CN1533242A - 口蹄疫病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

通过对易感动物接种一种含有干扰素DNA序列的疫苗，可以实现口蹄疫(FMD)的早期预防。接种一天后，发现动物能够抵抗致命的口蹄疫病毒的侵染。与有效的口蹄疫病毒疫苗的合并给药可以在产生特异性免疫之前对动物进行保护，这一特性在口蹄疫爆发时显得尤为必要。

Description

口蹄疫病毒疫苗
                      发明背景
发明领域
口蹄疫是世界范围内最主要的一种经济性的家畜疾病。这种疾病是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的，其具有高度的感染性，可通过接触和空气迅速传播。
由于FMD的高度感染性，未发现疾病的国家通常会保持严格的检疫，限制由疫区国家的动物及动物产品的引进以预防疾病的侵入和维系在国际贸易中的主动参与能力。该疾病在美国、加拿大及墨西哥都没有发现，但美国畜牧工业和美国农业部(USDA)依然要首要考虑其今后不会出现。
在传统的FMD控制方案中使用灭活的全病毒疫苗，并在疾病的控制中取得了巨大的成功。然而，目前的疫苗还存在着问题，包括需要一些用以生产疫苗制备所需病毒的高容量设备、病毒的抗原性变异会产生的大量的病毒血清型及亚型，以及疫苗不具有快速引发保护性免疫的能力。因此，目前迫切需要开发大量在病毒早期侵染阶段即可提供更好保护作用的有效疫苗。本发明涉及最新的遗传工程抗FMD的疫苗，该疫苗较现有的商品化疫苗具有更强的预防作用。
相关技术描述
根据传统的重组步骤生产的基因工程疫苗在本领域已得到很好的建立(如Current Protocol in Molecular Blology.1994.Ausubel等，eds.J.Wiley & Sons，NY所描述)。另外，包含目的DNA序列的载体也最来最多的被应用于真核表达中遗传物质的递送(Ricigliano等，U.S.Pat.No.5,795,872)。例如，腺病毒是一种长度约为36kb的双链线性DNA病毒，由腺病毒构建而来的载体在基因治疗和疫苗开发中通常被应用于表达目的基因(Alkhatib and Briedis.1988.J.Virol.vol.62，pp.2718-2727；Chang等1995.Mol.Med.vol.1，pp.172-181；Cheng等，1992.J.Virol.vol.66，pp.6721-6727；Chengalvala等，1994.J.Gen.Virol.vol.75，pp.125-131；Eloit and Adam.1995.J.Gen.Virol.vol.76，pp.1583-1589；Fueyo等，1996.oncogene.vol.12，pp.103-110；GaherySegard等，1997.Eur.J.Immunol.Vol.27，pp.653-659；Gonin等，1995.Vet.Microbiol.vol.45，pp.393-401；Graham and Prevec.1992.InVaccines：New Approaches to Immunological Problems.Ellis，R.W.，ed.，Butterworth-Heinemann，Massachusetts，pp.363-390；Jacobs等，1992.J.Virol.vol.66，pp.2086-2095；Karlsson等，1985.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.vol.82，pp.158-162；Konishi等，1995.J.Clin.Invest.vol.96.pp.1125-1130；Korst等，1995.Am.J.Respir.Crit.Care Med.vol.151，pp.S75-S87；Luback等，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.vol.86，pp.6763-6767；Mayr等，1999.Virology.vol.263，pp.496-506；Mayr等，2001.Vaccine.vol.19，pp.2152-2162；Muhlhauser等，1995.Cric.Res.Vol.77，pp.1077-1086；Papp等，1997.J.Gen.Virol.vol.78，pp.2933-2943；Prevec等，1990.J.Infec.Dis.vol.70，pp.429-434；Rosenfeld等，1989.J.Science.Vol.252，pp.431-434；Sheppard等，1998.Arch.Virol.vol.143，pp.915-930；Smith等，1991.Mol.Endocrinol.vol.5，pp.867-878；Zabner等，1993.Cell.vol.75，pp.207-216；He等，U.S.Pat.No.5,922,576)。大多数这些系统都利用了一种腺病毒，具体的说是人血清5型腺病毒(Ad5)。
人复制缺陷型Ad5的构建体包含一些E1区内的缺失，这种缺失导致病毒只能在某些可通过腺病毒基因组E1区进行稳定转染的细胞，即293细胞中进行复制(Graham等，1977.J.Gen.Virol.vol.36，pp.59-74)。同样地，很多这些载体包含一种E3区内的缺失，此缺失导致MHC-I类应答的抑制丧失，从而增强了被这些病毒感染的动物对表达的外源基因产生免疫应答的能力(Chengalvala等，同上)。E1区内缺失的编码序列约为3000个碱基对，而在E3区内缺失的编码序列约为2700个碱基对，再加上腺病毒所能包装的估计为其基因组长度105％的序列(追加大约1800个碱基对)，使得载体具有了容纳约7500个碱基对大小外源序列的能力。因此，该结构提供了一种有效模型以用于设计需在体内进行基因表达的疫苗。
已知I型干扰素，IFNα和β或IFNα/β，都具有抗病毒活性，并且是宿主细胞抵御病毒感染的第一道防线(Vilcek and Sen.1996.InVirology.Fields等，eds.Lippincott-raven Publishers，Philadelphia)。病毒侵染的细胞会被诱导表达和分泌IFNα/β，IFNα/β能结合到临近细胞上的特异受体，经由一系列事件引发细胞进入抗病毒状态从而激活干扰素诱生基因(ISGs)。这些ISGs的产物在不同阶段对病毒的复制进行影响，而不同的病毒对不同的ISG的产物具有特异的敏感性。得到详尽描述的ISGs的实例包括双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)、2’-5’A合成酶、RNase L及Mx。
现已证实，FMDV的复制对IFNα或β是高度敏感的，并且含有猪或牛的IFNα/β的上清液可以抑制FMDV的复制(Chinsangaram等，1999.J.Virol.vol.73，pp.9891-9898)。为了更加直接的研究IFNα或β对FMDV复制的影响，用对每一物种的IFNα和β的特异性一致序列引物从猪肾(PK)和胎牛肾脏(EBK)细胞中对IFNα/β进行了扩增和克隆。每种IFN的克隆均在大肠杆菌中进行了测序和表达(Chinsangaram等，2001.J.Virol.vol.75，pp.5498-5503，参见图一)。在最高诱导下，牛的IFNα和β与猪的IFNα具有相似的表达水平，而猪的IFNβ在低水平表达(Chinsangaram等，同上，2001，参见图1)。当在PH2.0条件下对猪和牛的IFNα或β进行处理，连续稀释，并进行活性测试，可发现其对来自同源物种的细胞，包括一种猪的细胞系(IBRS2)和EBK细胞均表现出相似的对FMDV复制的抑制作用(Chinsangaram等，2001.同上，参见表1)。与预期一致，做为对照的由大肠杆菌表达的FMDV的3C蛋白对病毒复制不具有抑制作用(Chinsangaram等，同上)。猪和牛的IFNα或β的表达还具有相似的对水泡性口炎病毒(VSV)、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒的抗病毒活性。另外，已发现除牛的IFNβ以外，猪的IFNα和β及牛的IFNα均能抑制来源于其他物种的细胞中的FMDV复制(Chinsangaram等，2001，同上，参见表1)。
由于在细胞培养过程中FMDV的复制对IFNα和β的处理是敏感的，所以I型IFN可作为一种在体内抗FMDV的药剂。I型IFN作用迅速，并且将其给药可对FMDV所有因抗原性变异而产生的血清型和亚型提供预防作用。但是，IFNα/β会被快速降解，而且临床上需要多次进行高剂量注射较长的时间。含有I型IFN基因的构建体提供了一种可选择的方法来递送IFN蛋白，因此使动物能在一段周期内内源地产生IFN。此外，所递送的IFN的量可以用重组病毒的剂量来加以控制。含有这些基因的载体，例如重组的人复制缺陷型腺病毒，对IFN的递送和随后的体内基因表达也是有效的。
