MXPA06006267A - Proteina nmbo928 y su uso en formulaciones farmaceuticas - Google Patents

Abstract

Uso de un nuevo antígeno vacunal aplicado de manera preventiva o terapéutica contra enfermedades bacterianas, virales, cancerosas, o de otro origen;el objetivo técnico que se persigue es el desarrollo de formulaciones capaces de elevar el espectro protector de las vacunas existentes y extenderlo contra diferentes patógenos, para lograr este objetivo se aislóe identificóla proteína NMB0928 como componente de las preparaciones de membrana externa de Neisseria meningitidis, capaz de inducir actividad bactericida;adicionalmente, se clonóy expresóel gen codificante para la proteína NMB0928, la cual se purificóevaluándose luego su inmunogenicidad en biomodelos animales. El secuenciamiento de genes homólogos evidenció, por su elevado grado de conservación, su alto valor como antígeno inductor de una respuesta inmune cruzada cuando es presentado por diferentes vías. Las formulaciones resultantes de esta invención son aplicables en la industria farmacéutica como formulaciones vacunales para uso humano.

Description

PROTEINA NMB0928 Y SU USO EN FORMULACIONES FARMACÉUTICAS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención está relacionada con la rama de la medicina, particularmente con el desarrollo de nuevas formulaciones combinadas, de aplicación preventiva o terapéutica, que permitan un aumento en la calidad de la respuesta inmune contra antígenos vacunales contra enfermedades de origen diverso. Neisseria meningitidis, un diplococo Gram negativo cuyo único hospedero es el hombre, es el agente causal de la meningitis meningocóccica. Usualmente esta bacteria se encuentra en estado de portador asintomático en la población, siendo esta la vía más común para su aislamiento microbiológico. En el mundo los niños menores de 2 años de edad son la población más susceptible a contraer la meningitis meningocóccica, sin embargo, los adolescentes jóvenes y la población de adultos mayores también pueden ser afectados. La enfermedad meningocóccica sin tratamiento es fatal en la mayoría de los individuos afectados, y la vacunación podría prevenir esta situación evitando incluso etapas tan tempranas como la colonización bacteriana.

Diversas estrategias se han desarrollado con el objetivo de obtener un preparado vacunal que satisfaga los requisitos necesarios para proteger a la población contra esta enfermedad. Para ello se han tenido en cuenta los antígenos capsulares cuya especificidad inmunológica ha permitido la clasificación de este microorganismo en serogrupos. En la actualidad se han definido 5 de estos serogrupos como los responsables de la mayoría de los casos de enfermedad meningocóccica en el mundo. El serogrupo A es el principal responsable de las epidemias en África subsahariana. Los serogrupos B y C están asociados a la mayor parte de los casos que ocurren en los países desarrollados. Los serogrupos Y y W135 están presentes en la mayoría de los casos remanentes de la enfermedad y de infección prevalente en algunas regiones de los Estados Unidos, con un marcado incremento en los últimos años. De ahí que los polisacáridos capsulares hayan sido objeto de estudio y evaluación como candidatos vacunales. Una vacuna tetravalente, basada en polisacáridos, que confiere protección contra los serogrupos A, C, Y, y W-135 ha sido licenciada en los Estados Unidos. Los anticuerpos que son generados tras la vacunación son serogrupo- específico (Rosenstein N. eí al. 2001. Menningococcal disease. N. Engl. J. Med, 344, 1378-1388). El serogrupo B, a diferencia del resto, continúa siendo una importante causa de enfermedad meningocóccica endémica y epidémica, en gran parte debido a la no existencia de vacunas efectivas contra el mismo. Se ha visto que el polisacárido del serogrupo B posee una baja inmunogenicidad, además del riesgo teórico que existe de que vacunas basadas en este compuesto podrían desarrollar inmunotolerancia e inducir autoinmunidad dada su homología estructural con cadenas oligosacarídicas presentes en estructuras fetales humanas (Finne J. eí al. 1987. An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisúes. J. Immunol, 138: 4402-4407). Por este motivo, el desarrollo de vacunas contra el serogrupo B se ha concentrado en el uso de antígenos subcapsulares.

