CZ301520B6 - Bakterie zeslabená nevratnou mutací, vakcína, která ji obsahuje a její použití - Google Patents

Abstract

Bakterie zeslabená nevratnou mutací v genu aroC, v genu ompF a v genu ompC volená z rodu Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella a Brucella je vhodná pro výrobu vakcíny. Takovou bakterií je napríklad zeslabený kmen E. coli vhodný pro vakcinaci proti prujmu.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká zeslabených bakterií užitečných ve v akcí nách, zvláště k ochraně proti enterotoxigennímu E. coli (ETEC) způsobujícímu průjmové onemocnění.

io Dosavadní stav techniky

Principem vakcinace je vyvolat imunitní odezvu v hostiteli a tím zajistit ochranu proti následnému napadení patogenem. Toho se dá dosáhnout očkováním živým zeslabeným kmenem patogenu, tedy kmenem majícím sníženou viruienci, takže nevyvolá chorobu způsobovanou vírulent15 ním patogenem.

Klasicky se selektovaly zeslabené vakcínové kmeny bakterií a virů jedním ze dvou rozdílných způsobů. Vytvořily se mutanty buď zpracováním organismu mutagenními chemickými sloučeninami, nebo opakovanou pasáží organismu in vitro. Použití obou způsobů však vede k zeslabeným kmenům, ve kterých je způsob zeslabení nejasný. Tyto kmeny se obzvlášť obtížně charakterizují z hlediska možného přechodu na kmen standardního typu, jelikož zeslabení může vyvolat jednotlivé (snadno reversibilní) nebo mnohonásobné mutační děje. Kromě toho je obtížné získat kmeny mající optimální imunogenní vlastnosti vzhledem k mnohonásobným mutačním dějům a může být nutno použít více kmenů k zajištění ochrany proti patogenů.

Pomocí moderních genetických technik je nyní možno konstruovat geneticky definované zeslabené bakteriální kmeny, ve kterých mohou být vytvořeny stabilní zeslabující delece. Touto technologií byla vytvořena řada místně zaměřených mutantů salmonely (2, 4, 5, 9, 12, 16, 17, 18). Byly popsány mutace četných genů, včetně aro genů (například aroA, aroC, aroD a aroE), pur, htrA, ompR, ompF, ompC, galE, cya, crp a phoP.

Nyní byly dobře charakterizovány mutanty salmonely aroA a ukázalo se, že jsou výtečnými živými vakcínami proti salmonelóze v případě četných druhů živočichů, Kromě toho, ke snížení možnosti reverze na viruienci rekombínačními ději, byly mutace začleněny do dvou nezávislých genů, jako je aroA/purA a aroA/aroC. Identické mutací ve kmenech salmonely přizpůsobených hostiteli, jako je S. typhi (lidí) a S. dublin (koček) vedly také k vytvoření řady kandidátů jednodávkových vakcín, které se s úspěchem osvědčily v klinických (Hohman E. L., Oletta C. A., Killeen K, P, a Miller S. I,, Vaccine 14, str. 19 až 24, 1996; Lewine Ν. M,, Galen J„ Bány E. a kol., J. Biotech. 44, str. 193 až 196, 1995) a obecných pokusech (Jones P. W., Dougan G.,

Haywood C., MacKensie N., Collins P. a Chatfíeld S. N„ Vacinne 9, str. 29 až 36,1991).

Kmen Salmonella typhimurium se stabilními mutacemi v ompC a ompF popsal Chatfíeld a kol. (Cattfíeld S. N., Dorman C. J., Hayward C. a Dougan G., Infection & Immunity 59, str. 449 až 452, 1991). Při orálním podání myším BALB/c byl kmen zeslaben, s 50% smrtelnou dávkou (LD50) přibližně 1000-násobně. Intravenózní LD50 však byla snížena přibližně 10-krát, což poukazuje na význam porinů, jež dodávají bakteriím schopnost infikovat orální cestou.

Exprese genů ompC a ompF je řízena ompR. Pickard a kol. (Pickard D., Li J. L,, Roberta M., Maskell D., Hone D., Lewine M., Douglas G. a Chatfíeld S., Infection and Immunity 62, str. so 3984 až 3993, 1994) popisuje klonování ompB operonu, zahrnující geny ompR a envZ ze Salmonella typhi Ty2 kosmidové banky a charakterizaci DNA sekvenční analýzou. Sekvenčních hodnot

DNA bylo použito k identifikaci vhodných restrikčních míst pro vytvoření definované delece 517 bp uvnitř otevřeného čtecího rámce genu ompR. Tato delece byla zavedena homologovou rekombínací do chromosomů dvou kmenů S. typhi, které již měly definované delece v obou genech aroC a aroD. Mutanty S. typhi ompR vykazovaly výrazný pokles exprese porinů ompC a

-1 víl. juíjav υυ ompF, jak bylo doloženo zkoumáním vnější membrány preparátů. Ukázalo se také, že dvousložkový regulační systém ompR-envZ má významnou úlohu v regulaci Vi polysacharidové syntese v S. typhi.

Ve studiích na živočiších bylo použito zeslabeného S. typhimurium jako nosiče k dodávání heterologových antigenů do imunitního systému (Chatfield S. N., Strahan K., Pickard D., Charlesi. G., Hormaeche C. E. a Douga G., Microbiol. Pathog. 12, str. 145 až 151, 1992b; Faírweather N. F., Chatfield S, N„ Makoff A, J. a kol. Infect. Immun. 58, str. 1323 až 1329, 1990; Strugnell R. A., Dougan G., Chatfield S. N., a kol., Infect Immun. 60, str. 3994 až 4002, ίο 1992). To zvyšuje potenciál vývoje multivalentních vakcín k použití na lidech (Gomaz-Duarte O.

G., Galen I, Chatfield S. N„ Vaccine 13, str. 1596 až 1602,1995).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je zeslabená bakterie nevratnou knock-out-mutací v každém z genů aroC, ompF a ompC volená z rodu Escherichia, Salmonella Bakterie rodu Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella a Brucella a také vakcína ji obsahující.

Má se zato, že kombinace mutací aroC/ompF/ompC poskytuje vakcínu s vynikajícími vlastnostmi. Například se má zato, že kombinace aroC/ompF/ompC může být lepší než kombinace aroC/ompR ze dvou důvodů:

1. Mutace ompR může způsobovat vyšší úroveň zeslabení než kombinace mutací ompF/ompC, jelikož ompR může regulovat řadu jiných genů než ompF a ompC, které jsou významné pro přežití bakterií in vivo. Kombinace ompF/ompC může tedy dovolovat přežití bakterií ve vakcinovaném hostiteli po delší dobu a lépe, což vede k lepší ochraně.

2. Mutace ompR může způsobovat sníženou imunogenitu ve srovnání s kombinací mutací ompF/ompC, jelikož ompR může regulovat expresi antigenů významných pro imunogenitu.

Jako příklady takových bakterií se uvádějí jsou Escherichia coli způsobující průjmy u lidí, Salmonella typhimurium způsobující salmonelózu u četných druhů živočichů, Salmonella typhi způsobující tyfové onemocnění lidí, Salmonella enteritidis způsobující otravu lidské potravy, Salmonella choleraesuis způsobující salmonelózu vepřů, Salmonella dublin způsobující systemické a průjmové onemocnění hovězího dobytka, zejména telat, Haemophilus influenzae způso35 bující meningitidu, Neisseria gonorrhoeae způsobující kapavku, Yersinia enterocolitica způsobující celé spektrum onemocnění lidí od současného zánětu žaludku a tenkého střeva (gastroenteritis) až po fatální septicemickou chorobu, Bordetella pertussis způsobující černý kašel a Brucella abortus způsobující zmetání a neplodnost hovězího dobytka a stav známý jako brucelóza lidí.

Pro vynález se hodí obzvláště kmeny E. coli a Salmonella. Stejně jako vakcíny proti infekci Salmonellou, může být zeslabené Salmonelly použito jako nosiče heterologových antigenů z jiných organismů do imunitního systému orální cestou. Salmonelly jsou mocnými imunogeny a jsou schopny podnítit systemické a lokální buněčné a protilátkové odezvy. Systémy k vyvolání exprese heterologových antigenů v Salmonelle in vivo jsou známy. Je například známo, že promotory nirB a htrA jsou účinnými podněty antigenové exprese in vtvo.

Vynález lze aplikovat na enterotoxigenní E. coli („ETEC“). ETEC je třída E. coli způsobující průjmové onemocnění. Jejich kolonie se usazují v blízkosti tenkého střeva. Standardním kmenem ETEC je ATCCH10407.

Infekce ETEC jsou jedinou nejčastější příčinou cesto vatě Iských průjmů, čítající 3 až 9 milionů případů do roka mezi návštěvníky rozvojových zemí. V endemických oblastech jsou infekce ETEC významnou příčinou dehydratačních průjmů novorozenců a malých dětí, které zaviňují ročně 800000 úmrtí v méně než pěti zemích na světě. V rozvojových zemích počet případů infek-2cí ETEC, vedoucí ke klinickému onemocnění, klesá s věkem, což naznačuje, že imunity proti infekci ETEC lze dosáhnout. Na rozdíl od toho neinformování dospělí z průmyslových zemí, kteří navštíví endemické oblasti, jsou vysoce náchylní k infekcím ETEC. Avšak při delším pobytu nebo při opakovaných návštěvách endemických oblastí náchylnost k infekcím ETEC klesá, což naznačuje, že živá zeslabená bakterie k vakcinaci ETEC se může ukázat jako úspěšná.

Podle vynálezu se využívá netoxigenního kmene ETEC nazývaného E1392/75/2A. Tento kmen vzniká spontánně z toxického mutantu deleci toxinových genů. Při studiích na lidech se dociluje orální vakcinaci živým kmenem E1392/75/2A 75% ochrany proti konkurenční ETEC expresující io toxin z různého serotypu. Avšak přibližně u 15 % vakcinovaných jedinců se vyskytl průjem jako vedlejší účinek vakcíny. Kmen vyžaduje další zeslabení ke snížení vedlejších účinků, dříve než ho lze považovat za potenciální vakcínu a vynález se týká způsobu, jak tohoto zeslabení dosáhnout.

Seq Id č. 1 ukazuje sekvenci genu E. coli aroC,

Seq Id č. 3 ukazuje sekvenci genu E. coli ompC,

Seq Id č. 5 ukazuje sekvenci genu E, coli ompF.

Další mutace

Do bakterií podle vynálezu může být začleněna jedna nebo několik dalších mutací k vytvoření kmenů obsahujících mutace přídavně k aroC, ompC a ompF. Takovou další mutací může být (i) zeslabující mutace v genu jiném než aroC, ompC a ompF, (ii) mutace k zajištění selekce in vivo z buněk udržujících plazmid (například plazmid expresují25 cí heterologový antigen), nebo (iii) mutace k zabránění exprese toxinového genu.

