CN113621055A

CN113621055A - 一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段、表达该片段的枯草芽孢杆菌、制剂以及应用

Info

Publication number: CN113621055A
Application number: CN202110967690.8A
Authority: CN
Inventors: 王兴业; 韩国英; 李琦; 王晓冉; 乔雪; 刘刚; 郭海岩
Original assignee: Shandong Xianpu Airui Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Xianpu Airui Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-23
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2041-08-23
Also published as: CN113621055B

Abstract

本发明提供一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段，所述片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；本发明还提供表达上述抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌、含上述猪血红蛋白β链C端片段的制剂和应用。本发明所制备的含有猪血红蛋白β链C端片段根据其活性变化确定出最佳多肽片段，并将其串联形成的。本发明所示猪血红蛋白β链C端片段，抗病毒活性为8.16*10⁴U/ml，抗细菌活性：抑菌圈直径为13.47±0.67mm。本发明含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂对猪病毒性腹泻和细菌性腹泻腹泻均具有显著的治疗效果。

Description

一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段、表达该片段的枯草芽孢杆菌、制剂以及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段、表达该片段的枯草芽孢杆菌以及应用。

背景技术

在国民经济发展中，生猪养殖业占据的地位日益重要，既关系到人们的日常生活，对养殖场所在地的经济发展也具有一定的推动作用。近年来，猪场疫病越来越复杂，主要存在以猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病等多病原混合感染现象，发病率高，成活率低，造成严重经济损失。

血红蛋白是在大多数动物血管内专门负责运输氧气的蛋白，属于呼吸蛋白大家族之一，广泛存在于所有的脊椎动物和大多数非脊椎动物的红细胞中，功能研究比较透彻。脊椎动物体内的血红蛋白为四条链构成，两条相同的α链以及两条相同的β链，每一条链均只有一个环状血红素分子组成，每一个血红素的结构相同：均由4个吡咯环构成，在吡咯环中心有一个铁原子。氧气能够结合在铁原子上，并且随血液运输到机体的各个组织发挥作用。血红蛋白的最重要的作用是运输氧气，在缺氧的各个组织中，血红蛋白能够发生构象变化，释放氧气，而在肺部等氧气充足的组织器官中有能够将结合氧气，血红蛋白通过构象变化快速的将氧气从血液运输到全身各个器官。

血红蛋白肽是一种具有很高生物活性的肽，其分子量小，稳定性高，氨基酸平衡，目前血红蛋白肽在抗菌方面的研究进展主要包括对威胁动物机体健康的病原菌进行清除和消灭。我国研究人员分离了人的血红蛋白及其各个片段，并进行了体外抗菌能力检测和研究，并对血红蛋白动物机体抑菌活性研究，结果证实人血红蛋白α、β链及其片段均有抗菌活性。此外，血红蛋白肽具有调节抗病毒天然免疫应答的功能，能够抑制仙台病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒和猪流行性腹泻病毒的复制。

目前猪血红蛋白肽制备方法均是以猪血为原料，采用水解法和微生物发酵法进行制备现有技术制备的猪血红蛋白肽，存在以下不足：猪血红蛋白肽的抗菌抗病毒的性能较差；产量小；猪血红蛋白肽在制备成猪血红蛋白肽制剂时，会降低其活性；猪血红蛋白肽的结构、理化性质及功能性质稳定性差。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段、表达该片段的枯草芽孢杆菌以及应用，实现以下发明目的：筛选得到猪血红蛋白β链C端片段，抗菌和抗细菌活性高；该片段转入枯草芽孢杆菌后，发酵液中猪血红蛋白β链C端片段的浓度达到120mg/L以上，产量高；含猪血红蛋白β链C端片的发酵液制备得到的猪血红蛋白β链C端片段产品，活性保持率高；猪血红蛋白肽的结构、理化性质及功能性质稳定性好。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段，所述片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

一种表达所述抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌的菌种保藏号为CCTCC NO：M 2020837。

所述表达所述抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌的制备方法为将pHT01-P43-HBB重组载体转入枯草芽孢杆菌感受态中得到；

