KR20150034192A - 폐렴 연쇄상구균에 의해 유발되는 폐렴에 대한 키메라 단백질 백신 - Google Patents

Abstract

해결하고자 하는 과제: 폐렴 연쇄상구균(S. pneumoniae) 유발 질병의 예방 및 치료를 위한 모든 폐렴 연쇄상구균 균주에 대한 방어를 제공할 수 있는 안전하고 효과적인 백신의 부재(보편적인 폐렴구균 백신의 부재). 해결 수단: 유연 연결을 통해 연결된, 보존된 폐렴 연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 단백질의 면역원성 에피토프: PspA, Spr1895, 및 PsaA 및 안전한 아쥬반트로서 기능하는 플라젤린 성분(FliC1, FliC2)으로 구성된 키메라 단백질에 기초한 백신 및 그들의 아미노산 서열과 60% 이상 상동성인 단백질 또는 펩타이드 동족체(homolog)를 제공한다. 안정하고, 효능 있고, 및 예방적 효과 및 치료적 효과 둘 모두가 나타난다.

Description

폐렴 연쇄상구균에 의해 유발되는 폐렴에 대한 키메라 단백질 백신{Chimeric protein vaccine against pneumonia caused by Streptococcus pneumoniae}

본 발명은 의약, 약학, 및 생명공학에 관한 것이고, 폐렴구균(pneumococci) (Streptococcus pneumoniae)(S. pneumoniae)에 의해 유발되는 폐렴의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

용어 "하이브리드(또는 키메라) 단백질(hybrid(or chimeric) protein)"은 다수의 상이한 유전자의 코딩 어레이(coding array)가 하나의 리딩 프레임(reading frame)에 결합하는 재조합 DNA 분자의 발현의 결과로 수득된 단백질을 의미한다.

폐렴(동의어: 폐의 발열(pulmonic fever)은 성인 및 소아의 통상적인 질환이고, 세심한 진단 및 치료가 요구된다. 의학 통계에 따르면, 매년 백만명 이상의 러시아인들이 폐렴에 걸리고, 환자 중 5%에 대해서 이 질병은 치명적으로 끝이 난다(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/ru/index.html)

용어 "폐렴(pneumonia)"은 넓은 범위의 질병을 의미하고, 이들의 각각은 각자의 병인(etiology), 발병(pathogenesis), 임상적 표현(clinical presentation), X-선 특징, 실험실 데이터 및 특정 요법을 보유하고, 독립적인 질병 또는 다른 질병의 속발성으로 진행될 수 있다.

폐렴은 인간 호흡기계의 염증성 상태이다. 폐렴의 원인물질로서 바이러스, 진균이 있고, 그러나 일반적으로 대부분 이 질병은 세균에 의해서 일어난다. 세균성 폐렴을 일으키는 가장 일반적인 병원체는 폐렴 연쇄상구균(S. pneumoniae)이다. 인두 미생물총(microflora)의 검사는 건강한 사람의 5 내지 25%가 폐렴구균의 보균자인 것을 밝혀냈다.

폐렴구균은 옵소닌 작용(opsonization) 및 이후의 식균 작용(phagocytosis)으로부터 세균을 보호하는 두꺼운 다당류 캡슐을 특징으로 한다. 캡슐이 면역 시스템에 의해 인식되는 폐렴구균의 주요 표면 구조(superficial structure)라는 사실의 결과로 인해, 캡슐 다당류는 가장 높은 변이성을 특징으로 한다. 현재까지, 폐렴구균의 91개의 상이한 캡슐이 알려졌고; 그러나, 주요 침습성 폐렴구균 질병(90% 이상)은 23 개의 가장 널리 퍼진 혈청형(serovar)에 의해 일어난다. 다수의 캡슐 다당류의 면역학적 변이는 효과적인 다당류 백신의 생산을 복잡하게 하는 인자로 밝혀졌다.

모든 인간은 폐렴구균 감염에 걸릴 수 있으나, 다수의 위험군이 존재하고, 이들은 높은 확률로 이 질병에 걸리기 쉽다. 이들은 65세 이상의 사람, 소아(small infant), 특정 건강 장애를 갖는 사람, 약해진 면역 시스템을 갖는 사람, 및 흡연자이다.

많은 경우에 있어서 폐렴구균 감염은 치료에 거의 반응하지 않는 반면, 많은 순환 유행(circulating epidemic) 폐렴구균주는 다수의 항생제 내성을 발달시킨다. 예방적 목적을 위해 백신이 사용된다. WHO (국제 보건 기구) 및 러시아 호흡기학회(Russian Respiratory Society)에 따르면, "백신 접종은 폐렴구균 감염 경로 를 예방하는 유일한 가능성이다". 현재, FDA (식품의약국)는 두 개의 종류의 백신을 승인하였다: 폐렴구균 컨쥬게이트(conjugate) 백신 및 폐렴구균 다당류 백신 (http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/pneumococcalinfections.html). 러시아 연방에서는 다음의 백신이 승인되었다: 뉴모 23(Pneumo 23) (PPSV23)- 프랑스, 사노피 파스퇴르사(Sanofi Pateur)에 의해 생산된 23-가성(valent) 폐렴구균 다당류 백신 및 프레베나(Prevenar^TM) (PCV7)- 미국, 와이어스 파마슈티컬사(Wyeth Pharmaceuticals Inc)에 의해 생산된 7-가성 폐렴구균 다당류 컨쥬게이트 백신.

