplo, aqueles descritos em New Generation Vaccines (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc. Nova York, Basel, Hong Kong), que é incorporado aqui por referência.

[00106] Em algumas formas de realização, composições e vacinas podem ser administradas a mamíferos na forma de bactérias atenuadas ou inativadas que podem ser geneticamente modificadas para expressar o peptídeo, fragmento, variante ou derivado p*17 e/ ou o agente que facilita a restauração ou o aprimoramento de atividade dos neutrófilos. Exemplos não limitativos de bactérias atenuadas incluem espécies de Salmonella, por exemplo Salmonella enterica var. Typhimurium ou Salmonella typhi. Alternativamente, outros patógenos entéricos, como espécies de Shigella ou E. coli, podem ser utilizados na forma atenuada. As cepas atenuadas de Salmonella foram construídas pela inativação de genes na via biossintética de aminoácidos aromáticos (Alderton et al., Avian Diseases 35 435), introduzindo mutações em dois genes na via biossintética de aminoácidos aromáticos (como descrito na patente US 5,770,214) ou em outros genes como htrA (como descrito na patente US 5,980,907) ou em genes que codificam proteínas da membrana externa, como ompR (como descrito na patente US 5,851,519).

[00107] Qualquer via segura de admissão pode ser empregada, incluindo oral, retal, parenteral, sublingual, bucal, intravenosa, intra- articular, intra-muscular, intra-dérmica, subcutânea, inalatória, intraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, tópica, mucosa e administração transdérmica, embora sem limitação.

[00108] Em uma forma de realização particular, a administração é intramuscular, como por meio de uma ou mais injeções intramusculares. Normalmente, a administração intranasal é considerada ideal para induzir imunidade da mucosa. Surpreendentemente, a administração intramuscular do peptídeo p*17 provoca uma resposta imune da mucosa às bactérias estreptocócicas do grupo A.

[00109] As formas de dosagem incluem comprimidos, dispersões, suspensões, injeções, soluções, xaropes, trociscos (troches), cápsulas, sprays nasais, supositórios, aerossóis, adesivos transdérmicos e similares. Essas formas de dosagem também podem incluir a injeção ou implantação de dispositivos de liberação controlada projetados especificamente para esta finalidade ou outras formas de implantes modificadas para atuar adicionalmente dessa maneira. A liberação controlada pode ser efetuada através do revestimento com polímeros hidrofóbicos, incluindo resinas acrílicas, ceras, álcoois alifáticos superiores, ácidos polilácticos e poliglicólicos e certos derivados de celulose, tais como hidroxipropilmetil celulose. Além disso, a liberação controlada pode ser efetuada usando outras matrizes poliméricas, lipossomos e/ ou microesferas.

[00110] As composições podem ser apresentadas como unidades discretas, como cápsulas, saquetas, alimentos/ rações funcionais ou comprimidos, cada uma contendo uma quantidade predeterminada de um ou mais agentes terapêuticos da invenção, como um pó ou grânulos ou como solução ou suspensão em um líquido aquoso, líquido não aquoso, uma emulsão óleo em água ou uma emulsão líquida água em óleo. Tais composições podem ser preparadas por qualquer um dos métodos de farmácia, mas todos os métodos incluem a etapa de associar um ou mais agentes como descritos acima com o veículo que constitui um ou mais ingredientes necessários. Em geral, as composições são preparadas misturando uniformemente e intimamente os agentes da invenção com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, moldando o produto na apresentação desejada.

[00111] As composições acima podem ser administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e em quantidade adequada como eficaz. A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para efetuar uma resposta benéfica em um paciente durante um período de tempo apropriado. A quantidade de agente(s) a ser(em) administrado(s) pode depender do sujeito a ser tratado, incluindo idade, sexo, peso e condição geral de saúde, fatores que dependerão do julgamento do profissional.

[00112] Em uma forma de realização dos métodos acima mencionados e das composições, o peptídeo, fragmento ou variante modificad de P145 pode ser administrado em combinação com um fragmento imunogênico de uma proteína SpyCEP. Será apreciado que o fragmento de proteína SpyCEP pode atuar como um agente que facilita a restauração ou melhora a atividade dos neutrófilos, aumentando direta ou indiretamente pelo menos parcialmente a melhoria ou restauração da produção, migração e/ ou quimiotaxia de neutrófilos e/ ou uma ou mais atividades imunológicas de neutrófilos. Tipicamente, os fragmentos SpyCEP provocam uma resposta imune inibidora para a protease de serina SpyCEP que cliva proteoliticamente interleucina 8. SpyCEP é uma protease de serina multidomínio de 170 kDa expressa na superfície dos organismos patogênicos humanos Streptococcus pyogenes, que desempenha um papel importante na infecção por catalisar a clivagem e a inativação do neutrófilo quimioatraente interleucina-8. Exemplos não limitativos de sequências de aminoácidos SpyCEP podem ser encontrados nos números de acesso YP597949.1 e (S. pyogenes MGAS10270) e YP596076.1 (S. pyogenes MGAS9429). De preferência, o fragmento de SpyCEP é ou compreende um peptídeo S2 (SEQ ID NO: 23) ou uma variante como um peptídeo K4S2 (SEQ ID NO: 24).

[00113] Em algumas formas de realização, o peptídeo, fragmento ou variante de P145 modificado e o peptídeo, fragmento ou variante de S2 pode ser fornecido como um peptídeo único, quimérico. Nesta forma de realização, o peptídeo p145 modificado pode estar no N-terminal ou C-terminal do peptídeo S2.

[00114] Como geralmente usado aqui, os termos “paciente”, “indivíduo” e “sujeito” são usados no contexto de qualquer receptor mamífero de um tratamento ou composição aqui divulgado. Por conseguinte, os métodos e composições aqui divulgados podem ter aplicações médicas e/ ou veterinárias.

Em uma forma preferida, o mamífero é um humano.

[00115] Para que a invenção possa ser completamente compreendida e posta em prática, é feita referência aos seguintes Exemplos não limitativos.

EXEMPLOS INTRODUÇÃO

[00116] A capacidade de aumentar a imunogenicidade de pequenos epítopos peptídicos facilitaria muito o desenvolvimento da vacina. As abordagens que foram adotadas até agora para melhorar a imunogenicidade para a produção de anticorpos se concentraram em novas tecnologias de dobragem que resultam no epítopo mais parecido com a estrutura nativa (por exemplo, (5)) ou estratégias para incorporar moléculas adicionais ao peptídeo que ativará as células de apresentação de antígenos (por exemplo (6, 7)) ou células T auxiliares (8, 9).