所述pHT01-P43-HBB重组载体的制备方法为：将酶切位点BamH I核酸人工序列（SEQ ID NO.1）、枯草芽孢杆菌P43组成型启动子核酸人工序列（SEQ ID NO.2）、猪血红蛋白β链C端片段核酸人工序列[简称：HBB] （SEQ ID NO.3）、酶切位点Sma I核酸人工序列（SEQID NO.4）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成其整个表达框（SEQ ID NO.5）并插入枯草芽孢杆菌表达载体pHT01上，得到pHT01-P43-HBB重组载体。

所述枯草芽孢杆菌的发酵，包括制备一级种子、发酵；所述制备一级种子，将枯草芽孢杆菌的单个菌落，接种到LB液体培养基中，培养至OD600=0.6～0.8，得到一级种子液。

所述发酵，将一级种子液按照1%的接种量，接种到发酵培养基中，温度维持36.5-37.5℃，pH值维持在7.8-8.2，溶氧维持20%～40%。

所述发酵培养基，胰蛋白胨11-13g/L、酵母浸粉23-25 g/L、蔗糖11-13g/L、KH₂PO₄6-7 mmol/L、K₂HPO₄ 26-28mmol/L。

一种含抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段的制剂，所述制剂的制备方法为将含猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌发酵液，加入19-21%的麦芽糊精，0.7-0.8%的聚乙二醇20000，进行喷雾干燥得到含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂。

所述发酵液中，猪血红蛋白β链C端片段的含量为120-125 mg/L；所述枯草芽孢杆菌，为表达抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段的重组枯草芽孢杆菌。

所述喷雾干燥，进口温度为130-140℃，出口温度为70-80℃，喷液速度为245-255L/h。

一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段在制备治疗猪病毒性腹泻和猪细菌性腹泻药物中的应用。

本申请以猪血红蛋白β链为模板，从N-端到C-端逐步分解成大小为15氨基酸的片段，两个片段有5个氨基酸重叠，共设计15个多肽片段，并采用自动化多肽合成设备高效快速地合成，再根据其活性变化确定出最佳多肽片段，并将其串联，形成猪血红蛋白β链C端片段。将其与组成型启动子P43串联后与表达载体连接，构建了组成型重组表达质粒，再导入枯草芽孢杆菌宿主细胞中即得重组枯草芽孢杆菌，经过菌株活化、种子培养、发酵培养，使猪血红蛋白β链C端片段编码的浓度达到120mg/L以上。再往发酵液中加入赋形剂海藻糖、保护剂大豆卵磷脂后，进行喷雾干燥得到含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂。该喷干粉剂对猪病毒性腹泻和细菌性腹泻均具有显著的治疗效果。

本发明表达猪血红蛋白β链C端片段的重组枯草芽孢杆菌WB800n/HBB(110-147)，分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2020年12月4日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020837。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

（1）本发明所制备的含有猪血红蛋白β链C端片段根据其活性变化确定出最佳多肽片段，并将其串联形成的。一方面根据其活性变化确定必需氨基酸残基或活性中心。另一方面也相应的增加多肽的长度，在一定程度上提高了稳定性。

本发明所示猪血红蛋白β链C端片段，抗病毒活性为8.16*10⁴U/ml，抗细菌活性：抑菌圈直径为13.47±0.67mm。

（2）本发明表达猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌重组菌，经过菌株活化、种子培养、发酵培养32h后，发酵液中猪血红蛋白β链C端片段的浓度为

120-125 mg/L，发酵液上清的抗病毒活性为1.02-1.05*10¹¹U/ml；抑菌活性：抑菌圈为8.3-8.35 mm。

（3）本发明所述含猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌发酵液，加入20%麦芽糊精作为赋形剂，0.75%的聚乙二醇20000作为保护剂，经过喷雾干燥制备的制剂，抗病毒活性保持率达99.5%以上，抑菌活性保持率达98%以上。

（4）本发明所制备的含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂，在细胞水平上对流行性腹泻病毒（PEDV）增殖的抑制效果，并且还可显著抑制F18大肠杆菌的生长。人工感染试验表明含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂对猪病毒性腹泻和细菌性腹泻腹泻均具有显著的治疗效果，对猪病毒性腹泻的治愈率达80%，对猪细菌性腹泻的治愈率为100%。因此，通过含有猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌喷干粉剂具有抗菌和抗病毒双重活性，具有重要的应用价值。