폐렴구균 다당류 백신(PPSV)는 성인에서 지시된다. PPSV를 접종 받은 성인의 대부분은 접종 후 2 내지 3주에 대부분의 세균 균주(그의 항원이 백신 내에 존재한다)에 대한 내성이 생긴다. 연장자, 2세 미만의 소아, 및 만성 질병을 갖는 사람에 있어서, 백신 접종은 지속적인 면역의 발생을 일으키지 않을 수 있고, 질병에 대한 면역이 완전히 생기지 않을 수 있다 (http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/languages/pneumococcalinfections.html#Russian). 또한, 백신 접종은 주사 부위에 홍반, 감각 과민(algesthesis), 발열, 근육통(myalgia) 또는 심각한 국소 반응(local reaction)과 같은 합병증을 일으킬 수 있다(Donalisio MR, Rodrigues SM, Mendes ET, Krutman M. Adverse events after pneumococcal vaccination. J Bras Pneumol. 2007 Feb;33(1):51-6).

그러나, PPSV는 폐렴구균 질병에 걸릴 위험이 낮은 사람에서만 유의적으로 효과적인 것이 밝혀졌다. 2세 미만의 소아에 대해서, 백신 접종 동안 항생제를 사용하는 동시 예방이 추천된다(Bacle A, Diot P, Lemarie E. Anti-pneumococcal vaccine: justifications and results. Rev Pneumol Clin. 1997;53(3):128-37).

PPSV는 폐렴의 발생 빈도 및 그의 치사율을 감소시키지 못하고, 심각한 폐렴구균 감염에 걸릴 위험만 낮추는 것으로 나타났다. 또한 현재의 백신은 고농도의 페니실린에 민감한 폐렴구균 균주로부터는 보호하지 못하는 것으로 나타났다(Pneumococcal vaccine: a second look. Solution for SC or IM injection: pneumococcal vaccine. Prescrire Int. 1998 Feb;7(33):16-8). 이러한 결과는 또한 65세 이상의 사람에서도 보고되었다(Pneumococcal vaccination for elderly subjects: license extension. Still no proof of clinical efficacy. Prescrire Int. 2000 Aug;9(48):106-9).

PPSV의 활성 성분은 폐렴구균 병인을 갖는 침습성 질병의 90%까지 일으키는 23 혈청형의 연쇄상 구균 다당류 혼합물이다. 다당류는 T-세포 반응과 관련된 항원으로, 면역 기억을 형성함이 없이 오로지 단기간의 면역화 발달을 유도한다; 상기 성분만 함유하는 백신은 비효과적이고, 이는 2세 미만의 소아에서 밝혀졌다(Greenwood B M et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 1980, 74:756-760; 국제출원 WO2010120921 A1, 우선일 2009.04.16). 전 세계의 상이한 지역의 감염원은 다양하기 때문에, 폐렴구균의 90개 이상의 혈청형이 존재한다는 사실은 또한 보편적인 다당류-기반 백신의 생산을 복잡하게 한다.

소아에서 가장 빈번하게 질병을 일으키는 7 개의 폐렴구균 혈청형의 다당류와 함께, 소아에서 추천되는 컨쥬게이트 백신은 아쥬반트의 역할을 충족하는 담체 (carrier)-단백질 CRM 197 (디프테리아 독소 변이(diphtheria toxin mutant))을 함유한다. 백신 중 아쥬반트의 존재로 인해, 이 항원 복합체는 지속적인 면역력을 보장하는 T-세포에 의해 잘 인식된다(Schneerson R,　Barrera O,　Sutton A,　Robbins JB. Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates. J Exp Med.　1980　Aug 1;152(2):361-76). CRM 197은 헤파린-결합 EGF-유사 성장인자(Heparin-binding EGF-like growth factor) (HB-EGF)와 결합한다. CRM 197의 독성이 디프테리아 독소의 독성에 비해 약 106배 낮음에도 불구하고, 특히 고용량에서, 이것을 주의깊게 사용하여야 한다(Takuya Kageyama, Minako Ohishi1,Shingo Miyamoto, Hiroto Mizushima, Ryo Iwamoto and Eisuke Mekada. Diphtheria Toxin Mutant CRM 197 Possesses Weak EF2-ADP-ribosyl Activity that Potentiates its Anti-tumorigenic Activity. Received April 16, 2007. Accepted May 2, 2007). 그와 함께, 백신 접종은 다음의 합병증을 일으킬 수 있다: 불안(restlessness), 졸림증(restlessness) 및 식욕의 상실뿐만 아니라, 주사 부위에서의 홍반, 피부통(dermatodynia), 및 경화(induration), 체온의 38 내지 39 ℃ (100.4 내지 102.2 ℉)까지의 증가. 또한, 소아의 연령에 따라 2 내지 5세의 소아, 2세의 소아에 4회 백신 접종을 하는 것이 권장된다. 총, 적어도 4번의 복용이 소아를 백신 접종하는데 필요하고, 이는 비싸고 안전하지 못하다.

백신은 두 개의 주요 성분을 함유하는 것으로 알려졌다: 수막염균(N. meningitidi)의 표면 다당류 및 폐렴연쇄상 구균의 PsaA-단백질 (PspA-단백질 또한 사용될 수 있음) (국제 출원 WO2010120921 A, 우선일 2009.04.16). 다당류에 대한 면역 기억력을 발생시키지 못하는 능력을 고려했을 때, 본 발명자들은 백신 성분으로 수막염균(N. meningitidi)의 표면 다당류를 사용하는 것은 부적절하다고 간주한다. 차례로 PsaA- 및 PspA-단백질의 사용이 합리적이다: 이들은 폐렴구균 표면 항원이고, 이것은 면역 반응 및 면역 기억을 둘 다 유도할 수 있다.

특허가 되는 백신의 효과는 강한 면역 반응 및 이후의 면역 기억력의 발생의 유도에 기초한다. 그러므로, 본 발명의 중앙 위치는 다당류가 아닌, 분자 생물학 및 재조합 DNA에 기초한 방법을 사용하여 수득된 폐렴구균 단백질이 차지한다. 문헌 내의 데이터에 따라서, 가장 유망한 단백질-기반 항원은 세 개의 표면 단백질이다:PsaA, PspA, Spr1895.