                      发明概述
我们构建了一种复制缺陷型重组载体，其包含一种特别适用于赋予易感动物早期防御能力的干扰素基因。用这种载体接种后一天，发现动物能够抵抗致命的口蹄疫病毒(FMDV)的侵染。通过在疫苗中加入IFN，使得动物在特异性免疫反应发生之前就具有了早期抵抗作用，这种特性在口蹄疫的爆发期显得尤为必要。
因此，本发明的一个目的是提供一种可作为有效疫苗的新构建体，通过表达IFNα或β早期保护易感动物免受FMDV侵染。
本发明的另一个目的是提供一种含有用于在体内表达IFNα或IFNβ的新构建体的载体，可用作一种有效疫苗，通过表达IFNα或β来早期保护易感动物免受FMDV侵染。
本发明的另一目的是提供一种针对FMDV的有效疫苗，该疫苗含有新的构建体，该构建体包含在一种生理相容性载体中的编码IFNα或β的基因，和一种针对FMDV的有效疫苗。
本发明的另一目的是提供一种通过施用有效剂量的组合物来免疫易感动物的方法，所述组合物含有新构建体和生理相容性载体。
本发明的另一目的是提供一种通过施用组合物来免疫FMD易感动物的方法，所述组合物含有有效剂量的载体(vector)，所述载体含有新构建体和生理相容性载体(carrier)，以及一种针对FMDV的有效疫苗。
从下文的描述中将会容易地了解本发明的其它目的和优点。
                       附图简述
图1显示猪干扰素α(pIFN-α)。图A显示了包含有信号序列的pIFN-α克隆7的序列(SEQ ID NO：1)。这一克隆在pTOPO中进行测序，被Pst1和BamHI消化并连接到为同样酶消化的KSII中。随后，质粒被ClaI和XbaI消化并连接到被ClaI和XbaI消化过的Ad5-Blue中。由上述质粒得到的病毒被称为Ad5-pIFNα7.6.3。表B显示了包含有信号序列的pIFN-α克隆9的序列(SEQ ID NO：2)。这一克隆在pTOPO中进行测序，被Pst1和SpeI消化并连接到为同样酶消化的KSII中。随后，质粒被ClaI和XbaI消化并被连接到为ClaI/XbaI消化过的Ad5-Blue中。由上述质粒得到的病毒被称为Ad5-pIFNα9.9.6。
图2显示包含有信号序列的猪干扰素β(pIFN-β)克隆1的DNA序列(SEQ ID NO：3)。这一克隆在pTOPO中进行测序，被RcoRI和BamHI消化并连接到为同样酶消化的KSII中。随后，质粒被ClaI和XbaI并被连接到为ClaI/XbaI消化过的Ad5-Blue中。由上述质粒得到的病毒被称为Ad5-pIFNβ1.4.6。
图3显示包含有信号序列的牛干扰素α(bIFN-α)克隆9的DNA序列(SEQ ID NO：4)。这一克隆在pTOPO中被测序，被BamHI和EcoRV消化并连接到为同样酶消化的KSII中。随后，质粒被ClaI和XbaI并被连接到为ClaI/XbaI消化过的Ad5-Blue中。由上述质粒得到的病毒被称为Ad5-bIFNα9.2.2。
图4显示含有信号序列的牛干扰素β(bIFN-β)克隆5的DNA序列(SEQ ID NO：5)。这一克隆在pTOPO中被测序，被BamHI和EcoRV消化并连接到为同样酶消化的KSII中。随后，质粒被ClaI和XbaI并被连接到为ClaI/XbaI消化过的Ad5-Blue中。由上述质粒得到的病毒被称为Ad5-bIFNβ5.3.1。
图5显示用放射免疫沉淀测定法(RIP)获得的在Ad5-pIFN-α侵染的IBRS细胞中的pIFN-α的表达动力学。分别在侵染4.5、6、25和30小时后(hpi)取样。
图6显示Ad5pIFN-α侵染的IBRS2细胞中的pIFN-α的表达动力学。分别在第4.5、6、25和30hpi取样。
图7显示Ad5-bIFN-α或Ad5-bIFN-β侵染的IBRS2细胞中的IFN-α或IFN-β的表达动力学。分别在5、23、28和48hpi取样。
图8显示将Ad5-pIFN-α对猪进行给药以保护猪免受FMDV侵染的效果。记录损伤直到侵染后14天。第一组接受Ad5-Blue(对照)，第二组接受低剂量的Ad5-pIFN-α。
图9显示接种了Ad5-Blue的动物在侵染后其血清学反应和临床反应。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来显示反应情况。
图10显示经低剂量或高剂量的Ad5-pIFN-α接种的猪的抗病毒活性。
图11显示经低剂量Ad5-pIFN-α接种的动物在侵染后的血清学反应和临床反应。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来显示反应情况。
图12显示经高剂量Ad5-pIFN-α接种的动物在侵染后的血清学反应和临床反应。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来显示反应情况。
图13显示经Ad5-pIFN-α接种并在一天后被侵染的猪第14dpc的血清的RIP。
图14显示在对照组中，接种Ad5-pIFN-α对猪防御FMDV侵染的影响。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来确定效果。
图15显示在第2组(在侵染7天前进行给药)中，接种Ad5-pIFN-α对猪防御FMDV侵染的影响。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来确定效果。
图16显示在第2组(在侵染5天前进行给药)中，接种Ad5-pIFN-α对猪防御FMDV侵染的影响。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来确定效果。
图17显示在第2组(在侵染3天前进行给药)中，接种Ad5-pIFN-α对猪防御FMDV侵染的影响。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来确定效果。
图18显示在第2组(在侵染1天前进行给药)中，接种Ad5-pIFN-α对猪防御FMDV侵染的影响。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来确定效果。
图19显示在第2组(在侵染1天后进行给药)中，接种Ad5-pIFN-α对猪防御FMDV侵染的影响。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来确定效果。
图20显示经Ad5-pIFN-α接种并在多日后被侵染的猪第14dpc的血清的RIP。
图21显示接受Ad5-VSVG给药的对照组中的猪直接被FMDV接种侵染后所产生的防御作用。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来确定抵抗效果。
图22显示猪直接被FMDV接种侵染后所产生的防御作用(Ad5-A24的效应)。可通过抗病毒活性、病毒血、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来确定抵抗效果。
图23显示猪直接被FMDV接种侵染后所产生的的防御作用(Ad5-pIFN-α的效应)。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来确定抵抗效果。
图24显示猪直接被FMDV接种侵染后所产生的的防御作用(Ad5-pIFN-α和Ad5-A24的效应)。可通过抗病毒活性、病毒血征、损伤记录和产生的FMDV中和抗体来确定抵抗效果。
图25显示经Ad5-pIFN-α、Ad5-A24或Ad5-pIFN-α和Ad5-A24接种并在5天后被侵染的猪第14dpc的血清的RIP。
图26显示将Ad5-bIFN-α对牛进行给药以保护牛免受FMDV侵染的效果。
                        发明详述
文中定义的疫苗是一种生物药剂，该药剂能在经疫苗递送的动物体内激发防御反应，并能在细胞和体液中促使所有的防御反应，包括，但不局限于，免疫反应。在此应用中，如果由IFN赋予的防御反应足以延缓疾病的攻击或减轻疾病的剧烈程度，使得传统的FMD疫苗能在未受保护的动物体内刺激出一种后续的保护反应，则可认为此类防御反应是有效的。
重组疫苗包括一种在接种方案中可有效地作为疫苗的构建体，另外包括至少一种的调节元件，例如启动子(如CMV启动子)、SV40聚合酶信号序列、末端序列，该调控元件与编码能引发保护性反应的药剂的异源DNA序列有效连接。上述构建体可根据为本领域所熟知的重组方法来制备，并且能够表达出足够量的免疫药剂以诱发保护性反应。
该构建体可被插入到用于免疫方案或接种方案的载体中。所需序列可以单独地插入到载体中，也可将其相互连接作为一个盒插入到载体中。