（5）本发明首次尝试利用枯草芽孢杆菌的组成型分泌表达系统表达可溶性猪血红蛋白β链C端片段，实现了猪血红蛋白β链C端片段在枯草芽孢杆菌中自诱导高效表达，又由于枯草芽孢杆菌具有易于分离培养、较清晰的遗传背景、良好的分泌性及无致病性等优点，可以直接被动物食用。因此，本发明无需诱导、提纯等复杂的步骤直接即可得到大量具有活性猪血红蛋白β链C端片段。与现有技术的相比，该制备方法简单、便于使用，且具有很好地应用前景。

附图说明

图1为本发明14个多肽片段的设计意图；

图2为本发明多肽片段的抗病毒示意图；

图3为本发明多肽片段的多肽片段部分抑菌圈的效果图；

图4为pHT01-P43-HBB重组载体构建流程图。

图5为表达猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌重组阳性菌株电泳图。

具体实施方式

实施例1具有抗菌和抗病毒双重活性猪血红蛋白β链C端片段的确定

以猪血红蛋白β链为模板，从N-端到C-端逐步分解成大小为15-17个氨基酸的片段，两个相连的片段有5个氨基酸重叠，共设计14个多肽片段，设计意图见图1。委托常州市祥泰生物科技有限公司采用自动化多肽合成设备高效快速地合成所设计的14个多肽片段，记为片段1～片段14。见表1。

表1 14个多肽片段的序列

1.1根据用细胞病变抑制法测定多肽片段的抗病毒活性

采用PEDV/Vero系统检测多肽片段的生物活性，按常规传代细胞培养方法消化的Vero细胞悬液，用DMEM培养基（10%胎牛血清）稀释至每毫升含30万个细胞，加入96孔细胞培养板内，每孔0.1ml，置37℃、含5% CO₂培养箱内，静置培养24小时。将长成良好单层的细胞孔，弃去培养液，用DMEM培养基（10%胎牛血清）将每个含有数量为10¹⁰个多肽片段样品溶于1mL无菌水中，再进行10倍系列稀释，稀释10¹～10⁸倍，得到8个不同稀释度的多肽，每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml，置37℃、含5％CO₂培养箱内，培养18～24小时后，再接种病毒。每次试验均设不同多肽片段对照组、细胞对照组及病毒对照组。将PEDV用DMEM液(含胰蛋白酶20µg/ml)稀释至1000TCID50/ml，加入培养板各孔内，每孔0.1ml。置37℃、含5% CO₂培养箱内培养30h。

结果判定：(1)弃掉96孔板中营养液，使用PBS洗涤3次；(2)将4%多聚甲固定液滴加入每孔中，4℃下固定30min；(3)弃去固定液，使用PBS洗涤3次。每孔加入0.25% Tritonx-100 100µl静置15min，对细胞进行通透，协助染色；(4)每孔加入100 µL配制的5% BSA液封闭1h；(5)使用PBS洗涤3次，每次5min；(6)加入100 µL小鼠抗PEDV的单克隆抗体（稀释比1:1000），于37℃孵育1h；(7)使用PBS洗涤3次，每次静置2min。每孔加入100 µL稀释好的AlexaFluoro8488标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗（1:1000），于37℃解育1h；(8)使用PBS洗涤3次，每次5min；(9)使用倒置荧光显微镜进行观察。

结果计算：按Reed-Muench法计算结果，多肽片段单位以log₁₀表示。能保护半数细胞免受攻击病毒破坏的多肽片段最高稀释度的倒数，即为多肽片段效价。见表2和图2。

结果表明片段13的抗病毒效价最高，片段12和片段14次之。

表2 14个多肽片段的抗病毒活性

1.2抑菌圈试验测定多肽片段的抑菌活性

在超净工作台内，取100mL无菌的药敏试验检测培养基，加入100uL检测菌菌液，所述检测菌为大肠杆菌，摇匀，得到含菌检测培养基；吸取混合均匀的含菌检测培养基10mL，在90mm培养皿底内均匀摊布，放置在超净工作台上使其凝固。

