WO2005054282A1 - Proteína nmb0928 y su uso en formulaciones farmaceuticas - Google Patents

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Rolando PAJÓN FEYT
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
Gretel Sardiñas García
Lázaro Hiram BETANCOURT NÚÑEZ
Lila Rosa Castellanos Serra
Yasser PERERA NEGRÍN
Darién GARCÍA DÍAZ
Olivia NIEBLA PÉREZ
Evelin CABALLERO MENÉNDEZ
Sonia González Blanco
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Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
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Definitions

  • the present invention is related to the branch of medicine, particularly with the development of new combined formulations, of preventive or therapeutic application, that allow an increase in the quality of the immune response against vaccine antigens against diseases of diverse origin.
  • Neisseria meningitidis a Gram negative diplococcus whose only host is man, is the causative agent of meningococcal meningitis. This bacterium is usually found in an asymptomatic carrier state in the population, this being the most common route for its microbiological isolation.
  • meningococcal meningitis Children under 2 years of age worldwide are the population most susceptible to contracting meningococcal meningitis, however, young adolescents and the elderly population may also be affected. Untreated meningococcal disease is fatal in most affected individuals, and vaccination could prevent this situation by avoiding even stages as early as bacterial colonization.
  • capsular polysaccharides have been studied and evaluated as vaccine candidates.
  • a tetravalent, polysaccharide-based vaccine that confers protection against serogroups A, C, Y, and W-135 has been licensed in the United States.
  • Antibodies that are generated after vaccination are serogroup- specific (Rosenstein N. et al. 2001. Menningococcal disease. N. Engl. J. Med, 344, 1378-1388).
  • Serogroup B unlike the rest, continues to be an important cause of endemic and epidemic meningococcal disease, largely due to the lack of effective vaccines against it.
  • the serogroup B polysaccharide has been shown to possess low immunogenicity, in addition to the theoretical risk that vaccines based on this compound could develop immunotolerance and induce autoimmunity given their structural homology to oligosaccharide chains present in human fetal structures (Finne J. ef al 1987. An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tissues. J. Immunol, 138: 4402-4407).
  • Vaccines composed of outer membrane vesicles were significantly more immunogenic parenterally than PME aggregates, and this immunogenicity was initially explained by increased adsorption to the adjuvant aluminum hydroxide (Wang LY and Frasch CE. 1984. Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model .. Infect Immun. 46 (2): 408-14136).
  • Several efficacy studies have been carried out using vaccines based on outer membrane vesicles, in different formulations. The two most widely studied vaccines were developed in the 1980s in response to outbreaks of meningococcal disease in Cuba (Sierra GV et al. 1991.
  • Vaccine against group B Neisseria meningitidis protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14 (2): 195-210) and Norway (Bjune G, et al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338 (8775): 1093-6), respectively.
  • the vaccine produced by Instituto Finlay in Cuba (commercially called VA-MENGOC-BC ® ) is produced from strain B: 4: P1.19,15 and is composed of a PME preparation of said strain and isolated capsular polysaccharide from serogroup C, adsorbed to aluminum hydroxide (Sierra GV et al. 1991.
  • Vaccine against group B Neisseria meningitidis protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14 (2): 195-210). This vaccine contributed to a rapid decline in the epidemic in Cuba (Rodr ⁇ guez AP, et al. The epidemiológica! Impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba. 1999. Mem Inst Oswaldo Cruz. 94 (4): 433-40).
  • the vaccine produced by the Norwegian National Institute of Public Health (NIPH) was initially used during a hyperendemic period of the disease caused by a strain belonging to the ET-5 clone (B: 15: P1.7,16).
  • This monovalent vaccine was also produced from purified EMVs and adsorbed to aluminum hydroxide (BjuneG, et al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group S meningococcal disease in Norway. Lancet. 338 (8775): 1093-6) .
  • VME vaccines appear to be effective in presenting PME, arranged in their natural conformation, to allow the generation of bactericidal antibodies, by less in adolescents and adults. Antibody responses generated increased meningococcal opsonophagocytosis.
  • the precise formulation of the vaccines (for example: PME content, LPS content and the presence or absence of the adjuvant) has a significant impact on immunogenicity, with large differences from one producer to another depending on the strain and / or the methodology used ( Lehmann AK, et al. 1991. Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence. APMIS. 99 (8): 769-72, Gómez JA, et al. 1998.
  • EMV vaccines have been more widely used than any other serogroup B vaccine and are useful in the context of outbreaks of disease caused by a single strain type.
  • the immunogens responsible for the cross reactivity induced by this type of preparations have not been fully characterized, and many antigens present in these preparations remain to be identified.
  • Studies conducted with sera from Finlay Institute and NIPH clinical trials suggest that antibodies to class 1 protein (P1, also called PorA) and Opc (another major PME) (Wedege E, et al. 1998. Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infec ⁇ Immun. 66 (7): 3223-31), are important mediators of serum bactericidal activity (mainly P1 ) and in both proteins a marked variability from strain to strain was observed.
  • Proiein P1 is an antigen with a significant level of variability, which seems to experience continuous variation between and during outbreaks (Jelfs J, et al. 2000. Sequence Variation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningi ⁇ idis during Epidemic Spread. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3): 390-5) and towards which the bacfericidal antibodies are predominantly directed after vaccination (and after disease), therefore the projection caused by immunization with single-strain (monovalent) EMV vaccines ), which could be specific serosubipty (for example dependent on the type of P1), becomes questionable.
  • an EMV vaccine was developed in the Netherlands (RIVM) that contained P1 of six different payogenic isolates (Van Der Ley P and Poolman JT. 1992. Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein . Infec ⁇ Immun. 60 (8): 3156-61, Claassen I, et al. 1996. Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine. 14 (10): 1001-8 ). In this case, the vesicles were extracted from two variants of the H44 / 76 strain, genetically manipulated to express independent P1 protein proteins. The search for a universal antigen
  • outer membrane propheines can induce a functional immune response against serogroup B
  • none of the vaccines confers universal protection, due to the great heterogeneity of the exposed regions on the surface of PMEs.
  • the discreet cross-reactivity induced by the outer membrane vesicle (EMV) vaccines has encouraged the search for an outer membrane antigen (or a group of antigens), which induces functional antibodies and is present in all strains of meningococcus.
  • EMV outer membrane vesicle
  • TbpA and B are part of the transferrin binding complex, along with TbpA.
  • TbpA has a more important role in iron binding (Pintor M, et al. 1998. Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutants of Neisseria meningitidis. J Med Microbe!
  • NspA was detected by ELISA in 99.2% of the tested strains belonging to serogroups from A to C, using monoclonal antibodies (Martin D, et al. 1997. Highly conserveed Neisseria meningitidis Sur ⁇ ace Protein Confers Protection against Experimental Infection J Exp Med 185 (7): 1173-83). These monoclonal antibodies have been shown to have bactericidal activity against numerous strains of meningococcus and to be able to reduce bacteremia caused by this microorganism in a murine model (Cadieux N, et al. 1999.
  • Vaccines consisting of a single protein have been used for decades and have generally shown good stability, but this may vary if the presentation of the proteins in the form of vesicles is required to ensure that the antigens remain bound to the membrane.
  • the immunogenicity and reactogenicity of VME can vary with alterations in the amount of protein and LPS removed during the purification process.
  • the construction of synthetic liposomal vesicles allows the optimization and standardization of these vaccines (Christodoulides M, et al. 1998.
  • Intramuscular injection of the meningococcal vaccine has been the route used that allows the production of systemic immunoglobulin G (IgG), although the production of secretory IgA is important, since during meningococcal infection the invasion of the host occurs via the nasal epithelium . Genome sequencing of N. meningitidis
  • Genome sequencing of MC58 (a meningococcal strain of serogroup B) (Tettelin H, et al. 2000. Complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science 287 (5459): 1809-15172) and Z2491 (a serogroup A strain) (Parkhill J, et al. 2000. Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature 404 (6777): 502-6173) were published in 2000. The availability of the DNA has a great influence on the research of a meningococcal vaccine. As sequencing of the MC58 genome continued to develop, Pizza et al.
  • ORFs open reading frames
  • This group of researchers identified 570 ORFs, amplified through the polymerase chain reaction and cloned them in Escherichia coli, to allow the expression of histidine tail or glutathione S-transferase fusion proteins (Pizza M, et al. 2000. Identification of Vaccine Candidates against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequencing. Science 287 (5459): 1816-20). 61% (350) of the selected ORFs were successfully expressed, in most cases those that failed to express themselves had more than one hydrophobic transmembrane domain.
  • Recombinant proteins were purified and used to immunize mice. The sera obtained were evaluated by ELISA, flow cytometry and bactericidal activity against 2 strains was determined. Subsequently, 7 proteins were selected, which in all 3 tests were positive. Vaccine formulations using some of these proteins combined with adjuvants, induced significant bactericidal antibody titers against the homologous strain (MC58), but none of them was as high as those induced by an EMV vaccine of this same strain (Giuliani MM, e ⁇ al. 2000. Proceedings 12th I PNC. p. 22). On the other hand, there is evidence that combinations of these proteins are more immunogenic than each protein separately (Santini L. et al. 2000. Proceedings 12th IPNC.
  • the components of a vaccine should be selected based on the contribution of antigens in the pathogenesis of N. meningitidis. Antigens alone can be effective vaccine candidates, or alternatively, attenuated mutants can be considered members of a vaccine. In this sense, the use of candidates whose sequence is highly conserved even between different genres of pathogenic microorganisms, could be a solution to the affectations produced by them if they generate a convenient response by the immune system.
  • the technical objective pursued with this invention is precisely the development of formulations capable of raising and / or expanding the body's immune response against various pathogens or against a wide spectrum of varieties thereof, these pathogens being parasitic, bacterial, and viral. , cancerous or other.
  • the use of the protein NMB0928 is reported for the first time as a component of a vaccine formulation of therapeutic or preventive nature against meningococcal disease or any infection caused by a member of the genus Neisseria .
