CN104470538B - 针对由肺炎链球菌引起的肺炎的嵌合蛋白疫苗 - Google Patents

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Abstract

要解决的问题：对于肺炎链球菌(S.pneumoniae)引起的疾病的预防和治疗，缺少能够针对所有肺炎链球菌菌株提供防御的安全有效的疫苗(缺少抗肺炎球菌的通用疫苗)。解决方案：提供了包括SEQ ID NO:1所示的嵌合蛋白的疫苗，所述嵌合蛋白包含通过柔性连接体连接的保守的肺炎链球菌蛋白的免疫原性表位：PspA、Spr1895、PsaA以及鞭毛蛋白成分，其中所述鞭毛蛋白成分充当佐剂。显示出安全性、效力以及预防和治疗作用。

Description

针对由肺炎链球菌引起的肺炎的嵌合蛋白疫苗
发明领域
本发明涉及医学、药学、生物技术，并且可以用于预防和治疗由肺炎球菌(肺炎链球菌(S.pneumoniae))引起的肺炎。
发明背景
术语“杂合(或嵌合)蛋白”指的是由于重组DNA分子的表达而获得的蛋白质，其中数个不同基因的编码阵列被划定在一个阅读框中。
肺炎(与肺热同义)是成人和儿童的常见疾病，并且需要谨慎的诊断和治疗。据医学统计，每年有超过一百万的俄罗斯人感染肺炎，并且对于5％的患者而言，该疾病结果致死(http：//www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/ru/index.html)。
术语“肺炎”指的是宽范围的疾病，其中的每一种都具有其特有的病原学、发病机理、临床表现、X-射线特征、实验数据和具体治疗，可以作为独立的疾病或者作为其它疾病的延续进展。
肺炎是人类呼吸系统的炎性状况。肺炎的病原体有病毒和真菌，但是该疾病最常见的是由细菌引起。引起细菌性肺炎的最常见的病原体为肺炎球菌(Pneumococcus)(肺炎链球菌(S.pneumoniae))。咽微生物群的检查已经表明，5-25％的健康人是肺炎球菌的携带者。
肺炎球菌的特征在于厚多糖荚膜，其保护病菌免遭调理作用和随后的吞噬作用。由于荚膜转变为被免疫系统识别的肺炎球菌的主要表面结构的事实，荚膜多糖的特征在于最高的可变性。到目前为止，已经检测到肺炎球菌的91种不同荚膜类型；然而，大多数(多于90％)侵袭性肺炎球菌疾病是由23种最普遍的血清型引起的。大量的荚膜多糖免疫变体成为使有效多糖疫苗的生产复杂化的因素。
每个人都可能遭受肺炎球菌感染，但存在若干危险群体具有较高预期易患这种疾病。他们是65岁及更老龄的人、小婴儿、有某些健康异常的人、免疫系统低下的人、吸烟者。
在许多情况下，肺炎球菌感染对治疗几乎无响应，而许多循环的流行性肺炎球菌菌株产生多种抗生素抗性。出于预防目的，使用疫苗。根据WHO(世界卫生组织)和俄罗斯呼吸系统协会(Russian Respiratory Society)，“接种疫苗是预防肺炎球菌感染途径的唯一可能”。目前，FDA(食品和药物管理局)批准了两种类型 的疫苗：肺炎球菌结合疫苗和肺炎球菌多糖疫苗(http：//www.nlm.nih.gov/medlin eplus/pneumococcalinfections.html)。在俄罗斯联邦，下列疫苗被批准：由法国San ofiPasteur生产的Pneumo 23(PPSV23)——23价肺炎球菌多糖疫苗，和由WyethPharmaceuticals Inc.,USA生产的PrevenarTM(PCV7)——7价肺炎球菌多糖结合疫苗。
肺炎球菌多糖疫苗(PPSV)被指示用于成人。大多数接种PPSV的成人在接种后2-3周产生对大多数细菌菌株(其抗原存在于疫苗中)的抗性。在老年人、2岁以下的儿童以及患有慢性疾病的人群中，接种疫苗可能不会导致持久性免疫的产生，或者对疾病的免疫力可能完全不产生(http://www.nlm.nih.gOv/medlineplus/l anguages/pneumococcalinfections.html#Russian)。此外，接种疫苗可引起诸如下列的并发症：红斑、注射部位的痛觉、发热、肌痛或者严重的局部反应(Donalisio MR,Rodrigues SM,Mendes ET,rutman M.Adverse events after pneumococcal vaccination.J BrasPneumol.2007Feb；33(l)：51-6)。
然而，PPSV仅在低危感染肺炎球菌疾病的人群中变得显著有效。对于2岁以下的儿童，推荐在接种疫苗期间同时使用抗生素预防(Bade A,Diot P,Lemarie E.Anti-pneumococcal vaccine:justifications and results.Rev Pneumol Clin.1997；53(3)：128-37)。
