KR20010042175A - ＡｒｏＣ, ＯｍｐＦ 및 ＯｍｐＣ 유전자 각각에 비복귀돌연변이로 약독화된 백신에 유용한 박테리아 - Google Patents

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Abstract

백신에 유용한 약독화된 박테리아
본 발명은 aroC 유전자, ompF 유전자 및 ompC 유전자의 비복귀돌연변이(non-reverting mutation)에 의하여 약독화된 박테리아를 제공한다. 본 발명의 박테리아는 백신에 유용하게 사용될 수 있으며, 전기 박테리아는 예를 들면 설사를 예방하기 위한 약독화된 대장균주가 될 수 있다.

Description

ＡｒｏＣ, ＯｍｐＦ 및 ＯｍｐＣ 유전자 각각에 비복귀 돌연변이로 약독화된 백신에 유용한 박테리아{Bacteria attenuated by a non-reverting mutation in each of the AroC, OmpF and OmpC genes, useful as vaccines}
예방접종의 원리는 면역 반응을 유도하여 훗날 병원체에 의해 침입을 받았을 때 숙주를 보호하는 것이다. 이러한 면역성은 병원성 균주를 약독화시킨 생균 백신(live attenuated strain of the pathogen)을 접종함으로써 얻을 수 있는데, 즉 균주의 병원성을 약화시켜(reduced virulence) 병원성 균주에 의해 야기되는 질병을 방지하는 것이다.
박테리아나 바이러스 균주의 생균 백신은 다음의 두가지 고전적인 방법 중 한가지를 이용하여 선택되어져 왔다. 균주(organism)에 돌연변이를 일으키는 화학물질을 처리하거나, 또는 균주를 실험실 내에서 반복적으로 계대배양(repeated passage)하여 돌연변이체를 만들었다. 그러나, 두가지 방법 모두 약독화의 형태(mode)가 불분명한 상태의 약독화된 균주를 만들어 낸다. 이러한 균주들은 약독화 과정에서 유전자의 단일 변환(single mutation, 쉽게 복귀됨) 또는 복수 변환(multiple mutation)을 초래함에 따라 야생 균주로의 복귀 가능성 측면에서 특성을 규명하기가 특히 어렵다. 더우기, 유전자의 복수 변환 현상으로 인하여 적절한 면역원성(immunogenic)의 특성을 갖는 균주를 얻는다는 것은 어려운 일이며, 아마도 병원균에 대한 예방책을 제공하기 위하여는 여러가지 균주가 필요하게 될 것이다.
현대의 유전학적 기술을 이용함으로써, 안정적으로 약독화시키는 유전자 결실(deletion)을 도입하여, 유전학적으로 확실하게 약독화된 박테리아 균주를 작제(construct)하는 것이 가능해졌다. 이러한 기술을 이용하여 살모넬라(Salmonella)의 여러 가지 부위특이적 돌연변이체(site-directed mutants)가 만들어졌다(참조문헌 2,4,5,9,12,16,17,18). aro 유전자(즉, aroA, aroC, aroD 및 aroE)를 비롯한 pur, htrA, ompR, ompF, ompC, galE, cya, crp 및 phoP 등 많은 유전자에서의 돌연변이가 살모넬라를 약독화시키는 것으로 보고되었다.
살모넬라의 aroA 돌연변이체는 특성이 잘 규명되었고, 몇 가지 동물에서 살모넬라증(salmonellosis)에 대한 우수한 생균 백신임이 밝혀졌다. 게다가, aroA/purA와 aroA/aroC 같이 두 개의 독립된 유전자에 돌연변이를 일으킴으로써 유전자 조합(recombination)에 의한 병원성으로의 복귀(reversion) 기회를 감소시켰다. S.typhi(사람)와 S.dublin(소) 같이 숙주에 적응된 살모넬라 균주에 나타난 동일한 돌연변이는 또한 단일 접종 백신의 제조에 이용되어 실제로 임상(참조문헌 8,11)이나 포장시험(10)에서 성공적인 결과를 나타내었다.
ompC와 ompF 유전자 모두에 안정적인 돌연변이를 포함하는 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)균주가 챗필드(Chatfield)등(참조문헌 21)에 의하여 보고되었다. BALB/c 쥐에게 경구 투여하여 50% 치사량(lethal dose, LD50)을 측정한 결과, 위 균주가 약 1,000배 정도 약독화된 것으로 나타났다. 그러나, 정맥주사로 투여하여 LD50를 측정하였을 경우 약 10배 정도만 약독화된 것으로 나타난 결과는, 경구 투여했을 경우 박테리아의 감염 능력에 포린(porin)이 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
ompC와 ompF 유전자의 발현은 ompR에 의하여 조절된다. 피카드(Pickard)등(참조문헌 13)은 ompR과 envZ 유전자를 포함하는 ompB 오페론을 Salmonella typhi Ty2 코스미드 은행(cosmid bank)으로부터 클로닝하여 DNA 염기서열을 결정한 결과를 보고하였다. DNA 염기서열 결과를 이용하여 ompR 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)내에 517bp의 특성이 규명된 결실(deletion)을 일으키는 적절한 절단위치를 찾았다. 이러한 결실은 aroC와 aroD에 이미 알려진 결실을 포함하는 S.typhi의 두가지 균주의 염색체와 상동조합(homologous recombination)에 의해 치환 도입되었다. S.typhi의 ompR 돌연변이체는 외막분리물(outer membrane preparation)의 분석에 나타난 바와 같이 포린 유전자 ompC와 ompF의 발현이 현저하게 감소되었다. ompR-envZ 의 요소로 이루어진 조절계(regulatory system)는 S.typhi의 다당류 Vi 합성의 조절에 중요한 역할을 한다.
동물 실험에서, 약독화된 쥐티푸스균이 이종(heterologous) 항원을 면역체계로 전달하는 매개체(vehicle)로 이용되었다(참조문헌 3,6,15). 이러한 시도는 사람에게 이용할 수 있는 다가백신(multivalent vaccine) 개발의 가능성을 높여준다(참조문헌 7).
[발명의 요약]
본 발명은 aroC, ompF, ompC 유전자 각각에 비복귀성(non-reverting) 돌연변이를 일으켜 약독화시킨 박테리아를 제공한다. 본 발명은 또한 전기 박테리아를 포함하는 백신을 제공한다.
aroC/ompF/ompC 돌연변이의 조합이 우수한 성질의 백신을 만들 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 다음과 같은 두가지 이유에서 aroC/ompF/ompC 조합은 aroC/ompR 조합 보다 우수한 것으로 생각된다:
1. ompR의 돌연변이는 ompF/ompC 돌연변이의 조합보다 박테리아를 훨씬 더 약독화시키는데, 이는 아마도 ompR이 박테리한천배지 생체내에서 생존하는데 중요한 역할을 하는 ompF와 ompC 이외의 여러 가지 유전자의 발현을 조절하기 때문일 것이다. 그러므로, ompF/ompC의 조합은 박테리아가 예방접종을 받은 숙주 내에서 더욱 오랫 동안 높은 생존률을 유지하게 하므로 높은 예방 효과를 가져올 것이다.
2. ompR의 돌연변이는 ompF/ompC 돌연변이의 조합보다 낮은 면역원성을 나 타내는데, 아마도 ompR이 면역원성의 표출에 중요한 항원의 발현을 조절하기 때문일 것이다.
본 발명은 백신에 유용한 약독화된 박테리아에 관한 것이다.
도 1은 오버래이 익스텐션 PCR(overlay extension PCR) 돌연변이법을 이용하여 대상 유전자에 결실 돌연변이를 만든 시스템을 보여주는 도식이다.
도 2는 재조합과 결실돌연변이의 선택 후 예상되는 대상 유전자의 서열이다.
도 3은 결실 돌연변이를 포함하는 카세트(deletion cassette)를 pCVD442 플라스미드에 클로닝하는 과정을 보여주는 도식이다.
도 4는 저농도(무염 L-broth) 및 고농도(무염 L-broth + 15% 자당)의 삼투 조건에서 ETEC 종에서 분리된 외막 단백질의 SDS-PAGE 분석이다. M: 마커; 시료 1: PTL010; 시료 2: PTL002; 시료 3: PTL003; 시료 4: △aroC△ompC; 시료 5 = △ompF.
도 5는 CFA 한천 배지에서 증식 후, 결실 돌연변이 종에서 CS1 및 CS3의 발현을 보여준다. 각 균주에서 동수의 세포를 15% SDS-PAGE 젤에 로딩한 후, 단일 특이적 항-CS1 또는 항-CS3 다클론성 항체로 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 하였다. 항체 특이성에 대한 대조구로서, CS1의 주요 필린 단백질 또는 CS3로부터 순수 분리된 주요 필린 단백질을 발현하는 TG1세포의 전체 분쇄물을 사용하였다. 레인 M, 레인보우(rainbow) 저분자량 마커; 레인 1, pKK223을 갖는 TG1 세포; 레인 2, CS1-ETEC 균주; 레인 4, PTL010; 레인 5, PTL001; 레인 6, PTL002; 레인 7, PTL003; 레인 8, 순수분리된 CS3 주요 필린 단백질.
도 6은 돌연변이 유전자좌를 보여주는 서던 블랏(Southern blot)이다. 도 6에서 보듯이, 야생형 ETEC(E1392/75-2A), PTL001(htrA aroC), PTL002(aroC ompR) 및 PTL003(aroC ompC ompF)에서 분리한 염색체 DNA를 EcoRV 제한 효소로 절단 후 1% 한천 젤에서 전기영동하였다. 전기영동된 DNA를 Hybond N+ 나일론 막에 옮긴 후, aroC, htrA, ompR, ompC 또는 ompF 유전자좌에서 유래된 탐침과 하이브리디제이션(hybridization)시켰다. 단백질 밴드의 패턴은 결실을 갖고 있는 돌연변이 유전자좌와 일치하였다.
도 7은 본 발명에 의한 백신을 투여받은 지원자의 IgA 반응을 보여주는 그래프이다.
본 발명에 사용되는 박테리아
본 발명의 백신을 제조하기 위하여 사용되는 박테리아는 대체로 경구를 통한 감염을 일으키는 박테리아이다. 이러한 박테리아는 진핵세포를 침입하여 세포 안에서 증식하거나 및/또는 점막 표면에 정착하며(colonise), 대체로 그람음성균이다.
전기 박테리아는 에쉐리히아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 비브리오(Vibrio), 헤모필러스(Haemophilus), 나이세리아(Neisseria), 예르시니아(Yersinia), 보르데텔라(Bordetella) 또는 브루셀라(Brucella) 등의 속(genera)이면 된다. 이러한 박테리아의 예로서는 대장균(Escherichia coli) - 사람의 설사 유발균; 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium) - 여러 가지 동물에서의 살모넬라증 유발균; 장티푸스균(Salmonella typhi) - 사람의 장티푸스 유발균; 장염균(Salmonella enteritidis) - 사람의 식중독 유발균; 돼지 콜레라균(Salmonella choleraesuis) - 돼지의 살모넬라증 유발균; 소티푸스균(Salmonella dublin) - 소, 특히 갓 태어난 송아지의 전신성 및 하리성 질병 유발균; 인플루엔자균(Haemophilus influenza) - 뇌수막염 유발균; 임균(Neisseria gonorrhoeae) - 임질 유발균; 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) - 사람의 위장염으로부터 치명적인 패혈증에 이르기까지 여러 종류의 질병 유발균; 백일해균(Bordetella pertussis) - 백일해 유발균; 소유산균(Brucella abortus) - 소의 유산/불임 유발 및 사람의 파상열(undulent fever)유발균 등이 있다.