Vacunas de vesículas y proteínas de membrana externa En la década de los años 70 la producción de vacunas de proteínas de membrana externa (PME), estuvo basada en la eliminación del lipopolisacárido (LPS) de las preparaciones proteicas mediante la utilización de detergentes (Frasch CE and Robbins JD. 1978. Protection against group B meningococcal disease. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection in a guinea pig model. J Exp Med 147(3):629-44). Después, las PME fueron precipitadas para producir agregados resuspendidos en cloruro de sodio. A pesar de los buenos resultados obtenidos en estudios realizados en animales, estas vacunas no indujeron anticuerpos bactericidas ni en adultos ni en niños (Zollinger WD, eí al. 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animáis and humans. J. Infect. Dis. 137(6):728-39), resultado que fue atribuido a la desnaturalización de las proteínas presentes en la preparación como resultado de la precipitación. Los próximos pasos en la búsqueda de un nuevo candidato, fueron: diseñar una vacuna que presenta las proteínas en su conformación nativa formando vesículas de membrana externa (Zollinger WD, eí al. 1979. Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48, Wang LY and Frasch CE. 1984. Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infect Immun. 46(2):408-14136). Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa (VME) fueron significativamente más inmunogénicas por vía parenteral que los agregados de PME, y esta inmunogenicidad fue explicada inicialmente por una mayor adsorción al adyuvante hidróxido de aluminio (Wang LY and Frasch CE. 1984. Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model.. Infecí Immun. 46(2):408-14136). Varios estudios de eficacia se han llevado a cabo utilizando vacunas basadas en vesículas de membrana externa, en diferentes formulaciones. Las dos vacunas más ampliamente estudiadas fueron desarrolladas en los años 80 en respuesta a brotes de la enfermedad meningocóccica en Cuba (Sierra GV eí al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2):195-210) y Noruega (Bjune G, eí al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6), respectivamente. La vacuna producida por en Instituto Finlay en Cuba (comercialmente denominada VA-MENGOC-BC®) es producida a partir de la cepa B:4:P1.19,15 y está compuesta por una preparación de PME de dicha cepa y polisacárido capsular aislado del serogrupo C, adsorbidas a hidróxido de aluminio (Sierra GV eí al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2):195-210). Esta vacuna contribuyó a un rápido descenso de la epidemia en Cuba (Rodríguez AP, eí al. The epidemiológica! impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba.1999. Mem Inst Oswaldo Cruz. 94(4):433-40). La vacuna producida por el Instituto Nacional de Salud Pública de Noruega (NIPH) fue inicialmente utilizada durante un período hiperendémico de la enfermedad causada por una cepa perteneciente al clon ET-5 (B:15:P1.7,16). Esta vacuna monovalente también fue producida a partir de VME purificadas y adsorbidas a hidróxido de aluminio (BjuneG, et al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6). Las vacunas de VME parecen ser efectivas en la presentación de PME, dispuestas en su conformación natural, para permitir la generación de anticuerpos bactericidas, al menos en adolescentes y adultos. Las respuestas de anticuerpos generadas, incrementaron la opsonofagocitosis del meningococo. La formulación precisa de las vacunas (por ejemplo: contenido de PME, contenido de LPS y la presencia o ausencia del adyuvante) tiene un significativo impacto en la inmunogenicidad existiendo grandes diferencias de un productor a otro según la cepa y/o la metodología empleada (Lehmann AK, eí al. 1991. Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence. APMiS. 99(8):769-72, Gómez JA, eí al. 1998. Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activity of antibodies against the transferrin-binding proteins of Neisseria meningitidis. Vaccine.16(17):1633-9, Steeghs L, eí al. 1999. Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitidis.' Influence of Adjuvants on the Immune Response. Infect Immun. 67(10):4988-93). Sin embargo, el perfil antigénico de los aislamientos obtenidos de pacientes cambia rápidamente y una vacuna abarca sólo un limitado número de cepas, por tanto puede ser inefectiva en unos años si las cepas que la componen no se corresponden con la epidemia local existente. Hasta el momento, las vacunas de VME han sido más utilizadas que cualquier otra vacuna del serogrupo B y son útiles en el contexto de los brotes de la enfermedad causada por un solo tipo de cepa. Los inmunógenos responsables de la reactividad cruzada inducida por este tipo de preparados no han sido completamente caracterizados, y muchos antígenos presentes en estos preparados restan por ser identificados. Estudios realizados con los sueros provenientes de ensayos clínicos del Instituto Finlay y el NIPH, sugieren que los anticuerpos contra la proteína de clase 1 (P1 , también llamada PorA) y Opc (otra PME mayoritaria) (Wedege E, eí al. 1998. Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infect Immun. 66(7): 3223-31), son importantes mediadores de la actividad bactericida del suero (fundamentalmente P1) y en ambas proteínas se observó una marcada variabilidad de cepa a cepa. La proteína P1 es un antígeno con un significativo nivel de variabilidad, el cual parece experimentar variación continua entre y durante los brotes (Jelfs J, eí al. 2000. Sequence Variation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemic Spread. Clin Diagn Lab Immunol. 7(3):390-5) y hacia el cual van dirigidos predominantemente los anticuerpos bactericidas después de la vacunación (y después de la enfermedad), por lo que la protección producto de la inmunización con vacunas de VME de una sola cepa (monovalentes), las cuales pudieran ser serosubtipo específica (por ejemplo dependientes del tipo de P1), se hace cuestionable. Para resolver este problema se desarrolló una vacuna de VME en Holanda, (RIVM) que contenía P1 de seis aislamientos patogénicos diferentes (Van Der Ley P and Poolman JT. 1992. Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein. Infect Immun. 60(8):3156-61 , Claassen I, eí al. 1996. Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine. 14(10):1001-8). En este caso las vesículas fueron extraídas de dos variantes de la cepa H44/76, genéticamente manipulada para expresar tres proteínas P1 independientes.

La búsqueda de un antíqeno universal Aunque las proteínas de membrana externa (PME) pueden inducir una respuesta inmune funcional contra el serogrupo B, ninguna de las vacunas confiere una protección universal, debido a la gran heterogeneidad de las regiones expuestas en la superficie de las PME. La discreta reactividad cruzada inducida por las vacunas de vesículas de membrana externa (VME) ha incentivado la búsqueda de un antígeno de membrana externa (o de un grupo de antígenos), que induzca anticuerpos funcionales y esté presente en todas las cepas del meningococo. Estos antígenos deben ser la base para una vacuna antimeningocóccica realmente universal, la cual eliminará el potencial problema de la modificación capsular en las cepas patogénicas, después de la vacunación con polisacárido. Debido a la variabilidad de la proteína inmunodominante P1 , su uso en una vacuna universal esta limitado, y por tanto otras PME mayoritarias fueron consideradas candidatos para una vacuna y muchas de ellas se encuentran en desarrollo. Algunas de las que han sido incluidas son: proteínas de clase 5 (Opc), NspA y proteínas reguladas por hierro (TbpA y B, FbpA y FetA). TbpB forma parte del complejo de unión de transferrina, junto con TbpA. Recientes trabajos sugieren que la TbpA tiene una función más importante en la unión a! hierro (Pintor M, eí al. 1998. Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutants of Neisseria meningitidis. J Med Microbiol 47(9): 757-60) y es un inmunogéno más efectivo que la TbpB.

Una PME minoritaria, altamente conservada, ha sido descubierta a través de una técnica novedosa, la que consiste en emplear combinaciones de PME provenientes de diferentes cepas para inmunizar ratones (Martín D, eí al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Se utilizaron células B de ratones inmunizados para producir hibridomas, y los mAbs se examinaron para evaluar la reactividad cruzada contra múltiples cepas del meningococo. Como resultado se encontró un anticuerpo monoclonal con reactividad cruzada que reconoció una PME de 22 kDa y fue designada como NspA. La inmunización con la proteína NspA indujo respuesta de anticuerpos bactericidas en ratones contra las cepas de los grupos A hasta C y también protege contra la infección meningocóccica letal (Martin D, eí al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). La comparación de secuencias de NspA, genéticamente divergentes, demostró que la proteína está altamente conservada (97% homología) (Cadieux N, eí al. 1999. Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infecí Immun 67 (9): 4955-9). La presencia de NspA se detectó por ELISA en un 99.2% de las cepas tesíadas períenecieníes a los serogrupos desde la A hasta la C, utilizando anticuerpos monoclonales (Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Se ha comprobado que estos anticuerpos monoclonales presentan actividad bactericida contra numerosas cepas del meningococo y son capaces de reducir la bacteriemia provocada por este microorganismo en un modelo murino (Cadieux N, eí al. 1999. Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infecí Immun 67 (9): 4955-9). Aunque estos resultados sugieren que la NspA es un prometedor candidato vacunal capaz de conferir protección contra varios serogrupos, un suero policlonal de ratón contra la proteína recombinante, no se asoció a la superficie en un 35% de las cepas de meningococo del serogrupo B, a pesar de la presencia del gen nspA en estos organismos (Moe GR eí al. 1999. Differences in Surface Expression of NspA among Neisseria meningitidis Group B Strains. Infecí Immun 67 (11): 5664-75).