PsaA-단백질은 또한 국제 출원 WO2004102199 A2, 우선일 2003.05.16의 저자에 의해 유망한 면역원으로 간주된다. 저자는 이 단백질 및 다수의 다른 단백질(SlrA-리포단백질 로타마아제(lipoprotein rotamase), IgA1 - 프로테아제(protease), PpmA - 연쇄상 구균 성숙 단백질(streptococcal maturation protein)) 또는 그들의 화합물을 백신 생성을 위한 기초로 언급한다. 그러나, 본 발명자들은 PsaA, PspA 및 Spr1895 외에 폐렴 연쇄상 구균의 다른 표면 단백질을 사용하는 접근이 더욱 유망하다고 여긴다.

아쥬반트 기능을 갖는 콜레라 독소(cholera toxin)의 PsaA 및 B 서브유닛(subunit)을 포함하는 키메라 단백질을 기술한다(Areas AP, Oliveira ML, Miyaji EN, Leite LC, Aires KA, Dias WO, Ho PL. Expression and characterization of cholera toxin B-pneumococcal surface adhesin A fusion protein in Escherichia coli: ability of CTB-PsaA to induce humoral immune response in mice. Biochem Biophys Res Commun.　2004 Aug 13;321(1):192-6). 그러나, 인간 생물체는 콜레라 독소에 고도로 민감해서, 8 ㎍의 독소만으로도 심한 설사를 일으킬 수 있기 때문에, 본 발명자들은 백신의 성분으로서 콜레라 독소 또는 그의 화합물이 플라젤린(flagellin)에 비해 덜 안전하다고 생각한다.

연구는 폐렴구균 백신 생성을 위한 기초로서 PsaA- 및 PspA- 단백질을 사용하는 것이 합리적이라는 것을 밝혔다. PsaA-단백질은 상이한 폐렴구균 혈청형 사이에서 고도로 보존되어 있고, 및 세균성 부착 및 그의 독력(virulence)를 제공한다(Berry AM, and Paton JC: Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun 1996;64:5255-5262). PsaA 특이적인 항체는 폐렴 연쇄상 구균(S. pneumonia)의 모든 혈청형에 대하여 교차(cross-linking) 활성을 보유한다고 밝혀졌다.

PspA는 보체-독립적인(complement-independent) 식균 작용을 억제하는 콜린-결합(choline-binding) 표면 항원이고, 락토페린(lactoferrin)과 결합하고, 및 세균 세포의 락토페린-독립적인(lactoferrin-independent) 제거를 막는다(Hammerschmidt S, Bethe G, Remane PH, Chhatwal GS(1999) Identification of pneumococcal surface protein A as a lactoferrin-binding protein of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun 67:1683-1687). 이 논문에서는 PsaA-단백질은 백신의 생산을 위한 유망한 것으로 언급된다. 저자는 또한 폐렴구균 감염 백신을 생산하기 위한 단백질 후보물질의 범위를 나타내었다; 그러나, 본 발명자들은 폐렴구균 및 다수의 다른 세균의 혈청형 사이의 보존성을 고려하여 두 개의 특정 단백질: PsaA 및 PspA를 사용하는 것이 합리적이라고 여긴다.

제공된 백신의 주요 구성 성분 중의 하나는 포스페이트-결합 단백질-포스페이트 ABC 트랜스포터(phosphate - binding protein - phosphate ABC transporter )의 유전자에 의해 암호화되는 Spr1895-단백질이다. 이 단백질은 세균 생존 및 항수(constant)에 필수적이고, 이것이 폐렴 연쇄상 구균-유발 질병에 대한 폐렴구균 백신의 생산을 위해 선택되는 성분이 되게 한다.

본 발명에 있어서, 플라젤린-단백질 (FliC)는 아쥬반트의 기능을 충족한다. 이것의 톨-유사 수용체-5(Toll-like receptor-5) (TLR-5)와의 상호작용에 기인하여, FliC는 대식세포(macrophage) 및 수지상 세포(dendritic cell)의 성숙을 촉진하고, 이로 인해 면역 반응의 발생이 유도된다((Mc Dermott P.F..High-affinity interaction between Gram-negative flagellin and a cell surface polypeptide results in human monocyte activation. Infect. Immun. - 2000. - V. 68. - p.:5525-5529; Means T.K. et al. The Toll-like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells. J.Immunol. - 2003. - V.170. - p.:5165-5175).

최근에, 플라젤린은 가장 유망하고 가장 특징지어진 새로운 세대의 아쥬반트 중의 하나로 고려된다. 연구의 결과는 플라젤린과 함께 주입된 재조합 단백질이 증가된 면역원성 및 항원성 특징을 보유한다는 것을 나타낸다. 그의 반응은 더 단기간 동안 기록되었고, 강한 세포-매개 및 체액성 면역 반응을 유도하였다(Balaram, 2008).

본 발명에 있어서, 플라젤린 성분은 아쥬반트로서 작용할 수 있다는 것을 보여준다. 두 개의 수용체-활성 도메인이 플라젤린의 말단 영역에서 발견되었다(아미노산 79 - 117 및 아미노산 408 - 439) (Tonyia, 2001).

그러므로, 플라젤린의 분명한 성분을 사용하는 접근은 합리적이다(FliC 도메인 1, FliC 도메인 2).

TLR-5는 선천성 면역 세포, 상피 세포 및 내피 세포의 표면에서 발현된다 (Sebastiani G. et al. Cloning and characterization of the murine Toll-like receptor 5(Tlr5) gene: sequence and mRNA expression studies in Salmonella-susceptibleMOLF/Eimice. Genomics. - 2000. - V. 64. - p.230-240; Zarember K.A. and Godowski P.J. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J.Immunol. - 2002. - V.168. - p.554-561; Delneste, 2007). 이러한 관점에 있어서, 면역원의 전달을 상당히 촉진하는 면역화를 위한 점막(mucosa)을 사용하는 것은 합리적이다.