看起来PPSV并不降低肺炎的频率及其致死率，而只降低遭受严重肺炎球菌感染的风险。还显示当前的疫苗不抵御对高浓度青霉素敏感的肺炎球菌菌株(Pneumococcalvaccine:a second look.Solution for SC or IM injection:pneumococcalvaccine.Prescrire Int.1998Feb；7(33):16-8)。对于超过65岁的人群，也报道了这样的结果(Pneumococcal vaccination for elderly subjects：license extension.Still noproof of clinical efficacy.Prescrire Int.2000Aug；9(48)：106-9)。
PPSV的有效成分是23种血清型的链球菌多糖的混合物，该血清型引起上至90％的具有肺炎球菌病原学的侵袭性疾病。多糖是与T细胞反应有关的抗原，因此其只导致短期免疫的产生，而不形成免疫记忆；仅包含上述成分的疫苗是无效的，这已显示于2岁以下的儿童(Greenwood B M et al.,Trans R Soc Trop Med Hyg,1980,74：756-760；国际申请WO2010120921Al的公开版本,有效期日期16.04.2009)。由于世界上不同区域的感染因子不同而存在超过90种肺炎球菌血清型的事实，也使通用多糖基疫苗的生产复杂化。
连同在儿童体内最频繁引发疾病的七种肺炎球菌血清型的多糖，推荐用于儿童的结合疫苗包含载体蛋白CRM 197(白喉毒素突变体)，其充当佐剂的角色。由于疫苗中佐剂的存在，这种抗原复合物被T细胞很好地识别，确保持久性免疫(Schneerson R,Barrera O,Sutton A,Robbins JB.Preparation,characterization,and immunogenicity ofHaemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.J ExpMed.1980 Aug l；152(2)：361-76)。CRM 197结合至肝素结合EGF样生长因子 (HB-EGF)。尽管事实是CRM197的毒性比白喉毒素的毒性低约106倍，但也应该小心地使用它，尤其是在高剂量情况下(Takuya Kageyama,Minako Ohishil,Shingo Miyamoto,Hiroto Mizushima,Ryo Iwamoto and Eisuke Mekada.Diphtheria Toxin Mutant CRM 197 Possesses WeakEF2-ADP-ribosyl Activity that Potentiates its Anti-tumorigenicActivity.Received April 16,2007.Accepted May 2,2007)。此外，接种疫苗可引起下列并发症：红斑、注射部位的皮肤痛(dermatodynia)和硬结、体温升至38-39℃(100.4-102.2°F)以及不安、嗜睡和食欲不振。此外，建议给儿童如下接种疫苗：年龄在2岁以内的4次，年龄在2至5岁的根据孩子的年龄。总而言之，需要给儿童接种疫苗至少四剂，这是昂贵且不安全的。
已知疫苗包含两种主要的成分：脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidi)的表面多糖和肺炎链球菌的PsaA-蛋白(也可使用PspA-蛋白)(国际申请WO2010120921Al的公开版本,优先权日2009年4月16日)。考虑到不能产生多糖的免疫记忆，我们认为脑膜炎奈瑟氏菌的表面多糖用作疫苗成分是不适当的。反过来PsaA-蛋白和PspA-蛋白的轮流使用是合理的：它们是能够诱导免疫应答和免疫记忆的肺炎球菌表面抗原。
请求保护的疫苗的作用基于强免疫应答的诱导和随后免疫记忆的产生。因此，本发明的中心位置不是被多糖占据，而是被利用基于分子生物学的方法和重组DNA而获得的肺炎球菌蛋白占据。根据文献中的数据，最有前景的基于蛋白的抗原是三种表面蛋白：PsaA、PspA、Spr1895。
PsaA-蛋白也被公开为WO2004102199A2的国际申请、优先权日2003年5月16日的作者认为是一种有前景的免疫原。作者提到了这种和多种其它蛋白(Slr A——脂蛋白旋转异构酶、IgAl——蛋白酶、PpmA——链球菌成熟蛋白)或者它们的复合物，作为疫苗创建的基础。然而，我们认为使用肺炎链球菌的其它表面蛋白——除了PsaA、PspA和Spr1895以外——的方法更有前景。
