KR20020018193A - 감염의 치료를 위한 감쇠된 미생물 - Google Patents
감염의 치료를 위한 감쇠된 미생물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20020018193A KR20020018193A KR1020017014154A KR20017014154A KR20020018193A KR 20020018193 A KR20020018193 A KR 20020018193A KR 1020017014154 A KR1020017014154 A KR 1020017014154A KR 20017014154 A KR20017014154 A KR 20017014154A KR 20020018193 A KR20020018193 A KR 20020018193A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- aroc
- microorganism
- ssav
- mutation
- microorganism according
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 45
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 32
- 101100533947 Mus musculus Serpina3k gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101100257418 Mus musculus Serpina3n gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract 3
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 claims description 71
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 claims description 51
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 39
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 claims description 36
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 claims description 8
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 4
- 101100532775 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) sctL2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 101150116294 ssaJ gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 claims description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 32
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 31
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 7
- 101150032013 ssaV gene Proteins 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 3
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 201000005789 splenic abscess Diseases 0.000 description 3
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 2
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 2
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 2
- 101000823106 Equus caballus Alpha-1-antiproteinase 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 206010024652 Liver abscess Diseases 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 101150040872 aroE gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 101100163490 Alkalihalobacillus halodurans (strain ATCC BAA-125 / DSM 18197 / FERM 7344 / JCM 9153 / C-125) aroA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 244000135860 Capparis spinosa subsp spinosa Species 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100399296 Mus musculus Lime1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108700008969 Salmonella SPI-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000405383 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 Species 0.000 description 1
- 241001607429 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. SL1344 Species 0.000 description 1
- 101100422341 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) ssaL gene Proteins 0.000 description 1
- 101100422342 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) ssaM gene Proteins 0.000 description 1
- 101100422343 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) ssaO gene Proteins 0.000 description 1
- 101100311018 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) ssaQ gene Proteins 0.000 description 1
- 101100311020 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) ssaS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100311022 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) ssaT gene Proteins 0.000 description 1
- 101100311023 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) ssaU gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 235000018936 Vitellaria paradoxa Nutrition 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 101150102858 aroD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150108612 aroQ gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 230000008102 immune modulation Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 101150002764 purA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 231100000279 safety data Toxicity 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 101150012196 ssaP gene Proteins 0.000 description 1
- -1 ssaR Proteins 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 229960001266 typhoid vaccines Drugs 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 229940104152 vivotif Drugs 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/255—Salmonella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/42—Salmonella
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
살모넬라 미생물은 Spi2 병원성 아일랜드내에 위치한 기구 유전자의 발현을 파괴하는 감쇠한 돌연변이 및 영양요구 돌연변이를 갖는다. 따라서 미생물은 면역 반응을 유도하는 미생물의 효과를 유지하면서 미생물의 반응성을 예방하는 것을 돕는 이중 돌연변이를 갖는다.
Description
감쇠된 생(生) 미생물은 매우 효과적인 백신이라고 잘 입증되어 있다; 그러한 백신에 의해 유도된 면역 반응들은 비-복제 면역원에 의해 생성된 것들보다 종종 더 큰 규모이고 더 오래 지속된다. 이에 대한 한 설명으로 감쇠된 생 균주들은 숙주내에서 제한된 감염을 확립하고, 자연 감염의 초기 단계를 모사(mimic)한다는 것일 수 있다. 또한, 사멸된 조제물(preparation)과는 달리, 생 백신은 마크로파지(macrophage)같은 항원-제시 세포내에서 복제하는 능력과 연관될 수 있는 유력한 세포-중개(mediated) 반응을 유도할 수 있다.
동물 및 인간에게 살모넬라증(salmonellosis)의 예방을 위한 안전하고 효과적인 백신으로 감쇠된 살모넬라 생 백신을 사용하는 것은 오랜 역사를 갖는다. 사실, Swiss Serum Vaccine Institute에 의해 제조된 감쇠된 경구용 장티푸스 생 백신인 Ty21a(Vivotif)는 장티푸스 열병의 예방을 위한 매우 성공적인 백신임이 증명되어 왔고, 미국 및 유럽을 포함한 많은 나라에서 인가되어 왔다.
그러나, 이 균주의 감쇠는 화학적 돌연변이 생성 기술을 이용하여 달성되었고, 균주의 감쇠에 대한 기초는 완전히 이해되지 않는다. 이 때문에, 투약(dose)의 수(현재는 4) 및 각 투약시 주어져야 하는 생 유기체의 수의 관점에서 백신은 이상적이지 않다.
살모넬라 병인론에 대한 늘어나는 지식과 연계된, 현대 분자 생물학 기술은 이 유기체의 생체내 성장 및 생존을 위해 필수적인 여러 유전자들이 동정 (identification)되게 하였다. 이것은 정의된 비-복귀성 돌연변이를 독성(virulence)에 관련 있다고 알려진 선택된 유전자로 도입함에 의해 미래의 백신 균주는 "합리적으로" 감쇠될 수 있다는 개념을 이끌어 내는, 감쇠를 위한 새로운 유전자 표적을 제공해왔다. 이는 특히 면역원성 및 따라서 주어져야 하는 투약의 수의 관점에서 개선된 백신의 발전을 촉진할 것이다.
살모넬라의 많은 감쇠된 균주가 현재 공지되어 있더라도, 인간에게 사용을 위한 유력한 백신 후보로 적합한 것들을 거의 없다. 이는 부분적으로 백신의 면역원성과 살모넬라 미생물이 반응성 있게 되는 가능성을 균형을 맞추는 필요 때문일 수 있다.
적합한 백신 후보를 야기하는 감쇠에 대한 적절한 표적의 선택은 수월하지 않고, 쉽게 예상될 수 없다는 것은 명백하다. 많은 인자들이 적절한 백신으로서 감쇠된 균주의 적합성에 영향을 주고, 적합한 균주를 동정하기 위한 많은 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 백신 후보로서 시험된 많은 감쇠된 균주들은 환자에서 백신증(vaccinemia) 또는 농양을 초래한다.
따라서, 미생물 균주가 반응성 있는 형태로 복귀될 가능성이 감소되고, 한정된 부작용으로 우수한 안전성의 프로파일을 보이는 높은 등급의 면역원성을 갖는 백신의 개발이 요구된다.
본 발명은 세균성 또는 바이러스성 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물에 사용될 수 있는 감쇠된(attenuated) 미생물에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 살모넬라 미생물내로 도입된 두 특정한 감쇠화 돌연변이가 높은 등급의 면역원성을 갖고 미생물이 반응성 형태로 복귀하는 위험이 낮은 백신을 생산할 수 있다는 발견에 기초한다. 생성되는 백신 균주는 우수한 부작용 프로파일을 보인다.
첫번째 돌연변이는 살모넬라 병원성 아일랜드(island) 2(Spi2)의 영역내에 포함된다; 두번째는 영양요구성(auxotrophic) 돌연변이 즉, 생합성 경로에서 요구되는 단백질을 코드화하는 유전자의 발현을 파괴하는 돌연변이이다.
본 발명의 첫번째 측면에 따르면, 살모넬라 미생물은 Spi2 병원성 아일랜드내에 위치한 기구(apparatus) 유전자의 발현을 파괴하는 감쇠화 돌연변이 및 독립적인 영양요구성 돌연변이를 갖는다. 바람직한 감쇠화 돌연변이는 기구 유전자ssaV내에 있고, 바람직한 영양요구성 돌연변이는aroC내에 있다.
이 미생물은 바람직하게는 추가로 하나 이상의 이종성 항원 또는 치료학적 단백질, 예를 들어 병원성E. coli,Shigella, A형, B형, 또는 C형 간염, 단순 헤르페스 바이러스 및 인간 유두종 바이러스를 포함한다. 따라서, 이 미생물은 살모넬라를 제외한 감염에 대해 면역화하는 전달체로 작용할 수 있다.
살모넬라 미생물은 세균성 또는 바이러스성 감염의 치료, 예를 들어 장티푸스의 치료를 위한 정맥내 또는 경구 전달용 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 감쇠된 살모넬라 미생물은 놀랍게도 점막뿐만 아니라 시스템(systemic) 면역을 자극하는 백신을 형성한다. 또한, 단일 돌연변이를 갖는 돌연변이체들이 비장 농양을 초래하는 반면에, 이 미생물은 동물 모델에서 비장 종양을 초래하지 않는다. 이것은 본 발명에서 정의된 이중(double) 돌연변이체의 특별한 장점이다.