Presentación de los antígenos y la formulación de la vacuna. Los primeros trabajos sugirieron que la forma en que los antígenos eran presentados era muy importante para generar una respuesta inmune. Los epitopos presentes en las proteínas que se encuentran unidas a la membrana, en muchos casos, dependen de la correcta estrucíura terciaria y la misma a su vez, depende frecuentemente de los dominios hidrofóbicos unidos a la membrana. Este efecto se ha demostrado en preparaciones de PME que resultan inmunogénicas en humanos, sólo cuando se presentan en forma de vesículas (Zollinger WD, eí al. 1979. Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J Clin Invesí 63 (5): 836-48, Zollinger WD, eí al. 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animáis and humans. J Infecí Dis 137 (6): 728-39). Duraníe décadas se han uíilizado vacunas iníegradas por una sola proíeína y generalmeníe han mosírado buena esíabilidad, pero la misma puede variar si se requiere la preseníación de las proteínas en forma de vesículas para lograr que los antígenos permanezcan unidos a la membrana. La inmunogenicidad y reactogenicidad de las VME puede variar con alteraciones en la cantidad de proteínas y LPS eliminadas durante el proceso de purificación. La construcción de vesículas liposomales sintéíicas permite la optimización y estandarización de dichas vacunas (Christodoulides M, eí al. 1998. Immunization with recombinant class 1 outer-membrane protein from Neisseria meningitidis: influence of liposomes and adjuvants on antibody avidity, recognition of native protein and the induction ofa bactericidal immune response against meningococci. Microbiology 144(Pí 11 ):3027-37). Es decir, las PME han sido preseníadas en forma de vesículas y como proíeínas expresadas con un elevado grado de pureza, y en ambos casos se ha logrado desarrollar respuesfa de aníicuerpos. La inyección intramuscular de la vacuna antimeningocóccica ha sido la vía utilizada que permite la producción de inmunoglobulina G (IgG) sisíémica, aunque es importanfe la producción de IgA secretora, ya que duraníe la infección meningocóccica la invasión al hospedero ocurre por la vía del epiíelio nasal.

Secuenciación del genoma de N. meningitidis La secuenciación del genoma de MC58 (una cepa de meningococo del serogrupo B) (Teítelin H, eí al. 2000. Complete Genome Sequence of Neisse?a meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science 287 (5459): 1809-15172) y de Z2491 (una cepa de serogrupo A) (Parkhill J, eí al. 2000. Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature 404 (6777):502-6173) fueron publicadas durante el año 2000. La disponibilidad de las secuencias de ADN tiene una gran influencia en la investigación de una vacuna antimeningocóccica. Mientras la secuenciación del genoma de MC58 continuaba su desarrollo, Pizza y colaboradores comenzaron identificando los marcos abiertos de lectura (ORFs) que fueron predichos para codificar las proteínas expuestas en la superficie, unidas a membrana y las que se exportan. Esíe grupo de invesíigadores ideníificaron 570 ORFs, amplificados a través de la reacción en cadena de la polimerasa y los clonaron en Escherichia coli, para permiíir la expresión de proteínas de fusión con cola de histidina o glutatión S-transferasa (Pizza M, eí al. 2000. Identification of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequencing. Science 287 (5459): 1816-20). El 61% (350) de los ORFs seleccionados fueron expresados exitosameníe, en la mayoría de los casos aquellos que no lograron expresarse, tenían más de un dominio hidrofóbico de transmembrana. Las proteínas recombinantes fueron purificadas y se utilizaron para inmunizar ratones. Los sueros obtenidos fueron evaluados por ELISA, citomefría de flujo y se les deíerminó la acíividad bacíericida contra 2 cepas. Posteriormente se seleccionaron 7 proteínas que en los 3 ensayos resultaron positivas. Las formulaciones vacunales empleando algunas de estas proteínas combinadas con adyuvantes, indujeron tííulos significativos de anticuerpos bactericidas contra la cepa homologa (MC58), pero ninguno de ellos fue tan alto como los inducidos por una vacuna de VME de esta misma cepa (Giuliani MM, ef al. 2000. Proceedings 12th IPNC. p. 22). Por otro lado, existen evidencias de que combinaciones de estas proteínas resultan más inmunogénicas que cada proteína por separado (Santini L. et al. 2000. Proceedings 12lh IPNC. p. 25). Los numerosos ORFs excluidos en ese trabajo, quizás por la falta de la expresión proteica o por modificaciones de las propiedades inmunológicas, necesitan una investigación más profunda. Los componentes de una vacuna deben seleccionarse en base a la contribución de los antígenos en la patogénesis de N. meningitidis. Los antígenos por sí solos pueden ser efectivos candidatos vacunales, o alternativamente, los mutantes atenuados pueden ser considerados integrantes de una vacuna. En este sentido, el empleo de candidatos cuya secuencia esté altamente conservada incluso entre diferentes géneros de microorganismos patógenos, podria resulíar una solución a las afectaciones producidas por los mismos en caso de que generen una convenieníe respuesía por parte del sistema inmune. El objetivo técnico que se persigue con esta invención es precisameníe el desarrollo de formulaciones capaces de elevar y/o ampliar la respuesía inmune del organismo coníra varios patógenos o coníra un especíro amplio de variedades del mismo, siendo esíos patógenos de carácíer parasiíario, bacteriano, viral, canceroso u otro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En el trabajo objeto de la presente invención se reporta por primera vez el uso de la proteína NMB0928 como componente de una formulación vacunal de carácter terapéutico o preventivo contra la enfermedad meningocóccica o de cualquier infección provocada por un miembro del género Neisseria. El carácter novedoso de esta invención reside en el uso, previamente no reportado, de la proteína NMB0928 en formulaciones con nuevas propiedades, capaces de inducir una respuesta inmune sistémica y mucosal de amplio especlro proíector, dado el carácter conservado de esta proteína en diferentes aislamientos de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Vecíor pM100 empleado en el clonaje y la expresión de la proíeína NMB0928. pTrip, promotor triplófano; N-term P64k, fragmento N-íerminal de la P64k; T4 Terminaíor, íerminador de la transcripción, del bacíeriófago T4. Figura 2. Consírucción final obtenida del clonaje de la secuencia nucleotídica correspondiente a! gen NMB0928 en el vector pM100. Figura 3. Análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en la ruptura celular; carril 1 , sobrenadante de ruptura; carril 2, precipitado de ruptura. Figuras 4A y 4B. Análisis mediante SDS-PAGE del proceso de solubilización de la proteína NMB0928 a partir del precipitado de ruptura: (A) carril 1 , precipiíado de rupíura; carril 2, precipiíado del lavado con solución íampón TE1X que coníiene urea 3M ; carril 3, fracción soluble del lavado; (B) carril 1 , sobrenadante de solubilización con solución íampón TE1X que coníiene urea 6M; carril 2, precipiíado de solubilización. Figura 5. Niveles de aníicuerpos (IgG) coníra la proteína recombinante NMB0928, obtenidos al inmunizar ratones con el mismo antígeno por vía intranasa! o intraperitoneal. Se representan los resultados obtenidos en un ensayo tipo ELISA, que fueron expresados como el inverso del tííulo, calculado como la dilución de la muesíra donde se duplica la densidad ópíica de la muestra preinmune.

