CN1177863C - 用于治疗感染的减毒微生物 - Google Patents
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Abstract
一种沙门氏菌属的微生物具有一个破坏、一种器官基因表达的减毒突变和一个营养缺陷型突变，所述器官基因定位于Spi2致病性岛中。该微生物因而具有一个有助于避免该微生物的反应性而保持该微生物激发免疫应答有效性的双重突变。
Description
技术领域
本发明涉及可在疫苗组合物中使用的减毒微生物，所述疫苗组合物用于预防或治疗细菌或病毒感染。
背景技术
已经完全证实活的减毒微生物是非常有效的疫苗；由这种疫苗引发的免疫应答通常比由非复制型免疫原产生的免疫应答强烈并且持续的时间长。关于这一点的一种解释是可能活的减毒株在宿主中引起有限的感染并酷似自然感染的早期。另外，与灭活制剂不一样，活疫苗能够诱导有效的细胞介导的反应，所述细胞介导的反应可能与它们在抗原呈递细胞如巨噬细胞中复制的能力有关。
将沙门氏菌属减毒活疫苗用作预防动物及人类沙门氏菌病的安全而有效的疫苗已有很长历史了。实际上，由Swiss Serum VaccineInstitute制造的口服减毒活伤寒疫苗Ty21a(Vivotif)已被证明是一种用于预防伤寒热的非常成功的疫苗，并在包括美国和欧洲在内的许多国家中得到许可。
然而，所述菌株的减毒作用是通过采用化学诱变技术实现的而且所述菌株的减毒机理还不完全清楚。正是由于这一点，所述疫苗在给药次数(通常四次)和每一次给药时必须给予的活生物体的数量方面不够理想。
伴随着现代分子生物学技术的发展，对沙门氏菌属致病机理的认识不断加深，结果鉴定出所述微生物在体内生长和存活所必需的几种基因。这为减毒提供了新的基因靶，结果产生了这样的概念，即通过把一定的非回复突变引入已知与毒力有关的选择的基因中来对将来的疫苗株进行“合理地”减毒。这将有利于改良疫苗，尤其是在免疫原性和由此规定的给药次数方面得到改进的疫苗的研制。
尽管现在已知有多种沙门氏菌属的减毒株，但是几乎没有一株够格作为潜在的人用疫苗候选株。部分原因是由于需要平衡疫苗的免疫原性与沙门氏菌属微生物变得具有反应性的这种可能性之间的关系。
显然，选择适当的减毒靶来得到合适的疫苗候选株不是简单的并且也不容易推断。许多因素可能影响减毒株适于作为合适的疫苗，而且目前正在进行大量研究来鉴定合适的菌株。例如，许多被试用作疫苗候选株的减毒株在患者身上引起疫苗血或脓肿。
因此需要研制这样一种疫苗，该疫苗具有高度免疫原性同时该微生物菌株回复为反应形式的可能性降低而且具有副作用极其有限的良好的安全分布图。
本发明的概述
本发明是基于发现了被引入沙门氏菌属微生物中的两个特定减毒突变能够产生具有高度免疫原性和该微生物菌株回复为反应形式的危险性低的疫苗。得到的疫苗株具有良好的副作用分布图。
第一个突变包含于沙门氏菌属致病性岛2(Spi2)的区域中；第二个突变是营养缺陷型突变，即该突变破坏编码生物合成途径中所需蛋白质的基因的表达。
本发明的一种沙门氏菌属微生物具有一个破坏一种器官基因表达的减毒突变和一个独立的营养缺陷型突变，所述器官基因定位在Spi2致病性岛中。优选的减毒突变位于器官基因ssaV中，优选的营养缺陷型突变位于aroC中。
微生物还优选地含有一种或多种异种抗原或治疗蛋白，例如致病的大肠杆菌抗原，志贺氏菌属抗原，甲型、乙型或丙型肝炎抗原，单纯疱疹病毒抗原和人类乳头状瘤病毒抗原。因此，除沙门氏菌属外，所述微生物也可以作为抗感染免疫的递送载体。
所述沙门氏菌属微生物可被用于制备一种治疗细菌或病毒感染，例如治疗伤寒的静脉注射或口服药物。
本发明的减毒沙门氏菌属微生物形成的疫苗出人意外地刺激粘膜和系统免疫。而且，所述微生物不引起动物模型的脾脏脓肿，而具有单一突变的突变体则引起动物模型的脾脏脓肿。本文限定的双重突变体尤其具有这一优点。
本发明的描述
本发明的微生物和疫苗组合物可以通过已知技术来制备。
本领域的技术人员不需做额外的实验就能进行特定沙门氏菌属微生物的选择以及适当突变的选择。一种优选的微生物是鼠伤寒沙门氏菌。
可以将第一种突变引入位于沙门氏菌属致病性岛2区域内的器官基因中，该区域在WO-A-9617951中已被公开。
沙门氏菌属致病性岛2(Spi2)是位于沙门氏菌属染色体上的两种经典的致病性岛中的一种。Spi2包括若干个基因，这些基因编码III型分泌系统，该III型分泌系统涉及将Spi2编码的毒性相关蛋白(所谓的效应蛋白)转运到沙门氏菌属细菌外并可能直接转运到靶宿主细胞如巨噬细胞中。部分Spi2(器官基因)编码III型系统的分泌器。Spi2是沙门氏菌属对小鼠产生致病性和毒性所绝对必需的，这一观察结果已被世界范围内的几个不同研究小组所记载。鼠伤寒沙门氏菌Spi2突变体在通过口服、静脉和腹膜内给药途径攻击的小鼠中毒性大减。
