JP5547657B2 - パスツレラ・ムルトシダ(P.multocida)のfur細胞およびその外膜タンパク質の抽出物によるパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurellamultocida)に対する異種性の防御 - Google Patents
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Description
本発明は、毒性のパスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)による感染症に対する異種性の防御(heterologous protection)を実現できるパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)の変異体に関する。これらの変異体は、fur ompH遺伝子およびfur ompH galE遺伝子に欠損を有する。本発明は、パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)から得られる、furとompHとの二重変異体およびfurとompHとgalEとの三重変異体、または、これらの変異体から得られる鉄によって制御される外膜タンパク質(IROMPs)の抽出物と、賦形剤と、および/または、薬学的に許容可能なアジュバントと、を含む、パスツレラ属細菌(特に、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida))に対するワクチン組成物に関する。
世界的に、動物およびヒト(特に子供)が罹る病気の主な原因は、細菌の感染である。パスツレラ属細菌は病原菌であり、現在、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)を含む20の種が存在している。パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)は、豚やその他の家畜において、家禽コレラ、ウシの肺炎、出血性敗血症、萎縮性鼻炎などの様々な感染症を引き起こす病原菌であり、この感染症の制御は、上記家畜を飼育する畜産農家にとって極めて重要である。
a)生きた病原菌の毒性を生育にとって低減、除去、または無毒化して生成する「弱毒化生ワクチン(live attenuated vaccines)」、
b)病原菌の精製された成分を使用するワクチン、
c)死んだ病原菌を直接使用する「死菌ワクチン(killed vaccines)」、
これらの3種類のワクチンは、それぞれ利点および欠点をもつ。弱毒化生ワクチンは、自然の疾病と同様の条件下において防御を生み出す。しかし、b)およびc)のタイプのワクチンの方が、安全性の観点からは好ましい。
本発明の目的は、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)のfur ompH変異体から調製される外膜タンパク抽出物が毒性パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)に対して完全な異種性の防御を行うことから、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)のfur ompH二重変異体およびfur ompH galE三重変異体を含むワクチンを生成するための材料および方法を提供することにある。
図1は、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)のfur変異体のPCR分析を示す。
本発明は、パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)による感染症に対する異種性の防御を促進することができるパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)由来の変異体、およびワクチンにおけるその利用に関する。これらの変異体は、fur遺伝子に異常を有している。この変異体については、以前、本発明の発明者らと同一の著者らが説明しているが、ワクチンにおけるその利用については説明していない。パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)のfur変異体に加えて、fur ompH変異体などの二重変異体、および、fur ompH galE変異体などの三重変異体が得られる。これらをワクチンに加えることによって、パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)による感染症に対する異種性の防御を実現する。
〔細菌株および成長条件〕
使用した細菌株の一覧を表1に示す。全てのパスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)株を液体培地、緩衝ペプトン水(BPW)またはBHI、SBA寒天プレートにて培養した。必要に応じて、上記濃縮液に抗菌剤を加えた(Cardenas, M. et al. A.R. Fernandez de Henestrosa, S. Campoy, A.M. Perez de Rozas, J. Barbe, I. Badiola, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 80:53-61. 2001)。野生型株の培養では、使用した二価陽イオンキレート剤、2−2’−ジピリジルDPD(シグマ)の濃度は150μMであった(表3)。
プラスミドpUA891から、パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)のfur変異体を得た(図1A)。このプラスミドは、394bpのパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)のfur遺伝子の内部断片とともに、pUA826遺伝子の内部断片を挿入した結果得られる(Bosch, M., R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernandez de Henestrosa, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol. Lett. 203: 35-40. 2001)。pUA826は、pGY2(26−)に由来する。pGY2(26−)から、SalI制限酵素によってcat遺伝子が抽出された。プラスミドpGY2は、R6Kの複製起点を有している。R6Kの複製はλpirタンパク質に依存しているので、プラスミドpGY2は、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)において自己不活性化(suicidal)しているとともに、RP4のmob可動化領域(mobilization region)、並びに、アンピシリン(bla)、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン(aadA)およびクロラムフェニコール(cat)に対する抵抗性を付与する遺伝子を含む。後者の遺伝子は、すでに述べたように、pUA826およびpUA891には存在しない。