[00117] Abordagens para alterar a sequência do peptídeo para melhorar sua imunogenicidade também estão sendo consideradas. Os peptídeos heteroclíticos foram testados para aumentar a imunogenicidade para células T (10). No entanto, quase todas as vacinas dependem da produção de anticorpos protetores e aqui os peptídeos modificados foram amplamente ignorados, mas as modificações de aminoácidos fora de um epítopo mínimo de 4 aminoácidos mostraram ser capazes de melhorar o reconhecimento de peptídeos por um anticorpo monoclonal, sugerindo que essa abordagem pode ser útil para o desenvolvimento de vacinas (11). Modificações de sequência de epítopos complexos e modificações dentro de epítopos mínimos para melhorar a imunogenicidade não foram testadas como um modo de aumentar a eficácia.

[00118] Um epítopo peptídico conservado da proteína M de Streptococcus pyogenes fornece um foco e uma oportunidade ideais para desenvolver uma estratégia para projetar e testar racionalmente um imunogênio peptídico complexo aprimorado para induzir anticorpos protetores. A proteína M possui uma região terminal carboxila conservada e um peptídeo de 20 aminoácidos, ‘p145’, que possui uma estrutura alfa hélice, foi descrito que pode induzir anticorpos protetores contra cepas amplas (revisado em (12)). Existe um epítopo mínimo de células B de 12 aminoácidos dentro de p145. No entanto, os 20 aminoácidos inteiros são necessários para manter o dobramento helicoidal do epítopo mínimo. Este epítopo é críptico para o organismo.

[00119] A exposição a S. pyogenes geralmente não resulta na produção de anticorpos para p145 (13), (14); no entanto, os anticorpos induzidos ao epítopo mínimo por vacinação podem matar o organismo. A imunidade requer múltiplas rodadas de vacinação e a proteção se correlaciona com a magnitude da resposta imune (15).

[00120] No presente estudo, foram realizadas rodadas iterativas de substituições direcionadas de aminoácidos dentro do epítopo mínimo de células B para criar variantes de p145. Como resultado, a imunogenicidade e a capacidade do peptídeo-anti-soro de se ligar a p145 e estreptococos foram aumentadas significativamente e a eficácia da vacina foi aumentada de tal forma que apenas uma única imunização foi necessária para induzir imunidade. Observamos um nível de proteção aumentado em 10.000 vezes contra a doença estreptocócica invasiva em comparação com os camundongos controle vacinados com o peptídeo parental.

MATERIAIS E MÉTODOS

Peptídeos

[00121] Os peptídeos foram obtidos na Mimotopes Pty Ltd (Victoria, Austrália). A biblioteca de peptídeos (87 peptídeos incluindo p145) foi adquirida como um PepSet clivado com uma biotina acoplada ao terminal N5 e um ligante de quatro aminoácidos (SGSG) foi adicionado entre o peptídeo e a biotina. Os peptídeos foram biotinilados através do N-terminal para minimizar a interferência na ligação ao ligante. Os peptídeos p*1-p*18 foram obtidos como peptídeos personalizados com pureza mínima de > 90%. Um resíduo de cisteína adicional foi adicionado na extremidade do N-terminal a cada peptídeo para permitir o acoplamento às colunas de Gel Spin (veja abaixo). O p145 usado para revestimento em ELISA foi sintetizado no Instituto de Pesquisa Médica QIMR Berghofer, na Unidade de DNA e Peptídeo ou nos peptídeos da China. O peptídeo p*17 com resíduo de cisteína C-terminal, foi sintetizado em peptídeos da China e conjugado com DT como descrito em outro local (16).

Anti-soros

[00122] Os anti-soros utilizados para a triagem de peptídeos foram de camundongos B10.BR imunizados com J8, BALB/c imunizados com J8-DT ou BALB/c imunizados com p145, Quackenbush e B10.D2.

Bactérias

[00123] As cepas de GAS 2031 (emm 1) são um isolado do centro de referência de Praga e 8830 (emm 97) é um isolado clínico do Território do Norte da Austrália (17). Ambas as cepas foram obtidas na Menzies School of Health Research (MSHR); adaptado ao camundongo para estudos in vivo e tornou resistente à estreptomicina (200 μg/mL). JRS145 é um mutante negativo da proteína M.

Ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)

[00124] O ELISA com peptídeos biotinilados foi realizado conforme recomendado pelo fabricante (Mimotopes, Austrália). Resumidamente,

foram adicionados 100 µl de aliquotas de estreptavidina (Sigma-Aldrich, Austrália) a uma concentração final de 5 µg/ ml em água a placas de microtitulação com 96 poços ativadas por Oltrack, Concentrack, Países Baixos) e incubou-se a 37 °C durante a noite. Os poços foram bloqueados durante 1 h à temperatura ambiente com 200 µl de PBS, pH 7,2, contendo 0,05% de Tween 20 e 1% de caseinato de sódio e em seguida lavou-se com PBS/ Tween 20. Os peptídeos foram diluídos em PBS/ Tween 20 com 0,1% de azida de sódio a uma concentração de trabalho de 20 µg/ml e 100 µl de cada um foi adicionado aos poços e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagens completas, foram adicionados anti-soros murinos p145 ou J8. As placas foram incubadas por 1 h em temperatura ambiente, lavadas e IgG anti-camundongo de cabra conjugado com HRP (Bio-Rad, Austrália) (1/3000) foi adicionado por mais 20 minutos à temperatura ambiente. Após lavagens adicionais, o substrato OPD (Sigma-Aldrich) foi adicionado e medido em OD450. O título foi definido como a maior diluição que deu uma leitura de densidade óptica (OD) de mais de três desvios padrão (DP) acima da OD média dos poços controle contendo soros normais de camundongo na mesma diluição (19).

[00125] Para os ensaios de inibição, as placas de microtitulação foram revestidas com 100 µl de P145 purificado a uma concentração final de 5 µg/ml em carbonato de sódio a 75 mM, pH 9,6, a 4 °C durante a noite. As placas foram lavadas com tampão de lavagem (PBS com Tween 20 a 0,05%, pH 7,2) e bloqueadas por 90 minutos a 37 °C com o tampão de lavagem aplicado com 5% de leite desnatado (tampão de bloqueio). Os soros anti-P145 foram incubados com várias concentrações (0,25 µg/ ml a 2,5 µg/ ml) de peptídeos selecionados da biblioteca de peptídeo, durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os anti-soros de teste foram posteriormente adicionados às placas bloqueadas e incubados por 90 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas quatro vezes e adicionou-se IgG anti-camundongo de cabra conjugada com HRP (Biorad, Austrália) (1/3000) e incubou-se por mais 90 minutos a 37 °C.

Após lavagem adicional, as placas foram desenvolvidas como acima e medidas a OD450.

[00126] Na análise de reatividade cruzada com proteínas de coração humano, 5 µg/ ml de tropomiosina, miosina ou queratina (Sigma-Aldrich, Austrália) foram imobilizados em placas de microtitulação. Após o bloqueio e lavagens como acima, as placas foram incubadas por 90 minutos a 37 °C com triplicatas de soro anti-peptídeo (p*1-p*18) (1/100), respectivamente. Depois disso, o anticorpo secundário e o substrato foram adicionados como acima.

