CN110343164A

CN110343164A - 一种高活性7位点突变的猪干扰素α突变体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110343164A
Application number: CN201910779235.8A
Authority: CN
Inventors: 梁秀丽; 魏法山; 魏战勇; 郑兰兰; 王朋涛; 夏璐; 张福良; 王雪平; 龙福庆; 贾雪娜
Original assignee: Anyang Institute of Technology
Current assignee: Anyang Institute of Technology
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2019-10-18

Abstract

本发明属于干扰素领域，特别是指一种高活性7位点突变的猪干扰素α突变体及其制备方法和应用。本发明对猪干扰素α基因进行改造以获得新的基因序列，通过改造提高其生物活性。运用重叠PCR的方法对天然猪干扰素α基因进行定点突变，将改造后的基因克隆到pET‑32a载体上构建重组质粒，将鉴定正确的重组质粒克隆到Rosetta表达菌中诱导表达和鉴定，重组蛋白以包涵体形式表达，蛋白分子质量约32KDa，经纯化和透析处理后，获得纯度较高的猪干扰素α突变体，用细胞病变抑制法测定抗病毒活性；结果表明试验所得的突变体蛋白的抗病毒活性为8.15×10⁸U/mg，比体外表达的野生型干扰素活性提高了大约200倍。

Description

一种高活性7位点突变的猪干扰素α突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于干扰素领域，涉及突变体干扰素的制备，特别是指一种高活性7位点突变的猪干扰素α突变体及其制备方法和应用。

背景技术

猪干扰素（Porcine Interferon, PoIFN）对多数病毒性猪病具有广泛良好的防御和抑制作用，并且安全可靠，被看作是最有希望治疗病毒的“青霉素”。市场上使用广泛的是猪白细胞干扰素，它是一种天然的猪α干扰素，主要优点有：具有显著的抗病毒和免疫调节功能；在比较短的时间内即可激发动物机体的抗病毒功能；抗病毒谱相对比较广泛，能抵御数种病毒在同一时间的混合感染；绿色环保、低药残量、没有毒副作用，无休药期，不会使动物机体产生不必要的耐药性。然而，诱导剂诱导猪白细胞产生的天然的猪α干扰素存在部分缺点，例如，表达量低，难以纯化，不宜大量应用和生产，极大的限制了应用前景。所以如何生产高效、经济、安全、大规模的猪IFN-α，是我国急需解决的问题。

猪干扰素PoIFN 有三个型别，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅰ型干扰素作用广泛，能够抑制病毒繁殖、抗寄生虫活性、抑制胞内菌、抗肿瘤等等，临床上普遍用于发挥抗病毒活性的是I型PoIFN中的IFN-α。猪IFN-α1基因结构中，有四个保守的半胱氨酸形成对其活性至关重要的两对二硫键，另外还有单个游离不稳定的半胱氨酸Cys，在第86位。由于半胱氨酸Cys、酪氨酸Tyr、苏氨酸Thr都是极性不带电荷氨基酸，精氨酸Arg是极性带正电氨基酸，所以相当于引入了正电荷，以此促进干扰素和相应的受体更快更紧密结合。

许多学者表达猪α干扰素均采取原核表达系统，其遗传背景清楚、成本低及表达量高等优点被广泛应用。陈涛（2002）、谢海艳（2004）、曹瑞兵（2004）、曾翠萍（2008）、及陈雪梅（2009）等将猪α干扰素克隆到原核表达载体上，利用TPTG诱导表达猪α干扰素，蛋白均以包涵体的形式存在且蛋白活性均为106U/mg。陈涛等参照人干扰素α的改造方法把第86位半胱氨酸C突变为酪氨酸Y，获得蛋白活性为5.2×10³ IU/mg；但是该蛋白的活性仍不能解决养殖业的发展所面临的流行猪病的制约。本申请发明人为了获得更高的抗病毒活性对猪α干扰素蛋白的氨基酸序列进行深入研究。