待含菌检测培养基凝固后用灭菌的打孔器打孔，孔径为2.7mm，在培养皿底部上均匀的打七个上样孔，将上样孔内的含菌检测培养基挑出，用记号笔在培养皿底部为七个上样孔做好标记，包括一个阴性对照上样孔、一个阳性抗生素对照上样孔和多肽片段待测样品上样孔。阴性对照上样孔内放置无菌水，阳性抗生素对照上样孔内放置阳性抗生素，待测样品上样孔内分别放置不同的待测多肽样品，用微量移液器分别吸取5uL 1 mg/mL待测样品加入各自对应的上样孔中，并将培养皿置于37℃培养箱中培养16~18 h。用游标卡尺测定抑菌圈直径，计算抑菌效价。由阳性抗生素抑菌圈为标准计算出样品的效价。

结果表明片段13的抑菌活性最高，片段14和片段12次之。表3和图3。

表3 14个多肽片段的抑菌活性

1.3猪血红蛋白β链C端片段的抗病毒活性和抗细菌活性

将片段12、片段13和片段14进行串联，形成猪血红蛋白β链C端片段IVVVLARRLGHDFNPNVQAAFQKVVAGVANALAHKYH，并托常州市祥泰生物科技有限公司采用自动化多肽合成设备高效快速地合成猪血红蛋白β链C端片段，按照1.1和1.2的方法进行验证猪血红蛋白β链C端片段的抗病毒活性（8.16*10⁴）U/ml和抗细菌活性（13.47±0.67）mm。结果表明：猪血红蛋白β链C端片段的抗病毒和抑菌活性均高于片段12、片段13和片段14。

实施例2 猪血红蛋白β链C端片段在枯草芽孢杆菌中的高效表达

2.1 pHT01-P43-HBB表达载体的构建

分别按酶切位点BamH I核酸人工序列（序列1）、枯草芽孢杆菌P43组成型启动子核酸人工序列（序列2）、猪血红蛋白β链C端片段核酸人工序列[简称：HBB] （序列3）、酶切位点Sma I核酸人工序列（序列4）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成其整个表达框（序列5）并插入枯草芽孢杆菌表达载体pHT01上，得到pHT01-P43-HBB重组载体，见图4。

上述序列1、2、3、4是依次串联。

2.2 枯草芽孢杆菌感受态的制备

挑取新鲜的LB固体培养基(添加新霉素抗性)表面的B.subtilis WB800n单菌落，接种于5 mL的LB培养基中，37℃、200 r/min培养过夜；取500μL上述菌液转接到50 mL GM增殖培养基中，37 ℃、200r /min培养至OD600=1.0；将菌液转移至已灭过菌的100 mL离心管，冰水浴10 min后，5000 r /min、4 ℃离心10 min，收集菌体；用预冷的电转缓冲液ETM洗涤3～4次，将洗涤后的菌体重悬于500 μL的ETM中，即为枯草芽孢杆菌电转化感受态细胞。

LB培养基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，pH 7.0；

LB固体培养基：在LB培养基中加入质量浓度20 g/L琼脂粉；

ETM电转缓冲液：山梨醇0.5 mol/L、甘露醇0.5 mol/L、海藻糖0.5 mol/L、甘油体积分数10%。

2.3 构建表达猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌重组菌

取出3管新制60μL的枯草芽孢杆菌B.subtilis W800n感受态细胞，分别加入6μL的质粒pHT01-P43-HBB混合均匀，预冷5 min后将混合的菌液加入2 mm的冰中预冷电转杯中，用Eppendorf电转仪在2000 V、5 ms条件下电击1次。电转完毕后，迅速加入1 mL RM复苏培养基，37℃、200 r/min复苏4 h后，离心重悬后涂布在含氯霉素(40 μg/mL)固体LB培养基，放在37 ℃恒温培养箱中倒置培养1～2 d，筛选抗氯霉素的菌株。

挑取上述抗氯霉素菌株的单菌落作为模板，分别通过上下游引物来进行PCR扩增，扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳进行验证，见图5，最终获得表达猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌重组菌株。