발명의 설명
본 발명의 미생물 및 백신 조성물은 공지된 기술로 제조될 수 있다.
특정 살모넬라 미생물의 선택 및 적절한 돌연변이의 선택은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 미생물은Salmonella typhimurium이다.
첫번째 돌연변이는 살모넬라 병원성 아일랜드2의 영역에 위치된 기구 유전자내로 도입될 수 있고, 이 영역은 WO-A-9617951에 개시되어 있다.
살모넬라 병원성 아일랜드 2(Spi2)는 살모넬라 염색체에 위치한 두개의 전통적인 병원성 아일랜드중 하나이다. Spi2는 Spi2 코드화된 독성-관련 단백질들(소위 작용인자 단백질)을 살모넬라 세균 외부 및 잠재적으로 직접 매크로파지같은 표적 숙주 세포로 운송하는데 연관된 유형 III 분비 계를 코드화하는 여러 유전자들을 포함한다. Spi2(기구 유전자)는 유형 III 계의 분비 기관을 코드화한다. Spi2는 세계에서 여러 다른 그룹에 의해 현재 입증된 관찰인, 마우스에서의 살모넬라의 병인론 및 독성에 절대적으로 필수적이다.S.typhimuriumSpi2 돌연변이체는 경구, 정맥내 및 복막내 투여 경로에 의해 공격(challenge)된 마우스에서 매우 감쇠된다.
Spi2내에 위치한 기구 유전자들은 현재 잘 특징되어 진다; 예를 들어 Hensel et al,Molecular Microbiology(1997); 24(1): 155-167을 참조. 본 발명의 사용에 적합한 유전자들에는ssaV, ssaJ, ssaK, ssaL, ssaM, ssaO, ssaP, ssaQ, ssaR, ssaS, ssaT, ssaU및ssaH유전자들이 포함된다.
Spi2 영역내 돌연변이는 반드시 기능을 파괴하기 위한 유전자내에 있어야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 상류 조절 영역내의 돌연변이는 감쇠를 초래하며 역시 유전자 발현을 파괴할 수 있다. 유전자간 영역내의 돌연변이는 또한 유전자 기능을 파괴하는데 충분하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 기구 유전자는ssaV이다. 본 발명의 별개의 구현예에서, 돌연변이는ssaJ및ssaK사이의 유전자간 영역내에 놓여 있다.
두번째 돌연변이는 생합성 경로에 필수적인 유전자를 파괴하기 때문에 "영양요구성 돌연변이"라고 칭해진다. 생합성 경로는 살모넬라내에 하나 존재하지만 포유류내에 존재하지 않는다. 따라서, 돌연변이체들은 돌연변이의 효과를 우회하기 위해 치료된 환자내에서 발견되는 신진대사 산물에 의존할 수 없다. 영양요구성 돌연변이에 대한 적합한 유전자들에는aro유전자, 예를 들어aroA, aroC, aroD및aroE가 포함된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 백신 조성물은ssaV및aroC내의 감쇠화 돌연변이를 갖는 살모넬라 미생물을 포함한다.
돌연변이는 공지된 기술을 이용하여 미생물내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 결실 돌연변이로, 여기서 유전자의 파괴는 핵산의 삭제에 의해 초래된다. 다른 방법으로, 돌연변이는 핵산의 삽입 또는 점 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 돌연변이를 특정한 영역으로 도입하는 방법은 당업자들에게 명백할 것이다.
두 돌연변이에 추가하여, 살모넬라 미생물은 또한 이종성 항원을 포함할 수 있다. 따라서 이 감쇠된 미생물은 다른 세균성 또는 바이러스성 감염에 대한 항원을 투여하기 위한 전달체로서 작용할 수 있다. 이런 방식에 사용하기에 적합한 항원은 당업자들에게 명백할 것이고 다음을 포함한다:
병원성 E.coli 항원 즉, ETEC
A형, B형 및 C형 간염 항원
라임(lime) 병 항원
비브리오 콜레라 항원
헬리코박터 항원
단순 헤르페스 바이러스 항원
인간 유두종 바이러스 항원
이 시스템은 또한 환자들, 예를 들어 간염에 감염된 환자들의 치료를 위한 치료학적 단백질, 예를 들어 사이토킨을 전달할 가능성을 갖는다. 백신 조성물을 이용한 이종성 항원 또는 치료학적 단백질의 전달을 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 미생물을 사용하여 제조된 백신들은 인간 환자의 감염의 치료 그리고 수의학적 감염의 치료에 적용된다.
이중 돌연변이는 안전한 백신 후보를 제공하기 위해 미생물을 감쇠하는 효과적인 수단을 제공한다.
백신 조성물들은 심지어 면역절충된(immunocompromised) 환자에게도 효과적인 단백질을 제공하고, 중요하게도 비장 농양을 진전시킬 위험이 낮다. 비장 농양은 단일 돌연변이에 기초한 백신을 사용하여 확인되어 왔고, 따라서 본 조성물은 환자들에게 실질적인 이득을 제공할 수 있다.
백신 조성물을 제제화하기 위해서, 돌연변이체 미생물은 적합한 약학적으로 수용가능한 보조제, 희석제 또는 부형제를 포함한 조성물로 존재할 수 있다. 적합한 제제화는 당업자들에게 명백할 것이다. 제제화는 적합한 투여 수단을 위해 개발될 수 있다. 바람직한 투여는 경구 또는 정맥내 경로를 통한 것이고, 백신들은 감쇠된 생 살모넬라 미생물들이다. 제제화에서 존재하도록 요구되는 미생물의 수는 당업자에 의해 결정되고 최적화될 수 있다. 그러나, 일반적으로, 환자는 단일 투약 단위로 대략 107- 1010CFUs, 바람직하게는 약 108- 109CFUs로 투여될 수 있다.
하기의 실시예가 본 발명을 예시한다.
실시예 1
본 실시예는 ZH9로 지정된 인간 경구 장티푸스 백신으로 활성을 갖는 돌연변이 균주의 제조를 설명한다. 이 균주는 독성S.typhi균주 Ty2로부터 유도되고, 원래 장티푸스의 경우로부터 단리된다. 유도된 균주는purA및aroA내에 정의된 돌연변이를 갖는다.
ZH9의 구성을 위한 Ty2
S.typhiTy2는 원래 1916년 장티푸스 열병에 걸린 개인으로부터 단리되었고, 모든 인가된 장티푸스 백신의 유도를 위해 사용되어 왔다. 이 균주는 콜린데일 (Colindale)에 있는 PHLS national culture collection으로부터 얻었다. NCTC 번호가 8385인 동결건조된 배양균(culture)으로 얻었다.
S.typhiTy2로부터S.typhi aroC유전자의 클로닝
S.typhiTy2는 스톡(stock)으로부터 회복되었고 Luria Bertani(LB) 브로스(broth)에서 밤새 성장시켰다. 세포들을 수확하고 전체 세포 DNA를 제조하였다. 제한 효소Sau3A로 부분 절단하여S.typhiTy2 DNA의 단편들을 생성하고, 생성되는 단편들을 BamH1 분할된 pHC79에 결찰하여E.coliHU835를 수용체로 사용하는S.typhiTy2 DNA의 코스미드 라이브러리를 생성하였다.S.typhiDNA로부터 DNA 코드화aroC를 단리하기 위해서 이 코스미드 라이브러리를, 하나의 돌연변이가aroC유전자에 있고 성장을 위한 방향족 화합물에 의존하는E.coliAB2849를 형질도입하는데 사용하였다. 형질도입 혼합물을 방향족 화합물이 결핍된 최소 배지상에 플레이트하고, 37℃에서 인큐베이트하였다. 많은 수의 단리된 콜로니들을 관찰하고 밤새 인큐베이트하였다. 이 세균들은 아마 손상되지 않은aroC유전자 형태를 갖는 코스미드 클론에 의해 AB2849내에aroC돌연변이의 보충의 결과로서 생겨났을 것이다. 이 균주들 중의 하나에서 유래한 코스미드 DNA를 정제하였다. 이 코스미드에서 유래한 5.2kbHindIII 단편은 pUC18로 클론되어 AB2849 내에서aroC의 결실을 보충할 수 있는 플라스미드 pTAC2를 부여하는데, 이것은S.typhi aroC유전자를 함유하는 것을 나타낸다.
