NO329520B1 - Salmonella mikroorganisme samt anvendelse derav og vaksinepreparat - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår svekkete mikroorganismer som kan anvendes i vaksinepreparater for forebygging eller behandling av bakterielle eller virale infeksjoner. Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig Salmonella mikroorganisme samt anvendelse derav og vaksinepreparat.

Bakgrunn til oppfinnelsen

Det er godt etablert at levende svekkete mikroorganismer er meget effektive vaksiner; immunresponser fremkalt av slike vaksiner er ofte av større og av lengre varighet enn de produsert av ikke-replikerende immunogener. En forklaring for dette kan være at levende svekkete stammer etablerer begrensete infeksjoner i verten og etterligner de tidlige stadier av naturlig infeksjon. I tillegg, ulik drepte preparater, er levende vaksiner i stand til å fremkalle kraftige cellemedierte responser som kan være forbundet med deres evne til å replikere i antigenpresenterende celler, så som makrofager.

Der har vært en lang historie for anvendelse av levende svekkete Salmonella vaksiner som sikre og effektive vaksiner for forhindring av salmonellose i dyr og mennesker. Den levende svekkete orale tyfoidvaksine, Ty21a (Vivotif), fremstilt av det Sveitsiske serumvaksine instituttet, har vist seg å være en meget vellykket vaksine for forhindring av tyfoidfeber og er lisensiert i mange land omfattende USA og Europa.

Imidlertid, ble attenuering av denne stammen oppnådd ved anvendelse av kjemiske mutageneseteknikker og basisen for attenueringen av stammen er ikke fullstendig forstått. På grunn av dette, er vaksinen ikke ideell med hensyn til antallet doser (for tiden fire) og antallet levende organismer som har vært gitt i hver dose.

Moderne molekylærbiologi-teknikker, koblet med den økende kunnskap om Salmonella patogenese, har ført til identifikasjon av mange gener som er essensielle for in vivo veksten og overlevelsen av organismene. Dette har medført nye genmål for attenuering, hvilket fører til konseptet at fremtidige vaksinestammer kan være 'rasjonelt' svekket ved innføring av definerte ikke-reverterende mutasjoner inn i utvalgte gener kjent for å medvirke i virulens. Dette vil lette utviklingen av forbedrete vaksiner, spesielt med hensyn til immunogenisiteten, og derfor antallet doser som må gis.

Selv om mange svekkete stammer av Salmonella nå er kjent, har få kvalifisert seg som potensielle vaksinekandidater for anvendelse i mennesker. Dette kan delvis tilskrives behovet for å balansere immunogenisiteten til vaksinen med muligheten for Salmonella mikroorganismen til å bli reaktivert.

Det er klart at seleksjonen av passende mål for attenuering som vil resultere i en egnet vaksinekandidat, ikke er rett-frem, og ikke lett kan forutsies. Mange faktorer kan innvirke på egnetheten av den svekkete stammen, som en passende vaksine og det er meget forskning som utføres for å identifisere egnete stammer. For eksempel førte mange av de svekkete stammer som ble testet som vaksinekandidater til vaksinemi eller abscesser i pasienten.

Det er derfor ønskelig å utvikle en vaksine som har en høy grad av immunogenisitet med redusert mulighet for at mikroorganismestammen reverterer til en reaktiv form og som utviser en god sikkerhetsprofil med begrensete bivirkninger.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er basert på det funnet at to spesifikke attenuerte mutasjoner innført i en Salmonella mikroorganisme kan produsere en vaksine som har en høy grad av immunogenisitet og en lav risiko for at mikroorganismen reverterer til en reaktiv form. De resulterende vaksinestammer viser en god bivirkningsprofil.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig Salmonella mikroorganisme, kjennetegnet ved at den har en attenuerende mutasjon som ødelegger ekspresjonen av ssaV genet og en auxotrof mutasjon som ødelegger ekspresjonen av aroC genet.

Det er videre beskrevet vaksinepreparat omfattende en mikroorganisme ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4, kjennetegnet ved at det omfatter et adjuvans og et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av en mikroorganisme som definert i hvilken som helst av kravene 1 til 4, ved fremstillingen av et medikament for intravenøs administrering for behandling av systemisk bakterieinfeksjon.

Det er også beskrevet anvendelse av en mikroorganisme som definert i hvilken som helst av kravene 1 til 4, ved fremstillingen av et medikament for oral levering for behandling av systemisk bakterieinfeksjon.

Den første mutasjonen er innen en region av Salmonella påtogenisitetsøy to (Spi2); den andre er en auxotrof mutasjon, dvs. en mutasjon til å ødelegge ekspresjonen av et gen som koder for et protein nødvendig i en biosyntetisk bane.

Salmonella mikroorganismen kan være en attenuerende mutasjon som ødelegger ekspresjonen av et apparat-gen lokalisert innen Spi2 - patogenisitetøyen og en uavhengig auxotrof mutasjon. Den foretrukne attenuerende mutasjon er innen apparat-genet ssaV og den foretrukne auxotrofe mutasjon er innen aroC.

Mikroorganismen omfatter fortrinnsvis ytterligere én eller flere heterologe antigener eller terapeutiske proteiner, for eksempel antigener for patogene E. coli, Shigella, hepatitt A, B eller C, Herpes Simplex Virus og Human papilloma virus. Derfor, kan mikroorganismen virke som en leveringskonstituent for å immunisere mot infeksjoner forskjellige fra Salmonella.

Salmonella mikroorganismer kan følgelig anvendes ved fremstillingen av et medikament for intravenøs eller oral levering for behandling av en bakteriell eller viral infeksjon, f.eks. for behandling av tyfoid.

De svekkete Salmonella mikroorganismer ifølge foreliggende oppfinnelse danner vaksiner som overraskende stimulerer mukosal så vel som systemisk immunitet. Videre, forårsaker mikroorganismene ikke miltabscesser i en dyremodell, mens mutanter med enkeltmutasjoner gjør. Dette er en spesiell fordel av dobbeltmutantene som er definert her.