이러한 방법에 있어서, WO2004102199 A2에 기술된 발명 및 상기 언급된 문헌에 기술된 컨스트럭트(construct) CTB-PsaA는 본 발명과 가장 유사한 것으로 참조될 수 있다. 그러나, 상기 언급된 국제 출원에 있어서, 개별적인 백신 구성 성분으로서 단백질 또는 그들의 기능적 단위를 사용하는 것이 제안된다. 본 발명은 그러나, 그의 특정 폐렴 연쇄상구균 단백질 성분외에 아쥬반트를 포함하는 키메라 단백질에 기초한다. 그러므로, 본 발명의 프로토타입(prototype)은 브라질 저자에 의해 기술된 키메라 단백질이다.

키메라 단백질 CTB-PsaA는 아쥬반트로서 기능하는 콜레라 독소의 B-서브유닛뿐만 아니라 폐렴연쇄상 구균의 6B 혈청형의 PsaA(289 아미노산)을 포함한다(Areas AP, Oliveira ML, Miyaji EN, Leite LC, Aires KA, Dias WO, Ho PL. Expression and characterization of cholera toxin B-pneumococcal surface adhesin A fusion protein in Escherichia coli: ability of CTB-PsaA to induce humoral immune response in mice. Biochem Biophys Res Commun.　2004 Aug 13;321(1):192-6). 그러나, 전체 크기의 단백질 대신에 단백질 단편, 항원 결정기(antigenic determinant)를 사용하는 것이 정확한 분자적 접힘(folding)을 제공하는데 유리하고 용이하다. 정확하게 이 방법-가장 면역원성이 높은 단백질 단편의 사용-이 본 발명의 형성을 위해 고려되었다. 사람은 콜레라 독소에 고도로 민감하고, 8 ㎍의 독소만으로 강한 설사를 일으킬 수 있기 때문에, 본 발명자들은 또한 백신의 구성 성분으로서 콜레라 독소 또는 그의 성분의 사용이 플라젤린과 비교하여 덜 안전하다는 것을 고려한다. 이 키메라 단백질을 생산하기 위한 방법에 있어서, PsaA-단백질을 암호화하는 유전자는 플라스미드로부터 분리되어 증폭되었고, 나중에 플라스미드에 삽입된 후에, CTB-암호화 유전자를 포함하는 벡터 내의 제한-자리를 통해 클로닝되었다. 본 발명의 경우에 있어서, 본 발명자들은 전체 키메라 단백질을 암호화하는 전체-크기 유전자의 합성을 사용하였다.

본 발명은 유연 연결(flexible link)를 통해 연결된, 아쥬반트의 기능을 갖는 플라젤린(1 - 169 아미노산 gb|AAB33952.1| 플라젤린 {대안적으로 스플라이스(splice)된} [쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)], 311 - 405 아미노산 gb|AAB33952.1| 플라젤린 {대안적으로 스플라이스된} [쥐티푸스균]) 성분뿐만 아니라, 단백질 PspA (160-262 아미노산 gb|EHD89266.1| 폐렴구균 표면 단백질 A [폐렴연쇄상 구균]), Spr1895(94 - 161 아미노산 ref|ZP_01836139.1| LysM 도메인 단백질 [폐렴연쇄상 구균]), 및 PsaA (238 - 309 아미노산 gb|AAF70667.1| PsaA [폐렴연쇄상 구균])의 면역원성 단편을 포함하는 고도로 정제된 키메라 단백질(서열번호 1), 또는 그들의 아미노산 서열에 따라 60% 이상 상기 열거된 것과 상동성인 단백질 동족체(homolog)에 기초한 백신을 포함한다. 본 발명에 따른 백신은 기술된 키메라 단백질을 암호화하는 재조합 DNA, 대장균(Eschericia coli) (E. coli) 박테리움 내에서 이것의 발현을 고수준으로 제공하는 벡터 컨스트럭트 내에 이러한 DNA의 삽입, 앞서 인용한 생물체 내에서 키메라 단백질의 생산, 그의 추출, 정제 및 생리학적으로 허용가능한 담체와의 혼합의 결과로서 수득된다.

본 발명과 일치하게 키메라 단백질을 생산하기 위해, 분자생물학적 및 미생물학적 표준 방법이 사용될 수 있고, 이는 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진자에 익숙하다. 이러한 방법은 충분하게 과학적 문헌에 기술되어 있다.

백신의 도입 후에, 생물체는 백신의 키메라 단백질 내에 존재하는 세균 표면 단백질의 에피토프에 대한 항체를 생산하고, 폐렴연쇄상 구균의 유입에 반응하여 항체를 생산하는 능력을 얻는다. 언급된 미생물의 모든 혈청형에 존재하는 보존성 폐렴구균 단백질의 항원 결정기는 백신의 키메라 단백질에 의해 제시된다; 그러므로 백신 접종 후 면역 반응은 모든 폐렴구균 혈청형에 직면 즉시 발달할 것이다. 다수의 단백질의 에피토프의 사용은 백신 효능의 증가를 일으킬 것이다. 인간 혈청 내에 폐렴연쇄상 구균에 대한 보호 항체의 존재는 사람이 병이 나지 않게 하거나 또는 병이 더 잘 극복하게 할 것이다.

백신은 예방적 및 치료적 효과 둘 다를 보유한다.