RM复苏培养基：NaCl 10g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、山梨醇0.5 mol/L、甘露醇0.38 mol/L。

PCR反应体系：dNTP Mixture（2.5mM）4 ul、10×LA PCR Buffer II（Mg2+Plus）2.5ul、F primer （CGCGGATCCGCGTGTCGACGT ）10μmol/L、R primer（TTAGTGGTACTTGTGGGCCAG）10μmol/L、变性液 1ul、TaKaRa LA Taq （5U/ul）0.25ul、dH₂Oup to 25 ul。

PCR反应条件：94℃ 1 min 1 cycle、98℃ 10 sec、55℃30 sec 72℃ 1.5 min30cycles。取10 µL 进行1%琼脂糖凝胶电泳。出现555bp的条带为阳性转化子。

实施案例3 生产猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌重组菌的高密度发酵

生产猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌重组菌株在含有30µg/mL氯霉素抗性的LB平板上划线培养后，选取单个菌落，接种至含250mL LB液体培养基的1L三角瓶中，于摇床中在37℃、200rpm 的条件下培养，培养至OD600=0.6～0.8；镜检无染菌后，作为一级种子备用。将4瓶一级种子液共1L接入已灭菌的100L发酵培养基，发酵过程中，温度维持37 ℃，pH值维持在8.0，(pH值通过滴加10%的氨水来维持)，并且通过对通风量与搅拌速率的控制使溶氧(dissolved oxygen，DO)维持在20%～40%。发酵时间为32h。

发酵培养基：胰蛋白胨12 g/L、酵母浸粉24 g/L、蔗糖12g/L、KH₂PO₄ 6.5 mmol/L、K₂HPO₄ 27mmol/L。

表4连续3批本发明发酵液中猪血红蛋白β链C端片段的浓度SDS-PAGE检测结果(mg/L)

表5连续3批本发明发酵液上清抗病毒和抑菌检测结果(mg/L)

实施案例4含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂的制备

将上述发酵液利用压缩空气将发酵罐压力调节至0.05MPa左右，储料罐压力为零，利用发酵罐与储料罐之间的压力差通过不锈钢物料管道将发酵液压到储料罐中，加入20%麦芽糊精作为赋形剂，不同比例聚乙二醇20000（0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.5%）作为保护剂进行喷雾干燥，采用喷雾干燥机进行喷雾干燥（无锡市能达干燥设备有限公司生产），喷雾干燥条件如下：进口温度为135℃，出口温度为75℃，喷液速度为250L /h。结果表明选用0.75%的聚乙二醇20000作为保护剂，可有效保证猪血红蛋白β链C端片段的抑菌和抗菌效价，抗病毒活性的保持率为99.52±0.23%，抑菌活性保持率为98.04±1.14%；见表6。

表6添加不同比例聚乙二醇20000对猪血红蛋白β链C端片段的抑菌和抗菌效价的影响（%）

实施例5含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂对猪病毒性腹泻治疗效果

将30头刚出生未吃初乳的仔猪随机分成3组，每组10头，第1组为试验组，即含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗组；第2组为对照组，即未重组枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗组；第3组为空白对照组，即未进行治疗组。各组仔猪注射器灌服2 mL PED病毒液(病毒浓度为1×10⁶ TCID50 /mL)，一天2次。当仔猪开始出现腹泻症状时，试验组仔猪灌服含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂，每次用量0.5g，用生理盐水稀释成4mL，每天2次；对照组仔猪灌服同等剂量重组未重组枯草芽孢杆菌喷干粉剂，每天2次；空白对照组仔猪灌服同等剂量生理盐水4mL。持续治疗7天，观察治疗效果。统计发病及死亡情况。

结果表明：试验组在猪灌服含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂后80%猪腹泻症状逐渐减轻，且7 d后恢复正常；灌服未重组枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗对照组和未采取治疗措施的空白对照组则全部死亡，痊愈数为0%，死亡率为100 %，结果见表7。