本发明的疫苗是由一种构建体或含有该构建体的载体与一种生理相容性载体，如磷酸盐缓冲液、生理盐水，以及培养基，所组成的组合物。该构建体可能含有用于编码IFN-α、IFN-β或二者复合结构的序列。编码合适的FMDV抗原的序列可包含于构建体中以应用于传统的IFN与FMDV抗原的合并给药，同时此序列也可以作为单独的构建体存在。这些抗原一般在本领域中是被熟知的。有效的重组疫苗的例证包括有，Grubman等人描述的(U.S.Pat.No.5,824,316)去除了口蹄疫病毒的前导肽，以及Mason等人描述的人工制备的无感染性的FMDV。无感染性的病毒是一种突变病毒体，其VP1区上的G-H环结构中的氨基酸序列GVRGDF被去除并为氨基酸序列NP所取代。作为选择，该疫苗可以是含有IFN的载体与有效的FMD疫苗的混合物，也可以作为单独的构建体用于传统给药。
可通过肌肉内、皮内、皮下或鼻内的接种或注射等方法将疫苗给药于动物，该给药量应有效地使该疫苗表达足够的IFN以产生抗病毒活性并保护动物免受FMDV的致命株的侵染。给药量可根据被接种动物的情况来变化，并且考虑动物的个体大小和重量以及IFN的类型。举例说明，用于接种猪的有效量大约为108-1010pfu Ad5-IFN，优选的大约为108-109pfu Ad5-IFN。对牛来说，有效量大约为109-1010pfu Ad5-IFN。如有必要，本领域技术人员可根据下文特定实施例1-14中提供的指导来实验测定该有效量。
可通过将IFN-α或IFN-β的cDNA构建体插入到有效的载体中来制备一种含有IFN的重组疫苗。插入的构建体中还可包括FMDV抗原的编码序列。用于在体内递送遗传物质的有效系统为本领域技术人员所熟知，此外这些系统可包括一些病毒和非病毒转移方法(例如Ricigliano，同上)。本领域中已经广泛公布了病毒基因转移载体的应用，包括腺病毒的应用、腺伴随病毒的应用、细小病毒的应用、牛痘病毒的应用、疱疹病毒的应用、痘病毒的应用、脊髓灰质炎病毒的应用和许多逆转录病毒的应用。尽管任意已知的载体都可有效用于IFN的递送，但是为了实验目的而仅将文中描述的腺病毒载体(Ad5)作为实例给出。
此外，本发明的疫苗还应包括在生理相容性载体中含有编码IFN的构建体，以及如果需要，含有编码FMDV抗原的构建体。作为选择，该疫苗还可以是一种含有IFN的编码序列的构建体与一种已知有效的FMDV疫苗的混合物。
含有IFN的疫苗可根据已知的重组技术来制备。首先，克隆合适的IFN基因，然后将其插入到所选载体中。为了给本领域技术人员提供指导，文中给出了一些特定实施例。合适的IFN基因是从任意FMD易感动物中获得的I型IFNα/β，此类动物包括任意的偶蹄目动物，例如猪、牛和羊。此疫苗产生迅速，可在短期内防御FMD和其它病毒试剂。通过将含有IFN的疫苗和熟知的传统FMD疫苗合并给药，可获得长期和短期的保护作用。
通过直接连接可以将猪的IFNα或IFNβ的cDNA插入到复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)基因组的E1区，并且利用嵌合DNA转染可表达E1功能区的293细胞以产生在实施例1-5中所描述的重组腺病毒Ad5-pIFNα或Ad5-pIFNβ。
当用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和考马斯蓝染色进行检测时，在不支持复制缺陷型腺病毒生产性复制的转染了Ad5-pIFNα或Ad5-pIFNβ的猪肾脏细胞系(IBRS2)中，两种IFN分子均具有高水平的表达。使用兔抗猪IFNα或IFNβ抗体进行放射免疫沉淀测定可确定反应的特异性。用FMDV病毒斑减少试验可测定Ad5-pIFNα转染的IBRS2细胞的上清液对同源细胞提供了超过105个单位的抗病毒活性。以108或109pfu Ad5-pIFNα对猪进行肌肉内接种，在最初的检测时间，即接种后16小时后，可在血样中检测到大于约400个单位的抗病毒活性。
试验结果证明，接种Ad5-pIFNα可以迅速地使猪免受FMD的侵染(见实施例8)。此外，已证实高剂量的Ad5-pIFNα接种后产生的抗病毒活性至少会维持5天，这一数据暗示至少在此周期内动物可以免受病毒的侵染。
以下提供的实施例仅作为本发明的进一步说明，而不意味着本发明局限于权利要求所定义的范围。
文中引用的所有文献都在此完整引入作为参考。
                         实施例
实施例1  细菌株和哺乳动物细胞系
在电感受态细胞(Invitrogen One Shot TOP10 ElectrocompTM细胞，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中扩增腺病毒质粒和pAd-Blue(Moraes等，2001.BioTechniques.Vol.31，pp.1050-1056)。在化学感受态细胞TOP10细胞(Invitrogen One Shot TOP10，同上)中培养其它载体。在pAd-Blue载体的设计之前，按照制造商的方案(Quantum Biotechnologies，Montreal，Canada)在感受态BJ5183细胞中用同源重组方法构建含有外源基因的前载体。
在293细胞(Graham等，同上)中培养并纯化来自pAd-Blue载体的重组腺病毒。含有VSV-NJ糖蛋白基因的质粒(pCR-Blunt II-TOPO-VSV G)由Luis Rodriguez博士提供。
实施例2  I类干扰素基因的克隆
利用基于有效的Genebank序列设计的引物，分别地以来自于猪肾脏细胞(EK)和胎牛肾脏细胞的DNA(由于IFN不含有内含子)和cDNA对猪和牛的IFNα和IFNβ基因进行扩增。该5’引物含有IFN的分泌信号序列，而3’引物含有一个后续有BamHI限制性酶切位点的终止密码子。以pfu聚合酶和合适的引物(表1)进行25个循环的聚合酶链式反应(PCR)对基因进行扩增。将PCR产物(平末端)连接于线性化的PCR-BluntII-TOPO上，并转染到TOP10细胞中。通过限制性内切酶消化对克隆进行检测，并对含有合适大小的插入序列的克隆进行测序(图1-4)。由于所有检测的动物种类均含有大量的IFN-α亚科，而且猪和牛都含有至少5种相互关连的IFN-β基因(Vilcekand Sen，同上)，因而可获得多于一种的IFN-α基因和IFN-β基因的克隆。图1-4的IFN序列对用于生产重组腺病毒(见实施例4)的基因进行了描述。重组腺病毒Ad5-pIFNα7.6.3来源于图.1a中的序列(SEQ ID NO：1)，Ad5-pIFNα9.9.6来源于图.1b中的序列(SEQ ID NO：2)，Ad5-pIFNβ1.4.6来源于图.2中的序列(SEQ ID NO：3)，Ad5-bIFNα9.2.2来源于图.3中的序列(SEQ ID NO：4)，而Ad5-bIFNβ5.3.1来源于图.4中的序列(SEQ ID NO：5)。
实施例3  含有IFN的质粒的表达
用不同的限制性内切酶对含有猪的IFN-α克隆7和9的质粒进行消化，并将其连接到用同样的内切酶消化的pBluescript II KS+(pKSII)(Stratagene，LaJolla，CA)中。在一种体外的转录/翻译系统(TNT kit，Promega，Madison，WI)中，通过放射性标记对按正确方向连接的克隆进行检测以用于表达。用多克隆血清对体外表达的IFN进行免疫沉淀反应并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分析。对于猪的IFNα和IFNβ均可发现一条相应条带(结果未给出)。用在一种大肠杆菌系统(Chinsangaram等，2001同上)中先期表达的IFNs来制备兔抗猪和牛的IFNs的抗血清。
用EcoRI和BamHI对含有牛IFN-α克隆8和9(图3)及含有牛IFN-β克隆5(图4)的质粒进行消化，并将其连接到用同样的内切酶消化的pKS II。用在前文描述过的用于在体外检测猪IFN基因.的TNT系统对克隆进行检测以用于表达。所有被检测克隆在适宜的位置均可检测到单一的条带(结果未给出)。
表1用于扩增牛和猪IFN基因的探针
牛IFN-α正向：    5’CCG ATG GCC CCA GCC TGG TCC(SEQID NO：6)牛IFN-α反向：    5’GGA TGG ATC CTC AGT CCT TTC TCCTGA AWY TCT C(SEQ ID NO：7)牛IFN-β正向：    5’CAT CAT GAC CYA CCG GTG CCT CCTCC(SEQ ID NO：8)牛IFN-β反向：    5’GGA TGG ATC CTC AKT CAC GGA SGKAAC CTG TTA G(SEQ ID NO：9)猪IFN-α正向：    5’ATG GCC CCA ACC TCA GCC(SEQ ID NO：10)猪IFN-α反向：    5’TGG ATC CTC ACT CCT TCT TCC TCAGTC TGT C(SEQ ID NO：11)猪IFN-β正向：    5’ATG GCT AAC AAG TGC ATC CTC(SEQID NO：12)猪IFN-β反向：    5’GGA TGG ATC CTC AGT TCC GGA GGTAAT CTG TAA G(SEQ ID NO：13)
K＝T和G
S＝G和C
W＝A和T
Y＝C和T
实施例4  Ad5-IFN载体的构建