특정 면역 반응이 면역학적 기억 형성으로 방출되는 다수의 보존성 폐렴구균 단백질의 면역원성 에피토프에 의해 단백질이 제시된다는 사실에 따라서, 본 발명 사용의 기술적 결과는 폐렴연쇄상 구균에 의해 유발되는 질병과 관련된 예방적 및 치료적 효과의 가용성에 기인한 폐렴구균으로부터의 보편적인 방어에 있다.

본 발명 사용의 기술적 결과는 또한 컨스트럭트 내의 플라젤린 성분 또는 그와 60% 이상 상동성인 단백질 사용에 의해 제시되는 아쥬반트에 기인한 백신 활성 성분에 대한 면역 반응 강화에 있다.

기술적 결과는 또한 비독성 성분-아쥬반트(플라젤린 성분 또는 그와 60% 이상 상동성인 단백질)의 사용에 따른 백신 안전성 증가에 있다.

본 발명은 다음의 도면에 의해 도식화된다:
도 1. 키메라 단백질의 3D-구조, α-헬릭스 및 β-시트가 묘사된다.
도 2. 키메라 단백질의 3D-구조, 아미노산 잔기가 묘사된다.
도 3. 1 LD 폐렴연쇄상 구균 감염 후에 마우스 생존(%)의 역학 (예방 모델)
도 4. 1 LD 폐렴연쇄상 구균 감염 후에 마우스 생존(%)의 역학 (치료 모델)

실시예 1. 키메라 단백질 모델링( modeling )

계획된 키메라 단백질은 복합 다중도메인 단백질(complex multidomain protein) (5 도메인: FliC1, FliC2, PspA, PsaA, Spr1895). 다중도메인 단백질의 모델링을 위해 다음의 과정을 수행하였다: 도메인 경계(boarder)의 평가, 도메인 배향(orientation)의 평가를 위한 전체 단백질의 모델의 구축, 각 도메인을 위한 모델의 구축(3D 구조 및 압이니시오(ab initio)-기반 모델링의 예 사용), 전체 단백질의 모델을 사용하여 모델의 도킹(docking).

계획된 키메라 단백질에 있어서, 두 개의 도메인은 포로토타입(prototype)을 보유했고, 그 중 3개는 압이니시오-기반 모델링이 필요했다; 또한 압이니시오-기반 모델링동안 본 발명자들은 도메인 사이에 유연 연결(flexible link)을 형성해야 했다.

자동 모드에서 현실적인 결과의 생성을 위해, 마지막 세 개의 CASPs(Critical Assessment of protein Structure Prediction)- 단백질-모델링 경쟁(protein-modeling competition) 중 가장 좋은 것으로 간주되는 아이-태서 알고리즘(I-Tasser algorithm)을 사용하였다. 이 분석은 3일 동안 수행하였다. 그러나, 이 강력한 알고리즘의 방법으로도, 도메인 및 그들의 경계의 압이니시오-기반 모델링을 포함하는 다중 도메인 단백질에 대한 현실적인 데이타는 완전히 유효하지 않다(70%).

더욱 정확한 데이터의 생성의 목적을 위해, 단백질을 사용된 도메인으로 나누고, 이후 그들의 모델링을 아이-태서(I-Tasser)를 사용하여 수행한 후, 그들의 도킹을 수행하였다.

상기 언급된 모든 단계 후에, 구조가 구축되었고, 도 1, 2로 나타내었다.

모델링된 키메라 단백질은 536의 아미노산 잔기로 이루어진다; 이들의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 제공된다. 프로트파람 프로그램 (ProtParam program) (http://au.expasy.org/tools/protparam.html)을 통한 이 단백질의 아미노산 서열의 분석은 키메라 단백질의 분자량이 56.6 kDa, pI 4.56이라는 것을 나타냈다.

실시예 2. 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 생산

PspA, Spr1895, PsaA, FliC도메인1, FliC도메인2를 포함하는 키메라 단백질의 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열(1623 bp)로 번역되었고, 이후 이는 대장균(E. coli) 세포 중 발현을 위해 최적화되었다.

뉴클레오티드 서열의 합성은 기술된 방법(Majumber, 1992)에 따라 오버랩핑(overlapping) 올리고뉴클레오티드의 연장(elongation)을 통해 수행하였다. 올리고뉴클레오티드는 70 뉴클레오티드 길이의 키메라 유전자의 단편으로 제시되었고, 20 뉴클레오티드의 오버랩핑 영역을 포함하였다. 주요 프라이머 요건은 다음과 같다: 그들의 길이는 60 뉴클레오티드를 초과하여 허용되지 않았고, 반면 혼성화 부위는 20 뉴클레오티드보다 짧게 허용되지 않았다. 또한, 긴 말단 G/C 반복은 존재하도록 허용되지 않았다. 특정 경우에 있어서, 최적 프라이머의 선택은 경험적으로 프라이머-주형 이동(primer-template movement) 또는 3 내지 6 뉴클레오티드로의 프라이머 길이 변화를 통해 수행하였다. 완전히 1623 bp 길이 키메라 유전자의 합성을 위해, 59개의 프라이머를 사용하였다. 합성된 단편(각 300 bp)은 겔 전기영동을 통해 추출하였고, 플라스미스 벡터 pGEM-T Easy로 클로닝하였다. 클로닝은 경우에 따라서 제한 자리 Kpnl, SacII, EcoRV, BamHI를 포함하거나, 또는 무딘 말단(blunt end)을 통해 수행하였다. 시퀀싱(sequencing) 후에 단편을 증폭하였고, 이후, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 키메라 단백질의 뉴클레오티드 서열로 합쳤다. 단편의 라이게이션(ligation)을 통한 키메라 유전자 합성의 최종 단계 후에, 인공 유전자(artificial gene)를 KpnI 및 SacI 제한 자리를 통해 pGEM-T 벡터로 클로닝하였다. 생산된 유전자는 부가적인 제한 자리에 의해 플랭크(flank)되었다: 5' 말단에서 EcoRI 및 3' 말단에서 XhoI. 다음에, 인공 유전자는 EcoRI 및 XhoI 제한 자리를 통해 발현 벡터 pET24a로 클로닝 되었다.