대장균(E.coli)과 살모넬라 균주들은 본 발명에 특히 유용하게 쓰인다. 살모넬라 자체에 의한 감염에 대한 예방백신 뿐 만 아니라, 약독화된 살모넬라는 구강을 통하여 다른 개체로부터 유래된 항원인 이종 항원의 전달매개체로 이용될 수 있다. 살모넬라는 강력한 면역원(immunogen)이며 전신 및 국부 세포면역과 항체 반응을 자극한다. 생체내에서 이종항원을 살모넬라를 통하여 발현시키는 시스템이 알려져 있다; 예를 들어, nirB 와 htrA 유전자의 프로모터는 생체내에서 항원을 효율적으로 발현시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 장관독소성 대장균(enterotoxigenic E.coli, 이하 'ETEC'라 함)에 응용될 수 있다. ETEC는 대장균 강(class)에 속하며, 설사를 유발하고 근위(proximal) 소장에 정착한다. ETEC의 대표 균주는 ATCC H10407이다.
여행객 설사의 가장 빈번한 원인은 ETEC에 의한 감염이며, 개발도상국가를 방문하는 여행객 중 일년에 3백만 내지 9백만 명이 감염되는 것으로 알려져 있다. ETEC 감염이 풍토병인 곳에서는 영유아의 탈수성 설사를 유발하는 주요한 원인이며, 전세계적으로 일년에 다섯 살 이하의 어린이 800,000여 명이 사망하는 것으로 알려져 있다. 개발도상국에서, ETEC의 감염에 의한 질병 발병율이 나이가 들어감에 따라 감소하는 것은 ETEC에 대한 면역성이 획득될 수 있다는 것을 의미한다. 반면에, 선진국에서 개발도상국의 풍토병 지역(endemic area)으로 여행하는 면역성이 없는 성인은 ETEC 감염에 매우 민감하다. 그러나, 전염지역에 오래 체류하거나 여러 번 반복해서 방문하면 ETEC 감염에 대한 감수성이 줄어드는 것으로 미루어 보아, ETEC 감염의 예방에 약독화된 생균 백신을 성공적으로 사용할 수 있을 것이다.
본 발명자들은 E1392/75/2A로 불리우는 무독성 ETEC 균주를 선택하였다. E1392/75/2A는 독성 돌연변이체의 독소 유전자가 결실되어 자연발생적으로 생긴 균주이다. 사람에게 E1392/75/2A의 생균을 구강을 통하여 접종(oral vaccination)한 결과, 독소를 발현하는 다른 항원형(serotype)의 ETEC 감염을 75% 예방한 것으로 나타났다. 그러나, 접종을 받은 사람의 15%는 백신의 부작용으로 설사를 경험한 것으로 나타났다. 전기 균주는 백신으로 사용되기 위해서는 부작용을 감소시킬 수 있도록 한층 더 약독화되어야 하며, 본 발명이 이러한 약독화를 가능하게 하는 방법을 제공한다.
서열 번호 1은 대장균 aroC 유전자의 염기서열이며, 서열번호 3은 대장균 ompC 유전자의 염기서열이고, 서열번호 5는 대장균 ompF 유전자의 염기서열을 나타낸다.
유전자의 추가 변환(further mutation)
aroC, ompC, ompF 유전자의 돌연변이 외의 변환된 유전자를 포함하는 균주를 작제하기 위하여, 본 발명의 박테리아에 하나 또는 그 이상의 유전자 변환을 추가로 도입하였다. 이러한 유전자의 추가 변환은 (i) aroC, ompC, ompF 유전자 외의 약독화를 위한 변환, (ii) 플라스미드(즉, 이종 항원을 발현하는 플라스미드)를 포함하는 박테리아를 생체 내에서 선별할 수 있게 하는 변환, 또는 (iii) 독소 유전자의 발현을 방지하는 변환 등이다.
약독화시키기 위한 추가 변환은 이미 약독화의 효과가 알려진 돌연변이가 될 것이다. 이러한 돌연변이로는 aro 유전자(즉, aroA, aroD 및 aroE), pur, htrA, ompR, galE, cya, crp, phoP 및 surA의 돌연변이를 포함한다(참조문헌 2,4,5,9,12,13,16,17,18).
플라스미드를 유지하기 위한 선별 환경을 제공하는 변환은 박테리아가 생존하는데 필요 불가결한 유전자의 변환이 되기 때문에, 전기 플라스미드를 가진 박테리아만이 살아남을 것이다. 이러한 방법은 이종 항원을 포함하는 플라스미드를 박테리아에서 발현시킬 때 유용하다.
독소 유전자의 발현을 방지하는 변환은 박테리아를 이용한 백신의 부작용을 감소시키기 위하여 도입된다. 예를 들어, ETEC와 같은 대장균 균주를 이용한 백신의 경우 열민감 독소(heat labile toxin, 이하 'LT' 라 함) 또는 열안정 독소(heat stable toxin, 이하 'ST' 라 함) 유전자를 변환시켜 발현되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
유전자 변환의 특성(the nature of the mutation)
박테리아 백신에 도입되는 유전자 변환은 일반적으로 유전자의 기능을 완전히 잃게하는(knock-out the funcion) 변환이다. 이러한 변환은 유전자로부터 폴리펩타이드의 합성이 전혀 되지 않게 하거나, 또는 기능을 잃은 폴리펩타이드를 합성하는 것이다. 폴리펩타이드의 합성이 전혀 일어나지 않게 하기 위해서는 유전자 전체 또는 5'-말단을 제거한다. 유전자의 코딩 서열 안에 결실이나 삽입의 도입은 기능을 잃은 폴리펩타이드(즉, 정상 단백질의 N-말단 서열만을 포함하는 폴리펩타이드)를 합성하는 유전자를 만든다.
이러한 유전자 변환은 비복귀성(non-reverting) 변환이다. 즉, 이러한 박테리아를 백신으로 사용하였을 때 야생종(wild-type)으로 절대로 복귀하지 않는 변환을 의미한다. 이러한 변환은 삽입 및 결실을 포함한다. 삽입과 결실은 길이가 긴 것이 바람직하며, 일반적으로 10 뉴클레오티드 이상, 즉 10 내지 600 뉴클레오티드가 바람직하다. 바람직하게는, 코딩 서열 전체를 제거한다.
백신에 이용되는 박테리아는 반드시 잘 알려진 돌연변이 즉, 이미 특성이 규명된 돌연변이만을 포함한다. 특성규명이 이루어지지 않은 돌연변이를 게놈에 포함하는 박테리아는 특성규명이 이루어지지 않은 돌연변이가 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수도 있으므로 백신으로 바람직하지 않다.
약독화를 위한 유전자 변환은 당업자들에게 잘 알려진 방법으로 도입할 수 있다(참조문헌 14). 적절한 방법은 야생종 유전자 DNA 서열을 벡터, 즉 플라스미드에 클로닝하고 선별 마커를 클로닝한 DNA에 삽입하거나, 또는 유전자의 불활성화를 초래하도록 DNA 서열의 일부를 제거하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 코딩 서열내 혹은 코딩 서열 바로 밖을 제한효소를 이용하여 절단하고 남아있는 DNA 서열의 양끝을 연결시켜 결실을 도입할 수 있다. 이와 같이 불활성화 된 DNA 서열을 포함하는 플라스미드를 일렉트로포레이션(electroporation)이나 접합(conjugation) 같은 잘 알려진 기술을 이용하여 박테리아로 형질전환시킨다. 적절한 선별 방법에 의해서, 불화성화된 DNA 서열이 박테리아의 염색체내로 상동조합(homologous recombination)되어 박테리아의 정상 DNA 서열이 기능을 잃게 된 유전자 변환체를 확인할 수 있다.
이종 항원의 발현
본 발명의 약독화된 박테리아는 천연 상태의 박테리아에서는 발현되지 않는 항원("이종 항원")이 발현 될 수 있도록 유전적으로 조작될 수 있으므로, 약독화된 박테리아가 이종 항원의 전달매개체로 사용될 수 있다. 다른 개체의 항원을 발현시킬 수 있으므로, 본 백신은 다른 개체의 감염으로부터 숙주를 보호할 수 있다. 약독화된 박테리아의 병원성을 가진 원래의 균주에 대한 면역성뿐만 아니라, 다른 개체에 대한 면역성까지 부여할 수 있는 다가(multivalent) 백신을 제조할 수 있다. 더우기, 약독화된 박테리아는 한가지 이상의 이종 항원을 발현할 수 있도록 유전적으로 조작될 수 있으므로, 이종 항원은 같은 개체 혹은 다른 개체로부터 올 수 있다.
이종 항원은 완전한 단백질 또는 항원결정기(epitope)를 포함하는 단백질의 일부분이 될 수 있다. 항원은 다른 박테리아, 바이러스, 효모, 또는 곰팡이 등으로부터 유래될 수 있다. 특히 항원 염기서열(antigenic sequence)은 대장균(즉, ETEC), 파상풍(tetanus), 간염(hepatitis) A, B, 또는 C 바이러스, 사람 라이노바이러스(rhinovirus) 타입 2 또는 타입 14, 단순포진(herpes simplex) 바이러스, 소아마비 바이러스(poliovirus) 타입 2 또는 타입 3, 풋앤마우스병(foot-and-mouth disease) 바이러스, 인플루엔자(influenza) 바이러스, 콕사키(coxsackie) 바이러스 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 등으로부터 유래될 수 있다. 유용한 항원으로는 대장균의 열민감 독소(heat labile toxin)의 무독성 부분, 대장균 K88 항원, ETEC 정착 인자 항원(colonization factor antigen), 백일해균(B.pertussis)의 P69 단백질, 파상풍 독소의 단편 C(tetanus toxin fragment C) 등을 포함한다.
ETEC의 정착 인자와 그의 요소가 이종 항원 발현의 첫 번째 후보이다. 설사 증상을 유발하기 위하여는, ETEC의 병원성 균주가 소장내에 정착하여 장관독소(enterotoxin)를 생산할 수 있어야 한다. 대부분의 ETEC 균주에서 소장 점막에 부착하는데 필요한 정착인자(colonization factor, 이하 'CF'라 함)가 확인되었다. 많은 수의 CF가 동정되었고, 가장 흔한 것으로는 CFAI, CRAII(CS1, CS2, CS3을 포함) 및 CFAIV(CS4, CS5, CS6 포함) 등이 있다.
ETEC에 대한 백신은, 다른 균주에 대한 방어도 확실하게 하기 위하여, 이상적으로는 모든 정착인자 항원에 대한 방어 능력을 부여할 것이다 이러한 목표를 달성하기 위하여, 여러 가지 정착항원을 한가지 균주에서 발현시킬 수 있다. 다른 방법으로는, 각각 다른 정착인자를 갖는 여러 가지 다른 ETEC 균주를 같은 방법으로 약독화시킨다. 이 방법은 이러한 균주로부터 독소 유전자를 제거하는 것이다.