发明内容

为了获得更高的抗病毒活性，对猪α干扰素蛋白的氨基酸序列进行深入研究，本发明提供了一种高活性7位点突变的猪干扰素α突变体及其制备方法和应用，首先把第86位半胱氨酸Cys突变为酪氨酸Tyr，再将156位苏氨酸Thr突变为精氨酸Arg，另外对38、40、43及151位氨基酸的进行突变，这些突变的氨基酸残基朝向干扰素结构的核心，进而改变了局部的疏水性影响干扰素的活性。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种高活性7位点突变的猪干扰素α突变体，所述突变体蛋白与天然猪干扰素α蛋白相比氨基酸突变位点为S₃₈→F₃₈、H₄₀→Q₄₀、F₄₃→L₄₃、N₇₈→D₇₈、C₈₆→Y₈₆、V₁₅₁→A₁₅₁及T₁₅₆→R₁₅₆。

所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码高活性7位点突变的猪干扰素α突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

含有所述的基因的重组表达载体。

所述的高活性7位点突变的猪干扰素α突变体的制备方法，步骤如下：

（1）设计突变体基因的引物组，扩增目的基因；

（2）构建目的基因的重组表达载体；

（3）重组表达载体的诱导表达及突变体蛋白的纯化收集。

所述步骤（1）中引物组包括F-1、R-1、F-86、R-86、R-156、F-38和R-38，其中引物F-1序列如SEQ ID NO.3所示、R-1序列如SEQ ID NO.4所示、F-86序列如SEQ ID NO.5所示、R-86序列如SEQ ID NO.6所示、R-156序列如SEQ ID NO.7所示、F-38序列如SEQ ID NO.8所示、R-38序列如SEQ ID NO.9所示。

所述步骤（1）中目的基因为编码高活性7位点突变的猪干扰素α突变体的基因。

所述步骤（1）中突变体蛋白以包涵体的形式存在；所述包涵体的纯化步骤为：将经过诱导表达的重组表达载体菌液通过超声波裂解后，离心沉淀并用无菌的PBS洗两遍，所得沉淀用4M尿素除去杂蛋白，然后再用8M尿素溶解去杂蛋白的沉淀得蛋白溶液，将蛋白溶液装入透析袋，依次分别用6M、5M、4M、3M、2M、1M的尿素溶液透析，每个阶段6h，最后用无菌的PH=7.2的PBS透析24 h，得包涵体。

所述4M尿素除去杂蛋白的操作为：用4M尿素溶液溶解蛋白后，在4℃、12000 rpm条件下离心10min，重复3-5次。

所述的高活性7位点突变的猪干扰素α突变体作为制备治疗猪流行病、提高产量、增强生物活性药物试剂的应用。

本发明具有以下有益效果：

1. 本发明采用定点突变的方法构建突变体期望获得目的表达蛋白，构建突变体过程中，将第86位半胱氨酸Cys突变为酪氨酸Tyr，使蛋白在复性的过程中减少错误折叠；将第156位极性不带电荷的苏氨酸Thr突变为极性带正电的精氨酸Arg，引入了能够有效促进干扰素和相应的受体结合的正电荷等，成功构建了高活性7位点突变的猪干扰素α突变体并获得高活性的蛋白，

2. 现有研究中，干扰素基因被克隆并在不同的表达系统中表达，对于哺乳动物细胞表达系统，其表达的干扰素能够正确的发挥其生物活性，但细胞转染效率低及筛选稳定表达的细胞系难度大等是目前普遍难题，而且其蛋白产量低、成本高、耗时长等制约其大规模推广应用；本发明采取原核表达策略，成本低；而且表达的蛋白大多是包涵体，需要复杂的复性过程，本发明并没有采取常规的镍柱纯化，而是采用尿素除杂，然后运用合适的尿素处理蛋白，进而透析到PBS溶液，使包涵体蛋白能够充分的复性，获得的蛋白有很好的生物活性。

3. 本发明成功构建了高活性7位点突变的猪干扰素α突变体并获得高活性的蛋白，蛋白活性达8.15×10⁸U/mg。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为猪α干扰素基因PCR扩增结果图，其中M: DL 2000 DNA Marker；1:猪α干扰素；N:阴性对照。