클론된S.typhiTy2aroC유전자의 한정된 결실의 생성
한정된 600bp 결실을 PCR을 사용하여 클론된aroC유전자내에서 생성하였다. PCR내에서 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머를S.typhi aroC유전자(Acc. M27715)의 발표된 DNA 서열을 사용하여 설계하였다.aroC유전자에 대한 DNA 5'는 프라이머 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 1을 사용하여 pTAC2로부터 증폭하였다. SEQ ID NO. 3을 벡터 DNA로 어닐링 하고, SEQ ID NO. 1을aroC의 5' 영역으로 어닐링하였다.aroC유전자에 대해 3' DNA를 프라이머 SEQ ID NO. 4 및 SEQ ID NO. 2를 사용하여 증폭하였다. SEQ ID NO. 4를 벡터 DNA로 어닐링 하고, SEQ ID NO. 2를aroC의 3' 영역으로 어닐링 하였다. 생성되는 PCR 생성물은 클로닝을 촉진하기 위해 5' 말단으로 혼입되는 Xbal 부위를 가졌다. 단편들을 벡터 pUC18로 클론하였다. pMIAC23으로 지정되는 최종 플라스미드 구조물은 4.8 kbHindIII 단편상에aroC의 한정된 결실(위치 544 내지 1143)을 포함한다. 이HindIII 단편은 pUC18의HindIII부위에 삽입된다. 단일 Xbal 부위는aroC결실의 부위에 존재한다.
aroC돌연변이의S.typhiTy2 게놈으로의 도입
자기불활화(suicide) 플라스미드 pCVD442(Donnenberg & Kaper, Infection and Immunity, 1991; 59: 4310-4317)를aroC결실의S.typhiTy2의 게놈으로 도입을 위한 벡터로서 사용하였다.aroC결실을 함유한 4.8kbHindIII 단편을 pMIAC23에서 단리시키고 Stratagene DNA 연마 키트를 사용하여 말단부를 둔단으로 만들었다. 플라스미드 pCVD442를 Smal으로 소화하여 선형화하고 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 둔단-말단 단편들로 결찰하였다. 요구되는 구조물을 단리하고 pYCVC21로 지정하였다.
pYCVC21을 표준 전기천공(electroporation) 프로토콜을 사용하여S.typhiTy2로 도입하였다. 플라스미드는 Ty2 게놈으로 통합할 수 있어서, 게놈과 플라스미드 상의 상동성 영역간에 재조합이 뒤따라서, 엠피실린 내성을 형질전환체에 부여한다. 이 형질전환체들은 본래의 야생형aroC및 결실된aroC유전자 모두의 복사체를 포함했다. 이 균주들을 엠피실린의 부재하에서 성장시키는 것은, pCVD442 DNA 서열의 손실 및 야생형 복사체나 결실된 복사체 중의 하나인,aroC유전자의 복사체를 야기한 두번째 재조합을 발생하게 하였다. 이 두번째 재조합을 겪은S.typhiTy2 세균은 5% 수크로스(pCVD442는 발현시 수크로스 민감성 표현형을 야기하는sacB유전자를 지닌다)의 존재하에 성장할 수 있는 엠피실린 민감 유도체들로 동정되었다. 결실된 aroC 유전자만을 보유했던 균주들은 초기에는 방향족 화합물의 보충의 부재하에 최소 배지 플레이트상에서 성장할 수 없는 균주들로 동정되었다.aroC유전자형은 PCR 분석을 사용함에 의해 확인되었다. SEQ ID NO. 5 및 SEQ ID NO. 6을 갖는 프라이머들은 야생형aroC에 대해서 994bp의 생성물을, 그리고 결실된aroC유전자에 대해서는 400bp의 생성물을 제공하였다. 생성되는 PCR 생성물의 서열 분석은 DTY6, DTY7, DTY8, DTY9 및 DTY10으로 지정된 5가지의 개별 단리체에서 요구되는 결실의 존재를 확인하였다. 이 균주들을 장기간 보관을 위해 -70℃에서 Microbank 바이알내에 저장하였다. 균주 DTY8을 더 조작하기 위해 선택하였다.
S.typhi aroC돌연변이 DTY8로ssaV돌연변이의 도입
S.typhi의ssaV영역을 포함하는 7.5kb Pstl 단편들을 PCR을 사용함에 의한 전체 DNA 제조물로부터 증폭하고 벡터 pCR2.1(invitrogen)내로 클론하였다. 사용된, SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 8을 갖는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머들을S.typhimuriumSP12 서열로 설계하였다. 생성되는 플라스미드 구조물을 pTYSV21로 지정하였다.
ssaV유전자의 결실을 소유하는 플라스미드 구조물을 역배향 PCR을 사용하여 pTYSV21로부터 유도하였다.ssaV개방 리딩 프레임의 5'(SEQ ID NO. 9) 및 3'(SEQ ID NO. 10)의 영역으로 한 프라이머들의 어닐링은S.typhimuriumSPi2 서열로 설계되었다.AVrll 제한 부위는 각 프라이머의 5' 영역으로 혼입되었고, Xbal 부위는 SEQ ID NO. 10내로 혼입되었다. Xbal 부위는 ssaV 돌연변이를 위한 태그(tag)로 작용하여, 제한 분석에 의해 쉽게 검출될 수 있다. 생성되는 PCR 생성물은Avrll로 소화시키고, 골격 플라스미드 분자는 뒤따르는 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다.Avrll 점착성-말단에서 생성되는 단편들의 재순환은 요구되는 결실 구조물 pYDSV1을 제공했다. pYDSV1은ssaV개방 리딩 프레임내의 한정된 1894bp 결실을 갖는 5.5kbPstl단편을 함유한다.
자기불활화 플라스미드 pCVD442를ssaV결실을S.typhiTy2aroC돌연변이 DTY8의 게놈으로 도입하기 위하여 벡터로 사용하였다.ssaV결실을 함유하는 5.5kbPstl단편은 pYDSV1로부터 단리되었고, 말단부는 Klenow DNA 폴리머라제로 처리하여 둔단으로 만들었다. 플라스미드 pCVD442를 Smal로 소화하여 선형화했고, 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 둔단-말단된 단편들에 결찰하였다. 요구되는 구조물을 단리하고 pYDSV214로 지정하였다.
pYDSV214를 전기천공을 사용하여S.typhi내로 도입하였다. 엠피실린-내성 형질전환체를 선택하고 나서, 엠피실린의 부재하게 성장시켜서 pCVD442 DNA 서열의 손실 및 야생형 복사체나 결실된 복사체중의 하나인ssaV의 복사체를 가능하게 하였다. 이 두번째 재조합을 겪은 균주들은 엠피실린-민감성, 수크로스-내성 콜로니로 동정되었다. 결실된ssaV유전자만을 보유한 균주들은 PCR 분석을 사용하여 동정하였다. SEQ ID NO. 11 및 SEQ ID NO. 12를 갖는 프라이머들은, 야생형ssaV에 대해서는 2458bp 그리고 결실된ssaV유전자에 대해서는 591bp의 생성물을 제공했다. 생성되는 PCR 생성물의 서열 분석은 5가지 개별 단리체들인 ZH2, ZH4, ZH6, ZH7 및 ZH9 내의 요구되는 결실의 존재를 확인하였다. 균주 ZH9가 CGMP 마스타 세포 은행의 제조를 위해 선택되었다.
실시예 2
본 실시예는 인간 위장염에 대해 백신 활성을 갖는 WT05로 지정된S.typhimurium돌연변이 균주의 제조를 설명한다. 균주는 공지된 인간 독성S.typhimurium균주 TML로부터 유도된다.