Figura 6. Reconocimiento por Western blotting de la proíeína NMB0928 preseníe en las PME de N. meningitidis utilizando sueros de raíones inmunizados con la proleína recombinanfe: La flecha indica la banda correspondieníe a la proíeína NMB0928 inmunoideníificada. Figuras 7A y 7B. Respuesía de anticuerpos IgA contra la proteína recombinante NMB0928, a nivel mucosal, en ratones inmunizados con el antígeno por vía intranasal. Los resultados se expresan como el inverso del título, calculado como aquella dilución de la muestra donde se duplica la densidad óptica de la muestra preinmune. (A) Respuesta de anticuerpos IgA en saliva. (B) Respuesta de anticuerpos IgA en lavados pulmonares Figura 8. Resultados de la búsqueda de similitud entre el gen NMB0928 ("query") y las secuencias anotadas de los genomas de diferentes serogrupos de Neisseria meningitidis ("Sbjct") empleando el programa BLAST. Figura 9. Reconocimiento de la proteína NMB0928 en diferentes cepas de N. meningitidis, por sueros producidos contra el antígeno recombinante. En el gráfico sólo se muestran los valores obtenidos cuando se inmunizó con la proteína semipurificada por vía intraperitoneal, aunque en el resto de los casos se observó un comportamiento similar. Los resultados fueron expresados como el inverso del tííulo, calculado como la dilución del suero donde se duplica la densidad óplica del suero preinmune. Figura 10. Comparación eníre los sueros obíenidos inmunizando con la proíeína obtenida por dos procedimieníos, administrada por vía intraperitoneal, en el experimento de protección pasiva contra infección meningocóccica, en el modelo de rata infante. Figura 11 : Reconocimiento de la proteína NMB0928, y de un panel de antígenos no relacionados, por los mAbs generados (mAbs E45-8-15, 2G23-12). P1 , proteína de clase 1 de Neisseria meningitidis cepa B:4:P1.15; P64k, subunidad E3 de la enzima piruvato deshidrogenasa de Neisseria meningitidis; T.T, íoxoide íeíánico; HBsAg, aníígeno de superficie del virus de ia Hepaíiíis B. Figura 12. Reconocimiento de la proteína NMB0928 por sueros de pacientes convalecientes de la enfermedad meningocóccica. Como control negativo se emplearon sueros de donantes sanos. Los resultados se representan como la absorbancia (492nm) en un ensayo tipo ELISA. Figura 13. Títulos de anticuerpos anti-pépíido JY1 correspondienles a los sueros de los animales inmunizados con el pépíido libre (JY1), la proleína recombinaníe (NMB0928) y el conjugado JY1-NMB0928.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Detección de la proteína NMB0928 en preparaciones de vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis, sero rupo B.

Con el objetivo de estudiar las proíeínas présenles en preparaciones de vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis serogrupo B (cepa B:4:P1.19,15), se realizó una electroforesis bidimensional según lo descrito en la literatura (Górg A, et.al. 1985. Electrophoresis 6:599-604). A continuación se realizó una digestión enzimática de las proteínas extraídas del gel empleando la enzima tripsina (Promega .Madison, Wl, E.U). Los péptidos generados durante la digestión fueron extraídos de la solución empleando microcolumnas (ZipTips, Millipore, MA, E.U). Previo al análisis por espectrometría de masas los péptidos fueron eluídos de las microcolumnas con solución de acetoniírilo al 60% y 1% de ácido fórmico e inmediaíamente la mezcla se cargó en nanoagujas (Protana, Dinamarca). Las mediciones se realizaron en un espectrómetro de masas híbrido con cuadrupolo y tiempo de vuelo (QTof-2™ .Manchester, Reino Unido), equipado con una fuente de ionización (nanoESI). Los espectros de masas fueron adquiridos en un rango de m/z desde 400 hasta 2000 en 0.98 segundos y utilizando 0.02 segundos entre cada uno de los barridos. La adquisición y procesamiento de los datos fue realizada a través del programa MassLynx (versión 3.5, Micromass). La identificación de proteínas basada en los espectros ESI-MS se realizó empleando el programa ProFound (Zhang W and Chait BT. 2000. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem 72:2482-2489. http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound). La búsqueda se subscribió a las secuencias de genes y proteínas de bacterias contenidas en las bases de datos SwissProt (http://www.ebi. ac.uk/swissproi/) y NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), considerando la oxidación de metioninas, la desamidación y la carboxiamidomeíilación de cisíeínas como posibles modificaciones preseníes. La ideníificación de las proteínas basada en los espectros MS/MS se realizó a través del programa MASCOT (Perkins DN, eí al. 1999. Probability-based protein Identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.