이종 항원을 암호화하는 DNA는 생체 내에서 작용할 수 있는 프로모터로부터 발현된다. 살모넬라에서 잘 작용하는 것으로 알려진 두 개의 프로모터는 nirB 프로모터(참조문헌 19,20)와 htrA 프로모터(참조문헌 20)이다. ETEC 정착인자의 발현을 위하여는 정상(wild-type) 프로모터를 사용할 수 있다.
이종 항원 DNA에 프로모터 DNA가 작동할 수 있도록 연결시킨 재조합 DNA를 작제하여 약독화된 박테리아에 도입시키는 과정은 통상의 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 재조합 DNA에 선별 표지(selection marker)를 포함시킴으로써, 재조합 DNA를 도입한 박테리아(transformant)를 선별할 수 있다. 재조합 DNA를 가지고 있는 박테리아는 실험실에서 증식시켜 숙주에 투여하는 백신형태로 조제할 수 있다.
백신의 조제
약독화된 박테리아를 이용하여 백신을 제조하는 이미 알려진 기술을 이용하여 백신을 제조할 수 있다. 백신은 경구 투여의 형태가 편리한데, 예를 들어 동결건조하여 캡슐화한 형태가 있다. 이러한 캡슐은 유드라게이트(Eudragate) "S"(등록 상표), 유드라게이트 "L"(등록 상표), 셀룰로즈 아세테이트(cellulose acetate), 셀룰로즈 프탈레이트(cellulose phthalate) 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로즈(hydroxypropylmethyl cellulose) 등으로 이루어진 장용제피(enteric coating)의 형태로 제공된다. 다른 방법으로는, 동결건조된 물질을 현탁액 등으로 재구성하여 투여할 수 있다. 재구성은 박테리아의 생존율을 높히도록 적절한 pH의 완충용액을 이용하여 편리하게 할 수 있다. 약독화된 박테리아와 백신을 위산(gastric acidity)으로부터 보호하기 위하여, 백신을 투여하기 전에 중탄산염나트륨(sodium bicarbonate) 제재를 투여하는 것이 좋다. 다른 방법으로는, 백신을 비강내 또는 근육내 투여 등의 비경구 투여용으로 제조할 수 있다.
본 백신은 포유류, 특히 사람뿐만 아니라, 동물 숙주의 예방 접종에도 이용될 수 있다. 미생물, 특히 병원성 미생물에 의한 감염은 본 발명에 따라 제조한 백신을 유효량 만큼 투여함으로써 예방할 수 있다. 사용되는 투여량은 전적으로 의사의 판단에 따르지만, 숙주의 크기와 몸무게 그리고 백신이 조제된 종류 등의 여러 가지 요인에 따라 다르다. 그러나, 70 kg의 성인이라면 경구 투여할 경우 한번에 약 107내지 1011개의 박테리아가 적당하다.
실시예 1: 본 발명에 의한 균주의 제작 및 특성규명
결실 돌연변이 구상 및 pCVD△AroC, pCVD△ompC 및 pCVD △ompF 플라스미드의 제작
결실은 대상 유전자의 전체 오픈 리딩 프레임을 제거하도록 고안되었다. 대장균의 게놈을 주형으로 사용하여, 대상 오픈 리딩 프레임을 플랭킹(flanking)하는 500 내지 600 염기쌍의 DNA 단편을 증폭시킬 수 있도록 프라이머를 고안하였다(참조: 표 1의 프라이머 서열). 결실 주변의 야생형 서열과 결실후 예상되는 서열을 표 2에 나타내었다.
각각의 유전자에 대하여 서로 다른 두 종류의 제한효소 자리를 스플라이스 부위(splice region)에 도입하였다(참조: 표 2). 이들을 결실 클론의 확인에 사용하였다. PCR절편의 어느 한 쪽 프라이머를 pCVD442 다중 클로닝 자리에 절편을 클로닝하기 위해 사용하는 독특한 제한효소 위치에 도입하였다(참조: 도 3).
PCR 산물은 퀴아젠(Qiagen) 젤 추출 키트를 사용하여 순수분리하였고, 관련 제한효소로 자살 플라스미드(suicide plasmid)인 pCVD442(22)를 절단하고 알칼라인 포스파타제를 처리하여 자가연결(self ligation)을 하지 못하도록 준비된 플라스미드에 연결(ligation)하기 전에, 동일한 제한효소로 PCR산물을 절단하였다(참조: 도 3). 연결 믹스(ligation mix)로 SY327λpir 을 형질전환시켰고, L-암피실린(100 ㎍/㎖)배지에 도말하였다. 암피실린 저항성 형질 전환체로부터의 플라스미드를 이용하여 제한효소 절단의 방법으로 결실 카세트(deletion cassette)의 존재를 조사하였다. 다음의 플라스미드가 제작되었다:
pCVD△AroC
pCVD△ompC
pCVD△ompF
전기 자살 플라스미드는 pir 유전자를 갖는 세포에서만 복제할 수 있다. pir이 없는 균주에 도입될 경우, pCVD442는 복제할 수 없다. 전기 플라스미드에 의해 부여된 암피실린 저항성은 그 플라스미드가 단일 상동 조합에 의해 염색체에 삽입될 때만이 유지될 수 있다. 전기 플라스미드는 또한, 자당 존재하에 그람음성 세균에게 있어 독성이 있는 레벤 수크라제(leben sucrase)를 암호화하는 sacB 유전자를 갖고 있다. 이는 자살 플라스미드가 제거되는 두번째 조합을 거친 클론을 선별하는데 사용될 수 있다. 그러한 세포는 자당에는 저항성이 있지만, 암피실린에는 민감하다.
△AroC△ompC△ompF 균주의 제작 및 특성 규명
본 섹션은 △AroC△ompC△ompF 균주를 제작하기까지의 과정을 요약하고 있고, "ETEC" 라 함은 E1392/75/2A 또는 그의 파생체를 특별하게 일컫는다.
△AroC△ompC△ompF 결실은 다음과 같은 순서로 E1392/75/2A에 도입되었다:
△AroC-△AroC△ompC-△AroC△ompC△ompF
ETEC△AroC의 제작
(1) 원종(original stock)으로부터 E1392/75/2A를 L-한천배지에 도말하였다.
(2) 전기 세포로부터 일렉트로포레이션(electroporation)용 컴피턴트(competent) 세포를 준비하였고, 100㎕씩 분취하여 동결하였다.
(3) SY327λpir 세포로부터 퀴아젠 퀴아필터 미디프렙(Quiagen Quiafilter midiprep)을 이용하여 pCVD△AroC를 순수분리하였고, 에탄올 침전법을 이용하여 10배 농축하였다. pCVD△AroC의 제작은 상기에 기술되어 있다.
(4) 5㎕의 농축된 플라스미드는 100㎕의 해동된 세포와 혼합하였고, 전기적으로 형질전환시켰다. 형질전환한 세포 전체를 L-암피실린 고체배지(50㎍/㎖)에 도말한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
(5) 암피실린 저항성 단일 콜로니가 자랐다.
(6) 전기 콜로니는 L-암피실린 고체배지상에 스트리킹(streaking)하였고, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다("merodiploid plate").
(7) aroC 유전자에 특이적인 TT19 및 TT20의 프라이머와 전기 고체배지에서 수득한 콜로니를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 야생형 aroC 유전자 및 △aroC 유전자의 크기에 해당하는 두 밴드가 증폭됨을 알 수 있었다. 전기 프라이머의 염기서열을 표 1에서 보여주고 있다.
(8) 전기 고체배지상에서 수득한 한 콜로니를 a) L-암피실린 고체배지(100㎍/㎖) 및 b) L-암피실린 액체배지(100㎍/㎖)에서 7시간 동안 배양하였다. 전기 L-암피실린 배지상에서 증식한 콜로니를 소량 분취하여 보존하였다.
(9) L-액체배지를 연속적으로 희석하여 다음의 배지에서 배양하였다:
a) 무염 L-한천배지
b) 무염 L-한천배지 + 5% 자당.
전기 배지는 30℃에서 하룻밤 동안 배양되었다.
(10) 콜로니 수를 세었을 때, L-한천배지 + 5% 자당의 경우보다 L-한천배지에서 배양하였을 경우의 콜로니수가 104만큼 더 많았으므로, 자당 선택이 제대로 작동함을 알 수 있었다.
(11) 자당 저항성 콜로니를 △aroC의 존재를 PCR을 통해 확인하였다. 확인을 위해 선택된 콜로니는 우선 L-한천배지에 옮겨 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, 다음의 테스트까지 4℃에 보관하였다.
(12) 테스트된 90개의 콜로니중 50% 이상이 △aroC만을 갖고 있었다.
(13) 전기 콜로니를 다음의 배지상에서 성장 정도를 시험하였다:
a) M-9 최소 고체배지
b) M-9 최소 배지 + 아로믹스(Aromix) 고체배지
c) L-암피실린 배지(100㎍/㎖)
△aroC 콜로니는 아로믹스가 없는 최소배지 또는 L-암피실린 배지상에서는 자라지 않아야 한다.
아로믹스는 다음과 같은 방향성 화합물의 혼합물이다:
물질 최종 농도 (% w/v)
페닐알라닌 0.004
트립토판 0.004
티로신 0.004
p-아미노벤조산 0.001
디히드록시벤조산 0.001
이러한 화합물은 야생형 세균에서 합성되나, aroC가 돌연변이되면 그들의 합성을 막는다.
(15) 3개의 콜로니(1, 2, 3 번)을 MGR169 및 MGR170의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하므로써, CS1 주요 필린 단백질의 존재를 확인하였다. 그 결과, 3가지 콜로니 모두가 예상되는 크기(700bp)의 PCR산물을 나타내었다. 전기 프라이머의 염기서열을 표 1에서 보여주고 있다.
(16) 콜로니 1, 2, 및 3번을 원래의 배지에서 새로운 L-고체배지상으로 옮기고 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 전기 배지에서 배양한 세포는 보관용 튜브에 접종하는데 사용되었다.
(17) 보관용 튜브에 저장된 콜로니 1번은 그 이후의 다른 실험에 사용되었다.
(18) 균주의 영구보관을 위하여 보관용 튜브의 균주를 1㎖의 L-액체배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 진탕배양하였고, 동결건조에 사용될 경사배지(agar slope)를 만드는데 사용하였다. E1392/75/2A△AroC 의 동결건조 원종(stock)은 PTL004라 명명되었다. 20㎖의 L-액체배지를 1㎖ 배양액의 나머지에 첨가하여 30℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 전기 배양한 배양액을 1㎖씩 3개의 바이알에 옮기고, 이를 액체 질소에서 보관하였다.
ETEC△AroC△Ompr 균주의 제작
1) 일렉트로포레이션을 위한 pCVD△OmpC 플라스미드 DNA의 준비:
pCVD△OmpC를 갖는 SY327λpir 콜로니를 100㎖의 L-암피실린 배지(100 ㎍/㎖)에서 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, 2가지의 퀴아젠 퀴아필 터 미디프렙(Quiagen Quiafilter midiprep)을 이용하여 플라스미드 DNA를 순수분리하였다. 전기 DNA는 에탄올 침전으로 더욱 농축하였 고, pCVD△OmpC 의 제작은 상기에서 기술되었다.
2) 일렉트로포레이션용 컴피턴트 세포의 준비:
전기 섹션의 17단계에서 제작된 보관용 튜브로부터 ETEC△AroC 세포를 L-고체배지상에 스트리킹하고, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하여 컴피턴 트 세포 준비를 위한 접종까지, 그러나 1주일 이상을 넘지 않도록 4℃에서 보관하였다.