Beskrivelse av foreliggende oppfinnelse

Mikroorganismer og vaksinepreparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved kjente teknikker.

Valget av spesiell Salmonella mikroorganisme og seleksjon av den passende mutasjon, kan fremstilles av fagfolk uten utilbørlig eksperimentering. En foretrukket mikroorganisme er Salmonella typhimurium.

En første mutasjon kan innføres i et apparat-gen lokalisert innen regionen av Salmonella patogenisitetsøyen2, denne regionen er beskrevet i WO-A-9617951.

Salmonella patogenisitetsøyen to (Spi2) er én av to klassiske patogenisitetsøyer lokalisert på Salmonella kromosomet. Spi2 omfatter mange gener som koder for en type III sekresjons-system involvert i transport av Spi2-kodete virulens-assosierte proteiner (såkalt effektorproteiner) ut av Salmonella bakterier og potensielt direkte inn i mål vertsceller så som makrofager. Del av Spi2 ( apparat-genene) koder for sekresjonsapparatet av type III systemet. Spi2 er absolutt essensiell for patogenesen og virulens av Salmonella i en mus, en observasjon nå dokumentert av mange forskjellige grupper rundt om i verden. S. typhimurium Spi2 mutanter er meget svekket hos mus utfordret med de orale, intravenøse og intraperitoneale administreringsmetoder.

Apparat-gener lokalisert innen Spi2 er nå godt karakteriserte; se for eksempel Hensel et al, Molecular Microbiology (1997); 24(1): 155-167. Gener egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter ssaV, ssaJ, ssaK, ssaL, ssaM, ssaO, ssaP, ssaQ, ssaR, ssaS, ssaT, ssail og ssaH gener.

Mutasjonen i Spi2 regionen må ikke nødvendigvis være innen et gen for å ødelegge dets funksjon. For eksempel kan en mutasjon i en oppstrøms regulatorisk region også ødelegge gen-ekspresjon, hvilket fører til attenuering. Mutasjoner i en intergenisk region kan også være tilstrekkelig til ødelegge genfunksjon.

Den andre mutasjon er benevnt en "auxotrof mutasjon" som ødelegger et gen som er essensielt i en biosyntetisk reaksjonsvei (bane). Den biosyntetiske banen er én som er tilstede i Salmonella, men ikke tilstede hos pattedyr. Derfor, kan mutantene ikke avhenge av metabolitter funnet i den behandlete pasienten for å omgå effekten av mutasjonen. Egnete gener for den auxotrofe mutasjonen, omfatter hvilket som helst aro gen, f.eks. aroA, aroC, aroD og aroE.

Vaksinepreparatet kan omfatte en Salmonella mikroorganisme som har attenuerte mutasjoner i ssaV og aroC.

Mutasjoner kan innføres i mikroorganismen ved anvendelse av hvilken som helst kjent teknikk. Fortrinnsvis, er mutasjonen en delesjonsmutasjon, hvor ødeleggelsen av genet er forårsaket av utskjæring av nukleinsyrer. Alternativt, kan mutasjoner innføres ved innskudd av nukleinsyrer eller ved punktmutasjoner. Metoder for innføring av mutasjoner inn i de spesifikke regioner vil være åpenbare for fagfolk.

I tillegg til de to mutasjoner, kan Salmonella mikroorganismen også omfatte heterologe antigener. Den svekkete mikroorganismen kan derfor virke som en leveringskonstituent for administrering av antigener mot andre bakterielle eller virale infeksjoner. Antigener som er egnet for anvendelse på denne måten vil være åpenbare for fagfolk og omfatter:

Patogene E. coli antigener, dvs. ETEC

Hepatitt A, B og C antigener

Lime sykdom antigener

vibrio cholera antigener

Helicobacter antigener

Herpes Siimplex virus antigener

Human papilloma virus antigener

Dette systemet har også potensiale til å levere terapeutiske proteiner, f.eks. cytokiner, for behandling av pasienter, f.eks. pasienter infisert med hepatitt. Metoder for leveringen av heterologe antigener eller terapeutiske proteiner ved anvendelse av vaksinepreparateter vil være åpenbare for fagfolk.

Vaksiner laget ved anvendelse av mikroorganismene ifølge foreliggende oppfinnelse har nytte i behandlingen av infeksjoner i human pasienter og ved behandling av veterinærinfeksjoner.

Dobbeltmutasjonen tilveiebringer en effektiv måte å svekke mikroorganismen på og gir en sikker vaksinekandidat.

Vaksinepreparateter gir effektiv beskyttelse, til og med i immuno-kompromitterte pasienter, og viktig nok tilbyr en lav risiko i utvikling av miltabscesser. Miltabscesser er identifisert ved anvendelse av vaksiner basert på en enkeltmutasjon og derfor kan de foreliggende preparater tilby en vesentlige fordel for pasienter.

For å formulere vaksinepreparatene kan mutante mikroorganismer være tilstede i et preparat sammen med hvilket som helst egnet farmasøytisk akseptabelt adjuvans, fortynningsmiddel eller tilsetningsmiddel. Egnede preparater vil være åpenbare for fagfolk. Preparatene kan utvikles for hvilken som helst egnet måte for administrering. Foretrukket administrering er via den orale eller intravenøse rute og vaksinene er levende svekkete Salmonella mikroorganismer. Antallet mikroorganismer som er nødvendig tilstede i preparatene kan bestemmes og optimaliseres av fagfolk. Imidlertid, kan generelt, en pasient administreres omtrent 10<7->10<10> CFUer, fortrinnsvis omtrent 10<8->10<9 >CFUer i en enkel doseenhet.