Electrophoresis 20:3551-3567. htíp://www.matrixscience.com/). Entre los parámetros de búsqueda se incluyó la modificación de cisternas así como las posibles oxidaciones y desamidaciones. A partir del análisis de los datos obtenidos de la identificación de las proteínas presentes en preparaciones de vesículas de membrana externa se seleccionó para evaluar como posible candidato vacunal a la proteína NMB0928, de la cual fue identificado mediante espectro meíría de masas 1 péptido.

EJEMPLO 2 Identificación del producto del gen nmb0928 como la lipoproteína-34 de Neisserla menin itidis Para ia identificación de la proteína NMB0928, se realizó una búsqueda de similitud de secuencias en la base de datos del NCBI empleando el programa BLAST (Altschul SF, eí al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410, hítp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Los resulíados de esíe procedimiento indicaron homología, además de con las correspondientes proteínas de otros serogrupos de Neisseria, con las de varios microorganismos entre las cuales se encuentra la lipoproteína-34 codificada por el gen nlpB de Escherichia coli, identificada en el año 1991 la cual se demostró que se fracciona en los proteoliposomas de membrana exíerna (Bouvier J, Pugsley A.P and Síragier.P. 1991. A gene for new lipoprotein in the dapA-purC interval of the E. coli chromosome. J Bacíeriol 173(17):5523-31) La conservación de esía proíeína en el genoma de varios géneros microbianos, ha dado lugar a que se reúnan como grupo de proíeínas ortólogas en un dominio conservado reportado en la NCBI fgnl|CDDI12651 , COG3317, NIpB, Uncharacíerized lipoproíein (Cell envelope biogénesis, ouíer membrana)], lo cual indica un común anceslro filogenéíico para íodas ellas. El análisis de la vecindad de estos genes empleando la base de datos MBGD (Uchiyama, I. 2003. MBGD: microbial genome datábase for comaprative análisis. Nucleic Acids Res. 31 , 58-62.), reveló una significativa similiíud en la organización génica, por lo que se ideníificó a la proíeína NMB0928 como la lipoproíeína-34 (NIpB) de Neisseria meningitidis.

EJEMPLO 3 Clonaje y expresión del gen NMB0928, codificante para la proteína NMB0928 de N. meningitidis en Escherichia coli.

Para realizar el clonaje y la expresión del gen NMB0928 se uíilizó el vecíor pM-100, dicho vector permile realizar el clonaje empleando difereníes enzimas de resíricción, y obíener elevados niveles de expresión de proteínas heterólogas en forma de cuerpos de inclusión citoplasmáticos en E. coli. El vector pM-100 (Figura 1) cuenía con los siguientes elementos principales: promotor tripíófano, secuencia correspondieníe al segmento estabilizador N-terminal del anfígeno P64k de N. meningitidis cepa B:4:P1.19,15 codificante para 47 a.a, secuencia correspondieníe al íerminador de la transcripción del bacteriófago T4 y secuencia correspondiente al gen que confiere resistencia a ampicillina como marcador de selección.

A partir de la secuencia nucleotídica correspondieníe al gen que codifica para la proíeína NMB0928 (Ejemplo 1) se procedió a diseñar un par de oligonucleóíidos (7740 y 7741 ) para amplificar el segmento de dicho gen sin la secuencia que codifica para el pépíido señal, uíilizando el ADN genómico de la cepa B:4:P1.19,15. Bglll 7740: 5' GCAGATCTTGGCAGCAAAACCGAAC 3' (No. Ideníificación de secuencia: 1) EcoRV 7741 : 5' ATGGATATCCTCAGCTCGAGATGGAG 3' (No. Identificación de secuencia: 2) Para la predicción del péplido señal se utilizaron los métodos descritos en el SignalP World Wide Web server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0). A coníinuación de la amplificación del gen de la proíeína NMB0928 medianíe la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) (Randall K, eí al. 1988. Science 42394:487-491) utilizando los oligonucleótidos 7740 y 7741 , se digirió dicho producto de RCP empleando las enzimas Bglll y EcoRV, y se clonó en el vector pM- 00 digerido previamente de la misma forma. La construcción final obtenida se muestra en la Figura 2, la proteína NMB0928 se expresa fusionada con el segmento N-terminal de la P64k. La secuenciación del segmento del gen NMB0928 clonado se realizó empleando el secuenciador auíomálico ALFexpressIl (Termo Sequenase™ Cy™ 5 Dye Terminador Kit, Amersham Biosciences) y los oligonucleotidos 1573 (No. Identificación de secuencia: 8) y 6795 (No. Idenlificación de secuencia: 9), que hibridan en la secuencia correspondiente al segmento esíabilizador de la P64k y en el íerminador de la íranscripción del bacteriófago T4, respectivameníe. El plasmidio obíenido se nombró pM-242 para su posterior utilización. Para la expresión del gen NMB0928 se transformó por el método químico la cepa de E. coli GC 366 con el plasmidio pM-242 (Figura 2). El experimento de expresión se realizó en medio mínimo salino M9 (Miller JH. 1972. Experiments in Molecular Genelics, Cold Spring Harbor Laboraíory Press, NEW York, USA) suplemeníado con glicerol al 1 %, hidrolizado de caseína al 1%, CaCl2 0.1 M, MgSO4 1mM y ampicillina 50 ug/mL. Los cultivos se incubaron durante 12 h a 37°C a 250 r.p.m. Al cabo de este íiempo se cenírifugaron y se realizó la rupíura del precipifado celular medianíe disrupción sónica (IKA LABORTECHNIK). Fracciones de sobrenadante y precipitado obtenidas fueron analizadas mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277:680) y finción con Azul Brillante de Coomassie R-250; analizándose el porciento de expresión medianíe densitometría del gel (LKB Bromma 2202 Ullrascan láser densiíomeíer; Amersham Pharmacia Bioíech, Reino Unido). La proteína NMB0928 se obíuvo en el precipiíado de rupíura, represenlando un 60% del total de las proteínas presentes en esta fracción (Figura 3). A continuación el precipitado se lavó con una solución íampón TE 1X (Tris-hidroximeíil amino meíano 10mM, ácido eíilendiamino tetracéíico 1mM, pH 8) que coníiene urea 2M con lo cual algunos coníaminanles pasaron al sobrenadante en lanío la proíeína de interés permanecía en el precipitado (Fig 4A). Luego dicho precipitado se solubilizó con una solución tampón TE1X que contenía urea 6M, pasando la proteína NMB0928 a la fracción soluble que se dializó contra una solución tampón TE1X obteniéndose finalmente con un 70% de pureza como se puede observar en la Figura 4B.