3) 5㎕의 농축된 pCVD△OmpC DNA를 이용하여 ETEC△AroC 세포를 전기적으로 형질전환시켰고, 형질전환한 세포를 단일 L-암피실린 배지(50㎍/㎖), 37℃ 조건에서 하룻밤 동안 배양하였다.
4) 17개의 암피실린 저항성 콜로니(잠정적인 ETEC△AroC/pCVD△OmpC merodiploid)를 수득하였다.
5) 전기 콜로니를 하나의 마스터 L-암피실린 배지에 스팟팅(spotting)하여 TT7/TT8 프라이머를 이용한 PCR에서 주형으로 사용하였다. 전기 마스터 배지는 상온에서 1주일 동안 배양되었다. 사용한 프라이머의 염기서열은 표 1에 나타나 있다.
6) 하나의 단일 콜로니(7번)은 △ompC 유전자를 가졌다.
7) 전기 콜로니를 L-액체배지에서 5시간 동안 배양하였다.
8) 전기 L-액체배지 배양액을 연속적으로 희석하여, 다음의 배지에서 배양하였다:
a) 무염 L-한천배지
b) 무염 L-한천배지 + 5% 자당
전기 배지를 30℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
9) 콜로니 수를 세었을 때, L-한천배지 + 5% 자당의 경우보다 L-한천배지에서 배양하였을 경우의 콜로니수가 104만큼 더 많았으므로, 자당 선택이 제대로 작동함을 알 수 있었다.
10) 45개의 자당 저항성 콜로니를 TT7/TT8 프라이머를 이용하여 △ompC 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. 9개의 콜로니는 △ompC 를 보유하고 있었으나, 대부분은 야생형 ompC 유전자를 보유하고 있었다. 전기 프라이머의 염기서열은 표 1에 나타나 있다.
11) 잠정적인 ETEC△AroC△OmpC 콜로니의 특성을 좀 더 규명하기 위해, 1㎖ 의 L-액체 배지에 배양한 다음, 다음의 고체배지에 접종하였다:
a) L-한천배지 + L-암피실린 (100㎍/㎖)
b) L-한천배지
c) L-한천배지 + 5% 자당
△OmpC 균주는 자당에는 저항성이 있으나, 암피실린에는 민감해야 한다.
12) 오직 한 콜로니(1번)만이 암피실린에는 민감하고 자당에는 저항성이 있었다.
13) 콜로니 1번은 TT19/TT20, TT7/TT8 및 MGR169/170의 프라이머를 사용하여 △aroC, △ompC 및 CS1 유전자의 존재를 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다. 전기 프라이머의 염기서열은 표 1에 나타나 있다.
14) 콜로니 1번은 △aroC, △ompC 및 CS1 유전자 각각에 대해 예상되는 크기의 밴드를 나타내었다.
15) 전기 콜로니는 소량으로 분취되어 보관되었다.
16) 균주의 영구보관을 위하여 보관용 튜브의 균주를 1㎖의 L-액체배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 진탕배양하였고, 동결건조에 사용될 경사배지(agar slope)를 만드는데 사용하였다. E1392/75/2A△AroC△OmpC의 동결건조 원종(stock)은 PTL008이라 명명되었다. 20㎖의 L-액체배지를 1㎖ 배양액의 나머지에 첨가하여 30℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 전기 배양한 배양액을 1㎖씩 3개의 바이알에 옮기고 이를 액체 질소에서 보관하였다.
ETEC△AroC△OmpC△OmpF의 제작
pCVD△OmpF를 E1392/75/2A△AroC△OmpC에 도입하기 위해 접합의 방법을 사용하였다.
1) 접합공여 세포인 SM10λpir을 pCVD△OmpF로 형질전환하였고, pCVD△OmpF 플라스미드의 제작은 전기에서 기술하였다.
2) ETEC△AroC△OmpC 세포는 SM10λpir/pCVD△OmpF 세포와 접합되었다. pCVD442 플라스미드는 RP4 전이 유전자를 갖고 있는 공여 균주(예, SM10λpir)로부터 수혜균주(예, ETEC)로 플라스미드가 전이되도록 하는 전이 오리진(transfer origin)을 포함한다. ETEC△AroC△OmpC 세포 및 pCVD△OmpF 를 갖는 대장균 SM10λpir을 L-한천배지에 약 10 ㎠의 면적을 덮도록 같이 도말하였다. 플레이트는 37℃에서 20 시간 동안 배양하였고 4㎖의 L-액체배지로 씻어내어 그 현탁액을 20㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 300㎍/㎖ 암피실린이 들어있는 멕콘케이(McConkey) 한천배지(Difco)에 도말하였다. 플레이트는 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, 그 결과 형성된 콜로니는 적당한 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 merodiploidy에 대해 확인하였다.
3) 잠정적인 ETEC 접합체는 확인되었는데, 멕콘케이 한천배지(Difco)로부터 수득한 10개의 콜로니를 L-암피실린 고체배지(100㎍/㎖)상에서 하룻밤 동안 배양하였다. △ompC유전자의 존재여부는 TT1/TT2 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 확인하였고, 전기 프라이머의 염기서열은 표 1에 나타나 있다.
4) 전기 콜로니는 L-액체배지에서 5시간 동안 배양하였다.
5) L-액체배지를 연속적으로 희석하여 다음의 배지에서 배양하였다:
a) 무염 L-한천배지
b) 무염 L-한천배지 + 5% 자당.
전기 배지는 30℃에서 하룻밤 동안 배양되었다.
6) 콜로니 수를 세었을 때, L-한천배지 + 5% 자당의 경우보다 L-한천배지에서 배양하였을 경우의 콜로니수가 105만큼 더 많았으므로, 자당 선택이 제대로 작동함을 알 수 있었다.
7) 자당 저항성 콜로니를 TT1/TT2 프라이머를 사용하여 △ompF에 대하여 PCR을 통해 확인하였고, 전기 프라이머의 염기서열은 표 1에 나타나 있다. 확인을 위해 선택된 콜로니를 우선 L-한천배지에 옮겨 하룻밤 동안 배양하였고, 47개의 콜로니중 3개가 야생형 ompF 유전자가 아닌 △ompF를 보유하고 있었다.
8) 잠정적인 ETEC△AroC△OmpC△OmpF 콜로니의 특성을 좀 더 규명하기 위해, 다음의 고체배지에 접종하였다:
a) L-한천배지 + 암피실린 (100㎍/㎖)
b) L-한천배지
c) L-한천배지 + 5% 자당
△OmpC 균주는 자당에는 저항성이 있으나, 암피실린에는 민감해야 한다.
9) 3가지 △OmpF 콜로니 모두 암피실린에는 민감하고 자당에는 저항성이 있었다.
10) 전기 콜로니는 소량으로 분취되어 보관되었고, 그중 한 콜로니를 마스터 원종(master stock)으로 선택하였다.
11) 균주의 영구보관을 위하여 보관용 튜브의 균주를 1㎖의 L-액체배지에 접종하여 37℃에서 4시간 동안 진탕배양하였고, 동결건조에 사용될 경사배지(agar slope)를 만드는데 사용하였다. E1392/75/2A△AroC△OmpC△OmpF의 동결건조 원종(stock)은 PTL003이라 명명되었다. 20㎖의 L-액체배지를 1㎖ 배양액의 나머지에 첨가하여 30℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 전기 배양한 배양액을 1㎖씩 3개의 바이알에 옮기고, 이를 액체 질소에서 보관하였다.
E1392/75/2A△AroC△OmpC△OmpF 의 특성 규명
1) 생장 요건:
전기 섹션의 10 단계에서 수득한 마스터 원종으로부터 세포를 취하여 L-한천배지에 도말하였다. 이와 동시에, 서던 블랏팅에 사용될 염색체 DNA를 수득하기 위해 8㎖의 액체배지에도 접종하였다. 전기 고체 및 액체배지를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 전기 고체배지에서 수득한 세포는 다음의 배지에 접종되었고, 이를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
배지 생장여부
L-암피실린 배지 생장하지 못함
M9 최소배지 생장하지 못함
M9 최소배지 + 아로믹스(Aromix) 생장
M9 + 설파티아졸 (100㎍/㎖) 생장하지 못함
M9 + 설파티아졸 (100㎍/㎖) + 아로믹스 생장
L-한천배지 + 50㎍/㎖ 스트렙토마이신 생장
L-한천배지 + 5% 자당 생장
예상된 바와 같이, 세포는 암피실린에 민감하였고, 자당, 스트렙토마이신 및 설파티아졸에는 저항성이 있었으며, 최소배지에서 성장하기 위해서는 아로믹스가 요구되었다.
2) PTL003의 LPS분석:
a) PTL003의 동결건조된 바이알을 파쇄하여 L-액체배지에 부유시켜서 생 장의 목적으로 L-한천배지에 접종하였다. 약간의 세포를 긁어 모아 소저장소(microbank)에 보관하였다.
b) 보다 많은 세포를 모아 LPS 분석하였고, PTL003과 원래의 E1392/75/2A 균주의 LPS 프로파일 사이에는 별차이가 없었다.
3) PCR을 통한 결실의 확인:
a) 2a에서 만들어진 고체 배지로부터 세포를 모아 L-한천배지에 접종하여 하룻밤 동안 배양하였다.
b) 새로 자란 세포 및 다음의 유전자를 플랭킹하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다: aroC, htrA, ompC, ompF, ompR.
c) PTL003은 aroC, ompC 및 ompF 유전자에서는 결실이 일어났고, htrA 또 는 ompR 에서는 결실이 일어나지 않았음을 확인할 수 있었다.
4) PTL003의 외막 단백질 분석:
PTL010(E1392/75/2A) 균주 및, 결실 돌연변이 균주인 PTL002 및 PTL003에서 외막 단백질 분획을 준비하였다. 단일 ompF 결실을 갖는 균주 및, aroC 및 ompC 결실 모두를 갖는 균주에 대해서도 분석하였다. 전기 균주를 저삼투압 조건하(무염 L-액체배지) 및 고삼투압(무염 L-액체배지 + 15% 자당)조건하에서 생장시켰다. OmpF 단백질 산물은 정상적으로 저삼투압 조건에서 발현되는 반면, OmpC 단백질은 고삼투압 조건에서 발현된다. 전기 두 단백질은 비슷한 전기영동 이동을 나타낸다. 고삼투압 및 저삼투압 조건에서, PTL003 균주는 야생형 E1392/75/2A 또는, △AroC△OmpC 또는 △OmpF 결실 돌연변이 균주와 비교하였을 시, OmpC 및 OmpF 단백질 모두에 대해 발현하지 않았으며, 그 결과는 도 4에 나타나 있다.
5) CFA 한천 배지상에서의 CS1 및 CS3 필린(pilin)의 발현:
결실 균주에서 CS1 또는 CS3의 발현을 조사하였다. CFA 한천배지에서 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 동수(2 A600nm단위)의 PTL010, PTL001, PTL002 및 PTL003 균주를 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였고, CS1 또는 CS3 대한 단일 특이적인 다클론성 항체로 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 4종류의 모든 균주에서 CS1 및 CS3 필린 단백질이 동일하게 잘 발현됨을 알 수 있었다(참조: 도 5).