Další zeslabující mutací může být mutace, o které je již známo, že je zeslabující. Mezi takové mutace patří aro geny (například aroA, aroD a aroE), pur, htrA, ompR, galE, cya, crp, phoP a surA (například Chatfleld S. N., Charles I. G., Makoff A. J. a kol. Biotech. 10, str. 888 až 892, 1992a; Curtiss III, R. a Kelly S. M,, Infect. Immun. 55, str. 3035 až 3043, 1987; Dougan G., Chatfleld S., Pickard D., Bester J., 0'Callaghan D. a Maskell D., J. Inf. Dis. 158, str. 1329 až 1335, 1988; 9. Hone D., Morona R., Attridge S. a Hackett J., J. Infect. Dis., 156, str. 167 až 1, 1987; Miller S. I., Kukral A. M. a Mekalanos J. J., Proč. Nat. Acad. Sci, USA 86, str. 5054 až

5058, 1989; Pickard D., LiJ. L., Roberts M,, Maskell D., Hone D., Levine M., Douglas G. a

Chatfleld S., Infection and Immunity 62, str. 3984 až 3993, 1994; EP-B-0322237 (Doudan a kol.); EP-B-0400958 (Dougan a kol.); a EP-B-0524205 (Dougan a kol.).

Mutace, k zajištění selekce k udržení plazmidů, může být provedena mutací genu, který je nez40 bytný pro přežití bakterie. Plazmid, nesoucí nezbytný gen, je pak zaveden do bakterie tak, že přežít mohou pouze buňky nesoucí plazmid. To může být užitečné tehdy, když plazmid obsahuje například heterologový antigen, který má být expresován bakterií.

Mutace k zabránění exprese toxinového genu může být provedena ke snížení veškerých vedlej45 ších účinků způsobených vakcinaci bakteriemi. Například v případě vakcinace kmeny E. coli, jakoje ETEC, může být žádoucí mutovat geny tepelně labilního toxinu (LT) nebo tepelně stabilního toxinu (ST), aby nebyly expresovány.

Povaha mutací

Mutace, zavedené do bakteriální vakcíny, vyřadí úplně funkci genu. Toho se dá dosáhnout buď naprostým zrušením syntézy jakéhokoliv polypeptidu z genu, nebo provedením mutace vedoucí k syntéze nefunkčního polypeptidu. Ke zrušení syntézy polypeptidu vede buď vypuštění celého genu, nebo jeho 5-zakončení. Delece nebo vložení do kódovací sekvence genu může být použito

-3VZ. JU13ZU DO k vytvoření genu, který syntetizuje pouze nefunkční polypeptid (například polypeptid obsahující pouze N-koncovou sekvenci proteinu standardního typu).

Mutace jsou nevratné. Jde o mutace, které vykazují v podstatě nevratnost do standardního typu, je-li bakterie použito jako vakcíny. Takové mutace zahrnují začlenění nebo deleci. Začlenění a delece jsou s výhodou velké, typicky o délce nejméně 10 nukleotidů, například 10 až 600 nukleotidů. S výhodou se vypustí celá kódující sekvence.

Bakterie, použitá ve vakcíně, obsahuje s výhodou pouze definované mutace, tedy mutace, které io jsou charakterizovány. Je zřejmě nežádoucí použít jako vakcíny bakterie, která má ve svém genomu necharakterizované mutace, neboť hrozí nebezpečí, že necharakterizované mutace mohou udělit bakterii vlastnosti, které způsobí nežádoucí vedlejší účinky.

Zeslabující mutace mohou být začleněny způsoby dobře známými pracovníkům v oboru (Jones P. W., Dugan G., Haywood C., MacKensie N., Collins P. a Chatfield S. N., Vaccine 9, str. 29 až 36, 1991). Mezi vhodné způsoby patří klonování sekvence DNA genu standardního typu do vektoru, například plazmidu a vložení selektovatelného markéru do klonované sekvence DNA nebo vypuštění části sekvence DNA vedoucí k její inaktivaci. Vypuštění může být provedeno například přerušením sekvence DNA pomocí restrikčních enzymů, které vystřihnou ve dvou místech nebo právě vně kódovací sekvenci a spojí oba konce zbývající sekvence. Plazmid, nesoucí inaktivovanou sekvenci, DNA, může být transformován do bakterie známými technikami, jako je elektroporace a konjugace. Vhodnou selekcí je pak možno identifikovat mutant, ve kterém se inaktivovaná sekvence DNA rekombinovala na chromosom bakterie a sekvence DNA standardního typu se stala nefunkční homologovou rekombinací.

Exprese heterologových antigenů

Genovým inženýrstvím může být zeslabená bakterie podle vynálezu upravena k expresi antigenů, který není expresován nativní bakterií („heterologový antigen“), takže zeslabená bakterie působí jako nosič heterologového antigenů. Antigen může pocházet z jiného organismu, takže vakcína zajišťuje ochranu proti jinému organismu. Může být vyrobena multivalentní vakcína, která nejenom zajišťuje imunitu proti virulentnímu původci zeslabené bakterie, ale zajišťuje také imunitu proti jinému organismu. Kromě toho může být zeslabená bakterie upravena k expresi více než jednoho heterologového antigenů a v tom případě mohou být heterologové antigeny ze stejných nebo z odlišných organismů.

Heterologovým antigenem může být úplný protein nebo část proteinu obsahující epitop. Antigen může být z jiné bakterie, z viru, z kvasinky nebo zhouby. Speciálně může být antigenová sekvence z následujících organizmů: E. coli (například ETEC), tetanus, virus hepatitidy A, B nebo

C, lidský rinovirus typu 2 nebo 14, virus herpes simplex, poliovirus typu 2 nebo 3, virus kulhavky a slintavky, virus chřipky, coxsakcie virus nebo Chlamydia trachomatis. Mezi vhodné antigeny patří netoxické složky tepelně labilního toxinu E. coli, antigeny E. coli K88, antigeny kolonizačního faktoru ETEC, protein P.69 z B. pertussis a tetanový toxinový fragment C.

Kolonizační faktory ETEC ajejich složky jsou prvními kandidáty pro expresi jako heterologové antigeny. K navození průjmového onemocnění musejí být patogenní kmeny ETEC schopny kolonizovat střevo a vytvořit enterotoxiny. Pro většinu kmenů byly identifikovány kolonizační faktory (CF) ETEC, které jsou potřeba k přilnutí ke sliznici střeva. V téměř všech případech jsou CF expresovány jako třásně na vnějším povrchu bakterie. Byla identifikována velká řada CF, přičemž převládající jsou CFAI, CRAH (zahrnující CS1, CS2, CS3) a CFA1V (zahrnující CS4 CS5aCS6).

Vakcína ETEC ideálně poskytuje ochranu proti řadě antigenů kolonizačních faktorů k zajištění ochrany proti různým kmenům. Aby toho bylo dosaženo, bylo by potřeba expresovat četné kolo55 nizační faktory v jednom kmeni. Alternativně by bylo možno provést stejné zeslabení v řadě růz-4ných kmenů ETEC, každého s jiným kolonizačním faktorem. To by zahrnovalo deleci toxinů z takových kmenů.

DNA kódující heterologový antigen je expresována z promotoru, který je aktivní in vivo. Dvěma promotory, které se ukázaly jako dobře fungující v salmonele, jsou promotor nirB (WO 92/15689 (Charles a kol.); Everest P., Allen J. Papakonstantinopoulou A., Mastroeni P., Roberts M. a DouganG., FEMS Microbiol. Letts., 126, str. 97 až 101, 1995) a promotor htrA (Everest P., Allen J. Papakonstantinopoulou A:, Mastroeni P., Roberts M. a Dougan G., FEMS Microbiol. Letts., 126, str. 97 až 101, 1995). K expresi antigenů kolonizaěního faktoru ETEC může být pouio žito promotorů standardního typu.

Konstrukce DNA, obsahující promotor operativně připojený k DNA kódující heterologový antigen, se může připravit a transformovat na zeslabenou bakterii o sobě známými způsoby. Produkty transformace, obsahující konstrukci DNA, mohou být vyčleněny například skrínováním pro selektovaný markér na konstrukci. Bakterie obsahující konstrukci mohou být pěstovány in vitro dříve než se zformulují před podáním hostiteli k vakcinačním účelům.

Formulace vakcíny

Vakcína se může formulovat známými způsoby formulování zeslabených bakteriálních vakcín. S výhodou je vakcína určena pro orální podání, například v lyofilizované zakapslované formě. Takové kapsle mohou být opatřeny enterickým povlakem, obsahujícím například Eudragate „S“™, Eudragate „L“™, acetát celulózy, ftalát celulózy nebo hydroxypropylmethylcelulózu. Těchto kapslí se může použít jako takových, nebo alternativně může být lyofilizovaný materiál před podáním rekonstituován, například jako suspense. Rekonstituce se s výhodou provádí v pufru při vhodné hodnotě pH k zajištění životnosti bakterií. K ochraně zeslabených baterií a vakcíny před žaludeční kyselinou se s výhodou podává před každým podáním vakcíny hydrogenuhličitan sodný. Jinak může být vakcína připravena pro parenterální, intranasální nebo intramuskulámí podání.

Vakcíny se může použít při vakcinaci savců, zejména lidí, avšak také zvířecího hostitele. Infekci, způsobené mikroorganismy, obzvláště patogeny, může být zabráněno podáním účinné dávky vakcíny, připravené podle vynálezu. Použité dávkování určuje lékař v závislosti na různých faktorech včetně velikosti a hmotnosti hostitele a typu formulované vakcíny. Pro dospělého člověka o hmotnosti 70 kg může však být vhodná dávka pro orální podání 10⁷ až 10¹¹ bakterií v dávce.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení pomocí přiložených obrázků.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. I je znázorněn systém pro konstruování definovaných delecí v cílových genech pomocí sestřihování převrstvením extenze mutagenese PCR.

Příměr A zahrnuje restrikční místo 1 Primer B zahrnuje restrikční místo 2 Primer C zahrnuje restrikční místo 3 a 4 Primer D zahrnuje restrikční místo 3 a 4

Na obr. 2 jsou očekávané sekvence cílových genů po rekombinaci a selekci pro delece.

Bolt -Stop a start kodony

Zavedena italic-restrikční enzymová místa nižší případ- extra n.t. adováno k příměrům k předcházení vytváření primorového dimeru

-5---standardní typ genu

N.B. aroC delece odstraňuje 16 n.t. 3' ke stopovému kodonu

Na obr. 3 je znázorněno klonování deleěních kazet do plazmidu pCVD442.

Na obr. 4 je znázorněna analýza SDS-PAGE vnějších membrán připravených z kmenů ETEC za podmínek nízké (L-kultivační půda prostá soli) a vysoké (L-kultivační půda prostá soli + 15 % sacharózy) osmolarity. M=markery, vzorek 1 = PTL010, vzorek 2 = PTL002, vzorek 3 = PTL003, vzorek 4 = aroC AompC, vzorek 5 - ÁompF.

Na obr. 5 je exprese CS1 a CS3 v deleěních kmenech po růstu na CFA agaru. Stejný počet buněk z každého kmene je uložen na 15% SDS-PAGE gelu westernovým přenosem s monospecifickými anti-CSl nebo anti-CS3 polyklonálními protilátkami. Kontrolou pro protilátkovou specifícitu byly plné buněčné lysáty buněk TGl expresujících hlavní pilin protein CS1, nebo vyčištěný hlavní pilin protein zCS3. Pruh M, se překlenuje markéry nízké molekulové hmotnosti, pruh 1 indukované buňky TGl obsahující pKK223, pruh 2 indukované buňky TGl obsahující pKKCsl, pruh 3 kmen CS1-ETEC, pruh 4 PTL010, pruh 6 PTL002, pruh 7 PTL003, pruh 8 vyčištěný hlavní pilin protein.