  • the novelty of this invention resides in the previously unreported use of the NMB0928 protein in formulations with new properties, capable of inducing a systemic and mucosal immune response with a broad protective spectrum, given the conserved character of this protein in different isolates of Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae.
  • Figure 1 Vector pM100 used in cloning and expression of the NMB0928 protein.
  • pTrip tryptophan promoter
  • N-term P64k N-terminal fragment of P64k
  • T4 Terminator T4 bacteriophage transcription terminator.
  • Figure 2 Final construction obtained from the cloning of the nucleotide sequence corresponding to the NMB0928 gene in vector pM100.
  • Figure 3 Analysis by SDS-PAGE of the fractions obtained in the cell disruption; lane 1, disruption supernatant; lane 2, precipitate of rupture.
  • Figure 4 SDS-PAGE analysis of the solubilization process of the NMB0928 protein from the breaking precipitate: (A) lane 1, breaking precipitate; lane 2, precipitate from the wash with TE1X buffer solution containing 3M urea; lane 3, soluble fraction of the wash; (B) lane 1, solubilization supernatant with TE1X buffer solution containing 6M urea; lane 2, solubilization precipitate.
  • FIG. 1 Western blotting recognition of the NMB0928 protein present in the N. meningitidis PME using sera from mice immunized with the recombinant protein: The arrow indicates the band corresponding to the immuno-identified NMB0928 protein.
  • FIG. 7 IgA antibody response against the recombinant protein NMB0928, at the mucosal level, in mice immunized with the antigen intranasally. The results are expressed as the inverse of the titer, calculated as that dilution of the sample where the optical density of the preimmune sample is doubled.
  • A IgA antibody response in saliva.
  • B IgA antibody response in lung lavages
  • Figure 8 Results of the similarity search between the NMB0928 gene (“query”) and the annotated sequences of the genomes of different serogroups of Neisseria meningitidis (“Sbjct”) using the BLAST program.
  • Figure 9 Recognition of the NMB0928 protein in different N. meningitidis strains, by sera produced against the recombinant antigen. The graph only shows the values obtained when immunized with the semi-purified protein intraperitoneally, although a similar behavior was observed in the rest of the cases. The results were expressed as the inverse of the titer, calculated as the dilution of the serum where the optical density of the preimmune serum is doubled.
  • Figure 10 Comparison between the sera obtained by immunizing with the protein obtained by two procedures, administered intraperitoneally, in the passive protection experiment against meningococcal infection, in the infant rat model.
  • Figure 11 Recognition of NMB0928 protein, and of a panel of unrelated antigens, by the generated mAbs (mAbs E45-8-15, 2G23-12).
  • P1 Neisseria meningitidis strain B class 4 protein: 4: P1.15; P64k, Neisseria meningitidis pyruvate dehydrogenase enzyme E3 subunit; T.T, tetanus toxoid; HBsAg, Hepatitis B virus surface antigen.
  • Http //prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound).
  • the search was subscribed to the bacterial gene and protein sequences contained in the SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) and NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih .gov /), considering the oxidation of methionines, the deamidation and the carboxyamidomethylation of cisterns as possible present modifications.
  • Protein identification based on MS / MS spectra was performed through the MASCOT program (Perkins DN, et al. 1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20: 3551-3567. Http : //www.matrixscience.com/). Search parameters included the modification of cisterns as well as possible oxidations and deamidations. From the analysis of the data obtained from the identification of the proteins present in preparations of outer membrane vesicles, we selected to evaluate the protein NMB0928 as a possible vaccine candidate, from which 1 peptide mass spectrometry was identified.
  • Example 2 From the analysis of the data obtained from the identification of the proteins present in preparations of outer membrane vesicles, we selected to evaluate the protein NMB0928 as a possible vaccine candidate, from which 1 peptide mass spectrometry was identified.
  • Neisseria meningitidis For the identification of the NMB0928 protein, a sequence similarity search was performed in the NCBI database using the BLAST program (Altschul SF, et al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403 -410, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
  • the pM-100 vector ( Figure 1) has the following main elements: tryptophan promoter, sequence corresponding to the N-terminal stabilizing segment of the P64k antigen of N. meningitidis strain B: 4: P1.19,15 coding for 47 aa, sequence corresponding to the transcription terminator of bacteriophage T4 and sequence corresponding to the gene that confers resistance to ampicillin as a selection marker.
  • a pair of oligonucleotides (7740 and 7741) was designed to amplify the segment of said gene without the sequence encoding the signal peptide, using the genomic DNA of strain B: 4: P1.19, 15.
  • Sequencing of the cloned NMB0928 gene segment was performed using the ALFexpressIl automated sequencer (Termo Sequenase TM Cy TM 5 Dye Terminator Kit, Amersham Biosciences) and oligonucleotides 1573 (Sequence ID No.: 8) and 6795 (Sequence ID No. : 9), which hybridize in the sequence corresponding to the stabilizing segment of P64k and in the transcription terminator of bacteriophage T4, respectively.
  • the plasmid obtained was named pM-242 for its subsequent use.
  • the E. coli GC 366 strain was transformed with the plasmid pM-242 ( Figure 2).
  • the precipitate was then washed with a 1X TE buffer solution (10mM Tris-hydroxymethyl amino methane, 1mM ethylenediamine tetracetic acid, pH 8) containing 2M urea whereby some contaminants passed into the supernatant while the protein of interest remained in the precipitate (Fig 4A). Then said precipitate was solubilized with a TE1X buffer solution containing 6M urea, passing the NMB0928 protein to the soluble fraction that was dialyzed against a TE1X buffer solution, finally obtaining 70% purity as can be seen in Figure 4B.
  • 1X TE buffer solution 10mM Tris-hydroxymethyl amino methane, 1mM ethylenediamine tetracetic acid, pH 8) containing 2M urea
  • mice In which the same protein obtained by two different methods was administered. The first consisted of extracting the band from a polyacrylamide gel (Castellanos L, et al. 1996. A procedure for protein elution from reverse-stained polyarcylamide gels applicable at the low picomole level: An alternative route to the preparation of low abundance proteins for microanalysis, Electrophoresis 17: 1564-1572) and the second was reported in Example 3, the product of which was denoted as semi-purified protein.
  • mice Female Balb / c mice, 8-10 weeks old, were immunized with these preparations, which were divided into 4 groups of 8 mice each. 3 immunizations were performed intranasally or intraperitoneally, separated by an interval of 15 days. The protein administered intraperitoneally was mixed with Freund's adjuvant. Table 1 describes the composition of the groups:
  • the antibody titers (IgG), against the recombinant protein and the homologous protein present in the bacteria were determined by means of an ELISA type assay in sera obtained after the third inoculation.
  • Figure 5 shows the Antibody titers of each of the animals against the recombinant protein. After the second inoculation, antibody levels were detected, although they were higher after the third inoculation. Immunological identification was also performed by Western blotting, detecting the recognition of the band corresponding to the protein. The groups immunized intraperitoneally presented antibody titers significantly higher than the groups inoculated intranasally.
  • Figure 8 shows the results of sequence comparison for those sequences that produce a significant alignment in each of the genomes analyzed. Said sequences show 98% identity in serogroups A and C, 99% identity in serogroup B and 96% identity with Neisseria gonorrhoeae, with the sequence obtained from the gene that encodes the NMB0928 protein (Identification No. sequence: 3).
  • nucleotide sequence of the gene in question was determined for 3 Cuban isolates (Sequence ID No.: 5-7) belonging to serogroup B (B: 4: P1.19,15) and a sequence alignment was performed using the program ClustalX (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). The alignment results show that there is a great conservation in the nucleotide sequence of the NMB0928 gene between the different strains analyzed.
  • NMB0928 protein as a vaccine candidate, taking into account the high degree of similarity between the aforementioned sequences, would generate an effective immune response, and a broad spectrum of protection (product of cross-reactivity), against meningococcal disease .
  • Example 7 Protection induced by the murine sera generated against the NMB0928 protein, against homologous and heterologous strains, in the infant rat model
  • a protection test was performed in the meningococcal infection model in infant rats. In this test 24 rats 5 to 6 days old were used, divided into groups of 6 animals each.
  • mice were administered by the intraperitoneal route protected rats from infection by the bacterium (strain CU385), inoculated by the same route one hour later.
  • the sera from each group of immunized mice were mixed before being inoculated into infant rats and diluted 1/10 in sterile PBS. Four hours after the challenge, the animals were sacrificed and the viable bacteria in the blood were counted.
  • the immunization scheme was performed in Balb / c mice (H-2 d , female sex, 5-6 weeks) and had a total of 4 doses distributed as follows: on days 0, 15 and 30 of the scheme 10 ⁇ g of the NMB0928 antigen per mouse (total volume 100 ⁇ l) , administered subcutaneously, the first dose emulsified in Freund's Complete Adjuvant, and the remaining doses with Freund's Incomplete Adjuvant; day 50, 10 ⁇ g of the antigen per mouse in phosphate buffer solution (140 mM NaCl, 270 mM KCI, 1.5 mM KH 2 PO 4 , 6.5 mM Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, pH 7.2) intraperitoneally.
  • phosphate buffer solution 140 mM NaCl, 270 mM KCI, 1.5 mM KH 2 PO 4 , 6.5 mM Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, pH 7.2
  • Extractions were performed on days 0 and 45 of the scheme.
  • bactericidal assay was performed.
  • the bactericidal antibody titer was expressed as the reciprocal of the highest dilution of antibodies evaluated, capable of killing 50% or more of the bacteria;
  • mAb 2G23-12 had bactericidal titers greater than 1: 128 against homologous strain B: 4: P1.19,15 and greater than 1:64 against heterologous strains B: 15: P1.7,16 and C: 2a: P1.5.
  • Example 11 NMB0928 protein as a carrier for a peptide.