上述したように、コンピュータを用いて、配列を分析した(8- Cardenas, M., A.R. Fernandez de Henestrosa, S. Campoy, A.M. Perez de Rozas, J. Barbo, I. Badiola, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 80: 53-61. 2001)。使用したプライマーを表2に示す。ALFシーケンサー(Pharmacia Biotech)においてジデオキシ法を実施し、ヌクレオチド配列を測定した。上述したように、RNA抽出およびRT−PCR分析を実施した(Bosch, M., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol Lett. 210: 201-208. 2002)。上述したように、パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)の外膜タンパク質の抽出物を得て、分析した(Bosch, M., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol Lett. 210: 201-208. 2002)。上述したように、タンパク質の濃度を測定した(Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr, and R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275. 1951)。
生後3週間のメスのスイスマウス(Harlan Iberica; Barcelona, Spain)5匹の群に、腹腔内注射によって10または40μg/匹の外膜タンパク質(OMP)の抽出物を注入した。異なる培養条件下にて培養した、異なるパスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)株から抽出物を調製した。全ての場合において、投与した抽出物の量は、100μlであった。この100μlを、2週間の間隔を空けて2服にわけて投与した。対照マウスには100μlの生理食塩水を投与した。3週間後、0.1mlの毒性のパスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)株(PM1002)を腹腔内投与することによって、異種抗原投与(heterologous challenge)を行った。この毒性のパスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)株(PM1002)は、100または500倍のLD50を含んでいた。
Fur1プライマーおよびFur2プライマーを用いたPCR増幅によって、パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)のfur遺伝子の394−bpの内部断片を得た(表2)。得られた断片を自殺プラスミドpUA826にクローン化し、プラスミドpUA891を得た(図1A)。
パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)のfur変異体の推定される防御効果を分析するために、DPDの非存在下または存在下にて培養した野生型のパスツレラ・ムルトシダ(P. multocida) PM1011株、fur変異体およびfur ompH変異体から調製された外膜タンパク質(OMP)の抽出物を10μg/匹および40μg/匹にて、5匹のマウス群に免疫した。そして、用量500XLD50の毒性PM1002株(LD50=3cfu/匹)によって、マウスに異種抗原投与を行った。DPD欠乏下において培養された野生型の細胞から得られた外膜タンパク質(OMP)の抽出物を免疫した全てのマウスが、抗原投与の2日後に死んだ(表3)。しかし、鉄が欠乏した培地にて培養された野生型株由来の外膜タンパク質(OMP)の抽出物40μgを免疫したマウス、およびfur変異体を免疫したマウスは、20%の防御を示した(表3)。抽出物におけるP. multocida主要な外膜タンパク質(OMP)が無いことにより、完全防御(complete protection)が飛躍的に達成された(表3)。
鉄によって制御される外膜タンパク質(IROMPs)の表面への露出の最適化が、不活性化されたfur ompH細胞から得られる防御を高めるか否かを測定するために、fur ompH変異体のリポ多糖体(LPS)に変異を導入して、派生株を作製した。galE遺伝子の産物は、UDP−ガラクトースのUDP−グルコースへのエピ化を触媒するものであって、リポ多糖体の中心の正確な合成に必要である。このために、グルコースの存在下において培養できるが、野生型の細胞の表面LPSを合成することができないgalE変異体を作製した。GalEintupオリゴヌクレオチドおよびGalEintrpオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅によって、495bpのgalE遺伝子の内部断片を得た。この断片をpUA1089にクローン化し、その結果生じたプラスミドを、トリペアレンタルメイティングによってfur ompH株(PM1094)に導入した。適した選択培地によって培養した後で、複数のgalE変異体を得た。
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Claims (19)
- furの発現、または、ompH1およびompH2の発現が生じないように、fur遺伝子およびompH遺伝子に欠損を有することを特徴とする、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体。
- fur遺伝子およびompH遺伝子に欠損を有することに加えて、パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)のfur ompH細胞における鉄によって制御される外膜タンパク質の表面への露出が最適化されるようにgalE遺伝子にも欠損を有することを特徴とする、請求項1に記載のパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体。
- Fur1プライマーおよびFur2プライマーによって増幅される394bpのfur遺伝子の内部断片をfur遺伝子内に挿入することによって野生型遺伝子が分断され、これによって、fur遺伝子に欠損を有することを特徴とする、請求項1または2に記載のパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体。
- ompH1における76位のナンセンス変異、並びに、ompH2における670位のナンセンス変異および複数のヌクレオチドの変化を有する、OmpHに欠損を有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載のパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体。
- ompH1における上記変異が、グルタミンのかわりに終止コドンを生じさせることによって、24個のアミノ酸からなる短縮されたタンパク質を発生させ、
ompH2における上記変異が、350個のアミノ酸の代わりに223個のアミノ酸からなる短縮されたタンパク質を発生させることを特徴とする、請求項4に記載のパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体。 - 請求項5に記載の上記ナンセンス変異によって、36−Kdaの主要な外膜タンパク質が無いことを特徴とする、請求項5に記載のパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体。
- GalEintupプライマーおよびGalEintrpプライマーによる増幅によって得られる495bpのgalEの内部断片をgalE遺伝子内に挿入することによって野生型遺伝子が分断され、これによって、galEに欠損を有することを特徴とする、請求項2に記載のパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体。
- 不活性化されていることを特徴とする、請求項1〜7の何れか1項に記載のパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体。
- 熱によって不活性化されていることを特徴とする、請求項8に記載のパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体。
- 超音波処理によって不活性化されていることを特徴とする、請求項8に記載のパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体。
- 請求項1〜10の何れか1項に記載のパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)細菌の変異体の外膜タンパク質の製剤。
- パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)の感染に対する異種性の防御を動物へ付与するためのワクチンの製造方法であって、以下のa)およびb)の工程を含む製造方法。
a)fur遺伝子およびompH遺伝子、または、fur遺伝子、ompH遺伝子およびgalE遺伝子に欠損を有する請求項1〜10の何れか1項に記載のパスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)細菌の変異体を得る、および/または、上記パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)細菌の変異体の細胞から作製される請求項11に記載の外膜タンパク質の製剤を得る、工程。
b)有効量のfur ompH変異体またはfur ompH galE変異体および/または当該変異体の外膜タンパク質と、賦形剤と、および/または、薬学的に許容可能なアジュバントとを含む、上記a)において得られる細胞の抽出物を含む上記ワクチンの選択された投与方法に適した準備を行う工程。 - パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)の感染症に対して異種性の防御を動物へ付与する、請求項12に記載のワクチンの製造方法であって、
上記fur変異体の上記細胞、上記fur ompH二重変異体の上記細胞、または上記fur ompH galE三重変異体の上記細胞が、熱によって不活性化されていることを特徴とする製造方法。 - パスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)の感染症に対して異種性の防御を動物へ付与する、請求項12に記載のワクチンの製造方法であって、
上記fur変異体の上記細胞、上記fur ompH二重変異体の上記細胞、または上記fur ompH galE三重変異体の上記細胞が、超音波処理によって不活性化されていることを特徴とする製造方法。 - パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)の感染症に対して異種性の防御を動物へ付与するワクチン組成物であって、
請求項12〜14に記載の方法により得られた、免疫原性量のfur ompH二重変異体、免疫原性量のfur ompH galE三重変異体、および/または当該変異体の上記外膜タンパク質と、賦形剤と、および/または薬学的に許容可能なアジュバントとを含むことを特徴とするワクチン組成物。 - 豚および牛の肺炎、ウサギやハムスターなどの小動物の家禽コレラ、および肺炎などのパスツレラ・ムルトシダ(P. multocida)の感染によって発症する病気に対する異種性の防御のための、請求項15に記載のワクチン組成物。
- パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)による感染症に対して動物に異種性の防御を付与する請求項12〜16の何れか1項に記載の製造方法またはワクチン組成物のための、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)のfur ompH二重変異体またはfur ompH galE三重変異体、および/または、当該変異体の外膜タンパク質の抽出物の使用。
- パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)による感染症に対して動物に異種性の防御を付与する請求項12〜16に記載の製造方法またはワクチン組成物のための、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)のfur ompH 二重変異体、および/または、当該変異体の外膜タンパク質の抽出物の使用。
- パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)による感染症に対して動物に異種性の防御を付与する請求項12〜16に記載の製造方法またはワクチン組成物のための、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)のfur ompH galE三重変異体、および/または、当該変異体の外膜タンパク質の抽出物の使用。
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