现已开发了一套利用复制缺陷型人5型腺病毒作为载体的哺乳动物表达系统，即pAd5-Blue(Moraes，同上)。这种病毒含有β-半乳糖苷酶的α片断。这种pAd5-Blue载体系统可使重组腺病毒在获得合适的外源插入基因后3周内进行传代。
用ClaI/XbaI将来自猪IFNα克隆7和9(见图.1)、猪IFNβ克隆1(图.2)、牛IFNα克隆9(图.3)，以及牛IFNβ克隆5(图.4)的IFN基因由pKSII上切除，并将这些基因连接到ClaI/XbaI消化过并被碱性磷酸酶处理过的pAd5-Blue上。通过电穿孔使连接反应在TOP10细胞中进行，并在具有合适抗性的含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(XgaI)的琼脂平板上筛选出白色克隆。用HindIII消化DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳验证构建体中IFN基因的存在。将能够在平板上生长并在HindIII酶切后具有合适大小基因片断的pAd5-IFN载体的1-2个克隆进行大规模制备，并通过CsCl离心纯化质粒DNA。
用PacI线性化纯化后的DNA，并通过CaPO4沉降法(Moraes，同上)将质粒转染到293细胞中。每日对细胞进行检测，挑选细胞斑并在150mm的培养瓶中对293细胞进行感染以进行扩增。根据Moraes(同上)的描述，由于致细胞病变效应的发展，在感染2-3天后病毒将会被分离。提取病毒DNA并通过HindIII对其进行消化检测以确认合适基因片断的存在。预加工的病毒(Ad5-pIFNα，Ad5-pIFNα，Ad5-pIFNβ，Ad5-bIFNα和Ad5-bIFNβ)代表了一些高效价的粗制品，可用来制备大量的病毒，这些病毒可通过连续的CsCl梯度离心及之后的非连续的CsCl梯度离心得到纯化。通过半数组织培养感染量检测(TCID50)方法在293细胞中确定病毒的效价，其效价大约为1010pfu/ml(转化为pfu计量的效价后)。
用类似的方案来制备绵羊的Ad5-IFN载体(Ad5-oIFNα和Ad5-oIFNβ)。
实施例5  IFN在哺乳动物细胞中的表达
在IBRS2细胞中对Ad5-pIFNs进行检测以用于表达，该细胞系对于复制缺陷型的Ad5的侵染是敏感的，而对可进行生产性复制的Ad5不敏感。在病毒侵染后(Chinsangaram等，2001，同上)，IBRS2细胞不能产生I型IFN基因的mRNAs，因此可检测到IFN应是Ad5侵染的一种结果。在转染后的多个时段用[35S]蛋氨酸对细胞进行1小时的放射性标记，并用适当的多克隆兔抗体对上清液(S)和细胞溶解物(P)进行免疫沉淀反应，再通过PAGE进行检测。如在Ad5-pIFNα9.9.6侵染的细胞所显示的结果中，最早发现上清中出现pIFN-α是在侵染后4.5小时(hpi)，并且在6、25和30hpi也发现了IFN(图5)。IFN-α的表达量比体外翻译的IFN的量大(泳道c1和c2)，这可能是因为体内的IFN-α被糖基化的缘故。由于表达的IFN含有一个信号序列并会为细胞分泌，因此认为在细胞的上清液中应该可以检测到IFN。用Ad5-pIFNα7.6.3和Ad5-pIFNβ1.4.6感染的细胞进行实验也可得到类似的结果(结果未给出)。这些结果证明了IFN的表达开始于4.5hpi或更早的时段，并且表达至少可以持续到30hpi。
同样采用PAGE分析和考马斯兰染色的方法对转染后.未标记的IBRS2细胞中的IFN的表达水平进行监控。表达分析系统中还包括适当的对照，其中包括假转染细胞和其它Ad载体(Ad5-FMDV A24)侵染的细胞。在Ad5-pIFNα7.6.3转染细胞的第4hpi刚刚能够发现IFN条带的迁移滞后于大肠杆菌中pIFN-α条带的迁移的现象，在第6hpi此现象变得明显起来(图6)。在假转染细胞和Ad5-FMDVA24侵染的细胞中观测不到可供比较的条带(泳道1和2)。在第25和第30hpi.可检测到两条不同的对应于pIFN-α分子量的条带，这可能是由于不同水平糖基化(IFN-α克隆7.6.3含有一个潜在的糖基化位点)的缘故。在Ad5-pIFNα9.9.6转染的IBR2细胞中也可发现相似的IFN-α表达的动力学，尽管最早在第2hpi即可检测到IFN的表达(结果未给出)。在Ad5-pIFNβ1.4.6感染的细胞中最早可在第4.5hpi.检测到一条宽的条带，这可能是蛋白不同水平糖基化的反映(pIFN-β克隆1.4.6含有两个潜在的糖基化位点)。初步分析表明每1ml的上清液可生产大约25μg的pIFN-α。而pIFN-β的产量要少一些(结果未给出)。
用Ad5-bIFNα9.2.2和Ad5-bIFNβ5.3.1对IBRS2细胞进行转染以用于牛IFN-α和IFN-β基因的表达，并且在转染后多个时段用[35S]蛋氨酸对细胞进行1小时的放射性标记。用PAGE方法和使用兔抗牛IFN-α和IFN-β的多克隆抗血清进行的免疫沉淀反应直接检测上清液和细胞溶解物。在第23hpi可发现蛋白的表达(在第5hpi.有很低水平的表达)，蛋白表达可持续至少48小时(图7)。牛IFN-α的免疫沉淀反应的结果显示为单一条带，而牛IFN-β的免疫沉淀反应的结果显示为多条条带，这可能表明在IFN-β中存在多种水平的糖基化(结果未显示)。此外，还利用PAGE分析方法和考马思兰染色方法对转染的IBRS2的上清液中的蛋白表达情况进行监控。最早在第5hpi观察到bIFN-α的相应条带，而在第23hpi可检测到显著水平的表达。初步分析表明每1ml的上清液可生产大约12-25μg的bIFN-α和5μg的pIFN-β。
实施例6  转染细胞中由IFN-α和IFN-β所诱导的抗病毒活性
为了证实pIFN-α和pIFN-β的抗病毒活性，用Centricon 100滤器对来自于Ad5-pIFNα7.6.3、Ad5-pIFNα9.9.6和Ad5-pIFNβ1.4.6转染的IBRS2细胞的上清液进行过滤以去除大部分残余的Ad5疫苗(这一程序可去除104-105pfu的病毒)，在PH 2的条件下对上清液进行过夜处理(这一程序可灭活102-103pfu的病毒)，并对上清液进行中和以去除更多的Ad5疫苗。对带有A12类FMDV的IBRS2细胞进行病毒斑减少试验以鉴定上清液的抗病毒生物活性(Chinsangaram等，1999，同上)。最早可在第2-4hpi.检测到Ad5-pIFNα7.6.3、Ad5-pIFNα9.9.6和Ad5-pIFNβ1.4.6转染细胞的上清液中的抗病毒活性，并且在第25hpi.可检测到64-256,000单位的抗病毒活性(表2)。将Ad5-FMDVA24转染的IBRS2细胞(第24hpi)和假转染的细胞的上清液作为对照，在其上清中没有检测到抗病毒活性(结果未给出)。
在IBRS2细胞和MDBK细胞(一种牛的细胞系)中对Ad5-pIFN-α和Ad5-pIFN-β转染的IBRS2细胞的上清液进行鉴定。如表3所显示，在猪和牛的细胞系中，含有pIFN-α和pIFN-β的上清液具有同等的抗病毒活性。由pIFN-β诱导的抗病毒活性低于pIFN-α，这可能是由于pIFN-β的低水平表达所致。
表2  Ad5-pIFN-α和Ad5-pIFN-β转染的IBRS2细胞的上清液a中的抗病毒活性
感染后时间(小时)                              Ad5-载体
Ad5-pINFα7.6.3  Ad5-pIFNα9.9.6  Ad5-pIFNβ1.4.6
    1     ＜50b       ＜50       ＜50
    2     ＜50       ＜50       ＜50
    4     800       400       200
    6     3200       3200       1600
    25     256,000       128,000       64,000
a用Centricon 100滤器对上清液进行离心，在pH 2的条件下对上清液进行处理并对其进行中和，鉴定上清液的抗病毒活性。
b可使IBRS2细胞的FMDV病毒斑的数目降低到原有的50％的最高稀释度。
表3  在猪和牛的细胞系中，Ad5-pIFN-α和Ad5-pIFN-β转染的IBRS2细胞的上清液a中的抗病毒活性。
感染后时间(小时)                           Ad5-载体
        Ad5-pINFα7.6.3      Ad5-pIFNβ1.4.6
           细胞类型          细胞类型
    IBRS2b     MDBKc     IBRS2     MDBK
    1     ＜50     ＜50     ＜50     ＜50
    2     ＜50     ＜50     ＜50     ＜50
    4     800     400     200     100
    6     3200     3200     1600     400
    25     256,000     128,000     64,000     32,000