Abstract

Uso de un nuevo antígeno vacunal aplicado de manera preventiva o terapéutica contra enfermedades bacterianas, virales, cancerosas, o de otro origen. El objetivo técnico que se persigue es el desarrollo de formulaciones capaces de elevar el espectro protector de las vacunas existentes y extenderlo contra diferentes patógenos. Para lograr este objetivo se aisló e identificó la proteína NMB0928 como componente de las preparaciones de membrana externa de Neisseria meningitidis, capaz de inducir actividad bactericida. Adicionalmente, se clonó y expresó el gen codificante para la proteína NMB0928, la cual se purificó evaluándose luego su inmunogenicidad en biomodelos animales. El secuenciamiento de genes homólogos evidenció, por su elevado grado de conservación, su alto valor como antígeno inductor de una respuesta inmune cruzada cuando es presentado por diferentes vías. Las formulaciones resultantes de esta invención son aplicables en la industria farmacéutica como formulaciones vacunales para uso humano.

Description

MEMORIA DESCRIPTIVA:
PROTEÍNA NMB0928 Y SU USO EN FORMULACIONES FARMACÉUTICAS.
La presente invención está relacionada con la rama de la medicina, particularmente con el desarrollo de nuevas formulaciones combinadas, de aplicación preventiva o terapéutica, que permitan un aumento en la calidad de la respuesta inmune contra antígenos vacunales contra enfermedades de origen diverso. Neisseria meningitidis, un diplococo Gram negativo cuyo único hospedero es el hombre, es el agente causal de la meningitis meningocóccica. Usualmente esta bacteria se encuentra en estado de portador asintomático en la población, siendo esta la vía más común para su aislamiento microbiológico.
En el mundo los niños menores de 2 años de edad son la población más susceptible a contraer la meningitis meningocóccica, sin embargo, los adolescentes jóvenes y la población de adultos mayores también pueden ser afectados. La enfermedad meningocóccica sin tratamiento es fatal en la mayoría de los individuos afectados, y la vacunación podría prevenir esta situación evitando incluso etapas tan tempranas como la colonización bacteriana.
Diversas estrategias se han desarrollado con el objetivo de obtener un preparado vacunal que satisfaga los requisitos necesarios para proteger a la población contra esta enfermedad. Para ello se han tenido en cuenta los antígenos capsulares cuya especificidad inmunológica ha permitido la clasificación de este microorganismo en serogrupos. En la actualidad se han definido 5 de estos serogrupos como los responsables de la mayoría de los casos de enfermedad meningocóccica en el mundo. El serogrupo A es el principal responsable de las epidemias en África subsahariana. Los serogrupos B y C están asociados a la mayor parte de los casos que ocurren en los países desarrollados. Los serogrupos Y y W135 están presentes en la mayoría de los casos remanentes de la enfermedad y de infección prevalente en algunas regiones de los Estados Unidos, con un marcado incremento en los últimos años. De ahí que los polisacáridos capsulares hayan sido objeto de estudio y evaluación como candidatos vacunales. Una vacuna tetravalente, basada en polisacáridos, que confiere protección contra los serogrupos A, C, Y, y W-135 ha sido licenciada en los Estados Unidos. Los anticuerpos que son generados tras la vacunación son serogrupo- específico (Rosenstein N. et al. 2001. Menningococcal disease. N. Engl. J. Med, 344, 1378-1388).
El serogrupo B, a diferencia del resto, continúa siendo una importante causa de enfermedad meningocóccica endémica y epidémica, en gran parte debido a la no existencia de vacunas efectivas contra el mismo. Se ha visto que el polisacárido del serogrupo B posee una baja inmunogenicidad, además del riesgo teórico que existe de que vacunas basadas en este compuesto podrían desarrollar ¡nmunotolerancia e inducir autoinmunidad dada su homología estructural con cadenas oligosacarídicas presentes en estructuras fetales humanas (Finne J. ef al. 1987. An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisúes. J. Immunol, 138: 4402-4407). Por este motivo, el desarrollo de vacunas contra el serogrupo B se ha concentrado en el uso de antígenos subcapsulares. Vacunas de vesículas y proteínas de membrana externa En la década de los años 70 la producción de vacunas de proteínas de membrana externa (PME), estuvo basada en la eliminación del lipopolisacárido (LPS) de las preparaciones proteicas mediante la utilización de detergentes (Frasch CE and Robbins JD. 1978. Protection against group B meningococcal disease. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection in a guinea pig model. J Exp Med 147(3):629-44). Después, las PME fueron precipitadas para producir agregados resuspendidos en cloruro de sodio. A pesar de los buenos resultados obtenidos en estudios realizados en animales, estas vacunas no indujeron anticuerpos bactericidas ni en adultos ni en niños (Zollinger WD, et al. 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animáis and humans. J. Infect. Dis. 137(6):728-39), resultado que fue atribuido a la desnaturalización de las proteínas presentes en la preparación como resultado de la precipitación. Los próximos pasos en la búsqueda de un nuevo candidato, fueron: diseñar una vacuna que presenta las proteínas en su conformación nativa formando vesículas de membrana externa (Zollinger WD, et al. 1979. Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48, Wang LY and Frasch CE. 1984. Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infecí Immun. 46(2):408-14136).
Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa (VME) fueron significativamente más inmunogénicas por vía parenteral que los agregados de PME, y esta ¡nmunogenicidad fue explicada inicialmente por una mayor adsorción al adyuvante hidróxido de aluminio (Wang LY and Frasch CE. 1984. Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model.. Infect Immun. 46(2):408-14136). Varios estudios de eficacia se han llevado a cabo utilizando vacunas basadas en vesículas de membrana externa, en diferentes formulaciones. Las dos vacunas más ampliamente estudiadas fueron desarrolladas en los años 80 en respuesta a brotes de la enfermedad meningocóccica en Cuba (Sierra GV et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2):195-210) y Noruega (Bjune G, et al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6), respectivamente. La vacuna producida por en Instituto Finlay en Cuba (comercialmente denominada VA-MENGOC-BC®) es producida a partir de la cepa B:4:P1.19,15 y está compuesta por una preparación de PME de dicha cepa y polisacárido capsular aislado del serogrupo C, adsorbidas a hidróxido de aluminio (Sierra GV et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2): 195-210). Esta vacuna contribuyó a un rápido descenso de la epidemia en Cuba (Rodríguez AP, et al. The epidemiológica! impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba.1999. Mem Inst Oswaldo Cruz. 94(4):433-40). La vacuna producida por el Instituto Nacional de Salud Pública de Noruega (NIPH) fue ¡nicialmente utilizada durante un período hiperendémico de la enfermedad causada por una cepa perteneciente al clon ET-5 (B:15:P1.7,16). Esta vacuna monovalente también fue producida a partir de VME purificadas y adsorbidas a hidróxido de aluminio (BjuneG, et al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group S meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6).
Las vacunas de VME parecen ser efectivas en la presentación de PME, dispuestas en su conformación natural, para permitir la generación de anticuerpos bactericidas, al menos en adolescentes y adultos. Las respuestas de anticuerpos generadas, incrementaron la opsonofagocitosis del meningococo. La formulación precisa de las vacunas (por ejemplo: contenido de PME, contenido de LPS y la presencia o ausencia del adyuvante) tiene un significativo impacto en la inmunogenicidad existiendo grandes diferencias de un productor a otro según la cepa y/o la metodología empleada (Lehmann AK, et al. 1991. Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence. APMIS. 99(8):769-72, Gómez JA, eí al. 1998. Effect of adjuvants in the isotypes and bacterícidal activity of antibodies against the transferrin-binding proteins of Neisseria meningitidis. Vaccine.16(17): 1633-9, Steeghs L, et al. 1999. Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitidis; Influence of Adjuvants on the Immune Response. Infect Immun. 67(10):4988-93). Sin embargo, el perfil antigénico de los aislamientos obtenidos de pacientes cambia rápidamente y una vacuna abarca sólo un limitado número de cepas, por tanto puede ser inefectiva en unos años si las cepas que la componen no se corresponden con la epidemia local existente.
Hasta el momento, las vacunas de VME han sido más utilizadas que cualquier otra vacuna del serogrupo B y son útiles en el contexto de los brotes de la enfermedad causada por un solo tipo de cepa. Los inmunógenos responsables de la reactividad cruzada inducida por este tipo de preparados no han sido completamente caracterizados, y muchos antígenos presentes en estos preparados restan por ser identificados. Estudios realizados con los sueros provenientes de ensayos clínicos del Instituto Finlay y el NIPH, sugieren que los anticuerpos contra la proteína de clase 1 (P1, también llamada PorA) y Opc (otra PME mayoritaria) (Wedege E, eí al. 1998. Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infecí Immun. 66(7): 3223-31), son importanfes mediadores de la actividad bactericida del suero (fundamentalmente P1) y en ambas proteínas se observó una marcada variabilidad de cepa a cepa.
La proíeína P1 es un antígeno con un significativo nivel de variabilidad, el cual parece experimeníar variación continua entre y durante los brotes (Jelfs J, et al. 2000. Sequence Variation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningiíidis during Epidemic Spread. Clin Diagn Lab Immunol. 7(3):390-5) y hacia el cual van dirigidos predominanfemeníe los aníicuerpos bacfericidas después de la vacunación (y después de la enfermedad), por lo que la proíección producto de la inmunización con vacunas de VME de una sola cepa (monovalentes), las cuales pudieran ser serosubíipo específica (por ejemplo dependientes del tipo de P1), se hace cuestionable. Para resolver este problema se desarrolló una vacuna de VME en Holanda, (RIVM) que coníenía P1 de seis aislamieníos paíogénicos diferenfes (Van Der Ley P and Poolman JT. 1992. Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein. Infecí Immun. 60(8):3156-61, Claassen I, et al. 1996. Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine. 14(10):1001-8). En este caso las vesículas fueron extraídas de dos variantes de la cepa H44/76, genéíicameníe manipulada para expresar fres proteínas P1 independientes. La búsqueda de un antígeno universal
Aunque las profeínas de membrana externa (PME) pueden inducir una respuesta inmune funcional contra el serogrupo B, ninguna de las vacunas confiere una protección universal, debido a la gran heterogeneidad de las regiones expuestas en la superficie de las PME. La discreta reactividad cruzada inducida por las vacunas de vesículas de membrana externa (VME) ha incentivado la búsqueda de un antígeno de membrana externa (o de un grupo de antígenos), que induzca anticuerpos funcionales y esté presente en todas las cepas del meningococo. Estos antígenos deben ser la base para una vacuna antimeningocóccica realmente universal, la cual eliminará el potencial problema de la modificación capsular en las cepas patogénicas, después de la vacunación con polisacárido.