실시예 3. 키메라 단백질을 암호화하는 플라스미스 DNA 의 생산

실시예 2에 개시된 방법에 따라서, 폐렴구균 백신의 생산을 위한 뉴클레오티드 서열을 얻었다.

결과 유전자는 이후의 발현을 위해 pET24a 플라스미드로 클로닝되었다. 그를 위해 적절한 버퍼 및 리가아제(ligase)를 통한 유전자 및 pET24a 벡터의 라이게이션을 수행하였다. 반응은 +20℃에서 2시간 동안 수행하였다.

혼합물을 +95℃에서 10분 동안 가온하였고, 이후 0.025 ㎛의 공극 크기를 갖는 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터(nitrocellulose membrane filter) (Millipore, USA)을 통한 투석을 통해 염을 제거하였다. 투석은 10분 동안 10% 글리세롤 중 0.5 mM EDTA를 포함하는 용액에 대해 수행하였다.

실시예 4. 키메라 유전자를 암호화하는 플라스미드 DNA 의 증폭을 위한 대장균( E. coli ) 균주의 생산

실시예 3에 개시된 방법에 따라서, 폐렴구균 백신의 생성을 위한 유전자의 뉴클레오티드 서열을 생산하였고, pET24a 벡터에 클로닝하였다. 다음의 유전자형을 보유하는 균주 DH10B/R (Gibko BRL, CIIIA)로부터의 대장균 세포: F- mcrA △( mrr - hsdRMS - mcrBC ) φ80 dlacZ △M 15 △ lacX74 deoR recA1 endA1 araD139 △( ara , leu )769 galU galK λ- rpsL nupG를 전기천공법(electroporation)을 통해 결과 플라스미드에 형질전환하였다.

형질전환 후에, 세포를 +37℃에서 40분 동안 SOC 배지(2% 박토트립톤(bactotryptone), 0.5% 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM 포도당)에서 배양하였다.

LB-아가 및 100 ㎍/ml 암피실린을 포함하는 선택적 배지 중 플라스미드의 존재의 식별을 위한 대장균 세포의 스크리닝을 통해, 키메라 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA의 이후의 증폭을 위한 대장균주를 얻기 위해 적절한 대장균 세포를 샘플링(sample)하였다.

플라스미드 DNA는 위자드 미니프렙 DNA 정제 시스템 키트(Wizard Minipreps DNA Purification System kit) (Promega, USA)를 사용하여 성장 클론(grown clone)으로부터 추출하였다.

정제된 플라스미드 DNA는 제한 분석 및 시퀀싱을 통해 필요한 것으로 입증되었다. 연구의 진행 동안, 클론을 샘플링하였고, 이것은 플라스미드 내에서 요구되는 크기의 DNA 단편을 포함하였다. 다음에, 이러한 플라스미드를 유전자 발현의 이후의 유도를 위해 추출하였다.

실시예 5. 키메라 단백질의 대장균 생산 균주( producer strain )의 수득

실시예 4에 개시된 방법에 따라서, 단백질의 뉴클레오티드 서열을 폐렴구균 백신의 생산을 위해 수득하였고, 이후 pET24a 플라스미드에 클로닝하였다; 결과 플라스미드를 균주 DH10B/R로부터의 대장균 세포에서 증폭하였고, 이후 추출하였다.

단백질의 발현을 위해, 다음의 유전자형을 갖는 균주 BL21 스타(Star) (DE3) (Invitrogen, USA)로부터의 대장균 세포를 사용하였다: F- ompThsdSB ( rB - mB -) gal dcm rne131 ( DE ), 게놈(genome)에 λ De3 라이소겐(lysogen) 및 rne131 돌연변이 포함. 돌연변이체 rne-유전자(rne131)는 세포 내 mRNA 분해를 감소시키고 이러한 방법으로 그의 발효 안정성을 증가시키는 RNase E의 짧은 버젼(short version)을 암호화한다. 프로테아제 내의 lon - 및 ompT - 돌연변이는 비단백질가수분해된(nonproteolysed) 재조합 단백질을 고수율로 수득할 수 있게 한다.

F- ompT hsdSB ( rB - mB -) gal dcm rne131 (DE3) 유전자형을 갖는 균주 BL21로부터의 대장균 세포는 다음과 같이 준비되었다. 세포를 1% 트립톤, 1% 효모 추출물 및 1% 염화나트륨을 포함하는 5 ml L-브로스(broth)에서 +37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양물을 신선한 L-브로스에서 40 내지 100 배로 희석하였고, 590 nm 파장에서 0.2 내지 0.3의 흡광도(optical density) (OD)까지 +37℃에서 진탕배양기에서 배양하였다. 0.3 OD에 도달한 후에, 배양물을 신선한 L-브로스에서 0.1 OD까지 희석하였고, 30분 동안 배양하였다. 100 ml 부피의 배양물을 멸균된 원심분리 튜브로 옮기고, 세포 펠렛팅(pelleting)을 +4℃, 5000g에서 10분 동안 수행하였다. 상층액은 버리고, 세포를 이후의 원심분리하에서 초기 부피로 탈염수(deionized water)에서 재현탁하였다. 세척 단계는 세 번 반복하였다. 세척 후에 세포 펠렛(pellet)을 탈염수의 작은 부피로 재현탁하였고, 현탁액은 마이크로원심분리기에서 5000 rpm에서 30초 동안 원심분리하였다.