目前已完全了解定位于Spi2内的器官基因的性质；参见例如Hensel等，Molecular Microbiology(1997)；24(1)：155-167。适用于本发明的基因包括ssaV，ssaJ，ssaK，ssaL，ssaM，ssaO，ssaP，ssaQ，ssaR，ssaS，ssaT，ssaU和ssaH基因。
Spi2区域内的突变没有必要一定位于基因内部才能破坏基因的功能。例如，上游调控区域中的突变也可以破坏基因的表达，从而导致毒性减弱。基因间隔区中的突变也可能足以破坏基因的功能。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述器官基因是ssaV。在另一个优选的实施方案中，所述突变位于ssaJ和ssaK之间的基因间隔区内。
由于其破坏一种生物合成途径中必需的基因，所以第二种突变被称作“营养缺陷型突变”。该生物合成途径是一种存在于沙门氏菌属中，但不存在于哺乳动物中的途径。因此，突变体不能依赖于在所治疗的患者体内发现的代谢物来防止突变效应的发生。营养缺陷型突变的合适基因包括任何aro基因，例如aroA，aroC，aroD和aroE。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物含有一种在ssaV和aroC中发生减毒突变的沙门氏菌属微生物。
可以通过采用任何已知技术将所述突变引入所述微生物中。优选地，所述突变是缺失突变，其中基因的破坏是由核酸的切除引起的。或者，可以通过核酸的插入或通过点突变来引入突变。将突变引入特定区域的方法对本领域的技术人员来说是显而易见的。
除所述两种突变外，所述沙门氏菌属微生物还可以含有异种抗原。所述减毒微生物因而能够作为用于抗其它细菌或病毒感染的抗原给药的递送载体。适合于以这种方式使用的抗原对本领域的技术人员来说是显而易见的并且包括：
致病大肠杆菌抗原，即ETEC
甲型、乙型和丙型肝炎抗原
Lime病抗原
霍乱孤菌抗原
螺杆菌抗原
单纯疱疹病毒抗原
人乳头瘤病毒抗原
对于患者，例如肝炎患者的治疗，这个系统还具有递送治疗蛋白，例如细胞因子的潜力。利用疫苗组合物递送异种抗原或治疗蛋白的方法对本领域的技术人员来说是显而易见的。
利用本发明的微生物制备的疫苗被用于人类传染病和兽类传染病的治疗。
为了提供一种安全的候选疫苗，双重突变提供了一种减弱微生物毒性的有效方法。
即使在元免疫应答的患者体内，所述疫苗组合物也提供了一种有效的保护，而且重要的是在形成脾脓肿方面呈现出低危险性。已经利用基于单突变的疫苗鉴定了脾脓肿，因此该组合物非常有益于患者。
为了配制所述疫苗组合物，所述突变微生物能以与任何适宜的药学上可接受的佐剂、稀释剂或赋形剂组合的形式存在。合适的制剂对本领域的技术人员来说是显而易见的。所述制剂可以被制成任何适宜的给药形式。优选的给药方式是通过口服或静脉途径并且疫苗是活的减毒沙门氏菌属微生物。制剂中所需微生物的数量能够由本领域的技术人员来确定和优化。然而，一般来说，可以给患者施用单一剂量单位中的大约107-1010CFUs，优选地，大约108-109CFUs。
下列实施例阐述了本发明。
实施例1
这个实施例描述了称作ZH9的突变株的制备，该突变株具有作为人口服伤寒疫苗的活性。该突变株衍生于最初分离自伤寒病例的毒性伤寒沙门氏菌菌株Ty2。衍生的菌株在purA和aroA中具有一个确定的突变。
用于构建ZH9的Ty2
伤寒沙门氏菌Ty2最初是在1916年从患有伤寒热的个体患者身上分离出来的并已被用于衍生所有经批准的伤寒疫苗。该菌株从位于Colindale的PHLS国家培养物保藏中心获得。获得的是冻干培养物，保藏号为NCTC8385。
从伤寒沙门氏菌Ty2中克隆伤寒沙门氏菌aroC基因
从贮存物中回收伤寒沙门氏菌Ty2并在Luria Bertani(LB)肉汤中过夜培养。收集细胞并制备全细胞DNA。伤寒沙门氏菌Ty2 DNA的DNA片段是通过采用限制酶Sau3A进行部分切割而产生的并且产生的片段被连接到BamH1切割的pHC79上以便产生以大肠杆菌HU835作为受体的伤寒沙门氏菌Ty2的DNA粘粒文库。为了分离编码来源于伤寒沙门氏菌DNA的aroC的DNA，将粘粒文库用来转导大肠杆菌AB2849，该大肠杆菌具有一个aroC基因上的突变并且依赖芳族化合物生长。将转导混合物平铺在缺乏芳族化合物的基本培养基上并于37℃下进行培养。过夜培养后对几个分离的菌落进行观察。这些细菌的生长大概是由于含有完整aroC基因的粘粒克隆与AB2849中的aroC突变互补的结果。纯化来源于这些菌株的粘粒DNA。将此粘粒的一个5.2kb HindIII片段克隆到pUC18中以便得到能够补偿AB2849中的aroC缺失的质粒pTAC2，结果表明该质粒含有伤寒沙门氏菌aroC基因。