Imunização de camundongos

[00127] Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do QIMR Berghofer Medical Research Institute, em conformidade com as diretrizes da Australian National Health and Medical Research (NHMRC).

No dia 0, camundongos Quackenbush (Animal Resources Centre, Austrália) (n = 3 por grupo) foram inoculados subcutaneamente (s.c.) na base da cauda com 30 µg dos diferentes peptídeos emulsionados a 1 : 1 com adjuvante completo de Freund (CFA) em um volume total de 50 µl. Camundongos controle receberam PBS filtrado estéril em CFA. Três semanas após a imunização primária, os camundongos receberam 2 imunizações de reforço de imunogênio (30 µg cada em PBS filtrado estéril) dada em intervalos semanais (dias 21 e 28). Grupos de camundongos com títulos de anticorpos menores que 1000 receberam um terceiro reforço emulsionado 1 : 1 com adjuvante incompleto de Freund. O GAS 2031 morto por calor (emm1) foi preparado como descrito anteriormente (18).

Para os estudos de desafio da pele, camundongos BALB/c (n = 10/ grupo) foram imunizados s.c. uma vez na base da cauda com 30 µg de P145-DT ou p*17-DT ou preparação formulada de GAS 2031 mortos por calor em Alume. Para o estudo de variação da dose de p145, após imunização primária com p145- DT/Alume no dia 0, coortes específicas foram administradas 1 ou 2 reforços nos dias 21 e 28. Os camundongos controle receberam adjuvante sozinho. O sangue foi coletado de cada camundongo 1 dia antes dos reforços e uma semana após a imunização final. O sangue foi coagulado a 4 °C por pelo menos 4 horas e o soro foi coletado após centrifugação a 1000 g por 10 minutos. Os soros foram armazenados a -20 °C.

Purificação por afinidade de soros

[00128] Para purificação dos soros específicos para peptídeos, foi utilizado o kit de acoplamento de peptídeos Microlink (Pierce, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, cada peptídeo foi diluído para 0,6 mg/ml em tampão de acoplamento e imobilizado em uma coluna de centrifugação de gel de iodoacetil Ultralink (Pierce, EUA). As colunas foram cuidadosamente lavadas com tampão de acoplamento e bloqueadas com L-cisteína HCl (10 mg/ ml). Depois disso, as colunas foram lavadas com tampão de lavagem seguido por PBS. Para a purificação por afinidade, 300 µl dos diferentes soros de Quackenbush foram adicionados às respectivas colunas e incubados de ponta a ponta a 4 °C durante a noite. As colunas foram lavadas três vezes com PBS e os anticorpos foram eluídos com 100 µl de tampão de eluição. Depois disso, as colunas foram lavadas e bloqueadas novamente como acima e foram adicionados soros adicionais. As concentrações de imunoglobulina eluída (Ig) foram estimadas usando o Nanodrop (Thermo Scientific, EUA). As preparações de IgG purificadas a uma concentração de 5 µg/ml, seguidas de diluições em série de duas vezes, foram avaliadas quanto à sua ligação a concentrações variáveis de p145.

Citometria de fluxo

[00129] A ligação dos anticorpos peptídicos ao S. pyogenes foi analisada por citometria de fluxo. As bactérias foram cultivadas em caldo de Todd-Hewitt (THB) com 1% de neopeptona durante a noite e lavadas duas vezes em PBS. Posteriormente, as bactérias (3 x 107 unidades formadoras de colônias;

ufc) foram pré-incubadas com 100 μl de bloqueador Fc por 15 minutos à temperatura ambiente, seguida pela adição dos anticorpos peptídicos a uma concentração de 10 mg/ ml. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, as bactérias foram lavadas duas vezes em PBS, seguido de incubação com IgG anti-camundongo conjugada com FITC (diluída 1/50 em PBS com BSA a 2%), volume total de 100 μl, foi adicionado por mais 30 minutos à temperatura ambiente. As bactérias foram lavadas e incubadas em 300 μl de formaldeído a 1% (em PBS) e por 15 minutos à temperatura ambiente e depois transferidas para gelo até a leitura em um citômetro de fluxo FACS Calibur 1 (Becton Dickinson, EUA).

[00130] A IgG anti-camundongo conjugada com FITC foi adicionada separadamente como um controle negativo para cada cepa analisada e, além disso, uma IgG de camundongo não específica foi incluída como controle.

Procedimento para desafio cutâneo com GAS

[00131] S. pyogenes 2031 (emm 1), 88/30 (emm97) e 5448AP (emm1) foram cultivadas durante a noite em THB com 1% de neopeptona (THBN), lavadas duas vezes em THBN e ressuspensas em 25% do volume original. A dose de inóculo (UFC/ml) foi determinada por densidade óptica a 600 nm e plaqueamento de diluições de 10 vezes de suspensões bacterianas em 2% de ágar THB de sangue de cavalo. Seguido de incubação durante a noite de a 37 °C, foram determinadas as contagens de colônias. Duas semanas após a imunização final, os camundongos imunizados e controle foram desafiados com a cepa GAS selecionada pela via cutânea da infecção, como descrito anteriormente (19).

Simulações de dinâmica molecular (MD)

[00132] Simulações de dinâmica molecular (MD) dos peptídeos p*17 e P145 foram realizadas para examinar possíveis bases moleculares de sua imunogenicidade. Suas sequências, com uma Cisteina conectada ao C-terminal, foram submetidas ao servidor PEP-FOLD (20) para construir modelos estruturais iniciais. Esses modelos foram utilizados como ponto de partida para simulações de MD, realizadas no GROMACS 5 (21). Todos os resíduos foram parametrizados com o campo de força Amber ff14SB (22).

Cada peptídeo foi colocado em uma caixa dodecaédrica com uma distância mínima de 1,2 nm entre o soluto e a borda da caixa, seguido de solvatação com as moléculas de água TIP3P (23). Os íons de sal foram então adicionados a uma concentração de 0,15 M para equilibrar a carga iônica no sistema. As minimizações de energia foram realizadas com o integrador de descida mais íngreme e o algoritmo de gradiente conjugado sequencialmente para atingir uma força máxima inferior a 500 kJ mol-1 nm-1 em qualquer átomo. O esquema de corte de Verlet (24) foi utilizado para avaliar interações de curto alcance e não ligadas, com interações de van der Waals e eletrostáticas truncadas a 0,8 nm.

Interações eletrostáticas de longo alcance foram tratadas pelo método de malha de partículas de Ewald (PME) (25, 26). A temperatura foi mantida em 298 K usando um termostato de redimensionamento de velocidade (27) com uma constante de acoplamento de 0,1 ps, enquanto a pressão foi mantida em 1,0 atm usando um barostat de Berendsen (28), com uma constante de acoplamento de 1 ps.