图2为重组质粒pET-32a--IFN-α的双酶切鉴定图；M: DL 5000 DNA Marker；1:pET-32a--IFN-α双酶切产物。

图3为目的基因氨基酸序列比对及部分突变位点三级结构分析图。

图4为重组蛋白的SDS-PAGE鉴定图；M: 蛋白Marker；1: 重组质粒pET-32a--IFN-α诱导; 2:上清; 3: 沉淀; 4: 纯化浓缩后的蛋白。

图5为重组蛋白的WB验证图；M: 蛋白 Marker; 1: pET-32a空载诱导; 2: 重组质粒诱导。

图6为蛋白生物活性检测图。

图7为蛋白抑制VSV复制的活性图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本试验所需主要材料均为正规公司购买，详情如下：

主要试验验材料和来源

实施例1

一、获得目的基因

设计引物：根据GenBank数据库里收录的猪α干扰素成熟核苷酸基因序列（登录号：AB369102.1），设计两对引物扩增猪α干扰素，F-1和R-1扩增完整的猪α干扰素，F-86、R-86、R-156、F-38、R-38包含突变位点。引物由郑州尚亚生物工程有限公司合成：其中引物F-1序列如SEQ ID NO.3所示、R-1序列如SEQ ID NO.4所示、F-86序列如SEQ ID NO.5所示、R-86序列如SEQ ID NO.6所示、R-156序列如SEQ ID NO.7所示、F-38序列如SEQ ID NO.8所示、R-38序列如SEQ ID NO.9所示。

目的基因片段扩增及电泳鉴定：以实验室保存的pMD18T-IFN-α质粒（采用保存目的基因的方法，获得的目的片段克隆到pMD18T上，方便克隆和后续酶切等实验）为模板，通过重叠PCR对猪干扰素α基因进行定点突变，获得突变体基因，体系总体积为25µL（如表1）。采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据电泳条带将验证正确的PCR产物按照说明书进行胶回收操作并放置-20℃备用。

表1目的基因PCR反应体系（25µL)及反应程序

二、重组表达质粒的构建

将验证正确的PCR产物和pET-32a载体分别进行双酶切，16℃连接过夜。将连接产物转入DH5α感受态细胞，并进行如下鉴定。

三、重组质粒的鉴定

①菌液PCR鉴定挑取适量的菌落于含有氨苄抗性的液体LB中，以菌液为模板进行PCR反应，电泳鉴定是否表达出所需目的基因。

②酶切鉴定扩大培养鉴定过的阳性克隆菌落，提取质粒，双酶切鉴定重组质粒是否成功构建。

③测序双酶切鉴定正确的质粒送公司测序，并与参考基因序列进行同源性比对。

四、重组质粒的诱导表达

诱导表达取测序正确的阳性重组质粒2μL转化到50μL的Rosetta表达菌感受态细胞中，挑选验证正确的菌液转移至装有20mL含氨苄抗性的LB(1mL的LB中含50µg Amp⁺)的管中，摇床培养至菌液OD值达0.6-0.8。取出1mL菌液作为阴性对照，剩余菌液加入终浓度为0.5mM的IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）溶液，于摇床上诱导6h。取诱导后1mL菌液，8000g离心5min，倒掉上清；加入细菌裂解液1mL，震荡混匀后8000g离心5min，弃上清；再加入40μL的PBS溶液，震荡混匀；加入10μL的蛋白Loading buffer，沸水煮10min，室温冷却，用于SDS-PAGE凝胶电泳鉴定猪干扰素突变体蛋白的表达情况。

蛋白质免疫印迹Western Blot鉴定将电泳后的蛋白转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，将印有蛋白的膜放置培养皿中，用5%脱脂奶封闭，摇床1h。His单抗进行一抗孵育1h，冰箱放置4-5h后，用HRP标记的羊抗鼠进行二抗孵育1h。用二氨基联苯胺DAB染色，观察显色结果。

五、蛋白的纯化

蛋白可溶性分析：将诱导好的菌液进行富集，超声波裂解、离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE 电泳，检测重组蛋白的表达形式。