产生确定的克隆的伤寒沙门氏菌Ty2 aroC缺失
采用PCR在克隆的aroC基因中建立了一个确定的600bp的缺失。利用公开的伤寒沙门氏菌aroC基因(Acc.M27715)的DNA序列设计PCR中使用的寡核苷酸引物。利用具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.1的引物由pTAC2扩增DNA5’至aroC基因。SEQ ID NO.3退火到载体DNA上，SEQ ID NO.1退火到aroC的5’区上。利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.2引物扩增DNA3’至aroC基因。SEQ ID NO.4退火到载体DNA上，SEQ ID NO.2退火到aroC的3’区上。得到的PCR产物具有插入到5’端的XbaI位点以利于克隆。将所述片段克隆到载体pUC18中。被命名为pMIAC23的最终质粒构建体在4.8kb HindIII片段上含有一个确定的aroC缺失(位置544至1143)。该HindIII片段被插入pUC18的HindIII位点。一个单独的XbaI位点存在于aroC的缺失的位点上。
将aroC突变引入伤寒沙门氏菌Ty2基因组中
自杀质粒pCVD442(
Donnenberg & Kaper，Infection and Immunity，1991；59：4310-4317)被用作将aroC缺失引入伤寒沙门氏菌Ty2基因组的载体。从pMIAC23中分离出含有aroC缺失的4.8kbHindIII片段并且通过采用Stratagene DNA补齐试剂盒使末端变成平端。质粒pCVD442通过用SmaI消化被线性化，用碱性磷酸酶处理并将其连接到所述的平端片段上。分离所需的构建体并将其命名为pYCVC21。
通过采用标准的电穿孔方法将pYCVC21引入伤寒沙门氏菌Ty2中。通过质粒和基因组上同源区域之间的重组，所述质粒能整合到Ty2基因组中以便得到氨苄青霉素抗性转化体。这些转化体含有原始野生型aroC和缺失aroC基因的拷贝。在没有氨苄青霉素存在的条件下培养这些菌株以便发生第二次重组，结果导致pCVD442 DNA序列和一种aroC基因的拷贝，即野生型拷贝或缺失型拷贝的丢失。经历了这种第二次重组的伤寒沙门氏菌Ty2被鉴定为能够在有5％蔗糖存在的条件下生长的氨苄青霉素敏感性衍生株(pCVD442携带sacB基因，该基因被表达时产生蔗糖敏感性表型)。只保留了缺失型aroC基因的菌株最初被鉴定为在没有补充芳族化合物的基本培养基平板上不能生长的菌株。aroC基因型通过PCR分析得到证实。含有SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6的引物产生一种994bp的野生型aroC和400bp的缺失型aroC基因的产物。得到的PCR产物的序列分析证实了在被命名为DTY6，DTY7，DTY8，DTY9和DTY10的5个单独的分离物中存在所需要的缺失。用Microbank小瓶将这些菌株长期贮存在-70℃下。菌株DTY8被选出进行进一步的操作。
将ssaV突变引入伤寒沙门氏菌aroC突变体DTY8中
采用PCR由总DNA制备物扩增一个7.5kb的含有伤寒沙门氏菌ssaV区域的PstI片段并将该片段克隆到载体pCR2.1(Invitrogen)中。所使用的具有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的PCR寡核苷酸引物被设计成鼠伤寒沙门氏菌Spi2序列。得到的质粒构建体被命名为pTYSV21。
通过采用反向PCR由pTYSV21衍生一种具有ssaV基因的缺失的质粒构建体。退火到ssaV可读框的5’(SEQ ID NO.9)和3’(SEQID NO.10)区的引物被设计成鼠伤寒沙门氏菌Spi2序列。将AvrII限制位点插入每一引物的5’区，将XbaI位点插入SEQ ID NO.10中。XbaI位点作为ssaV突变的标记因而通过限制酶切分析能容易地被检测到。用AvrII消化得到的PCR产物并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化主链质粒分子。得到的片段在AvrII粘端的再环化产生了所需的缺失构建体pYDSV1。pYDSV1含有在ssaV可读框内具有一个确定的1894bp缺失的5.5kb PstI片段。
自杀质粒pCVD442被用作将ssaV缺失引入伤寒沙门氏菌Ty2aroC突变体DTY8的基因组中的载体。从pYDSV1中分离出含有ssaV缺失的5.5kb PstI片段并且通过用克列诺DNA聚合酶进行处理使末端变成平端。通过采用SmaI进行消化将质粒pCVD442线性化，用碱性磷酸酶进行处理并且连接到平端片段上。所需的构建体被分离出来并命名为pYDSV214。