包含PsaA和具有佐剂功能的霍乱毒素的B亚单位的嵌合蛋白被描述过(Areas AP,Oliveira ML,Miyaji EN,Leite LC,Aires KA,Dias WO,Ho PL.Expression andcharacterization of cholera toxin B-pneumococcal surface adhesin A fusionprotein in Escherichia coli:ability of CTB-PsaA to induce humoral immuneresponse in mice.Biochem Biophys Res Commun.2004 Aug 13；321(l):192-6)。然而，我们认为使用霍乱毒素或其复合物—与鞭毛蛋白相比—作为疫苗成分是不太安全的，而人类有机体对霍乱毒素高度敏感，因而即使8μg的毒素也可引起强烈腹泻。
研究显示，使用PsaA-蛋白和PspA-蛋白作为肺炎球菌疫苗创建的基础是合理的。PsaA-蛋白在不同的肺炎球菌血清型中是高度保守的，并且提供细菌附着及其毒力(BerryAM,and Paton JC:Sequence heterogeneity of PsaA,a 37-kilodalton putativeadhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae.Infect Immun1996；64:5255-5262)。显示PsaA特异性抗体对于肺炎链球菌的所有血清型都具有交联活性。
PspA是胆碱结合的表面抗原，其抑制与补体无关的吞噬作用、结合于乳铁蛋白，并且阻止与乳铁蛋白无关的细菌细胞消除(Hammerschmidt S,Bethe G,Remane PH,ChhatwalGS(1999)Identification of pneumococcal surface protein A as a lactoferrin-binding protein of Streptococcus pneumoniae.Infect Immun67:1683-1687)。在这篇文章中，提到PsaA-蛋白对于生产疫苗是有前景的。作者还显示了用于生产抗肺炎球菌感染的疫苗的候选蛋白质的范围；然而，我们认为，使用两种具体蛋白：PsaA和PspA是合理的——考虑到它们在肺炎球菌和若干其它细菌的血清型中的保守性。
提供的疫苗的主要成分之一是由磷酸结合蛋白——磷酸ABC转运体——的基因编码的Spr1895-蛋白。这种蛋白对于细菌生存和持续是至关重要的，这使其成为选择用于抵抗肺炎链球菌所引起的疾病的肺炎球菌疫苗的生产的成分。
在本发明中，鞭毛蛋白FliC满足佐剂的功能。由于它与Toll样受体-5(TLR-5)相互作用，FliC刺激巨噬细胞和树突状细胞成熟，导致免疫应答的产生(Mc DermottP.F..High-affinity interaction between Gram-negative flagellin and a cellsurface polypeptide results in human monocyte activation.Infect.Immun.-2000.-V.68.-p.:5525-5529；Means T.K.et al.The Toll-like receptor 5 stimulusbacterial flagellin induces maturation and chemokine production in humandendritic cells.J.Immunol.-2003.-V.170.-p.:5165-5175)。
目前，鞭毛蛋白被认为是最有前景和充分表征的新一代佐剂之一。研究结果显示，与鞭毛蛋白一起注射的重组蛋白具有增强的免疫原性和抗原性特征。与之的反应被报告在较短期内，并且导致较强的细胞介导的和体液的免疫应答(Balaram，2008)。
在本发明中显示，鞭毛蛋白成分可充当佐剂。在鞭毛蛋白的末端区域发现两个受体激活结构域(aa 79-117和aa 408-439)(Tonyia，2001)。
因此，利用明确的鞭毛蛋白成分的方法是合理的(FliC结构域1、FliC结构域2)。