Debido a la variabilidad de la proteína inmunodominante P1, su uso en una vacuna universal esta limitado, y por tanto otras PME mayoritarias fueron consideradas candidatos para una vacuna y muchas de ellas se encuentran en desarrollo. Algunas de las que han sido incluidas son: proteínas de clase 5 (Opc), NspA y proteínas reguladas por hierro (TbpA y B, FbpA y FetA). TbpB forma parte del complejo de unión de transferrina, junto con TbpA. Recientes trabajos sugieren que la TbpA tiene una función más importante en la unión al hierro (Pintor M, et al. 1998. Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutants of Neisseria meningitidis. J Med Microbio! 47(9): 757-60) y es un inmunogéno más efectivo que la TbpB. Una PME minoritaria, altamente conservada, ha sido descubierta a través de una técnica novedosa, la que consiste en emplear combinaciones de PME provenientes de diferentes cepas para inmunizar ratones (Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Suríace Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Se utilizaron células B de ratones inmunizados para producir hibridomas, y los mAbs se examinaron para evaluar la reactividad cruzada contra múltiples cepas del meningococo. Como resultado se encontró un anticuerpo monoclonal con reactividad cruzada que reconoció una PME de 22 kDa y fue designada como NspA. La inmunización con la proteína NspA indujo respuesta de anticuerpos bactericidas en ratones contra las cepas de los grupos A hasta C y también protege contra la infección meningocóccica letal (Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Suríace Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). La comparación de secuencias de NspA, genéticamente divergentes, demostró que la proteína está altamente conservada (97% homología) (Cadieux N, et al. 1999. Bactericidal and Cross- Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neissería meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infecí Immun 67 (9): 4955-9). La presencia de NspA se detectó por ELISA en un 99.2% de las cepas testadas pertenecientes a los serogrupos desde la A hasta la C, utilizando anticuerpos monoclonales (Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Suríace Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173- 83). Se ha comprobado que estos anticuerpos monoclonales presentan actividad bactericida contra numerosas cepas del meningococo y son capaces de reducir la bacteriemia provocada por este microorganismo en un modelo murino (Cadieux N, et al. 1999. Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infecí Immun 67 (9): 4955-9). Aunque estos resultados sugieren que la NspA es un prometedor candidato vacunal capaz de conferir protección contra varios serogrupos, un suero policlonal de ratón contra la proteína recombinante, no se asoció a la superficie en un 35% de las cepas de meningococo del serogrupo B, a pesar de la presencia del gen nspA en estos organismos (Moe GR eí al. 1999. Differences in Suríace Expression of NspA among Neissería meningitidis Group B Strains. Infect Immun 67 (11): 5664-75).
Presentación de los antígenos y la formulación de la vacuna. Los primeros trabajos sugirieron que la forma en que los antígenos eran presentados era muy importante para generar una respuesta inmune. Los epitopos presentes en las proteínas que se encuentran unidas a la membrana, en muchos casos, dependen de la correcta estructura terciaria y la misma a su vez, depende frecuentemente de los dominios hidrofóbicos unidos a la membrana. Este efecto se ha demostrado en preparaciones de PME que resultan inmunogénicas en humanos, sólo cuando se presentan en forma de vesículas (Zollinger WD, et al. 1979. Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J Clin Invest 63 (5): 836-48, Zollinger WD, eí al. 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animáis and humans. J Infect Dis 137 (6): 728-39).
Durante décadas se han utilizado vacunas integradas por una sola proteína y generalmente han mostrado buena estabilidad, pero la misma puede variar si se requiere la presentación de las proteínas en forma de vesículas para lograr que los antígenos permanezcan unidos a la membrana. La inmunogenicidad y reactogenicidad de las VME puede variar con alteraciones en la cantidad de proteínas y LPS eliminadas durante el proceso de purificación. La construcción de vesículas liposomales sintéticas permite la optimización y estandarización de dichas vacunas (Christodoulides M, et al. 1998. Immunization with recombinant class 1 outer- membrane protein from Neisseria meningitidis: influence of liposomes and adjuvants on antibody avidity, recognition of native protein and the induction of a bactericidal immune response against meningococci. Microbiology 144(Pt 11):3027-37). Es decir, las PME han sido presentadas en forma de vesículas y como proteínas expresadas con un elevado grado de pureza, y en ambos casos se ha logrado desarrollar respuesta de anticuerpos. La inyección intramuscular de la vacuna antimeningocóccica ha sido la vía utilizada que permite la producción de inmunoglobulina G (IgG) sistémica, aunque es importante la producción de IgA secretora, ya que durante la infección meningocóccica la invasión al hospedero ocurre por la vía del epitelio nasal. Secuenciación del genoma de N. meningitidis
La secuenciación del genoma de MC58 (una cepa de meningococo del serogrupo B) (Tettelin H, eí al. 2000. Complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science 287 (5459): 1809-15172) y de Z2491 (una cepa de serogrupo A) (Parkhill J, eí al. 2000. Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature 404 (6777):502-6173) fueron publicadas durante el año 2000. La disponibilidad de las secuencias de ADN tiene una gran influencia en la investigación de una vacuna antimeningocóccica. Mientras la secuenciación del genoma de MC58 continuaba su desarrollo, Pizza y colaboradores comenzaron identificando los marcos abiertos de lectura (ORFs) que fueron predichos para codificar las proteínas expuestas en la superficie, unidas a membrana y las que se exportan. Este grupo de investigadores identificaron 570 ORFs, amplificados a través de la reacción en cadena de la polimerasa y los clonaron en Escherichia coli, para permitir la expresión de proteínas de fusión con cola de histidina o glutatión S- transferasa (Pizza M, et al. 2000. Identification of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequencing. Science 287 (5459): 1816-20). El 61% (350) de los ORFs seleccionados fueron expresados exitosamente, en la mayoría de los casos aquellos que no lograron expresarse, tenían más de un dominio hidrofóbico de transmembrana. Las proteínas recombinantes fueron purificadas y se utilizaron para inmunizar ratones. Los sueros obtenidos fueron evaluados por ELISA, citometría de flujo y se les determinó la actividad bactericida contra 2 cepas. Posteriormente se seleccionaron 7 proteínas que en los 3 ensayos resultaron positivas. Las formulaciones vacunales empleando algunas de estas proteínas combinadas con adyuvantes, indujeron títulos significativos de anticuerpos bactericidas contra la cepa homologa (MC58), pero ninguno de ellos fue tan alto como los inducidos por una vacuna de VME de esta misma cepa (Giuliani MM, eí al. 2000. Proceedings 12th I PNC. p. 22). Por otro lado, existen evidencias de que combinaciones de estas proteínas resultan más inmunogénicas que cada proteína por separado (Santini L. eí al. 2000. Proceedings 12th IPNC. p. 25). Los numerosos ORFs excluidos en ese trabajo, quizás por la falta de la expresión proteica o por modificaciones de las propiedades inmunológicas, necesitan una investigación más profunda. Los componentes de una vacuna deben seleccionarse en base a la contribución de los antígenos en la patogénesis de N. meningitidis. Los antígenos por sí solos pueden ser efectivos candidatos vacunales, o alternativamente, los mutantes atenuados pueden ser considerados integrantes de una vacuna. En este sentido, el empleo de candidatos cuya secuencia esté altamente conservada incluso entre diferentes géneros de microorganismos patógenos, podría resultar una solución a las afectaciones producidas por los mismos en caso de que generen una conveniente respuesta por parte del sistema inmune.
El objetivo técnico que se persigue con esta invención es precisamente el desarrollo de formulaciones capaces de elevar y/o ampliar la respuesta inmune del organismo contra varios patógenos o contra un espectro amplio de variedades del mismo, siendo estos patógenos de carácter parasitario, bacteriano, viral, canceroso u otro.
Descripción detallada de la invención En el trabajo objeto de la presente invención se reporta por primera vez el uso de la proteína NMB0928 como componente de una formulación vacunal de carácter terapéutico o preventivo contra la enfermedad meningocóccica o de cualquier infección provocada por un miembro del género Neisseria. El carácter novedoso de esta invención reside en el uso, previamente no reportado, de la proteína NMB0928 en formulaciones con nuevas propiedades, capaces de inducir una respuesta inmune sistémica y mucosal de amplio espectro protector, dado el carácter conservado de esta proteína en diferentes aislamientos de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Vector pM100 empleado en el clonaje y la expresión de la proteína NMB0928. pTrip, promotor triptófano; N-term P64k, fragmento N-terminal de la P64k; T4 Terminator, terminador de la transcripción del bacteriófago T4.
Figura 2. Construcción final obtenida del clonaje de la secuencia nucleotídica correspondiente al gen NMB0928 en el vector pM100. Figura 3. Análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en la ruptura celular; carril 1 , sobrenadante de ruptura; carril 2, precipitado de ruptura.
Figura 4. Análisis mediante SDS-PAGE del proceso de solubilización de la proteína NMB0928 a partir del precipitado de ruptura: (A) carril 1, precipitado de ruptura; carril 2, precipitado del lavado con solución tampón TE1X que contiene urea 3M ; carril 3, fracción soluble del lavado; (B) carril 1, sobrenadante de solubilización con solución tampón TE1X que contiene urea 6M; carril 2, precipitado de solubilización.
Figura 5. Niveles de anticuerpos (IgG) contra la proteína recombinante NMB0928, obtenidos al inmunizar ratones con el mismo antígeno por vía intranasal o intraperitoneal. Se representan los resultados obtenidos en un ensayo tipo ELISA, que fueron expresados como el inverso del título, calculado como la dilución de la muestra donde se duplica la densidad óptica de la muestra preinmune.