[00133] As simulações foram realizadas com um intervalo de tempo de 2 fs, e todas as ligações envolvendo átomos de hidrogênio foram restringidas por um solucionador de restrições linear paralelo (P-LINCS) (29).

Cada sistema foi equilibrado sob um conjunto de volume constante (NVT) para 100 ps e um conjunto de pressão constante (NPT) para 100 ps. Uma restrição de posição harmônica com uma constante de força de 1000 kJ mol-1 nm-2 foi aplicada a todos os átomos pesados de moléculas não solventes. Após o equilíbrio, foram realizadas simulações de MD de produção por 100 ns para cada sistema, sem quaisquer restrições. Foram realizadas três execuções de MD replicadas para cada sistema, variando a semente aleatória para a geração inicial de velocidade. As análises das trajetórias de MD foram realizadas por programas incluídos no GROMACS 5 nos 40 ns finais de cada corrida de 100 ns para permitir o equilíbrio.

Análise estatística.

[00134] A média e o erro padrão foram calculados usando fórmulas padrão. Os testes de Mann-Whitney foram utilizados para comparar os títulos de anticorpos entre dois grupos. Salvo indicado de outra forma, os valores de P foram corrigidos usando o método de Bonferroni para comparações múltiplas. O ANOVA com o método post hoc de Tukey foi usado para determinar a significância entre todas as coortes tratadas e controle em cada momento.

Resultados

[00135] Nosso objetivo foi projetar um imunogênio peptídico superior contra o GAS em comparação com o p145 usando ciclos iterativos de seleção de sequências mutantes dentro do epítopo mínimo de 12 aminoácidos no p145 (Tabela 1). Inicialmente, projetamos uma biblioteca de peptídeos mutantes (L1) para perguntar se a antigenicidade de p145 poderia ser aumentada com mutações únicas. Procuramos identificar mutações que aumentariam a antigenicidade, mas sem criar sequências que se parecessem com proteínas humanas conhecidas.

[00136] Em L1, um aminoácido foi alterado de cada vez e as substituições de aminoácidos foram selecionadas com base em suas propriedades físico-químicas relevantes para manter o peptídeo dobrado como uma alfa hélice (5, 11 30). A biblioteca resultante consistiu em 86 variantes de p145 mais a p145 original (Tabela 3). Além disso, um peptídeo não específico (pNS [# 87]) foi incluído como controle. A ligação dos anti-soros p145 a cada peptídeo foi analisada usando ELISA. Nesses estudos, para garantir que a mesma quantidade de cada peptídeo estivesse ligada à placa, usamos peptídeos biotinilados, que foram ligados às placas via estreptavidina. Um ligante peptídico de quatro aminoácidos foi colocado entre o peptídeo mutante e a biotina para garantir espaço suficiente para o reconhecimento de anticorpos. Os anti-soros foram obtidos de camundongos B10.D2, BALB/c imunizados com p145 e camundongos Quackenbush com pais não relacionados (outbred). Para cada uma das três cepas diferentes de camundongo, a ligação dos anti-soros aos peptídeos variantes variou entre mínima e ligeiramente aumentada em comparação com a sua ligação a p145 (Figura 1A). A maioria das substituições resultou em ligação reduzida. Além disso, resultados semelhantes foram obtidos com anti-soros J8 ou J8-DT retirados de camundongos B10.BR ou BALB/c, respectivamente (dados não mostrados).

[00137] O peptídeo não específico foi menos bem reconhecido de todos os peptídeos. Identificamos 17 peptídeos aos quais os anti-soros específicos para p145 apresentaram ligação semelhante ou melhor do que para p145 e perguntamos se esses peptídeos em solução poderiam inibir a ligação do anti-soro específico para p145 ao peptídeo p145 parental. Estes peptídeos, quando testados em ELISA de inibição, a duas concentrações diferentes (0,25 µg/ml e 2,5 µg/ml), demonstraram uma resposta dependente de dose (Figura 1B e a Figura 6). Em ambas as concentrações, os peptídeos inibiram a ligação de anticorpos anti-p145 em solução em uma extensão comparável à p145, provavelmente devido à retenção de dobras semelhantes a p145, no entanto, nenhum era claramente superior (Figura 1B e Figura 6).

[00138] Para evitar a indução de anticorpos humanos específicos, analisamos se as substituições de aminoácidos resultaram em sequências que eram estreitamente relacionadas às proteínas humanas, utilizando programas de bioinformática (BLASTP e Clustal Omega). Três peptídeos (2, 9 e 41) foram eliminados de outras considerações devido a similaridades (> 50% de identidade de sequência) com proteínas humanas, incluindo rootletina (proteína de bobina espiralada de raiz ciliar), dinactina 1, proteína 29 associada ao receptor de células B, fator 1 de microtúbulo-actina de reticulação e miosina (polipeptídeo pesado 7B, músculo cardíaco, beta, Isoforma CRA_c). Portanto, sete peptídeos emergiram da triagem primária (5, 6, 11, 13, 40, 66 e 72), que envolveu mutações em quatro posições: S1E, S1V, R2N, R2D, K6N, K10R e K10M dentro do epítopo mínimo p145 (Figura 1C).

[00139] Argumentando que mutações únicas nesses peptídeos resultaram em um reconhecimento ligeiramente aprimorado pelo anti- soro p145, projetamos uma segunda biblioteca, L2, que continha 18 peptídeos envolvendo todas as combinações possíveis de duas mutações das sete mutações de aminoácidos identificadas acima. Isto resultou em peptídeos designados como p*1-18 (Tabela 2).

[00140] Investigamos a imunogenicidade desses peptídeos duplamente mutados em camundongos (Quackenbush). A imunogenicidade dos peptídeos variou, mas todos, exceto p*14 e p*16, geraram anticorpos contra o peptídeo imunizante, com a maioria dos títulos dando entre 1 105 e 106 após três imunizações (Figura 2A). Todos os peptídeos, exceto p*14, p*15 e p*16, foram significativamente mais imunogênicos que o p145. O peptídeo mais imunogênico foi p*17. Anticorpos para todos os peptídeos, exceto p*14 e p*16, foram purificados por afinidade usando o peptídeo imunizante e verificamos a ligação relativa de cada um dos anticorpos às concentrações de título do peptídeo p145 imobilizados no plástico. Cada placa foi incubada com anticorpos purificados a 5 μg/ml.