包涵体蛋白纯化：菌液通过超声波裂解后，离心沉淀用高压过的PBS洗两遍，沉淀用4M尿素除去杂蛋白，每次10min，4℃离心除杂3-5次；用适量的8M尿素溶解沉淀，将蛋白溶液装入透析袋，分别用6M、5M、4M、3M、2M、1M的尿素溶液透析，每个阶段6h，最后用高压过的PBS（PH=7.2）透析24 h。将透析好的蛋白溶液用蔗糖进行浓缩，分装放入-40℃保存。

破碎前处理：富集诱导好的菌液，4℃ 8000rpm离心15min，PBS重悬菌体（1：10比例），分别加入终浓度为1mg/mL的溶菌酶，1mM的蛋白酶抑制剂，1%（V/V）的Triton X-100，充分混匀后，于4℃冰箱内放置30min。

破碎菌体：在冰浴的环境中，超声破碎菌体。工作2s，休息9s，共15min。每3min摇晃一下菌液以防菌体下沉影响破碎效率，破碎两组共30min。

变性与复性：变性用8M尿素溶液，复性用低于4M尿素溶液和PBS（PH=7.2）。

六、重组蛋白的活性的测定

①VSV的半数细胞感染量(TCID₅₀)测定将Vero细胞接种到96孔板中，待其在96孔培养板上长成单层后，倾去营养液，每孔加入用细胞维持液10倍倍比稀释的VSV病毒0.1mL，每一稀释度加6孔。将细胞培养板置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养72h后，测定VSV在Vero细胞上的TCID₅₀，按Reed—Muench法计算TCID₅₀。

②抗病毒活性的测定将Vero细胞接种到96孔板中，待其在96孔培养板上长成单层后，倾去营养液，每孔加入用细胞维持液2倍系列稀释的干扰素0.1 mL，每一稀释度加6孔。将细胞培养板置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养5h后，倾去干扰素液，用维持液洗1次，然后每孔按100 TCID₅₀/0.1 mL加入VSV。同时，设不加干扰素的对照和不加病毒的对照。继续培养至不加干扰素的对照孔有75％细胞出现病变时，在倒置显微镜下观察并记录结果。将抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位。

③蛋白抑制VSV病毒复制的活性将Vero细胞接种到6孔板中，待其长成单层后，倾去营养液，每孔加入用细胞维持液稀释的干扰素0.1 mL，干扰素浓度设置为100ng/mL和1ng/mL。将细胞培养板置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养24h后，倾去干扰素液，用维持液洗1次，然后每孔按100 TCID₅₀/0.1 mL加入VSV。同时，设病毒的对照。继续培养至不加干扰素的对照孔有75％细胞出现病变时，分别收取上清检测病毒的TCID₅₀。

结果与分析

基因的PCR扩增

以本实验室保存的测序正确的重组质粒pMD18-T-IFN-α为模板，以上述引物扩增猪α干扰素突变体，经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果与预期结果一致，如图1所示，扩增出大小约501bp的目的基因片段。

双酶切鉴定

将重组质粒pET-32a-IFN-α进行双酶切鉴定，如图2所示，切出预期的两条带，说明目的基因和空载体已成功连接。

重组质粒的序列分析

将鉴定正确的重组质粒送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序，用DNAStar软件将测序结果与参考序列(GenBank登录号：AB369102.1)进行比对分析，同源性达95.8%，其编码的蛋白氨基酸序列与预期氨基酸序列完全一致，如图3所示，图3为目的基因氨基酸序列比对（a）及部分突变位点三级结构分析图（b）。

重组蛋白的诱导表达及可溶性分析

将测序正确的重组质粒pET-32a-IFN-α转入Rosetta(DE3)进行诱导表达，诱导后的菌液经过超声破碎离心后进行SDS-PAGE电泳，结果如图4所示，经IPTG诱导后的重组质粒在Rosetta(DE3)中表达，表达方式为包涵体，蛋白分子量与DNAStar软件预测的蛋白大小一致，约33kDa.