Figura 6. Reconocimiento por Western blotting de la proteína NMB0928 presente en las PME de N. meningitidis utilizando sueros de ratones inmunizados con la proteína recombinante: La flecha indica la banda correspondiente a la proteína NMB0928 inmunoidentificada.
Figura 7. Respuesta de anticuerpos IgA contra la proteína recombinante NMB0928, a nivel mucosal, en ratones inmunizados con el antígeno por vía intranasal. Los resultados se expresan como el inverso del título, calculado como aquella dilución de la muestra donde se duplica la densidad óptica de la muestra preinmune. (A) Respuesta de anticuerpos IgA en saliva. (B) Respuesta de anticuerpos IgA en lavados pulmonares
Figura 8. Resultados de la búsqueda de similitud entre el gen NMB0928 ("query") y las secuencias anotadas de los genomas de diferentes serogrupos de Neisseria meningitidis ("Sbjct") empleando el programa BLAST. Figura 9. Reconocimiento de la proteína NMB0928 en diferentes cepas de N. meningitidis, por sueros producidos contra el antígeno recombinante. En el gráfico sólo se muestran los valores obtenidos cuando se inmunizó con la proteína semipurificada por vía intraperitoneal, aunque en el resto de los casos se observó un comportamiento similar. Los resultados fueron expresados como el inverso del título, calculado como la dilución del suero donde se duplica la densidad óptica del suero preinmune.
Figura 10. Comparación entre los sueros obtenidos inmunizando con la proteína obtenida por dos procedimientos, administrada por vía intraperitoneal, en el experimento de protección pasiva contra infección meningocóccica, en el modelo de rata infante.
Figura 11: Reconocimiento de la proteína NMB0928, y de un panel de antígenos no relacionados, por los mAbs generados (mAbs E45-8-15, 2G23-12). P1, proteína de clase 1 de Neissería meningitidis cepa B:4:P1.15; P64k, subunidad E3 de la enzima piruvato deshidrogenasa de Neisseria meningitidis; T.T, toxoide tetánico; HBsAg, antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B.
Figura 12. Reconocimiento de la proteína NMB0928 por sueros de pacientes convalecientes de la enfermedad meningocóccica. Como control negativo se emplearon sueros de donantes sanos. Los resultados se representan como la absorbancia (492nm) en un ensayo tipo ELISA.
Figura 13. Títulos de anticuerpos anti-péptido JY1 correspondientes a los sueros de los animales inmunizados con el péptido libre (JY1), la proteína recombinante (NMB0928) y el conjugado JY1-NMB0928.
Ejemplos. Ejemplo 1
Detección de la proteína NMB0928 en preparaciones de vesículas de membrana externa de Neissería meningitidis, serogrupo B.
Con el objetivo de estudiar las proteínas presentes en preparaciones de vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis serogrupo B (cepa B:4:P1.19,15), se realizó una electroforesis bidimensional según lo descrito en la literatura (Górg A, et.al. 1985. Electrophoresis 6:599-604). A continuación se realizó una digestión enzimática de las proteínas extraídas del gel empleando la enzima tripsina (Promega ,Madison, Wl, E.U). Los péptidos generados durante la digestión fueron extraídos de la solución empleando microcolumnas (ZipTips, Millipore, MA, E.U). Previo al análisis por espectrometría de masas los péptidos fueron eluídos de las microcolumnas con solución de acetonitrilo al 60% y 1% de ácido fórmico e inmediatamente la mezcla se cargó en nanoagujas (Protana, Dinamarca).
Las mediciones se realizaron en un espectrómetro de masas híbrido con cuadrupolo y tiempo de vuelo (QTof-2™ ,Manchester, Reino Unido), equipado con una fuente de ionización (nanoESI). Los espectros de masas fueron adquiridos en un rango de m/z desde 400 hasta 2000 en 0.98 segundos y utilizando 0.02 segundos entre cada uno de los barridos. La adquisición y procesamiento de los datos fue realizada a través del programa MassLynx (versión 3.5, Micromass). La identificación de proteínas basada en los espectros ESI-MS se realizó empleando el programa ProFound (Zhang W and Chait BT. 2000. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping Information. Anal Chem 72:2482-2489. http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound). La búsqueda se subscribió a las secuencias de genes y proteínas de bacterias contenidas en las bases de datos SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) y NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), considerando la oxidación de metioninas, la desamidación y la carboxiamidometilación de cisternas como posibles modificaciones presentes.
La identificación de las proteínas basada en los espectros MS/MS se realizó a través del programa MASCOT (Perkins DN, eí al. 1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20:3551-3567. http://www.matrixscience.com/). Entre los parámetros de búsqueda se incluyó la modificación de cisternas así como las posibles oxidaciones y desamidaciones. A partir del análisis de los datos obtenidos de la identificación de las proteínas presentes en preparaciones de vesículas de membrana externa se seleccionó para evaluar como posible candidato vacunal a la proteína NMB0928, de la cual fue identificado mediante espectrometría de masas 1 péptido. Ejemplo 2
Identificación del producto del gen nmb0928 como la Iipoproteína-34 de
Neisseria meningitidis Para la identificación de la proteína NMB0928, se realizó una búsqueda de similitud de secuencias en la base de datos del NCBI empleando el programa BLAST (Altschul SF, eí al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Los resultados de este procedimiento indicaron homología, además de con las correspondientes proteínas de otros serogrupos de Neisseria, con las de varios microorganismos entre las cuales se encuentra la lipoproteína-34 codificada por el gen nlpB de Escherichia coli, identificada en el año 1991 la cual se demostró que se fracciona en los proteoliposomas de membrana externa (Bouvier J, Pugsley A.P and Stragier.P. 1991. A gene for new lipoprotein in the dapA-purC interval of the E. coli chromosome. J Bacteriol 173(17):5523-31) La conservación de esta proteína en el genoma de varios géneros microbianos, ha dado lugar a que se reúnan como grupo de proteínas ortólogas en un dominio conservado reportado en la NCBI [gnl|CDD| 12651, COG3317, NIpB, Uncharacterized lipoprotein (Cell envelope biogénesis, outer membrana)], lo cual indica un común ancestro filogenético para todas ellas. El análisis de la vecindad de estos genes empleando la base de datos MBGD (Uchiyama, I. 2003. MBGD: microbial genome datábase for comaprative análisis. Nucleic Acids Res. 31, 58-62.), reveló uha significativa similitud en la organización génica, por lo que se identificó a la proteína NMB0928 como la lipoproteína-34 (NIpB) de Neisseria meningitidis. Ejemplo 3
Clonaje y expresión del gen NMB0928, codificante para la proteína NMB0928 de N. meningitidis en Escherichia coli.
Para realizar el clonaje y la expresión del gen NMB0928 se utilizó el vector pM-100, dicho vector permite realizar el clonaje empleando diferentes enzimas de restricción, y obtener elevados niveles de expresión de proteínas heterólogas en forma de cuerpos de inclusión citoplasmáticos en E. coli. El vector pM-100 (Figura 1) cuenta con los siguientes elementos principales: promotor triptófano, secuencia correspondiente al segmento estabilizador N-terminal del antígeno P64k de N. meningitidis cepa B:4:P1.19,15 codificante para 47 a.a, secuencia correspondiente al terminador de la transcripción del bacteriófago T4 y secuencia correspondiente al gen que confiere resistencia a ampicillina como marcador de selección.
A partir de la secuencia nucleotídica correspondiente al gen que codifica para la proteína NMB0928 (Ejemplo 1) se procedió a diseñar un par de oligonucleótidos (7740 y 7741) para amplificar el segmento de dicho gen sin la secuencia que codifica para el péptido señal, utilizando el ADN genómico de la cepa B:4:P1.19, 15.
Bglll 7740: 5 ' GCAGATCTTGGCAGCAAAACCGAAC 3 ' (No. Identificación de secuencia: 1)
EcoRV 7741: 5' ATGGATATCCTCAGCTCGAGATGGAG 3' (No. Identificación de secuencia: 2)
Para la predicción del péptido señal se utilizaron los métodos descritos en el SignalP World Wide Web server (http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP-2.0).
A continuación de la amplificación del gen de la proteína NMB0928 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) (Randall K, eí al. 1988. Science 42394:487-491) utilizando los oligonucleótidos 7740 y 7741, se digirió dicho producto de RCP empleando las enzimas Bglll y EcoRV, y se clonó en el vector pM-100 digerido previamente de la misma forma. La construcción final obtenida se muestra en la Figura 2, la proteína NMB0928 se expresa fusionada con el segmento N-terminal de la P64k. La secuenciación del segmento del gen NMB0928 clonado se realizó empleando el secuenciador automático ALFexpressIl (Termo Sequenase™ Cy™ 5 Dye Terminador Kit, Amersham Biosciences) y los oligonucleotidos 1573 (No. Identificación de secuencia: 8) y 6795 (No. Identificación de secuencia: 9), que hibridan en la secuencia correspondiente al segmento estabilizador de la P64k y en el terminador de la transcripción del bacteriófago T4, respectivamente. El plasmidio obtenido se nombró pM-242 para su posterior utilización. Para la expresión del gen NMB0928 se transformó por el método químico la cepa de E. coli GC 366 con el plasmidio pM-242 (Figura 2). El experimento de expresión se realizó en medio mínimo salino M9 (Miller JH. 1972. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NEW York, USA) suplementado con glicerol al 1%, hidrolizado de caseína al 1%, CaCI2 0.1 mM, MgSO4 1mM y ampicillina 50 ug/mL Los cultivos se incubaron durante 12 h a 37°C a 250 r.p.m. Al cabo de este tiempo se centrifugaron y se realizó la ruptura del precipitado celular mediante disrupción sónica (IKA LABORTECHNIK). Fracciones de sobrenadante y precipitado obtenidas fueron analizadas mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS- PAGE) (Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277:680) y tinción con Azul Brillante de Coomassie R- 250; analizándose el porciento de expresión mediante densitometría del gel (LKB Bromma 2202 Ultrascan láser densitometer; Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido). La proteína NMB0928 se obtuvo en el precipitado de ruptura, representando un 60% del total de las proteínas presentes en esta fracción (Figura 3). A continuación el precipitado se lavó con una solución tampón TE 1X (Tris-hidroximetil amino metano 10mM, ácido etilendiamino tetracético 1mM, pH 8) que contiene urea 2M con lo cual algunos contaminantes pasaron al sobrenadante en tanto la proteína de interés permanecía en el precipitado (Fig 4A). Luego dicho precipitado se solubilizó con una solución tampón TE1X que contenía urea 6M, pasando la proteína NMB0928 a la fracción soluble que se dializó contra una solución tampón TE1X obteniéndose finalmente con un 70% de pureza como se puede observar en la Figura 4B.