대조구로서, E1392/75/2A 균주의 CFAII-음성 파생 균주를 제작하였다. 이는 ETEC균주인 E1392/75-2A로부터 CS를 암호화하는 플라스미드의 특이적인 치료(specific curing)를 통해 수행할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 CSA01 및 CSA02의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행해서 cooB 유전자로부터 짧은 DNA 절편을 수득하고, 이를 PCR 산물을 클로닝하도록 고안된 pGEM-T easy 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 전기 절편은 SalI 및 SphI 제한효소를 이용하여 pCVD442벡터에 서브클로닝하였다. pCVD442-cooB 파생물을 SM10λpir을 이용한 접합을 통하여 ETEC균주인 E1392/75/2A에 도입하였다. 암피실린 저항성의 접합체는 pCVD442-cooB 파생물과 cooB를 갖는 플라스미드 사이의 융합에 의해 기인되었을 가능성이 크다. 그러한 접합체를 pCVD442의 sacB 유전자 손실에 의해 선택하기 위하여 5% 자당이 보충된 L-한천배지 상에서 배양하였다. 그 결과 생성된 콜로니는 암피실린 저항성에 대해서 시험되었고, CSA01 및 CSA02의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이러한 PCR에 양성 대조구로서 3개의 E1392/75/2A 콜로니를 포함시켰다. PCR에서 아무 산물을 생성시키지 않는 자당 저항성의 콜로니를 좀 더 순수하게 수득할 목적으로 5% 자당이 보충된 새 L-한천배지상에서 배양하였다. 이들을 약 37℃에서 약 16시간 동안 L-액체배지에서 배양하였고, -70℃에서 보관하였다. CS1를 암호화하는 플라스미드의 손실은 한천 젤 전기영동을 통하여 파생균주의 플라스미드 프로파일 분석으로 확인하였다. 두 종류의 파생균주가 CS1-음성이나, CS3에 대해서는 양성인 것으로 확인되었다.
6) PTL003의 서던 블랏팅(Southern Blotting) 분석:
결실 돌연변이의 구조: 저장된 원종(stock)으로부터 생장시킨 3가지의 결실 돌연변이체를 배양하여 전체 DNA를 추출하고 EcoRV 제한효소로 절단하여, 절단한 DNA를 펄스 장 한천젤 전기영동(pulsed field agrose gel electrophoresis)하였다. DNA는 젤로부터 Hybond N+ 나일론 막으로 옮겨졌고, 표준적인 방법에 따라서 적당한 탐침을 이용하여 하이브리디제이션시켰다. 그 결과(참조: 도 6), 돌연변이체에서의 하이브리디제이션한 DNA 절편이 야생형보다 짧은 것을 알 수 있었고, 이는 결실 돌연변이를 갖고 있음을 제시하고 있다.
대장균 E1392/75-2A에서의 열안정(ST) 및 열민감(LT) 독소 유전자의 부재 확인: 이를 위해, ST 및 LT 유전자가 E1392/75-2A로부터의 전체 DNA에 대한 탐침으로서 사용되었다. 독소 양성인 ETEC균주 E1393/75로부터의 전체 DNA를 양성 대조구로서 포함시키는 반면, 또 다른 대장균인 JM109의 DNA를 음성 대조구로서 사용하였다. 하이브리디제이션된 막은 최대의 시그널을 얻기 위해 1시간 동안 Hyperfilm-ECL하에 방치하였다. 탐침은 E1392/75-2A로부터 추출한 DNA를 주형으로 하고, ST에 대한 프라이머로서 EST01 및 EST02, LT-AB에 대한 프라이머로서는 LT-R1 및 LT-03을 사용하여 PCR을 통해 준비하였다. LT-AB 탐침, ST 탐침중 어느 것을 사용한 경우도 양성 대조구에서 매우 강한 시그널을 얻었으며, 하이브리디제이션상의 유의적인 차이는 없었다.
돌연변이 염색체상의 pCVD442 서열부재의 확인: 플라스미드 pCVD442를 표지하여 EcoRV로 절단한 PTL001, PTL002 및 PTL003 돌연변이체의 전체 DNA와 하이브리디제이션시키고, ETEC균주 E1393/75로부터의 전체 DNA를 양성 대조구로서 포함시켰다. 복잡한 패턴의 하이브리디제이션된 DNA절편을 수득할 수 있었다. 그러나, 야생형에서 얻은 패턴이나 돌연변이체에서 얻은 패턴상에서 서로 유의적인 차이가 없었고, 이는 돌연변이체의 게놈상에 pCVD442 뉴클레오티드 서열이 전혀 남아있지 않음을 제시한 것이다. 복잡한 패턴의 하이브리다제이션 절편은 아마도 pCVD442 탐침의 E1393/75 균주 및 돌연변이 파생균주의 플라스미드 DNA의 요소와의 하이브리디제이션에 기인하는 것 같다.
PCR 프라이머
이름 대상 용도 서열(5'-3')
TT1 ompF 프라이머 A ATC TGT TTG TTG AGC TCA GCA ATC TAT TTG CAA CC
TT2 ompF 프라이머 B TTT TTT GCC AGC ATG CCG GCA GCC ACG CGT AGT G
TT3 ompF 프라이머 C CTC GAG GCT TAG CTC TAT TTA TTA CCC TCA TGG
TT4 ompF 프라이머 D GAG CTA AGC CTC GAG TAA TAG CAC ACC TCT TTG
TT7 ompC 프라이머 A TTG CTG GAA AGT CGA CGG ATG TTA ATT ATT TGT G
TT8 ompC 프라이머 B GGC CAA AGC CGA GCT CAT TCA CCA GCG GCC CGA CG
TT9 ompC 프라이머 C GCT AAG CCT CGA GTA ATC TCG ATT GAT ATC CG
TT10 ompC 프라이머 D CTC GAG GCT TAG CGT TAT TAA CCC TCT GTT
TT19 aroC 프라이머 A CCG CGC TCG CTC TAG AGT GAA CTG ATC AAC AAT A
TT20 aroC 프라이머 B ATG CGC GCG AGA GCT CAA CCA GCG TCG CAC TTT G
TT21 aroC 프라이머 C CTC GAG GCA TGC TGA ATA AAA CCG CGA TTG
TT22 aroC 프라이머 D GCA TGC CCT CGA GGG CTCC GTT ATT GTT GTG
MGR169 CS1 CS1 서열에 결합 TGA TTC CCT TTG TTG CGA AGG CGA A
MGR170 CS1 CS1 서열에 결합 ATT AAG ATA CCC AAG TAA TAC TCA A
LT-R1 LT-AB 본문 참조 GCT TTT AAA GGA TCC TAG TT
LT-03 LT-AB 본문 참조 GGT TAT CTT TCC GGA TTG TC
EST01 ST 본문 참조 CAT GTT CCG GAG GTA ATA TGA A
EST02 ST 본문 참조 AGT TCC CTT TAT ATT ATT AAT A
CSA01 CS1 본문 참조 TGG AGT TTA TAT GAA ACT AA
CSA02 CS1 본문 참조 TGA CTT AGT CAG GAT AAT TG
CS3-01 CS3 본문 참조 ATA CTT ATT AAT AGG TCT TT
CS3-02 CS3 본문 참조 TTG TCG AAG TAA TTG TTA TA
대상 유전자 pCVD442에 클로닝할 제한효소 자리 스크린용으로 도입된 제한효소 자리
Site 1 Site 2 Site 3 Site 4
aroC XbaI SacI XhoI SphI
htrA SalI SphI XhoI XbaI
ompC SalI SacI BlpI XhoI
ompF SacI SphI BlpI XhoI
ompR SalI SacI BlpI SphI
실시예 2: 지원자를 대상으로 한 약독화된 백신인 장관독소성 대장균(△aroC/△ompC/△ompF)의 안전성(safety) 및 면역원성(immunogenicity)
본 시험은 상술한 후보 백신인 장관독소성 대장균의 약독화된 생균 백신, 일명 △aroC/△ompC/△ompF PTL003을 평가하기 위하여 고안되었다.
백신 균주 원종(vaccine seed lot)의 준비
박테리아 균주를 정제 및 동정하기 위하여, 맥콘케이 한천배지(MacConkey agar)상에 도말하였으며, 5개의 집락을 LB배지(Luria broth) 200㎖을 포함하는 플라스크에 접종시켰다. 37℃에서 8시간 동안 배양시킨 후에, 멸균된 글리세롤 30㎖을 배양배지에 첨가하고 바이알당 1㎖씩 분주한다. 전기 100개의 바이알을 -70℃에서 냉동시켰다. 이러한 바이알은 백신 균주 원종(seed lot)를 포함하도록 준비되었다.
균주 원종의 순도는 10개의 바이알을 무작위로 취하여 결정하였으며, 순도 결정 및 진균류에 대한 감염을 테스트하였다. 3개의 바이알을 추가로 취하여 배양배지의 연속적인 희석에 의한 표준 플레이트 계수법(standard plate count methods with serial dilution)을 사용함으로써 배지내의 박테리아의 수를 산정하였다.
백신의 제조
백신은 각각의 예방접종 직전에 새로 제조되었으며, 접종 준비에 필요한 모든 단계는 안전실에서 수행되었다. 예방접종 전날, 멸균된 면봉을 사용하여 루리아 한천배지의 표면에 0.2㎖의 박테리아를 도말하여 박테리아 평판을 준비하였다. 동일한 배양배지는 순도를 위하여 맥콘케이 및 루리아 한천배지 플레이트에 도말되었다. 한천배지 플레이트를 개봉저항 표지기(tamper-resistant indicator)가 부착된 밀봉된 용기내에 37℃에서 18시간 동안 배양하여, 플레이트가 배양되는 동안 개봉되지 않게 하였다. 배양 후, 박테리아의 평판을 멸규된 인산염 완충액(PBS) 5㎖로 수득하였으며, 부유액(suspension)의 흡광도를 측정하였다. 이러한 부유액은 원하는 투여량에 상응하도록 적당 부피로 30㎖의 중탄산염 완충액(bicarbonate buffer)이 든 1회 투여량의 병(unit dose bottle)에 취한 다음, 지원자에게 투여되었다. 여분의 백신투여량을 준비하고 실험실에 비치하였고, 지원자를 예방접종한 후 즉시, 백신의 각각 투여량내의 박테리아의 실제 수를 10배 희석에 의한 표준 집락 산정 방법에 의하여 확인하였다.
지원자에게 투여될 백신을 준비할 때와 동일한 방법으로 준비 및 배양된 평판배지를 사용하여 예비시험을 하는 과정에서 박테리아를 희석하는 절차를 확립하였다. 부유액을 제조한 다음, 생존가능한 박테리아의 수를 연속희석법에 의한 집락산정으로 계수하였고, 측정된 흡광도와 연관시켰다. 이러한 예비시험을 근거로, 백신 투여량을 결정하기 위하여 박테리아의 정확한 희석배율을 결정하고 평가할 수 있는 표준 절차를 확정지었다.