TLR-5在先天免疫的细胞、上皮细胞和内皮细胞的表面上被表达(SebastianiG.et al.Cloning and characterization of the murine Toll-like receptor 5(Tlr5)gene：sequence and mRNA expression studies in Salmonella-susceptibleMOLF/Eimice.Genomics.-2000.-V.64.-p.230-240；Zarember K.A.and Godowski P.J.Tissueexpression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes,their products,andcytokines.J.Immunol.-2002.-V.168.-p.554—561；Delneste,2007)。鉴于此，使用粘膜用于免疫是合理的，其显著促进免疫原的运输。
以这种方式，在WO2004102199A2中所描述的发明和上述文章中所描述的构建体CTB-PsaA可被称为与本发明最类似。然而，在所提到的国际申请中，提出使用蛋白质或者其功能单元作为单独的疫苗成分。而本发明基于嵌合蛋白，该嵌合 蛋白除了特定肺炎链球菌蛋白组分以外，还包括佐剂。因此，本发明的原型是巴西作者所描述的嵌合蛋白。
嵌合蛋白CTB-PsaA包括肺炎链球菌的6B血清型的PsaA(289aa)以及充当佐剂的霍乱毒素的B-亚单位(Areas AP,Oliveira ML,Miyaji EN,Leite LC,Aires KA,Dias WO,HoPL.Expression and characterization of cholera toxin B-pneumococcalsurfaceadhesin A fusion protein in Escherichia coli：ability of CTB-PsaA toinducehumoral immune response in mice.Biochem Biophys Res Commun.2004 Aug13；321(l)：192-6)。然而，为了提供正确的分子折叠，使用蛋白片段，抗原决定簇，来代替全尺寸蛋白，是更有利和容易的。确切地，此方法——使用最具免疫原性的蛋白片段——被用于本发明的创建。我们确实认为使用霍乱毒素或者其成分作为疫苗成分与鞭毛蛋白相比不太安全，因为人们对霍乱毒素高度敏感，即使8μg的毒素也可引起强烈腹泻。关于生产这种嵌合蛋白的方法，将编码PsaA-蛋白的基因独立地从其稍后插入的质粒扩增，然后在包含CTB编码基因的载体(媒介，vector)中通过限制性位点进行克隆。在我们的实例中，我们采用合成编码嵌合蛋白的全尺寸基因。
发明内容
本发明实施了包括SEQ ID NO：l所示的高纯度嵌合蛋白的肺炎球菌疫苗，该嵌合蛋白包含通过柔性连接体连接的肺炎链球菌蛋白PspA(160-262aa gb|EHD89266.1|肺炎球菌表面蛋白A[肺炎链球菌])、Spr1895(94-161aa ref|ZP01836139.1|LysM结构域蛋白[肺炎链球菌])、PsaA(238-309aa gb|AAF70667.1|PsaA[肺炎链球菌])的免疫原性片段以及鞭毛蛋白成分(1-169aa gb|AAB33952.1|鞭毛蛋白{选择性剪接的}[鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)]和311-405aa gb|AAB33952.1|鞭毛蛋白{选择性剪接的}[鼠伤寒沙门氏菌])，其中该鞭毛蛋白成分充当佐剂。
根据本发明所述的疫苗是通过如下获得：将高纯度嵌合蛋白与生理上可接受的载体混合。
关于按照本发明生产嵌合蛋白，可以使用本领域普通技术人员所熟悉的分子 生物学和微生物学的标准方法。这样的方法最大程度地在科学文献中被描述。
在引入疫苗后，有机体产生针对疫苗嵌合蛋白中存在的细菌表面蛋白的表位的抗体，并且获得响应肺炎链球菌的入侵产生抗体的能力。存在于上述微生物的所有血清型中的保守肺炎球菌蛋白的抗原决定簇显示于疫苗的嵌合蛋白中；因此，接种疫苗后的免疫应答将在遭遇每个肺炎球菌血清型后产生。数种蛋白的表位的使用将使疫苗效力增加。人血清中抗肺炎链球菌的保护抗体的存在将使人不患病或者更好地战胜疾病。
疫苗具有预防和治疗作用。
本发明应用的技术成果在于，由于可获得关于由肺炎链球菌所引起的疾病的预防和治疗作用，全面防御肺炎球菌，这是根据如下事实：蛋白质是由利用免疫记忆形成针对其释放特异性免疫应答的、数种保守肺炎球菌蛋白的免疫原性表位呈递。
本发明应用的技术成果还在于，由于由鞭毛蛋白成分代表的佐剂，疫苗活性成分的免疫应答加强。
技术成果还在于，由于无毒性试剂-由鞭毛蛋白成分代表的佐剂的使用，疫苗的安全性增加。.