De følgende Eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Dette eksemplet beskriver fremstilling av en mutant stamme betegnet ZH9 som har aktivitet som en menneske oral tyfoidvaksine. Stammen er avledet fra den virulente S. typhi stammen Ty2, opprinnelig isolert fra et tyfoidtilfelle. Den avledete stammen har en definert mutasjon innen purk og aroA.

Ty2 for konstruksjonen av ZH9

S. typhilyl ble opprinnelig isolert fra et individ med tyfoidfeber i 1916 og har vært anvendt for avledning av alle lisensierte tyfoidvaksiner. Stammen ble oppnådd fra PHLS nasjonalkultur kolleksjonen ved Colindale. Den ble oppnådd som en frysetørket kultur, NCTC -nummeret er 8385.

Kloning av S. typhi aroC genet fra S. typhi Ty2

S. typhi Ty2 ble gjenvunnet fra lager og dyrket natten over i Luria Bertani (LB) medium. Cellene ble høstet og helcelle-DNA ble fremstilt. DNA-fragmenter av S. typhi Ty2 DNA ble dannet ved partiell spaltning med restriksjonsenzymet Sau3A og de resulterende fragmenter ble ligert til SamH1 spaltet pHC79 for å danne et kosmidbibliotek av S. typhi Ty2 DNA ved anvendelse av E. coli HU835 som mottager. For å isolere DNAet som koder for aroC fra S. typhi DNAet, ble kosmidbiblioteket anvendt til å transdusere E. coli AB2849 som inneholdt en mutasjon i aroC genet og er avhengig av aromatiske forbindelser for vekst. Transduksjonblandingen ble utsådd på minimal medium som manglet aromatiske forbindelser, og inkubert ved 37°C. Flere isolert kolonier ble observert etter inkubering natten over. Disse bakterier hadde antagelig oppstått som en konsekvens av komplementering av aroC mutasjonen i AB2849 med en kosmid klon inneholdende det intakte aroC gen fra. Kosmid-DNA fra én av disse stammer ble renset. Et 5,2kb H/nc/lll-fragment fra dette kosmidet ble klonet inn i pUC18, hvilket gir plasmid pTAC2 som var istand til å komplementere delesjonen av aroC i AB2849, som demonstrerer at den inneholder S. typhi aroC genet.

Dannelse av en definert delesjon av det klonete S. typhiTy2 aroC

En definert 600bp-delesjon ble dannet innen det klonete aroC-genet ved anvendelse av PCR. Oligonukleotid-primere anvendt i PCR ble utformet ved anvendelse av den publiserte DNA-sekvensen av S. typhi aroC genet (Acc. M27715). DNA 5' til aroC genet ble amplifisert fra pTAC2 ved anvendelse av primere SEKV ID NR. 3 og SEKV ID NR. 1. SEKV ID NR. 3 hybridiserer til vektor-DNA, SEKV ID NR. 1 hybridiserer til 5'- regionen av aroC. DNA 3' til aroC -genet ble amplifisert ved anvendelse av primere SEKV ID NR. 4 og SEKV ID NR. 2. SEKV ID NR. 4 hybridiserer til vektor- DNA, SEKV ID NR. 2 hybridiserer til 3'-regionen av aroC. De resulterende PCR-produkter hadde Xba\ seter innført i 5'-ender for å lette kloning. Fragmentene ble klonet inn i vektoren pUC18. Den endelige plasmid- konstruksjonen, betegnet pMIAC23, inneholder en definert delesjon av aroC (stilling 544 til 1143) på et 4,8 kb H/nc/lll-fragment. Hind\\\-fragmentet blir innsatt ved /-//nc/lll-setet av pUC18. Ett enkelt Xbal-sete er tilstede ved setet til aroC-delesjonen.

Innføring av aroC- mutasjonen inn i S. typhi Jy2- genomet

Selvmordsplasmidet pCVD442 (Donnenberg & Kaper, Infection and Immunity, 1991; 59: 4310-4317) ble anvendt som en vektor for å innføre aroC-delesjonen inn i genomet av S. typhi Tyl. 4,8kb H/nc/lll-fragmentet inneholdende aroC-delesjonen ble isolert fra pMIAC23 og endene gjort butte ved anvendelse av Stratagene DNA poleringssett. Plasmid-pCVD442 ble linearisert ved spalting med Smal, behandlet med alkalisk fosfatase og ligert til de butt-endete fragmenter. Den nødvendige konstruksjonen ble isolert og betegnet pYCVC21.

pYCVC21 ble innført i S. typhilyl ved anvendelse av en standard elektroporeringsprotokoll. Plasmidet var istand til integrere inn i Ty2- genomet etter rekombinering mellom de homologe regioner på plasmidet og genomet, hvilket gir ampicillinresistente transformanter. Disse transformantene inneholdt en kopi av både det opprinnelige villtype aroC og det deleterte aroC-genet. Dyrking av disse stammer i fravær av ampicillin tillater for en andre rekombinerings-hendelse å forekomme som resulterte i tap av pCVD442 DNA-sekvenser og én kopi av aroC- genet, enten villtype- kopien eller den deleterte kopien. S. typhi Ty2 bakterier som hadde gjennomgått denne andre rekombinerings-hendelsen ble identifisert som ampicillin-sensitive derivater som var istand til å vokse i nærvær av

5% sukrose (pCVD442 bærer sacB-genet som når uttrykt, resulterer i en sukrose sensitiv fenotype). Stammer som hadde beholdt bare det deleterte aroC-genet ble initielt identifisert som stammer som ikke var i stand til å vokse på minimal media plater i fravær av et supplement av aromatiske forbindelser. aroC-genotypen ble bekreftet ved anvendelse av PCR-analyse. Primere som har SEKV ID NR. 5 og SEKV ID NR. 6 ga et produkt på 994bp for villtypen aroC og 400bp for det deleterte aroC-genet. Sekvensanalyse av de resulterende PCR-produkter bekreftet tilstedeværelsen av den nødvendige delesjon i 5 individuelle isolater betegnet DTY6, DTY7, DTY8, DTY9 og DTY10. Disse stammer ble lagret i Mikrobank medisinglass ved - 70°C for langtids lagring. Stamme DTY8 ble valgt for ytterligere manipulering.