완충액의 준비
중탄산염나트륨(sodium bicarbonate) 수용액으로 구성된 완충액을 사용하였다. 백신의 1회 투여량에 사용될 중탄산염나트륨 2g을 포함하는 탈이온화된 물 150㎖을 준비하고 여과멸균하였다. 완충액의 30㎖을 50㎖ 투여량의 멸균된 바이알에 취하고, 박테리아 백신의 1회 투여량을 전기 바이알에 첨가하였다. 남아있는 120㎖의 완충액은 별도의 멸균된 유리병에 담았다. 예방접종때에, 지원자들에게 1차적으로 120㎖의 완충액이 투여되었으며, 1분후에 백신을 포함하는 완충액 30㎖이 투여되었다.
예방접종 일정
지원자들의 그룹에 대하여 투여량을 증가시키면서 테스트하였다. 첫번째 지원자 그룹에게는 대략 5×107박테리아의 투여량이, 두번째 지원자 그룹에게는 대략 5×109박테리아의 투여량이, 세번째 지원자 그룹에게는 대략 5×108박테리아의 투여량이 투여되었다.
지원자들에게 4일째를 시작으로, 1일 2회씩 3일동안 시프로플록사신(Ciprofloxacin) 500㎎를 투여하였다. 안전성 시험을 위하여 혈액학적 및 화학적인 시험을 수행하였고, 항체 측정을 위해 혈청을 채취하였다.
9일째 및 14일째 되는 날, 지원자들은 병원에 외래 방문하여 병력에 대해 조사되었으며, 혈청학적 분석을 위하여 혈액 시료가 채취되었다. 예방접종 전날과 예방접종이후 9일째 및 14일째 되는 날 3회에 걸쳐서 혈청학적 분석을 위하여 총 40㎖의 혈액이 수집되었다.
실험실 분석 과정
지원자들이 병원에 있는 동안, 매일 2회의 분변 시료가 채취되었다. 정성적인 배양을 위하여, 분변용 면봉을 카리-블레아 이동배지(Cary Blair transport media)에 취하여 실험실로 이동시킨 다음, 즉시 맥콘케이 한천배지 및 백신균주의 선택에 필요한 항생제를 포함하고 있는 맥콘케이 한천배지(MacConkey agar)에 접종하였다. 백신균주에 선택적인 항혈청을 사용하여 5개의 집락이 응집됨을 확인하였다. 정량적인 배양을 목적으로, 하루 중 첫번째 취한 분변시료의 무게를 재서 PBS에 연속적인 10배 희석으로 10-4까지 희석시키고, 각각의 희석액 100㎕를 항생제가 포함된 맥콘케이 한천배지에 도말하였다. 백신균주라고 의심되는 집락을 항-O 혈청을 사용한 응집반응에 의하여 확인하였다.
혈청을 채취하고, 이를 ELISA에 의한 CFA Ⅱ 항원에 대한 항체의 분석, 및 백신균주에 대한 박테리아 항체의 분석을 위하여 보관하였다.
구연산염(citrate) 완충용액내에 채취된 전혈(whole blood)로부터 말초혈액 단핵구 세포를 분리하고 세척하였다. 전기 세포들은 RPMI 조직배양 배지내에서 ㎖ 당 107세포의 농도로 37℃에서 48시간동안 배양되었다. 48시간 이후에, 상층액을 냉동보관용 바이알(cryovial)에 옮긴 후 -20℃에서 보관하고, 이후에 ELISA에 의한 CFA Ⅱ에 대한 IgG 및 IgA 항체를 분석하기 위하여 사용되었다.
프로토콜 절차의 요약
일(day)(예방접종한 당일은 day 0) pre -1 0 1 2 3 4 5 6 9 14
회수/스크린닝 x
HCG(소변) x x
훈련/동의 x
원내 체류 x x x x x x x x
예방접종 x
외래 방문 x x x
분변 배양-양적배양 x x x x x x x x x x
분변 배양-질적배양 x x x x x x x x x x
혈청학적 분석 x x x
CBC/Chem 패널 x x
3일간 1일 2회500㎎ 시프로플록사신 x x x
결과:
6.8×107및 3.7×108cfu에 해당하는 박테리아 균주의 실제 투여량에서도 어떠한 증상은 나타나지 않았다. 4.7×109의 고투여량에서는 6명의 지원자 중 1명에서 설사가 일어났고, 2명은 경미하게 복부경련(abdominal cramp)이 발생하였다. 5×109cfu 투여량을 받은 모든 지원자에게서, 접종후 1일째부터 프로토콜에 의하여 예방접종이후 4일째 되는 날에 시프로플록사신을 투여하기 전까지, 박테리아 쉐딩(shedding)을 나타내었으며, 이러한 사실은 장내 집락형성이 효과적으로 일어남을 의미하며, 집락형성이 효과적으로 일어나는 것은 면역반응을 효율적으로 유도하는 잠재성을 갖고 있음을 제시해주는 것이다. 2가지 경우의 저투여량에서, 예방접종후 적어도 한 시점에서 모든 지원자로부터 백신 균주가 회수되었으나, 배출시간은 고투여량과 비교하였을 때 감소되었다.
특허출원하는 시점에서, 백신에 의하여 유도된 면역반응 분석이 완결되지는 못하였다. 그러나, 0일째 고투여량의 박테리아 백신을 투여받은 지원자로부터, 예방접종전, 예방접종 이후 7일째 및 10일째 되는 날에 분리된 PBMNC의 상층 배양액에서 IgA 항-CFA Ⅱ 반응을 분석하였다(참조: 도 7). 상층액은 정제된 CFA Ⅱ 항원으로 코팅된 분석 플레이트상에서 ELISA에 의하여 분석되었다. 7일째 및 10일째 되는 시료로부터 관찰된 흡광도 값은 예방접종전의 시료의 흡광도보다 현저히 상승됨을 알 수 있었는 바, 7일째 및 10일째 되는 날에 특이적인 IgA 면역반응이 유도됨을 확인할 수 있었다. 예상하는 바와 같이, 면역반응은 7일째에 절정에 도달하였으며 10일째에 감소되어, 초회항원의 자극을 받은(primed) IgA를 분비하는 B-세포가 혈액으로부터 장관련림프양조직(Gut Associated Lymphoid Tissue)의 점막효과기부위(mucosal effector site)로 회귀(homing)하는 사실과 일치하였다.
결론:
ETEC(△aroC/△ompC/△ompF)의 약독화된 생균 백신는 건강한 성인 지원자에게 면역관용(tolerance)이 잘 일어나며, 여행자의 설사를 예방하기 위하여 사용되는 경구용 백신의 용도와 같은 양상으로 장내에서 집락을 이룰 수 있음이 확인되었다. 아울러, 전기 약독화된 생균 백신는 특이적인 면역반응을 유발할 수 있음이 입증되었다.
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gtcgacgcgg tggatatctc tccagacgcg ctggcggttg ctgaacagaa catcgaagaa 60
cacggtctga tccacaacgt cattccgatt cgttccgatc tgttccgcga cttgccgaaa 120
gtgcagtacg acctgattgt cactaacccg ccgtatgtcg atgcgaagat atgtccgacc 180
tgccaaacaa taccgccacg agccggaact gggcctggca tctggcactg acggcctgaa 240
actgacgcgt cgcattctcg gtaacgcggc agattacctt gctgatgatg gcgtgttgat 300
ttgtgaagtc ggcaacagca tggtacatct tatggaacaa tatccggatg ttccgttcac 360
ctggctggag tttgataacg gcggcgatgg tgtgtttatg ctcaccaaag agcagcttat 420
tgccgcacga gaacatttcg cgatttataa agattaagta aacacgcaaa cacaacaata 480
acggagccgt g atg gct gga aac aca att gga caa ctc ttt cgc gta acc 530
Met Ala Gly Asn Thr Ile Gly Gln Leu Phe Arg Val Thr
1 5 10
acc ttc ggc gaa tcg cac ggg ctg gcg ctc ggc tgc atc gtc gat ggt 578
Thr Phe Gly Glu Ser His Gly Leu Ala Leu Gly Cys Ile Val Asp Gly
15 20 25
gtt ccg cca ggc att ccg ctg acg gaa gcg gac ctg caa cat gac ctc 626
Val Pro Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu Ala Asp Leu Gln His Asp Leu
30 35 40 45
gac cgt cgt cgc cct ggg aca tcg cgc tat acc acc cag cgc cgc gag 674
Asp Arg Arg Arg Pro Gly Thr Ser Arg Tyr Thr Thr Gln Arg Arg Glu
50 55 60
ccg gat cag gtc aaa att ctc tcc ggt gtt ttt gaa ggc gtt act acc 722
Pro Asp Gln Val Lys Ile Leu Ser Gly Val Phe Glu Gly Val Thr Thr
65 70 75
ggc acc agc att ggc ttg ttg atc gaa aac act gac cag cgc tct cag 770
Gly Thr Ser Ile Gly Leu Leu Ile Glu Asn Thr Asp Gln Arg Ser Gln
80 85 90
gat tac agt gcg att aag gac gtt ttc cgt cca ggc cat gcc gat tac 818
Asp Tyr Ser Ala Ile Lys Asp Val Phe Arg Pro Gly His Ala Asp Tyr
95 100 105
acc tac gaa caa aaa tac ggt ctg cgc gat tat cgc ggc ggt gga cgt 866
Thr Tyr Glu Gln Lys Tyr Gly Leu Arg Asp Tyr Arg Gly Gly Gly Arg
110 115 120 125
tct tcc gcc cgc gaa acc gcc atg cgc gtg gcg gca gga gct att gcc 914
Ser Ser Ala Arg Glu Thr Ala Met Arg Val Ala Ala Gly Ala Ile Ala
130 135 140
aaa aaa tat ctc gcc gag aaa ttt ggt att gaa atc cgt ggc tgc ctg 962
Lys Lys Tyr Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ile Arg Gly Cys Leu
145 150 155
acc cag atg ggc gac att ccg ctg gat atc aaa gac tgg tcg cag gtc 1010
Thr Gln Met Gly Asp Ile Pro Leu Asp Ile Lys Asp Trp Ser Gln Val
160 165 170
gag caa aat ccg ttt ttt tgc ccg gac ccc gac aaa atc gac gcg tta 1058
Glu Gln Asn Pro Phe Phe Cys Pro Asp Pro Asp Lys Ile Asp Ala Leu
175 180 185
gac gag ttg atg cgt gcg ctg aaa aaa gag ggc gac tcc atc ggc gct 1106
Asp Glu Leu Met Arg Ala Leu Lys Lys Glu Gly Asp Ser Ile Gly Ala
190 195 200 205
aaa gtc acc gtt gtt gcc agt ggc gtt cct gcc gga ctt ggc gag ccg 1154
Lys Val Thr Val Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Gly Leu Gly Glu Pro
210 215 220
gtc ttt gac cgc ctg gat gct gac atc gcc cat gcg ctg atg agc atc 1202
Val Phe Asp Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ala His Ala Leu Met Ser Ile
225 230 235
aac gcg gtg aaa ggc gtg gaa att ggc gac ggc ttt gac gtg gtg gcg 1250
Asn Ala Val Lys Gly Val Glu Ile Gly Asp Gly Phe Asp Val Val Ala
240 245 250
ctg cgc ggc agc cag aac cgc gat gaa atc acc aaa gac ggt ttc cag 1298
Leu Arg Gly Ser Gln Asn Arg Asp Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe Gln
255 260 265
agc aac cat gcg ggc ggc att ctc ggc ggt atc agc agc ggg cag caa 1346
Ser Asn His Ala Gly Gly Ile Leu Gly Gly Ile Ser Ser Gly Gln Gln
270 275 280 285
atc att gcc cat atg gcg ctg aaa ccg acc tcc agc att acc gtg ccg 1394
Ile Ile Ala His Met Ala Leu Lys Pro Thr Ser Ser Ile Thr Val Pro
290 295 300
ggt cgt acc att aac cgc ttt ggc gaa gaa gtt gag atg atc acc aaa 1442
Gly Arg Thr Ile Asn Arg Phe Gly Glu Glu Val Glu Met Ile Thr Lys
305 310 315
ggc cgt cac gat ccc tgt gtc ggg atc cgc gca gtg ccg atc gca gaa 1490
Gly Arg His Asp Pro Cys Val Gly Ile Arg Ala Val Pro Ile Ala Glu
320 325 330
gcg aat gct ggc gat cgt ttt aat gga tca cct gtt acg gca acg ggc 1538
Ala Asn Ala Gly Asp Arg Phe Asn Gly Ser Pro Val Thr Ala Thr Gly
335 340 345
gca aaa tgc cga tgt gaa gac tga tattccacgc tggtaaaaaa tgaataaaac 1592
Ala Lys Cys Arg Cys Glu Asp
350 355
cgcgattgcg ctgctggctc tgcttgccag tagcgccagc ctggcagcga cgccgtggca 1652
aaaaataacc caacctgtgc cgggtagcgc caaatcga 1690
〈210〉 2
〈211〉 356
〈212〉 PRT
〈213〉 Escherichia coli
〈400〉 2
Met Ala Gly Asn Thr Ile Gly Gln Leu Phe Arg Val Thr Thr Phe Gly
1 5 10 15
Glu Ser His Gly Leu Ala Leu Gly Cys Ile Val Asp Gly Val Pro Pro
20 25 30
Gly Ile Pro Leu Thr Glu Ala Asp Leu Gln His Asp Leu Asp Arg Arg
35 40 45
Arg Pro Gly Thr Ser Arg Tyr Thr Thr Gln Arg Arg Glu Pro Asp Gln
50 55 60
Val Lys Ile Leu Ser Gly Val Phe Glu Gly Val Thr Thr Gly Thr Ser
65 70 75 80
Ile Gly Leu Leu Ile Glu Asn Thr Asp Gln Arg Ser Gln Asp Tyr Ser
85 90 95
Ala Ile Lys Asp Val Phe Arg Pro Gly His Ala Asp Tyr Thr Tyr Glu
100 105 110
Gln Lys Tyr Gly Leu Arg Asp Tyr Arg Gly Gly Gly Arg Ser Ser Ala
115 120 125
Arg Glu Thr Ala Met Arg Val Ala Ala Gly Ala Ile Ala Lys Lys Tyr
130 135 140
Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ile Arg Gly Cys Leu Thr Gln Met
145 150 155 160
Gly Asp Ile Pro Leu Asp Ile Lys Asp Trp Ser Gln Val Glu Gln Asn
165 170 175
Pro Phe Phe Cys Pro Asp Pro Asp Lys Ile Asp Ala Leu Asp Glu Leu
180 185 190
Met Arg Ala Leu Lys Lys Glu Gly Asp Ser Ile Gly Ala Lys Val Thr
195 200 205
Val Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Gly Leu Gly Glu Pro Val Phe Asp
210 215 220
Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ala His Ala Leu Met Ser Ile Asn Ala Val
225 230 235 240
Lys Gly Val Glu Ile Gly Asp Gly Phe Asp Val Val Ala Leu Arg Gly
245 250 255
Ser Gln Asn Arg Asp Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe Gln Ser Asn His
260 265 270
Ala Gly Gly Ile Leu Gly Gly Ile Ser Ser Gly Gln Gln Ile Ile Ala
275 280 285
His Met Ala Leu Lys Pro Thr Ser Ser Ile Thr Val Pro Gly Arg Thr
290 295 300
Ile Asn Arg Phe Gly Glu Glu Val Glu Met Ile Thr Lys Gly Arg His
305 310 315 320
Asp Pro Cys Val Gly Ile Arg Ala Val Pro Ile Ala Glu Ala Asn Ala
325 330 335
Gly Asp Arg Phe Asn Gly Ser Pro Val Thr Ala Thr Gly Ala Lys Cys
340 345 350
Arg Cys Glu Asp
355
〈210〉 3
〈211〉 1713
〈212〉 DNA
〈213〉 Escherichia coli