a用Centricon 100滤器对上清液进行离心，在PH 2的条件下对上清液进行处理并对其进行中和，鉴定上清液的抗病毒活性。
b可使FMDV A12病毒斑的数目降低到原有的50％的最高稀释度。
c可使VSV-NJ病毒斑的数目降低到原有的50％的最高稀释度。
采用上文中描述的方法对Ad5-bIFNα9.2.2和Ad5-bIFNβ5.3.1转染的IBRS2细胞的上清液进行处理以去除所有残余的Ad5来证实pIFN-α和pIFN-β的抗病毒活性。在MDBK和IBRS2细胞中对处理后的上清液进行抗病毒活性检测。在第5hpi时检测到抗病毒活性，而在第28-48hpi.抗病毒活性可到达大约204,000单位/ml的水平(表4)。如表中所证实，bIFN-α在牛和猪的细胞中具有同等的生理活性，而bIFN-β仅在牛的细胞中具有活性(Chinsangaram，1999，同上)。
表4  牛和猪的细胞中Ad5-bIFNα和Ad5-bIFNβ感染的IBRS2细胞上清液的抗病毒活性。
感染后时间(小时)                         Ad5-载体
        Ad5-bINFα9.2.2       Ad5-bIFNβ5.1.3
           细胞类型          细胞类型
    MDBKb     IBRS2c     MDBK   IBRS2
    1     ＜50     ＜50     50   ＜50
    5     3200     6400     12,800   ＜50
    23     51,200     ＞51,200     204,800   ＜50
    28     102,400     ＞102,000     204,800   ＜50
    48     204,800     204,000     51,200   100
a用Centricon 100滤器对上清液进行离心，在PH 2的条件下对上清液进行处理并对其进行中和，鉴定上清液的抗病毒活性。
b可使VSV-NJ病毒斑的数目降低到原有的50％的最高稀释度。
c可使FMDV A12病毒斑的数目降低到原有的50％的最高稀释度。
实施例7  猪体内IFN的表达：安全性和效力测试
对接种Ad5-pIFNα7.6.3的猪进行剂量-效应试验以验证在接种动物体内是否可以检测到具有生理活性的IFN。用107、108或109pfuAd5-pIFNα7.6.3对猪进行肌肉内(IM)接种(每只对应一种剂量)，而用108pfu Ad5-VSVG(含有水泡性口炎病毒基因的腺病毒，Moraes，同上)对另外的动物进行肌肉内接种。检测IFN给药后对动物的有害影响.，并每日测量动物的体温。在第16、18、20和22hpi.提取血样，而在此后的6天内每日提取一次。用病毒斑减少试验检验抗病毒活性(Chinsangaram，1999，同上)。
在接种后没有发现任何动物出现有害的临床表征，也没有发现接种动物体温升高现象。Ad5-VSVG接种的动物和107pfu Ad5-pIFNα接种的动物均没有产生抗病毒能力。在最早的检测期，例如第16hpi，以108或109pfu Ad5-pIFNα接种的动物均产生抗病毒能力。在第16hpi.，以109pfu Ad5-pIFNα接种的动物的血样中具有400单位/ml的抗病毒活性，并且活性可至少维持该水平达两天。随时间推进抗病毒活性有所降低，但仍可在第4dpi.检测到该活性。
实施例8  接种Ad5-pIFN-α的猪对FMDV侵染的防御
将几组猪(每组3头)关在单独的房间内，对第2和3试验组采用108或109pfu Ad5-pIFN-α7.6.3的肌肉内注射，而对第1试验组采用109pfu Ad5-Blue的肌肉内注射以作为对照组。接种一天后，在动物左前足的足管处直接接种3×105倍的半数牛感染剂量(BID50)的FMDV A24以感染动物。对动物进行FMD侵染后临床表征的检测，这些表征包括发热、病毒血征、直至侵染后14天(dpc)的FMDV特异性抗体的诱发现象以及接种后7天内(dpi)的抗病毒活性。
表5试验设计
组号 动物编号 接种a 侵染b
#1Ad5-Blue 304-12，305-2，305-3 109pfu Ad5-Blue 3×105BID50
#2低剂量 186-1，199-2，501-3 108pfu Ad5-pIFNα7.6.3 3×105BID50
#3高剂量 3-1，3-2，7-7 109pfu Ad5-pIFNα7.6.3 3×105BID50
#4Ad5-Blue 367-1，368-1，402-1 109pfu Ad5-Blue 未侵染
#5低剂量 204-1，208-6，365-4 108pfu Ad5-pIFNα7.6.3 未侵染
#6高剂量 202-4，202-6，203-3 109pfu Ad5-pIFNα7.6.3 未侵染
a用表中指示剂量的Ad5-载体对猪进行肌肉内接种
b在用Ad5-载体对猪进行给药后，以表中指示剂量的FMDV A24在动物左前足的足管处直接接种
如上图中所示对另外3组相同的动物进行接种，但不对其进行FMDV的侵染(4-6试验组)。对这些动物进行发热和抗病毒活性的监测。结果在图8-13中给出。
侵染后的临床反应：在第2dpc，三只对照组动物中的两只，即#305-2和305-3，出现了泡状损伤，而在第3dpc，所有的3只动物均出现了损伤现象(图8)。所有的3只动物在3dpc均出现严重的症状。猪#305-2在三天内持续发热(体温超过104°F)，而此组中另两只动物只在一天或两天内出现发热现象(结果未给出)。在以108pfuAd5-pIFN-α接种的第2组中，#501-3在第4dpc显示出严重的FMD症状，猪#199-2在第5dpc出现一处损伤并在第7dpc显示出严重的FMD症状，而猪#186-1仅在第8dpc于左足背侧出现一处损伤(图8)。在以109pfu Ad5-pIFN-α接种的第3试验组中，在整个试验过程中，即侵染后14天内，没有发现任何动物出现任何的FMD症状。第3组中的猪#7-7在第12天(侵染后)死亡。尸检结果显示没有出现FMD感染的症状，并且通过在BHK细胞上进行的滴定检测也没有在咽扁桃体、心、肺、左前囊淋巴结或血中发现FMDV。该死亡动物出现了可能由回肠穿孔所导致的严重的腹膜炎症状。
血清学分析：第1dpc，可在对照组，即第1试验组的所有动物中检测到病毒血征，此现象可持续至第3dpc并达到104-105的滴度(图9)。在第4dpc，这些动物体内会发生FMDV特异性中和抗体的应答。第2组中编号为#501-3的猪仅可在第1dpi(-1dpc)检测到100单位的抗病毒活性，在第2dpc出现病毒血征，并且在第4dpc出现损伤现象(图10A和11)。编号为#199-2的猪可在第1dpi(-1dpc)检测抗病毒活性，该活性可在之后的一天内持续。该动物在第5dpc出现病毒血征并持续2天，在第5dpc出现一处损伤，并且在7dpc时病变进一步恶化。编号为#186-2的猪可在第1dpi(-1dpc)检测抗病毒活性，活性在之后一天内持续。该动物没有出现病毒血征，但在第8dpc出现一处损伤并在第7dpc产生FMDV特异性中和抗体的应答。
第3试验组的动物在第1dpi可检测到400单位的高水平的抗病毒活性，并且在之后的2-3天内也可检测到此活性(图10C和12)。该组中所有动物均受到彻底的保护作用以免受FMDV的侵染。并且该组中无任何动物出现病毒血征。
在没有进行FMDV侵染的第5和第6试验组动物中，通常可产生更高水平的抗病毒活性，该活性可较FMDV侵染的同等动物多持续1-2天(图10B和10D)。在Ad5-Blue接种的作为对照的第4试验组中没有检测到抗病毒活性(结果未给出)。第5和第6组动物都出现持续2-3天的发热现象，动物的体温可恢复正常并且动物没有出现其它有害的临床症状(结果未给出)。
用RIP方法对来自1-3试验组动物的第4dpc的血清进行检测，通过对血清中的抗病毒结构蛋白和非结构(NS)蛋白的抗体的存在度的鉴定来证明IFN治疗是否可以阻断侵染病毒的复制过程。如来自于感染动物中的血清具有和病毒NS蛋白发生免疫沉淀反应的能力，则可证明在该动物体内病毒进行了复制(图13，9-11泳道)。与预期一致，第1试验组中3只动物的血清中均含有抗病毒结构蛋白和NS蛋白的抗体。同样地，第2试验组中所有动物也都产生了抗病毒结构蛋白和NS蛋白的抗体(6-8泳道)。相反地，在未出现临床症状和病毒血征的第3试验组所有动物的血清中都没有产生抗病毒NS蛋白的抗体，通过该检测可证明该组中所有动物均受到彻底的保护以阻止FMDV的复制(3-5泳道)。上述动物血清的3个ABCELISA检测结果也证实在第3试验组中的动物体内没有出现病毒的复制。
实施例9  用Ad5-pIFN-α接种的猪对FMDV侵染的防御作用的 持久性
实施例8中描述的试验证明了在以109pfuAd5-pIFN-α给药一天后，猪得到了彻底的保护以防御致命的FMDV A24的侵染。为证实在接种Ad5-pIFN-α多久后动物才可防止临床症状的产生以及已感染的动物能否通过侵染一天后的Ad5-pIFN-α给药来防止病毒血征和疾病临床症状的产生，将109pfu pfuAd5-pIFNα7.6.3对各组动物(3只/组)进行给药并且在Ad5-pIFNα给药前一天以3.5×105BID50 FMDVA24在1、3、5和7dpi时在动物左后足(50μl/趾)进行侵染(表6)。结果在图14-20中显示。