Innføring av en ssa V mutasjon inn i S. typhi aroC mutanten DTY8

Et 7,5 kb Pstl- fragment inneholdende ssaV regionen av S. typhi ble amplifisert fra et total DNA-preparat ved anvendelse av PCR og klonet inn i vektoren pCR2,1 (Invitrogen). PCR-oligonukleotidprimere ble anvendt, som har SEKV ID NR. 7 og SEKV ID NR. 8, ble utformet til S. typhimurium SPI2 sekvensen. Den resulterende plasmidkonstruksjonen ble betegnet pTYSV21.

En plasmidkonstruksjon som har en delesjon av ssaV genet ble avledet fra pTYSV21 ved anvendelse av revers orienterings-PCR. Primere hybridiserende til 5' (SEKV ID NR. 9) og 3' (SEKV ID NR. 10) regioner av ssaV -åpen leseramme, ble utformet til S. typhimurium Spi2 sekvensen. Et Avr\\ restriksjonssete ble innført i 5'-regionen av hver primer, et Xbal-sete ble innført i SEKV ID NR. 10. Xbal-sete tjener som et merke for ssaV-mutasjonen slik at det kan detekteres lett ved restriksjonsanalyse. Det resulterende PCR-produktet ble underkastet spalting med Avr\\ og ryggradplasmid-molekyler renset etter agarosegel-elektroforese. Re-sirkularisering på de resulterende fragmenter ved >4vrll klebrig-ender ga den nødvendige delesjonskonstruksjonen pYDSVI. pYDSVI inneholder et 5,5kb Pstl-fragment med en definert 1894bp delesjon innen ssaV- åpen leseramme.

Selvmordsplasmidet pCVD442 ble anvendt som en vektor for å innføre ssaV- delesjonen inn i genomet til S. typhi Ty2 aroC-mutanten DTY8. 5,5kb Psfl-fragmentet inneholdende ssaV- delesjonen ble isolert fra pYDSVI og endene laget butte ved behandling med Klenow DNA-polymerase. Plasmid-pCVD442 ble linearisert ved spalting med Smal, behandlet med alkalisk fosfatase og ligert til de butt-endete fragmentene. Den nødvendige konstruksjonen ble isolert og betegnetYDSV214.

pYDSV214 ble innført i S. typhi DTY8 ved anvendelse av elektroporering. Ampicillin-resistente transformanter ble valgt og deretter dyrket i fravær av amplicillin for å tillate tap av pCVD442 DNA-sekvenser og én kopi av ssaV- genet, enten villtype-kopien eller den deleterte kopien. Stammer som hadde gjennomgått denne andre rekombinerings-hendelsen ble identifisert som ampicillin-sensitive, sukrose-resistente kolonier. Stammer som hadde beholdt bare det deleterte ssaV-genet ble identifisert ved anvendelse av PCR-analyse. Primere som har SEKV ID NR. 11 og SEKV ID NR. 12 ga et produkt av 2485bp for villtypen ssa V og 591 bp for det deleterte ssaV-genet. Sekvensanalyse av de resulterende PCR-produkter bekreftet tilstedeværelsen av den nødvendige delesjonen i 5 individuelle isolater, ZH2, ZH4, ZH6, ZH7 og ZH9. Stamme ZH9 ble valgt for fremstilling av en CGMP hovedcelle-bank.

Eksempel 2

Dette eksemplet beskriver fremstilling av en S. typhimurium mutant-stamme betegnet WT05 som har vaksineaktivitet mot human gastroenteritt. Stammen er avledet fra den kjente human virulente S. typhimurium stammen TML.

TML for konstruksjonen av WT05

TML ble opprinnelig isolert fra en pasient som lider av gastroenteritt og ble identifisert i laboratoriet til Dr. John Stevens ved Birmingham University. Den ble lyofilisert ved Wellcome forskningslaboratoriet og tildelt et kulturnummer, BRD 519. Kulturen ble oppnådd fra Birmingham University.

Dannelse av en definert delesjon av det klonete S. typhimurium ssa V genet

Et plasmid (plasmid 7-2, Shea et al; PNAS, 1996; 93: 2593-2597) ble dannet ved kloning av et 7,5kb Psfl-fragment isolert fra S. typhimurium LT2 inn i Psfl-setet til pUC18. ssa V er posisjonert sentralt på dette fragmentet. En plasmidkonstruksjon inneholdende en definert delesjon av ssaV ORF ble avledet fra plasmid 7-2 ved anvendelse av revers orienterings-PCR. Primere hybridiserende til de 5' (SEKV ID NR. 13) og 3' (SEKV ID NR. 14) regioner av den ssaV- åpen leseramme ble utformet til S. typhimurium Spi2 sekvensen. Et A vri I restriksjonssete ble innført i 5'-regionen av hver primer og et Xbal-sete ble innført i SEKV ID NR. 14. Xbal-setet tjener som et merke for ssaV-mutasjonen slik at den lett kan detekteres ved restriksjonsanalyse. Det resulterende PCR-produktet ble underkastet spalting med >Avrll og ryggradplasmid-molekyler renset etter agarosegel-elektroforese. Re-sirkularisering av de resulterende fragmenter ved de Avr\\ klebrige-ender ga den nødvendige delesjonskonstruksjonen betegnet pMDSVI. pMDSVI inneholder et 5,5kb Psfl-fragment med en definert 1894bp delesjon innen ssaV -åpen leserammen, et yAvrll og et Xbal-restriksjonssete er ved setet til delesjonen.