通过电穿孔将pYDSV214引入伤寒沙门氏菌DTY8中。选择氨苄青霉素抗性转化体，然后在不存在氨苄青霉素的情况下进行培养以便丢失pCVD442 DNA序列和一种ssaV基因的拷贝，即野生型拷贝或缺失型拷贝。经过这种第二次重组的菌株被鉴定为氨苄青霉素敏感性、蔗糖抗性菌落。通过PCR分析鉴定出了仅保留了缺失的ssaV基因的菌株。具有SEQ ID NO.11和SEQID NO.12的引物产生出2485bp的野生型ssaV和591bp的缺失型ssaV基因的产物。对得到的PCR产物进行的序列分析证实了在5个单独的分离物ZH2，ZH4，ZH6，ZH7和ZH9中存在所需的缺失。菌株ZH9被选出用于制备CGMP主细胞库。
实施例2
这个实施例描述了被命名为WT05的鼠伤寒沙门氏菌突变菌株的制备，该突变菌株具有抗人胃肠炎的疫苗活性。该菌株是由已知对人致病性强的鼠伤寒沙门氏菌菌株TML衍生的。
用于构建WT05的TML
TML最初是从胃肠炎患者身上分离到的并且是在伯明翰大学的John Stevens博士的实验室中进行鉴定的。TML冻干保藏在WellcomeResearch实验室中并且其培养物编号为BRD519。该培养物从伯明翰大学获得。
产生确定的克隆的鼠伤寒沙门氏菌ssaV基因缺失
通过将分离自鼠伤寒沙门氏菌LT2的7.5kb的PstI片段克隆到pUC18的PstI位点来制备一种质粒(质粒7-2，
Shea等；PNAS，1996； 93：2593-2597)。ssaV位于该片段的中心。采用反向PCR由质粒7-2衍生含有确定的ssaV ORF缺失的质粒构建体。退火到ssaV可读框的5’(SEQ ID NO.13)和3’(SEQ ID NO.14)区的引物被设计成鼠伤寒沙门氏菌Spi2序列。将AvrII限制位点插入到每一种引物的5’区和将XbaI位点插入到SEQ ID NO.14中。XbaI位点作为ssaV突变的标记因而通过限制性酶切分析能容易地被检测到。用AvrII消化得到的PCR产物并采用琼脂糖凝胶电泳纯化主链质粒分子。得到的片段在AvrII粘性末端的再环化产生了所需的缺失构建体，该构建体被命名为pMDSV1。pMDSV1含有一个5.5kb的PstI片段，该片段在ssaV可读框内具有一个确定的1894bp缺失突变，AvrII和XbaI限制位点位于该缺失的位点上。
自杀质粒pCVD442被用作将ssaV缺失引入鼠伤寒沙门氏菌TML的基因组中的载体。从pMDSV1中分离含有ssaV缺失的5.5kb的PstI片段并通过用克列诺DNA聚合酶处理使该片段变成平端。质粒pCVD442通过用SmaI消化被线性化，用碱性磷酸酶处理并将其连接到平端片段上。分离所需的构建体并将其命名为pMDSV22。
利用接合作用将pMDSV22引入鼠伤寒沙门氏菌TML。至此所述构建体被转化到大肠杆菌菌株S17-1λpir中。按照标准方法进行接合。通过质粒与基因组上同源区域间的重组，质粒pMDSV22能整合到TML基因组中而产生氨苄青霉素抗性转接合子。被命名为mdsv-WT2的转接合子被选出进行进一步的操作。该转接合子含有原始野生型ssaV和缺失型ssaV基因的拷贝。在没有氨苄青霉素存在的条件下进行培养以便发生第二次重组，第二次重组将会导致pCVD442 DNA序列和一种ssaV基因的拷贝，即野生型或缺失型拷贝的缺失。经过这种第二次重组的分离物被鉴定为氨苄青霉素敏感性衍生株，该衍生株能够在有5％的蔗糖存在的条件下生长(pCVD442携带被表达时能产生蔗糖敏感性表型的sacB基因)。只保留了缺失的ssaV基因的菌株通过采用PCR分析进行了鉴定。具有SEQ ID NO.15和SEQ ID NO..16的引物产生一种2485bp的野生型ssaV和591bp的缺失型ssaV基因的产物。对得到的PCR产物进行的序列分析证实了4个独立的分离物ZH20，ZH23，ZH25和ZH26中存在所需要的缺失。这些菌株在添加了15％甘油的LB中在-80℃下进行长期保存。菌株ZH26被选出进行进一步的操作。
从鼠伤寒沙门氏菌TML中克隆鼠伤寒沙门氏菌aroC基因
从鼠伤寒沙门氏菌TML分离出基因组DNA并用HindIII进行切割。5至6kb大小的HindIII片段被纯化出来并被连接到HindIII切割的pBluescript上。连接混合物被用来转化大肠杆菌aroC突变株AB2849，然后通过利用它们补偿该突变株的能力来选择含有鼠伤寒沙门氏菌aroC基因的克隆。对其中一个克隆pDAC1的分析结果表明了该克隆含有一个5.2kb的HindIII片段。