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (491)..(1594)
〈400〉 3
gttaacaagc gttatagttt ttctgtggta gcacagaata atgaaaagtg tgtaaagaag 60
ggtaaaaaaa accgaatgcg aggcatccgg ttgaaatagg ggtaaacaga cattcagaaa 120
tgaatgacgg taataaataa agttaatgat gatagcggga gttattctag ttgcgagtga 180
aggttttgtt ttgacattca gtgctgtcaa atacttaaga ataagttatt gattttaacc 240
ttgaattatt attgcttgat gttaggtgct tatttcgcca ttccgcaata atcttaaaaa 300
gttcccttgc atttacattt tgaaacatct atagcgataa atgaaacatc ttaaaagttt 360
tagtatcata ttcgtgttgg attattctgc atttttgggg agaatggact tgccgactga 420
ttaatgaggg ttaatcagta tgcagtggca taaaaaagca aataaaggca tataacagag 480
ggttaataac atg aaa gtt aaa gta ctg tcc ctc ctg gtc cca gct ctg 529
Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu
1 5 10
ctg gta gca ggc gca gca aac gct gct gaa gtt tac aac aaa gac ggc 577
Leu Val Ala Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly
15 20 25
aac aaa tta gat ctg tac ggt aaa gta gac ggc ctg cac tat ttc tct 625
Asn Lys Leu Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser
30 35 40 45
gac aac aaa gat gta gat ggc gac cag acc tac atg cgt ctt ggc ttc 673
Asp Asn Lys Asp Val Asp Gly Asp Gln Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe
50 55 60
aaa ggt gaa act cag gtt act gac cag ctg acc ggt tac ggc cag tgg 721
Lys Gly Glu Thr Gln Val Thr Asp Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp
65 70 75
gaa tat cag atc cag ggc aac agc gct gaa aac gaa aac aac tcc tgg 769
Glu Tyr Gln Ile Gln Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp
80 85 90
acc cgt gtg gca ttc gca ggt ctg aaa ttc cag gat gtg ggt tct ttc 817
Thr Arg Val Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gln Asp Val Gly Ser Phe
95 100 105
gac tac ggt cgt aac tac ggc gtt gtt tat gac gta act tcc tgg acc 865
Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr
110 115 120 125
gac gta ctg cca gaa ttc ggt ggt gac acc tac ggt tct gac aac ttc 913
Asp Val Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe
130 135 140
atg cag cag cgt ggt aac ggc ttc gcg acc tac cgt aac act gac ttc 961
Met Gln Gln Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe
145 150 155
ttc ggt ctg gtt gac ggc ctg aac ttt gct gtt cag tac cag ggt aaa 1009
Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gln Tyr Gln Gly Lys
160 165 170
aac ggc aac cca tct ggt gaa ggc ttt act agt ggc gta act aac aac 1057
Asn Gly Asn Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn
175 180 185
ggt cgt gac gca ctg cgt caa aac ggc gac ggc gtc ggc ggt tct atc 1105
Gly Arg Asp Ala Leu Arg Gln Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile
190 195 200 205
act tat gat tac gaa ggt ttc ggt atc ggt ggt gcg atc tcc agc tcc 1153
Thr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser
210 215 220
aaa cgt act gat gct cag aac acc gct gct tac atc ggt aac ggc gac 1201
Lys Arg Thr Asp Ala Gln Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp
225 230 235
cgt gct gaa acc tac act ggt ggt ctg aaa tac gac gct aac aac atc 1249
Arg Ala Glu Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile
240 245 250
tac ctg gct gct cag tac acc cag acc tac aac gca act cgc gta ggt 1297
Tyr Leu Ala Ala Gln Tyr Thr Gln Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly
255 260 265
tcc ctg ggt tgg gcg aac aaa gca cag aac ttc gaa gct gtt gct cag 1345
Ser Leu Gly Trp Ala Asn Lys Ala Gln Asn Phe Glu Ala Val Ala Gln
270 275 280 285
tac cag ttc gac ttc ggt ctg cgt ccg tcc ctg gct tac ctg cag tct 1393
Tyr Gln Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gln Ser
290 295 300
aaa ggt aaa aac ctg ggt cgt ggc tac gac gac gaa gat atc ctg aaa 1441
Lys Gly Lys Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys
305 310 315
tat gtt gat gtt ggt gct acc tac tac ttc aac aaa aac atg tcc acc 1489
Tyr Val Asp Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr
320 325 330
tac gtt gac tac aaa atc aac ctg ctg gac gac aac cag ttc act cgt 1537
Tyr Val Asp Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gln Phe Thr Arg
335 340 345
gac gct ggc atc aac act gat aac atc gta gct ctg ggt ctg gtt tac 1585
Asp Ala Gly Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr
350 355 360 365
cag ttc taa tctcgattga tatcgaacaa gggcctgcgg gccctttttt 1634
Gln Phe
cattgttttc agcgtacaaa ctcagttttt tggtgtactc ttgcgaccgt tcgcatgagg 1694
ataatcacgt acggaaata 1713
〈210〉 4
〈211〉 367
〈212〉 PRT
〈213〉 Escherichia coli
〈400〉 4
Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu Leu Val Ala
1 5 10 15
Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu
20 25 30
Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser Asp Asn Lys
35 40 45
Asp Val Asp Gly Asp Gln Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu
50 55 60
Thr Gln Val Thr Asp Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Gln
65 70 75 80
Ile Gln Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp Thr Arg Val
85 90 95
Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gln Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly
100 105 110
Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr Asp Val Leu
115 120 125
Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe Met Gln Gln
130 135 140
Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe Phe Gly Leu
145 150 155 160
Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gln Tyr Gln Gly Lys Asn Gly Asn
165 170 175
Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly Arg Asp
180 185 190
Ala Leu Arg Gln Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Thr Tyr Asp
195 200 205
Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser Lys Arg Thr
210 215 220
Asp Ala Gln Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp Arg Ala Glu
225 230 235 240
Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala
245 250 255
Ala Gln Tyr Thr Gln Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly Ser Leu Gly
260 265 270
Trp Ala Asn Lys Ala Gln Asn Phe Glu Ala Val Ala Gln Tyr Gln Phe
275 280 285
Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gln Ser Lys Gly Lys
290 295 300
Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys Tyr Val Asp
305 310 315 320
Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp
325 330 335
Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gln Phe Thr Arg Asp Ala Gly
340 345 350
Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr Gln Phe
355 360 365
〈210〉 5
〈211〉 1808
〈212〉 DNA
〈213〉 Escherichia coli
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (457)..(1545)
〈400〉 5
aaaactaatc cgcattctta ttgcggatta gttttttctt agctaatagc acaattttca 60
tactattttt tggcattctg gatgtctgaa agaagatttt gtgccaggtc gataaagttt 120
ccatcagaaa caaaatttcc gtttagttaa tttaaatata aggaaatcat ataaatagat 180
taaaattgct gtaaatatca tcacgtctct atggaaatat gacggtgttc acaaagttcc 240
ttaaatttta cttttggtta catatttttt ctttttgaaa ccaaatcttt atctttgtag 300
cactttcacg gtagcgaaac gttagtttga atggaaagat gcctgcagac acataaagac 360
accaaactct catcaatagt tccgtaaatt tttattgaca gaacttattg acggcagtgg 420
caggtgtcat aaaaaaaacc atgagggtaa taaata atg atg aag cgc aat att 474
Met Met Lys Arg Asn Ile
1 5
ctg gca gtg atc gtc cct gct ctg tta gta gca ggt act gca aac gct 522
Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val Ala Gly Thr Ala Asn Ala
10 15 20
gca gaa atc tat aac aaa gat ggc aac aaa gta gat ctg tac ggt aaa 570
Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Val Asp Leu Tyr Gly Lys
25 30 35
gct gtt ggt ctg cat tat ttt tcc aag ggt aac ggt gaa aac agt tac 618
Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly Asn Gly Glu Asn Ser Tyr
40 45 50
ggt ggc aat ggc gac atg acc tat gcc cgt ctt ggt ttt aaa ggg gaa 666
Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu
55 60 65 70
act caa atc aat tcc gat ctg acc ggt tat ggt cag tgg gaa tat aac 714
Thr Gln Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Asn
75 80 85
ttc cag ggt aac aac tct gaa ggc gct gac gct caa act ggt aac aaa 762
Phe Gln Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp Ala Gln Thr Gly Asn Lys
90 95 100
acg cgt ctg gca ttc gcg ggt ctt aaa tac gct gac gtt ggt tct ttc 810
Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Val Gly Ser Phe
105 110 115
gat tac ggc cgt aac tac ggt gtg gtt tat gat gca ctg ggt tac acc 858
Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Ala Leu Gly Tyr Thr
120 125 130
gat atg ctg cca gaa ttt ggt ggt gat act gca tac agc gat gac ttc 906
Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Asp Asp Phe
135 140 145 150
ttc gtt ggt cgt gtt ggc ggc gtt gct acc tat cgt aac tcc aac ttc 954
Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Asn Phe
155 160 165
ttt ggt ctg gtt gat ggc ctg aac ttc gct gtt cag tac ctg ggt aaa 1002
Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gln Tyr Leu Gly Lys
170 175 180
aac gag cgt gac act gca cgc cgt tct aac ggc gac ggt gtt ggc ggt 1050
Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly
185 190 195
tct atc agc tac gaa tac gaa ggc ttt ggt atc gtt ggt gct tat ggt 1098
Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Val Gly Ala Tyr Gly