[00141] Os anticorpos induzidos por sete peptídeos (p*2, p*4, p*6, p*10, p*13, p*17 e p*18) apresentaram maior afinidade, ligando-se significativamente mais fortemente ao p145 imobilizado do que os anticorpos induzidos por p145 (Figura 2B). Observamos que cinco desses sete peptídeos

(p*4, p*10, p*13, p*17 e p*18) apresentavam uma mutação K10. Em seguida, usamos citometria de fluxo para investigar a ligação de anticorpos purificados por afinidade, cada um na mesma concentração, à superfície de estreptococos que expressam diferentes proteínas emm - 2031 (emm1) e 88/30 (emm97), ambos contendo exatamente a mesma sequência de p145.

[00142] Os anticorpos para p*2, p*4, p*17 e p*18 se ligam a ambas as cepas de GAS em uma extensão muito mais alta quando comparados aos anticorpos induzidos por p145 (Figuras 3A-B), com IgG anti-p*17 demonstrando a ligação mais alta. Para a maioria dos anti-soros peptídicos, houve uma correlação entre a ligação a p145 e a superfície bacteriana, com os anti-soros a p*17 mostrando a ligação mais forte aos p145 e aos streptococos (Figuras 2B e 3). Este anti-soro também foi testado contra uma cepa negativa de emm (JRS145). Não foi observada ligação contra esta cepa (Figura 3C) confirmando que os anticorpos estavam reconhecendo um epítopo dentro da proteína M.

[00143] Dos peptídeos mais eficazes (p*2, p*4, p*17 e p*18), os peptídeos *2 e *4 não foram considerados ainda mais porque os anticorpos para esses dois peptídeos reconheceram proteínas humanas de bobina helicoidal alfa (Figura 7) Assim, dois peptídeos, p*17 e p*18 permaneceram para uma análise mais aprofundada e nos concentramos em p*17 devido à sua imunogenicidade superior.

[00144] Tendo demonstrado que p*17 era mais imunogênico que p145, que anticorpos para p*17 demonstravam maior afinidade por p145 do que anticorpos induzidos pelo próprio p145 e que eles ligavam diferentes cepas de estreptococos mais fortemente que anticorpos induzidos por p145, perguntamos se p*17 seria uma vacina superior à p145. O p145 conjugado ao toxóide da difteria (p145-DT) pode proteger contra o desafio estreptocócico da pele, mas são necessárias três doses da vacina (Figuras 3A e B suplementares).

O p*17 foi assim conjugado ao toxóide da difteria e comparado em um estudo frente a frente com o p145-DT, mas usando apenas uma dose única da vacina.

Usamos peptídeos conjugados para fornecer um grau semelhante de ajuda das células T para as respostas antipeptídicas, permitindo comparar diretamente a imunogenicidade dos peptídeos das células B.

[00145] Camundongos BALB/c foram imunizados subcutaneamente com p*17-DT, p145-DT ou PBS cada um formulado em Alume. Embora os imunogênios tenham sido conjugados ao DT, observamos que os títulos de anticorpos específicos para p145 induzidos por p*17-DT eram significativamente mais altos que os induzidos por p145-DT quando medidos três semanas após a vacinação (Figura 4A). Os camundongos foram então desafiados através da via cutânea com as cepas 2031 (emm1) ou 88/30 (emm97) de GAS para determinar a eficácia da vacina. Novamente, nenhuma proteção foi proporcionada pela vacinação com uma dose única de p145-DT contra 2031 ou 88/30 de GAS (Figuras 4B e D). No entanto, a vacinação com p*17-DT resultou em uma redução de 100-1000 vezes na carga bacteriana da pele seis dias após o desafio, em comparação com camundongos vacinados com p145-DT (Figuras 4B e D). Além disso, a vacinação com p*17-DT resultou em proteção estéril contra bacteremia devido ao GAS 2031 em camundongos (redução > 10.000 vezes na carga sanguínea bacteriana em comparação com camundongos vacinados com p145-DT) (Figura 4C). Além disso, a coorte vacinada com p*17-DT resolveu completamente a infecção sistêmica, devido a 88/30, no dia 6 após a infecção, enquanto as coortes imunizadas com p145 e PBS ainda apresentavam bacteremia significativamente mais alta (Figura 4E).

[00146] A capacidade de proteção de p*17-DT foi demonstrada em mais um estudo utilizando uma cepa mutante CovR/S. A vacinação única com p*17-DT induziu altos títulos específicos de peptídeos (Figura 8C) e resultou em redução > 90% da carga bacteriana da pele em comparação com a coorte de controle PBS (Figura 8D). Além disso, o nível de proteção foi significativamente melhor comparado ao oferecido pelo GAS morto por calor (Figura 8D).

[00147] Assim, p*17, um derivado não natural de p145, pode induzir anticorpos superiores reativos contra p145 em termos de títulos e afinidade do que o próprio p145 e é um imunogênio significativamente superior ao p145 em termos de indução de anticorpos que reconhecem estreptococos e protegem contra eles. Para perguntar se existiam diferenças estruturais significativas entre p145 e p*17 que possam explicar essa discrepância, usamos simulações de dinâmica molecular (MD) para analisar os peptídeos. As simulações revelaram que a hélice em p145 quebra entre as posições 12 e 14, provavelmente devido ao efeito disruptivo dos Ks carregados positivamente nas posições 12 e 13 (Figura 5A). O p*17 tem uma asparagina não carregada (N) na posição 13, facilitando o dobramento da hélice. Os dados também demonstram que o peptídeo p145 tinha menor probabilidade de adotar uma estrutura helicoidal que p*17 (porcentagem de forma helicoidal < 50 vs < 80; Figura 5B) e também mostrava maior flexibilidade (flutuação RMS; Figura 5C).

[00148] Em outros experimentos de acordo com o esquema da Figura 9, foi investigada a imunização intramuscular com p*17 sozinho ou em conjunto com o peptídeo S2. Os camundongos foram imunizados três (3) vezes com p*17-DT + K4S2-DT/Alume e desafio intranasal com 5448AP (cepa CovR/S MT). A Figura 10 mostra a imunogenicidade após imunização i.m. com vacinas à base de p*17. Camundongos BALB/c (n = 15/ grupo; fêmeas, 4-6 semanas de idade) foram imunizados i.m. com p*17-DT/Alume, p*17-DT + K4S2-DT/Alume e PBS/Alume nos dias 0, 21 e 42. Uma semana após o último reforço, foram coletadas amostras de soro e saliva e as respostas de anticorpos IgG (A & C) e IgA (B & D) específicas para p*17 foram medidas por ELISA e estão representadas como média ± SEM. Os títulos são comparados à coorte controle que recebeu apenas PBS/Alume.

[00149] A Figura 11 mostra a proteção após infecção intranasal. Duas semanas após o último reforço da vacina, os camundongos foram infectados por via intranasal com GAS mutante covR/S (5448AP). Nos dias 1-3, o derramamento nasal (NS) foi coletado. A carga bacteriana em NS foi determinada pressionando as narinas de cada camundongo em placas de ágar de sangue de columbia (CBA) contendo 5% de sangue de cavalo desfibrinado e partículas exaladas. Nos dias 1-3, o NS foi coletado e representado como a média transformada logarítmica ± SEM de cada dia individual (A) e como UFCs cumulativas dos três dias combinados (B). A redução percentual na carga bacteriana do derramamento nasal é mostrada na Figura 12.