Selvmordsplasmidet pCVD442 ble anvendt som en vektor for å innføre ssaV- delesjonen inn i genomet av S. typhimurium TML. 5,5kb Psfl -fragmentet inneholdende ssaV- delesjonen ble isolert fra pMDSVI og endene gjort butte ved behandling med Klenow DNA-polymerase. Plasmid pCVD442 ble linearisert ved spalting med Smal, behandlet med alkalisk fosfatase og ligert til de butt-endete fragmentene. Den nødvendige konstruksjonen ble isolert og betegnet pMDSV22.

pMDSV22 ble innført i S. typhimurium TML ved anvendelse av konjugering. Til denne enden ble konstruksjonen transformert inn i E. coli stammen S17-1 A pir. Konjugasjon ble utført i henhold til standard prosedyrer. Plasmid pMDSV22 var i stand til å integrere inn i TML-genomet etter rekombinering mellom de homologe regioner på plasmidet og genomet, hvilket gir ampicillinresistente trans-konjuganter. Et transkonjugat betegnet mdsv-WT2 ble valgt for ytterligere manipulationer. Dette transkonjugatet inneholder en kopi av både den opprinnelige villtype ssa V og det deleterte ssaV -genet. Den ble dyrket i fravær av ampicillin for å tillate en andre rekombinerings-hendelse å forekomme som ville resultere i tap av pCVD442 DNA-sekvensene, og én kopi av ssaV- genet, enten villtypekopien eller den deleterte kopien. Isolater som hadde gjennomgått denne andre rekombinerings-hendelsen ble identifisert som ampicillin-sensitive derivater som var i stand til vokse i nærvær av 5% sukrose (pCVD442 bærer sacB- genet som når uttrykt resulterer i en sukrose-sensitiv fenotype). Stammer som hadde beholdt bare det deleterte ssaV- genet ble identifisert ved anvendelse av PCR-analyse. Primere som har SEKV ID NR. 15 og SEKV ID NR. 16 ga et produkt av 2485bp for villtypen ssaV og 591 bp for det deleterte ssaV- genet. Sekvensanalyse av de resulterende PCR-produkter bekreftet tilstedeværelsen av den nødvendige delesjonen i 4 individuelle isolater, ZH20, ZH23, ZH25 og ZH26. Disse stammer

ble lagret i LB pluss 15% glycerol at -80°C for langvarig lagring. Stamme ZH26 ble valgt for ytterligere manipulering.

Kloning av S. typhimurium aroC genet fra S. typhimurium TML

Genomisk DNA ble isolert fra S. typhimurium TML og spaltet med Hind\\\. /-//nc/lll-fragmenter i størrelsesområdet 5 til 6kb ble renset og ligert til /-//nc/lll-spaltet pBluescript. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere en E. coli aroC-mutant, AB2849 og kloner inneholdende S. typhimurium aroC-genet ble valgt i kraft av deres evne til å komplementere denne stammen. Analyse av én klon, pDAC1, demonstrerte at den inneholdt et 5,2kb H/nc/lll-fragment.

En definert 600bp-delesjon ble dannet innen det klonete aroC-genet ved anvendelse av PCR. Oligonukleotid-primere ble utformet ved anvendelse av den publiserte DNA-sekvens av S. typhi aroC-genet (Acc. M27715). DNAet 5' til aroC-genet ble amplifisert fra pDAC1 ved anvendelse av primere som har SEKV ID NR. 19 og SEKV ID NR. 17. SEKV ID NR. 19 hybridiserer til vektor DNA, SEKV ID NR. 17 hybridiserer til 5'-regionen av aroC. DNAet 3' til aroC-genet ble amplifisert ved anvendelse av primere som har SEKV ID NR. 20 og SEKV ID NR. 18. SEKV ID NR. 20 hybridiserer til vektor-DNA, SEKV ID NR. 18 hybridiserer til 3'- regionen til aroC. De resulterende PCR-produkter hadde Xba\ seter innført i 5'- endene for å lette kloning. Fragmenter ble klonet inn i vektoren pUC18. Den endelige plasmidkonstruksjon pMIAC8 inneholder en definert delesjon av aroC (Acc. M27715 stilling 544 til 1143) på et 4,8 kb Hind\\\- fragment. HindUl- fragmentet blir innsatt ved /-//nc/lll-setet til pUC18. Et enkelt Xba\- sete er til stede ved setet av delesjonen.

Innføring av aroC- mutasjonen inn i S. typhimurium ssa V -mutanten ZH26

Selvmordsplasmidet pCVD442 ble anvendt som vektor for å innføre aroC-delesjonen inn i genomet av S. typhimuriuim TML. 4,8kb Hind\\\ -fragmentet inneholdende aroC- delesjonen ble isolert fra pMIAC8 og endene gjort butte ved anvendelse av Stratagene DNA-poleringssettet (Del No. 200409). Plasmid pCVD442 ble linearisert ved spalting med Smal, behandlet med alkalisk fosfatase og ligert til de butt-endete fragmenter. Den nødvendige konstruksjonen ble isolert og betegnet pMCVC16. pMCVC16 ble innført i S. typhimurium ZH26 ved anvendelse av elektroporering. Ampicillin-resistente transformanter ble valgt og fikk vokse i fravær av ampicillin for å tillate tap av pCVD442 DNA-sekvenser og én kopi av aroC- genet, enten villtypekopien eller den deleterte kopien. Stammer som hadde gjennomgått denne andre rekombinerings-hendelsen ble identifisert som ampicillin-sensitive derivater som var i stand til vokse i nærvær av 5% sukrose. Stammer som hadde beholdt bare det deleterte aroC- genet ble initialt identifisert som stammer som var ute av stand til å vokse på minimal media plater i fravær av et supplement av aromatiske forbindelser. aroC- genotypen ble bekreftet ved anvendelse av PCR-analyse. Primere som har SEKV ID NR. 21 og SEKV ID NR. 22 gir et produkt av 994bp for villtypen aroC og 400bp for det deleterte aroC-genet. Sekvensanalyse av de resulterende PCR-produkter bekreftet tilstedeværelsen av den nødvendige delesjonen i 4 individuelle isolater betegnet WT05, WT09, WT10 og WT12. Stamme WT05 ble valgt for fremstilling av en CGM P hovedcelle-bank.