Ejemplo 4
Evaluación de la respuesta inmune inducida por la proteína NMB0928 por vía intraperitoneal e intranasal.
Para evaluar la inmunogenicidad de la proteína NMB0928, se diseñó un esquema de inmunización en ratones, en el que se administró la misma proteína obtenida por dos métodos diferentes. El primero consistió en extraer la banda de un gel de poliacrilamida (Castellanos L, eí al. 1996. A procedure for protein elution from reverse- stained polyarcylamide gels applicable at the low picomole level: An alternative route to the preparation of low abundance proteins for microanalysis. Electroforesis 17: 1564- 1572) y el segundo se refirió en el Ejemplo 3, cuyo producto se denotó como proteína semipurificada.
Con estas preparaciones se inmunizaron ratones Balb/c hembras, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales fueron divididos en 4 grupos de 8 ratones cada uno. Se realizaron 3 inmunizaciones por vía intranasal o intraperitoneal, separadas por un intervalo de 15 días. La proteína administrada por vía intraperitoneal fue mezclada con adyuvante de Freund. En la Tabla 1 se describe la composición de los grupos:
Tab
Figure imgf000018_0001
Los títulos de anticuerpos (IgG), contra la proteína recombinante y la proteína homologa presente en la bacteria se determinaron mediante un ensayo tipo ELISA en sueros obtenidos después de la tercera inoculación En la Figura 5 se muestran los títulos de anticuerpos de cada uno de los animales contra la proteína recombinante. Después de la segunda inoculación se detectan niveles de anticuerpos, aunque fueron superiores luego de la tercera inoculación. También se realizó la identificación inmunológica por Western blotting, detectándose el reconocimiento de la banda correspondiente a la proteína. Los grupos inmunizados por vía intraperitoneal presentaron títulos de anticuerpos significativamente superiores a los grupos inoculados por vía intranasal. Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el método no paramétrico de análisis de varianza de clasificación simple por rangos de Kruskal-Wallis, debido a que las varianzas entre los grupos no eran homogéneas según la Prueba de Bartlett. En la comparación de las medias de los tratamientos, en las combinaciones necesarias, se empleó la prueba de comparación múltiple de Dunn.
Los sueros obtenidos después de inmunizar con la proteína recombinante reconocieron a la proteína natural presente en un preparado de proteínas de membrana externa (PME) de la cepa CU385. Estos resultados son expuestos en la Figura 6.
Para analizar la respuesta a nivel mucosal se evaluaron muestras de saliva y lavados pulmonares. En la Figura 7 sólo se muestran los grupos inmunizados por vía intranasal y se observa un incremento en el título de IgA en el grupo al cual se le administró la proteína semipurificada.
Ejemplo 5
Caracterización de la secuencia del gen codificante para la proteína NMB0928 en distintas cepas de N. meningitidis. Para analizar la conservación de la secuencia del gen codificante para la proteína NMB0928 en las especies patógenas del género Neisseria se realizó una búsqueda de similitud con los genomas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B y C) y Neisseria gonorrhoeae anotados en la base de datos del NCBI (NC 003116.1, NC 003112.1, NC 003221. NC 002946 SANGER 135720IContiq1) empleando el programa BLAST (Altschul SF, et al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La Figura 8 muestra los resultados de la comparación de secuencias para aquellas secuencias que producen un alineamiento significativo en cada uno de los genomas analizados. Dichas secuencias presentan un 98% de identidad en los serogrupos A y C, un 99% de identidad en el serogrupo B y un 96% de identidad con Neisseria gonorrhoeae, con la secuencia obtenida del gen que codifica para la proteína NMB0928 (No. Identificación de secuencia: 3). Adicionalmente se determinó la secuencia nucleotídica del gen en cuestión para 3 aislamientos cubanos (No. Identificación de secuencia: 5-7) pertenecientes al serogrupo B (B:4:P1.19,15) y se realizó un alineamiento de secuencia empleando el programa ClustalX (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Los resultados del alineamiento evidencian que existe una gran conservación en la secuencia nucleotídica del gen NMB0928 entre las distintas cepas analizadas.
El empleo de la proteína NMB0928 como candidato vacunal, tomando en cuenta el alto grado de similitud existente entre las secuencias anteriormente citadas, permitiría generar una respuesta inmune efectiva, y de amplio espectro de protección (producto de la reactividad cruzada), contra la enfermedad meningoccócica.
Ejemplo 6
Caracterización de la respuesta inmune de amplio espectro de acción inducida por la inmunización de ratones Balb/c con la proteína NMB0928.
Con el objetivo de evaluar si la inmunización con la proteína NMB0928 induce una respuesta de amplia reactividad cruzada con otras cepas de Neisseria, se realizó un ensayo tipo ELISA en el que las placas de poliestireno se recubrieron con células totales de 7 cepas de Neisseria pertenecientes a diferentes serotipos y serosubtipos. Las placas se incubaron con la mezcla de los sueros obtenidos contra la proteína NMB0928 por dos rutas de inmunización, según se describe en el Ejemplo 4. En la Figura 9 se muestran los resultados obtenidos con los sueros producidos contra la proteína semipurificada administrada por la ruta intraperitoneal. Como se observa los sueros inmunes reconocieron la proteína presente en diferentes cepas, con niveles semejantes al encontrado en la cepa CU385. El resto de los sueros tuvieron un comportamiento similar en este ensayo.
Ejemplo 7 Protección inducida por los sueros murinos generados contra la proteína NMB0928, contra cepas homologas y heterólogas, en el modelo de rata infante
Para determinar la actividad funcional de los antisueros obtenidos, se realizó un ensayo de protección en el modelo de infección meningocóccica en ratas infantes. En dicho ensayo se emplearon 24 ratas de 5 a 6 días de nacidas, divididas en grupos de 6 animales cada uno.
Se determinó si los sueros que se administraron por la ruta intraperitoneal protegían a las ratas de la infección por la bacteria (cepa CU385), inoculada por la misma ruta una hora después. Los sueros de cada grupo de ratones inmunizados se mezclaron antes de ser inoculados en ratas infantes y se diluyeron 1/10 en PBS estéril. Cuatro horas después del reto, los animales se sacrificaron y se hizo un conteo de las bacterias viables en la sangre.
Para la interpretación de los resultados se realizó un Análisis de Varianza (Anova) seguido de un análisis de comparación múltiple de Dunnet, donde se comparan los grupos en estudio con el control negativo. Como se observa en la Figura 10 los grupos que recibieron los antisueros contra la proteína NMB0928 mostraron diferencias significativas respecto al control negativo, o sea fueron protectores en este modelo. Un ensayo similar fue realizado infectando las ratas infantes con las cepas M982 y 120/90, aisladas de pacientes en Cuba, cuya clasificación serológica es homologa a la cepa B385. Además, se realizaron experimentos de reto con las cepas 233 (C:2a: P1.5) del serogrupo C y la cepa H44/76 ( B:15,P1.7,16) del serogrupo B. En todos los casos los antisueros protegieron a las ratas infantes contra la infección meningocóccica.
Ejemplo 8
Generación de anticuerpos monoclonales contra la proteína NMB0928 capaces de mediar actividad bactericida contra Neisseria meningitidis
Con el objetivo de generar anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos contra la proteína NMB0928, y estudiar su capacidad funcional de mediar actividad bactericida contra cepas homologas y heterólogas de N. meningitidis, se empleó en un esquema de inmunización una preparación de la proteína NMB0928 con un porciento de pureza superior al 70% (Ejemplo 3). El esquema de inmunización se realizó en ratones Balb/c (H-2d , sexo femenino, 5-6 semanas) y contó con un total de 4 dosis distribuidas de la siguiente manera: los días 0, 15 y 30 del esquema 10 μg del antígeno NMB0928 por ratón ( volumen total 100 μl), administrados por vía subcutánea, emulsificada la primera dosis en Adyuvante Completo de Freund, y las restantes dosis con Adyuvante Incompleto de Freund; día 50, 10 μg del antígeno por ratón en solución tampón fosfato (NaCI 140 mM, KCI 270 mM, KH2PO4 1.5 mM, Na2HPO4 x 2H2O 6.5 mM, pH 7.2) por vía intraperitoneal. Las extracciones se realizaron los días 0 y 45 del esquema. Los esplecnocitos del animal de mejor título, evaluados mediante un ELISA indirecto empleando la proteína NMB0928 (Ejemplo 3) en el recubrimiento, se fundieron con las células de mieloma X63 Ag8 653 y los hibridomas resultantes se aislaron y pesquisaron según métodos establecidos (Gavilondo JV. 1995. Anticuerpos Monoclonales: Teoría y Práctica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba). La reactividad de los anticuerpos secretados por los hibridomas obtenidos contra la proteína NMB0928, así como su reactividad cruzada contra un grupo de antígenos no relacionados, se evaluó mediante un ELISA indirecto empleando en el recubrimiento 5 μg/ml de cada uno de los antígenos, e igual concentración de cada uno de los mAbs a ensayar. La Figura 11 muestra los resultados obtenidos en este experimento, en total se obtuvieron 2 clones positivos (mAbs E45-8-15 y 2G23-12) que reconocen específicamente la proteína NMB0928, y no a la secuencia aminoacídica correspondiente al segmento N-term de la P64k, tampoco al resto del panel de antígenos no relacionados ensayados.