컴피턴트(competent) 세포의 형질전환은 전기천공법을 통해 수행하였다. 이에, 플라스미드 DNA의 1 ㎕를 컴피턴트 세포의 12 ㎕에 첨가하였고, 현택액을 혼합하였다. 이후의 전기천공법은 펄스 제네레이터(pulse generator) GVI-1(ΓΒΗ-1) (St. Petersburg State Polytechnical University, St. Petersburg)를 통해 멸균된 챔버에서 4 msec 동안 10 kV/cm에서 수행하였다.

형질전환 후에 세포를 +37℃에서 40분 동안 SOC 배지(2% 박토트립톤(bactotryptone), 0.5% 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM 포도당)에서 배양하였다. 10 내지 100 ㎕ 세포 현탁액을 플라스미드을 갖는 클론(생산 균주(producer strain))의 선별을 위해 암피실린 (100 ㎍/ml)을 포함하는 선택적 LB 배지 (Gibko BRL, USA)에 옮겼다.

컴피턴트 대장균 세포의 형질전환 후에 수득한 플라스미드는 암호화된 재조합 단백질의 높은 수준의 발현을 제공한다.

실시예 6. 스튜디어 방법( Studier method )에 따른 0.2% 락토오즈에 의한 단백질 합성 유도를 통한 대장균 세포 내 폐렴구균 백신의 생성을 위한 키메란 단백질의 생산

실시예 5에 개시된 방법에 따라서, 폐렴구균 백신의 생성을 위한 키메라 단백질의 뉴클레오티드 서열을 얻었고, pET24a 플라스미드에 클로닝하였다; 수득된 플라스미드를 균주 DH10B/R로부터의 대장균 세포에서 증폭하였고, 추출하였고, 및 균주 BL21로부터의 대장균세포를 목적 유전자 발현 유도의 목적을 위해 그의 안에서 형질전환하였다.

수득된 생산 균주의 배양의 목적을 위해, 비특이적 발현의 차단을 위한 암피실린 (100 ㎍/ml) 및 1% 포도당을 포함하는 표준 아가화된(agarized) LB 배지를 사용하였다.

발현 유도는 세포 배양이 600 nm에서 0.6 내지 0.8 OD의 흡광도에 도달한 후에 수행하였다.

0.2% 락토오스즈는 유도 물질(inductor)로서 사용하였다(Studier, 2005).

스튜디어 방법(Studier's method)에 따른 발현의 자가유도(autoinduction)를 위해(Studier, 2005), 1% 펩톤(peptone) (Gibco, USA), 0.5% 효모 추출물 (Gibco, USA), 50 mM Na₂HPO₄, 50 mM K₂HPO₄, 25 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0.5% 글리세롤, 0.05% 포도당 및 0.2% 락토오즈를 포함하는 PYP-5052 배지를 사용하였다.

단일 생산 균주 콜로니를 암피실린 (100 ㎍/ml)을 포함하는 PYP-5052 배지에 접종하였다. 발효는 시간당 OD₆₀₀에서 유의적인 변화가 없음이 기록될 때까지 +37℃에서 시간 동안 250 rpm에서 항온 진탕기(thermostatic shaker)에서 수행하였다. 백신 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 분석의 목적을 위해 세포의 앨리쿼트(aliquot)를 취하였다. 발현 분석은 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (PAGE)을 통해 수행하였다. 바이오매스(biomass)의 나머지는 9000g에서 원심분리하여 펠렛팅하였다.

단백질은 세포 용해를 통해 대장균 세포로부터 추출되었다. 세포는 20 mM 트리스-HCL pH7.5, 5 mM EDTA, 및 1 mM 페녹시메틸설포닐플루오라이드(Phenoxymethylsulfonylfluoride) (PMSF)를 포함하는 라이시스 버퍼(lysis buffer)에서 5 내지 7 ml 버퍼당 1 g 세포 기반으로 재현탁하였다. 세포 현탁액은 30초 동안 30 초 간격으로 7번 초음파에 노출시켰다(22 kHz). 용해물은 +4℃, 5000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액은 버리고, 펠렛은 강력한 혼합으로 1 g 세포 당 1 ml 기반으로 1 M 요소 용액에서 재현탁하였다. 원심분리 단계를 반복하였다. 상층액을 버리고, 펠렛을 동일한 부피의 2 M 요소(urea) 용액에서 재현탁하였다. 원심분리 단계를 반복하였다. 상층액을 버렸다.

SDS-페이지 (소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate)를 갖는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동) 데이터에 따라서, 수득된 산물은 농도 1 mg/ml의 키메라 단백질의 약 97%를 포함하였다.

추출 및 정제 조건은 실험적으로 조정되었고, 이에 익숙한 통상의 기술자에게 알려진 일부 정도로 다양할 수 있다.

실시예 7. 폐렴연쇄상 구균( S. pneumoniae )에의 치명적 감염 예방 모델에서, PspA, Spr1895 , PsaA , FliC도메인1 , FliC도메인2를 포함하는 키메라 단백질에 기초한 백신의 보호 효과

키메라 단백질의 보호 효과의 평가를 위해 마우스를 사용하였다.

대조군 및 실험군은 7-8 주령의 30마리의 Balb/c 암컷 마우스(18 내지 20 g 중량)로 구성하였다. 키메라 단백질의 10 ㎍을 각 마우스에 도입하였다. 접종 1주 후에, 마우스를 폐렴구균으로 감염시켰다: 마우스당 폐렴연쇄상 구균의 10⁴ cfu (콜로니-형성 단위)를 복강으로 주사하였다(이는 마우스에 대하여 최소 치사량이다). 생존 연구는 폐렴구균의 치사량의 주입 후 즉시 시작하였고 14일 동안 지속하였다(도 3).

재조합 키메라 단백질-기반 백신으로 면역화된 마우스는 감염 후 1주에 80%의 생존율 및 14일째에 68%의 생존율을 나타내었다. 대조군의 생존율은 5일째에 0%가 되었다.