附图简述
本发明通过下列附图进行示例：
图1.描绘了嵌合蛋白、α-螺旋和β-折叠的三D结构。
图2.描绘了嵌合蛋白、氨基酸残基的三D结构。
图3.用1LD肺炎链球菌感染后的小鼠存活率(％)动态(预防模型)。
图4.用1LD肺炎链球菌感染后的小鼠存活率(％)存活(治疗模型)。
实施例
实施例1.嵌合蛋白的建模
计划的嵌合多肽是复杂的多结构域蛋白(5个结构域：FliCl、FHC2、PspA、PsaA、Spr1895)。关于多结构域蛋白的建模，进行下列程序：结构域边界的评估、用于结构域定向评估的全蛋白的模型构建、每个结构域的模型构建(使用三D结构的实例和基于从头开始的建模)、利用全蛋白模型的模型对接。
在计划的嵌合多肽中，两个结构域具有原型，并且其中三个需要基于从头开始的建模；此外，在基于从头开始的建模期间，我们须在结构域之间形成柔性连接体。
关于在自动模式下生成实际结果，使用I-Tasser算法，其被认为在最近三个CASPs(蛋白质结构预测关键评定)——蛋白建模竞争——中是最好的。此分析进 行三天。然而，即使通过这种可靠算法，包括结构域的基于从头开始的建模及其边界的多结构域蛋白的实际数据的生成也不完全有效(70％)。
为了生成更多准确数据，将蛋白分割成所使用的结构域，然后利用I-Tasser进行其建模，随后进行其对接。
在上述所有步骤之后，构造产生，显示在图1、图2中。
建模后的嵌合蛋白由536个氨基酸残基组成；给出其氨基酸序列——SEQ ID NO：l。通过ProtParam程序对该蛋白质的氨基酸序列分析表明，嵌合蛋白的分子量为56.6kDa，pI 4.56。
实施例2.编码嵌合蛋白的核苷酸序列的生成。
包含PspA、Sprl895、PsaA、FliC的片段的的嵌合蛋白的氨基酸序列被翻译成核苷酸序列(1623bp)，然后将其优化用于在大肠杆菌细胞中表达。
根据所描述的方法(Majumder，1992)，通过重叠的寡核苷酸的延长，进行该核苷酸序列的合成。寡核苷酸代表70个核苷酸长的嵌合基因片段，其包含20个核苷酸的重叠区。主要引物要求如下：它们的长度不允许超过60个核苷酸，而杂交位点不允许短于20个核苷酸。而且，长末端G/C重复不允许存在。在某些情况下，通过引物-模板移动或者引物长度改变3-6个核苷酸来凭经验进行最优引物的选择。总之，关于1623bp长的嵌合基因的合成，使用59个引物。通过凝胶电泳提取合成的片段(各300bp)，并克隆到质粒载体pGEM-T Easy中。如情况允许，克隆涉及限制性位点Kpnl、SacII、EcoRV、BamHI或者通过平端进行。在测序之后，片段被扩增，然后通过聚合酶链式反应(PCR)结合到嵌合蛋白的核苷酸序列中。在通过片段连接进行嵌合基因合成的最后阶段之后，人工基因通过Kpnl和Sacl限制性位点被克隆到pGEM-T载体中。生成的基因侧翼有附加的限制性位点：5'端的EcoRI和3'端的XhoI。然后，人工基因通过EcoRI和XhoI限制性位点被再克隆到表达载体pET24a中。
实施例3.编码嵌合蛋白的质粒DNA的生产。
根据实施例2中所述的方法，获得用于生产肺炎球菌疫苗的核苷酸序列。
所得基因被克隆到pET24a质粒中，用于后续表达。因此，通过合适的缓冲液和连接酶进行基因和pET24a载体的连接。反应在+20℃下进行2小时。
将混合物于+95℃升温10分钟，然后通过孔径为0.025μm的硝化纤维素膜滤器(Millipore，USA)进行透析，将盐去除。透析针对如下溶液进行10分钟：在10％甘油中包含0.5mM EDTA的溶液。
实施例4.用于扩增编码嵌合基因的质粒DNA的的大肠杆菌菌株的生成。
根据实施例3中所述的方法，生成用于创建肺炎球菌疫苗的基因核苷酸序列， 并克隆到pET24a载体中。通过电穿孔，用生成的质粒转化来自菌株DH10B/R(Gibko BRL，CIIIA)的大肠杆菌细胞，该菌株具有下列基因型：F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)15ΔlacX74 deoR recAl endAl araD139Δ(ara，leu)769galU galKλ-rpsLnupG。