Para determinar la capacidad de los mAbs generados contra la proteína NMB0928 de mediar respuesta bactericida contra cepas homologas y heterólogas de Neisseria meningitidis se realizó un ensayo bactericida. El título de anticuerpos bactericidas fue expresado como el recíproco de la mayor dilución de anticuerpos evaluada, capaz de matar el 50% ó más de las bacterias; el mAb 2G23-12 tuvo títulos bactericidas superiores a 1 : 128 contra la cepa homologa B:4:P1.19,15 y superiores a 1:64 contra las cepas heterólogas B:15:P1.7,16 y C:2a:P1.5.
Ejemplo 9
Caracterización de las regiones blanco de la respuesta inmune murina contra la proteína NMB0928 Con el objetivo de identificar las regiones dentro de la proteína, que son más reconocidas por los antisueros murinos generados contra el antígeno recombinante se realizó un ensayo de tipo SPOTScan. Una serie de péptidos sobrelapados que cubren la secuencia de la proteína se sintetizaron sobre un soporte de celulosa y la membrana se incubó con una mezcla de sueros diluida 1:100. La reacción antígeno- anticuerpo se detectó mediante la incubación con un conjugado anti-lnmunoglobulina G murina- fosfatasa alcalina, seguido de la adición de una solución que contenía el sustrato Bromo-Cloro-Indolil-Fosfato.
Se observaron varias regiones antigénicas comunes presentes en la proteína, con independencia de la preparación que se empleó en la inmunización. No obstante, se apreció que en los grupos inmunizados con proteína adyuvada con Adyuvante de Freund se obtuvo un patrón de reconocimiento mucho más amplio.
Ejemplo 10 Reconocimiento de la proteína NMB0928 por sueros humanos.
Una batería de sueros humanos, provenientes de individuos convalecientes se empleó en este estudio, que se realizó en un ensayo tipo ELISA. Las placas se recubrieron con la proteína NMB0928 obtenida mediante electroforesis preparativa (5 μg/ml). Después de bloquear las placas con leche descremada en polvo al 3% en PBS con Tween-20, los sueros se diluyeron (1:50) en la misma solución y se incubaron en las placas. El inmunoensayo prosiguió como ha sido ampliamente reportado. Como control negativo se emplearon sueros de donantes sanos. También se empleó como control no relacionado una mezcla de sueros de vacunados con vacuna recombinante contra la Hepatitis B (datos no mostrados). La Figura 12 muestra los resultados obtenidos con 5 sueros de convalecientes en este ensayo. Como se aprecia, los sueros humanos reconocieron la proteína lo que indica que la misma se expresa durante la infección meningocóccica y que es inmunogénica.
Ejemplo 11 Proteína NMB0928 como portadora de un péptido.
Para demostrar la capacidad portadora de la proteína recombinante NMB0928, se conjugó a la misma un péptido sintético de 15 residuos aminoacídicos, derivado de la región V3 de la proteína gp120 del VIH-1 , aislamiento JY1. La conjugación se realizó por el método del glutaraldehído. El péptido JY1 libre, la proteína recombinante NMB0928 y el conjugado JY1-NMB0928, se administró a ratones adultos en un esquema de 3 dosis, donde los inmunógenos se emulsificaron con Adyuvante de Freund. Dos semanas después de la tercera dosis se obtuvieron muestras del suero de los animales inmunizados, los que se analizaron por ELISA para determinar los niveles de anticuerpos anti-péptido. Para ello las placas se recubrieron con el péptido libre (20μg/ml) y el inmunoensayo prosiguió como se ha descrito previamente. Los resultados del experimento (Figura 13) evidencian la capacidad portadora de la proteína NMB0928, capaz de potenciar significativamente la respuesta de anticuerpos contra el péptido JY1, tras su conjugación al mismo.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología <120> PROTEÍNA NMB0928 Y SU USO EN FORMULACIONES FARMACÉUTICAS
<130> NMB0928 <140> <141>
<160> 9 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<400> 1 gcagatcttg gcagcaaaac cgaac 25
<210> 2
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<400> 2 atggatatcc tcagctcgga atggag 26
<210> 3 <211> 1197
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 3 atgccgtccg aaccgttcgg acggcataac gcaacaaaca ctttaatatc catcacacag 60 gatgacacga tgacccatat caaacccgtc attgccgcgc tcgcactcat cgggcttgcc 120 gcctgctccg gcagcaaaac cgaacagccc aagctcgact accaaagccg gtcgcaccgc 180 ctgatcaaac ttgaagtccc acctgatttg aacaaccccg accaaggcaa cctctaccgc 240 ctgcctgccg gttcgggcgc cgtccgcgcc agcgatttgg aaaaacgccg cacacccgcc 300 gtccaacagc ctgccgatgc cgaagtattg aaaagcgtca aaggtgtccg cctcgagcgc 360 gacggcagcc aacgctggct cgttgtcgac ggcaagtctc ctgccgaaat ctggccgctc 420 ctgaaagcct tttggcagga aaacggcttc gacatcaaat ccgaagaacc cgccatcgga 480 caaatggaaa ccgagtgggc ggaaaaccgc gccaaaatcc cccaagacag cttgcgccgc 540 ctcttcgaca aagtcggctt gggcggcatc tactccaccg gcgagcgcga caaattcatc 600 gtccgtatcg aacagggcaa aaacggcgtt tccgacatct tcttcgccca caaagccatg 660 aaagaagtgt acggcggcaa agacaaagac acgaccgtat ggcagccctc cccgtccgat 720 cccaacctcg aagccgcttt cctgacgcgc tttatgcaat atttgggcgt tgacggacag 780 caggcggaaa acgcatcggc aaaaaaacct acccttcccg ccgccaacga aatggcgcgt 840 atcgaaggca aaagcctgat tgtctttggc gactacggca gaaactggcg gcgcaccgtg 900 ctcgccctcg accgcatcgg gctgaccgtc gtcggtcaaa acaccgaacg ccacgccttc 960 ctggttcaaa aagccccgaa cgaaagcaat gcagttaccg aacaaaaacc cggcctgttc 1020 aaacgcctgc tgggcaaagg caaagcggag aaacctgccg aacagccgga actgattgtc 1080 tatgcagaac ctgtcgccaa cggctcgcgc atcgtcctgc tcaacaaaga cggcagcgca 1140 tatgccggca aagacgcatc cgcattattg ggcaaactcc attccgaact gcgttaa 1197
<210> 4 <211> 357 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis
<400> 4 Cys Ser Gly Ser Lys Thr Glu Gln Pro Lys Leu Asp Tyr Gln Ser Arg 1 5 10 15
Ser His Arg Leu He Lys Leu Glu Val Pro Pro Asp Leu Asn Asn Pro 20 25 30
Asp Gln Gly Asn Leu Tyr Arg Leu Pro Ala Gly Ser Gly Ala Val Arg 35 40 45
Ala Ser Asp Leu Glu Lys Arg Arg Thr Pro Ala Val Gln Gln Pro Ala 50 55 60
Asp Ala Glu Val Leu Lys Ser Val Lys Gly Val Arg Leu Glu Arg Asp 65 70 75 80 Gly Ser Gln Arg Trp Leu Val Val Asp Gly Lys Ser Pro Ala Glu lie 85 90 95
Trp Pro Leu Leu Lys Ala Phe Trp Gln Glu Asn Gly Phe Asp lie Lys 100 105 110
Ser Glu Glu Pro Ala lie Gly Gln Met Glu Thr Glu Trp Ala Glu Asn 115 120 125
Arg Ala Lys lie Pro Gln Asp Ser Leu Arg Arg Leu Phe Asp Lys Val 130 135 140
Gly Leu Gly Gly lie Tyr Ser Thr Gly Glu Arg Asp Lys Phe lie Val 145 150 155 160 Arg lie Glu Gln Gly Lys Asn Gly Val Ser Asp lie Phe Phe Ala His 165 170 175 Lys Ala Met Lys Glu Val Tyr Gly Gly Lys Asp Lys Asp Thr Thr Val 180 185 190
Trp Gln Pro Ser Pro Ser Asp Pro Asn Leu Glu Ala Ala Phe Leu Thr 195 200 205
Arg Phe Met Gln Tyr Leu Gly Val Asp Gly Gln Gln Ala Glu Asn Ala 210 215 220
Ser Ala Lys Lys Pro Thr Leu Pro Ala Ala Asn Glu Met Ala Arg lie 225 230 235 240
Glu Gly Lys Ser Leu He Val Phe Gly Asp Tyr Gly Arg Asn Trp Arg 245 250 255 Arg Thr Val Leu Ala Leu Asp Arg He Gly Leu Thr Val Val Gly Gln 260 265 270
Asn Thr Glu Arg His Ala Phe Leu Val Gln Lys Ala Pro Asn Glu Ser 275 280 285
Asn Ala Val Thr Glu Gln Lys Pro Gly Leu Phe Lys Arg Leu Leu Gly 290 295 300
Lys Gly Lys Ala Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Glu Leu lie Val Tyr 305 310 315 320
Ala Glu Pro Val Ala Asn Gly Ser Arg lie Val Leu Leu Asn Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Ala Tyr Ala Gly Lys Asp Ala Ser Ala Leu Leu Gly Lys Leu 340 345 350
His Ser Glu Leu Arg 355
<210> 5 <211> 1058 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis
<400> 5 ggcagcaaaa ccgaacagcc caagctcgac taccaaagcc ggtcgcaccg cctgatcaaa 60 cttgaagtcc cacctgattt gaacaacccc gaccaaggca acctctaccg cctgcctgcc 120 ggttcgggcg ccgtccgcgc cagcaatttg gaaaaacgcc gcacacccac cgtccaacag 180 cctgccgatg ccgaagtatt gaaaagcgtc aaaggtgtcc gcctcgagcg cgacggcagc 240 caacgctggc tcgttgtcga cggcaagtct cctgccgaaa tctggccgct cctgaaagcc 300 ttttggcagg aaaacggctt cgacatcaaa tccgaagaac ccgccatcgg acaaaaggaa 360 accgagtggg cggaaaaccg cgccaaaatc ccccaagaca gcttgcgccg cctcttcgac 420 aaagtcggct tgggcggcat ctactccacc ggcgagcgcg acaaattcat cgtccgtatc 480 gaacagggca aaaacggcgt ttccgacatc ttcttcgccc acaaagccat gaaagaagtg 540 tacggcggca aagacaaaga cacgaccgta tggcagccct ccccgtccga tcccaacctc 600 gaagccgctt tcctgacgcg ctttatgcaa tatttgggcg ttgacggaca gcaggcggaa 660 aacgcatcgg caaaaaaacc tacccttccc gccgccaacg aaatggcgcg tatcgaaagc 720 aaaagcctga ttgtctttgg cgactacggc agaaactggc ggcgcaccgt gctcgccctc 780 gaccgcatcg ggctgaccgt cgtcggtcaa aacaccgaac gccacgcctt cctggctcaa 840 aaagccccga acgaaagcaa tgcagttacc gaacaaaaac ccggcctgtt caaacgcctg 900 ctgggcaaag gcaaagcgga gaaacctgcc gaacagccgg aactgattgt ctatgcagaa 960 cctgtcgcca acgggtcgcg catcgtcctg ctcaacaaag acggcagcgc atatgccggc 1020 aaagacgcat ccgcattatt gggcaaactc cattccga 1058