200 205 210
gca gct gac cgt acc aac ctg caa gaa gct caa cct ctt ggc aac ggt 1146
Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gln Glu Ala Gln Pro Leu Gly Asn Gly
215 220 225 230
aaa aaa gct gaa cag tgg gct act ggt ctg aag tac gac gcg aac aac 1194
Lys Lys Ala Glu Gln Trp Ala Thr Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn
235 240 245
atc tac ctg gca gcg aac tac ggt gaa acc cgt aac gct acg ccg atc 1242
Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr Arg Asn Ala Thr Pro Ile
250 255 260
act aat aaa ttt aca aac acc agc ggc ttc gcc aac aaa acg caa gac 1290
Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe Ala Asn Lys Thr Gln Asp
265 270 275
gtt ctg tta gtt gcg caa tac cag ttc gat ttc ggt ctg cgt ccg tcc 1338
Val Leu Leu Val Ala Gln Tyr Gln Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser
280 285 290
atc gct tac acc aaa tct aaa gcg aaa gac gta gaa ggt atc ggt gat 1386
Ile Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp Val Glu Gly Ile Gly Asp
295 300 305 310
gtt gat ctg gtg aac tac ttt gaa gtg ggc gca acc tac tac ttc aac 1434
Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn
315 320 325
aaa aac atg tcc acc tat gtt gac tac atc atc aac cag atc gat tct 1482
Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ser
330 335 340
gac aac aaa ctg ggc gta ggt tca gac gac acc gtt gct gtg ggt atc 1530
Asp Asn Lys Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp Thr Val Ala Val Gly Ile
345 350 355
gtt tac cag ttc taa tagcacacct ctttgttaaa tgccgaaaaa acaggacttt 1585
Val Tyr Gln Phe
360
ggtcctgttt tttttatacc ttccagagca atctcacgtc ttgcaaaaac agcctgcgtt 1645
ttcatcagta atagttggaa ttttgtaaat ctcccgttac cctgatagcg gacttccctt 1705
ctgtaaccat aatggaacct cgtcatgttt gagaacatta ccgccgctcc tgccgacccg 1765
attctgggcc tggccgatct gtttcgtgcc gatgaacgtc ccg 1808
〈210〉 6
〈211〉362
〈212〉 PRT
〈213〉 Escherichia coli
〈400〉 6
Met Met Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val
1 5 10 15
Ala Gly Thr Ala Asn Ala Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys
20 25 30
Val Asp Leu Tyr Gly Lys Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly
35 40 45
Asn Gly Glu Asn Ser Tyr Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg
50 55 60
Leu Gly Phe Lys Gly Glu Thr Gln Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Gly Gln Trp Glu Tyr Asn Phe Gln Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp
85 90 95
Ala Gln Thr Gly Asn Lys Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr
100 105 110
Ala Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Tyr Thr Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr
130 135 140
Ala Tyr Ser Asp Asp Phe Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Asn Ser Asn Phe Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala
165 170 175
Val Gln Tyr Leu Gly Lys Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn
180 185 190
Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly
195 200 205
Ile Val Gly Ala Tyr Gly Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gln Glu Ala
210 215 220
Gln Pro Leu Gly Asn Gly Lys Lys Ala Glu Gln Trp Ala Thr Gly Leu
225 230 235 240
Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr
245 250 255
Arg Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe
260 265 270
Ala Asn Lys Thr Gln Asp Val Leu Leu Val Ala Gln Tyr Gln Phe Asp
275 280 285
Phe Gly Leu Arg Pro Ser Ile Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp
290 295 300
Val Glu Gly Ile Gly Asp Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly
305 310 315 320
Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile
325 330 335
Ile Asn Gln Ile Asp Ser Asp Asn Lys Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp
340 345 350
Thr Val Ala Val Gly Ile Val Tyr Gln Phe
355 360
〈210〉 7
〈211〉 35
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: PCR primer
〈400〉 7
atctgtttgt tgagctcagc aatctatttg caacc 35
〈210〉 8
〈211〉 34
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 8
ttttttgcca gcatgccggc agccacgcgt agtg 34
〈210〉 9
〈211〉 33
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 9
ctcgaggctt agctctattt attaccctca tgg 33
〈210〉 10
〈211〉 33
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 10
gagctaagcc tcgagtaata gcacacctct ttg 33
〈210〉 11
〈211〉 34
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 11
ttgctggaaa gtcgacggat gttaattatt tgtg 34
〈210〉 12
〈211〉 35
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 12
ggccaaagcc gagctcattc accagcggcc cgacg 35
〈210〉 13
〈211〉 32
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 13
gctaagcctc gagtaatctc gattgatatc cg 32
〈210〉 14
〈211〉 31
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 14
ctcgaggctt agcgttatta accctctgtt a 31
〈210〉 15
〈211〉 34
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 15
ccgcgctcgc tctagagtga actgatcaac aata 34
〈210〉 16
〈211〉 34
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 16
atgcgcgcga gagctcaacc agcgtcgcac tttg 34
〈210〉 17
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 17
ctcgaggcat gctgaataaa accgcgattg 30
〈210〉 18
〈211〉 31
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 18
gcatgccctc gagggctccg ttattgttgt g 31
〈210〉 19
〈211〉 25
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 19
tgattccctt tgttgcgaag gcgaa 25
〈210〉 20
〈211〉 25
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 20
attaagatac ccaagtaata ctcaa 25
〈210〉 21
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 21
gcttttaaag gatcctagtt 20
〈210〉 22
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 22
ggttatcttt ccggattgtc 20
〈210〉 23
〈211〉 22
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 23
catgttccgg aggtaatatg aa 22
〈210〉 24
〈211〉 22
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 24
agttcccttt atattattaa ta 22
〈210〉 25
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 25
tggagtttat atgaaactaa 20
〈210〉 26
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 26
tgacttagtc aggataattg 20
〈210〉 27
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 27
atacttatta ataggtcttt 20
〈210〉 28
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR primer
〈400〉 28
ttgtcgaagt aattgttata 20

Claims (16)

  1. aroC 유전자, ompF 유전자 및 ompC 유전자의 비복귀돌연변이(non-reverting mutation)에 의하여 약독화된 박테리아.
  2. 제 1항에 있어서,
    경구(oral route)로 투여되는 것을 특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  3. 제 1항에 있어서,
    박테리아는 에쉐리히아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella),
    비브리오(Vibrio), 헤모필러스(Haemophilus), 예르시니아(Yersinia),
    보르데텔라(Bordetella) 또는 브루셀라(Brucella) 속으로부터 유래되는
    것을 특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  4. 제 3항에 있어서,
    박테리아는 대장균(Escherichia coli),
    쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 장티푸스균(Salmonella typhi),
    장염균(Salmonella enteritidis), 돼지콜레라균(Salmonella
    choleraesuis), 소티푸스균(Salmonella dublin),
    인플루엔자균(Haemophilus influenzae), 임균(Neisseria gonorrhoeae),
    예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica),
    백일해균(Bordetella pertussis) 또는 소유산균(Brucella abortus)인
    것을 특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  5. 제 4항에 있어서,
    박테리아는 장관독소성 대장균(enterotoxigenic E. coli, ETEC)인
    것을 특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  6. 제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서,
    제 4의(the fourth) 유전자의 추가적인 돌연변이에 의하여
    약독화되는 것을 특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  7. 제 6항에 있어서,
    제 4의 유전자는 aroA, aroD, aroE, pur, htrA, galE, cya, crp, phoP
    또는 surA인 것을 특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  8. 제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항에 있어서,
    각각의 유전자의 돌연변이는 이미 특성이 규명된 돌연변이(defined
    mutation)인
    것을 특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  9. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이는 전체 코딩 서열의 결실(deletion)인 것을 특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  10. 제 1항 내지 제 9항의 어느 한 항에 있어서,
    이형의(heterologous) 항원을 발현하도록 유전적으로 조작된 것을
    특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  11. 제 10항에 있어서,
    항원의 발현은 nirB 프로모터 또는 htrA 프로모터에 의하여
    유도되는 것을 특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  12. 제 1 내지 제 11항의 어느 한 항에 개시된 박테리아를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  13. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,
    사람 또는 동물에 예방접종하는 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는
    약독화된 박테리아.
  14. 사람 또는 동물에 설사를 예방하기 위한 방법에 사용할 목적으로 사용되며, aroC 유전자, ompF 유전자 및 ompC 유전자의 비복귀돌연변이에 의하여 약독화된 장관독소성 대장균(enterotoxigenic E. coli).
  15. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 개시된 박테리아의 사람 또는 동물에 예방접종하기 위한 약제를 제조하기 위한 용도.
  16. aroC 유전자, ompF 유전자 및 ompC 유전자의 비복귀돌연변이(non-reverting mutation)에 의하여 약독화된 박테리아를 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주인 포유동물에서 면역반응을 증대시키는 방법.
KR1020007010633A 1998-03-25 1999-03-25 ＡｒｏＣ, ＯｍｐＦ 및 ＯｍｐＣ 유전자 각각에 비복귀돌연변이로 약독화된 백신에 유용한 박테리아 KR100628657B1 (ko)

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