与上文中描述的试验一样，将各组动物在分别的房间进行饲养，临床监测IFN给药对动物所产生的有害反应症状，例如发热和嗜眠，并临床监测动物血中的抗病毒活性。FMDV侵染后，在14天内对动物的疾病病征进行检测，这些病征包括体温和损伤，以及病毒血征、FMDV特异性抗体的应答和抗病毒活性。
表6试验设计：保护作用的持久性
组号 动物编号 接种a 接种日期 侵染b
#1对照 61-6，66-11，69-11 109pfu Ad5-VSVG 7天侵染前 3×105BID50
#2 IFN-α 70-4，70-5，70-6 109pfu Ad5-pIFNα7.6.3  7天侵染前 3×105BID50
#3 IFN-α 70-7，70-8，71-4 109pfu Ad5-pIFNα7.6.3 5天侵染前 3×105BID50
#4 IFN-α 337-3，338-6，342-6 109pfu Ad5-pIFNα7.6.3 3天侵染前 3×105BID50
#5 IFN-α 333-4，335-9，335-11 109pfu Ad5-pIFNα7.6.3 1天侵染前 3×105BID50
#6 IFN-α 81-6，81-10，308-9 109pfu Ad5-pIFNα7.6.3 1天侵染前 3×105BID50
a以表中显示剂量对猪进行肌肉内接种
b以图中所示剂量的FMDV A24在Ad5-载体给药后7天(#1和#2)、5天(#3)、3天(#4)和1天(#5)或在Ad5-载体给药前一天(#6)在动物左前足足管处对各组动物进行侵染。
在侵染前对抗病毒反应进行检测，可发现所有接种Ad5-pIFN-α的动物在接种后1天均产生了高水平的抗病毒活性，即200-800单位/ml(图14-19，图A)。该活性在第2天时有所衰退但通常在此后两天内仍可维持大约100单位/ml的水平。在接种后3-5天仍可检测到抗病毒活性。除了第2试验组动物以外，该组动物在接种后5-6天出现发热现象，接种了Ad5-pIFN-α的动物一般不会出现体温升高的现象(结果未给出)。用致命的FMDV对接种Ad5-pIFN-α后1天的动物组(第6试验组)进行直接侵染，可在编号为#81-6和#308-9的的动物体内检测到高水平的抗病毒活性，而在#81-10动物体内检测不到(图19，图A)。一些动物(第2组中#70-4和#70-5，第3组中#71-4)在Ad5-pIFN-α接种后出现发热现象和轻微的嗜睡现象，但这些病征只持续了1-2天。
在侵染后的病毒血征和临床反应方面，对照组中的所有3只动物都在第1dpc出现病毒血征，并且在第二天出现损伤(图14，组B和C)。病毒血征可在4天内被检测到，其滴度为9×105-3.1×107pfu/ml。3天内所有对照组中的动物都产生严重的临床症状。该组中#69-8动物在3天内持续发热，而组中另两只动物只在一天内出现发热现象。对照组动物#611-6在5dpc时死亡，而#69-8在8dpc时死亡。基于尸检结果的组织病理学结论证实#611-6和#69-8动物均出现了典型的FMD型心脏损伤，引起两只动物死亡的最可能原因是心肌的坏死。
在侵染前7天接受Ad5-pIFN-α的试验组在侵染当天没有检测到循环抗病毒活性(图14，组A)。该试验组在第2dpc时具有病毒血征，比对照组晚一天(图15，组B)。病毒滴度为1.9×104-9.1×104pfu/ml，比对照组低1-3个对数值。在第4dpc，该试验组中每三只动物就有两只产生损伤，而第三只动物在第5天出现损伤(图15，组C)。该试验组的所有动物都出现持续1-2天的发热征状。#70-5动物在第12dpc死亡。在其组织病理学报告中发现脑干脓肿、甲状腺脓肿和肺脓肿，并且引起死亡的最可能的原因是与FMD无关的脑脓肿和脑肿胀。
第3试验组的所有动物在侵染当天可检测到25-50单位/ml的低抗病毒活性(图16，组A)。动物在第7dpc发现病毒血征并在第8dpc出现损伤(图16，组B和C)。动物在第7dpc发现病毒血征并在第8dpc出现损伤(图16，组B和C)。在第8和第9dpc将产生病毒血征的#70-7和#71-4动物分别转移到单独的房间。#70-8动物即使暴露性地与临床病变动物直接接触也可以至少在两天内不出现病毒血征和损伤现象。
在侵染前3天和前1天接受Ad5-pIFN-α的第4和第5试验组的所有动物在侵染当天分别具有抗病毒活性(图17和18，组A)。第4试验组动物在侵染后一天可检测到抗病毒活性，而第5试验组动物在侵染后两天内可检测到抗病毒活性。上述两组试验动物即使在进行了3次血液盲目传代后的BHK细胞中也检测不到病毒血征，并且也检测不到任何疾病的临床病征(图16和18，组B和C)。
第1dpc接受Ad5-pIFN-α的第6试验组的所有动物在一天后出现病毒血征(图19，组B)。然而#81-6动物的最大病毒滴度只有7×101pfu/ml。该动物即使暴露地与两只被感染动物接触也至少可以在7天内不出现临床病征。但是，#81-6动物在侵染后第9天死亡。在其组织病理学报告发现严重的细菌性脑膜炎，并且引起死亡的最可能的原因是与FMD无关的由皮肤脓肿引起的通过血液散步的细菌性脑膜炎。
对上述所有动物的血清进行的鉴定，并且对第14dpc的动物血清对抗体的应答进行鉴定以验证血清学反应。第1和第2实验组的幸存动物均出现显著的FMDV特异性中和抗体的应答现象(图14和15)，并且都产生了抗病毒NS蛋白的抗体(图20，泳道3-5)。第3实验组的两只临床病变动物产生了抗病毒NS蛋白的抗体(图20，泳道6和8)，而另一动物#70-8没有出现临床病征和病毒血征，并且该动物只产生了抗病毒结构蛋白的抗体而没有产生抗病毒NS蛋白的抗体(图20，泳道7)。第4和第5实验组的动物没有出现临床病征和病毒血征，只产生了低水平的抗病毒结构蛋白的抗体而没有产生抗病毒NS蛋白的抗体(图20，泳道11-16)。第4和第5实验组的动物血清在3ABC ELISA试验中呈阴性也可作为上述结果的支持。这些结果证明了上述动物可阻止病毒的复制。第6实验组的动物幸存动物产生了显著的FMDV特异性中和抗体的应答现象(图19)，并且产生了抗病毒NS蛋白的抗体。
实施例10  进行Ad5-pIFN-α和Ad5-A24合并给药的猪对FMDV 的侵染的防御
在实施例14描述的试验中，在侵染前1或3天接受Ad5-pIFN-α的猪能够防御FMD的侵染。由于在侵染前接种Ad5-pIFN-α的猪可以受到彻底的保护，如猪#70-8，或可以较对照组中的猪晚6-7天出现病毒血征或临床病征，因此，可对猪的Ad5-pIFN-α和Ad5-FMDV双接种的潜在性进行研究以作为一种方法，该方法能够在机体对疫苗中所采用的特定血清型FMDV的自适应免疫应答之前快速诱导出非特异的防御型抗病毒效应。
已经证实，包含有FMDV衣壳蛋白(P1)和3C蛋白酶编码区的Ad5-FMDV载体能够对猪进行保护以免受致命的FMDV的侵染(Mayr等，1999.Virology.vol.2263，pp.496-506；Mayr等，2001.Vaccine.vol.19，pp.2152-2162；Mayr等，2002.Vaccine.vol.20，pp.1631-1639)。因此，可以使用一种含有A24 Cruziero病毒株(Ad5-A24)的P1编码区的Ad5-FMDV载体，该病毒株来自巴西。早在接受该载体一次接种后7天，猪即可受到保护以防御同源病毒的直接接种侵染(Moraes等，2002，同上)。
在本试验中，以Ad5-VSVG(第1组)、Ad5-A24(第2组)、Ad5-pIFN-α(第3组)和Ad5-A24加Ad5-pIFN-α(第4组)对试验组动物进行接种(表7)。5天后在动物脚垫处以3.5×105BIC50 FMDVA24对动物进行接种侵染。收集血浆、血清和全血样，并如实施例9中方法对其进行检测。另外化验鼻拭以监测病毒流出情况。此外还在实验的全程对动物进行临床监测。结果在图21-25中显示。
表7试验设计：Ad5-pIFN-α和Ad5-A24的影响
组号  动物编号  接种a  侵染b
#1 Ad5-VSVG  9987-9989  109pfu  3×105BID50
#2 Ad5-A24  9981-9983  5×109pfu  3×105BID50
#3 Ad5-pIFNα7.6.3  9975-9977  109pfu  3×105BID50
#4 Ad5-pIFNα7.6.3+Ad5-A24  9972-9974  6×109pfu  3×105BID50
a以所示剂量Ad5-载体对猪进行肌肉接种
bAd5-载体给药后第5天，以所示剂量FMDV A24在动物左前足足管处对猪进行接种侵染
在接种后多个时段收集血浆以测定侵染前的抗病毒应答。接种了Ad5-pIFN-α(第3组和第4组)的试验组中所有动物早在第4dpc就出现了抗病毒应答，该应答可持续大约4-5天(图23和24)。最大的活性可达400-800单位/ml。接受了不含IFN-α基因的Ad5-载体的第1和第2试验组也在第4dpc产生了抗病毒应答，但应答只持续大约一天(图21和22)。后两组接受了5倍于第3组的病毒侵染。