EJEMPLO 4 Evaluación de la respuesta inmune inducida por la proteína NMB0928 por vía intraperitoneal e intranasál.

Para evaluar la inmunogenicidad de la proteína NMB0928, se diseñó un esquema de inmunización en ratones, en el que se administró la misma proteína obtenida por dos métodos diferentes. El primero consislió en exíraer la banda de un gel de poliacrilamida (Castellanos L, eí al. 1996. A procedure for protein elution from reverse-stained poiyarcylamide gels applicable at the low picomole level: An alternative route to the preparation of low abundance proteins for microanalysis. Electroforesis 17: 1564-1572) y el segundo se refirió en el Ejemplo 3, cuyo producto se denotó como proteína semipurificada.

Con esías preparaciones se inmunizaron ratones Balb/c hembras, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales fueron divididos en 4 grupos de 8 ratones cada uno. Se realizaron 3 inmunizaciones por vía intranasal o ¡ntraperitoneal, separadas por un intervalo de 15 días. La proíeína administrada por vía intraperiíoneal fue mezclada con adyuvante de Freund. En el Cuadro 1 se describe la composición de los grupos: CUADRO 1 Grupos de ratones utilizados para la inmunización Los tííulos de anficuerpos (IgG), coníra la proíeína recombinaníe y la proteína homologa presente en la bacteria se determinaron mediante un ensayo tipo ELISA en sueros obtenidos después de la tercera inoculación En la Figura 5 se muestran los títulos de anticuerpos de cada uno de los animales contra la proteína recombinante. Después de la segunda inoculación se detectan niveles de anticuerpos, aunque fueron superiores luego de la tercera inoculación. También se realizó la identificación inmunológica por Western blotting, detecíándose el reconocimiento de la banda correspondieníe a la proíeína. Los grupos inmunizados por vía inlraperitoneal presentaron tííulos de aníicuerpos significativamente superiores a los grupos inoculados por vía intranasal. Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el método no paramétrico de análisis de varianza de clasificación simple por rangos de Kruskal-Wallis, debido a que las varianzas entre los grupos no eran homogéneas según la Prueba de Bartleít. En la comparación de las medias de los traíamientos, en las combinaciones necesarias, se empleó la prueba de comparación múltiple de Dunn. Los sueros obtenidos después de inmunizar con la proteína recombinante reconocieron a la proteína natural presente en un preparado de proteínas de membrana externa (PME) de la cepa CU385. Estos resultados son expuestos en la Figura 6. Para analizar la respuesta a nivel mucosal se evaluaron muestras de saliva y lavados pulmonares. En las Figuras 7A y 7B sólo se muestran los grupos inmunizados por vía intranasal y se observa un incremento en el título de IgA en el grupo al cual se le administró la proíeína semípurificada.

EJEMPLO 5 Caracterización de la secuencia del gen codificante para la proteína NMB0928 en distintas cepas de N. meningitidis.

Para analizar la conservación de la secuencia del gen codificante para la proteína NMB0928 en las especies patógenas del género Neisseria se realizó una búsqueda de similiíud con los genomas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B y C) y Neisseria gonorrhoeae anotados en la base de datos del NCBI (NC 003116.1 , NC 003112.1 , NC 003221 , NC 002946 SANGER 135720|Contig1) empleando el programa BLAST (Alíschul SF, ei al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La Figura 8 muesíra los resulfados de la comparación de secuencias para aquellas secuencias que producen un alineamiento significaíivo en cada uno de los genomas analizados. Dichas secuencias presentan un 98% de identidad en los serogrupos A y C, un 99% de ideníidad en el serogrupo B y un 96% de ideníidad con Neisseria gonorrhoeae, con la secuencia obtenida del gen que codifica para la proteína NMB0928 (No. Ideníificación de secuencia: 3). Adicionalmenfe se deíerminó la secuencia nucleoíídica del gen en cuesíión para 3 aislamientos cubanos (No. Ideníificación de secuencia: 5-7) pertenecientes al serogrupo B (B:4:P1.19,15) y se realizó un alineamiento de secuencia empleando el programa ClustalX (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Los resultados del alineamiento evidencian que existe una gran conservación en la secuencia nucleoíídica del gen NMB0928 entre las distintas cepas analizadas. El empleo de la proteína NMB0928 como candidato vacunal, tomando en cuenía el alto grado de similitud existente entre las secuencias anteriormente citadas, permitiría generar una respuesta inmune efectiva, y de amplio espectro de protección (producto de la reactividad cruzada), contra la enfermedad meningoccócica.

EJEMPLO 6 Caracterización de la respuesta inmune de amplio espectro de acción inducida por la inmunización de ratones Balb/c con la proteína NMB0928.

Con el objetivo de evaluar si la inmunización con la proteína NMB0928 induce una respuesta de amplia reactividad cruzada con otras cepas de Neisseria, se realizó un ensayo tipo ELISA en el que las placas de poliestireno se recubrieron con células tolales de 7 cepas de Neisseria pertenecientes a difereníes serotipos y serosubtipos. Las placas se incubaron con la mezcla de los sueros obtenidos contra la proteína NMB0928 por dos rutas de inmunización, según se describe en el Ejemplo 4. En la Figura 9 se muestran los resulíados obíenidos con los sueros producidos contra la proteína semipurificada administrada por la ruta intraperiíoneal. Como se observa los sueros inmunes reconocieron la proteína presente en diferentes cepas, con niveles semejaníes al enconírado en la cepa CU385. El resto de los sueros tuvieron un comportamiento similar en este ensayo.