采用PCR在克隆的aroC基因中建立了一个确定的600bp的缺失。利用公开的伤寒沙门氏菌aroC基因(Acc.M27715)的DNA序列设计寡核苷酸引物。利用具有SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.17的引物由pDAC1扩增DNA 5’至aroC基因。SEQ ID NO.19退火到载体DNA上，SEQ ID NO.17退火到aroC的5’区。利用具有SEQ ID NO.20和SEQID NO.18的引物扩增DNA 3’至aroC基因。SEQ ID NO.20退火到载体DNA上，SEQ ID NO.18退火到aroC的3’区。得到的PCR产物含有插入5’端的以XbaI位点利于克隆。所述片段被克隆到载体pUC18中。最终的质粒构建体pMIAC8在4.8kb的HindIII片段上含有一个确定的aroC缺失(Acc.M27715位置544至1143)。HindIII片段被插在pUC18的HindIII位点上。单一的XbaI位点存在于该缺失的位点上。
将aroC突变引入鼠伤寒沙门氏菌ssaV突变株ZH26中
用自杀质粒pCVD442作为载体将aroC缺失引入鼠伤寒沙门氏菌TML的基因组中。含有aroC缺失的4.8kb的HindIII片段被从pMIAC8中分离出来并利用Stratagene DNA补齐试剂盒(Part No.200409)使其末端变成平端。质粒pCVD442通过用SmaI消化被线性化，用碱性磷酸酶处理并将其连接到平端片段上。分离需要的构建体并将其表示为pMCVC16。采用电穿孔将pMCVC16引入鼠伤寒沙门氏菌ZH26中。筛选出氨苄氢霉素抗性转化体并于没有氨苄氢霉素存在的条件下进行培养以使pCVD442 DNA序列和一种aroC基因的拷贝，即野生型拷贝或缺失型拷贝丢失。经过这种第二次重组的菌株被鉴定为氨苄青霉素敏感性衍生株，该衍生株能够在有5％的蔗糖存在的条件下生长。只保留了缺失的aroC基因的菌株最初被鉴定为在没有添加芳族化合物的基本培养基平板上不能生长的菌株。利用PCR分析证实了aroC基因型。具有SEQ ID NO.21和SEQ ID NO..22的引物产生一种994bp的野生型aroC和400bp的缺失型aroC基因的产物。对得到的PCR产物进行的序列分析证明了被命名为WT05，WT09，WT10和WT12的4个独立的分离物中存在所需要的缺失。菌株WT05被选出来用于制备CGMP主细胞库。
实施例3
制备以下构建体来试验动物模型中的双重突变疫苗。采用具有单突变和双重突变的能感染小鼠的菌株—鼠伤寒沙门氏菌SL1344。
将来源于鼠伤寒沙门氏菌12023s的ssaV∷aph(非极性的)突变P22转导到SL1344中而产生单Spi2突变。
将aroC缺失/pCVD442自杀载体pMCVC16电穿孔导入鼠伤寒沙门氏菌菌株LB5010中获得了部分二倍体。然后将所述aroC缺失部分二倍体从LB5010中P22转导到SL1344中。然后采用蔗糖选择法对SL1344部分二倍体进行分离而产生aroC单突变。
通过将所述aroC缺失部分二倍体从LB5010中P22转导到SL1344ssaV∷aph中来产生双重突变体。质粒序列被从部分二倍体离去菌株3，SL1344 ssaV∷aph本底的aroC缺失突变中分离出来。
对确定的aroC/ssaV沙门氏菌属突变体进行临床前的药物动力学研究
在BALB/C小鼠中对含有确定的aroC突变，ssaV突变或这两种突变的组合的沙门氏菌属突变体(菌株SL1344)进行了深入的分析以便评价所述微生物的毒性减弱，持续生存性和对用野生型菌株攻击的免疫能力。
实施例4
通过静脉注射途径免疫动物保护研究
用105个和106个微生物对分为几组的10只BALB/C小鼠进行静脉注射免疫，所述微生物分别是在LB肉汤中过夜培养并悬浮在注射用盐水中的SL1344 aroC，SL1344 ssaV和SL1344 aroC:ssaV。6个星期后，用105个野生型微生物进行静脉注射来攻击小鼠。进行静脉注射的10个这种野生型菌株足以杀死小鼠。
注射了aroC或ssaV单突变体的所有小鼠在进行任何剂量的攻击后得到了很好的保护并于整个实验过程中保持健康，没有病症表现。对于双重突变体，有90％的动物在用106个微生物进行免疫后得到很好的保护。其中一只动物在受攻击后第8天死亡。对于用低剂量进行免疫的动物，只有一只小鼠幸免于攻击。
这一实验表明单独使用或与aroC突变组合使用沙门氏菌属ssaV突变体进行免疫能够使小鼠具有抗野生型沙门氏菌属菌株攻击的免疫力。
菌株的持续生存性
给几组小鼠施用了106个上述三种沙门氏菌属突变体。在第14天以前的不同时间点处死四只小鼠，然后对小鼠肝脏和脾脏中的微生物进行计数。直到第10天每一脏器中的微生物的计数大约为5×105，此时全部三种突变体的计数相差不大。在第14天，单突变和双重突变之间显示出差异，即肝脏和脾脏中的双重突变体微生物的数量呈对数减少。