同样监测侵染后的病毒血征和临床反应。第1组(对照)中所有3只动物在第1dpc都出现了高水平的病毒血征，该组动物鼻拭在第1dpc显示101-102pfu/ml的低病毒滴度并在之后2-3天内维持该水平，并且动物在第2dpc出现损伤现象(图21)。所有上述动物都出现了严重的疾病病征。动物在第4dpc血清转化。
在接受Ad5-A24的动物组中仅有#9983动物出现了一天内的102pfu/ml的低水平病毒血征(图22)。但是，该组中所有的3只动物的鼻拭都可在1-2天内检测到101-102pfu/ml的低水平病毒。可在3-4dpc检测到损伤，损伤较对照组晚出现1-2天，并且较对照组明显减轻。在侵染当天动物可产生低的，但可检测到的，FMDV特异性中和抗体的应答。滴度由第4dpc起显著提高。
接受Ad5-pIFN-α单独给药(第2组)或接受Ad5-pIFN-α与Ad5-A24合并给药(第4组)的试验组动物均受到彻底的保护。这些组中6只动物中的5只在侵染当天产生抗病毒活性。第4组中的动物在第4dpc可产生低的，但可检测到的，FMDV特异性中和抗体的应答，该应答由第4dpc起显著提升并在第21dpc保持高水平。
同时检测血清反应。测试第14dpc血清中的抗病毒结构蛋白的抗体和抗病毒NS蛋白的抗体。在全体出现临床疾病的第1和第2组的动物中都产生了抗病毒结构蛋白的抗体和抗病毒NS蛋白的抗体(图25，泳道3-8)。有趣地是，接受Ad5-pIFN-α与Ad5-A24合并给药的第4组动物比只单独接受Ad5-pIFN-α给药的第3组动物产生了更高水平的FMDV特异性中和抗体(图23和24)，并且第4试验组动物比第3试验组动物产生了更高水平的抗病毒结构蛋白的抗体(图23，泳道3-5[以两种载体接种]，泳道6-8[只以Ad5-pIFN-α接种])。来自于第3和第4组动物的血清在3ABC ELISA实验中均呈阴性，这可作为上述结果的实验支持。
实施例11  Ad5-bIFN-α和Ad5-bIFN-β在牛中的表达
对接种了Ad5-bIFN-α和Ad5-bIFN-β的牛进行剂量-反应实验。以1、2.5或5×109pfu/ml的每种病毒对牛进行肌肉内接种(每种剂量对应一只动物)。将另一动物作为对照用5×109pfu/ml Ad5-VSVG进行接种。对动物进行监测以观察IFN给药所产生有害临床效应，并且每日提取动物体温。在7天内每日提取血样并监测血样中抗病毒活性，并且在第0和第13dpc采集血清样用以检验其中的Ad5特异性中和抗体的应答。
没有动物显示反常行为，并且也没有动物出现体温升高现象。在任何接种了病毒的动物中都监测不到抗病毒反应。所有动物都产生了显著的Ad5特异性中和抗体的应答，这一现象证实了上述动物都接触了重组病毒。
有许多种可能性可用来解释为何在牛中监测不到抗病毒活性，这些可能性包括在实验中所选用的猪和牛个体上的差异(35-40lbs对400-450lbs)、bIFNα在牛中的表达要低于pIFNα在猪中的表达，以及在使用人Ad5病毒时牛的有效转染要低于猪的有效转染。
实施例12  Ad5-pIFN-α和Ad5-pIFN-β在牛和猪中的表达
已证实pIFN-α和pIFN-β在牛细胞培养物中具有生物学活性(Chinsangaram等，2001，同上，表3)。因此，以不同剂量的两种病毒对猪和牛进行接种，并在7dpi中每天对动物进行监测并收集血样(表8)。
以两种剂量的Ad5-pIFN-α接种的猪在1-2天内都出现发热现象。以高剂量接种的动物还出现嗜睡和进食困难。其余所有接种的猪或牛都没有出现行为异常和发热现象。
接受低剂量Ad5-pIFN-α的猪在第1dpc产生抗病毒反应并在之后的3天持续进行(表8)。接受高剂量Ad5-pIFN-α的猪在第1dpc产生更强的抗病毒反应并在之后的4天持续进行。只有以高剂量Ad5-pIFN-β接种的猪产生抗病毒应答。在该动物中诱导出的抗病毒活性明显低于以高剂量Ad5-pIFN-α接种的动物中的抗病毒活性，并且活性只持续两天。Ad5-pIFN-β侵染的猪所诱导的抗病毒活性要低于Ad5-pIFN-α侵染的猪所诱导的抗病毒活性，这可能是在侵染的IBRS2细胞中pIFN-β的表达要低于pIFN-α的表达所致(参见实施例5)。
表8实验设计：在猪和牛中Ad5-pIFN-α和Ad5-pIFN-β的剂量-效应
接种a 剂量 物种 抗病毒活性b
0dpi 1dpi 2dpi 3dpi 4dpi 5dpi  6dpi  7dpi
Ad5-VSVG 5×109pfu 猪 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25  NDc  ND
牛 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25  ND  ND
Ad5-pIFNα7.6.3 1×109pfu 猪 ＜25 400 200 100 25 ＜25  ND  ND
5×109pfu ＜25 800 800 400 100 25  25  ＜25
1×109pfu 牛 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25  ND  ND
5×109pfu ＜25 50 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25  ND  ND
Ad5-pIFNβ1.4.6 1×109pfu 猪 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25  ND  ND
5×109pfu ＜25 200 100 ＜25 25 ＜25  ND  ND
1×109pfu 牛 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25  ND  ND
5×109pfu ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25  ND  ND
a以1ml所示剂量的Ad5-载体在颈部对动物进行肌肉内接种
b使IBRS2细胞中FMDV A12病毒斑的数目降至原50％的最高稀释度
c未做
只有以高剂量Ad5-pIFN-β接种的牛产生抗病毒应答。该应答明显低于以同等剂量的其他载体接种的猪，并且应答之维持一天。上述结果暗示IFN治疗的效力与接种体的剂量和被接种动物的大小是相关的。此外，在猪中人Ad5病毒的结合可能比在牛中的更为有效。
实施例13  Ad5-bIFN-α和Ad5-bIFN-β的表达
前文显示，bIFN-β在牛和猪的细胞培养物中均具有生物学活性，而bIFN-α只在牛的细胞系中具有生物学活性(Chinsangaram等，2001，同上，表4)。以不同剂量的Ad5-bIFN对猪进行接种以鉴定该病毒是否能够诱导猪的抗病毒反应(表9)。对动物进行监测，并且在适宜的细胞系中对血样进行检测以观察抗病毒反应。
以1或5×109pfuAd5-bIFN-α接种的猪在第1dpc产生抗病毒应答。以较高剂量接种的动物具有相对高的活性，但在各病例中都只能在1天内检测到抗病毒活性。以1或5×109pfuAd5-bIFN-β接种的猪在第1dpc产生抗病毒应答。以低剂量接种的动物在之后3天内可检测到活性，而以高剂量接种的动物在之后4天内可检测到活性。
表9实验设计：Ad5-bIFN-α和Ad5-bIFN-β在猪中的剂量-效应
接种a 剂量 抗病毒活性b
0dpi  1dpi  2dpi  3dpi  4dpi  5dpi  6dpi  7dpi
Ad5-Blue 5×109pfu ＜25  ＜25  ＜25  ＜25  ＜25  ＜25  NDc  ND
Ad5-bIFNα9.2.2 1×109pfu ＜25  50  ＜25  ＜25  ＜25  ＜25  ND  ND
5×109pfu ＜25  100  ＜25  ＜25  ＜25  ＜25  ND  ND
Ad5-bIFNβ5.3.1 1×109pfu 25  400  200  50  25  ＜25  ND  ND
1×109pfu ＜25  400  200  50  50  25  ND  ND
a以所示剂量1mlAd5-载体在脖颈处对动物进行肌肉内接种
b使接种Ad5-bIFN-α的动物IBRS2细胞中FMDV A12病毒斑的数目降至原50％的最高稀释度，或使接种Ad5-bIFN-β的动物IBRS2细胞中VSV-NJ病毒斑的数目降至原50％的最高稀释度
c未做
实施例14  接种Ad5-pIFN-α的牛对FMDV侵染的防御
pIFN-α在牛细胞中具有生物学活性(表3)，并且对牛进行Ad5-pIFN-α给药可诱导低水平的抗病毒活性(表8)。为证实Ad5-pIFN-α是否可对牛进行保护以免受在牛中传代的FMDV的侵染，用很高剂量的Ad5-pIFN-α，即每只动物1×1010pfu，对称重大约为200磅的牛进行接种(表10)。第1实验组动物用对照病毒，即Ad5-Blue，进行肌肉内接种；第2和第3组动物用Ad5-pIFN-α进行肌肉内接种。对所有的动物以2×104BID50的牛传代A24在舌上进行皮内侵染。第1和第2组动物在第1dpc侵染，而第3组动物在第2dpc侵染。每隔一天监测动物的疾病临床病征。每日采集体温、血样和鼻拭直至第8dpc，并且在第1、4、7和14dpc采集血清样。