Na obr. 6 je Southemový přenos mutantu loci. DNA byla extrahována z ETEC standardního typu (El392/75-2A), PTL0Q1 (hrtA aroC), PTL002 (aroC ompR) a PTL003 (aroC ompC ompF) jak vyznačeno, digerována restrikční endonukleázou EcoRV a elektroforézována pulzujícím polem přes 1% agarózu. DNA byla přenesena z gelu na nylonové membrány Hybond N+ (Amersham) a hybridizována sondami DNA odvozenými z míst aroC, htrA, ompR, ompC, nebo ompF, jak zná25 zorněno. Pásmové obrazce jsou konsistentní s mutantovými místy delece.

Na obr. 7 jsou odezvy IgA u dobrovolníků, kterým byla podána vakcína podle vynálezu. Na ose x jsou dny, na ose y je čistý supematant ELISA O.D.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Konstrukce a charakterizace kmene podle vynálezu

Návrh delecí a konstrukce plazmidů pCVD AAroC, pCVD AOmpC a pCVDAOmpF

Delece byly určeny k odstranění úplného otevřeného čtecího rámce cílového genu. Za použití sekvence genomu E. coli jako matrice, byly určeny primery PCR k zesílení fragmentů párů bází 500-600 lemující cílový otevřený čtecí rámec (sekvence primerů jsou v tabulce I). Sestřihu překrytím extense pomocí PCR bylo použito k fúzi dvou lemujících sekvencí za vytvoření produktu PCR s delecí úplného genu (obr. 1). Sekvence standardního typu kolem místa delece a předpově45 zené sekvence po delecí jsou znázorněny na obr. 2.

Pro každý gen byla zavedena do sestřižné oblasti dvě různá restrikční místa (tabulka II). Těch bylo použito k identifikací deleěních klonů. Primery PCR na každém konci fragmentu PCR zavedená jedinečná restrikční místa byla použita ke klonování fragmentu do mnohočetného klonova50 čího místa pCVD442 (obr. 3).

Produkty PCR se vyčistily gelovým čištěním pomocí extrakčního kitu Qiagen (obchodní jméno) a digerovány s příslušnými restrikčními enzymy před ligací na sebevražedný plazmid pCVD442 (Donnenberg M. S. a Kaper J. B. Infection and Immunity 59, str. 4310 až 4317,1991) digerovaný

-6tímtéž enzymem a zpracovaný alkalickou fosfatázou k zabránění vektorové samoligaci (obr. 3).

Ligační směs se transformovala do SY327 Xpir a nanesla na destičky L-ampicilinu (100 pg/ml).

Plazmidy z transformantů resistentních k ampicilinu se skrínovaly se zřetelem na obsah delečních kaset restrikění digescí. Generovaly se tyto plazmidy:

pCVDAAroC pCVD Δ OmpC pCVD Δ OmpF

Sebevražedný plazmid pCVD442 může replikovat pouze v buňkách pro pir gen. Při zavedení do io ne-pir kmenů pCVD442 je neschopen replikace a odolnost k ampicilinu, zavedená plazmidem, může být udržena, jestliže se plazmid integruje do chromosomu jedním homologovým rekombinantním dějem. Plazmid má také sacB gen kódující leva cukrázu, kteráje toxická pro gram negativní bakterie v přítomnosti sacharózy. Toho se může využít pro selektování klonů, které prodělaly druhý rekombínační děj, při kterém se sebevražedný kmen vystřihne, Takové buňky jsou odolné sacharóze avšak citlivé k ampicilinu.

Konstrukce a charakterizace kmene AroC OmpC OmpF

V tomto oddíle se popisuje chronologie konstrukce a historie kmene AAroCAOmpCAOmpF.

Označením „ETEC“ se zde míní specificky kmen E1392/75/2A nebo jeho deriváty.

Delece AroC OmpC OmpF byly zavedeny do El392/75/2A v následujícím pořadí:

Δ AroC AAroC AOmpC -> AAroC AOmpC AOmpF

Konstrukce ETEC AAroC

1) E1392/75/2A z originálních zásob v mikrobance se nanese na L-agar,

2) z těchto buněk se připraví kompetentní buňky pro elektroporaci. Zmrazí se 100 μΐ podíly.

3) Pomocí míniprep Qiagen Qiafilter (obchodní jméno) se oddělí pCVDAAroC z buněk SY327pir. Plazmid se zkoncentruje přibližně 10—krát vysrážením ethanolem. Shora je popsána konstrukce pCVD AAroC.

4) Smísí se 5 μΐ koncentrovaného plazmidu se 100μ1 rozmražených buněk a podrobí se elektroporaci. Celá transformace se nanese na L-ampici línovou destičku (50 pg/ml) a inkubuje se přes noc při teplotě 37 °C.

5) Vyroste jediná k ampicilinu resistentní kolonie.

6) Kolonie se naočkuje na L-ampicilinovou destičku (100 pg/ml) a nechá se růst přes noc při teplotě 37 ^ŮC („merodiproid plate“).

7) PCR pomocí primerů TT19 a TT20 (specifických pro gen aroC) a kolonie sejmutá z merodiploidní destičky zesílí dva pruhy o velikostech odpovídajících velikostem standardního typu a genů AAroC. Sekvence primerů jsou vyznačeny v tabulce í.

8) Kolonie z merodiploidní destičky se nechá růst sedm hodin v a) L-ampicilinové kultivační půdě (100 pg/ml) a b) v L-kultivační půdě. Kolonie, vyrostlá na L-ampicilinové kultivační půdě, se uloží do mikrobanky.

9) Provede se série ředění kultury L-kultivační půdy na

a) neslaném L-agaru,

b) neslaném L-agaru + 5 % sacharózy.

Destičky se inkubují přes noc při teplotě 30 ^ÓC.

10) Počty kolon ukazují, že o IO⁴ více kolonií vyrostlo na L-agaru než na L-agaru + 5 % sacharózy, což ukazuje na selekční práci sacharózy.

11) Kolonie resistentní na sacharózu se skrínují se zřetelem na přítomnost genu aroC pomocí

PCR. Kolonie, vybrané ke skrínování se nanesou na L-agarovou destičku a nechají se růst přes noc při teplotě 37 °C. Tato destička se uloží při teplotě 4 °C až do dalšího testování.

-7CL JU13ZU DO

12) 50 % z 90 testovaných kolonií mělo pouze aroC.

13) Testuje se růst kolonie:

a) na destičkách M-9 minimal média

b) na destičkách M-9 minimal média + Aromixových destičkách

c) na L-Amp (100 pg/ml) kolonie aroC by neměly růst na M-9 minimal médiu bez Aromix nebo na L-Amp. Aromix je směs následujících aromatických sloučenin:

Látka

Konečná koncentrace C3í hm/obj) fenylalanin tryptofan tyros i n p-aminobenzoová kyselina dlhydroxybenzoová kyselina

0,004

0.004

0,004

0,001

0,001 io

Tyto sloučeniny se vyrábějí v bakteriích standardního typu, avšak mutace aroC brání jejich syntéze.

14) 13/4 předpokládaných kolonií AAroC vyžadovalo k růstu na N-9-minimálním médiu Aromix a byly citlivé na ampicilin.

15) Pomocí PCR se testovaly tři kolonie (č. 1, 2, 3) na přítomnost hlavního pilin proteinového genu CS1 za použití primerů MGR169 a MGR170. Všechny tři kolonie poskytly produkty PCR očekávané velikosti (700 bp.). Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce I.

16) Kolonie 1, 2 a 3 ze skrínovací hlavní destičky se vyjmuly na L-agar a nechaly se růst přes noc při teplotě 37 °C. Buňky z těchto tří destiček byly použity k očkování do zkumavek mikrobanky.

17) Kolonie 1, uložené v mikrobance, bylo použito k další práci.

18) K trvalému uskladnění se kulička z mikrobankové misky naočkuje do 1 ml L-kultivační půdy, nechá se růst čtyři hodiny za natřásání při teplotě 37 °C a slouží k vytvoření agarových produktů, kterých se použije k vytváření zásob sušených vymrazováním. Vymrazová25 ním vysušená zásoba El 392/75/2AAAroC se označí PTL004. Do zbytku 1 ml kultury se přidá 20 ml L-kultivační půdy a kultura se inkubuje přes noc při teplotě 30 °C. Přenese se 1 ml kultury, inkubované přes noc, do každé ze tří kryofiol a uloží se v tekutém dusíku.

Konstrukce ETEC AAroC AOmpr

1) Příprava pCV AOmpC plazmidu DNA pro elektroporaci:

Kolonie SY327 Xpir, nesoucí pCVDAOmpC, se nechá růst přes noc pří teplotě 37 °C ve 100 ml L-ampicilinu (100 gg/ml) jakožto kultivační půdě. Plazmid DNA se vyčistí pomocí miniprep Qiagen Qiafilter (obchodní jméno). DNA se dále zkoncentruje ethanolovou precipitací. Konstrukce pCVDAOmpC je popsána shora.

2) Příprava elektrokompetentních buněk:

Buňky ETECAAroC z mikrobankové misky, produkované ve stupni 17 předchozího oddílu se naočkují na L-agar, nechají se růst přes noc při teplotě 37 °C, načež se uskladní při teplotě 4 °C po dobu nepřekračující 1 týden před použitím k očkování kultur pro přípravu elektrokompetentních buněk.

3) Buňky ETECA AroC se elektroporují 5 μΐ koncentrované DNA pCVDAOmpC a každá transformace se nanese na samostatnou L-ampicilinovou destičku (50 pg/ml) a nechá se růst přes noc při teplotě 37 °C.

-84) Získá se 17 kolonií resistentních na ampicilin (předpokládané ETECAAroC/pCVDAOmpC merodíploidy).

5) Tyto kolonie se nastříknou na hlavní L-ampicilinovou destičku (100 pg/ml) a použije se jich jako matrice pro PCR s primery TT7/TT8. Hlavní destička se nechá růst při teplotě místnosti přes víkend. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce I.

6) Samotná kolonie (č. 7) měla gen Δ ompC.

7) Kolonie se nechá růst pět hodin na L-kultivační půdě.

8) Provede se série ředění kultury L-kultivační půdy na a) neslaném L-agaru, io b) neslaném L-agaru + 5 % sacharózy.

Destičky se inkubují přes noc při teplotě 30 °C.

9) Počty kolon ukazují, že o i O¹ více kolonii vyrostlo na L-agaru než na L-agaru + 5 % sacharózy, což dokládá selekční prácí sacharózy.

10) Skrínuje se 45 kolonií resistentních na sacharózu na gen AompC za použití primerů TT7 a

TT8, Devět kolonií mělo gen AompC, avšak většina měla stopy w.t. genu ompC. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce L

11) K dalšímu charakterizování předpokládaných kolonií ETECAAroCAompC se nechají růst pět hodin v 1 ml L-kultivační půdy a nanesou se na

a) L-agar + 100 pg/ml ampicilinu

b) L-agar

c) L-agar + 5 % sacharózy

Kolonie AOmpC by měly být resistentní na sacharózu a citlivé na ampicilin.