그러므로, 제공된 백신은 보호 효과를 보유한다. 또한, 백신의 시험된 용량 (10 ㎍/마우스)은 마우스에 어떠한 독성 효과도 갖지 않았다.

실시예 8. 폐렴연쇄상 구균( S. pneumoniae )에의 치명적 감염 치료 모델에서, PspA, Spr1895 , PsaA , FliC도메인1 , FliC도메인2를 포함하는 키메라 단백질에 기초한 백신의 보호 효과

대조군 및 실험군은 7-8 주령의 30마리의 Balb/c 암컷 마우스(18 내지 20 g 중량)로 구성하였다. 마우스에 폐렴구균으로 감염시켰다: 마우스당 폐렴연쇄상 구균의 10⁴ cfu (콜로니-형성 단위)를 복강으로 주사하였다(이는 마우스에 대하여 최소 치사량이다). 동일자에 키메라 단백질의 10 ㎍를 각 마우스에 접종하였다. 생존 연구는 폐렴구균의 치사량의 주입 후 즉시 시작하였고 14일 동안 지속하였다.

폐렴구균 및 키메라 단백질-기반 백신의 동시 도입 후에, 마우스는 도입 후 1주일에 76%의 생존율 및 14일째에 65%의 생존율을 나타내었다. 대조군의 생존율은 5일째에 0%가 되었다.

이러한 결과는 본 발명에서 제공된 백신의 고 면역원성을 입증한다. 그러므로, 백신은 폐렴구균 감염의 치료를 위해 사용될 수 있다.

<110> Epitope Limited (Epitope Ltd) <120> Chimeric protein vaccine against pneumonia caused by Streptococcus pneumoniae <150> RU 2012126328 <151> 2012-06-22 <160> 1 <210> SEQ ID NO:1 <211> 536 <212> protein <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> from 1 to 169 amino acids <223> FliC domain 1, from 1 to 169 amino acids of gb|AAB33952.1| flagellin {alternatively spliced} [Salmonella typhimurium] <220> <221> DOMAIN <222> from 182 to 276 amino acids <223> FliC domain 2, from 311 to 405 amino acids of gb|AAB33952.1| flagellin {alternatively spliced} [Salmonella typhimurium] <220> <221> DOMAIN <222> from 281 to 386 amino acids <223> PspA epitope, from 160 to 262 amino acids of gb|EHD89266.1| pneumococcal surface protein A [Streptococcus pneumoniae] <220> <221> DOMAIN <222> from 391 to 458 amino acids <223> Spr1895 epitope, from 94 to 161 amino acids of ref|ZP_01836139.1| LysM domain protein [Streptococcus pneumoniae] <220> <221> DOMAIN <222> from 466 to 536 amino acids <223> PsaA epitope, from 238 to 309 amino acids of gb|AAF70667.1| PsaA [Streptococcus pneumoniae] <400> 1 Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn 1 5 10 15 Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser 20 25 30 Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala 35 40 45 Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser 50 55 60 Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val 85 90 95 Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln 100 105 110 Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln 115 120 125 Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr 130 135 140 Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys 145 150 155 160 Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 165 170 175 Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ala Thr Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys 180 185 190 Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly 195 200 205 Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr 210 215 220 Val Asn Asn Leu Thr Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr 225 230 235 240 Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala 245 250 255 Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu 260 265 270 Ser Leu Leu Arg Gly Gly Gly Ser Ala Met Ala Asp Leu Lys Lys Ala 275 280 285 Val Asn Glu Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala 290 295 300 Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Ala Pro 305 310 315 320 Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu 325 330 335 Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln 340 345 350 Gln Pro Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Val Pro Lys Pro 355 360 365 Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Thr Gly Trp Gly Gln Glu Asn Gly 370 375 380 Met Trp Gly Gly Gly Ser Asn Glu Ala Glu Glu Val Thr Glu Val Glu 385 390 395 400 Ile Gln Thr Pro Gln Ala Asp Ser Ser Glu Glu Val Thr Thr Ala Thr 405 410 415 Ala Asp Leu Thr Thr Asn Gln Val Thr Val Asp Asp Gln Thr Val Gln 420 425 430 Val Ala Asp Leu Ser Gln Pro Ile Ala Glu Ala Pro Lys Glu Val Ala 435 440 445 Ser Ser Ser Glu Val Thr Lys Thr Val Ile Gly Gly Gly Gly Ser Ser 450 455 460 Ser Leu Val Glu Lys Leu Arg Gln Thr Lys Thr Pro Ser Leu Phe Val 465 470 475 480 Glu Ser Ser Val Asp Asp Arg Pro Met Lys Thr Val Ser Gln Asp Thr 485 490 495 Asn Ile Pro Ile Tyr Ala Gln Ile Phe Thr Asp Ser Ile Ala Glu Gln 500 505 510 Gly Lys Glu Gly Asp Ser Tyr Tyr Asn Met Met Lys Tyr Asn Leu Asp 515 520 525 Lys Ile Ala Glu Gly Leu Ala Lys 530 535

Claims (1)

1. 유연 연결(flexible link)을 통해 연결된,
   폐렴 연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 단백질의 단편: PspA (아미노산 160-262 gb|EHD89266.1|), Spr1895 (아미노산 94-161 ref|ZP_01836139.1|), 및 PsaA (아미노산 238-309 gb|AAF70667.1|), 및
   아쥬반트로서 기능하는 플라젤린(flagellin) 성분 (아미노산 1-169 gb|AAB33952.1| 및 아미노산 311-405 gb|AAB33952.1|)를 포함하는 키메라 단백질(서열번호 1)에 기초한 폐렴 연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)에 대한 폐렴구균(pneumococcal) 백신 및 그들의 아미노산 서열과 60% 이상 상동성인 단백질 또는 펩타이드 동족체(homolog).

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