Westernblot鉴定重组蛋白反应原性

包涵体的SDS-PAGE胶不经过考马斯亮蓝染色，直接半干转到NC膜上，经过His单抗和羊抗兔IgG(HRP标记)先后孵育，DAB显色，结果如图5显示，IPTG诱导的重组质粒在预期位置上出现一条与目的蛋白大小相同的棕色条带，而IPTG诱导的pET-32a空载体没有条带出现，证明重组蛋白在Rosetta中正确表达，且表达蛋白具有良好的反应原性。

蛋白生物活性检测

采用Vero/VSV系统检测蛋白细胞毒性和生物活性，用两倍倍比稀释的突变体(156S)蛋白处理Vero细胞细胞24h后，采用CPE抑制法检测其细胞毒性和生物活性结果见图6；其中所用VSV病毒的TCID₅₀为10^-14/0.1mL，结果显示野生猪干扰素蛋白（Y）活性为3.22×10⁶U/mg，突变体蛋白（156S）的生物活性为8.15×10⁸U/mg，突变体蛋白活性明显提高约200倍。

蛋白抑制VSV复制的活性

分别用100ng/mL和1ng/mL的蛋白处理Vero细胞24h，然后再用VSV感染细胞，通过滴定感染VSV的Vero的细胞培养液测定蛋白抑制VSV复制的活性。结果表明，用野生型蛋白Y（100ng/mL）预处理后再感染VSV的Vero细胞上清液中VSV的滴度比156S突变体蛋白（100ng/mL）预处理组高4个滴度（相当于活性高10⁴倍），用野生型蛋白Y（1ng/mL）预处理后再感染VSV的Vero细胞上清液中VSV的滴度比156S突变体蛋白（1ng/mL）预处理组高3个滴度（相当于活性高10³倍），显示出156S突变体抑制VSV的复制显著优于野生型干扰素。（如图7）

结论

猪IFN-α具有相对较高的抗病毒活性，即1mg猪IFN-α中含有上亿个活性单位。干扰素作用具有“广谱性”、相对无害性、特殊稳定性等生物学特性，可以防御和抑制已经出现的许多重大病毒性传染病，市场需求量大。20世纪末，国外学者发现猪IFN-α能够很好地抑制传染性胃肠炎病毒TGEV、猪繁殖与呼吸综合征PRRSV、口蹄疫病毒FMDV等病毒活性。天然的猪白细胞IFN-α体内表达量少又难以提取和纯化，体外表达活性比较低以至于不利于发挥作用，因此基因工程是首选的用于生产活性高、易提取、安全有效的猪IFN-α的方法。

到目前为止，许多学者对猪干扰素α进行研究，许多的干扰素基因被克隆并在不同的表达系统中表达。对于哺乳动物细胞表达系统，其表达的干扰素能够正确的发挥其生物活性，但细胞转染效率低及筛选稳定表达的细胞系难度大等是目前普遍难题，而且其蛋白产量低、成本高、耗时长等制约其大规模推广应用；本发明采取原核表达策略，虽然其表达的蛋白缺乏后期的加工和修饰，但其表达量高，成本低；而且其表达的蛋白大多是包涵体，需要复杂的复性过程，但本发明没有采取常规的镍柱纯化，笔者采用尿素除杂，然后运用合适的尿素处理蛋白，进而透析到PBS溶液，使包涵体蛋白能够充分的复性，获得的蛋白有很好的生物活性。

本发明选用的是大肠杆菌表达系统，采用定点突变的方法构建突变体期望获得目的表达蛋白。构建突变体中，将第86位半胱氨酸Cys突变为酪氨酸Tyr，使蛋白在复性的过程中减少错误折叠；将第156位极性不带电荷的苏氨酸Thr突变为极性带正电的精氨酸Arg，引入了能够有效促进干扰素和相应的受体结合的正电荷等。本发明成功构建了高活性7位点突变的猪干扰素α突变体并获得高活性的蛋白，蛋白活性达8.15×10⁸U/mg，为干扰素的进一步研究和规模化运用奠定一定的基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 安阳工学院

<120> 一种高活性7位点突变的猪干扰素α突变体及其制备方法和应用

<160> 9

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(501)