<210>6 <211> 1058 <212>ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 6 ggcagcaaaa ccgaacagcc caagctcgac taccaaagcc ggtcgcaccg cctgatcaaa 60 cttgaagtcc cacctgattt gaacaacccc gaccaaggca acctctaccg cctgcctgcc 120 ggttcgggcg ccgtccgcgc cagcgatttg gaaaaacgcc gcacacccac cgtccaacag 180 cctgccgatg ccgaagtatt gaaaagcgtc aaaggtgtcc gcctcgagcg cgacggcagc 240 caacgctggc tcgttgtcga cggcaagtct cctgccgaaa tctggccgct cctgaaagcc 300 ttttggcagg aaaacggctt cgacatcaaa tccgaagaac ccgccatcgg acaaaaggaa 360 accgagtggg cggaaaaccg cgccaaaatc ccccaagaca gcttgcgccg cctcttcgac 420 aaagtcggct tgggcggcat ctactccacc ggcgagcgcg acaaattcat cgtccgtatc 480 gaacagggca aaaacggcgt ttccgacatc ttcttcgccc acaaagccat gaaagaagtg 540 tacggcggca aagacaaaga cacgaccgta tggcagccct ccccgtccga tcccaacctc 600 gaagccgctt tcctgacgcg ctttatgcaa tatttgggcg ttgacggaca gcaggcggaa 660 aacgcatcgg caaaaaaacc tacccttccc gccgccaacg aaatggcgcg tatcgaaagc 720 aaaagcctga ttgtctttgg cgactacggc agaaactggc ggcgcaccgt gctcgccctc 780 gaccgcatcg ggctgaccgt cgtcggtcaa aacaccgaac gccacgcctt cctggctcaa 840 aaagccccga acgaaagcaa tgcagttacc gaacaaaaac ccggcctgtt caaacgcctg 900 ctgggcaaag gcaaagcgga gaaacctgcc gaacagccgg aactgattgt ctatgcagaa 960 cctgtcgcca acgcctcgcg catcgtcctg ctcaacaaag acggcagcgc atatgccggc 1020 aaagacgcat ccgcattatt gggcaaactc cattccga 1058 <210> 7 <211> 1058 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis <400> 7 ggcagcaaaa ccgaacagcc caagctcgac taccaaagcc ggtcgcaccg cctgatcaaa 60 cttgaagtcc cacctgattt gaacaacccc gaccaaggca acctctaccg cctgcctgcc 120 ggttcgggcg ccgtccgcgc cagcaatttg gaaaaacgcc gcacacccac cgtccaacag 180 cctgccgatg ccgaagtatt gaaaagcgtc aaaggtgtcc gcctcgagcg cgacggcagc 240 caacgctggc tcgttgtcga cggcaagtct cctgccgaaa tctggccgct cctgaaagcc 300 ttttggcagg aaaacggctt cgacatcaaa tccgaagaac ccgccatcgg acaaaaggaa 360 accgagtggg cggaaaaccg cgccaaaatc ccccaagaca gcttgcgccg cctcttcgac 420 aaagtcggct tgggcggcat ctactccacc ggcgagcgcg acaaattcat cgtccgtatc 480 gaacagggca aaaacggcgt ttccgacatc ttcttcgccc acaaagccat gaaagaagtg 540 tacggcggca aagacaaaga cacgaccgta tggcagccct ccccgtccga tcccaacctc 600 gaagccgctt tcctgacgcg ctttatgcaa tatttgggcg ttgacggaca gcaggcggaa 660 aacgcatcgg caaaaaaacc tacccttccc gccgccaacg aaatggcgcg tatcgaaagc 720 aaaagcctga ttgtctttgg cgactacggc agaaactggc ggcgcaccgt gctcgccctc 780 gaccgcatcg ggctgaccgt cgtcggtcaa aacaccgaac gccacgcctt cctggctcaa 840 aaagccccga acgaaagcaa tgcagttacc gaacaaaaac ccggcctgtt caaacgcctg 900 ctgggcaaag gcaaagcgga gaaacctgcc gaacagccgg aactgattgt ctatgcagaa 960 cctgtcgcca acgcgtcgcg catcgtcctg ctcaacaaag acggcagcgc atatgccggc 1020 aaagacgcat ccgcattatt gggcaaactc cattccga 1058
<210>8
<211>29
<212>ADN
<213> Secuencia nucleotídica del oligonucleotido sintético 1573
<400> 8 ttccatggta gataaaagaa tggctttag 29
<210> 9 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia nucleotídica del oligonucleotido sintético 6795 <400> 9 aactgcaggc ttgtaaaccg ttttgtg 27

Claims

REIVINDICACIONES.
PROTEÍNA NMB0928 Y SU USO EN FORMULACIONES FARMACÉUTICAS. 1. Proteína de N. meningitidis denominada NMB0928 caracterizada por ser un antígeno capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria y tener la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia 4.
2. Proteína denominada NMB0928, de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por estar codificada por el gen NMB0928 identificado en el listado de secuencias como Secuencia 3.
3. Gen NMB0928 de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por tener la secuencia de bases identificada en el listado de secuencias como Secuencia 3 y codificar para la proteína de la reivindicación 1.
4. Proteína o péptido obtenido por vía recombinante o por síntesis química caracterizada porque tiene la secuencia de la proteína NMB0928 y ser capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria de acuerdo con la reivindicación 1.
5. Formulación farmacéutica caracterizada porque contiene la proteína o el péptido de las reivindicaciones 1, 2 y 4, o la proteína de la reivindicación 1 producida de manera natural, de acuerdo con la reivindicaciones 1, 2 y 4.
6. Formulación farmacéutica de la reivindicación 5 caracterizada porque es una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria.
7. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6 caracterizada porque es una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por Neisseria meningitidis.
8. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6 caracterizada porque es una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por Neisseria gonorrhoeae.
9. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, caracterizada por ser una formulación profiláctica o terapéutica.
10. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, caracterizada porque es una formulación combinada conteniendo uno o varios antigenos de naturaleza antigénica diferente, obtenidos por vía recombinante, por vía sintética o producidos de manera natural.
11. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, caracterizada porque contiene antígenos polisacáridicos.
12. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 8 y 9, caracterizada porque uno de los componentes de la formulación es un polisacárido capsular de N. meningitidis.
13. Formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque contiene un conjugado proteína-polisacárido, cuya porción polisacarídica se corresponde con un polisacárido bacteriano.
14. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, caracterizada porque contiene uno o varios microorganismos inactivados.
15. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, caracterizada porque contiene antígenos peptídicos.
16. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6, caracterizada porque contiene hormonas.
17. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6, caracterizada porque contiene factores de crecimiento.
18. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 17 caracterizada porque es una formulación para ser administrada por vía parenteral.
19. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 17 caracterizada porque es una formulación para ser administrada por vía mucosal.
20. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 17 caracterizada porque es una formulación para ser administrada por vía oral.
21. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 20 caracterizada por ser una formulación inmunoestimulante o inmunopotenciadora.
22. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 21 caracterizada porque contiene péptidos o fragmentos del antígeno NMB0928.
23. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 21 caracterizada porque contiene mimotopos del antígeno NMB0928.
24. Organismo genéticamente modificado caracterizado porque contiene el gen de la reivindicación 3, o parte de este, solo o formando parte de otra secuencia génica.
25. Formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24 caracterizada porque contenga el organismo genéticamente modificado vivo, atenuado o un preparado de este.
26. Formulación farmacéutica caracterizada porque contiene la proteína expresada por el organismo de la reivindicación 24, y es capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria.
27. Formulación farmacéutica caracterizada porque contiene la proteína o el péptido de las reivindicaciones 1 , 2 y 4, como portadora de antígenos de diversa naturaleza.
28. Componente farmacéutico caracterizado porque contiene la proteína NMB0928 de las reivindicaciones 1 y 2, o fragmentos de esta y es capaz de permitir la detección, solo o de conjunto con otros componentes, la enfermedad meningocóccica en humanos.
29. Componente farmacéutico caracterizado porque contiene el gen de la reivindicación 3, o fragmentos de este y es capaz de permitir la detección, solo o de conjunto con otros componentes, la enfermedad meningocóccica en humanos.
30. Uso de la proteína NMB0928 o fragmentos de esta, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en biosensores u otras aplicaciones farmacéuticas o biotecnológicas.
31. Uso del gen NMB0928, de acuerdo con las reivindicación 3, o fragmentos de este, en biosensores u otras aplicaciones farmacéuticas o biotecnológicas.
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