在转化之后，将细胞于+37℃在SOC培养基(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KC1、10mM MgCl2、10mM MgS04、20mM葡萄糖)中培育40分钟。
通过筛选用于识别包含LB-琼脂和100μg/ml氨苄青霉素的选择性培养基中质粒存在的大肠杆菌细胞，取样合适的大肠杆菌细胞以获得用于随后扩增含嵌合基因的质粒DNA的大肠杆菌菌株。
用Wizard Minipreps DNA纯化系统试剂盒(Promega，USA)从生长的克隆中提取将质粒DNA。
通过限制性分析和测序，纯化的质粒DNA被证明是所需的质粒DNA。在研究过程中，取样质粒中含有所需尺寸的DNA片段的克隆。然后，提取该质粒，用于随后诱导基因表达。
实施例5.获得嵌合蛋白的大肠杆菌生产菌株。
根据实施例4中所描述的方法，获得用于生产肺炎球菌疫苗的蛋白质的核苷酸序列，然后克隆到pET24a质粒中；在来自菌株DH1OB/R的大肠杆菌细胞中扩增所得质粒，然后提取。
关于蛋白质的表达，使用来自菌株BL21 Star(DE3)(Invitrogen,USA)的大肠杆菌细胞，其具有下列基因型：F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm rne131(DE3)，基因组中包含λDe3溶素原和rne131突变。突变体rne-基因(rne131)编码短形式的RNA酶E，该短形式的RNA酶E降低胞内mRNA降解并且以这样的方式增加其发酵稳定性。蛋白酶基因中的lon-突变和ompT-突变允许获得高产率的非蛋白水解型重组蛋白。
来自具有基因型F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm rne131(DE3)的菌株BL 21的大肠杆菌细胞如下制备。将细胞在含1％胰蛋白胨、1％酵母提取物和1％氯化钠的5ml L-肉汤中于+37℃培育过夜。将培养物在新鲜的L-肉汤中稀释50-100倍，并且于+37℃在振荡培育器中培育，直到在590nm波长下的光学密度(OD)为0.2-0.3。在达到0.3OD后，将培养物在新鲜的L-肉汤中稀释到0.1OD，并培养30分钟。将100ml体积的培养物转移至无菌离心管，并且在+4℃、5000g下进行细胞制粒(成团，pelleting)10分钟。丢弃上清液，并将细胞在去离子水中重悬至初始量，然后离心。洗涤步骤重复三次。在洗涤后，在少量去离子水中重悬细胞团，并在微型离心机中将悬浮液于5000rpm离心30秒。
通过电穿孔进行感受态细胞的转化。因此，将1μl的质粒DNA添加至12μl 的感受态细胞，并将悬浮液混合。随后在无菌室中通过脉冲发生器GVI-1(ΓΒИ-1)(St.PetersburgState Polytechnical University,St.Petersburg)以10kV/cm进行穿孔4msec。
转化后，将细胞于+37℃在SOC培养基(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KC1、10mM MgCl2、10mM MgS04、20mM葡萄糖)中培育40分钟。将10-100μl细胞悬液转移至包含氨苄青霉素(100μg/ml)的选择性LB培养基(Gibko BRL，USA)，以选择具有质粒的克隆(生产菌株)。
转化感受态大肠杆菌细胞之后获得的质粒提供所编码的重组蛋白的高水平表达。
实施例6.用于根据Studier方法通过0.2％乳糖诱导蛋白合成来创建大肠杆菌细胞中的肺炎球菌疫苗的嵌合蛋白的生成。
根据实施例5中所描述的方法，获得用于创建肺炎球菌疫苗的嵌合蛋白的核苷酸序列，并克隆于pET24a质粒中；将所得的质粒在来自菌株DH10B/R的大肠杆菌细胞中扩增，提取，并用其转化来自菌株BL21的大肠杆菌细胞，目的是诱导目标基因表达。