单突变体和aroC/ssaV双重突变体间的另一重要差异在于双重突变体在实验过程中的任何时间都没有出现肝脓肿。然而，感染了单突变体的小鼠在第10天和第14天确实出现了肝脓肿。这是一个重要发现并且可强有力地支持利用这种突变的组合来评价疫苗的制剂。
免疫原性
取上述被免疫小鼠的血并采用ELISA来测定抗全细胞沙门氏菌属的抗体滴度。所有三种菌株都显示出高度的免疫原性，产生了高滴度的抗沙门氏菌属的循环IgG。
实施例5
通过口服途径免疫的动物
菌株的持续生存性
经口服5×109个三种沙门氏菌属突变体中的每一种微生物免疫的几组小鼠以一定的时间间隔被处死并进行肝脏和脾脏中微生物的计数。直到大约第21天时，对于aroC单突变体和ssaV单突变体，肝脏和脾脏中的微生物计数分别为103和102。此后数量减少。对于接受了aroC:ssaV双重突变体的小鼠，口服免疫后，在肝脏和脾脏中实际上未能检测到微生物。
用鼠伤寒沙门氏菌TML aroC/ssaV(WT05)接种的A-J小鼠的口服免
疫和静脉攻击
这个实验的目的是为了确定5×109个aroC/ssaV鼠伤寒沙门氏菌TML突变体在ityr小鼠口服接种疫苗和静脉攻击模型中的保护效力。这一模型更类似于人对沙门氏菌属的反应，因为那些动物比itys本底物更不敏感。
采用管饲法将0.2ml PBS中的5×109个鼠伤寒沙门氏菌TML aroC/ssaV口服接种给10只6-8周龄的A-J小鼠并保持8周。这时给2只小鼠仅施用PBS并作为对照动物。经过8周后，用107个野生型鼠伤寒沙门氏菌TML对两个免疫组进行静脉攻击。小鼠被攻击后观察30天。
所有的动物都非常有效地抵御了野生型鼠伤寒沙门氏菌的攻击(100％的存活率，10/10的动物存活)。只被施用了PBS然后被鼠伤寒沙门氏菌TML攻击的小鼠在被攻击后的第6天死亡。
在ityr本底物中，双重鼠伤寒沙门氏菌TML aroC/ssaV似乎对口服了5×109剂量的小鼠有保护作用。这一点对人来说可能很重要，因为ityr小鼠是人类沙门氏菌病的较好模型(就感染易发性而言)。
还进行了评价双重突变体在小鼠肝脏和脾脏中的持续生存性研究。结果发现双重突变体以低水平持续到大约第21天。到第28天时，突变株全部消失。
实施例6
人的临床试验
招募18名健康的志愿者来进行公开标记的、无安慰剂对照的试验研究。经适当的筛选后，3名志愿者各自接受单次口服剂量为107，108或109CFUs的伤寒沙门氏菌ZH9或鼠伤寒沙门氏菌WT05。将按照上述方法制备的微生物再悬浮在终体积为100ml的2％(w/v)碳酸氢钠溶液中达到合适的给药浓度，所述碳酸氢钠溶液能够中和胃酸。该悬浮液以口服的形式给志愿者用药。然后志愿者被隔离72小时，接着跟踪分析免疫后的安全性和免疫原性。
通过观察、体检和建立每日病历卡片对志愿者进行与疫苗接种有关的反应原性和其它副作用的分析。另外，收集血液，粪便和尿液培养物来测定疫苗株的疫苗血，脱落和持续生存性。通过采用标准方法测量血液中的C-活性蛋白(CRP)和肝功酶(ATL)的浓度，总白细胞(WBC)计数和红细胞的沉降速率(ESR)来获得附加的安全数据。首先每日取血至第7天，然后每周取血至第28天，对所取的血样进行这些参数的测定。
粘膜和系统免疫反应的分析
免疫前和免疫后的第7，14，21和28天采集血液和唾液样品，进行ELISA分析之前唾液和血清一直冷冻在-70℃。收集外周血单核细胞并采用ELISPOT技术测定所存在的抗体分泌细胞(ASCs)。
所有的志愿者对伤寒沙门氏菌ZH9和鼠伤寒沙门氏菌WT05都具有很好的耐受性。三种剂量浓度中的每一种都没有在任何志愿者体内引起严重的副作用并且在所有检测时间点所有疫苗接种者的血液和尿液培养物都保持阴性。因此，用伤寒沙门氏菌ZH9和鼠伤寒沙门氏菌WT05进行免疫没有产生疫苗血。被施用了任一菌株的志愿者中没有一名发生腹泻或持续高烧，这进一步表明疫苗株的安全性。第7天后，伤寒沙门氏菌ZH9的三个剂量组中的任一组中或在鼠伤寒沙门氏菌WT05的低剂量(107)组中都没有观察到持续排泄或疫苗血。
由伤寒沙门氏菌ZH9引发的粘膜和系统免疫反应
单次口服低剂量(1×107CFUs)的伤寒沙门氏菌ZH9的免疫导致2/3的被检测志愿者体内的伤寒沙门氏菌特异性IgA分泌ASCs在免疫后7天内致敏。在第14天和第21天进行的检测表明IgA ASCs仍然可以被检测到但浓度较低并且到第28天时消失。在几乎所有的应答接种者体内，ASCs的数量在第7天时最多。令人惊奇的是，摄入较高剂量(108CFUs)的伤寒沙门氏菌ZH9仅在1/3的接种者体内引起微弱的IgA ASC反应。摄入最高剂量(1×109CFUs)的伤寒沙门氏菌ZH9导致2/3的志愿者体内的IgA ASCs致敏。