表7含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂对猪病毒性腹泻治疗效果

实施案例6含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂对猪细菌性腹泻治疗效果

取30头15kg的健康断奶仔猪进行人工感染F18大肠杆菌，口服剂量为6×10⁹CFU，出现腹泻时，随机分为3组，每组10头第1组为试验组，即含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗组，每次用量0.5g，用生理盐水稀释成4mL，每天2次；第2组为对照组，即未重组枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗组，每次用量0.5g，用生理盐水稀释成4mL，每天2次；第3组为空白对照组，即未进行治疗组，为同等剂量生理盐水4mL，每天2次。持续治疗7天，观察治疗效果。统计发病及死亡情况。

结果表明：试验组在猪灌服含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂后腹泻症状逐渐减轻，3～4d后全部恢复正常；灌服未重组枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗对照组和未采取治疗措施的空白对照组腹泻均未好转，痊愈数也为0%，但死亡率为30%左右，结果见表8。

表8含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂对猪细菌性腹泻治疗效果

。

序列表

<110> 山东仙普爱瑞科技股份有限公司

<120> 一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段、表达该片段的枯草芽孢杆菌、制剂以及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

cgcggatccg cg 12

<210> 2

<211> 426

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 2

tgtcgacgtg catgcaggcc ggggcatatg ggaaacagcg cggacggagc ggaatttcca 60

atttcatgcc gcagccgcct gcgctgttct catttgcggc ttccttgtag agctcagcat 120

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tttacttatt tttttgccaa agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt 360

ttagaaatgg gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc 420

attata 426

<210> 3

<211> 117

<212> DNA

<213> 欧亚野猪(Sus scrofa)

<400> 3

atgatagtgg ttgttctggc tcgccgcctt ggccatgact tcaacccgaa tgtgcaggct 60

gcttttcaga aggtggtggc tggtgttgct aatgccctgg cccacaagta ccactaa 117

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 4

tcccccgggg ga 12

<210> 5

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggatccg cgtgtcgacg tgcatgcagg ccggggcata tgggaaacag cgcggacgga 60

gcggaatttc caatttcatg ccgcagccgc ctgcgctgtt ctcatttgcg gcttccttgt 120

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gatagcggta ccattataat gatagtggtt gttctggctc gccgccttgg ccatgacttc 480

aacccgaatg tgcaggctgc ttttcagaag gtggtggctg gtgttgctaa tgccctggcc 540

cacaagtacc actaatcccc cggggga 567

<210> 6

<211> 37

<212> PRT

<213> 欧亚野猪(Sus scrofa)

<400> 6

Ile Val Val Val Leu Ala Arg Arg Leu Gly His Asp Phe Asn Pro Asn

1 5 10 15

Val Gln Ala Ala Phe Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu

20 25 30

Ala His Lys Tyr His

35

Claims

1.一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段，其特征在于：所述片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段，其特征在于：所述片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

3.一种表达权利要求1所述的抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌的菌种保藏号为CCTCC NO：M 2020837。

4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌的发酵，包括制备一级种子、发酵；所述制备一级种子，将枯草芽孢杆菌的单个菌落，接种到LB液体培养基中，培养至OD600=0.6～0.8，得到一级种子液。

5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述发酵，将一级种子液按照1%的接种量，接种到发酵培养基中，温度维持36.5-37.5℃，pH值维持在7.8-8.2，溶氧维持20%～40%。

6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述发酵培养基，胰蛋白胨11-13g/L、酵母浸粉23-25 g/L、蔗糖11-13g/L、KH₂PO₄ 6-7 mmol/L、K₂HPO₄ 26-28mmol/L。

7.一种含权利要求1所述的抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段的制剂，其特征在于：

所述制剂的制备方法为将含猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌发酵液，加入19-21%的麦芽糊精，0.7-0.8%的聚乙二醇20000，进行喷雾干燥得到含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于：所述发酵液中，猪血红蛋白β链C端片段的含量为120-125 mg/L；所述枯草芽孢杆菌，为表达抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段的重组枯草芽孢杆菌。

9.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于：所述喷雾干燥，进口温度为130-140℃，出口温度为70-80℃，喷液速度为245-255L /h。

10.一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段在制备治疗猪病毒性腹泻和猪细菌性腹泻药物中的应用。