[00150] A Figura 13 mostra a proteção após infecção intranasal. Em adição ao NS nos dias 1-3 foram recolhidos esfregaços da garganta (TS). Para esfregaços na garganta, aplicadores de esfregaço foram colocados em PBS estéril para umedecer, os camundongos foram então imobilizados e as gargantas foram esfregadas. O aplicador de esfregaço foi então suspenso em PBS, diluído em série e semeado em duplicata em placas CBA contendo sangue de cavalo desfibrinado a 5%. Nos dias 1-3, o NS foi coletado e representado como a média transformada logarítmica ufc/ ml ± SEM de cada dia individual (A) e como UFCs cumulativas dos três dias combinados (B). A Figura 14 mostra a redução da carga bacteriana nos esfregaços na garganta.

[00151] A Figura 15 mostra a proteção após infecção intranasal. No dia 3 pós-infecção, todos os camundongos sobreviventes foram sacrificados e amostras de NALT, pulmão, baço e sangue foram coletadas para determinar a carga bacteriana do GAS, dados representados como média transformada logarítmica ufc/ ml ± SEM (A) e a porcentagem de redução em comparação com Controle de PBS/ Alume (B).

[00152] Observamos ainda que 3x imunizações i.m. com p*17-DT/Alume protegiam contra o desafio intranasal com GAS. Houve redução de 70% a 90% na carga bacteriana nos derramamentos nasais e nos esfregaços na garganta, respectivamente. Além disso, houve uma redução superior a 70% na carga bacteriana sistêmica. Isso ocorreu apesar do fato de esses camundongos não induzirem IgA sérica ou salivar. Curiosamente, vimos uma indução de IgG salivar após imunização i.m. Para a determinação de respostas de anticorpos, realizamos análise semi-quantitativa (ELISA), que foram definidas como os títulos de ponto final. Nos experimentos que utilizaram a vacinação intramuscular com p*17-DT (com ou sem K4S2), as respostas da IgA da mucosa eram indetectáveis, enquanto as respostas da IgG da mucosa foram pelo menos 10 vezes maiores.

[00153] Foram realizadas comparações estruturais do peptídeo J8, p145 e p*17 que sugerem diferenças entre os peptídeos J8 e p*17 que suportam ainda mais a imunogenicidade aumentada de p*17. J8 é 28-mero enquanto p*17 é um peptídeo de 20-mero. Os dois peptídeos compartilham 10 aminoácidos, que são derivados do peptídeo nativo p145 (Figura 16), aminoácidos estreptocócicos mostrados em negrito. Os estudos de simulação de MD comparando J8 e p*17 demonstraram que ambos os peptídeos se dobram como uma hélice; no entanto, J8 é mais flexível em comparação com p*17. Acreditamos que a estrutura terciária geral de p*17 a torna mais estável, facilitando uma melhor interação com as moléculas hospedeiras. Além disso, a composição de aminoácidos de p*17 (mais semelhante à sequência de estreptococos que J8) provavelmente induz anticorpos que reconhecem melhor a estrutura nativa do organismo que J8.

DISCUSSÃO

[00154] O desenvolvimento de vacinas peptídicas seria enormemente facilitado por tecnologias que aumentam a imunogenicidade dos peptídeos. Muito poucos estudos usaram substituições seletivas de aminoácidos para modificar a imunogenicidade e, quando testados, eles se concentraram nas modificações do epítopo para aumentar a estimulação das células T CD8+, onde os resultados foram misturados. Aqui, descrevemos uma estratégia para melhorar significativamente a imunogenicidade de um peptídeo sintético helicoidal de 12 aminoácidos complexo de S. pyogenes. Vários peptídeos duplamente modificados demonstraram imunogenicidade significativamente melhorada em termos de indução de anticorpos ao peptídeo imunizante e ao peptídeo parental com alguns anti-soros, mostrando também uma ligação aumentada à superfície dos estreptococos. O peptídeo com o anti-soro que se ligava mais fortemente ao peptídeo parental e ao organismo (anti-p*17) foi testado como uma vacina para prevenir a infecção estreptocócica, onde observamos que uma única imunização resultou em proteção significativamente melhorada da pele e da doença invasiva (redução de mais de 100 vezes na carga biológica de estreptococos da pele e um íon de redução > 10.000 vezes na carga bacteriana no sangue).

[00155] Projetamos p*17 com base em nossas observações iniciais de antigenicidade de uma biblioteca de peptídeos de 86 peptídeos com uma alteração de aminoácido em cada peptídeo. Quatro aminoácidos dos 12 aminoácidos do epítopo helicoidal mínimo foram relevantes para a construção de peptídeos que foram reconhecidos pelo menos tão bem quanto a sequência parental. Embora estes peptídeos mutados isolados mostrassem um reconhecimento mínimo melhorado sobre o peptídeo parental, p145, pelos anti- soros anti-p145, novos peptídeos com duas mutações eram muito superiores como imunogênios que p145. Mas, mais surpreendentemente, os anticorpos produzidos por esses peptídeos duplamente mutados reconheceram p145 com afinidade significativamente maior do que os anticorpos induzidos pelo próprio p145. Além disso, vários anti-soros peptídicos reconheceram a superfície dos estreptococos mais avidamente do que os anticorpos induzidos pela vacinação com p145.

[00156] Ainda mais, a eficácia protetora de um desses peptídeos, p*17, mostra que esse peptídeo é um candidato superior à vacina. A imunização única com p*17 induziu altos níveis de anticorpos auto e específicos para p145, que eram protetores contra múltiplas cepas de GAS. Além disso, o peptídeo também protegeu contra uma cepa de GAS hipervirulenta que é responsável por infecções invasivas em todo o mundo. Atualmente, o epítopo mínimo dentro de p145, exibido dentro de um peptídeo helicoidal de levedura e referido como J8, é um dos principais candidatos a vacinas para estreptococos (12). Esse candidato a vacina também requer três doses para induzir proteção contra doenças de pele (19).

[00157] As simulações de MD revelaram que é mais provável que p*17 se dobre como hélice que o p145 e tem maior estabilidade. A estabilidade aprimorada provavelmente a tornou mais imunogênica do que a p145 e mais suscetível de induzir anticorpos que reconhecem a estrutura nativa do organismo, onde o epítopo é mantido como hélice. A ligação conformacional de anticorpos p*17 a outros epítopos ao longo da proteína M que são distintos da sequência p145 também poderia, em parte, explicar a eficácia aprimorada de p*17. No entanto, é curioso que os anticorpos anti-p*17 reconheçam o p145 melhor do que os anticorpos criados para o próprio p145. É possível que os anticorpos anti-p*17 possam dobrar o p145 em uma hélice.