WT05의 구성을 위한 TML
TML은 본래 위장염을 겪는 환자로부터 단리되었고, Birmingham대학에서 JohnStevens 박사의 연구실에서 동정되었다. Wellcome Research Laboratories에서 동결건조되고, BRD 519로 배양균 번호가 할당되었다. 그 배양균을 Birmingham 대학에서 얻었다.
클론된S.typhimuriumssaV 유전자의 한정된 결실의 생성
S. typhimuriumLT2에서 단리된 7.5kbPstl단편을 pUC18의Pstl부위로 클로닝하여 플라스미드(plasmid 7-2, Shea et al; PNAS, 1996; 93: 2593-2597)를 생성하였다.ssaV를 이 단편의 중앙에 위치시켰다.ssaVORF의 한정된 결실을 함유하는 플라스미드 구조물은 역배향 PCR을 사용하여 플라스미드 7-2로부터 유도하였다.ssaV개방 리딩 프레임의 5'(SEQ ID NO. 13) 및 3'(SEQ ID NO. 14)의 영역에 프라이머들의 어닐링은S.typhimuriumSpi2 서열로 설계되었다.Avrll 제한 부위는 각 프라이머의 5' 영역으로 혼입되었고, Xbal 부위는 SEQ ID NO. 14내로 혼입되었다. Xbal 부위는ssaV돌연변이를 위한 태그로 작용하여 제한 분석에 의해 쉽게 검출될 수 있다. 생성되는 PCR 생성물은Avrll로 소화시키고, 골격 플라스미드 분자는 뒤따르는 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다.Avrll 점착성-말단에서, 생성되는 단편들의 재순환은 요구되는 결실 구조물 pMDSV1을 제공했다. pMDSV1은ssaV개방 리딩 프레임내의 한정된 1894bp 결실을 갖는 5.5kbPstl단편을 함유하고, Avrll 및 Xbal 제한 부위는 결실 부위에 있다.
자기 불활화 플라스미드 pCVD442를ssaV결실을S.typhimuriumTML의 게놈으로 도입하기 위하여 벡터로 사용하였다.ssaV결실을 함유하는 5.5kbPstl단편을 pMDSV1로부터 단리하였고, 말단부를 Klenow DNA 폴리머라제로 처리하여 둔단으로만들었다. 플라스미드 pCVD442를 Smal로 소화하여 선형화했고, 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 둔단-말단화된 단편들에 결찰하였다. 요구되는 구조물을 단리하고 pMDSV22로 지정하였다.
pMDSV22를 접합을 이용하여S.typhimuriumTML내로 도입하였다. 이 목적을 위해, 구조물을E.coli균주 S17-1 λpir로 형질전환시켰다. 표준 방법에 따라 접합을 수행하였다. 플라스미드 pMDSV22는 TML 게놈으로 통합될 수 있어서 플라스미드와 게놈의 상동성 영역간의 재조합이 뒤따라서, 엠피실린 내성 접합 완료체(transconjugant)를 제공한다. mdsv-WT2로 지정된 접합 완료체를 더 조작하기 위해 선택하였다. 이 접합 완료체는 본래의 야생형ssaV및 결실된ssaV유전자 모두의 복사체를 함유한다. pCVD442 DNA 서열의 손실 및 야생형 복사체나 결실된 복사체중의 하나인ssaV유전자의 복사체의 결과를 낳는 두번째 재조합이 발생하도록 엠피실린 부재하에서 성장시켰다. 이 두번째 재조합을 겪은 단리체들은 5% 수크로스(pCVD442는 발현시 수크로스 민감성 표현형을 야기하는sacB유전자를 지닌다)의 존재하에 성장할 수 있는 엠피실린-민감성 유도체로 동정되었다. 결실된ssaV유전자만을 보유했던 균주들은 PCR 분석을 사용함에 의해 확인되었다. SEQ ID NO. 15 및 SEQ ID NO. 16을 갖는 프라이머들은 야생형ssaV에 대해서 2485bp의 생성물을, 그리고 결실된ssaV유전자에 대해서는 591bp의 생성물을 제공하였다. 생성되는 PCR 생성물의 서열 분석은 ZH20, ZH23, ZH25 및 ZH26인 4가지의 개별 단리체에서 요구되는 결실의 존재를 확인하였다. 이 균주들을 장기간 보관을 위해 -80℃에서 LB + 15% 글리세롤내에 저장하였다. 균주 ZH26을 더 조작하기 위해 선택하였다.
S. typhimuriumTML로부터S. typhimurium aroC유전자의 클로닝
게놈성 DNA를S.typhimuriumTML로부터 단리하고HindIII로 절단하였다. 5 내지 6kb의 크기 범위의HindIII 단편들을 정제하고HindIII-절단된 pBluescript로 결찰하였다. 결찰 혼합물을E.coli aroC돌연변이체, AB2849를 형질전환하기 위해 사용하였고,S.typhimurium aroC유전자를 함유한 클론들을 이 균주를 보충하는 그것들의 능력때문에 선택하였다. 하나의 클론, pDAC1의 분석은 그것이 5.2kbHindIII 단편을 함유하는 것을 입증하였다.
한정된 600bp 결실을 PCR을 사용하여 클론된 aroC 유전자내에서 생성하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는S.typhi aroC유전자(Acc. M27715)의 발표된 DNA 서열을 사용하여 설계하였다.aroC유전자에 대해 5' DNA는 SEQ ID NO. 19 및 SEQ ID NO. 17을 갖는 프라이머들을 사용하여 pDAC1으로부터 증폭하였다. SEQ ID NO. 19는 벡터 DNA로 어닐링 하고, SEQ ID NO. 17은aroC의 5' 영역으로 어닐링 하였다.aroC유전자에 대해 3' DNA는 SEQ ID NO. 20 및 SEQ ID NO. 18을 갖는 프라이머들을 사용하여 증폭하였다. SEQ ID NO. 20은 벡터 DNA로 어닐링 하고, SEQ ID NO. 18은aroC의 3' 영역으로 어닐링 하였다. 생성되는 PCR 생성물은 클로닝을 촉진하기 위해 5' 말단으로 혼입되는 Xbal 부위를 가졌다. 단편들을 벡터 pUC18로 클론하였다. 최종 플라스미드 구조물, pMIAC8은 4.8 kbHindIII 단편상에aroC의 한정된 결실(Acc. M27715 위치 544 내지 1143)을 포함한다.HindIII 단편은 pUC18의HindIII 부위에 삽입된다. 단일 Xbal 부위는 결실의 부위에 존재한다.
aroC돌연변이의S.typhimurium ssaV돌연변이체 ZH26으로의 도입
자기불활화 플라스미드 pCVD442는aroC결실을S.typhimuriumTML의 게놈으로 도입하기 위한 벡터로 사용하였다.aroC결실을 함유하는 4.8kbHindIII 단편을 pMIAC8로부터 단리하였고, 말단부는 Stratagene DNA 연마 키트(Part No. 200409)를 사용하여 둔단으로 만들었다. 플라스미드 pCVD442를 Smal로 소화하여 선형화했고, 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 둔단-말단화된 단편들로 결찰하였다. 요구되는 구조물을 단리하고 pMCVC16으로 지정하였다. pMCVC16을 전기천공을 이용하여S.typhimuriumZH26내로 도입하였다. 엠피실린-내성 형질전환체를 선택하고, 엠피실린의 부재하게 성장시켜서 pCVD442 DNA 서열의 손실 및 야생형 복사체나 결실된 복사체중의 하나인aroC유전자의 복사체를 가능하게 하였다. 이 두번째 재조합을 겪은 균주들은 5% 수크로스 존재하에서 성장할 수 있는 엠피실린-민감성 유도체로 동정되었다. 결실된aroC유전자만을 보유했던 균주들은 초기에는 방향족 화합물의 보충의 부재하에 최소 배지 플레이트상에서 성장할 수 없는 균주들로 동정되었다.aroC유전자형은 PCR 분석을 사용하여 확인되었다. SEQ ID NO. 21 및 SEQ ID NO. 22를 갖는 프라이머들은 야생형aroC에 대해서 994bp의 생성물을, 그리고 결실된aroC유전자에 대해서는 400bp의 생성물을 제공하였다. 생성되는 PCR 생성물의 서열 분석은 WT05, WT09, WT10 및 WT12로 지정된 4가지의 개별 단리체에서 요구되는 결실의 존재를 확인하였다. 균주 WT05를 CGMP 마스타 세포 은행의 제조를 위해 선택하였다.