12) Pouze 1 kolonie (č. 1) byla citlivá na ampicilin a resistentní na sacharózu.

13) Kolonie č. 1 byla kontrolována na přítomnost genů aroC, AompC a CS1 za použití PCR s primery TT19/TT20, TT7/TT8 a MGR169 a 170. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce I.

14) Kolonie poskytuje samostatné PCR produkty očekávané velikosti pro geny AaroC, AompC a CS1.

15) Kolonie byla uložena v mikrobance.

16) K trvalému uskladnění se kulička z mikrobankové misky naočkuje do 1 ml L-kultivační půdy, nechá se růst čtyři hodiny za natřásání při teplotě 37 °C a slouží k vytvoření agarových produktů, kterých se použije k vytváření zásob sušených vymrazováním. Vymrazováním vysušená zásoba E1392/75/2AAAroC/AOmpC se označí PTL008. Do zbytku 1 ml kultury se přidá 20 ml L-kultivační půdy a kultura se inkubuje přes noc při teplotě 30 °C. Pře35 nese se 1 ml této kultury, inkubované přes noc, do každé ze tri kryofiol a uloží se v tekutém dusíku.

Konstrukce ETECAAroCAOmpCAOmpF

K zavedení pCVDAOmpF do El392/75/2AAAroCAOmpC se použije konjugace.

1) Konjugační donorové buňky SMlOlambdapir se transformují s pCVDAOmpF. Konstrukce plazmidu pCVD OmpF je popsána shora.

2) S buňkami SM10 Xpir/pCVD OmpF se konjugují buňky ETEC AroCAOmpC. Plazmid pCVD442 zahrnuje transferový počátek, který umožňuje plazmidu přemístění z donorového kmene obsahujícího transferové geny RP4 (například SM10 Xpir) na recípientový kmen (například ETEC). Buňky EZEC AaroCAompC a kmen E. coli SM101 Xpir, nesoucí rekombinant pCVDompF se křížově naočkují na L-agarové destičky k pokrytí plochy přibližně 10 cm². Destičky se inkubují 20 hodin při teplotě 37 °C, načež se nárůst smyje 4 ml L-kultivační půdy a suspense se nanese na McConkeyův agar (Difco) obsahující streptomycín v množství 20 pg/ml a ampicilin v množství pg/ml. Destičky se inkubují přes noc při teplotě

-9CL tJUlJÍU DO °C a výsledné kolonie se kontrolují na merodiploidy PCR za pomoci vhodných oligonukleotidů jako primerů.

3) Předpokládané transkonjuganty ETEC se skrínují. Sejme se 10 kolonií z McConkeyových agarových destiček a nechají se růst přes noc na L-ampicilinovém agaru (100 pg/ml). Pří5 tomnost genu AompF se kontroluje PCR primery TT1/TT2. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce I.

4) Kolonie se nechají růst pět hodin na L-kultívační půdě.

5) Provede se série ředění kultury L-kultivační půdy na a) neslaném L-agaru, io b) neslaném L-agaru + 5 % sacharózy.

Destičky se inkubují přes noc při teplotě 30 °C.

6) Počty kolon ukazují, že o 10⁵ více kolonií vyrostlo na L-agaru než na L-agaru + 5 % sacharózy, což ukazuje na selekční práci sacharózy.

7) Skrínují se kolonie resistentní na sacharózu na gen AompF za použití primerů TT1/TT2.

Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce I. Skrínované kolonie se nechají růst přes noc na

L-agaru. Tři kolonie ze 47 měly gen AompF, chyběl výskyt genu ompF standardního typu.

8) K dalšímu charakterizování předpokládaných kolonií ETEC AAroCAompCAompF se kolonie na

a) L-agar + 100 pg/ml ampicilinu

b) L-agar

c) L-agar + 5 % sacharózy.

Kolonie AOmpF by měly být resistentní na sacharózu a citlivé na ampicilin.

9) Všechny tri kolonie byly citlivé na ampicilin a resistentní na sacharózu.

10) Kolonie se uložily do mikrobanky ajedna kolonie byla zvolena jako základní zásoba.

11) K trvalému uskladnění se kulička ze základní zásoby naočkuje do 1 ml L-kultivační půdy, nechá se růst čtyři hodiny za natřásání při teplotě 37 °C a slouží k vytvoření agarových produktů, kterých se použije k vytváření zásob sušených vymrazováním. Vymrazováním vysušená zásoba Ε1392/75/2A AAroCAOmpCAompF má označení PTL003.

Do zbytku 1 ml kultury se přidá 20 ml L-kultivační půdy a kultura se inkubuje přes noc pri teplotě 30 °C. Přenese se 1 ml kultury, inkubované přes noc, do každé ze tří kiyofiol a uloží se v tekutém dusíku.

Charakterizace El392/75/2AAAroCAOmpCAOmpF 1) Růstové požadavky:

Buňky z hlavní zásoby, vyrobené ve stupni 10 v předchozím oddíle, se naočkují na L-agarovou destičku. Současně se naočkuje 8 ml L-kultivační půdy pro chromosomální DNA prep pro Southerovy přenosy. Destička a tekutá kultura se nechají růst přes noc při teplotě 37 °C. Buňky z růstové destičky se naočkují na následující média a nechají se růst přes noc při teplotě 37 °C.

- 10Medium

Růst

L-Amp	žádný
M9 minimální medium	žádný
M9 minimální + Aromix	ano
M9 + sulfathiazol <100 pg/mlž	Žádný
M9 + sulfathiazol <100 pg/ml> + Aromix	ano
L-Agar + 50 ug/ml streptomycinu	ano
L-Agar + 5 % sacharózy	ano

Podle očekávání jsou buňky citlivé na Amp. Buňky jsou resistentní na sacharózu, streptomycin a sulfathiazol, k růstu na minimálním médiu však potřebují Aromix.

2) LPS analýza PTL003:

a) Zmrazováním vysušená fiola PTL003 se otevře. Kultura se resuspenduje v L-kultivační půdě a nanese se na L-Agar k růstu. Několik buněk se seškrábne a uschová v mikrobance.

b) Seškrábne se více buněk a analyzuje se LPS profil. Není viditelný rozdíl mezi LPS profilem PTL003 a originálním kmenem E1392/75/2A.

io 3) Potvrzení delece PCR:

a) Odškrabek buněk se odebere z destičky připravené podle odstavce 2a, naočkuje se na LAgar a nechá se růst přes noc.

b) Čerstvě vyrostlé buňky se použijí k PCR s primery, které sousedí s následujícími geny: aroC, htrA, ompC, ompF, ompR.

c) Ukazuje se, že PTL003 má deleci v genech aroC, ompC a ompF, avšak nikoli v htrA nebo ompR.

4) Analýza profilu vnější membrány proteinu PTL003:

Z kmenů PTL010 (E1392/75/2A) a z delečních kmenů PTL002 a PTL003 se připraví frakce vnější membrány proteinu. Analyzuje se také kmen se samotnou deleci ompF a kmeny s oběma delecemi aroC a ompC. Kmeny se nechají růst za podmínek nízké osmolarity (Lkultivační půda bez soli + 15 % sacharózy). Proteinový produkt OmpF se normálně expresuje ze nízké osmolarity, zatímco produkt OmpC se expresuje za vysoké osmolarity. Proteiny OmpC a OmpF mají podobnou elektroporetickou mobilitu. Jak ve vysoké, tak v nízké osmolaritě chybí kmeni PTL003 proteiny v oblasti OmpC/OmpF ve srovnání se standardním kmenem typu E1392/75/2A nebo ve srovnání sdelečními kmeny AAroC AOmpC nebo

AOmpF. Výsledky jsou vyjádřeny na obr. 4.

5) Exprese pil CS1 a CS3 na CFA agaru:

Zkoumá se exprese pil CS1 a CS3 v delečním kmeni. Přes noc se nechají růst stejné počty bakterií (2 A^oonm jednotek) kmenů PTL010, PTL001, PTL002, PTL003 při teplotě 37 °C na agaru CFA a podrobí se SDS PAGE analyzují se westernovým přenosem s monospecifickými polyklonálními protilátkami proti CS1 nebo CS3. Pil CS1 a CS3 jsou expresovány stejně dobře v pěti pruzích (obr. 5).

CFAII-negativní derivát E1392/75/2A se konstruuje pro použití jako kontrola.

Provede se to specifickým zpracováním plazmidů kódujících CS z kmene ETEC

E1392/75/2A. Krátký fragment DNA se zesílí z genu cooB pomocí PCR s olígonukleotidy

CSA01 a CSA02 jako primery a ligují se do vektoru Easy plazmid pGEM-T (obchodní název, Promega) určeného ke klonování produktů PCR, Fragment se subklonuje do pCVD442 účinkem restrikčních míst enzymů Sáli a SphL Do kmene El392/75/2A se derivát pCVD442-cooB zavede konjugací z SM10 Xpir, Nejpravděpodobnějším výsledkem fúze derivátu pCVD442-cooB s plazmidem, obsahujícím cooB, jsou transkonjuganty resistentní

-11 CL JU13ZU ΒΟ vůči ampicilinu. Takové transkonjuganty se pak pěstují na L-agaru doplněném 5 % sacharózy k výběru pro ztrátu sacB genu pCVD442. Výsledné kolonie se testují na citlivost vůči ampicilinu a PCR pomocí CSA01 a CSA02 jako primerů. Jako pozitivní kontroly jsou z těchto PCR zařazeny tři kolonie E1392/75/A2. Dvě kolonie resistentní vůči sacharóze, které nedávaly žádný produkt s PCR, se naočkují na čerstvý L-agar doplněný 5 % sacharózy k získání čistých kultur. Čisté kultury se pak nechají růst na L-kultivační půdě při teplotě 37 °C přibližně 16 hodin a uloží se do mikrobanky při teplotě -70 °C. Ztráta plazmidu, kódujícího CS1, se potvrdí analýzou plazmidového profilu derivátů pomocí agarózové gelové elektroforézy. Jako CS1 negativní se potvrdily dva deriváty, byly však stále CS3+.

io 6) Southemův přenos PTL003:

Struktura delečních mutací. Z kultur tří delečních mutací, vypěstovaných na mikrobankovních zásobách, se extrahuje veškeré DNA, digeruje se s restrikční endonukleázou EcoRV, a digerovaná DNA se podrobí elektroforéze agarového gelu pulzujícím polem. DNA se z gelů přenese na nylonové membrány Hybond N+ (obchodní název) a hybriduje se příslušnými sondami DNA standardními způsoby. Výsledky (obr. 6) ukazují, že hybridizující chromosomální fragmenty DNA mutantů jsou kratší než u standardního typu konsistentně s mutacemi, ježjsou delecemi.

Potvrzení nepřítomnosti toxinových tepelně stabilních (ST) a tepelně nestabilních (LT) genů ve kmeni E.coli El392/75-2A

Pro toto potvrzení se použilo genů ST a LT-AB jako sond DNA proti totální DNA z

E1392/75-2A. Totální DNA ztoxin pozitivního ETEC kmene El392/75 byla zařazena jako pozitivní kontrola, zatímco DNA z laboratorního kmene E. coli JMI09 byla zařazena jako negativní kontrola. Hybridizované membrány byly ponechány jednu hodinu pod HyperfilmECL (obchodní název) k získání maximálního signálu. Sondy byly připraveny za použití

PCR splazmidem DNA extrahovaným zE1392/75-2A jako matrice a oligonukleotidů

EST01 a EST02 jako primerů pro ST, nebo LT-R1 a LT-03 pro LT-AB. U totální DNA nedošlo k významné hybridizaci za použití sondy LT-AB nebo ST, přes získání velmi intenzivního signálu z pozitivní kontrolní totální DNA.