[00158] Descobrimos que dos sete peptídeos variantes que induziam anticorpos anti-p145 de maior título e maior afinidade, quatro (p*10, p*13, p*17 e p*18) continham mutações nas posições e/ ou no epítopo mínimo, de modo que as duas posições não fossem ocupadas por aminoácidos carregados. Estas posições no epítopo mínimo correspondem às posições f e c no motivo do heptado que se juntam no lado hidrofílico do peptídeo helicoidal;

esta é susceptível de tornar estas estruturas mais estáveis. Não realizamos simulações de MD para os outros peptídeos para confirmar isso, pois nosso foco era o mais imunogênico que não compartilhava homologia de sequência com proteínas humanas (p*17).

[00159] Nós também testamos a hipótese de que a proteção na superfície da mucosa é devido à indução de IgG salivar. Foi demonstrado que a IgG na superfície da mucosa impede a colonização por aglutinação e, assim, a eliminação de bactérias (Roche et. al., Mucosal Immunol, 2015). Além disso p*17-DT quando combinado com K4S2-DT também foi capaz de induzir IgG salivar e a vacina de combinação foi capaz de proteger contra GAS 5448AP CovR/S mutante hipervirulenta significativamente melhor do que p*17-DT sozinho.

[00160] Os estudos de simulação de MD comparando J8 e p*17 demonstraram que ambos os peptídeos se dobram como uma hélice; no entanto, J8 é mais flexível em comparação com p*17. Acreditamos que a estrutura terciária geral de p*17 a torna mais estável, facilitando uma melhor interação com as moléculas hospedeiras. Além disso, a composição de aminoácidos de p*17 (mais semelhante à sequência de estreptococos que J8) provavelmente induz o reconhecimento por anticorpos da estrutura nativa do organismo melhor que J8.

[00161] Em conclusão, definimos uma estratégia para projetar peptídeos com imunogenicidade significativamente aprimorada por meio de um mecanismo que pode estar relacionado não a modificações dos resíduos de interação do epítopo com o receptor de imunoglobulina, mas com forças iônicas não específicas entre o epítopo e o receptor de Ig da célula B. A estratégia genérica que descrevemos poderia melhorar a imunogenicidade de muitos epítopos peptídicos complexos.

[00162] Em todo este relatório descritivo, o objetivo tem sido descrever as formas de realização preferidas da invenção sem limitar a invenção a qualquer forma de realização ou coleção específica de características. Várias alterações e modificações podem ser feitas nas formas de realização descritas e ilustradas neste documento sem se afastar do amplo espírito e escopo da invenção.

[00163] Todos os programas de computador, algoritmos, patentes e literatura científica mencionados aqui são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[00164] Referências:

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TABELA 1. P145 E O EPÍTOPO MÍNIMO Comprimento Peptídeo Sequência do peptídeo p145 LRRDLDASREAKKQVEKALE 20 aminoácidos Epítopo mínimo* SREAKKQVEKAL 12 aminoácidos * Um epítopo de célula B mínimo de 12-meros a partir de p145 (31).

TABELA 2. A BIBLIOTECA L2*COM A SEQUÊNCIA DE PEPTÍDEOS INDIVIDUAIS p145 LRRDLDA SREAKKQVEKAL E p*1. LRRDLDA ENEAKKQVEKAL E p*2. LRRDLDA EDEAKKQVEKAL E p*3. LRRDLDA EREAKNQVEKAL E p*4. LRRDLDA EREAKKQVERAL E p*5. LRRDLDA EREAKKQVEMAL E p*6. LRRDLDA VNEAKKQVEKAL E p*7. LRRDLDA VDEAKKQVEKAL E p*8. LRRDLDA VREAKNQVEKAL E p*9. LRRDLDA VREAKKQVERAL E p*10. LRRDLDA VREAKKQVEMAL E p*11. LRRDLDA SNEAKNQVEKAL E p*12. LRRDLDA SNEAKKQVERAL E p*13. LRRDLDA SNEAKKQVEMAL E p*14. LRRDLDA SDEAKNQVEKAL E p*15. LRRDLDA SDEAKKQVERAL E p*16. LRRDLDA SDEAKKQVEMAL E p*17 LRRDLDA SREAKNQVERAL E p*18. LRRDLDA SREAKNQVEMAL E * Cada peptídeo na biblioteca L2 foi projetado com duas alterações de aminoácidos. Os aminoácidos substituídos na sequência p145 original estão sublinhados.

Tabela 3. A biblioteca de peptídeos L1*incluindo 86 variantes de p145 P145. Biotina-SGSGLRRDLDASREAKKQVEKAL E (SEQ ID NO:113)