실시예 3
다음의 구조물을 동물 모델에서 이중 돌연변이체 백신을 시험하기 위해 제조하였다. 마우스를 감염시킨 균주, 단일 및 이중 돌연변이체를 갖는S.typhimuriumSL1344를 사용하였다.
S. typhimurium12023s에서 유래한ssaV::aph(비극성) 돌연변이를 단일 Spi2 돌연변이체를 생성하기 위해 SL1344로 P22 형질도입하였다.
aroC결실/pCVD422 자기 불활화 벡터 pMCVC16을S. typhimurium균주 LB5010으로 전기천공으로 도입하여 부분이배체(merodiploid)를 얻었다. 그리고 나서,aroC결실 부분이배체를 LB5010 부분이배체로부터 SL1344로 P22 형질도입하였다. 그리고 나서, SL1344 부분이배체를 수크로스 선택을 사용하여 분해하여 단일aroC돌연변이체를 생성하였다.
aroC결실 부분이배체를 LB5010으로부터 SL1344ssaV::aph로의 P22 형질도입하여 이중 돌연변이체를 생성하였다. 플라스미드 서열은 SL1344ssaV::aph 배경에서 부분이배체로 분해되어 균주 3,aroC결실 돌연변이를 이탈시켰다.
한정된aroC/ssaV살모넬라 돌연변이체에 대한 예비-임상 약물 동력학 연구
한정된 돌연변이를aroC,ssaV또는 두 돌연변이체의 조합내에 갖는 살모넬라 돌연변이체(균주 SL 1344)는 유기체의 감쇠, 지속 및 야생형 균주에 의한 공격에 대한 면역화 능력을 평가하기 위해 BALB/C 마우스에서 광범위하게 평가되어 왔다.
실시예 4
정맥내 경로에 의해 면역화된 동물
예방 연구
10개의 BALB/C 마우스의 군을, LB 배양액에서 밤새 성장시키고 투여를 위해 식염수에서 재현탁시킨 SL1344 aroC, SL1344ssaV및 SL1344aroC:ssaV의 105및 106미생물로 정맥내 면역화시켰다. 마우스들을 6주 후에 정맥내로 주입된 105야생형 유기체로 공격시켰다. 정맥내로 주입된 이 야생형 균주의 10 유기체는 마우스를 죽이기에 충분하다.
단일aroC또는ssaV돌연변이체가 주입된 모든 마우스들은 어느 하나의 투약으로 공격 후 완전히 예방되었고, 질병의 징후를 보이지 않으면서 실험동안 건강하게 남아 있었다. 이중 돌연변이체에 대해서, 106개의 유기체로 면역화된 동물의 90%가 완전히 예방되었다. 마우스들 중 한마리가 공격 후 8일째에 죽었다. 더 낮은 투약으로 면역화된 동물에서는, 단지 1마리의 마우스만이 공격에서 생존하였다.
이 실험은 살모넬라ssaV돌연변이체, 둘 중 하나만 이거나 또는aroC돌연변이체와 조합으로 된 면역화는 야생형 살모넬라 균주에 의한 공격에 대해 마우스를 면역시키는 것을 입증한다.
균주의 지속
마우스 군에 상기한 세가지 살모넬라 돌연변이체의 106유기체를 주입하였다. 네마리의 마우스를 14일에 걸쳐 다른 시점에서 희생시키고, 간 및 비장내의 유기체의 계수를 시행하였다. 세 돌연변이체의 계수는 약 5 x 105의 유기체의 수일때인 10일까지 각 기관에서 유사하였다. 14일에, 단일 돌연변이체와 이중 돌연변이체 사이에서, 간 및 비장 모두에서 이중 돌연변이체 유기체의 수에서 대수만큼 더 작은, 차이를 보였다.
단일 돌연변이체와aroC/ssaV이중 돌연변이체 사이의 다른 중요한 차이는 이중 돌연변이체에 대해서 실험 중에 어느 시점에서도 간 농양이 존재하지 않았다는 것이다. 그러나, 단일 돌연변이체로 감염된 마우스들에는 10일 및 14일에 간 농양이 존재하였다. 이것은 중요한 발견이고 백신의 제조의 평가에 대해 돌연변이의 조합의 용도를 강력하게 뒷받침한다.
면역원성
상기한 바와 같이 면역화된 마우스 혈액을 채취하고, ELISA를 사용하여 전체 세포 살모넬라에 대하여 항체 역가를 측정하였다. 세가지 균주는 모두 살모넬라에 대하여 순환 IgG의 높은 역가를 유도하며, 매우 면역원성임이 입증되었다.
실시예5
경구에 의해 면역화된 동물
균주의 지속
세가지 살모넬라 돌연변이체 각각의 5 x 109유기체로 경구 면역된 마우스 군을 주기적인 간격으로 희생시키고, 간 및 비장내에서의 그 유기체의 수를 계수하였다. 단일 aro 돌연변이체 및 단일ssaV돌연변이체에 대해서, 간 및 비장내의 수는 약 21일까지 각각 103및 102이었다. 그 후에 수는 감소하였다.aroC:ssaV이중 돌연변이체가 주입된 마우스들에 대해, 유기체는 경구 면역화 후에 간 및 비장에서실질적으로 검출되지 않았다.
Salmonella typhimuriumTMLaroC/ssaV(WT05)로 백신화된 A-J 마우스의 경구 면역화 및 정맥내 공격
이 실험의 목적은 경구의 ityr뮤린 백신화 및 정맥내 공격 모델에서 5 x 109 aroC/ssaV S.typhimuriumTML 돌연변이체의 예방 효과를 확인하는 것이었다. 이 모델은 이들 동물들이 itys배경보다 덜 민감하다는 점에서 살모넬라에 대한 인간 반응과 더 근접하게 유사하다.
0.2 ㎖ PBS 부피내의 5 x 109 S.typhimuriumTMLaroC/ssaV를 섭식(gavage) 관으로 10마리의 6-8주령 A-J 마우스에 접종하고 8주간 방치하였다. 두마리의 마우스를 이때에만 PBS를 주입하고, 대조구 동물로 이용하였다. 8주가 지난 후, 두 면역된 군을 107야생형 S.typhimuriumTML로 정맥내로 공격하였다. 접종 후 30일 동안 마우스를 관찰하였다.
모든 동물들이 야생형 공격에 대해 완전히 예방되었다(100% 생존, 10/10 동물들이 살아 있는). PBS 단독으로 주입하고 나서 야생형S.typhimuriumTML로 공격된 마우스는 공격 후 6일째에 죽었다.
ityr배경에서 이중 S.typhimuriumTMLaroC/ssaV는 5 x 109의 경구 투약으로 주입된 마우스를 예방하는 것으로 보인다. ityr마우스는 인간 살모넬라증의 더 우수한 모델이기 때문에, 감염에 대한 민감성이라는 점에서 이것은 인간 상황에 중요할 수도 있다.
마우스의 간 및 비장에서 이중 돌연변이체의 지속을 측정하기 위하여 또한 연구가 수행되었다. 이중 돌연변이체는 21일 부근까지 낮은 수준으로 지속되는 것이 발견되었다. 28일까지 돌연변이체 균주는 제거되었다.
실시예 6
인간 임상 시험
18명의 건강한 자원자를 공개 표시(label), 비-위약(placebo) 조절된 연구를 위해 모집하였다. 적절한 선별에 따라서, 3명의 각 자원자들은 107, 108또는 109CFUs의S.typhiZH9 또는S.typhimuriumWT05의 단일 경구 투약을 받았다. 상기한 바와 같이 제조된 미생물을 위산을 중화하기 위한 최종 부피가 100㎖인 2%(w/v) 중탄산 나트륨 용액내에 적절한 투약 농도로 재현탁하였다. 이 액체 현탁액을 경구로 자원자들에게 투여하였다. 그리고 나서, 자원자들을 72시간 동안 격리하고, 안전 및 면역성원을 위해 후-면역화했다.