沙门氏菌属特异性血清抗体反应
在第7，14，21和28天进行检测的结果表明，单次口服低剂量(1×107CFUs)伤寒沙门氏菌ZH9没有引发伤寒沙门氏菌LPS特异性血清IgG产生(尽管在2/3的接种者体内产生了IgA-ASCs)。类似地，只有1/3的接种者产生了很低浓度的鞭毛特异性IgG。然而，摄入108CFUs导致在所有3名志愿者体内产生高浓度的LPS和鞭毛特异性IgG。早在接种后的7天内就检测到高浓度的伤寒沙门氏菌LPS特异性IgG和鞭毛特异性IgG，第14天浓度升高并在第28天保持在高浓度。109CFUs的最高剂量在2/3的接种者体内同样刺激产生了LPS特异性和鞭毛特异性IgG，分别在第7天和第14天可检测到。
结论
这一研究表明ssaV突变具有作为任何新的口服伤寒疫苗株的组成成分的实用性。一株只含有aro突变的伤寒沙门氏菌菌株在各种给药剂量下可能引起疫苗血。因此通过利用这种早期的制剂消除疫苗血，ssaV突变提高了单独aro突变的安全性。
就象被证明具有很好的耐受性一样，在所有三个给药剂量浓度下ZH9还显示出免疫原性。在刺激产生血清抗体方面，中等(108CFUs)和最高(109CFUs)剂量被证明具有高免疫原性，其中给予108CFUs的3/3接种者和给予109CFUs的2/3接种者产生了高滴度的伤寒沙门氏菌LPS和鞭毛特异性血清IgG。由于利用口服免疫接种通常很难引发血清抗体产生，所以这些反应令人非常振奋。
就象产生伤寒沙门氏菌特异性血清抗体反应一样，ZH9也致敏了IgA ASCs，这是肠粘膜免疫刺激的标志。总共有5/9的志愿者引发了伤寒沙门氏菌LPS特异性IgA分泌细胞(ASC)反应，该反应没有表现出剂量依赖性。
WT05也具有很好的耐受性并且没有检测到疫苗血。有趣地是，在任何志愿者中都没有检测到腹泻或肠胃炎的症状。利用给小鼠服用的鼠伤寒沙门氏菌中具有aro或SPI2单突变的突变体TML菌株获得的前述数据表明aroC/ssaV双重突变可能引起人的某些局部肠反应例如腹泻，腹部绞痛。没有发生这些现象进一步证明了aro和SPI2突变的组合的实用性。
实施例7
异源抗原载体
为了说明ssaV:aroC双重突变株表达和递送外源抗原的实用性，用表达编码大肠杆菌热不稳定性肠毒素B亚单位(LT-B)的基因的质粒(pBRD026)转化WT05。
在第0天和第28天用109CFUs(用PBS制备的溶液200ml)的表达pBRD026的WT05，或用WT05载体菌株(对照)对BALB/C小鼠(n＝10只/组)进行口服免疫。为了进行比较(和作为阳性对照)，在第0天和第28天用10μg纯化的LT(Sigma)对一组小鼠(n＝5只)进行口服免疫。在第0天和第28天用200μl的PBS对阴性对照小鼠(n＝5只)进行口服免疫。在第21，28和35天从小鼠尾静脉取血，在第42天通过心脏穿刺取血并且收集血清和肠灌洗液(仅在第42天)然后保存在-20℃下。
除了其中一只小鼠，所有用WT05/LT-B免疫的小鼠在单次口服给药后的第28天都产生了LT特异性IgG(滴度为3000-50000)。口服WT05或PBS免疫的对照组小鼠中没有一只产生LT特异性IgG。单次服用纯化的LT的口服免疫引发了高滴度的LT特异性抗体产生(滴度为6000→50000)。当检测同型的LT-B特异性血清IgG时，发现表达pBRD026的WT05菌株几乎只引发了LT特异性IgG2a产生，表明了对TH1-型免疫反应的倾向性。相反，用纯化的LT(Sigma)免疫的小鼠几乎只引发了LT特异性IgG1产生，表明了对TH2-型免疫反应的倾向性。因此，在aroC/ssaV菌株中表达LT-B有利于进一步的免疫调制。当来源于病原性微生物的抗原被表达时，由于TH1-型反应对该病原性微生物具有保护作用，所以由沙门氏菌属aroC/ssaV菌株引发的倾向于TH1的免疫反应将是很重要的。
序列表
<110>Microscience Limited
<120>用于治疗感染的减毒微生物
<130>REP06128WO
<140>
<141>
<150>9910812.8
<151>1999-05-10
<160>22
<170>PatentIn Ver.2.1
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1.一种沙门氏菌属的微生物，其具有一个破坏一种器官基因表达的减毒突变和一个营养缺陷型突变，所述器官基因定位于Spi2致病性岛中，其中减毒突变破坏ssaV而营养缺陷型突变破坏aroC。
2.如权利要求1中所述的微生物，其中微生物进一步包括一种异种抗原或一种治疗蛋白质。
3.如权利要求中2所述的微生物，其中抗原是甲型、乙型或丙型肝炎抗原。
4.如前述权利要求中任一权利要求所述的微生物，其中微生物是伤寒沙门氏菌Ty2。