Eksempel 3

Den følgende konstruksjon ble fremstilt for å teste dobbeltmutant- vaksiner i en dyremodell. S. typhimurium SL1344, en stamme som infiserer mus, ble anvendt, med enkelt og dobbeltmutasjoner tilstede.

En ssaV::aph (ikke-polar) mutasjon fra S. typhimurium 12023s ble P22 transdusert til SL1344, hvilket gir enkelt Spi2-mutanten.

aroC delesjon/pCVD422 selvmordsvektoren pMCVC16 ble elektroporert inn i S. typhimurium stammen LB5010 og merodiploider ble oppnådd. aroC-delesjon merodiploiden ble deretter P22 transdusert fra LB5010 merodiploiden til SL1344. SL1344 merodiploiden ble deretter resolvert ved anvendelse av sukroseseleksjon, hvilket gir enkelt aroC- mutanten.

Dobbeltmutanten ble dannet ved P22 transduksjon av aroC-delesjon merodiploiden fra LB5010 inn i SL1344 ssaV::aph. Plasmidsekvenser ble resolvert fra merodiploiden utgående stamme 3, aroC-delesjonsmutasjonen i SL1344 ssaV::aph bakgrunn.

Pre-klinisk farmakodynamisk undersøkelser på definerte aroC/ssaV Sa//none//a-mutanter

Sa/mone/øt-mutanter (stamme SL1344) inneholdende definerte mutasjoner i enten aroC, ssaV eller en kombinasjon av begge mutasjoner er evaluert i stor utstrekning i BALB/C mus for å bedømme attenuering, persistens av organismene og evne til å immunisere mot utfordring med villtypestammen.

Eksempel 4

Dyr immunisert ved intravenøs rute

Beskyttelsesundersøkelser

Grupper av ti BALB/C mus ble immunisert i.v. med 10<5>og 10<6> organismer av SL1344 aroC, SL1344 ssaV og SL1344 aroC: ssaV dyrket natten over i LB medium og resuspendert i saltvann for administrering. Mus ble utfordret 6 uker senere med 10<5> villtype organismer gitt intravenøst. Ti organismer av denne villtypestammen gitt intravenøst er tilstrekkelig til drepe mus.

Alle musene gitt de enkle aroC- eller ssaV-mutanter ble solid beskyttet etter utfordring med begge doser og forble friske gjennom hele forsøket, og utviste ingen tegn på sykdom. For dobbeltmutanten var 90% av dyrene solid beskyttet, som mottok immunisering med 10<6> organismer. En av dyrene døde 8 dager etter utfordringen. For dyrene som ble immunisert med den lavere dose, overlevde bare 1 av musene utfordringen.

Dette forsøket demonstrerer at immuniseringen med Salmonella ssaV mutanter, enten alene eller i kombinasjon med en aroC-mutasjon vil immunisere mus mot utfordring med villtype Salmonella- stamme.

Persistens av stammer

Grupper av mus ble gitt 10<6> organismer av de tre Salmonella- mutanter beskrevet ovenfor. Fire mus ble avlivet ved forskjellige tidspunkter opptil dag 14, og telling av organismer i levre og milter ble utført. Tellinger av alle tre mutanter var sammenlignbare opp til dag 10, hvor tellingene var omtrent 5 X 105 organismer i hvert organ. Ved dag 14 ble en forskjell demonstrert mellom enkeltmutantene og dobbeltmutantene, der var en log mindre i antallet av dobbeltmutant-organismer i både lever og milter.

Den andre viktige forskjellen mellom enkeltmutanten og aroC/ ssaV-dobbeltmutanten er at det ikke var noen leverabscesser tilstede ved et hvilket som helst tidspunkt i løpet av forsøket for dobbeltmutanten. Imidlertid, hadde mus infisert med enkeltmutanter leverabscesser tilstede ved dag 10 og 14. Dette er et viktig funn som sterkt støtter anvendelse av denne kombinasjonen av mutasjoner for evaluering for fremstilling av vaksiner.

Immunogenisitet

Mus immunisert som ovenfor ble blødd og antistofftitrene ble bestemt mot helcelle Salmonella ved anvendelse av en ELISA. Alle tre stammer ble demonstrert å være meget immunogene, utløsende høye titre av sirkulerende IgG mot Salmonella.

Eksempel 5

Dyr immunisert ved den orale rute

Persistens av stammer

Grupper av mus immunisert oralt med 5 x 10<9> organismer av hver av de tre Sa/mone/tø-mutantene ble avlivet ved periodiske intervaller og antallet av organismer telt i levre og milter. For enkelt aro-mutanten og enkelt ssaV-mutanten var tellingene i levre og milter henholdsvis 10<3> og 10<2>, opp til omtrent dag 21. Deretter var antallet redusert. For musen som mottok aroC: ssaV dobbelt-mutanter, ble organismer praktisk talt udetekterbare i leverne og miltene etter oral immunisering.

Oral immunisering og intravenøs utfordring av A-J mus vaksinert med Salmonella typhimurium TML aroClssaV (WT05).

Formålet med dette forsøket var å bestemme den beskyttende effektivitet av 5 x 10<9> aroC/ ssaVS. typhimurium TML-mutanter i en oral ityr murin vaksinering og intravenøs utfordringsmodell. Denne modellen minner nærmere om humanrespons på Salmonella i at disse dyr er mindre mottagelige enn en ity<s >bakgrunn. 5 x 10<9> S. typhimurium TML aroC/ ssaV i et volum på 0,2 ml PBS ble inokulert oralt med "gavage"-rør inn i 10, 6-8 uker gamle A-J mus og forlatt i 8 uker. To mus ble kun gitt PBS, på denne tiden og tjente som kontrolldyr. Etter at 8 uker hadde gått ble de to immuniserte gruppene utfordret intravenøst med 10<7 >villtype S. typhimurium TML. Mus ble observert i 30 dager etter utfordring.