자원자들은 반응유전자성(reactogenicity) 및 백신화와 관련된 다른 부작용에 대해서, 관찰, 물리적 진단 및 일지 카드의 완결에 의해 평가되었다. 추가로, 혈액, 대변 및 소변 배양물을 백신 균주의 백신증, 셰딩(shedding) 및 지속을 분석하기 위해 수집하였다. 표준 방법을 사용하여, 혈액내 C-반응성 단백질(CRP) 및 간 기능성 효소(ALT)의 수준, 총 백혈구 세포(WBC) 수 및 적혈구 침강 속도(ESR)를 측정하여 부가적인 안전성 데이타를 얻었다. 이 매개변수들은을 7일까지 매일, 그리고 나서 28일까지 일주일 간격으로 채집한 혈액에 대해 측정하였다.
점막 및 시스템 면역 반응의 분석
혈액 및 타액 샘플들을 면역전 그리고 나서 면역후 7, 14, 21 및 28일에 수집하고, 타액 및 혈청을 ELISA에 의해 분석할 때까지 -70℃에서 동결시켰다. 말초 혈액 단핵 세포들을 모집하고 ELISPOT 기술을 사용하여 항체-분비 세포(ASCs)의 존재에 대해 분석하였다.
S.typhiZH9 및S.typhimuriumWT05 모두가 모든 자원자들에게서 잘 내성화되었다. 각각 3 투약 수준에서 어떤 자원자에게서도 심각한 부작용은 관찰되지 않았고, 모든 점에서 조사된 모든 피접종자의 혈액 및 소변 배양액에서 음성으로 남아 있었다. 따라서,S.typhiZH9 및S.typhimuriumWT05에 의한 면역화 모두는 백신증을 초래하지 않는다. 이 균주들 중의 하나를 주입한 자원자들 중 누구도 설사 또는 지속적인 높은-등급의 열을 진전시키지 않아서, 또한 백신 균주의 안전성을 나타내었다. 7일을 넘는 지속적인 배설이나 백신증이S.typhiZH9의 3 투약 군 또는 저 투약(107)의S.typhimuriumWT05중 어느 하나에서도 관찰되지 않았다.
S.typhi ZH9에 의해 유도된 점막 및 시스템 면역 반응
단일 저 투약(1 x 107CFUs)의S.typhiZH9에 의한 경구 면역화는 면역화 후 7일에 측정된 3명의 자원자 중 2명에게서 S.typhi-특이적 IgA-분비 ASCs의 초회항원자극(priming)을 야기하였다. 14일, 28일째에 뒤이은 시험은 IgA ASCs가 여전히검출되지만 훨씬 낮은 수준이고, 28일까지는 사라지는 것을 보였다. 거의 모든 반응자 피접종자에게서, ASCs의 수는 7일에 가장 높았다. 놀랍게도, 더 높은 투약(108CFUs)의S.typhiZH9의 섭취는 3명의 자원자중 2명에게서 낮은 IgA ASC 반응을 야기하였다. 가장 높은 투약(1 x 109CFUs)의 섭취는 3명의 자원자중 2명에게서 IgA ASCs를 초회항원자극하였다.
살모넬라-특이적 혈청 항체 반응
단일 저 투약(1 x 107CFUs)의 S.typhi ZH9에 의한 경구 면역화는 7, 14, 21 및 28일에 조사했을 때, S.typhi LPS-특이적 혈청 IgG를 유도하지 못했다(2/3 피접종자에게서 IgA-ASCs를 생성하더라도). 유사하게, 단지 1/3만이 매우 낮은 수준의 편모-특이적 IgG를 생성하였다. 그러나, 108CFUs의 섭취는 높은 수준의 LPS 및 편모-특이적 IgG를 지원자 3명 모두에게서 생성하는 결과를 야기하였다. 증가된 수준의 S.typhi LPS 특이적 및 편모-특이적 IgG는 면역 접종 후 7일만큼 빨리 검출되었고, 14일에 증가하고, 28일에 높게 유지되었다. 109CFUs의 가장 높은 투약은 또한 피접종자 3명중 2명에게서 LPS- 및 편모-특이적 IgG를 자극하여, 7일 및 14일째에 각각 검출될 수 있었다.
결론
본 연구는 새로운 경구 장티푸스 백신 균주의 구성 성분으로서,ssaV돌연변이의 유용성을 입증하였다. aro 돌연변이만을 단독으로 갖는S.typhi균주는 주입된 투약에서 백신증을 초래해왔다. 따라서ssaV돌연변이는 이 초기 제제화를 사용하여 백신증을 근절하여 aro 돌연변이만에 대한 부가적인 수준의 안정성을 제공한다.
잘 내성화된다고 증명되었을 뿐만 아니라, ZH9는 주입된 3가지 모두의 투약 수준에서 또한 면역원성이라고 입증되었다. 혈청 항체를 자극하는 것에 관련하여, 중간(108CFUs) 및 가장 높은(109CFUs) 투약은S.typhiLPS 및 편모 특이적-혈청 IgG를 유도하는 108CFUs 주입된 3/3 백신 및 109CFUs 주입된 2/3 백신으로, 매우 면역원성이라고 입증되었다. 일반적으로 경구 백신 접종에 의하여 혈청 항체를 유도하는 것이 어렵기 때문에, 이 반응들은 매우 고무적이다.
S.typhi-특이적 혈청 항체 반응을 생성할 뿐만 아니라, ZH9는 또한 장 점막에서 면역 자극의 지표인 IgA ASCs를 초회항원자극하였다. 5/9 자원자 전체가 투약량-의존적으로 보이지 않는S.typhiLPS-특이적 IgA-분비 세포(ASC) 반응을 유도하였다.
WT05는 또한 잘 내성화되고 어떤 백신증도 검출되지 않았다. 흥미롭게도, 어떤 설사 또는 위장염의 증상이 어떤 자원자들에게서도 검출되지 않았다. 마우스에 주입된S.typhimurium내의 단순 aro 또는 SPI2 돌연변이를 갖는 돌연변이체 TML 균주를 사용하여 얻어진 이전 데이타는 이중aroC/ssaV돌연변이체가 예를 들어, 인간에게서 설사, 경련같은 일부 국소 장내 효과를 초래할 수도 있다는 것을 제시하였다. 이런 경우가 없는 것은 또한 aro 및 SPI2 돌연변이의 조합의 유용성을 뒷받침한다.
실시예 7
이종성 항원 운반체
외래 항원을 발현하고 전달하는ssaV:aroC이중 돌연변이체의 유용성을 입증하기 위해, WT05를E.coli열-불안정성 장관독(enterotoxin) B 소단위(LT-B)의 유전자를 발현하는 플라스미드(pBRDO26)로 형질전환하였다.
BALB/C 마우스(n=10/군)를 pBRD026을 발현하는 109CFUs(PBS내에 200㎖) WT05 또는 WT05 벡터 균주(대조구)로 0일 및 28일에 경구 면역화하였다. 비교를 위해(그리고 양성 대조구로서), 한 군의 마우스들(n=5)을 0일 및 28일에 10㎍의 정제된 LT(Sigma)로 경구 면역화하였다. 음성 대조구 마우스들(n=5)을 0일 및 28일에 200㎕ PBS로 경구 면역화하였다. 마우스들은 21, 28, 35일에 꼬리 정맥에서 그리고 42일에 심장 천자(puncture)에 의해 채혈하였었고 그리고 혈청 및 장 세척(42일에만)을 모집하고 -20℃에서 보관하였다.
WT05/LT-B로 면역화된 마우스 중 하나를 제외하고 모두 단일 경구 투약 후 28일에 LT-특이적 IgG(3,000-5,000의 역가)를 유도하였다. WT05 또는 PBS로 경구 면역화된 대조구 마우스는 모두 LT-특이적 IgG를 유도하지 않았다. 정제된 LT의 단일 투약에 의한 경구 면역화는 LT-특이적 항체의 더 높은 역가를 유도했다(6,000 -> 50,000). LT-B-특이적 혈청 IgG의 이소타입을 조사했을때, pBRD026을 발현하는 WT05 균주는 거의 광범위하게 LT-특이적 IgG2a를 유도하여 TH1-타입의 면역 반응의성향을 보이는 것이 확인되었다. 반대로, 정제된 LT(Sigma)로 면역화된 마우스는 거의 광범위하게 LT-특이적 IgG1을 유도하여 TH2-타입 반응을 보였다. 따라서,aroC/ssaV균주 내에서 LT-B를 발현하는 것은 완전한 면역 변조(modulation)를 촉진한다. TH1-타입 반응이 보호적인 병원성 유기체에서 유래한 항원이 발현될 때,Salmonella aroC/ssaV균주에 의해 생성된 TH1-성향의 반응은 중요하게 될 것이다.