为了培养所得到的生产菌株，使用包含氨苄青霉素(100μg/ml)和1％葡萄糖的标准琼脂化LB培养基来阻断非特异性表达。
在细胞培养物在600nm下达到0.6-0.8OD的光学密度之后，进行表达诱导。
0.2％乳糖用作诱导物(Studier，2005)。
关于根据Studier方法(Studier，2005)所述的表达的自身诱导，使用包含1％蛋白胨(Gibco，USA)、0.5％酵母提取物(Gibco，USA)、50mM Na2HP04、50mMK2HP04、25mM(NH4)2S04、2mM MgS04、0.5％甘油、0.05％葡萄糖和0.2％乳糖的PYP-5052培养基。
将单个生产菌株菌落接种于包含氨苄青霉素(100μg/ml)的PYP-5052培养基中。在恒温摇床中以250rpm于+37℃进行发酵20小时，直到每小时OD600无明显变化被记录。取细胞等份用于编码疫苗蛋白的基因的表达分析。该表达分析通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行。将其余的生物质在离心机中在9000g下制粒。
通过细胞裂解，从大肠杆菌细胞中提取蛋白质。在每5-7ml缓冲液1g细胞的基础上，将细胞重悬于包含20mM tris-HCl pH 7.5、5mM EDTA和1mM苯氧基甲基磺酰氟(PMSF)的裂解缓冲液中。将细胞悬浮液以30秒时间间隔暴露于超声30秒7次(22kHz)。将裂解物于+4℃、5000g离心10分钟。丢弃上清液，并且将团粒通过剧烈混合在每1g细胞10ml的基础上重悬于1M尿素溶液中。重复离心步骤。丢弃上清液，并且将团粒重悬于相同体积的2M尿素溶液中。重复离心步骤。丢弃上清液。
根据SDS-Page(利用十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶电泳)数据，所得到 的产物包含约97％的嵌合蛋白，浓度为1mg/ml。
提取和纯化条件被实验性调整，并且可以在本领域普通技术人员熟悉的已知程度上改变。
实施例7.包括包含PspA、Spr1895、PsaA、FliC的片段的嵌合蛋白的疫苗在肺炎链球菌致命感染的预防模型中的保护作用。
关于嵌合蛋白的保护效果的评估，使用小鼠。
对照组和实验组由30只7-8周龄的Balb/c雌性小鼠(18-20g重量)组成。将10μg的嵌合蛋白引入每只小鼠。接种后一周，使小鼠感染肺炎球菌：每只小鼠腹部注射104cfu(集落形成单位)的肺炎链球菌(这对于小鼠来说是最低致死剂量)。在注射致死剂量的肺炎球菌后立即开始存活研究，并持续14天(图3)。
用基于重组嵌合蛋白的疫苗免疫的小鼠在感染后一周显示80％的存活率和到第14天68％的存活率。对照组的存活率到第5天为0％。
因此，所提供的疫苗具有保护作用。而且，疫苗的测试剂量(10μg/小鼠)对小鼠没有任何毒性作用。
实施例8.包括包含PspA、Spr1895、PsaA、FliC的片段的嵌合蛋白的疫苗在肺炎链球菌致命感染的治疗模型中的保护作用。
对照组和实验组由30只7-8周龄的Balb/c雌性小鼠(18-20g重量)组成。使小鼠感染肺炎球菌：每只小鼠腹部注射104cfu(集落形成单位)的肺炎链球菌(这对于小鼠来说是最低致死剂量)。在同一天将10μg的嵌合蛋白接种于每只小鼠。在注射致死剂量的肺炎球菌后立即开始存活研究，并持续14天。
在同时引入肺炎球菌和基于嵌合蛋白的疫苗之后，小鼠在引入后一周显示76％的存活率和到第14天65％的存活率。对照组的存活率到第5天为0％。
该结果证明了本发明所提供的疫苗的高免疫原性。因此，该疫苗可以用于肺炎球菌感染的治疗。

Claims (1)

1.肺炎球菌疫苗，其包括SEQ ID NO：l所示的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含通过柔性连接体连接的肺炎链球菌蛋白的片段PspA、Sprl 895、PsaA、鞭毛蛋白成分，其中所述鞭毛蛋白成分充当佐剂。
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