Potvrzení nepřítomnosti sekvencí pCVD442 z chromosomu delečních mutantů

Plazmid pCVD442 byl označen a hybridizován na totální DNA z delečních mutantů

PTL001, PTL002 a PTL003 d(generovaných s EcoRV. Celková DNA z kmene ETEC E1392/75-2A byla zařazena jako kontrola. Získal se komplexní obrazec hybridizuj ících fragmentů DNA. Nebyl však významný rozdíl mezi obrazcem získaným pro standardní typ a pro mutant, což naznačuje, že nebyl pravděpodobně v genomech mutantů zanechán žádný zbytkový nukleotid pCVD442. Komplexní obrazec hybridizuj ících fragmentů byl nejpravděpodobněji způsobem sondou pCVD442 hybridizuj ící plazmidem složek DNA kmene Ε1392/75-2A a deriváty mutantů.

-12Tabulka I

Primery PCR

Jméno	Cíl	Použití	Sekvence (5’-3 ’)
TT1	OmpF	Primer A pro klonování	ATC TGT TTG TTG AGC TCA GCA ATC TAT TTG CAA CC
TT2	ΟΛίρΓ	Primer B pro klonování	TTT TTT GCC AGC ATG CCG GCA GCC ACG CGT AGT G
TT3	ompF	Primer C pro klonování	CTC GAG GCT TAG CTC TAT TTA TTA CCC TCA TGG
TT4	ompF	Primer D pro klonování	GAG CTA AGC CTC GAG TAA TAG CAC ACC TCT TTG
TT7	ompC	Primer A pro klonování	TTG CTG GAA AGT CGA CGG ATG TTA ATT ATT TGT G
TT8	ompC	Primer B pro klonování	GGC CAA AGC CGA GCT CAT TCA CCA GCG GCC CGA CG
TT9	ompC	Primer C pro klonování	GCT AAG CCT CGA GTA ATC TCG ATT GAT ATC CG
I TT10	ompC	Primer D pro klonování	CTC GAG GCT TAG CGT TAT TAA CCC TCT GTT

- 13CZ JU13ZU Bfi

TT19	aroC	Primer A pro klonování	CCG CGC TCG CTC I TAG AGT GAA CTG ATC AAC AAT A
TT20	aroC	Primer B pro klonování	ATG CGC GCG AGA GCT CAA CCA GCG TCG CAC TTT G
TT21	aroC	Primer C pro klonování	CTC GAG GCA TGC TGA ΑΤΑ AAA CCG CGA TTG
TT22	aroC	Primer D pro klonování	GCA TGC CCT CGA GGG CTCC GTT ATT GTT GTG
MGR169	CS1	Vazba v CS1 sekvenci	TGA TTC CCT TTG TTG CGA AGG CGA A
MGR170	CS1	Vazba v CSi sekvenci	ATT AAG ATA CCC AAG TAA TAC TCA A
LT-R1	LT-AB	Viz text	GCT TTT AAA GGA TCC TAG TT
LT-03	LT-AB	Viz text	GGT TAT CTT TCC GGA TTG TC
ESTOl	ST	Viz text	CAT GTT CCG GAG GTA ATA TGA A
EST02	ST	Viz text	AGT TCC CTT TAT ATT ATT AAT A
CSAO1	CS1	Viz text	TGG AGT TTA TAT GAA ACT AA
CSA02	CS1	Viz text	TGA CTT AGT CAG GAT AAT TG
CS3-01	CS3	Viz text	ATA CTT ATT AAT AGG TCT TT
CS3-O2	CS3	Viz text	TTG TCG AAG TAA TTG TTA TA

- 14Tabulka II

Cílový gen	Místa použitá ke klonování do pCVD442	Místa zavedená ke skrfningu
	místo 1	místo 2	místo 3	místo 4
aroC	Xbal	Sací	Xhol	Sphl
htrA	Sáli	Sphl	Xhol	Xbal
ompC	Sáli	Sací	Blpl	Xhol
ompF	Sací	Sphl	BlpI	Xhol
ompR	Sáli	Sací	Blpl	Sphl

Příklad 2

Bezpečnost a imunogenicita zeslabeného vakcínového kmene enterotoxigenické E.coli (aroC/10 ompC/ompF) zkoušena na lidech jako dobrovolnících

Studie je zaměřena na vyhodnocení kandidáta živého zeslabeného vakcínového kmene enterotoxigenické E.coli, jmenovitě shora popsaného Δ aroC/AompC/AompF PTL003

Příprava očkovacích dávek vakcíny

Bakteriální kmen se nanese na MacConkeyův agar k zajištění Čistoty a k potvrzení identity a pět kolonií se použije k naočkování baňky obsahující 200 ml kultivační půdy luria. Inkubuje se po dobu osmi hodin při teplotě + 37 °C, načež se do kultivační půdy přidá 30 ml sterilního glycerolu a připraví se podíly (1 ml na fiolu). Sto takových fiol se zmrazí na -70 °C. Tyto fioly obsahují očkovací dávku pro vakcínový kmen.

Čistota očkovací dávky je zaručena výběrem deseti náhodných fiol a jejich testování na bakteriální čistotu a nepřítomnost hub. Další tři fioly se testují ke zjištění počtu bakterií ve fiolách pomocí standardního destičkového načítání se sériovým ředěním kultivační půdy.

Příprava vakcíny

Vakcína se připravuje Čerstvá před každou vakcinaci a všechny stupně přípravy očkovací látky se provádějí v bezpečnostní kabině. Den před vakcinaci se nanese 0,2 ml na povrch destiček agaru luria pomocí chomáčků sterilní vaty k přípravě bakteriálního pole. Tatáž kultivační půda se naočkuje na destičky MacConkey a agar luria k čistotě. Agarové destičky se inkubují 18 hodin při teplotě 37 °C v utěsněném kontejneru s indikačním páskem temperresaistant k zajištění, že destičky nebyly tamperovány během inkubace. Po inkubaci se pole bakterií sklidí 5 ml sterilní solanky pufrované fosfátem (PBS) a změří se optická hustota suspense. Příslušné množství této suspense, odpovídající požadované dávce, se vnesou do lahviček jednotkové dávky se 30 ml hydrogenuhličitanového pufru a podávají se dobrovolníkům. Připraví se zvlášť dávky vakcíny a ponechají se v laboratoři a okamžitě po vakcinaci dobrovolníků se vyhodnotí skutečný počet bakterií v každé dávce pomocí standardního postupu načítání kolon s desetinásobným zředěním vakcíny.

-15VZ JU13ZII BO

Postup zřeďování bakterií byl zřízen během předběžných studií za použití kultur, připravených a inkubovaných přesně jako při přípravě vakcín podávaných dobrovolníkům. Připravily se suspense s počtem živých bakterií očíslovaných počtem kolon sériových zředění a vztažených ke zjiště5 né optické hustotě. Na základě těchto předběžných studií byl vyvinut standardní způsob přípravy a hodnocení správných zředění bakterií k zajištění stanovených dávek.

Příprava pufru

Jako pufru se používá hydrogenuhličitanu sodného ve vodě. Pro každou dávku vakcíny se připraví 150 ml deionizované vody, obsahující 2 gramy hydrogenuhličitanu sodného, a sterilně se zfiltruje. Vnese se 30 ml pufru do 50 ml sterilních fiol a dávka vakcínových bakterií se přidá do těchto fiol. Zbytek 120 ml pufru se vlije do zvláštních sterilních lahví. V době vakcinace se dobrovolníkům podá napřed 120 ml pufru, pak o minutu později 30 ml pufru obsahujícího vakcínu.

Plán vakcinace

Skupina dobrovolníků se studuje způsobem eskalace dávek. První skupina dobrovolníků dostane dávku 5x10⁷ bakterií, druhá skupina dávku přibližně 5x10⁹ a třetí skupina dávku přibližně 5x10⁸.

Po tři dny od čtvrtého dne dostávají dobrovolníci Ciprofloxacin 500 mg BID. Vysadí se šestého dne a provede se hematologie a chemický rozbor pro bezpečnost. Sérum se zachová pro měření protilátek.

Devátý a čtrnáctý den se dobrovolníci vrátí k běžné vizitě pacientů a při tom se provede intervalová historie a získají se vzorky krve k serologickým zkouškám. Celkem se shromáždí krev (40 ml) třikrát pro sérologii, před vakcinaci a devátý a čtrnáctý den po vakcinaci.

Laboratorní testy

Až dva fekální vzorky se kultivují každý den pobytu dobrovolníků v nemocnici. Pro kvalitativní kultury se přenese fekální výtěr do transportního Cary Blairova média a předá se do laboratoře, kde je přímo naočkován na MacConkeyův agar a na MacConkeůyv agar obsahující selektivní antibiotika pro vakcínový kmen. Ukázalo se, že až pět kolonií se sráželo pomocí antiséra speci35 fického pro vakcínový kmen. Ke kvantitativní kultuře (pouze první vzorek každého dne) se fekální vzorky zváží a zředí se v PBS, se sérií 10-násobných zředění do 10^M a pak se 100 μΐ každého zředění nanese na MacConkeůyv agar s antibiotiky. Podezřelé kolonie se potvrdí srážením anti-0 sérem.

Sérum se sbírá a uchová se pro následné zkoušky na protilátky proti antigenům CFAÍI způsobem ELISA a na bakterícidní protilátky proti vakcínovému kmeni. Z plné krve se mononukleámí buňky periferální krve oddělí, shromáždí se do citrátu a promyjí se. Tyto buňky se kultivují při hustotě 10⁷ buněk na ml v médiu tkáňové kultury RPMI 48 hodin při teplotě 48 °C. Po 48 hodinách se supematant přelije do kryofiol a zmrazí se na teplotu -20 °C před vyzkoušením na protilátky IgG a IgA CFAII způsobem ELISA.

- 16Tabulka III

Dnem vakcinace je den □	pře	-1	D	1	2	3	4	5	6	9	14
nábor/ skríning	X
HCD (moč)	X				X
tréning/ souhlas	X
pacient ve stavu		X	X	X	X	X	X	X	X
vakcinace			X
návštěva pacienta	X									X	X
kultury stolice kvantitativní		X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
kultury stolice kvalitativní		X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
sérologie		X								X	X
SBC/chem panel	X								X
Ciprofloxacin 500 mg BID pro 3d							X	X	X

Výsledky:

Žádné příznaky nebyly patrny u žádné skutečné dávky 6,8x10⁷ a 3,7x10⁸. Při větší dávce io 4,7xl0⁹ měla 1/6 dobrovolníků průjem a 2/6 měly křeče v břiše. Bakteriální úbytek byl patrný u všech dobrovolníků pri velikosti dávek 5x10⁹ cfu první den po vakcinaci, dokud nenastartoval podle protokolu ciprofloxacin Čtvrtý den po vakcinaci. To indikuje dobrou střevní kolonizaci, což je indikativní pro možné zavedení dobré imunitní odezvy. Pri obou nižších dávkách byl vakcínový kmen získán od všech dobrovolníků alespoň v jednom bodě po vakcinaci, avšak doba exkrece byla snížena ve srovnání s dobou, která byla patrná při nejvyšší dávce.

V době podání přihlášky byla analýza imunitní odezvy, vyvolané vakcínou neúplná. Byly však analysovány IgA odezvy anti-CFA II v supematantech kultury PBMNC vyčištěné od krevních recipientů nejvyšší dávky vakcíny v den 0 (před vakcinaci) a sedmý a desátý den po vakcinaci (obr. 7). Supematanty byly analyzovány způsobem ELISA na zkušebních destičkách povlečených vyčištěným antigenem CFAII. Hodnoty OD, pozorované na vzorcích od sedmého do desátého dne, byly významně vyšší než hodnoty u vzorků před vakcinaci, což dokazuje navození specifické odezvy IgA v těchto časových bodech. Podle očekávaní vykazují odezvy vrchol sedmý den a sníženy jsou desátý den, což je konsistentní se sekrecí primovaných buněk IgA sekretují25 cích B buňky z krve ke sliznicovým efektorovým místům střevní asociované lymfoidní („Gut Associated Lymfoid“) tkáně.

- 17CL JU10ZU BO

Závěry:

Ukázalo se, že zeslabený živý kmen ETEC (aroC/ompC/OmpF) je dobře snášen zdravými dos5 pělými dobrovolníky a kolonizuje vnitřnosti způsobem konsistentním s jejich použitím jako orální vakcíny k ochraně proti cestovatelskému průjmu. Bylo také doloženo vyvolání specifické imunitní odezvy sliznic.

io Průmyslová využitelnost

Zeslabený živý kmen ETEC (aroC/ompC/OmpF) pro výrobu vakcín zvláště k ochraně proti cestovatelskému průjmu.

¹⁵ Literatura

1. Bacon G. A., Buitows T. W. a Yates M., Br. J. Exp. Pathol., 31, str. 714 až 24, 1950;

2. Chatfield S. N., Charles I. G., Makoff A. J. a kol, Biotech. 10, str. 888 až 892, 1992a;

3. Chatfield S, N., StrahanK., Pickard D., Charlesi. G., Hormaeche C. E. a Douga G., Microbiol. Pathog. 12, str. 145 až 151, 1992b;

4. Curtiss III, R. a Kelly S. M., Infect. Immun. 55, str. 3035 až 3043, 1987;

5. Dougan G., Chatfield S., Pickard D., Bester J., O'Callaghan D. a Maskell D., J. Inf. Dis. 158, str. 1329 až 1335,1988;

6. Fairweather N, F., Chatfield S. N., Makoff A. J. a kol. Infect. Immun. 58, str. 1323 až 1329, 1990;

7. Gomaz-Duarte O. G., Galen I, Chatfield S. N., Vaccine 13, str. 1596 až 1602, 1995;

8. Hohmann E. L., Oletta C. A., Killeen K. P. a Miller S. I., Vaccine 14, str. 19 až 24, 1996;

9. Hone D., Morona R., Attridge S. a Hackett J., J. Infect. Dis., 156, str. 167 až 1, (1987);

10. Jones P. W., Dougan G., Haywood C., MacKensie N., Collins P. a Chatfield S. N., Vaccine 9, str. 29 až 36,1991;

11. LevineN. M., Galen J., Barry E. a kol., J. Biotech. 44, str. 193 až 196, 1995;

12. Miller S. L, Kukral A. M, a Mekalanos J. J., Proč, Nat. Acad, Sci, USA 86, str. 5054 až 5058, 1989;

13. Pickard D., Li J. L., Roberts M., Maskell D., Hone D., Levine M., Douglas G. a Chatfield S., Infection and Immunity 62, str. 3984 až 3993, 1994;

14. Sambrook J., Fritsch E. F. a Maniatis T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989;

15. Strugnell R. A., Dougan G., Chatfield S. N., a kok, Infect. Immun. 60, str. 3994 až 4002, 1992;

16. EP-B-0322237 (Doudan a kok);

17. EP-B-0400958 (Dougan a kol);

18. EP-B-0524205 (Dougan a kok);

19. WO 92/15689 (Charles a kok);

20. Everest P., Allen J. Papakonstantinopoulou A,, Mastroeni P., Roberts M. a Dougan G., FEMS Microbiol. Letts., 126, str. 97 až 101,1995;

21. Chatfield S. N., Dorman C. J., Hayward C. a Dougan G., Infection & Immunity 59, str. 449 až 452, 1991;

22. Donnenberg M. S. a Kaper J. B., Infection and Immunity 59, str. 4310 až 4317 (1991).

-18Seznam sekvencí (1) Obecné informace

i) Přihlašovatel

A) Jméno: Peptide Therapeutics Limited

B) Ulice: 100 Fulboum Red

C) Město: Cambridge

D) Stát: není použitelné

E) Země: Spojené království ío F) Poštovní kód (ZIP): CB1 9PT ii) Název vynálezu: Zeslabená bakterie nevratnou mutací, vakcína, která ji obsahuje a její použití iii) Počet sekvencí: 6 iv) Forma pro počítač

A) Typ média: Floppy disk

B) Počítač: IBM PC kompatibilní

C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D) Software: Patentln Release # LO. Version # 1.30 (EPO)

v) Platné přihlašovací údaje

Číslo přihlášky:

(2) Informace o sekv. ID, Č. 1

i) Charakteristiky sekvence A) Délka: 1690 párů bází

B) Typ: nukleová kyselina

C) Řetězcovitost: dva řetězce

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomická) vi) Zdroj původů

A) Organizmus: aroC E. coli ix) Charakteristiky

A) Jméno/klíč: CDS

B) lokace: 492..1562 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1 35

-19V Z. JU1DAU DD

GTC5ACGCQG TGGATATCTC TCCAGACGCG CTGGCGGTTG CTGAACAGAA CATCGAA6AA 60

CACGGTCTGA TCCACAACGT CATTCCGATT CGTTCCGATC TGTTCCGCGA CTTGCCGAAA 120

GTGCAGTACG ACCTGATTGT CACTAACCCG CCGTATGTCG ATGCGAAGAT ATGTCCGACC 180

TGCCAAACAA TACCGCCACG AGCCGGAACT GGGCCTGGCA TCTGGCACTG ACGGCCTGAA 240

ACTGACGCGT CGCATTCTCG GTAACGCGGC AGA7TACCTT GCTGATGATG GCGTGTTGAT 300

TTGTGAAGTC GGCAACAGCA TGGTACATCT TATGGAACAA TATCCGGATG TTCCGTTCAC 360

CTGGCTGGAG TTTGATAACG GCGGCGATGG TGTGTTTATG CTCACCAAAG AGCAGCTTAT 420

TGCCGCACGA GAACATTTCG CGATTTATAA AGATTAAGTA AACACGCAAA CACAACAATA 480

ACGGAGCCGT G ATG GCT GGA AAC ACA ATT GGA CAA CTC TTT CGC GTA ACC 530

Met Ala Gly Asn Thr Ile Gly Gin Leu Phe Arg Val Thr

5 10

ACC TTC GGC GAA TCG CAC GGG CTG GCG CTC GGC TGC ATC GTC GAT GGT 578

Thr Phe Gly Glu Ser His Gly Leu Ala Leu Gly Cys Ile Val Asp Gly

20 25

GTT CCG CCA GGC ATT CCG CTG ACG GAA GCG GAC CTG CAA CAT GAC CTC 626

Val Pro Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu Ala Asp Leu Gin His Asp Leu

35 40 45

GAC CGT CGT CGC CCT GGG ACA TCG CGC TAT ACC ACC CAG CGC CGC GAG 674

Asp Arg Arg Arg Pro Gly Thr Ser Arg Tyr Thr Thr Gin Arg Arg Glu

55 60

CCG GAT CAG GTC AAA ATT CTC TCC GGT GTT TTT GAA GGC GTT ACT ACC 722

Pro A&h Gin Val Lys Ile Leu Ser Gly Val Phe Glu Gly Val Thr Thr

70 75

GGC ACC AGC ATT GGC TTG TTG ATC GAA AAC ACT GAC CAG CGC TCT CAG 770

-20818

Gly Thr Ser Ile Gly Leu Leu Ile Glu Asn Thr Asp Gin Arg Ser Gin 80 85 90

GAT TAC AGT GCG AH AAG GAC GH TTC CGT CCA GGC CAT GCC GAT TAC

Asp Tyr Ser Ala Ile Lys Asp Val Phe Arg Pro Gly His Ala Asp Tyr

100 105

ACC TAC GAA CAA AAA TAC GGT CTG CGC GAT TAT CGC GGC GGT GGA CGT

Thr Tyr Glu Gin Lys Tyr Gly Leu Arg Asp Tyr Arg Gly Gly Gly Arg

110 115 120 125

TCT TCC GCC CGC GAA ACC GCC ATG CGC GTG GCG GCA GGA GCT ATT GCC

Ser Ser Ala Arg Glu Thr Ala Met Arg Val Ala Ala Gly Ala Ile Ala

130 135 140

AAA AAA TAT CTC GCC GAG AAA ΠΤ GGT AH GAA ATC CGT GGC TGC CTG

Lys Lys Tyr Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ile Arg Gly Cys Leu

145 150 155

ACC CAG ATG GGC GAC ΑΠ CCG CTG GAT ATC AAA GAC TGG TCG CAG GTC

Thr Gin Met Gly Asp Ile Pro Leu Asp Ile Lys Asp Trp Ser Gin Val

160 165 170

GAG CAA AAT CCG TTT TTT TGC CCG GAC CCC GAC AAA ATC GAC GCG HA

Glu Gin Asn Pro Phe Phe Cys Pro Asp Pro Asp Lys Ile Asp Ala Leu

175 180 185

GAC GAG HG ATG CGT GCG CTG AAA AAA GAG GGC GAC TCC ATC GGC GCT

Asp Glu Leu Met Arg Ala Leu Lys Lys Glu Gly Asp Ser Ile Gly Ala

190 195 200 205

AAA GTC ACC GTT GTT GCC AGT GGC GH CCT GCC GGA CH GGC GAG CCG

Lys Val Thr Val Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Gly Leu Gly Glu Pro

210 215 220

GTC TH GAC CGC CTG GAT GCT GAC ATC GCC CAT GCG CTG ATG AfíC ATC

Val Phe Asp Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ala His Ala Leu Met Ser Ile

866

914

962

1010

1058

1106

1154

1202

-21 CZ 301520 B6

225 230 235

AAC GCG GTG AAA GGC GTG GAA ATT GGC GAC GGC TTT GAC GTG GTG GCG 1250

Asn Ala Val Lys Gly Val Glu Ile Gly Asp Gly Phe Asp Val Val Ala

240 245 250

CTG CGC GGC AGC CAG AAC CGC GAT GAA ATC ACC AAA GAC GGT TTC CAG 1298

Leu Arg Gly Ser Gin Asn Arg Asp Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe Gin

255 260 265

AGC AAC CAT GCG GGC GGC ATT CTC GGC GGT ATC AGC AGC GGG CAG CAA 1346

Ser Asn His Ala Gly Gly Ile Leu Gly Gly I1e Ser Ser Gly Gin Gin

270 275 280 285

ATC ATT GCC CAT ATG GCG CTG AAA CCG ACC TCC AGC AK ACC GTG CCG 1394

Ile Ile Ala His Het Ala Leu Lys Pro Thr Ser Ser Ile Thr Val Pro

290 295 300

GGT CGT ACC ATT AAC CGC TTT GGC GAA GAA GTT GAG ATG ATC ACC AAA 1442

Gly Arg Thr Ile Asn Arg Phe Gly Glu Glu Val Glu Met Ile Thr Lys

305 310 315

GGC CGT CAC GAT CCC TGT GTC GGG ATC CGC GCA GTG CCG ATC GCA GAA 1490

Gly Arg His Asp Pro Cys Val Gly Ile Arg Ala Val Pro Ile Ala Glu

320 325 330

GCG AAT GCT GGC GAT CGT Τπ AAT GGA TCA CCT GTT ACG GCA ACG GGC 1538

Ala Asn Ala Gly Asp Arg Phe Asn Gly Ser Pro Val Thr Ala Thr Gly

335 340 345

GCA AAA TGC CGA TGT GAA GAC TGA TATTCCACGC TGGTAAAAAA TGAATAAAAC 1592 Ala Lys Cys Arg Cys Glu Asp *

350 355

CGCGATTGCG CTGCTGGCTC TGCTTGCCAG TAGCGCCAGC CTGGCAGCGA CGCCGTGGCA 1652

AAAAATAACC CAACCTGTGC CGGGTAGCGC CAAATCGA 1690

-222. Informace o sekv. ID. Č. 2

i) Charakteristiky sekvence

A) Délka: 356 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2

Met Ala Gly Asn Thr Ile Gly Gin Leu Phe Arg Val Thr Thr Phe Gly 15 10 15

Glu Ser His Gly Leu Ala Leu Gly Cys Ile Val Asp Gly Val Pro Pro 20 25 30

Gly Ile Pro Leu Thr Glu Ala Asp Leu Gin His Asp Leu Asp Arg Arg 35 40 45

Arg Pro Gly Thr Ser Arg Tyr Thr Thr Gin Arg Arg Glu Pro Asp Gin 50 55 60

Val Lys Ile Leu Ser Gly Val Phe Glu Gly Val Thr Thr Gly Thr Ser 65 70 75 80

Ile Gly Leu Leu Ile Glu Asn Thr Asp Gin Arg Ser Gin Asp Tyr Ser 85 90 95

Ala Ile Lys Asp Val Phe Arg Pro Gly His Ala Asp Tyr Thr Tyr Glu 100 105 110

Gin Lys Tyr Gly Leu Arg Asp Tyr Arg Gly Gly Gly Arg Ser Ser Ala 115 120 125

Arg Glu Thr Ala Met Arg Val Ala Ala Gly Ala Ile Ala Lys Lys Tyr 130 135 140

-23Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ile Arg Gly Cys Leu Thr Gin Het

145 150 155 160

Gly Asp Ile Pro Leu Asp Ile Lys Asp Trp Ser Gin Val Glu Gin Asn

165 170 175

Pro Phe Phe Cys Pro Asp Pro Asp Lys Ile Asp Ala Leu Asp Glu Leu 180 185 190

Het Arg Ala Leu Lys Lys Glu Gly Asp Ser Ile Gly Ala Lys Val Thr 195 200 205

Val Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Gly Leu Gly Glu Pro Val Phe Asp 210 215 220

Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ala His Ala Leu Met Ser Ile Asn Ala Val

225 230 235 240

Lys Gly Val Glu Ile Gly Asp Gly Phe Asp Val Val Ala Leu Arg Gly

245 250 255

Ser Gin Asn Arg Asp Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe Gin Ser Asn His 260 265 270

Ala Gly Gly Ile Leu Gly Gly Ile Ser Ser Gly Gin Gin Ile Ile Ala 275 280 285

His Met Ala Leu Lys Pro Thr Ser Ser Ile Thr Val Pro Gly Arg Thr 290 295 300

Ile Asn Arg Phe Gly Glu Glu Val Glu Het Ile Thr Lys Gly Arg His 305 310 315 320

Asp Pro Cys Val Gly Ile Arg Ala Val Pro Ile Ala Glu Ala Asn Ala 325 330 335

-24Gly Asp Arg Phe Asn Gly Ser Pro Val Thr Ala Thr Gly Ala Lys Cys 340 345 350

Arg Cys Glu Asp * 355

2.

io

Informace o sekv. ID. Č. 3

i) Charakteristiky sekvence

A) Délka: 1713 párů bází

B) Typ: nukleová kyselina

C) Řetězcovitost: dva řetězce

D) Topologie: lineární íí) Typ molekuly: DNA (genomická) vi) Zdroj původu

A) Organizmus: ompC E. coli ix) Charakteristiky

A) Jméno/klíč: CDS

B) lokace: 491..1594 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3

GTTAACAAGC GTTATAGTTT TTCTGTQGIA GCACAGAATA ATGAAAAGTG TGTAAAGAAG 60

GGTAAAAAAA ACCGAATGCG AGGCATCCGG TTGAAATAGG GGTAAACAGA CATTCAGAAA 120

TGAATGACGG TAATAAATAA AGTTAATGAT GATAGCGGGA GTTATTCTAG TTGCGAGTGA 180

AGGTnTGTT TTGACATTCA GTGCTGTCAA ATACTTAAGA ATAAGTTATT GATTTTAACC 240

ITGAATTATT ATTGCTTGAT GTTAGGTGCT TATTTCGCCA TTCCGCAATA ATCTTAAAAA 300

GTTCCCTTGC ATTTACATTT TGAAACATCT ATAGCGATAA ATGAAACATC TTAAAAGTTT 360

-25LZ JU19AU tJO

TAGTATCATA KCGTGKGG AKAKCTGC ATTKTGGGG AGAATGGACT TGCCGACTGA 420

KAATGAGGG KAATCAGTA TGCAGTGGCA TAAAAAAGCA AATAAAGGCA TATAACAGAG 480

GGKAATAAC ATG AAA GK AAA GTA CTG TCC CTC CTG GTC CCA GCT CTG 529

Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu

360 365 370

CTG GTA GCA GGC GCA GCA AAC GCT GCT GAA GK TAC AAC AAA GAC GGC 577

Leu Val Ala Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly

375 380 385

AAC AAA KA GAT CTG TAC GGT AAA GTA GAC GGC CTG CAC TAT KC TCT 625

Asn Lys Leu Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser

390 395 400

GAC AAC AAA GAT GTA GAT GGC GAC CAG ACC TAC ATG CGT CK GGC TTC 673

Asp Asn Lys Asp Val Asp Gly Asp Gin Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe

405 410 415

AAA GGT GAA ACT CAG GK ACT GAC CAG CTG ACC GGT TAC GGC CAG TGG 721

Lys Gly Glu Thr Gin Val Thr Asp Gin Leu Thr Gly Tyr Gly Gin Trp

420 425 430

GAA TAT CAG ATC CAG GGC AAC AGC GCT GAA AAC GAA AAC AAC TCC TGG 769

Glu Tyr Gin Ile Gin Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp

435 440 445 450

ACC CGT GTG GCA TTC GCA GGT CTG AAA KC CAG GAT GTG GGT TCT KC 817

Thr Arg Val Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gin Asp Val Gly Ser Phe

455 460 465

GAC ΤΛ GGT CGT AAC TAC GGC GK GK TAT GAC GTA ACT TCC TGG ACC 865

Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr

470 475 480

-26GAC GTA CTG CCA GAA TTC GGT GGT GAC ACC TAC GGT TCT GAC AAC TTC 913

Asp Val Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe

485 490 495

ATG CAG CAG CGT GGT AAC GGC TTC GCG ACC TAC CGT AAC ACT GAC TTC 961

Het Gin Gin Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe

500 505 510

TTC GGT CTG GTT GAC GGC CTG AAC TTT GCT GTT CAG TAC CAG GGT AAA 100$

Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gin Tyr Gin Gly Lys

515 520 525 530

AAC GGC AAC CCA TCT GGT GAA GGC TTT ACT AGT GGC GTA ACT AAC AAC 1057

Asn Gly Asn Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn

535 540 545

GGT CGT GAC GCA CTG CGT CAA AAC GGC GAC GGC GTC GGC GGT TCT ATC 1105

Gly Arg Asp Ala Leu Arg Gin Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile

550 555 560

ACT TAT GAT TAC GAA GGT TTC GGT ATC GGT GGT GCG ATC TCC AGC TCC 1153

Thr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser

565 570 575

AAA CGT ACT GAT GCT CAG AAC ACC GCT GCT TAC ATC GGT AAC GGC GAC 1201

Lys Arg Thr Asp Ala Gin Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp

580 585 590

CGT GCT GAA ACC TAC ACT GGT GGT CTG AAA TAC GAC GCT AAC AAC ATC 1249

Arg Ala Glu Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile

595 600 605 610

TAC CTG GCT GCT CAG TAC ACC CAG ACC TAC AAC GCA ACT CGC GTA GGT 1297

Tyr Le&Ala Ala Gin Tyr Thr Gin Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly

615 620 625

TCC CTG GGT TGG GCG AAC AAA GCA CAG AAC TTC GAA GCT GTT GCT CAG 1345

-27CZ JU152U Bó

Ser Leu Gly Trp Ala Asn Lys Ala Gin Asn Phe Glu Ala Val Ala Gin 630 635 640

TAC CAG TTC GAC TTC GGT CTG CGT CCG TCC CTG GCT TAC CTG CAG TCT

Tyr Gin Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gin Ser

645 650 655

AAA GGT AAA AAC CTG GGT CGT GGC TAC GAC GAC GAA GAT ATC CTG AAA

Lys Gly Lys Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys

660 665 670

TAT GTT GAT GTT GGT GCT ACC TAC TAC TTC AAC AAA AAC ATG TCC ACC

Tyr Val Asp Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr

675 680 685 690

TAC GTT GAC TAC AAA ATC AAC CTG CTG GAC GAC AAC CAG TTC ACT CGT

Tyr Val Asp Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gin Phe Thr Arg

695 700 705

GAC GCT GGC ATC AAC ACT GAT AAC ATC GTA GCT CTG GGT CTG GTT TAC

Asp Ala Gly Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr

710 715 720

CAG TTC TAA TCTCGATTGA TATCGAACAA GGGCCTGCGG GCCCTTTTTT Gin Phe *

725

CATTGTTTTC AGCGTACAAA CTCAGTTTTT TGGTGTACTC TTGCGACCGT TCGCATGAGG

ATAATCACGT ACGGAAATA

2. Informace o sekv. ID. Č. 4

i) Charakteristiky sekvence

A) Délka: 367 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4

1393

1441

1489

1537

1585

1634

1694

1713

-28Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu Leu Val Ala 15 10 15

Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu 20 25 30

Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser Asp Asn Lys 35 40 45

Asp Val Asp Gly Asp Gin Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu 50 55 60

Thr Gin Val Thr Asp Gin Leu Thr Gly Tyr Gly Gin Trp Glu Tyr Gin 65 70 75 80

Ile Gin Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp Thr Arg Val 85 90 95

Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gin Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly 100 105 110

Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr Asp Val Leu 115 120 125

Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe Met Gin Gin 130 135 140

Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe Phe Gly Leu

145 150 155 160

Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gin Tyr Gin Gly Lys Asn Gly Asn

165 170 175

-29CL JU13ZU ΒΟ

Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly Arg Asp 180 185 190

Ala Leu Arg Gin Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Thr Tyr Asp 195 200 205

Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser Lys Arg Thr 210 215 220

Asp Ala Gin Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp Arg Ala Glu

225 230 235 240

Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala

245 250 255

Ala Gin Tyr Thr Gin Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly Ser Leu Gly 260 265 270

Trp Ala Asn Lys Ala Gin Asn Phe Glu Ala Val Ala Gin Tyr Gin Phe 275 280 285

Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gin Ser Lys Gly Lys 290 295 300

Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys Tyr Val Asp 305 310 315 320

Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Het Ser Thr Tyr Val Asp 325 330 335

Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gin Phe Thr Arg Asp Ala Gly 340 345 350

Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr Gin Phe * 355 360 365

-302. Informace o sekv. ID. Č. 5

i) Charakteristiky sekvence A) Délka: 1808 párů bází

B) Typ: nukleová kyselina

C) Řetězcovitost: dva řetězce

D) Topologie: lineární

ϋ) Typ molekuly: DNA (genomická) vi) Zdroj původu io A) Organizmus: ompF E. coli ix) Charakteristiky

A) Jméno/klíě: CDS

B) loxace: hó/.-ijh·.?

xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5 15

AAAACTAATC CGCATTCTTA nGCGGATTA GTTTTTTCn AGCTAATAGC ACAATTTTCA 60

TACTATTTTT TGGCATTCTG GATGTCTGAA AGAAGATTTT GTGCCAGGTC GATAAAGTÍT 120

CCATCAGAAA CAAAATTTCC GTTTAGTTAA ΤΤΓΑΑΑΤΑΤΑ AGGAAATCAT ATAAATAGAT 180

TAAAATTGCT GTAAATATCA TCACGTCTCT ATGGAAATAT GACGGTGTTC ACAAAGTTCC 240

TTAAATTTTA CTTTTGGTTA CATATTTTTT CTTTTTGAAA CCAAATCTTT ATCTTTGTAG 300

CACTTTCACG GTAGCGAAAC GHAGKTGA ATGGAAAGAT GCCTGCAGAC ACATAAAGAC 360

ACCAAACTCT CATCAATAGT TCCGTAAATT TTTATTGACA GAACTTATTG ACGGCAGTGG 420

CAGGTGTCAT AAAAAAAACC ATGAGGGTAA TAAATA ATG ATG AAG CGC AAT ATT 474 Met Met Lys Arg Asn Ile

5

-31 CTG GCA GTG ATC GTC CCT GCT CTG TTA GTA GCA GGT ACT GCA AAC GCT 522

Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val Ala Gly Thr Ala Asn Ala

15 20

GCA GAA ATC JAT AAC AAA GAT GGC AAC AAA GTA GAT CTG TAC GGT AAA 570

Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Val Asp Leu Tyr Gly Lys

30 35

GCT GTT GGT CTG CAT TAT TTT TCC AAG GGT AAC GGT GAA AAC AGT TAC 618

Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly Asn Gly Glu Asn Ser Tyr

45 50

GGT GGC AAT GGC GAC ATG ACC TAT GCC CGT CTT GGT TTT AAA GGG GAA 666

Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu

60 65 70

ACT CAA ATC AAT TCC GAT CTG ACC GGT TAT GGT CAG TGG GAA TAT AAC 714

Thr Gin Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr Gly Gin Trp Glu Tyr Asn

80 85

TTC CAG GGT AAC AAC TCT GAA GGC GCT GAC GCT CAA ACT GGT AAC AAA 762

Phe Gin Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp Ala Gin Thr Gly Asn Lys

95 100

ACG CGT CTG GCA TTC GCG GGT CH AAA TAC GCT GAC GTT GGT TCT TTC 810

Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Val Gly Ser Phe

105 110 115

GAT TAC GGC CGT AAC TAC GGT GTG GTT TAT GAT GCA CTG GGT TAC ACC 858

Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Ala Leu Gly Tyr Thr

120 125 130

GAT ATG CTG CCA GAA TTT GGT GGT GAT ACT GCA TAC AGC GAT GAC TTC 906

Asp MW Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Asp Asp Phe

135 140 145 150

TTC GTT GGT CGT GTT GGC GGC GTT GCT ACC TAT CGT AAC TCC AAC TTC 954

-32Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Asn Phe 155 160 165

TTT GGT CTG GTT GAT GGC CTG AAC TTC GCT GTT CAG TAC CTG GGT AAA 1002

Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gin Tyr Leu Gly Lys

170 175 180

AAC GAG CGT GAC ACT GCA CGC CGT TCT AAC GGC GAC GGT GTT GGC GGT 1050

Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly

185 190 195

TCT ATC AGC TAC GAA TAC GAA GGC TTT GGT ATC GTT GGT GCT TAT GGT 1098

Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Val Gly Ala Tyr Gly

200 205 210

GCA GCT GAC CGT ACC AAC CTG CAA GAA GCT CAA CCT CH GGC AAC GGT 1146

Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gin Glu Ala Gin Pro Leu Gly Asn Gly

215 220 225 230

AAA AAA GCT GAA CAG TGG GCT ACT GGT CTG AAG TAC GAC GCG AAC AAC 1194

Lys Lys Ala Glu Gin Trp Ala Thr Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn

235 240 245

ATC TAC CTG GCA GCG AAC TAC GGT GAA ACC CGT AAC GCT ACG CCG ATC 1242

Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr Arg Asn Ala Thr Pro Ile

250 255 260

ACT AAT AAA TTT ACA AAC ACC AGC GGC TTC GCC AAC AAA ACG CAA GAC 1290

Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe Ala Asn Lys Thr Gin Asp

265 270 275

GTT CTG TTA GTT GCG CAA TAC CAG TTC GAT TTC GGT CTG CGT CCG TCC 1338

Val Leu Leu Val Ala Gin Tyr Gin Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser

290 285 290

ATC GCT TAC ACC AAA TCT AAA GCG AAA GAC GTA GAA GGT ATC GGT GAT 1386

Ile Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp Val Glu Gly Ile Gly Asp

-33295 300 305 310

GTT GAT CTG GTG AAC TAC TTT GAA GTG GGC GCA ACC TAC TAC TTC AAC

Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn

315 320 325

AAA AAC ATG TCC ACC TAT GTT GAC TAC ATC ATC AAC CAG ATC GAT TCT

Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile Ile Asn Gin Ile Asp Ser

330 335 340

GAC AAC AAA CTG GGC GTA GGT TCA GAC GAC ACC GTT GCT GTG GGT ATC

Asp Asn Lys Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp Thr Val Ala Val Gly Ile

345 350

GH TAC CAG TTC TAA TAGCACACCT C' Val Tyr Gin Phe *

360

GGTCCTGTTT TTTTTATACC TTCCAGAGCA

TTCATCAGTA ATAGTTGGAA TTTTGTAAAT

CTGTAACCAT AATGGAACCT CGTCATGTTT

ATTCTGGGCC TGGCCGATCT GTTTCGTGCC

1434

1482

1530

1585

1645

1705

1765

1808

355

TTGTTAAA TGCCGAAAAA ACAGGACTTT

ATCTCACGTC TTGCAAAAAC AGCCTGCGTT

CTCCCGTTAC CCTGATAGCG GACTTCCCTT

GAGAACATTA CCGCCGCTCC TGCCGACCCG

GATGAACGTC CCG

2. Informace o sekv. ID. Č. 6

i) Charakteristiky sekvence

A) Délka: 362 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi)

Popis sekvence: SEQ ID NO:6

-34Het Met Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val 15 10 15

Ala Gly Thr Ala Asn Ala Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys 20 25 30

Val Asp Leu Tyr Gly Lys Ala Val Gly Leu H1s Tyr Phe Ser Lys Gly 35 40 45

Asn Gly Glu Asn Ser Tyr Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg 50 55 60

Leu Gly Phe Lys Gly Glu Thr Gin Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr 65 70 75 80

Gly Gin Trp Glu Tyr Asn Phe Gin Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp 85 90 95

Ala Gin Thr Gly Asn Lys Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr 100 105 110

Ala Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr 115 120 125

Asp Ala Leu Gly Tyr Thr Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr 130 135 140

Ala Tyr Ser Asp Asp Phe Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr

145 150 155 160

Tyr Arg Asn Ser Asn Phe Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala

165 170 175

Val Gin Tyr Leu Gly Lys Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn 180. 185 190

Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly

-35195 200 205

Ile Val Gly Ala Tyr Gly Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gin Glu Ala 210 215 220

Gin Pro Leu Gly Asn Gly Lys Lys Ala Glu Gin Trp Ala Thr Gly Leu

225 230 235 240

Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr

245 250 255

Arg Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe 260 265 270

Ala Asn Lys Thr Gin Asp Val Leu Leu Val Ala Gin Tyr Gin Phe Asp 275 280 285

Phe Gly Leu Arg Pro Ser Ile Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp 290 295 300

Val Glu Gly Ile Gly Asp Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly

305 310 315 320

Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile

325 330 335

Ile Asn Gin Ile Asp Ser Asp Asn Lys Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp 340 345 350

Thr Val Ala Val Gly Ile Val Tyr Gin Phe *

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   I. Zeslabená bakterie nevratnou knock-out-mutací v každém z genů aroC, ompF a ompC volená z rodu Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella a Brucella.

   io
2. 2, Zeslabená bakterie podle nároku 1 volená z rodu Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella choleraesuis, Salmonella dublin, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia enterocolitica, Bordetella pertussis a Brucella abortus.

   15
3. 3. Zeslabená bakterie podle nároku 2, kterou je kmen enterotoxigenní Escherichia coli (ETEC).
4. 4. Zeslabená bakterie podle nároků 1 až 3, která je přídavně zeslabená mutací ve čtvrtém genu.
5. 5. Zeslabená bakterie podle nároku 4, přičemž Čtvrtým genem je aroA, aroD, aroE, pur, htrA,

   20 galE, cya, crp, phoP nebo surA.
6. 6. Zeslabená bakterie podle nároků 1 až 5, přičemž mutací v každém genu je definovaná mutace.

   25
7. 7. Zeslabená bakterie podle nároků 1 až 6, přičemž mutací v každém genu je delece celé kóduj ící sekvence.
8. 8. Zeslabená bakterie podle nároků 1 až 7, která je geneticky konstruovaná k expresi heterologového antigenů.
9. 9. Zeslabená bakterie podle nároku 8, přičemž exprese antigenů je hnána promotorem nirB nebo promotorem htrA.
10. 10. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje zeslabenou bakterii podle nároků 1 až

    35 9 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

    II. Zeslabená bakterie podle nároků 1 až 9 pro použití k vakcinaci lidí nebo zvířat.
11. 12. Buňka enterotoxigenní Escherichia coli podle nároku 3 pro použití k vakcinaci lidí nebo zví40 řat proti průjmu.
12. 13. Použití zeslabené bakterie podle nároků 1 až 9 pro výrobu léčiva pro vakcinaci lidí nebo zvířat.