Alle dyr ble godt beskyttet mot villtype utfordring (100% overlevelse, 10/10 dyr levde). Mus kun gitt PBS og deretter utfordret med villtype S. typhimurium TML døde på dag 6 etter utfordring.

I en ity<r> bakgrunn synes den doble S. typhimurium TML aroC/ssaV å beskytte mus gitt en oral dose av 5 x 10<9>. Dette kan være viktig for human-situasjonen fordi ity<r->mus er en bedre modell på human salmonellose, i betydning av mottagelighet for infeksjon.

Undersøkelser ble også utført for å bedømme motstandsdyktigheten (persistensen) av dobbeltmutanter i leverne og miltene til musene. Det ble funnet at dobbeltmutanter persisterte ved lave nivåer til rundt dag 21. Ved dag 28, er mutantstammen klarert.

Eksempel 6

Human klinisk forsøk

18 friske frivillige ble rekruttert til en åpen merking, ikke-placebo kontrollert-studie. Etterfølgende passende screening, mottok hver av 3 frivillige en enkelt oral dose av enten 10<7>, 10<8> eller 10<9> CFUer av S. typhi ZH9 eller S. typhimurium WT05. Mikroorganismer fremstilt som ovenfor ble resuspendert til de passende doseringskonsentrasjoner i et endelig volum på 100 ml 2% (vekt/volum) natriumbikarbonat-løsning for å nøytralisere mavesyre. Denne væske-suspensjonen ble administrert oralt til de frivillige. Frivillige ble deretter isolert i 72 timer og deretter fulgt opp etter immunisering for sikkerhet og immunogenisitet.

Frivillige ble bedømt for reaktogenisitet og andre ugunstige hendelser forbundet med vaksinasjon ved observasjon, fysisk undersøkelse og ved fullførelse av dagbok-kort. I tillegg ble, blod, avføring og urin oppsamlet for forsøk for vaksinemi, "shedding" og persistens av vaksinestammer. Ytterligere sikkerhetsdata ble oppnådd ved å måle nivåer av C-reaktivt protein (CRP) og leverfunksjon-enzymer (ALT) i blod, total hvite blodcelle (WBC)-tellinger og erytrocyttsedimentasjonshastigheter (ESR) ved anvendelse av standardprosedyrer. Disse parametere ble målt på blod tatt daglig inntil dag 7 og deretter ved ukentlige intervaller inntil dag 28.

Analyse av mukosal og systemiske immunresponser

Blod- og salivaprøver ble oppsamlet før immunisering og deretter ved dagene 7, 14, 21 og 28 etter immunisering, saliva og serum ble frosset ved -70 °C inntil analyse ved ELISA. Perifert blod mononukleære celler ble oppsamlet og testet for tilstedeværelsen av antistoff-utskillende celler (ASCer) ved anvendelse av ELISPOT-teknikken.

Både S. typhi ZH9 og S. typhimurium WT05 ble godt tolerert i alle frivillige. Ingen alvorlig ugunstige hendelser ble oppdaget i noen av de frivillige ved hver av de 3 dosenivåer og blod og urinkulturer forble negative i alle vaksinerte ved alle tidspunkt undersøkt. Således resulterer, immunisering med både S. typhi ZH9 og S. typhimurium WT05 ikke i vaksinemier. Ingen av de frivillige gitt en av stammene utviklet diarre eller vedvarende høy-gradig feber, hvilket ytterligere indikerer sikkerheten av vaksinestammene. Vedvarende eksresjon eller vaksinemi utover dag 7 ble ikke observert i noen av de 3 dosegruppene av S. typhi ZH9 eller i lavdose (10<7>) av S. typhimurium WT05.

Mukosale og systemiske immunresponser fremkalt av S. typhi ZH9

Oral immunisering med en enkelt lavdose (1 x10<7> CFUer) av S. typhi ZH9 resulterte i primingen av S. typhi -spesifikke IgA-utskillende ASCer i 2 av 3 frivillige detektert 7 dager etter immunisering. Påfølgende testing på dagene 14 og 21 viste at IgA ASCer fortsatt var detekterbare, men ved meget lavere nivåer og hadde forsvunnet ved dag 28. I nesten alle vaksinerte som svarte, var tallet av ASCer høyest på dag 7. Overraskende, resulterte inntak av en høyere dose (10<8 >CFUer) av S. typhi ZH9 i en lav IgA ASC-respons i bare én av tre vaksinerte. Inntak av den høyeste dosen (1x10<9> CFUer) primet IgA ASCer i 2 av 3 frivillige.

Salmonella-spesifikk serum antistoff-respons

Oral immunisering med en enkelt lavdose (1 x10<7> CFUer) av S. typhi ZH9 feilet i å fremkalle S. typhi LPS-spesifikk serum IgG (til tross for dannelse av IgA-ASCer i 2/3 vaksinerte) når undersøkt på dagene 7, 14, 21 og 28. Tilsvarende produserte bare 1/3 meget lave nivåer av flagella-spesifikk IgG. Imidlertid, resulterte inntak av 10<8> CFUer i produksjon av høye nivåer av både LPS og flagella-spesifikk IgG i alle 3 frivillige. Økede nivåer av S. typhi LPS spesifikk og flagella-spesifikk ble detektert så tidlig som 7 dager etter vaksinasjon, stigende på dag 14 og stadig høy på dag 28. Den høyeste dosen av 10<9> CFUer stimulerte også LPS- og flagella-spesifikk IgG i 2 av 3 vaksinerte, påvisbaree på dagene 7 og 14 henholdsvis.