EJEMPLO 7 Protección inducida por los sueros murinos generados contra la proteína NMB0928, contra cepas homologas y heterólogas, en el modelo de rata infante Para determinar la actividad funcional de los antisueros obtenidos, se realizó un ensayo de protección en el modelo de infección meningocóccica en ratas infantes. En dicho ensayo se emplearon 24 ratas de 5 a 6 días de nacidas, divididas en grupos de 6 animales cada uno. Se determinó si los sueros que se administraron por la ruía iníraperiíoneal protegían a las raías de la infección por la bacteria (cepa CU385), inoculada por la misma ruía una hora después. Los sueros de cada grupo de raíones inmunizados se mezclaron aníes de ser inoculados en raías infantes y se diluyeron 1/10 en PBS estéril. Cuaíro horas después del reto, los animales se sacrificaron y se hizo un coníeo de las bacterias viables en la sangre. Para la interpretación de los resultados se realizó un Análisis de Varianza (Anova) seguido de un análisis de comparación múltiple de Dunneí, donde se comparan los grupos en esfudio con el conírol negaíivo. Como se observa en la Figura 10 los grupos que recibieron los aníisueros coníra la proteína NMB0928 mostraron diferencias significativas respecto al control negalivo, o sea fueron protectores en este modelo.

Un ensayo similar fue realizado infectando las ratas infantes con las cepas M982 y 120/90, aisladas de pacientes en Cuba, cuya clasificación serológica es homologa a la cepa B385. Además, se realizaron experimentos de reto con las cepas 233 (C:2a: P1.5) del serogrupo C y la cepa H44/76 ( B:15,P1.7,16) del serogrupo B. En todos los casos los antisueros protegieron a las ratas infantes contra la infección meningocóccica.

EJEMPLO 8 Generación de anticuerpos monoclonales contra la proteína NMB0928 capaces de mediar actividad bactericida contra Neisseria meningitidis Con el objetivo de generar aníicuerpos monoclonales (mAbs) específicos coníra la proíeína NMB0928, y esíudiar su capacidad funcional de mediar actividad bactericida contra cepas homologas y heterólogas de N. meningitidis, se empleó en un esquema de inmunización una preparación de la proteína NMB0928 con un porciento de pureza superior al 70% (Ejemplo 3). El esquema de inmunización se realizó en ratones Balb/c (H-2d , sexo femenino, 5-6 semanas) y contó con un total de 4 dosis distribuidas de la siguiente manera: los días 0, 15 y 30 del esquema 10 µg del antígeno NMB0928 por ratón ( volumen total 100 µl), administrados por vía subcutánea, emulsificada la primera dosis en Adyuvante Completo de Freund, y las restantes dosis con Adyuvante Incompleto de Freund; día 50, 10 µg del aníígeno por ratón en solución tampón fosfato (NaCI 140 mM, KCl 270 mM, KH2PO4 1.5 mM, Na2HPO4 x 2H2O 6.5 mM, pH 7.2) por vía iníraperitoneal. Las extracciones se realizaron los días 0 y 45 del esquema. Los esplecnocitos del animal de mejor íííulo, evaluados medianíe un ELISA indirecto empleando la' proteína NMB0928 (Ejemplo 3) en el recubrimiento, se fundieron con las células de mieloma X63 Ag8 653 y los hibridomas resultantes se aislaron y pesquisaron según métodos establecidos (Gavilondo JV. 1995. Anticuerpos Monoclonales: Teoría y Práctica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba). La reactividad de los anticuerpos secretados por los hibridomas obtenidos contra la proteína NMB0928, así como su reactividad cruzada contra un grupo de antígenos no relacionados, se evaluó mediante un ELISA indirecto empleando en el recubrimiento 5 µg/ml de cada uno de los anlígenos, e igual concenfración de cada uno de los mAbs a ensayar. La Figura 11 muesíra los resultados obtenidos en este experimento, en toíal se obíuvieron 2 clones posiíivos (mAbs E45-8-15 y 2G23-12) que reconocen específicamente la proíeína NMB0928, y no a la secuencia aminoacídica correspondiente al segmento N-term de la P64k, íampoco al resío del panel de antígenos no relacionados ensayados. Para determinar la capacidad de los mAbs generados contra la proteína NMB0928 de mediar respuesta bactericida contra cepas homologas y heterólogas de Neisseria meningitidis se realizó un ensayo bactericida. El tííulo de aníicuerpos bactericidas fue expresado como el recíproco de la mayor dilución de aníicuerpos evaluada, capaz de matar el 50% ó más de las bacterias; el mAb 2G23-12 tuvo tííulos bactericidas superiores a 1 : 128 conira la cepa homologa B:4:P1.19,15 y superiores a 1 :64 contra las cepas heterólogas B:15:P1.7,16 y C:2a:P1.5.

EJEMPLO 9 Caracterización de las regiones blanco de la respuesta inmune murina contra la proteína NMB0928 Con el objetivo de identificar las regiones dentro de la proteína, que son más reconocidas por los antisueros murinos generados contra el antígeno recombinante se realizó un ensayo de tipo SPOTScan. Una serie de péptidos sobrelapados que cubren la secuencia de la proteína se sintetizaron sobre un soporte de celulosa y la membrana se incubó con una mezcla de sueros diluida 1 :100. La reacción aníígeno-anticuerpo se detectó mediante la incubación con un conjugado anti-lnmunoglobulina G murina- fosfatasa alcalina, seguido de la adición de una solución que contenía el sustrato Bromo-Cloro-Indolil-Fosfato. Se observaron varias regiones antigénicas comunes presentes en la proteína, con independencia de la preparación que se empleó en la inmunización. No obstante, se apreció que en los grupos inmunizados con proteína adyuvada con Adyuvante de Freund se obtuvo un patrón de reconocimiento mucho más amplio.

EJEMPLO 10 Reconocimiento de la proteína NMB0928 por sueros humanos.