1. Biotina-SGSGLRRDLDA LREAKKQVEKAL E

2. Biotina-SGSGLRRDLDA AREAKKQVEKAL E

3. Biotina-SGSGLRRDLDA YREAKKQVEKAL E

4. Biotina-SGSGLRRDLDA MREAKKQVEKAL E

5. Biotina-SGSGLRRDLDA EREAKKQVEKAL E

6. Biotina-SGSGLRRDLDA VREAKKQVEKAL E

7. Biotina-SGSGLRRDLDA IREAKKQVEKAL E

8. Biotina-SGSGLRRDLDA SEEAKKQVEKAL E

9. Biotina-SGSGLRRDLDA SQEAKKQVEKAL E

10. Biotina-SGSGLRRDLDA SKEAKKQVEKAL E

11. Biotina-SGSGLRRDLDA SNEAKKQVEKAL E

12. Biotina-SGSGLRRDLDA STEAKKQVEKAL E

13. Biotina-SGSGLRRDLDA SDEAKKQVEKAL E

14. Biotina-SGSGLRRDLDA SRNAKKQVEKAL E

15. Biotina-SGSGLRRDLDA SRKAKKQVEKAL E

16. Biotina-SGSGLRRDLDA SRRAKKQVEKAL E

17. Biotina-SGSGLRRDLDA SRDAKKQVEKAL E

18. Biotina-SGSGLRRDLDA SRQAKKQVEKAL E

19. Biotina-SGSGLRRDLDA SRAAKKQVEKAL E

20. Biotina-SGSGLRRDLDA SRSAKKQVEKAL E

21. Biotina-SGSGLRRDLDA SRTAKKQVEKAL E

22. Biotina-SGSGLRRDLDA SREEKKQVEKAL E

23. Biotina-SGSGLRRDLDA SREKKKQVEKAL E

24. Biotina-SGSGLRRDLDA SREQKKQVEKAL E

25. Biotina-SGSGLRRDLDA SRENKKQVEKAL E

26. Biotina-SGSGLRRDLDA SRERKKQVEKAL E

27. Biotina-SGSGLRRDLDA SREDKKQVEKAL E

28. Biotina-SGSGLRRDLDA SREALKQVEKAL E

29. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAIKQVEKAL E

30. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAMKQVEKAL E

31. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAVKQVEKAL E

32. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAYKQVEKAL E

33. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAAKQVEKAL E

34. Biotina-SGSGLRRDLDA SREANKQVEKAL E

35. Biotina-SGSGLRRDLDA SREARKQVEKAL E

36. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKEQVEKAL E

37. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKDQVEKAL E

38. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKQQVEKAL E

39. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKAQVEKAL E

40. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKNQVEKAL E

41. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKRQVEKAL E

42. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKTQVEKAL E

43. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKEVEKAL E

44. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKDVEKAL E

45. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKKVEKAL E

46. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKNVEKAL E

47. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKRVEKAL E

48. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKAVEKAL E

49. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKSVEKAL E

50. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKTVEKAL E

51. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKHVEKAL E

52. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQLEKAL E

53. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQAEKAL E

54. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQYEKAL E

55. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQMEKAL E

56. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQEEKAL E

57. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQIEKAL E

58. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVQKAL E

59. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVKKAL E

60. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVNKAL E

61. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVRKAL E

62. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVTKAL E

63. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVDKAL E

64. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEEAL E

65. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVENAL E

66. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVERAL E

67. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEDAL E

68. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEQAL E

69. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEAAL E

70. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVESAL E

71. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVETAL E

72. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEMAL E

73. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKEL E

74. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKKL E

75. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKQL E

76. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKNL E

77. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKRL E

78. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKDL E

79. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKAI E

80. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKAM E

81. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKAV E

82. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKAY E

83. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKAK E

84. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKAA E

85. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKAN E

86. Biotina-SGSGLRRDLDA SREAKKQVEKAR E

87.Biotina-SGSGEGKVSTLPLDIQIIAATMSK * A biblioteca L1 foi projetada com uma substituição de aminoácidos em cada uma das 86 variantes de p145. O aminoácido substituído está sublinhado. A biotina e os aminoácidos extras SGSG foram incluídos na extremidade N-terminal. O peptídeo 87 é um peptídeo não específico (pNS) do Schistosoma.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA PROVOCAR UMA RESPOSTA IMUNE DA MUCOSA ÀS BACTÉRIAS ESTREPTOCÓCICAS DO GRUPO A em um mamífero, caracterizado pelo referido método incluir a etapa de administrar: uma proteína isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos do peptídeo p145 modificada compreendendo uma substituição de aminoácidos dos resíduos 13 e 17 de SEQ ID NO: 3; um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ou um ácido nucleico isolado que codifica a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ao mamífero para assim provocar a resposta imune na mucosa.

2. MÉTODO PARA INDUZIR IMUNIDADE NA MUCOSA contra uma infecção bacteriana estreptocócica do grupo a em um mamífero, caracterizado pelo referido método incluir a etapa de administrar: uma proteína isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos do peptídeo p145 modificada compreendendo uma substituição de aminoácido dos resíduos 13 e 17 de SEQ ID NO: 3; um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ou um ácido nucleico isolado que codifica a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ao mamífero para assim induzir imunidade da mucosa contra a infecção bacteriana estreptocócica do grupo A no mamífero.

3. MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE UMA INFECÇÃO bacteriana estreptocócica do grupo a em um mamífero, caracterizado pelo referido método incluir a etapa de administrar: uma proteína isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos do peptídeo p145 modificada compreendendo uma substituição de aminoácidos dos resíduos 13 e 17 de SEQ ID NO: 3; um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ou um ácido nucleico isolado que codifica a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ao mamífero para assim prevenir ou tratar a infecção bacteriana estreptocócica do grupo A no mamífero, em que a administração da proteina isolada provoca a resposta imune da mucosa e/ ou induz a imunidade à infecção bacteriana estreptocócica do grupo A no mamífero.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por administrar: uma proteína isolada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um fragmento ou variante da mesma; um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; ou um ácido nucleico isolado que codifica a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; é administrado ao mamífero por via intramuscular e/ ou subcutaneamente.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela imunidade da mucosa ou resposta imune da mucosa ter como característica a produção de IgG da mucosa.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela imunidade da mucosa ou resposta imune da mucosa ter como característica a ausência substancial de IgA da mucosa ou pelo menos produção reduzida de IgA.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela sequência de aminoácidos do peptídeo P145 modificada compreender um aminoácidos asparagina (N) no resíduo 13 e um aminoácido arginina (R) no resíduo 17.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela sequência de aminoácidos do peptídeo p145 modificada ser apresentada na SEQ ID NO: 1.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fragmento compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo peptídeo, variante ou fragmento de p145 modificado ser conjugado, acoplado ou de outro modo ligado a uma proteína transportadora.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela proteína transportadora ser a toxina da difteria, a proteína CRM ou um fragmento da mesma.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por incluir ainda a administração de um fragmento imunogênico de uma proteina SpyCEP.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fragmento de SpyCEP ser ou compreender um peptídeo S2 (SEQ ID NO: 23) ou uma variante do mesmo.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela variante ser um peptídeo K4S2 (SEQ ID NO: 24).

15. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender: uma proteína isolada compreendendo: uma proteína isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos do peptídeo p145 modificada compreendendo uma substituição de aminoácidos dos resíduos 13 e 17 de SEQ ID NO: 3, um fragmento ou variante da mesma, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma ou um ácido nucleico isolado que codifica a proteína isolada ou fragmento ou variante da mesma; e um fragmento imunogênico de uma proteína SpyCEP ou variante da mesma, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ou é produzido contra o fragmento imunogênico de SpyCEP ou variante do mesmo ou um ácido nucleico isolado que codifica o fragmento imunogênico SpyCEP ou variante do mesmo.

16. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela sequência de aminoácidos do peptídeo p145 modificada compreender um aminoácido asparagina (N) no resíduo 13 e um aminoácido arginina (R) no resíduo 17.

17. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pela sequência de aminoácidos do peptídeo p145 modificada ser apresentada na SEQ ID NO: 1.

18. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fragmento do peptídeo p145 modificado compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

19. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada pelo peptídeo, variante ou fragmento p145 modificado ser conjugado, acoplado ou de outro modo ligado a uma proteína transportadora.

20. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pela proteína transportadora ser a toxina da difteria, a proteína CRM ou um fragmento da mesma.

21. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizada pelo fragmento de SpyCEP ser ou compreender um peptídeo S2 (SEQ ID NO: 23) ou uma variante do mesmo.

22. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pela variante ser um peptídeo K4S2 (SEQ ID NO: 24).

23. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizada por compreender ainda um adjuvante.

24. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizada por ser adequada para administração intramuscular e/ ou administração subcutânea.

25. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 24, caracterizada por ser para uso de acordo com o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.