5.一种疫苗组合物，其包含一种如前述权利要求1至4中任一权利要求所述的微生物，和一种佐剂和一种生理上可接受的稀释剂。
6.如权利要求5所述的组合物，其在单一剂量单位中包含107-1010CFUs。
7.如权利要求6所述的组合物，其包含108-109CFUs。
8.如前述权利要求1至4中任一权利要求所述的微生物在制备用于治疗全身细菌感染的静脉注射药物中的用途。
9.如前述权利要求1至4中任一权利要求所述的微生物在制备用于治疗全身细菌感染的口服药物中的用途。
10.如权利要求1至4中任一权利要求所述的微生物在制备用于治疗伤寒的药物中的用途。
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| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
| US4757006A (en) * | 1983-10-28 | 1988-07-12 | Genetics Institute, Inc. | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
| US4677063A (en) * | 1985-05-02 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Human tumor necrosis factor |
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| US4810648A (en) * | 1986-01-08 | 1989-03-07 | Rhone Poulenc Agrochimie | Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene |
| US5397697A (en) * | 1989-01-10 | 1995-03-14 | Ciba-Geigy Corporation | Identification of plant-responsive genes of bacteria |
| FR2664614B1 (fr) | 1990-07-11 | 1992-10-16 | Pasteur Institut | Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires. |
| SE9101433D0 (sv) | 1991-05-13 | 1991-05-13 | Marianne Hansson | Recombinant dna sequence and its use |
| WO1993004202A1 (en) | 1991-08-22 | 1993-03-04 | Washington University | Polynucleotide probes for salmonella |
| WO1993007266A1 (en) * | 1991-10-07 | 1993-04-15 | Idaho Research Foundation, Inc. | Genetic construct for selection of homologous recombinants on a single selective medium |
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| US5700683A (en) * | 1995-02-17 | 1997-12-23 | Pathogenesis Corporation | Virulence-attenuating genetic deletions deleted from mycobacterium BCG |
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Legal Events
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Owner name: URGENT PRODUCTS DEVELOPMENT ENGLAND CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: MICRO SCIENCE CO., LTD. |
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Granted publication date: 20041201 Termination date: 20180509 |