Una batería de sueros humanos, provenientes de individuos convalecientes se empleó en este estudio, que se realizó en un ensayo tipo ELISA. Las placas se recubrieron con la proteína NMB0928 obtenida mediante electroforesis preparativa (5 µg/ml). Después de bloquear las placas con leche descremada en polvo al 3% en PBS con Tween-20, los sueros se diluyeron (1 :50) en la misma solución y se incubaron en las placas. El inmunoensayo prosiguió como ha sido ampliamente reportado. Como conírol negaíivo se emplearon sueros de donantes sanos. También se empleó como coníroi no relacionado una . mezcla de sueros de vacunados con vacuna recombinaníe coníra la Hepaliíis B (datos no mostrados). La Figura 12 muestra los resultados obtenidos con 5 sueros de convalecientes en este ensayo. Como se aprecia, los sueros humanos reconocieron la proteína lo que indica que la misma se expresa durante la infección meningocóccica y que es inmunogénica.

EJEMPLO 11 Proteína NMB0928 como portadora de un péptido.

Para demostrar la capacidad portadora de la proíeína recombinante NMB0928, se conjugó a la misma un pépíido siníéíico de 15 residuos aminoacídicos, derivado de la región V3 de la proíeína gp120 del VIH-1 , aislamiento JY1. La conjugación se realizó por el método del glutaraldehído. El péptido JY1 libre, la proteína recombinante NMB0928 y el conjugado JY1-NMB0928, se administró a ratones adultos en un esquema de 3 dosis, donde los ¡nmunógenos se emulsificaron con Adyuvante de Freund. Dos semanas después de la tercera dosis se obtuvieron muesíras del suero de los animales inmunizados, los que se analizaron por ELISA para determinar los niveles de anticuerpos anti-pépíido. Para ello las placas se recubrieron con el pépíido libre (20µg/ml) y el inmunoensayo prosiguió como se ha descriío previamente. Los resultados del experimento (Figura 13) evidencian la capacidad portadora de la proteína NMB0928, capaz de poíenciar significativamente la respuesta de anticuerpos coníra el pépíido JY1 , tras su conjugación al mismo.

Claims (29)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Proteína de N. meningitidis denominada NMB0928 caracterizada por ser un antígeno capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protecíora coníra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria y tener la secuencia aminoacídica ¡deníificada en el lisiado de secuencias como Secuencia 4.

2.- Proteína denominada NMB0928, de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada por estar codificada por el gen NMB0928 identificado en el listado de secuencias como Secuencia 3.

3.- Gen NMB0928 de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por tener la secuencia de bases identificada en el listado de secuencias como Secuencia 3 y codificar para la proteína de la reivindicación 1.

4.- Proteína o péptido obtenido por vía recombinante o por síntesis química caracterizada porque tiene la secuencia de la proteína NMB0928 y ser capaz de generar en el organismo recepíor una respuesía protecíora coníra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria de acuerdo con la reivindicación 1.

5.- Formulación farmacéutica caracterizada porque contiene la proíeína o el pépíido de las reivindicaciones 1 , 2 y 4, o la proíeína de la reivindicación 1 producida de manera natural, de acuerdo con la reivindicaciones 1 , 2 y 4.

6.- Formulación farmacéutica de la reivindicación 5 caracterizada porque es una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria.

7.- Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6 caracterizada porque es una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por Neisseria meningitidis.

8.- Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6 caracterizada porque es una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora coníra infecciones causadas por Neissería gonorrhoeae.

9.- Formulación farmacéuíica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, caracíerizada por ser una formulación profiláctica o terapéutica.

10.- Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, caracterizada porque es una formulación combinada conteniendo uno o varios antigenos de naturaleza antigénica diferente, obtenidos por vía recombinante, por vía sintética o producidos de manera natural.

11.- Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, caracterizada porque contiene antígenos polisacáridicos.

12.- Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 8 y 9, caracterizada porque uno de los componentes de la formulación es un polisacárido capsular de N. meningitidis.

13.- Formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque contiene un conjugado proteína-polisacárido, cuya porción polisacarídica se corresponde con un polisacárido bacteriano.

14.- Formulación farmacéuíica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, caracterizada porque contiene uno o varios microorganismos inactivados.

15.- Formulación farmacéuíica de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, caracterizada porque contiene antígenos peptídicos.

16.- Formulación farmacéuíica de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6, caracterizada porque coníiene hormonas.

17.- Formulación farmacéuíica de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6, caracterizada porque contiene factores de crecimiento.

18.- Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 17 caracterizada porque es una formulación para ser administrada por vía parenteral.

19.- Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 17 caracterizada porque es una formulación para ser administrada por vía mucosal.

20.- Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 17 caracterizada porque es una formulación para ser administrada por vía oral. 21- Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 20 caracterizada por ser una formulación inmunoestimulanle o inmunopotenciadora. 22.- Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 21 caracíerizada porque coníiene pépíidos o fragmeníos del anfígeno NMB0928. 23.- Formulación farmacéuíica de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 21 caracíerizada porque coníiene mimotopos del antígeno NMB0928. 24.- Organismo genéticamente modificado caracterizado porque contiene el gen de la reivindicación 3, o parte de este, solo o formando parte de oíra secuencia génica. 25.- Formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24 caracíerizada porque coníenga el organismo genéiicameníe modificado vivo, atenuado o un preparado de este. 26.- Formulación farmacéutica caracterizada porque contiene la proteína expresada por el organismo de la reivindicación 24, y es capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria. 27.- Formulación farmacéutica caracterizada porque contiene la proíeína o el péptido de las reivindicaciones 1 , 2 y 4, como portadora de antígenos de diversa naturaleza. 28.- Componente farmacéutico caracterizado porque contiene la proteína NMB0928 de las reivindicaciones 1 y 2, o fragmentos de esta y es capaz de permitir la detección, solo o de conjunto con otros componentes, la enfermedad meningocóccica en humanos. 29.- Componente farmacéutico caracterizado porque contiene el gen de la reivindicación 3, o fragmentos de este y es capaz de permitir la detección, solo o de conjunto con otros componentes, la enfermedad meningocóccica en humanos. 30.- Uso de la proteína NMB0928 o fragmentos de esta, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en biosensores u otras aplicaciones farmacéuíicas o bioíecnológicas. 31.- Uso del gen NMB0928, de acuerdo con las reivindicación 3, o fragmentos de este, en biosensores u otras aplicaciones farmacéuticas o biotecnológicas.