表10实验设计：Ad5-pIFN-α的效应
组号  动物编号  接种a 侵染日期 侵染b
#1 Ad5-Blue  8-10  1010pfu 1dpi  2×104BID50
#2 Ad5-pIFNα7.6.3  11-13  1010pfu 1dpi  2×104BID50
#3 Ad5-pIFNα7.6.3  14-16  1010pfu 2dpi  2×104BID50
a以所示剂量Ad5-载体对牛进行肌肉内接种
b在Ad5-载体给药后1或2天后，以所示剂量的牛传代Cruziero株FMDV A24在舌上对牛进行皮内侵染
第2和第3实验组动物从第1dpi起产生50-200单位/ml的抗病毒反应，并且此反应在之后的1-2天内持续进行。与预期一致，Ad5-Blue接种的动物没有产生可监测到的抗病毒活性。只有第2和第3实验组的动物出现1-2天的发热现象，之后动物恢复正常，然而在别的方面这些动物看上去却是健康的。
所有Ad5-Blue接种的动物在第1dpc均产生了低水平的病毒血征，病毒血征在之后增强并持续1-3天。在第2dpc可在所有动物鼻拭中检测到病毒。侵染后第2天，动物的舌上出现小泡，小泡的部位明显开始于侵染位置，并且动物的足上也出现了小泡。随后动物的齿龈和嘴部也出现了小泡，并且动物的四肢也都出现了小泡(图26)。
第2和第3组动物的病毒血征延迟至第2dpc出现并在之后2天内持续。在第2-3dpc可在所有动物鼻拭中检测到病毒。第2组动物的小泡延迟至第4dpc出现并且其病征不如对照组的严重(图26)。在第3组中，动物#16没有出现小泡，而该组中另两只动物的小泡出现时间也被延迟并且动物的病征没有对照组的严重(图26)。
在用致命的FMDV侵染前1天(第1组)或前2天(第2组)接受Ad5-pIFN-α接种的牛可受到部分的保护以避免临床疾病的发生。一只接种Ad5-pIFN-α的动物没有出现临床病变，而其余的动物的小泡延迟出现并且其病变要轻于Ad5-Blue接种的对照组动物。同样地，虽然所有Ad5-pIFN-α接种的动物都出现了病毒血征，但血征较对照组要延迟一天出现。
                            序列表
<110>U.S.Department of Agriculture，Agricultural Research Service
     Grubman，Marvin J.
     Chingsamaram，Jarasvech
     Koster，Marla
     Moraes，Mauro P.
<120>口蹄疫病毒疫苗
<130>D.N.0128.01
<150>60/286,345
<151>2001-04-26
<160>13
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>580
<212>DNA
<213>猪
<400>1
atggccccaa cctcagcctt tctcacggcc ctggtgctgc tcagctgcaa ggccatctgc  60
tctctgggct gcgacctgcc tcagacccac agcctggctc acaccagggc cctgaggctc  120
ctggcacaaa tgaggagaat ctcccccttc tcctgcctgg accacagaag ggactttggg  180
ttcccccaag aggccttggg gggcaaccag gtccagaagg ctcaagccat ggctctggtg  240
catgagatgc tccagcagac cttccagctc ttcagcacag agggctcggc tgctgcctgg  300
aatgagagcc tcctgcacca gttctgcact ggactggatc agcagctcag ggacctggaa  360
gcctgtgtca tgcaggaggt ggggctggaa gggacgcccc tgctggagga ggactccatc  420
ctggctgtga ggaaatactt ccacagactc accctctatc tgcaagagaa gagctacagc  480
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<210>2
<211>580
<212>DNA
<213>猪
<400>2
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ctggctgtga ggaaatactt ccacagactc accctctatc tgcaagagaa gagctacagc  480
ccctgtgcct gggagatcgt cagggcagaa gtcatgagat ccttctcttc ctccagaaac  540
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<210>3
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<212>DNA
<213>猪
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<212>DNA
<213>牛
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<213>牛
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tgtgcctgga cagtcgtgca agtgcaaata ctcacgaacg tttctttcct gatgagacta  540
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<213>牛
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<213>猪
<400>13
ggatggatcc tcagttccgg aggtaatctg taag                              34

Claims (23)

1.一种构建体，包括一段能够在口蹄疫易感动物体内表达干扰素的DNA序列，其中所述的干扰素通过对所述动物给药而进行表达。
2.权利要求1的构建体，其中所述干扰素是IFN-α或IFN-β。
3.权利要求1的构建体，其中所述口蹄疫易感动物选自猪、牛或羊。
4.权利要求1的构建体，其中所述构建体还包括一段可表达口蹄疫病毒的DNA序列，该口蹄疫病毒可通过对口蹄疫易感动物给药刺激免疫应答。
5.一种载体，包括权利要求1所述构建体。
6.权利要求5的载体，其中所述干扰素是IFN-α或IFN-β。
7.权利要求5的载体，其中所述载体包括病毒基因转移载体。
8.权利要求7的载体，其中所述病毒基因转移载体选自腺病毒、腺伴随病毒、细小病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒和逆转录病毒载体。
9.权利要求5的载体，其中所述口蹄疫易感动物是猪、牛或羊。
10.一种载体，包含权利要求4中的构建体。
11.权利要求10的载体，其中所述干扰素是IFN-α或IFN-β。
12.权利要求10的载体，其中所述载体包括病毒基因转移载体。
13.权利要求12的载体，其中所述病毒基因转移载体选自腺病毒、腺伴随病毒、细小病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒和逆转录病毒。
14.权利要求10的载体，其中所述口蹄疫易感动物是猪、牛或羊。
15.一种疫苗，包括权利要求1中的构建体和一种生理相容性载体，所述构建体的量可以有效地在口蹄疫易感动物中赋予保护效应。
16.权利要求15的疫苗，其中所述干扰素是IFN-α或IFN-β。
17.权利要求15的疫苗，其中所述口蹄疫易感动物是猪、牛或羊。
18.一种疫苗，包括权利要求4中的构建体和一种生理相容性载体，所述构建体的量可以有效地在口蹄疫易感动物中赋予保护效应。
19.权利要求18的疫苗，其中所述干扰素是IFN-α或IFN-β。
20.权利要求18的疫苗，其中所述口蹄疫易感动物是猪、牛或羊。
21.权利要求15的疫苗，其中所述疫苗是一种组合物，该组合物还包括一种有效的口蹄疫病毒疫苗，它的量可以有效地在口蹄疫易感动物中激发保护效应。
22.权利要求21的疫苗，其中所述的口蹄疫易感动物是猪、牛或羊。
23.一种保护易感动物免于患上口蹄疫的方法，包括以有效剂量的权利要求15-22中任一项的疫苗对上述动物进行接种。
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