Konklusjoner

Denne undersøkelsen demonstrerte nytten av ssaV- mutasjonen, som en komponent av en hvilken som helst ny oral tyfoid vaksinestamme. En S. typhi stamme inneholdende aro-mutasjoner alene ville ha forårsaket vaksinemier ved dosene gitt. ssaV -mutasjonen tilveiebringer derfor et ytterligere nivå av sikkerhet til aro-mutasjonen alene ved å avskrive vaksinemiene ved anvendelse av dette tidlige preparatet.

Så vel som å vise seg å være godt-tolerert, ble ZH9 også demonstrert å være immunogen ved alle tre dosenivåer gitt. Med hensyn til stimulering av serum antistoff, viste mellomste (10<8> CFUer) - og høyeste (10<9> CFUer) doser seg å være meget immunogene, med 3/3 vaksiner gitt 10<8> CFUer og 2/3 gitt 10<9> CFUer utløsende høye titre av både S. typhi LPS og flagella spesifikk-serum IgG. Disse responser er meget lovende siden det er generelt vanskelig å fremkalle serum antistoff ved oral vaksinering.

Så vel som å generere S. fypr//-spesifikke serum antistoffresponser, primet ZH9 også IgA ASCer, indikativ for immunstimulering av tarm mukosa. En total av 5/9 frivillige fremkalte en S. typhi LPS-spesifikk IgA-utskillende celle (ASC) respons som ikke synes å være dose-avhengig.

WT05 ble også godt tolerert og ingen vaksinemier ble detektert. Interessant nok ble , ingen diareer eller symptomer på gastroenteritter detektert i noen av de frivillige. De tidligere data oppnådd ved anvendelse av mutanten TML-stamme med enkel aro eller SPI 2 mutasjoner i S. typhimurium gitt til mus foreslo at en dobbelt aroC/ssaV-mutant kunne forårsake noen lokale intestinale effekter f.eks. diare, kramper hos mennesker. Fravær av disse hendelser støttet ytterligere nytten av kombinasjonen av aro og SPI2 mutasjoner.

Eksempel 7

Heterologe antigenbærere

For å demonstrere nytten av ssaV. aroC dobbeltmutant-stammene til å uttrykke og levere fremmede antigener, ble WT05 transformert med et plasmid

(pBRD026) som uttrykker genet for E. coli varme-labilt enterotoksin B subenhet

(LT-B).

BALB/C mus (n=1 O/gruppe) ble immunisert oralt på dagene 0 og 28 med 10<9> CFUer (200 ml i PBS) WT05 som uttrykker pBRD026 eller med WT05 vektor-stammene (kontroll). For sammenligning (og som en positiv kontroll) ble en gruppe mus (n=5) immunisert oralt på dagene 0 og 28 med 10 ug renset LT (Sigma). Negative kontrollmus (n=5) ble immunisert oralt på dagene 0 og 28 med 200 pl PBS. Mus ble blødd fra halevenen på dagene 21, 28, 35 og ved hjerte-punktur på dag 42 og sera og tarminnhold (dag 42 bare) oppsamlet og lagret ved - 20°C.

Alle, utenom en av musene immunisert med WT05/LT-B fremkalte LT-spesifikke IgG (titre på 3,000-50,000) på dag 28 etter en enkelt oral dose. Ingen av kontrollemusene immunisert oralt med WT05 eller PBS fremkalte LT-spesifikk IgG. Oral immunisering med en enkelt dose av renset LT fremkalte høyere titre av LT-spesifikke antistoff (titre på 6,000 til 50,000). Når isotypen av det LT-B-spesifikke serum IgG ble undersøkt ble det funnet at WT05-stammen som uttrykker pBRD026 fremkalte nesten utelukkende LT-spesifikk lgG2a, som indikerer en dreining mot en TH1-type immunrespons. I motsetning, ble det fremkalt i mus immunisert med renset LT (Sigma) nesten utelukkende LT-spesifikk lgG1, som indikerer en TH2-type respons. Derfor, letter uttrykk av LT-B innen aroC/ ssaV- stammen grundig immunmodulering. TH1-dreide responser dannet med Salmonella aroC/ssaV-stammen vil være viktige, når antigener fra patogene organismer for hvilke TH 1-type responser er beskyttende, uttrykkes.

Claims (11)

1. Salmonella mikroorganisme, karakterisert ved at den har en attenuerende mutasjon som ødelegger ekspresjonen av ssaV genet og en auxotrof mutasjon som ødelegger ekspresjonen av aroC genet

2. Mikroorganisme ifølge krav 1, karakterisert ved at mikroorganismen ytterligere omfatter et heterologt antigen eller et terapeutisk protein.

3. Mikroorganisme ifølge krav 2, karakterisert ved at antigenet er et hepatitt A, B eller C antigen.

4. Mikroorganisme i henhold til hvilket som helst av de foregående krav, kara kterisert ved at mikroorganismen er Salmonella typhi Ty2.

5. Mikroorganisme i henhold til hvilket som helst av de foregående krav, kara kterisert ved a t de er for anvendelse i terapi.

6. Vaksinepreparat omfattende en mikroorganisme ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved a t det omfatter et adjuvans og et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel.

7. Preparat ifølge krav 6, karakterisert ved at det omfatter fra 10<7->10<10> CFUer i en enkelt doseenhet.

8. Preparat ifølge krav 7, karakterisert ved a t det omfatter 10<8->10<9 >CFUer.

9. Anvendelse av en mikroorganisme som definert i hvilken som helst av kravene 1 til 4, ved fremstillingen av et medikament for intravenøs administrering for behandling av systemisk bakterieinfeksjon.

10. Anvendelse av en mikroorganisme som definert i hvilken som helst av kravene 1 til 4, ved fremstillingen av et medikament for oral levering for behandling av systemisk bakterieinfeksjon.

11. Anvendelse ifølge krav 9 eller krav 10, for behandling av tyfoid.