PT2256185E - Protecção heteróloga contra pasteurella multocida provida por células de p. multocida fur e seus extractos proteicos de membrana externa - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PROTECÇÃO HETERÓLOGA CONTRA PASTEURELLA MULTOCIDA PROVIDA POR CÉLULAS DE P. MULTOCIDA FUR E SEUS EXTRACTOS PROTEICOS DE MEMBRANA EXTERNA

Campo da Invenção A invenção refere-se a mutantes de Pasteurella multocida capazes de conferir protecção heteróloga contra infecção causada por P. multocida virulenta. Estes mutantes são defeituosos nos genes fur ompH e fur ompH galE. A presente invenção refere-se a composições de vacinas contra bactérias do género Pasteurella, especificamente Pasteurella multocida, que compreendem mutantes duplos fur ompH e mutantes triplos fur ompH galE, obtidos a partir de P. multocida ou um extracto de proteínas da membrana externa reguladas por ferro (IROMPs) obtido a partir dos referidos mutantes e um excipiente e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

Estado da Técnica Anterior

As infecções bacterianas são uma das principais causas de doenças em todo o mundo, tanto em animais como em seres humanos, especialmente em crianças. 0 género Pasteurella está entre as bactérias causadoras de doenças, e actualmente inclui 20 espécies, incluindo Pasteurella multocida, que é uma bactéria patogénica que provoca várias doenças infecciosas, como a cólera aviária, a pneumonia bovina, septicemia hemorrágica e rinite atrófica em suínos, em animais utilizados para a produção de alimentos, de modo que o controlo da doença é muito importante para os agricultores dedicados à criação destes animais. 1

Desse modo, é importante desenvolver uma vacina que impeça que o gado seja infectado. 0 objectivo do desenvolvimento de qualquer vacina é oferecer a devida protecção durante o maior tempo possível.

Tradicionalmente, foram desenvolvidos, fundamentalmente, três tipos de vacinas: a) "vacinas vivas atenuadas", em que é utilizado o patogénio vivo, cuja virulência foi reduzida ou eliminada, incapacitado para o seu crescimento, b) as vacinas em que são utilizados os componentes purificados do patogénio, e c) "vacinas mortas", em que o agente patogénico morto é utilizado directamente. Cada um destes tipos de vacinas tem as suas vantagens e inconvenientes; as vacinas vivas atenuadas produzem protecção em condições semelhantes às da doença natural. No entanto, as vacinas dos tipos (b) e (c) são mais atraentes do ponto de vista da segurança.

Em medicina veterinária, a vacinação contra P. multocida é baseada principalmente na utilização de células de P. multocida inactivadas, conhecidas como "bacterinas", ou em bactérias vivas atenuadas. As bacterinas só conferem protecção homóloga; as vacinas vivas proporcionam protecção homóloga e heteróloga, no entanto contêm marcadores de atenuação desconhecidos e, em alguns casos, foram associadas a surtos epidémicos.

Os documentos de patentes US 3,855,408, US 4,169,886 e US 4,626,430 descrevem "vacinas vivas" contra P. multocida. O pedido de patente WO 98/56901 A2, intitulado "Live Attenuated Vaccines", descreve bactérias atenuadas em que o gene fur ou um gene ou homólogo do mesmo, é modificado de tal modo que a expressão do produto do gene fur, ou do seu homólogo, é regulada independentemente da concentração de ferro presente no meio no qual 2 a bactéria está localizada. As referidas bactérias podem ser utilizadas como "vacinas vivas". 0 documento refere-se genericamente a qualquer bactéria gram-negativa, embora concentre-se particularmente em Neisseria meningitidis. A bactéria é atenuada por mutação de um gene que é essencial para a produção de um metabolito ou catabolito não produzido por seres humanos ou animais. De preferência, as mutações para atenuação da bactéria são no gene aro ou num gene da via das purinas ou pirimidinas. Num outro aspecto da invenção, a bactéria compreende uma mutação recA. A invenção também proporciona vacinas e o método para a produção de uma bactéria de acordo com a invenção e que compreende a modificação do gene fur nativo ou de um homólogo, de uma bactéria atenuada, de tal modo que a expressão do gene fur ou do seu homólogo é regulada independentemente da concentração de ferro presente no ambiente da bactéria. 0 documento indica que em tentativas passadas para produzir vacinas vivas atenuadas, os organismos não produziram certas proteínas que são importantes para a protecção cruzada durante a cultura em larga escala. Estas proteínas incluíam as proteínas reguladas por ferro, cuja produção é regulada pelo gene fur. Além disso, uma vez que estas bactérias eram administrados aos hospedeiro, as estirpes da vacina não tiveram tempo ou recursos metabólicos durante a sua colonização limitada para expressar essas proteínas. A produção de estirpes de bactérias atenuadas em que a expressão de fur foi modificada é uma técnica que pode ser genericamente aplicada. Desse modo, uma bactéria patogénica cujo genoma compreende o gene fur ou um homólogo do mesmo, sendo a 3 bactéria atenuada por supressão ou modificação de um gene que é essencial para crescimento no hospedeiro em que a bactéria é patogénica, pode ser modificada como foi descrito de tal modo que a bactéria produza o produto do gene fur ou do seu homólogo independentemente da concentração de ferro presente no ambiente da bactéria. Os homólogos de fur podem ser identificados por comparação com sequências conhecidas de outros genes fur, tais como E. coli e de N. meningitidis, por exemplo. De preferência, estes homólogos são substancialmente homólogas a outros genes fur conhecidos, com uma identidade entre 60-70% num comprimento de pelo menos 100 aminoácidos. Desse modo, os genes identificados em outras bactérias que codificam factores de transcrição e que têm ainda a propriedade de resposta à presença de ferro, também podem ser usados. A invenção também propõe mutações nos genes recA e comA para proporcionar estabilidade à bactéria usada na vacina. Estas mutações devem ser introduzidas como modificações genéticas finais, após as modificações restantes descritas. 0 pedido de patente ES 2 059 503 T3, intitulado "Vacuna contra la pasteurelosis" (Pasteurollosis Vaccine), descreve vacinas contra bactérias do género Pasteurella, e especificamente, em certos casos, contra Pasteurella multocida. O documento descreve que, quando os organismos Pasteurella são cultivados em condições de restrição de ferro, a extracção da membrana externa ou de todo o lisado celular gera um perfil de proteína diferente do obtido em condições normais in vitro, que é mais imunogénico do que o produzido pelo mesmo organismo cultivado em condições de crescimento normais. As células inteiras inactivadas de Pasteurella cultivadas em condições de restrição de 4 ferro, que incluem a "bacterina", com a finalidade de preparar uma vacina, estão incluídas no âmbito da invenção. A invenção propõe formular a vacina para a utilização de um serotipo homólogo, mas também inclui uma vacina polivalente que contém proteínas reguladas por ferro de todos os serotipos de Pasteurella patologicamente importantes. Desse modo, este documento de pedido de patente está focado em proteínas reguladas por ferro, anticorpos monoclonais ou policlonais para as referidas proteínas e formulações de vacinas em que o material proteico pode ser combinado com qualquer um dos coadjuvantes típicas em vacinas veterinárias. 0 documento estabelece que as proporções de agente quelante a ser usado deve ser cuidadosamente controlada, porque uma concentração demasiado elevada impediria a cultura das bactérias. O documento de patente US 6,790,950 B2, intitulado "Anti-bacterial vaccine compositions", identifica genes bacterianos virulentos gram-negativos (com foco em Pasteurella multocida como um caso particular), que permite a identificação de novos agentes antibacterianos contra esses genes virulentos e seus produtos.

Esta patente refere-se às tentativas de produzir composições de vacina que tradicionalmente utilizam células inteiras de bactérias mortas (inactivadas) que fornecem apenas protecção específica para um serotipo, o que envolve um problema para a vacinação, dada a existência de diferentes serotipos. Os inventores referem-se a um estudo em que uma vacina de bactéria atenuada, que produz uma forma inactiva da toxina ApxII, apresentou protecção cruzada.

Tendo em conta os problemas associados com formulações de vacina que compreendem estirpes bacterianas com mutações espontâneas, indefinidas, os autores do referido documento 5 descrevem a construção de bactérias atenuadas para sua utilização como vacinas que são seguras e proporcionam protecção homóloga e heteróloga contra os serotipos de Pasteurella, bem como na identificação de bactérias e genes atenuados necessários para a virulência bacteriana, que ajudam no desenvolvimento de métodos para a identificação de agentes antibacterianos. Desse modo, este documento proporciona organismos bacterianos gram-negativos (Pasteurella multocida entre eles) que contêm mutações funcionais na sequência de determinados genes. Esta mutação inibe ou impede a expressão ou a actividade biológica dos produtos codificados pelo gene, o efeito desta mutação sendo a atenuação da virulência da estirpe bacteriana. São descritas composições que compreendem organismos bacterianos gram-negativos mutados e atenuados e, opcionalmente, um adjuvante e/ou um excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável com vista à construção de uma vacina que previna a infecção bacteriana ou os sintomas a ela associados.