Claims (17)
- Spi2 병원성 아일랜드내에 위치한 기구 유전자의 발현을 파괴하는 감쇠화 돌연변이 및 영양요구 돌연변이를 갖는 살모넬라 미생물.
- 제 1항에 있어서, 상기 영양요구 돌연변이는 aro 유전자의 발현을 파괴하는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제 2항에 있어서, 상기 aro 유전자는aroC인 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감쇠화 돌연변이는ssaV,ssaJ,ssaK또는ssaH유전자중 어느 것의 발현을 파괴하는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감쇠화 돌연변이는ssaV를 파괴하고, 상기 영양요구 돌연변이는aroC를 파괴하는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감쇠화 돌연변이는ssaK와ssaJ사이의 유전자간 영역내에 있는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 이종성 항원 또는 치료학적 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제 7항에 있어서, 상기 항원은 A형, B형, 또는 C형 간염 항원인 것을 특징으로 하는 미생물
- 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 살모넬라typhi Ty2인 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 본 발명에서 ZH9 또는 WT05로 개시된 것을 특징으로 하는 미생물.
- 치료 용도의 상기 항들 중 어느 한 항에 따른 미생물.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 미생물, 보조제 및 생리학적으로 수용가능한 희석제를 포함하는 백신 조성물, .
- 제 12항에 있어서, 단일 투약 단위로 107-1010CFUs를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 13항에 있어서, 108-109CFUs를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 시스템 세균 감염의 치료를 위한 정맥내 투여용 약제의 제조에의 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 미생물의 용도.
- 시스템 세균 감염의 치료를 위한 경구용 약제의 제조에의 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 미생물의 용도.
- 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 장티푸스의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 용도.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9910812.8A GB9910812D0 (en) | 1999-05-10 | 1999-05-10 | Vaccine composition |
| GB9910812.8 | 1999-05-10 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020067018279A Division KR100811319B1 (ko) | 1999-05-10 | 2000-05-09 | 감염의 치료를 위한 감쇠된 미생물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20020018193A true KR20020018193A (ko) | 2002-03-07 |
| KR100680391B1 KR100680391B1 (ko) | 2007-02-08 |
Family
ID=10853168
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020017014154A KR100680391B1 (ko) | 1999-05-10 | 2000-05-09 | 감염의 치료를 위한 감쇠된 미생물 |
| KR1020067018279A KR100811319B1 (ko) | 1999-05-10 | 2000-05-09 | 감염의 치료를 위한 감쇠된 미생물 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020067018279A KR100811319B1 (ko) | 1999-05-10 | 2000-05-09 | 감염의 치료를 위한 감쇠된 미생물 |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6756042B1 (ko) |
| EP (2) | EP1702927B1 (ko) |
| JP (1) | JP4583607B2 (ko) |
| KR (2) | KR100680391B1 (ko) |
| CN (1) | CN1177863C (ko) |
| AP (1) | AP1470A (ko) |
| AT (2) | ATE346090T1 (ko) |
| AU (1) | AU763898B2 (ko) |
| BR (1) | BRPI0010418B8 (ko) |
| CA (1) | CA2372553C (ko) |
| CY (1) | CY1107656T1 (ko) |
| CZ (1) | CZ301926B6 (ko) |
| DE (2) | DE60043868D1 (ko) |
| DK (1) | DK1183269T3 (ko) |
| EA (1) | EA004921B1 (ko) |
| ES (1) | ES2277591T3 (ko) |
| GB (1) | GB9910812D0 (ko) |
| HU (1) | HUP0201117A3 (ko) |
| IL (3) | IL146255A0 (ko) |
| MA (1) | MA25411A1 (ko) |
| MX (1) | MXPA01011477A (ko) |
| NO (1) | NO329520B1 (ko) |
| NZ (1) | NZ539260A (ko) |
| OA (1) | OA11940A (ko) |
| PT (1) | PT1183269E (ko) |
| TR (1) | TR200702949T2 (ko) |
| WO (1) | WO2000068261A2 (ko) |
| ZA (1) | ZA200108912B (ko) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ511170A (en) * | 1994-12-09 | 2005-02-25 | Imp College Innovations Ltd | Administering anitgens for protection against Salmonella infections |
| AU5860599A (en) * | 1998-09-04 | 2000-03-27 | Creatogen Aktiengesellschaft | Attenuated salmonella spi2 mutants as antigen carriers |
| GB9910812D0 (en) * | 1999-05-10 | 1999-07-07 | Microscience Ltd | Vaccine composition |
| GB0105924D0 (en) * | 2001-03-09 | 2001-04-25 | Microscience Ltd | Promoter |
| US7449178B2 (en) * | 2002-04-05 | 2008-11-11 | Merial Limited | Attenuated gram negative bacteria |
| US20080124355A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-05-29 | David Gordon Bermudes | Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment |
| WO2008153772A2 (en) * | 2007-05-25 | 2008-12-18 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | Chlamydia vaccine comprising htra polypeptides |
| US8703153B2 (en) | 2008-06-16 | 2014-04-22 | Prokarium Ltd. | Salmonella vectored vaccines against Chlamydia and methods of use |
| EP2318515A4 (en) * | 2008-08-06 | 2012-11-14 | Emergent Product Dev Uk Ltd | DIFFICULT CLOSTRIDIUM VACCINES, AND METHODS OF USE |
| US20120064114A1 (en) * | 2008-10-21 | 2012-03-15 | Emergent Product Development United Kingdom | Use of e. coli surface antigen 3 sequences for the export of heterologous antigens |
| US8481052B2 (en) | 2011-05-17 | 2013-07-09 | Cj Cheiljedang Corporation | Avirulent Salmonella gallinarum variants and pharmaceutical composition using the same |
| JP2016535766A (ja) | 2013-10-11 | 2016-11-17 | セルヴィシオ ガレゴ デ サウデ（エスイーアールジーエーエス） | 弱毒化生ワクチン |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11541105B2 (en) | 2018-06-01 | 2023-01-03 | The Research Foundation For The State University Of New York | Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance |
| US11471497B1 (en) | 2019-03-13 | 2022-10-18 | David Gordon Bermudes | Copper chelation therapeutics |
| US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
| EP3922255A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-15 | Prokarium Limited | Cancer therapy |
| EP4124342A1 (en) | 2021-07-28 | 2023-02-01 | Prokarium Limited | Cancer therapy with live attenuated bacteria |
| WO2023105076A1 (en) | 2021-12-09 | 2023-06-15 | Prokarium Limited | Combination cancer therapy |
| WO2024061748A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Prokarium Limited | Salmonella strain with chromosomally integrated landing pad |
| GB202215134D0 (en) | 2022-10-13 | 2022-11-30 | Prokarium Ltd | Composition |
Family Cites Families (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4440859A (en) * | 1977-05-27 | 1984-04-03 | The Regents Of The University Of California | Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms |
| US4704362A (en) * | 1977-11-08 | 1987-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression |
| NO794196L (no) * | 1978-12-22 | 1980-06-24 | Biogen Nv | Fremgangsmaate ved fremstilling av et rekombinert dna molekyl |
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| US5210035A (en) * | 1980-05-19 | 1993-05-11 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Non-reventing live vaccines |
| US4550081A (en) * | 1980-05-19 | 1985-10-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Non-reverting salmonella |
| US4837151A (en) * | 1980-05-19 | 1989-06-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Stanford University | Live vaccines comprising two mutations and foreign antigen |
| US4766075A (en) * | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
| US4757006A (en) * | 1983-10-28 | 1988-07-12 | Genetics Institute, Inc. | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
| US4677063A (en) * | 1985-05-02 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Human tumor necrosis factor |
| US5643579A (en) * | 1984-11-01 | 1997-07-01 | American Home Products Corporation | Oral vaccines |
| US4810648A (en) * | 1986-01-08 | 1989-03-07 | Rhone Poulenc Agrochimie | Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene |
| US5397697A (en) * | 1989-01-10 | 1995-03-14 | Ciba-Geigy Corporation | Identification of plant-responsive genes of bacteria |
| FR2664614B1 (fr) | 1990-07-11 | 1992-10-16 | Pasteur Institut | Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires. |
| SE9101433D0 (sv) | 1991-05-13 | 1991-05-13 | Marianne Hansson | Recombinant dna sequence and its use |