<400> 1

tgtgacctgc ctcagaccca cagcctggct cacaccaggg ccctgaggct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctctccctt ctcctgcctg gaccacagaa gggactttgg gttcccccaa 120

gaggccttgg ggggcaacca ggtccagaag gctcaagcca tggctctggt gcatgagatg 180

ctccagcaga ccttccagct cttcagcaca gagggctcgg ctgctgcctg ggatgagagc 240

ctcctgcacc agttctacac tggactggat cagcagctca gggacctgga agcctgtgtc 300

atgcaggagg cggggctgga agggaccccc ctgctggagg aggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccacagact caccctctat ctgcaagaga agagctacag cccctgtgcc 420

tgggagatcg tcagggcaga agtcatgaga gccttctctt cctccagaaa cctgcaagac 480

agactcagga agaaggagtg a 501

<210> 2

<211> 166

<212> PRT

<213> 猪（Sus）

<220>

<221> MUTAGEN

<222> 38、40、43、78、86、151、156

<400> 2

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His

20 25 30

Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser

65 70 75 80

Leu Leu His Gln Phe Tyr Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu

100 105 110

Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val

130 135 140

Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp

145 150 155 160

Arg Leu Arg Lys Lys Glu

166

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（37）

<400> 3

cggaattctg cgacctgcct cagacccata gcctggc 37

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（27）

<400> 4

cgctcgagtc actccttctt cctgagt 27

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（23）

<400> 5

gctgatccag tccagtgtag aac 23

<210> 6

<211>23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（23）

<400> 6

gttctacact ggactggatc agc 23

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（47）

<400> 7

cgctcgagtc actccttctt cctgagtctg tcttgcaggt ttctgga 47

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（28）

<400> 8

gccccccaag gcctcttggg ggaaccca 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（28）

<400> 9

tgggttcccc caagaggcct tggggggc 28

Claims

1.一种高活性7位点突变的猪干扰素α突变体，其特征在于：所述突变体蛋白与天然猪干扰素α蛋白相比氨基酸突变位点为S₃₈→F₃₈、H₄₀→Q₄₀、F₄₃→L₄₃、N₇₈→D₇₈、C₈₆→Y₈₆、V₁₅₁→A₁₅₁及T₁₅₆→R₁₅₆。

2.根据权利要求1所述的高活性7位点突变的猪干扰素α突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.编码权利要求2所述的猪干扰素α突变体的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.含有权利要求3所述的基因的重组表达载体。

5.权利要求1或2所述的高活性7位点突变的猪干扰素α突变体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）设计突变体基因的引物组，扩增目的基因；

（2）构建目的基因的重组表达载体；

（3）重组表达载体的诱导表达及突变体蛋白的纯化收集。

6.根据权利要求5所述的高活性7位点突变的猪干扰素α突变体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中引物组包括F-1、R-1、F-86、R-86、R-156、F-38和R-38，其中引物F-1序列如SEQ ID NO.3所示、R-1序列如SEQ ID NO.4所示、F-86序列如SEQ ID NO.5所示、R-86序列如SEQ ID NO.6所示、R-156序列如SEQ ID NO.7所示、F-38序列如SEQ ID NO.8所示、R-38序列如SEQ ID NO.9所示。

7.根据权利要求5所述的高活性7位点突变的猪干扰素α突变体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中目的基因为权利要求2中编码高活性7位点突变的猪干扰素α突变体的基因。

8.根据权利要求5所述的高活性7位点突变的猪干扰素α突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中突变体蛋白以包涵体的形式存在；所述包涵体的纯化步骤为：将经过诱导表达的重组表达载体菌液通过超声波裂解后，离心沉淀并用无菌的PBS洗两遍，所得沉淀用4M尿素除去杂蛋白，然后再用8M尿素溶解去杂蛋白的沉淀得蛋白溶液，将蛋白溶液装入透析袋，依次分别用6M、5M、4M、3M、2M、1M的尿素溶液透析，每个阶段6h，最后用无菌的PH=7.2的PBS透析24 h，得包涵体。

9.根据权利要求8所述的高活性7位点突变的猪干扰素α突变体的制备方法，其特征在于，所述4M尿素除去杂蛋白的操作为：用4M尿素溶液溶解蛋白后，在4℃、12000 rpm条件下离心10min，重复3-5次。

10.权利要求1所述的高活性7位点突变的猪干扰素α突变体作为制备治疗猪流行病、提高产量、增强生物活性药物试剂的应用。