Para que a estirpe modificada da presente invenção seja eficaz numa formulação farmacêutica, os inventores indicam que a atenuação deve ser suficientemente significativa para evitar os sintomas clínicos de infecção, mas permitindo a replicação e o crescimento limitado das bactérias no hospedeiro. A invenção proporciona estirpes atenuadas de P. multocida, vacinas (que podem ser aplicados a seres humanos e animais), polinucleótidos que codificam os produtos dos genes necessários para a virulência da bactéria gram-negativa, células hospedeiras transformadas com os polinucleótidos da infecção, métodos para a produção dos polipéptidos da invenção, métodos para o tratamento de indivíduos infectados por bactérias gram-negativas por meio da 6 administração dos agentes antibacterianos definidos na invenção, etc.

No entanto, este documento reivindica apenas os polinucleótidos codificados pelas sequências que são fornecidas, bem como os vectores que as contêm e as células hospedeiras transformadas com os mesmos. As bactérias Pasteurella mutadas descritas pela presente invenção são utilizadas de uma forma atenuada.

Deve salientar-se que a mutação fur objecto da invenção do presente pedido não implica na redução da virulência da bactéria, de modo que não seria compreendida dentro deste grupo de mutações. 0 documento mencionado US 6,790,950 B2 refere-se à dificuldade de fornecer protecção heteróloga através de vacinação com células inteiras mortas, que é o que a invenção do presente pedido de patente atinge. 0 pedido de patente WO 99/29724 A2, intitulado "DNA encoding Pasteurella multoclda outer-membrane proteln" reivindica uma molécula de ácido nucleico isolada e purificada que compreende uma sequência de ácido nucleico pré-seleccionada que codifica uma proteína de membrana de Pasteurella multocida aviária ou polipéptido OmpH e uma subunidade ou variante biologicamente activa. Para o efeito, foram sequenciados e clonados OmpHs de 16 serotipos de P. multocida (que têm uma identidade de 73%).

Este pedido de patente mostra estudos de protecção homóloga de frango através de polipéptidos X-73 da membrana externa isolados e purificados. Indicam também que as composições imunogénicas da invenção podem ser utilizadas em combinação com bacterinas. Estas composições imunogénicas compreendem uma quantidade eficaz de polipéptido da membrana externa isolado e purificado de P. 7 multocida numa combinação, subunidade, péptido, variante ou combinação dos mesmos, juntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável que, após a sua administração para a coluna vertebral, induz a produção de anticorpos específicos para porinas da membrana externa de P. multocida. A invenção também proporciona um método para a detectar ou determinar a presença de anticorpos que são específicos para P. multocida aviária.

No artigo intitulado "Use of a repórter gene to follow high-pressure signal transduction in the Deep-Sea Bacterium Photobacterium. sp. Strain SS9" [Ellen Chi e Douglas H. Bartlett, (American Society for Microbiology, pp. 7533-7540 (1993)], é desenvolvido o primeiro sistema genético de uma bactéria barofílica, Photobacterium spl SS9. É descrita a utilização deste sistema na caracterização inicial dos mecanismos reguladores que controlam a expressão do gene ompH em resposta a mudanças na pressão hidrostática. A fim de estudar a referida relação entre o gene ompH e a pressão, uma estirpe ompHLac de Photobacterium spl é obtida, e são também obtidas estirpes mutantes de ompH seleccionadas em condições de pressão de 1 atm. Quatro mutantes são assim obtidos, três dos quais não são afectados na sua expressão pela pressão do meio. No entanto, o quarto mutante (EC1002) demonstra que é extremamente sensível à pressão. Desse modo, a futura caracterização de mutantes sensíveis à pressão, tais como EC1002, oferecerá a oportunidade de identificar as funções necessárias para a adaptação a altas pressões.

Observa-se que, apesar de no trabalho descrito neste artigo os mutantes ompH de uma bactéria gram-negativa serem construídos, estes mutantes não são destinados a estudos de imunidade contra a referida bactéria, além disso, neste caso específico, os mutantes 8 ompH defeituosos visam a identificação de funções importantes para o crescimento a altas pressões.

Por fim, os autores do presente pedido no artigo intitulado "Expression of the Pasteurella multocida ompH gene is negatively regulated by the Fur protein" [Montserrat Bosch, Raúl Tarragó, Ma Elena Garrido, Susana Campoy, Antonio R. Fernández de Henestrosa, Ana M. Pérez de Rozas, Ignacio Badiola e Jordi Barbé; FEMS Microbiology Letters 203, 35-40 (2001)] examinam os mecanismos e regulação da absorção de ferro em P. multocida. Por meio da construção de um mutante fur em P. multocida, demonstrou-se que o gene ompH, que codifica a principal proteína da membrana estrutural (que tem alta antigenicidade) , é regulada negativamente pela proteína fur, ferro e glucose. Da mesma forma, também é demonstrado que o tipo selvagem e células defeituosas de fur em P. multocida têm o mesmo nível de virulência. O documento explica o papel do gene fur no sistema de captação de ferro das bactérias através do seu produto, uma proteína de 17 KDa tendo actividade de ligação ao ADN dependente de Fe+' A proteína fur pode actuar como um regulador positivo ou negativo.

Levando-se em conta que se sabe que as culturas em condições de deficiência de ferro induzem protecção heteróloga contra a infecção causada por estirpes virulentas de P. multocida, os autores propõem a obtenção, isolamento e caracterização de um mutante com fur defeituoso desse organismo. A sequência nucleotídica deste gene está registada no GenBank com o Número de Acesso AF027154. 9 0 artigo descreve a clonagem e a construção de um mutante fur em P. multocida. Para esse efeito, inactiva-se o gene fur em P. multocida por simples recombinação de um plasmideo suicida que leva uma região interna do gene fur. Por meio de amplificação por PCR e utilizando os iniciadores FUR1 e Fur2, é obtido um fragmento de 394 pares de bases que compreendem os nucleótidos 18-412 do gene fur. Este fragmento é clonado no plasmideo suicida pUA826, dando origem ao plasmideo pUA8 91 o qual é introduzido em P. multocida por "acasalamento triparental". São seleccionados transconjugados resistentes à estreptomicina. 0 modo de inactivação do gene fur e a região amplificada e os iniciadores e os plasmideos utilizados, são utilizados como o ponto de partida para a obtenção subsequente dos mutantes duplos e triplos, objecto do presente pedido de patente. 0 estudo levado a cabo neste artigo continua subsequentemente a analisar a expressão do gene ompH em P. multocida do tipo selvagem (que codifica a porina de 36 KDa indicada acima) e em mutantes fur. Observa-se que a expressão de ompH é maior no mutante fur do que nas estirpes de tipo selvagem, o que leva à confirmação de que a expressão de ompH é regulada negativamente por fur. 0 trabalho também realiza estudos de virulência do mutante fur, concluindo que tanto as bactérias de tipo selvagem de P. multocida como os mutantes fur têm o mesmo nivel de virulência. 0 artigo conclui que, tendo em conta que é demonstrado o papel da proteína ompH como um antigénio protector contra a infecção por P. multocida para a obtenção de "bacterinas", a estirpe a ser utilizada deve ser cultivada na ausência de glicose, devido ao seu efeito inibidor sobre a expressão do gene ompH. 10

Sumário da Invenção

Um objecto da presente invenção proporciona materiais e métodos para a produção de vacinas que compreendem mutantes duplos e mutantes triplos ompH galE de Pasteurella multocida, uma vez que um extracto da proteína da membrana externa preparado a partir de mutantes de Pasteurella multocida fur ompH proporciona uma protecção heteróloga completa contra Pasteurella multocida virulenta. A invenção também menciona que a utilização de mutantes fur ompH e de mutantes triplos ompH galE de Pasteurella multocida inactivados termicamente fornece 60% de protecção cruzada contra P. multocida virulenta. Da mesma forma, a invenção refere que quando as células são inactivadas por meio de sonicação, obtém-se um nível mais elevado de protecção do que é obtido quando só são tratados termicamente.

Por conseguinte, um objecto da presente invenção é proporcionar composições que contêm os referidos mutantes duplos e triplos para serem utilizados como agentes imunogénicos para a protecção contra a P. multocida virulenta.

Da mesma forma, fornecer vacinas para prevenir infecções causadas por P. multocida, tais como pneumonias em suínos, gado e em pequenos mamíferos, bem como a cólera aviária, é também um objecto da invenção.

Além disso, é também aqui descrito um kit para a administração da referida vacina a animais em risco de se tornarem doentes devido a P. multocida, que compreende um extracto de proteína de membrana externa obtido de P. multocida defeituosa nos 11 genes fur, fur ompH (mutante duplo) e/ou fur ompH galE (mutante triplo) e um excipiente farmaceuticamente aceitável, opcionalmente, com adjuvantes adequados para a sua administração subsequente.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra uma análise de PCR dos mutantes fur de Pasteurella multocida.

Figura IA mostra a construção do mutante fur de P. multocida. Fur3 e Aad3 indicam as posições dos iniciadores utilizados para confirmar a presença da mutação fur. A Figura 1B mostra o ADN cromossómico da estirpe do tipo selvagem (PM1011) (pista 2) , mutante fur (PM 1095) (pista 3) e mutante fur ompH (PM1094) (pista 4) que foram submetidas a análise por PCR com os iniciadores Aad3 e Fur3 (Tabela 2) . O controlo de PCR sem ADN é mostrado na pista 5. O ADN do fago ΦΧ174 digerido com Hinfl foi usado como o marcador de peso molecular (pistas 1 e 6) . A Figura 2 mostra um diagrama da estrutura dos genes ompHl e ompH2 de P. multocida. RTompHlup, RTompHlrp, RTompH2up e RTompH2rp indicam as posições dos iniciadores utilizados para a análise de transcrição. A Figura 2A mostra os resultados da análise de RT-PCR dos transcritos dos genes ompHl. A Figura 2B mostra os resultados da análise de RT-PCR dos transcritos dos genes ompH2. 12 A Figura 2C mostra os resultados da análise de RT-PCR dos transcritos dos genes do operão possível ompHl-ompH2. A Figura 2D mostra os resultados da análise de RT-PCR dos transcritos dos genes, tanto na estirpe selvagem (PM1011) (pista 2) como no mutante fur ompH (PM10 94) (pista 3) . O ARN total de cada uma das estirpes e os pares de iniciadores RTompHlup e RTompHlrp, RTompH2up e RTompH2rp, RTompHlup e RTompH2rp, respectivamente, foram utilizados, PCRs com estirpe de ADN do tipo selvagem (pista 4) e de um controlo negativo sem ARN ou ADN (pista 5) também são mostrados. 0 ADN dos fagos ΦΧ174 digerido com Hinfl (B e C) e do fago λ, digerido com BstEII (D) foram utilizados como marcadores de peso molecular (pistas 1 e 6) . A Figura 3 mostra a análise por PCR da construção do mutante galE de P. multocida.

Figura 3A mostra a construção do mutante galE de P. multocida. GalEint2up e pK03-R indicam as posições dos iniciadores utilizados para confirmar a presença da mutação galE. A Figura 3B mostra o ADN cromossómico da estirpe do tipo selvagem (PM1011) (pista 2), mutante fur ompH (PM1094) (pista 3) e mutante fur ompH galE (PM1096) (pista 4) que foram submetidos a análise por PCR utilizando os iniciadores GalEint2up e pK03-R (Tabela 2) . 0 controlo de PCR sem ADN é mostrado na pista 5. 0 ADN do fago λ digerido com BstEII foi utilizado como marcador de peso molecular (pistas 1 e 6) .

Descrição Detalhada da Invenção A invenção refere-se a mutantes derivados de Pasteurella multocida capazes de promover protecção heteróloga contra infecção 13 causada por P. multocida e a sua utilização em vacinas. Estes mutantes são defeituosos no gene fur e ompH. Este mutante já foi anteriormente descrito pelos mesmos autores do presente pedido de patente, o seu uso em vacinas não tendo sido descrito. Mutantes duplos, tal como o mutante fur ompH, e mutantes triplos, tal como o mutante fur ompH galE, são obtidos e também são usados para proporcionar protecção heteróloga contra infecção causada por P. multocida por meio de sua incorporação em vacinas. O ferro é um elemento necessário para quase todas as células vivas. Muitas bactérias patogénicas gram-negativas, tais como o Haemophilus influenzae e Neisseria meningitidis, têm na sua membrana externa proteínas que se ligam a moléculas de ligação ao ferro, tais como a transferrina, lactoferrina, hemoglobina, hemina e ferritina, presentes na mucosa dos organismos hospedeiros (Ratledge, C. e L.G. Dover. Annu. Rev. Microbiol. 54; 881-941. 2000) . A expressão de quase todas estas proteínas de membrana externa está sob o controlo da proteína Fur (regulador de absorção férrico) (Sto j il j kovic, I., et al. A.J. BáumLer e K. Hantke. J. Mol. Biol. 236:531-545. J. Mol. Biol. 240; 271. 1994), que se liga ao ferro presente no citoplasma das bactérias. Nesta reacção, a proteína Fur forma um complexo com Fe (II), que subsequentemente se liga a uma sequência específica de ADN, conhecida como "caixa de fur" (2,12,14), na região promotora de genes regulados por ferro, desse modo bloqueando a sua transcrição. Muitas proteínas de membrana externa reguladas por ferro (IROMPs) são antigénios poderosos e factores que são essenciais para a virulência durante o processo de infecção de alguns patogénios (Ratledge, C., e L.G. Dover. Annu. Rev. Microbiol. 54:881-941. 2000). Por esta razão, as referidas proteínas da membrana externa reguladas por ferro foram propostas como possíveis candidatos para vacinas baseadas num receptor purificado (Chibber, S., e S.B. Bhardwaj J. Med. Microbiol. 53:705-706. 2004), ou utilizando anti-soro anti-IROMPs 14 (Sood, S., P. Rishi, V. Dahwan, S. Sharma, e Ganguly N.K. Mol. Cell. Biochem. 273:69-78. 2005). A Pasteurella multocida é uma bactéria patogénica que causa várias doenças infecciosas, tais como a cólera aviária, pneumonia bovina e septicemia hemorrágica, e rinite atrófica em suínos, em animais utilizados para a produção de alimentos. Em medicina veterinária, a vacinação contra o P. multocida é baseada principalmente na utilização de células inactivadas de P. multocida, conhecidas como "bacterinas", ou em bactérias vivas atenuadas. No entanto, as bacterinas apenas proporcionam protecção homóloga; por outro lado, embora as vacinas vivas proporcionem protecção homóloga e heteróloga, as mesmas contêm marcadores de atenuação desconhecidos e, em alguns casos, até foram associadas com surtos epidémicos. A protecção homóloga foi obtida utilizando proteínas de membrana externa de P. multocida cultivadas sem serem privadas de ferro (Basagoudanavar, S.H., D.K. Singh e BC Varshney. J. Vet. Med. 53:524-530. 2006) . Além disso, várias estirpes vivas atenuadas bem definidas que são candidatas promissoras para vacinas foram recentemente descritas (10,17). É conhecida a protecção cruzada de bacterinas (Glisson, J.R., M.D. Contreras, I.H. Cheng, e C. Wang. Avian. Dis. 37:1074-1079. 1993) , bem como de extractos de proteína da membrana externa (Adler B. et al. , J. Biotechnol., Vol. 44, pp. 139-144. 1996; Ruffolo, C. G., et al. B.H. José, e B. Adler. Vet. Microbiol. 59:123-137. 1998) obtidas a partir de P. multocida cultivada em meio deficiente em ferro. Esta protecção heteróloga parece basear-se na sobre-expressão de proteínas de membrana externa regulada por ferro de P. multocida, induzida pela ausência de ferro no meio, e como consequência, no interior das células. Esta abordagem é limitada pelo facto de que as bactérias crescem muito mal na presença de agentes quelantes de catiões divalentes, tais como 2,2'-dipiridilo 15 (DPD), o que é uma limitação importante para a obtenção de vacinas em grandes quantidades.

Dois receptores de ligação de hemoglobina foram inicialmente caracterizados em P. multocida (Bosch, M. et al.r M.E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas. I. Badiola, e J. Barbé. Infect. Immun. 70:5955-5964. 2002; Cox, A.J., M.L. Hunt, J.D. Boyce, e B. Adler. Microb. Pathog. 34:287-296, 2003), e foi subsequentemente demonstrado que estas bactérias têm pelo menos seis proteínas de ligação à hemina e/ou hemoglobina, todas as quais são imunogénicas (Bosch, M. et al. , M.E. Garrido, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, J. Barbé, e M. Llagostera. Vet. Microbiol. 99:103-112. 2004); no entanto, quando são inoculadas individualmente, nenhuma delas oferece protecção contra um ataque heterólogo (Bosch, M., M.E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, e J. Barbé. Infect. Immun. 70:5.955-5.964. 2002; Bosch, M., M.E. Garrido, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, J. Barbé, e M. Llagostera. Vet. Microbiol. 99:103-112. 2004; B. Adler, comunicação pessoal). O recente isolamento do gene fur de P. multocida permitiu que os autores do presente pedido construíssem mutantes fur desta espécie bacteriana (Bosch, M., R. Tarragó, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernández de Henestrosa, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, e J. Barbé. FEMS Microbiol. Lett. 203: 35-40. 2001). Dado que Fur regula muitas proteínas captação de ferro bacterianas, os autores do presente pedido estudaram a protecção heteróloga fornecida por células fur de P. multocida. A estratégia de utilização de mutantes fur resolve os problemas associados com o fraco crescimento que é observado na cultura de bactérias na presença de agentes quelantes de ferro, porque a sobre-expressão pelo mutante P. multocida fur de proteínas 16 de membrana externa reguladas com ferro é semelhante ao crescimento de células de P. multocida do tipo selvagem cultivadas num meio com deficiência de ferro, impedindo o fraco crescimento mostrado pelas células nestas condições. 0 desenvolvimento de vacinas baseadas em proteínas de membrana externa reguladas com ferro, em particular contra patogénios que têm vários receptores de ferro diferentes, como é o caso de P. multocida, destaca-se entre as suas utilizações.

Os mutantes de P. multocida, todos os quais são defeituosos no gene fur, e no gene ompH são descritos como resultado da invenção. 0 gene fur regula a expressão de muitas proteínas reguladas por ferro em bactérias. Desse modo, a sobre-expressão de proteínas de membrana externa reguladas por ferro em mutantes fur de P. multocida é semelhante à sobre-expressão resultante do crescimento de células de P. multocida do tipo selvagem em meio deficiente em ferro. São também divulgados mutantes duplos fur ompH, mutantes estes que não expressam a proteína OmpH (que é altamente imunogénica) , e os mutantes triplos fur ompH galE, que, para além de serem defeituosos em fur e ompH, são igualmente defeituosos em galE.

Juntamente com os mutantes da invenção, são também descritos os oligos utilizados para dar origem à mutação correspondente, os plasmídeos que as incorporam, e as vacinas a que os mutantes dão origem. As vacinas podem ser baseados em bactérias mutantes (que contêm as mutações anteriormente descritas), inactivadas termicamente ou por sonicação, ou com base nas referidas proteínas da membrana externa reguladas por ferro as quais os mutantes de P. multocida dão origem. 17

Por conseguinte, o presente pedido descreve: a) Gene mutado fur de P. multocida. Esta mutação consiste na ruptura do gene através da introdução na bactéria de um plasmideo que contém um fragmento de 394 pares de bases da região interna deste gene compreendida entre os nucleótidos 18 e 412. b) Os iniciadores FUR1, Fur2 e Fur3. Os iniciadores FUR1 e

Fur2 permitem a clonagem por PCR de um fragmento interno de 394 pares de bases do gene fur de P. multocida para a sua posterior inserção num plasmideo. O iniciador Fur3 permite verificar que o gene de tipo selvagem foi interrompido mediante a integração de P. multocida do plasmideo que integra o fragmento de 394 pares de bases da P. multocida clonada. A sequência dos oligos FUR1, Fur2 e Fur3 pode ser observada na Tabela 2. c) 0 plasmideo pUA891, que incorpora o gene de resistência à estreptomicina, que é obtido através do plasmideo suicida pUA826, e que permite a clonagem do fragmento de 394 pares de bases do gene fur de P. multocida. Este plasmideo é introduzido em P. multocida por acasalamento triparental, permitindo posteriormente o isolamento dos mutantes fur putativos por selecção. d) mutações sem sentido nos genes ompHl e ompH2. Levando-se em conta que em P. multocida existem duas cópias do gene ompH separadas por 154 pares de bases, que são transcritas de forma independente, duas mutações são descritas. A mutação em ompHl é uma mutação sem sentido na posição 76, que dá origem a um codão de paragem em vez de um codão de glutamina, fazendo-o expressar uma proteína truncada com 24 aminoácidos. A mutação em ompH2 envolve várias alterações de nucleótidos, incluindo uma mutação sem sentido na posição 670, o que dá origem a uma proteína 18 truncada com 223 aminoácidos, em vez dos 350 que a proteína nativa tem. 0 efeito causado pelas mutações sem sentido em ompHl e ompH2 é a ausência de expressão da proteína OMP de 36 KDa. e) Iniciadores OmpHlsequp, OmpH2seqdw, 0mp21000, 0mp22000, ompHl-2up, RTompHlup, RTompHlrp, RTompH2up e RTompH2dw. Os iniciadores OmpHlsequp e OmpH2seqdw amplificam as bandas que contêm os genes ompHl e ompH2 de P. multocida (número de Acesso do gene ompHl: EF102481 e do gene ompH2: EF102482, GenBank) para a sua subsequente clonagem em vectores. Omp21000 e 0mp22000 são usados para analisar a sequência dos genes ompHl e ompH2 de P. multocida. OmpHl-2up é usado para analisar a sequência de ompHl de P. multocida. E RTompHlup, RTompHlxp, RTompH2up, RTOmpH2dw são utilizados para analisar a transcrição do gene ompH (OmpHl e OmpH2) em P. multocida. A sequência dos oligos indicados pode ser observada na Tabela 2. f) Vectores que incorporam o fragmento clonado de P. multocida, utilizando os iniciadores e dando origem, por inserção em P. multocida, ao mutante P. multocida fur ompH. g) Iniciadores GalEintup, GalEintrp, GalEint2up, e pK03-R. Os iniciadores GalEintup e GalEintrp são os utilizados para obter o fragmento interno de 4 95 pb do gene galE de P. multocida. GalEint2up é um iniciador directo utilizado para confirmar a ruptura do gene galE em P. multocida. pK03-R é um iniciador para confirmar a interrupção do gene galE em P. multocida pela inserção do plasmídeo pUA891 (plasmídeo no qual o fragmento de 4 95 pb foi clonado) em P. multocida fur ompH. As sequências destes iniciadores podem ser observadas na Tabela 2. 19 h) Bactérias mutantes de P. multocida. Estas bactérias são defeituosas em determinados genes. Os mutantes P. multocida fur são defeituosos no gene fur, impedem a formação do complexo fur-Fe(II), não ocorrendo o bloqueio da transcrição de genes regulados por ferro. Estes mutantes ou as proteínas de membrana externa reguladas com ferro às quais dão origem, podem ser utilizados na preparação de vacinas contra P. multocida capazes de proporcionar protecção heteróloga contra P. multocida virulenta. Uma vez que o crescimento em meio deficiente em Fe não é necessário, obtém-se um rendimento mais elevado na cultura das bactérias (cujo crescimento é muito fraco, na presença de agentes quelantes). As bactérias P. multocida fur são obtidas após o isolamento dos mutantes obtidos pela inserção do plasmídeo que incorpora o fragmento de 394 pares de bases do gene fur de P. multocida. Os referidos mutantes já foram descritos (Bosch, M . , R. Tarrag6, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernández de Henestrosa, A ,M. Pérez de Rozas, I. Badiola, e J. Barbé . FEMS Microbiol. . Lett. 203 : 35 -40. 2001) .

Outro objecto da invenção é constituído pelos mutantes P. multocida fur ompH. As referidas bactérias são defeituosas nos genes fur e ompH. Desse modo, a expressão de ompHl e ompH2 não ocorre neles. Isto significa que uma vez que os referidos mutantes são utilizados em vacinas, os mesmos proporcionam uma maior protecção que os mutantes fur (uma consequência inesperada uma vez que ompH codifica a proteína OmpH de 36 KDa, que é altamente imunogénica). Finalmente, foram também obtidos os mutantes triplos P. multocida fur ompH galE. 0 objectivo da mutação galE é optimizar a superfície de exposição das proteínas da membrana externa reguladas por ferro do mutante P. multocida fur ompH com a finalidade de aumentar a 20 protecção contra P. multocida. Para esse efeito, é proporcionada a sequência dos iniciadores utilizados para amplificar um fragmento de 495 pares de bases de galE, que é subsequentemente clonado no plasmideo pUA1089. Este plasmideo é introduzido por meio de cruzamento triparental em mutantes P. multocida fur ompH PM1094, os mutantes triplos sendo posteriormente seleccionados. No entanto, as experiências realizadas in vivo sobre a eficácia dessas vacinas em ratinhos mostram um nível de protecção igual ao previsto pelos mutantes fur ompH. i) Utilização das bactérias mutantes inactivadas P. multocida fur, P. multocida fur ompH, P. multocida fur ompH galE e/ou as suas proteínas de membrana externa reguladas por ferro, fundamentalmente em forma de extracto, na preparação de uma vacina destinada a proporcionar protecção heteróloga para animais susceptíveis de serem infectados por P. multocida virulenta, a referida inactivação sendo térmica ou por sonicação, j) Vacinas que compreendem as bactérias mutantes P. multocida fur, P. multocida fur ompH, P. multocida fur ompH galE, inactivadas termicamente ou por sonicação e/ou extractos de proteínas de membrana externa reguladas por ferro destes mutantes, que compreendem um ou mais adjuvantes e/ou um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Com esta aplicação da invenção, isto é, a obtenção de vacinas, o requisito para a aplicação industrial da invenção é satisfeito.

Os estudos de protecção contra P. multocida, utilizando os mutantes duplos e triplos do presente pedido foram realizados com ratinhos. No entanto, a vacina pode ser aplicada no controlo de qualquer das doenças causadas por P. multocida, tais como 21 pneumonias em suínos e bovinos; cólera aviária e pneumonias em pequenos mamíferos, como coelhos e hamsters, etc.

Para formular a vacina, os mutantes P. multocida fur ompH ou fur ompH galE podem ser combinados com qualquer um dos coadjuvantes típicos em vacinas veterinárias deste tipo, tais como lipopolissacáridos, o adjuvante completo ou incompleto de Freund, monofosfolípidos, tais como monofosfolípido A, sulfatos, fosfatos, tais como fosfato de alumínio, e hidróxidos, tais como de hidroxifosfato de alumínio hidratado e hidróxido de alumínio. A dose da vacina irá variar dependendo da concentração do material antigénico; por exemplo, para uma vacina baseada em células inactivadas, a dose será de 0,1 mL usando uma concentração de 109 ufc/mL do mutante fur ou fur ompH ou fur ompH galE numa solução de 1 mL de soro fisiológico usada como excipiente, embora a concentração da substância activa será geralmente de 7 x 108 1 x 109 ufc/mL numa solução de 1 mL de excipiente e opcionalmente um adjuvante, tal como 0,7% de hidróxido de alumínio, por exemplo. Para uma vacina à base de extractos de proteína da membrana externa, um exemplo seria uma dose de 0,1 mL, utilizando uma concentração de 400 pg de extracto numa solução de 1 mL de soro fisiológico, embora a concentração de substância activa será geralmente de 100 a 400 pg numa solução de 1 mL de excipiente e opcionalmente um adjuvante, tal como hidróxido de alumínio a 0,7%, por exemplo. 22 TABELA 1

Estirpes bacterianas e plasmídeos utilizados na invenção

Organismo e plasmídeo características relevantes Fonte de consulta E. coli F'/supE4 AlacU169 (080 Clontech DH5CXÃ lacZAMlõ) hsdRll recAl endAl MC1061 Upir) gyrA96 thi-1 relAl hsdR mcrB araD139 Δ (araABC-leu) 1619 AlacXl4 gall galK rpsL thi lisogénio do bacteriófago Àpir Este laboratório P. multocida PM2 5 Tipo selvagem, serogrupo D Isolado de secreção nasal de coelho PM10 8 Tipo selvagem, serogrupo A Isolado de surto de pneumonia ovina PM1002 PM2 5 RifR SpcR Este laboratório PM1011 PM108 RifR SpcR Este laboratório PM1094 PM1011 fur ompH A presente invenção PM1095 PM1011 fur A presente invenção PM1096 PM1094 galE A presente invenção Plasmídeos pGEM-T Vector de clonagem PCR ApR PromegaD pRK2 013 rep (colEl) Mob+ Tra+ KmR (13 - Ditta, G., et al. T. Schmidhauser, E. Yakobson, P. Lu, pK03 M13ori repA(ts) sacB CmR X.W. Liang, D.R. Finlay, D. Guiney, D.R. Helinsky. Plasmid. 13: 149-153. 1985) (18 -Link, A.J., et al. D. Phillips, e G.M. Church. J. Bacteriol. 179-6228-6237. 1997)D pUA82 6 Mob+ R6K replicão ApR StrR Este laboratório PUA1089 SpcR pK03 contendo o local mob de pUA826D A presente invenção pUA891 pUA826 contendo um fragmento (4- Bosch, M., et al. R. Tarragó, interno de 394 bp do gene M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. fur de P. multocida Fernández de Henestrosa, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, e J. Barbé. FEMS Microbiol. Lett. 203: 35-40. 2001) pUA1090 pUA1089 contendo um fragmento interno de 495 bp do gene galE de P. multocida A presente invenção 23 TABELA 2

Caracteristicas dos iniciadores utilizados na presente invenção

Iniciador Sequência Posição Aplicação Furl 5'-AAACTTTTGAAAAAAGCGC-3' -18a Iniciador directo para a obtenção de um fragmento interno de 394 pb do gene fur de P. multocida Fur2 5-CTTGACATTACTACATTTGAA-3' + 412a Iniciador inverso para a obtenção de um fragmento interno de 394 pb do gene fur de P. multocida Fur3 5-CTTAATAGCAAAATAATTAAGGGGC- 3' -30a Iniciador directo utilizado para confirmar a ruptura do gene fur de P. multocida GalEintup 5'-GTGTTGCTCAAATCACCGGC-3' + 128b Iniciador directo para a obtenção de um fragmento interno de 495 pb do gene galE de P. multocida GalEintrp 5'-CCACTTGGCTAATATAAGGC-3' + 622b Iniciador inverso para a obtenção de um fragmento interno de 495 pb do gene galE de P. multocida GalEint2up 5'-AAGCCCTGCCTTCTATGTGG-3' -98“ Iniciador directo para confirmar a ruptura do gene galE de P. multocida Aad3 5'-GCCCGAGGCATAGACTGTACCCC-3' + 123c Iniciador para confirmar o rompimento do gene fur de P. multocida através da inserção do plasmideo pUA891 pK03-R 5'-TTAATGCGCCGCTACAGGGCG-3' 90d Iniciador para confirmar a ruptura do gene galE de P. multocida através da inserção do plasmideo pUA1090 OmpHlsequp 5'-caaacctattttgttttgac-3' -161e Iniciador directo para a amplificação da banda que contém os genes ompHl e ompH2 de P. multocida PM1011 e PM1094 e analisar a sequência do gene ompHle de P. multocida PM1011 PM1094 0mpH2 seqdw 5'-CAAAAACGGTGGTGTCGGTG-3' +1228“ Iniciador inverso para amplificar a banda que contém os genes ompHl e ompH2 de P. 24 multocida PM1011 e PM1094 e análise da sequência do gene ompH2 de P. multocida PM1011 e PM1094 Om21000 CATTTGGGCAAAAGAAGG + 8 60e Iniciador para a análise da sequência do gene ompH2 de P. multocida PM1011 e PM1094 Om22000 CTGCCACTGCAAAATCTTGG + 695* Iniciador para a análise da sequência do gene ompH2 de P. multocida PM1011 e PM1094 RTompHlup CGTTTTAGTAAAGATGTG + 235e Iniciador directo para a análise da transcrição de ompHl em PM1011 e PM109 de P. multocida RTompHlrp GTCACTTTAGATTGTGC + 7 7 9e Iniciador inverso para a análise da transcrição de ompHl em PM1011 e PM1094 de P. multocida RTompH2up AAAGAATATTAATAACAACG + 513* Iniciador directo para a análise da transcrição de ompH2 em PM1011 e PM1094 de P. multocida RTompH2dw AATCGTACTAACGTCACC + 7351 Iniciador inverso para a análise da transcrição de ompH2 em PM1011 e PM1094 de P. multocida e análise da sequência do gene ompH2 em ambas as estirpes OmpHl-2up AATGAGCTGATCGCTAATGC + 331 Iniciador para a análise da sequência do gene ompHl PM1011 e PM1094 de P. multocida a Posição da extremidade 5' do oligonucleótido com transcrição do gene fur de P. multocida respeito ao ponto inicial de b Posição da extremidade 5' do oligonucleótido com transcrição do gene galE de P. multocida respeito ao ponto inicial de c Posição da extremidade 5' do oligonucleótido com transcrição do gene aad pUA826 respeito ao ponto inicial de d Posição da Smal em pK03 extremidade 5' do oligonucleótido com respeito ao local de inserção de e Posição da extremidade 5' do oligonucleótido com respeito ao ponto inicial de transcrição do gene ompHl de P. multocida f Posição da extremidade 5' do oligonucleótido com respeito ao ponto inicial de transcrição do gene ompH2 de P. multocida 25 TABELA 3

Protecção proporcionada em ratinhos no desafio heterólogo com PM1002 de P. multocida por imunização com proteínas de membrana externa

Fonte de estirpe OMP Caracteristicas relevantes Dose°(gg/animal) Sobrevivência PM1011 Tipo selvagem 10 0/5 40 0/5 PM1011 Tipo selvagem desenvolvido 10 0/5 na presença de fur DPDa 40 1/5 PM1095 10 0/5 40 1/5 PM1094 Fur ompH 10 4/5 40 5/5 Soro fisiológico de 0/5 controlo a Agente quelante de catião divalente 2,2 '-dipiridilo b quantidade de extracto de proteina da membrana externa inoculada em cada imunização do animal. TABELA 4

Protecção dada em ratinhos no desafio heterólogo com PM1002 de P. multocida por meio da imunização com estirpes inactivadas de P. muitocida

Estirpe Processo de Dose de desafio Sobrevivência inactivação3 (x LDS0) Tipo selvagem H 500 0/5 H 100 0/5 fur oomph H 500 0/5 H 100 3/5 fur oomph galE H 500 0/5 H 100 3/5 fur oomph galE do S 500 0/5 tipo selvagem S 500 3/5 Soro fisiológico 100 0/5 de controlo a Uma suspensão de células a 7 x 10“ cfu/mL foi inactivada por calor por meio de incubação a 45 °C durante 12 horas (H) ou por sonicação (S) e 0,1 mL foram inoculados por animal 26

Materiais e Métodos

Estirpes Bacterianas e Condições de Crescimento A lista de estirpes bacterianas utilizada é mostrada na Tabela 1. Todas as estirpes de P. multocida foram cultivadas em meio liquido, em água de peptona tamponada (BPW) ou BHI, em placas de ágar de SBA. Quando foi necessário, foram adicionados antibióticos nas concentrações descritas (Cárdenas, M. et al. A.R. Fernández de Henestrosa, S. Campoy, A.M. Pérez de Rozas, J. Barbé, I. Badiola, e M. Llagostera. Vet. Microbiol. 80:53-61. 2001). No crescimento da estirpe de tipo selvagem, a concentração do agente de quelação de catiões divalentes, 2-2'-dipiridilo DPD (Sigma) utilizada foi de 150 μΜ (Tabela 3). Métodos Genéticos O mutante P. multocida fur foi obtido a partir do plasmideo pUA891 (Figura IA) . Este plasmideo é obtido como resultado da inserção de um fragmento interno do gene pUA826 (Bosch, M., R. Tarragó, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernández de Henestrosa, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, e J. Barbé. FEMS Microbiol. Lett. 203:35-40. 2001) com um fragmento interno do gene fur de

Pasteurella multocida de 394 pb. pUA826 é derivado de pGY2 (26-) do qual o gene cat foi extraído por meio de restrição com Sall. O plasmideo pGY2 tem uma origem de replicação R6K (dependente da proteína ypir para replicação, portanto, é suicida em Pasteurella multocida, contém a região a mobilização mob de RP4 e genes que fornecem o mesmo com resistência à ampicilina (bla) , estreptomicina e espectinomicina (aadA) e cloranfenicol (cat). Este último gene, como já foi discutido, não está presente nos plasmídeos pUA826 e pUA8 91. 27 0 plasmideo pUA1090 (Figura 3A) foi utilizado para construir o mutante fur ompH galE. Este plasmideo é o resultado da clonagem no plasmideo pUA1089 (pK03 com o local de mob do pUA82 6) um fragmento interno de 495 pb do gene galE de Pasteurella multocida. 0 plasmideo pUA1090 foi introduzido por meio de cruzamento triparental na estirpe mutante fur ompH, as transconjugados sendo seleccionados em placas selectivas.

Para determinar a estabilidade da mutação fur, os mutantes fur foram sub-cultivados 20 vezes consecutivas em placas de SBA sem a adição de antibióticos. A concentração de bactérias viáveis foi determinada em 5, 15 e 20 passagens utilizando diluições apropriadas de uma suspensão de células (IO9 ufc/mL) em placas de SBA com e sem estreptomicina, uma vez que pUA891 codifica o gene de resistência a este antibiótico. A percentagem de estabilidade foi calculada como o número de colónias obtidas em placas suplementadas com antibiótico em comparação com aquelas que não continham antibiótico.

Desse modo, foi observado que a mutação de fur foi mantida com 100% de estabilidade em células depois de 20 passagens na ausência de pressão selectiva.

Métodos Bioquímicos, Técnicas de ADN e ARN A metodologia e a análise de sequências por computador foram realizadas como foi descrito (8- Cárdenas, M., A.R. Fernández de Henestrosa, S., Campoy, A.M. Pérez de Rozas, J. Barbo, I. Badiola, e M. Llagostera. Vet. Microbiol, 80:53-61. 2001). Os iniciadores utilizados estão descritos na Tabela 2. As sequências de nucleótidos foram determinadas pelo método didesoxi num sequenciador ALF (Pharmacia Biotech). A extracção de ARN e análises de RT-PCR foram realizadas como foi descrito (Bosch, Μ., E. 28

Garrido, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, e J. Barbé. FEMS Microbiol Lett. 210:201-208. 2002). Os extractos de proteína da membrana externa de P. multocida foram obtidos e analisados tal como foi descrito (Bosch, Μ., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, e J. Barbé. FEMS Microbiol Lett. 210:201-208. 2002). As concentrações de proteína foram medidas tal como foi descrito (Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr, e R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193; 265-275. 1951) .

Estudos de Protecção contra P. multocida

Grupos de cinco ratinhos Swiss fêmeas de três semanas de idade (Harlan Ibérica; Barcelona, Espanha) foram injectados por via intraperitoneal com 10 ou 40 pg/animal de extracto de proteína de membrana externa (OMP). Os extractos foram preparados a partir de diferentes estirpes de P. multocida cultivadas em diferentes condições de cultura. Em todos os casos, o volume de extracto inoculado foi de 100 pL, que foram administrados em duas doses, com duas semanas de diferença. Os ratinhos de controlo foram inoculados com 100 pL de solução salina fisiológica. O desafio heterólogo foi realizado três semanas mais tarde por inoculação por via intraperitoneal de 0,1 mL de uma estirpe virulenta de P. multocida (PM1002) que continha 100 ou 500 vezes a sua DL50. A mesma metodologia foi usada para estudar a protecção proporcionada pela estirpe PM1094 de P. multocida (deficiente em fur e ompH) e estirpe PM1096 (deficiente em fur, ompH e galE) inactivada termicamente ou por sonicação. A inactivação térmica foi conseguida por incubação a 4 5 °C de um dia para o outro de uma cultura que cultivada anteriormente em BFN a 30 °C até uma densidade de 7 x 108 ufc/mL. As células inactivadas por sonicação foram preparadas por sonicação de 7 x 108 ufc/mL, ressuspensas em BPW, cinco vezes durante cinco minutos num banho de gelo a -40 °C, 29 com um rendimento de 80%. A ausência de células viáveis foi testada em placas de SBA. Em todos os casos, o volume de extracto de células inactivadas inoculado foi de 100 pL e foi administrado em duas doses com um intervalo de duas semanas. O controlo negativo e o desafio heterólogo foram realizadas como foi descrito anteriormente.

Resultados

Construção de um mutante de P. multocida O fragmento interno de 394 pb do gene fur de P. multocida foi obtido por amplificação por PCR utilizando os iniciadores FUR1 e Fur2 (Tabela 2). O fragmento obtido foi clonado no plasmideo suicida pUA826, resultando no plasmideo pUA891 (Figura IA).

Após a introdução do plasmideo pUA891 em P. multocida por acasalamento triparental, vários mutantes fur putativos foram isolados após a semeadura das bactérias em placas selectivas adequadas. A análise do ADN cromossómico através da técnica de PCR confirmou que o gene fur do tipo selvagem tinha sido interrompido por integração do plasmideo pUA891 (Figura 1B). A Figura 1B mostra o ADN cromossómico da estirpe de tipo selvagem (PM1011) (pista 2), mutante fur (PM1095) (pista 3) e mutante fur ompH (PM1094) (pista 4) que foram submetidos a análise por PCR com os iniciadores Aad3 e Fur3 (Tabela 2) . O controlo de PCR sem ADN é mostrado na pista 5. 0 ADN do fago ΦΧ174 digerido com Hinfl foi usado como marcador de peso molecular (pistas 1 e 6).

Da mesma forma, os perfis electroforéticos das fracções de membrana externa de vários mutantes fur foram analisados para confirmar que a presença da mutação fur deu origem à indução de 30 proteínas da membrana externa de elevado peso molecular reguladas por ferro (IROMPs) , tal como foi previamente descrito (4). Foram obtidos dois perfis diferentes mutantes fur. Surpreendentemente, o primeiro mutante expressou a principal proteína de 36 kDa da membrana externa de P. multocida (OMP), OMPH, enquanto o segundo não expressou.

Na sequência genómica completa de P. multocida, PM70 (21), foram identificadas duas cópias do gene ompH (separadas por 154 pb) , que codificam as proteínas OmpHl e 0mpH2. Para o fim de determinar a mutação responsável pelo fenótipo observado no mutante fur ompH (estirpe PM1094), foram realizadas análises de RT-PCR para determinar se os genes ompH tinham sido transcritos. Os resultados demonstraram que ompHl e ompH2 do mutante fur ompH tinham sido independentemente transcritos. No entanto, a sequenciação de ADN destes genes (número de acesso GenBank EF102481 e EF102482, respectivamente) revelou diferenças significativas em comparação com as sequências correspondentes das estirpes PM1011 e PM70. No gene ompHl do mutante fur ompH, uma mutação sem sentido foi encontrada na posição 76, dando origem a um codão de paragem em vez de um que codifica a glutamina; isto dá origem a uma proteína truncada muito curta com 24 aminoácidos. Do mesmo modo, a sequência de ompH2 deste mutante tinha muitas alterações de nucleótidos, incluindo uma mutação sem sentido na posição 670 que dá origem a uma proteína truncada com 223 aminoácidos em vez de 350 aminoácidos. Estes resultados indicam claramente que a ausência da proteína principal da membrana externa (OMP) de 36 kDa no mutante P. multocida fur ompH é devido a mutações sem sentido em ompHl e ompH2. A Figura 2 mostra o diagrama da estrutura dos genes ompHl e ompH2 de P. multocida. RTompHlup, RTompHlrp, RTompH2up e RTompH2rp indicam as posições dos iniciadores utilizados para a análise de transcrição (A). As secções (B), (C) e (D) mostram a análise de RT- PCR dos transcritos dos genes ompHl, ompH2 e do operão possível de 31 ompHl-ompHl tanto na estirpe de tipo selvagem (PM1011) (pista 2) como no mutante fur ompH (PM10 94) (pista 3) . Foram usados o ARN total de cada uma das estirpes e dos pares de iniciadores RTompHlup e RTompHlrp, RTompH2up e RTompH2rp e RTompHlup RTompH2rp, respectivamente. PCR com estirpe de ADN do tipo selvagem (pista 4) e de um controlo negativo sem ADN ou ARN (pista 5) , também são mostrados. 0 ADN dos fagos ΦΧ174 digerido com Hinfl (B e C) e do fago γ, digerido com BstEII (D) foram utilizados como marcadores de peso molecular (pista 1) .

Estudos de Protecção com Mutantes fur de P. multocida

Para analisar o efeito protector putativo do mutante fur de P. multocida, grupos de cinco ratinhos foram imunizados com 10 e 40 pg/animal de extracto de proteína da membrana externa (OMP), preparado a partir da estirpe de tipo selvagem PM1011 de P. multocida, cultivada na ausência ou na presença de DPD, e dos mutantes fur e fur ompH. Em seguida, os ratinhos foram desafiados de forma heteróloga com a estirpe virulenta PM1002 (DL50 = 3 ufc/animal) com uma dose de 500XLD50. Todos os ratinhos imunizados com o extracto de proteína de membrana externa (OMP) obtido a partir de células do tipo selvagem, cultivadas na ausência de DPD morreram dois dias após o desafio (Tabela 3) . No entanto, os ratinhos imunizados com 40 pg de extracto de proteína de membrana externa (OMP) tanto da estirpe de tipo selvagem cultivada em meio deficiente em ferro como os imunizados com o mutante fur apresentaram 20% de protecção (Tabela 3) . A ausência da proteína principal da membrana externa de P. multocida (OMP) no extracto deu origem a uma protecção completa (Tabela 3) de uma forma significativa. 32

Uma vez que o maior nivel de protecção foi obtido com o extracto de proteína de membrana externa (OMP) preparado do mutante duplo fur ompH, os seguintes experimentos foram focados na análise da protecção proporcionada por células inactivadas termicamente desta estirpe. Os ratinhos nos quais foi administrada uma dose de 7 x 107 ufc/mL de células de fur ompH termicamente inactivadas foram subsequentemente submetidos a desafio heterólogo com uma dose de IOOXLD50 da estirpe PM1002; estes ratinhos ficaram protegidos em 60% (Tabela 4) . Estes resultados indicam que a inactivação térmica simples das células de P. multocida fur ompH pode ser utilizada para produzir uma vacina que proporciona protecção heteróloga.

Efeito da mutação qalE na Capacidade Protectora da Estirpe de P. multocida

Com a finalidade de determinar se a optimização da superfície de exposição das proteínas da membrana externa reguladas por ferro (IROMPs) aumentou a protecção obtida com células inactivadas de fur ompH, foi introduzida uma mutação no lipopolissacárido (LPS) do mutante fur ompH, dando origem a uma estirpe derivada. O produto do gene galE catalisa a epimerização de UDP-galactose em UDP-glicose e é necessário para a síntese correcta do centro do lipopolissacárido. Para este fim, foi construído um mutante galE capaz de crescer na presença de glicose, mas incapaz de sintetizar LPS de superfície das células do tipo selvagem. Por meio de amplificação por PCR com os oligonucleótidos GalEintrp e GalEintup, foi obtido um fragmento interno do gene galE de 4 95 pb. Este fragmento foi clonado no pUAl089 e o plasmídeo resultante foi introduzido na estirpe fur ompH (PM1094) por acasalamento triparental. Após cultura em placas selectivas adequadas, foram obtidos vários mutantes galE putativos. 33 A Figura 3 descreve a análise PCR da construção do mutante galE de P. multocida. A secção (A) mostra a construção do mutante galE de P. multocida. GalEint2up e pK03-R indicam as posições dos iniciadores utilizados para confirmar a presença da mutação galE e a secção (B) mostra o ADN cromossómico da estirpe de tipo selvagem (PM1011) (pista 2), mutante fur ompH (PM1094) (pista 3) e mutante fur ompH galE (PM1096) (pista 4) que foram submetidos a análise por PCR utilizando os iniciadores GalEint2up e pK03-R (Tabela 2) . 0 controlo de PCR sem ADN é mostrado na pista 5. 0 ADN do fago λ digerido com BstEII foi usado como marcador de peso molecular (pistas 1 e 6). A análise de PCR do ADN cromossómico de quatro dos transconjugantes confirmaram que a inserção de pUA1090 interrompeu o gene galE de tipo selvagem. Em seguida, um destes clones, PM1096 (Figura 3), foi escolhido para estudos posteriores, e a análise do perfil da proteína da membrana externa dos mesmos corroborou que tinha o mesmo perfil que o da estirpe progenitora.

Grupos de cinco ratinhos foram inoculados com 7 x 107 ufc/animal de células de fur ompH galE termicamente inactivadas (45 °C durante 12 horas) e foram subsequentemente confrontados com o desafio heterólogo de PM1002 com doses de 100 e 500xLD50. Como pode ser visto na Tabela 4, os animais imunizados com a estirpe inactivada termicamente foram protegidos por 60% com a dose mais baixa. Desse modo, embora as células bacterianas expressassem LPS mais curtos na superfície de células, isto não resultou num aumento da protecção mediada por proteínas de membrana externa reguladas por ferro (IROMPs) , porque os mutantes fur ompH e fur ompH galE induziram o mesmo nível de protecção em ratinhos imunizados com qualquer uma das estirpes destes mutantes inactivados termicamente. 34 foi testada uma

Além disso, foi testada uma estratégia diferente de inactivação com base na ruptura das células por sonicação. Os ratinhos imunizados com células de fur ompH galE inactivadas por sonicação foram protegidos por 60% contra a dose mais elevada (500xLD5o) de bactéria virulenta (Tabela A), estes resultados sugerem que a inactivação das células por este método proporciona uma resposta imune mais forte do que o térmico tratamento e que este método de inactivação pode, portanto, ser mais adequado para o desenvolvimento de vacinas contra infecção causada por P. multocida.

Em conclusão, os resultados apresentados mostram pela primeira vez que as proteínas de membrana externa reguladas por ferro (IROMPs) do mutante P. multocida fur ompH são imunogénicas e fornecem protecção heteróloga. Por conseguinte, os referidos resultados sugerem que os mutantes duplos fur ompH podem ser utilizados para o desenvolvimento de vacinas à base de proteínas de membrana externa reguladas por ferro (IROMPs), em particular contra patogénios que têm vários receptores de ferro diferentes, como é o caso de P. multocida. Além disso, a estratégia de utilizar os mutantes duplos fur ompH resolve os problemas associados com outros métodos, tais como o crescimento fraco que as células bacterianas experimentam na presença de agentes quelantes de catião divalente.

Lisboa, 9 de Dezembro de 2014. 35

Literatura 1. Adler B., R. Chancellor, P. Homchampa, M. Hunt, C. Ruffolo, R. Strugnell, e D. Wapling. 1996. Immunity and vaccine development in Pasteurella multocida infections. J. Biotechnol. 44:139-144. 2. Baichoo, N., e J.D. Helmann. 2002. Recognition of DNA by Fur: a reinterpretation of the Fur box consensus sequence. J. Bacteriol. 184:5826-5832. 3. Basagoudanavar, S.H., D.K. Singh e B. C. Varshney. 2006. Immunization with outer membrane proteins of Pasteurella multocida (6;B) provides protection in mice. J. Vet. Med. 53:524-530. 4. Bosch, M., R. Tarrag6, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernándaz de Henestrosa, A.M. Pérez de Rozas, L Badiola, e J. Barbé. 2001. Expression of the Pasteurella multocida ompH gene is negatively regulated by the Fur protein. FEMS Microbiol. Lett. 203:35-40. 5. Bosch, Μ., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, e J. Barbé. 2002. Pasteurella multocida exbB, exbD and tonB genes are physically linked but independently transcribed. FEMS Microbiol Lett. 210:201-208. 6. Bosch, Μ., M.E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, e J. Barbé. 2002. Characterization of the Pasteurella multocida hgbA gene encoding a hemoglobin-binding protein. Infect. Immun. 70:5955-5964. 7. Bosch, M., M.E. Garrido, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, J. Barbé, and M. Llagostera. 2004. Pasteurella multocida contains multiple immunogenic haemin- and haemoglobin-binding proteins. Vet. Microbiol. 99: 103-112. 8. Cárdenas, M., A.R. Fernández de Henestrosa, S. Campoy, A.M. Pérez de Rozas, J. Barbé, I. Badiola, e M. Llagostera. 2001. Virulence of Pasteurella multocida recA mutants. Vet. Microbiol. 80:53-61. 9. Chibber, S., e S.B. Bhardwaj . 2004. Protection in a mouse peritonitis model mediated by iron-regulated outer- membrane protein of Salmonella typhi coupled to its Vi antigen. J. Med. Microbiol. 36 53:705-709. 10. Chung, J.Y., I. Wilkie, J.D. Boyce, e B. Adler. 2005. Vaccination against fowl cholera with acapsular Pasteurella multocida A:l. Vaccine. 23:2751-2755. 11. Cox, A.J., M.L. Hunt., J.D. Boyce, e B. Adler. 2003, Functional characterization of HgbB, a new hemoglobin binding protein of Pasteurella multocida. Microb. Pathog. 34:287-296. 12. de Lorenzo, V., M. Herrero, F. Giovannini, e J.B. Neilands. 1988. Fur (ferric uptake regulation) protein and CAP (catabolite-activator protein) modulate transcription of fur gene in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 173:537-546. 13. Ditta, G., T. Schmidhauser, E. Yakobson, P. Lu, X.W. Liang, D.R. Finlay, D. Guiney, D.R. Helinski. 1985. Plasmids related to the broad host range vector, pRK290, useful for gene cloning and for monitoring gene expression. Plasmid 13: 149-153. 14. Escolar, L., J. Pérez-Martin, e V. de Lorenzo. 1999. Opening the iron box: transcriptional metalloregulation by the Fur protein. J. Bacteriol. 181:6223-6229. 15. Garrido, M.E., M. Bosch, R. Medina, A. Bigas, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, e J. Barbé. 2003. fur-independent regulation of the Pasteurella multocida hbpA gene encoding a haemin-binding protein. Micro-biology 149:2273-2281. 16. Glisson, J.R., M.D. Contreras, I.H. Cheng, e C. Wang. 1993. Cross-protection studies with Pasteurella multocida bacterins prepared from bactéria propagated in iron-depleted médium. Avian. Dis. 37:1074-1079. 17. Hodgson, J.C, A. Finucane, M.P. Dagleish, S. Ataei, R. Parton, e J.G. Coote. 2005. Efficacy of vaccination of calves against hemorrhagic septicemia with a live aroA derivative of Pasteurella multocida B:2 by two different routes of administration. Infect. Immun. 73:1475-1481. 18. Link, A.J., D. Phillips, e G.M. Church. 1997. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type 37

Escherichia coli: application to open reading frame characterization. J. Bacteriol. 179:6228-6237. 19. Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr, e R.J. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275. 20. Luo, Y., J.R. Glisson, M.W. Jackwood, R.E. Hancock, M. Bains, I.H. Cheng, e C. Wang. 1997. Cloning and characterization of the major outer membrane protein gene (ompH) of Pasteurella multocida X-73. J. Bacteriol. 179:7856-7864. 21. May, B.J., Q. Zhang, L.L. Li, M.L. Paustian, T.S. Whittam, e V. Kapur. 2001. Complete genomic sequence of Pasteurella multocida, Pm70. Proc. Nati. Acad. Sei. USA. 98:3460-3465. 22. Ratledge, C, e L.G. Dover. 2000. Iron metabolism in pathogenic bactéria. Annu. Rev. Microbiol. 54:881-941. 23. Ruffolo, C.G., B.H. Jost, e B. Adler. 1998. Iron-regulated outer membrane proteins of Pasteurella multocida and their role in immunity. Vet. Microbiol. 59:123-137. 24. Sood, S., P. Rishi, V. Dahwan, S. Sharma, e N.K. Ganguly. 2005. Protection mediated by antibodies to iron- regulated outer-membrane proteins of S. thyphi in a mouse peritonitis model. Mol. Cell. Biochem. 273:69-78. 25. Stoj il j kovic, L, A.J. Baumler, e K. Hantke. 1994. Fur regulon in gram-negative bactéria. Identification and characterization of new iron-regulated Escherichia coli genes by a Fur titration assay. J. Mol. Biol. 236:531-545. Erratum in: 1994. J. Mol. Biol. 240:271. 26. Young, G.M., Amid, D. e Miller, V.L. 1996. A bifunctional urease enhances survival of pathogenic Yersinia enterocolitica and Morganella morganii at low pH. J. Bacteriol. 178, 6457-6495. 38

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Bactéria Pasteurella multocida mutada, caracterizada por ser defeituosa nos genes fur e ompH de modo que a expressão de fur e de ompHl e ompH2 não ocorre.
2. 2. Bactéria Pasteurella multocida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por, além de ser defeituosa nos genes fur e ompH, é também defeituosa no gene galE de tal modo que a superfície de exposição das proteínas de membrana exterior reguladas por ferro das células de Pasteurella multocida fur ompH ser optimizada.
3. 3. Bactéria Pasteurella multocida mutada de acordo com as reivindicações 1-2, caracterizada por ser defeituosa em fur pela interrupção do gene do tipo selvagem depositado no GenBank sob o número de acesso AF027154 versão 1, por integração no mesmo do fragmento interno de 394 bp do gene fur compreendido entre os nucleótidos 18 e 412, amplificado com o iniciador Furl com a sequência 5'-AAACTTTTGAAAAAAGCGC-3' e o iniciador Fur2 com a sequência 5-CTTGACAT- TACTACATTTGAA-3' .
4. 4. Bactéria Pasteurella multocida mutada de acordo com as reivindicações 1-3, caracterizada por ser defeituosa em OmpH, tendo uma mutação sem sentido em ompHl na posição 76, e várias mudanças de nucleótidos bem como uma mutação sem sentido na posição 670 em ompH2.
5. 5. Bactéria Pasteurella multocida mutada de acordo com as reivindicações 1-4, caracterizada por a mutação em ompHl dar origem a um codão de paragem em vez de glutamina resultando numa proteína truncada com 24 aminoácidos, e por a mutação em 1 ompH2 dar origem a uma proteína truncada com 223 aminoácidos em vez de 350 aminoácidos.
6. 6. Bactéria Pasteurella multocida mutada de acordo com as reivindicações 1-5, caracterizada pela ausência da proteína de membrana exterior principal de 36 KDa devido às mutações sem sentido de acordo com as reivindicações 4 e 5.
7. 7. Bactéria Pasteurella multocida mutada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser defeituosa em galE por interrupção do gene do tipo selvagem por integração na mesma do fragmento interno de galE de 495 bp obtido por amplificação com o iniciador GalEintup com a sequência 5'-GTGTTGCTCAAATCACCGGC-3' e o iniciador GalEintrp com a sequência 5'- CCACTTGGCTAATATAAGGC-3'.
8. 8. Bactéria Pasteurella multocida mutada de acordo com as reivindicações 1-7, caracterizada por ter sido inactivada.
9. 9. Bactéria Pasteurella multocida mutada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por ter sido inactivada termicamente.
10. 10. Bactéria Pasteurella multocida mutada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por ter sido inactivada por sonicação.
11. 11. Utilização do mutante duplo de Pasteurella multocida fur ompH ou mutante triplo fur ompH galE de acordo com qualquer das revindicações 1 a 10 para a obtenção de uma preparação de proteínas de membrana exterior. 2
12. 12. Método de preparação de uma vacina para a protecção heteróloga de animais contra a infecção causada por P. multocida, que é caracterizada por compreender: a. a obtenção de mutantes de P. multocida defeituosos nos genes fur e ompH, ou nos genes fur, ompH e galE, de acordo com as reivindicações 1-10, e/ou uma preparação de proteínas de membrana externa à qual os referidos mutantes dão origem de acordo com a reivindicação 11; e b. a preparação adequada para o método seleccionado de administração da vacina, que compreende um extracto de células obtidas em (a) contendo uma quantidade eficaz do mutante fur ompH ou fur ompH galE e/ou das suas proteínas de membrana externa e um excipiente e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
13. 13. Método de preparação de uma vacina para a protecção heteróloga de animais contra a infecção causada por P. multocida de acordo com a reivindicação 12, que é caracterizada por as células do mutante duplo fur ompH ou do mutante triplo fur ompH galE não serem activadas termicamente.
14. 14. Método de preparação de uma vacina para a protecção heteróloga de animais contra a infecção causada por P. multocida de acordo com a reivindicação 12, que é caracterizada por as células do mutante fur, do mutante duplo fur ompH ou do mutante triplo fur ompH galE terem sido inactivadas por sonicação.
15. 15. Composição de vacina para a protecção heteróloga de animais contra a infecção causada por P. multocida, caracterizada por compreender uma quantidade imunogénica do mutante duplo fur ompH ou do mutante triplo fur ompH galE de acordo com as reivindicações 12-14, um excipiente e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. 3
16. 16. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 15 para a protecção heteróloga de animais contra infecção causada por P. multocida, tais como pneumonia em suínos e gado, cólera aviária e pneumonias em pequenos mamíferos tais como coelhos e hamsters.
17. 17. Utilização do mutante duplo P. multocida fur ompH ou do mutante triplo fur ompH galE para preparar uma vacina para a protecção heteróloga de animais contra infecção causada por P. multocida de acordo com as reivindicações 12-16.
18. 18. Utilização do mutante duplo P. multocida fur ompH para preparar uma vacina para a protecção heteróloga de animais contra infecção causada por P. multocida de acordo com as reivindicações 12-16.
19. 19. Utilização do mutante triplo fur ompH galE para preparar uma vacina para a protecção heteróloga de animais contra infecção causada por P. multocida de acordo com as reivindicações 12-16. Lisboa, 9 de Dezembro de 2014. 4