| WO1993004202A1 (en) | 1991-08-22 | 1993-03-04 | Washington University | Polynucleotide probes for salmonella |
| WO1993007266A1 (en) * | 1991-10-07 | 1993-04-15 | Idaho Research Foundation, Inc. | Genetic construct for selection of homologous recombinants on a single selective medium |
| AU3130893A (en) | 1991-11-15 | 1993-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Membrane expression of heterologous genes |
| US5356797A (en) * | 1991-11-15 | 1994-10-18 | Board Of Regents, The University Of Texas | Membrane expression of heterologous genes |
| JPH08503136A (ja) | 1992-11-06 | 1996-04-09 | リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ | Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａによるパスツレラ症に対する感染防御剤 |
| WO1994026933A1 (en) | 1993-05-13 | 1994-11-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Genetic footprinting: insertional mutagenesis and genetic selection |
| AU3958895A (en) | 1994-10-18 | 1996-05-06 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Membrane expression of heterologous genes |
| NZ511170A (en) * | 1994-12-09 | 2005-02-25 | Imp College Innovations Ltd | Administering anitgens for protection against Salmonella infections |
| US5700683A (en) * | 1995-02-17 | 1997-12-23 | Pathogenesis Corporation | Virulence-attenuating genetic deletions deleted from mycobacterium BCG |
| WO1997014800A1 (en) * | 1995-10-16 | 1997-04-24 | Smithkline Beecham Plc | Novel saliva binding protein |
| WO1997018225A1 (en) | 1995-11-14 | 1997-05-22 | The General Hospital Corporation | Salmonella secreted proteins and uses thereof |
| WO1998006428A1 (en) | 1996-08-16 | 1998-02-19 | The Uab Research Foundation | Mucosal immunogens for novel vaccines |
| GB9621091D0 (en) * | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
| DE69828182T2 (de) | 1997-02-14 | 2005-12-22 | Merck & Co., Inc. | Polynukleotid-impfstoff-formulierungen |
| US6455323B1 (en) | 1997-07-03 | 2002-09-24 | Pharmacia & Upjohn Company | Anti-bacterial methods and materials |
| GB9804809D0 (en) | 1998-03-06 | 1998-04-29 | Wallis Timothy S | Attenuated salmonella:materials and methods relating thereto |
| US6585975B1 (en) * | 1998-04-30 | 2003-07-01 | Acambis, Inc. | Use of Salmonella vectors for vaccination against helicobacter infection |
| AU5860599A (en) | 1998-09-04 | 2000-03-27 | Creatogen Aktiengesellschaft | Attenuated salmonella spi2 mutants as antigen carriers |
| EP1129196B1 (en) * | 1998-11-09 | 2008-01-09 | Microscience Limited | Virulence genes and proteins, and their use |
| GB9910812D0 (en) * | 1999-05-10 | 1999-07-07 | Microscience Ltd | Vaccine composition |
| EP1226254A2 (en) | 1999-11-05 | 2002-07-31 | L'Unité de Recherche en Biologie Moléculaire (URBM) des Facultés Universitaires Notre Dame de la Paix (FUNDP) | Virulence genes, proteins, and their use |
| JP3414342B2 (ja) * | 1999-11-25 | 2003-06-09 | 日本電気株式会社 | 集積回路チップの実装構造および実装方法 |
| WO2001048208A2 (en) * | 1999-12-23 | 2001-07-05 | Vmax Limited | Streptococcus pyogenes virulence genes and proteins and their use |
| GB0011108D0 (en) | 2000-05-08 | 2000-06-28 | Microscience Ltd | Virulence gene and protein and their use |
| GB0127657D0 (en) | 2001-11-19 | 2002-01-09 | Microscience Ltd | Virulence genes and proteins and their use |
| US7449178B2 (en) * | 2002-04-05 | 2008-11-11 | Merial Limited | Attenuated gram negative bacteria |
-
1999
- 1999-05-10 GB GBGB9910812.8A patent/GB9910812D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-05-09 PT PT00927538T patent/PT1183269E/pt unknown
- 2000-05-09 JP JP2000616235A patent/JP4583607B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-09 AT AT00927538T patent/ATE346090T1/de active
- 2000-05-09 EP EP06012488A patent/EP1702927B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 BR BRPI0010418A patent/BRPI0010418B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 US US09/569,601 patent/US6756042B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 DK DK00927538T patent/DK1183269T3/da active
- 2000-05-09 DE DE60043868T patent/DE60043868D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 IL IL14625500A patent/IL146255A0/xx active IP Right Grant
- 2000-05-09 CN CNB00808419XA patent/CN1177863C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-09 AT AT06012488T patent/ATE457998T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 AP APAP/P/2001/002317A patent/AP1470A/en active
- 2000-05-09 CA CA2372553A patent/CA2372553C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-09 EP EP00927538A patent/EP1183269B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 HU HU0201117A patent/HUP0201117A3/hu not_active Application Discontinuation
- 2000-05-09 NZ NZ539260A patent/NZ539260A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 KR KR1020017014154A patent/KR100680391B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 WO PCT/GB2000/001749 patent/WO2000068261A2/en active Application Filing
- 2000-05-09 AU AU45932/00A patent/AU763898B2/en not_active Ceased
- 2000-05-09 OA OA1200100295A patent/OA11940A/en unknown
- 2000-05-09 TR TR2007/02949T patent/TR200702949T2/xx unknown
- 2000-05-09 KR KR1020067018279A patent/KR100811319B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 EA EA200101187A patent/EA004921B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 ES ES00927538T patent/ES2277591T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 CZ CZ20014030A patent/CZ301926B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 DE DE60031974T patent/DE60031974T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 MX MXPA01011477A patent/MXPA01011477A/es active IP Right Grant
-
2001
- 2001-10-29 ZA ZA200108912A patent/ZA200108912B/xx unknown
- 2001-10-31 IL IL146255A patent/IL146255A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-11-08 NO NO20015464A patent/NO329520B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-11-09 MA MA26404A patent/MA25411A1/fr unknown
-
2004
- 2004-04-08 US US10/822,053 patent/US7211264B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-12-21 CY CY20061101836T patent/CY1107656T1/el unknown
-
2007
- 2007-02-01 US US11/701,214 patent/US7887816B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-29 IL IL186993A patent/IL186993A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7887816B2 (en) | Attenuated microorganisms for the treatment of infection | |
| US6936425B1 (en) | Attenuated salmonella SP12 mutants as antigen carriers | |
| JP2640525B2 (ja) | 無毒の微生物とその使用 | |
| JP2002521345A (ja) | 鳥類病原体を制御するため生きた弱毒化サルモネラワクチン | |
| EP3978013A2 (en) | A novel live attenuated shigella vaccine | |
| KR100628657B1 (ko) | ＡｒｏＣ, ＯｍｐＦ 및 ＯｍｐＣ 유전자 각각에 비복귀돌연변이로 약독화된 백신에 유용한 박테리아 | |
| US20030059442A1 (en) | Attenuated microorganisms for the treatment of infection | |
| AU3935300A (en) | Live attenuated bacteria for use in a vaccine | |
| Dougan et al. | Live attenuated Salmonella vaccines as carriers of antigens to the secretory and systemic immune systems | |
| PL203551B1 (pl) | Mikroorganizm Salmonella, kompozycja szczepionki zawieraj aca mikroorganizm Salmonella i zastosowanie mikroorganizmu Salmonella | |
| ZA200204725B (en) | Attenuated microorganisms for the treatment of infection. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| A107 | Divisional application of patent | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130117 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140121 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150116 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160104 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170119 Year of fee payment: 11 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |