CN112159479A - 一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA及其应用 - Google Patents

一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG‑mEA及其应用，所述pMG‑mEA其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。pMG‑mEA融合蛋白包含鸡毒支原体CrmA、Gapa、Mgc2、PvpA等多个粘附素B细胞和T细胞抗原表位，能诱导体液免疫和细胞免疫，同时融合有鸡三肽囊素，具有免疫增强作用；此外原核表达pMG‑mEA融合蛋白的制备成本低，构建好表达质粒后可以大批量工业化表达生产，易于纯化。该鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG‑mEA的构建表达为临床预防鸡慢性呼吸道疾病（CRD）的发生奠定基础。

Description

一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA及其应用
技术领域
本发明属于动物医学领域，具体涉及一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA及其应用。
背景技术
鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）又称为鸡败血支原体、鸡毒霉形体，是引发鸡的慢性呼吸道疾病（Chronic respiratory disease，CRD）的主要病原之一，虽然致死率不高，但因其病程长，致病性强，严重影响家禽产蛋率、孵化率和饲养转化率，是导致养禽场经济损失最大的支原体病。
目前对于鸡毒支原体病的治疗主要是用抗生素和注射疫苗两种方法。有效的抗生素有大环内酯类和喹诺酮类等，泰乐菌素、泰妙菌素、氟苯尼考等。随着人们长期滥用药物，使得支原体对大环内脂类及其他抗生素药物的耐药性不断增加。
当前市面上所常用的MG疫苗主要分为灭活苗和弱毒苗两种，灭活苗虽然能够阻断MG的经蛋传播，可以增强体液免疫，暂时减轻感染时的症状，但是却不能彻底地清除鸡体内的野毒和阻止野毒入侵；弱毒苗可使机体产生黏膜免疫，应用较为广泛的主要有F株、6/85株和Ts-11株，但是存在毒株反强的风险。随着分子生物学的进一步发展，基因免疫也会成为克服常规疫苗的理想方法，但是基于目前社会的研究结果，目的基因在动物体内所表达出的蛋白质分子有着量小，且免疫原性弱的特点，对诱导动物产生保护力效果不足。
多表位疫苗是将多个抗原表位的核酸序列串联起来，利用重组DNA技术将其重组到载体中制备而成。多表位基因工程疫苗抗原可用于制备对单一病原体的多种血清型具有多重保护能力的多价疫苗，也可作为预防多种疾病的广谱疫苗。多表位疫苗是指同时携带多个目的抗原以及辅助性的表位的疫苗。它是基于目的抗原表位的氨基酸序列而制备的，是近年发展起来的一种新型的基因工程疫苗设计思路，代表了新一代疫苗的研究方向和发展趋势。多表位疫苗有很多传统基因工程疫苗所不具备的优点：多表位疫苗能被得到高效的抗原递呈；可以有效应对病原微生物抗原的突变和免疫反应中存在的许多不利因素；在细胞免疫方面具有独特的优势等。
随着人们长期滥用药物，使得支原体对大环内脂类及其他抗生素药物的耐药性不断增加。而市面上常见的疫苗又存在着诸多缺陷，在MG疫苗的研究方面，MG的基因工程疫苗的研究在国内外并不常见，随着对多表位疫苗的研究深入，为鸡毒支原体基因工程疫苗的研究提供了便利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：GSMKHGKHGKHGKHGKHGKHGGGGGAPTKPTAPKPAAPKGGGGVSGTNADDGMGGGGAPTKPTAPKPAAPKGGGGVSGTNADDGMGGGGFRKADHPSWFNNDSNFGGGGVKLNNQSSSLGGGGVQQEQKTKDQVFGGGGLSIDGTNPGAGGGGVQQEQKTKDQVFGGGGFAISNKKVDIGGVDGGGGMPPRPNFPNQMPNMGGGGQFGPNPQQRIGGGGGGMPPRPNFPNQMPNMGGGGQFGPNPQQRIGGGGPQNSQPRPMPNKGGGGVGGSNQPRPMGGGGMPNRPQNPQGPRPMGGGGAGGSNQPRPMKL。
在通过ABDpred、SYFPEITHI网站等相关网站查询鸡毒支原体膜粘附蛋白的序列，获得抗原表位序列，将筛选获得的抗原表位串联，以三肽囊素作为表达蛋白载体构建鸡毒支原体膜粘附素多表位蛋白，用Protean软件分析抗原位点情况，并命名为pMG-mEA。再通过遗传密码子将多抗原表位融合蛋白的氨基酸序列推导为核苷酸序列，尽可能选择大肠杆菌优势密码子，抗原表位融合蛋白核苷酸序列送生物公司进行基因合成，并通过T4 DNA连接酶将目的基因和质粒进行连接。将pMG-mEA重组原核表达质粒转化DH5α感受态细胞，用质粒提取盒提取质粒。取重组质粒作模板，用BamH I和Hind III对重组质粒进行双酶切和核酸电泳。将酶切鉴定鉴定为阳性的重组质粒送检测序。把构建正确的重组原核表达质粒命名为pET-MG-mEA。将测pET-MG-mEA重组质粒转化BL21，培养过夜后挑取单个分散的菌落在LB液体培养基继续培养，IPTG诱导pMG-mEA蛋白的表达。
将pMG-mEA的大量诱导表达与纯化后，免疫SPF鸡雏鸡，两周后用MG-R株攻菌，空白对照组试验鸡发病，而免疫组获得保护，表明pMG-mEA免疫SPF鸡雏鸡可获得良好的免疫保护效果。
本发明的优点在于：
使用ABCpred、SYFPEITHI等网站，结合DNAStar软件Protean程序，对MG-R(high)、MG-F、MG-Ts11株的CrmA、Gapa、Mgc2、PvpA等粘附素B细胞和T细胞抗原表位进行保守预测和筛选，将筛选获得的抗原表位串联，以三肽囊素作为蛋白载体，构建和原核表达鸡毒支原体粘附素多抗原表位融合蛋白（pMG-mEA）。以肌肉注射、点眼滴鼻、胚内注射三种方式对SPF鸡进行pMG-mEA融合蛋白免疫，试验结果表明，本实验制备的鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白对鸡能产生相应抗体，并提供不同程度的保护。弱毒苗在临床应用中可能会存在毒株返强以及疫苗株与野生型毒株基因重组等安全性问题；而灭活苗更倾向于诱导体液免疫，其诱导细胞免疫的能力相对较弱。相较于弱毒苗和灭活苗存在的不足，多表位疫苗兼具灭活疫苗的安全性和在弱毒疫苗可诱导体液免疫和细胞免疫等方面的独特优势。pMG-mEA融合蛋白包含鸡毒支原体CrmA、Gapa、Mgc2、PvpA等多个粘附素B细胞和T细胞抗原表位，能诱导体液免疫和细胞免疫，同时融合有鸡三肽囊素，具有免疫增强作用；此外原核表达pMG-mEA融合蛋白的制备成本低，构建好表达质粒后可以大批量工业化表达生产，易于纯化。该鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA）的构建表达为临床预防鸡慢性呼吸道疾病（CRD）的发生奠定基础。
附图说明
图1 多抗原表位融合蛋白pMG-mEA氨基酸序列的Protean软件分析结果。
图2 T7通用引物PCR菌检结果。M. 标准DNA分子质量。1，空白对照；2，PCR扩增结果。
图3 重组质粒pET-MG-mEA的酶切鉴定。M，标准DNA分子质量；1-2，重组质粒pET-MG-mEA由BamH I和Hind III双酶切结果。
图4 pMG-mEA融合蛋白的诱导表达。（A）M，标准蛋白分子质量；1，pET-32a(+)的诱导产物；2，重组质粒未经IPTG诱导的产物；3，重组质粒经IPTG诱导的产物。（B）M，标准蛋白分子质量；4，重组质粒IPTG诱导经超声后上清溶液；5，重组质粒IPTG诱导经超声后包涵体沉淀。
图5 IPTG诱导时间的优化。M，蛋白质分子质量标准；1-6，分别经IPTG诱导3-8 h后提取的蛋白。
图6 IPTG诱导浓度的优化。M，标准蛋白质分子质量；1-7，分别经终浓度为0.1-2.0mmol/L IPTG诱导4h后提取的蛋白。
图7 pMG-mEA可溶性蛋白的纯化结果。M，标准蛋白分子质量；1，上样流出液；2，平衡液洗涤后流出液；3，20 mM咪唑洗脱流出液；4，50 mM咪唑洗脱流出液；5，80 mM咪唑洗脱流出液；6，100 mM咪唑洗脱流出液；7，200 mM咪唑洗脱流出液。
图8鸡气囊的病理变化对比。A为正常鸡气囊，B为使用MG攻击的Aa组，个别鸡只出现眼部肿胀，C为使用MG攻击的Aa组、Ab组、Ac组，鸡气囊均出现浑浊增厚，D为使用MG攻击的Aa组、Ab组、Ac组，鸡气囊出现泡沫。
图9间接ELISA检测感染MG前后各组鸡血清粘附素抗体水平的变化。
图10 鸡气管的组织学病变对比（H.E染色 400×）。其中a气管正常上皮组织，b气管上皮组织脱落，c气管上皮组织增生。
具体实施方式
实施例1
首先通过相关文献资料找到符合要求的鸡毒支原体的粘附膜蛋白。在通过构建鸡毒支原体粘附素多抗原表位融合蛋白原核表达质粒pET-MG-mEA，经诱导表达和通过Ni-NTA纯化获得pMG-mEA可溶性蛋白。
1 鸡毒支原体粘附素多抗原表位融合蛋白(pMG-mEA)构建和表达
1.1 1.1 pET-MG-mEA原核表达质粒构建
1.1.1 鸡毒支原体粘附素抗原表位的预测与筛选
使用ABCpred网站和SYFPEITHI网站进行抗原表位预测，结合DNAStar软件Protean程序对GenBank数据库中MG-R(high)、MG-F、MG-Ts11株的粘附膜蛋白进行抗原表位的保守预测筛选，结果如表1。
表1 鸡毒支原体粘附素B细胞和T细胞表位预测与筛选
Figure 847622DEST_PATH_IMAGE001
1.1.2 pMG-mEA核苷酸序列的设计与合成
分别从筛选出的抗原表位通过4个甘氨酸（GGGG）将各抗原表位进行串联排列，并以具有增强免疫功能和恢复机体免疫力作用的三肽囊素作为载体蛋白，得到预期的多抗原表位融合蛋白氨基酸序列，通过Protean软件分析多抗原表位融合蛋白的抗原位点情况，并命名为pMG-mEA。获得其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过遗传密码子将多抗原表位融合蛋白的氨基酸序列推导为核苷酸序列，选择大肠杆菌优势密码子，同时在序列两端分别加上BamH I和Hind III酶切位点，总计942个碱基。将设计好的多抗原表位融合蛋白核苷酸序列送生物公司进行基因合成。多抗原表位融合蛋白氨基酸序列的Protean软件分析结果如图1。
1.1.3 pET-MG-mEA原核表达质粒的构建和鉴定
通过T4 DNA连接酶将目的基因和pET-32a(+)质粒进行连接，转化DH5α，采用T7通用引物进行PCR反应，PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳，结果如图2，在第一泳道的空白对照组无明显条带，在第2泳道可见一条约1 890 bp明显的条带。取重组质粒作模板，用BamH I和HindIII对重组质粒进行双酶切和核酸电泳，结果如图3，在第1、2泳道的双酶切分析可见一条大小约5 900 bp的pET-32a(+)线性条带和一条942 bp左右的目的基因条带，结果与预期相符。将酶切鉴定鉴定为阳性的重组质粒送检测序，测序结果如SEQ ID NO.2所示。测序结果与所设计的目的序列一致，未出现碱基突变和移码等。通过DNAStar软件预测，pMG-mEA大小约为30 ku，加上pET-32a(+)载体融合标签蛋白大小约为18 ku，因此pMG-mEA融合蛋白大小应约为48 ku。把构建正确的重组原核表达质粒命名为pET-MG-mEA。
pET-MG-mEA：GGATCCATGAAACATGGTAAACATGGTAAACATGGTAAACATGGTAAACATGGTAAACATGGTGGTGGTGGTGGTGCACCGACCAAACCGACCGCACCGAAACCGGCAGCACCGAAAGGTGGTGGTGGTGTTAGCGGTACCAATGCAGATGATGGTATGGGTGGTGGTGGTGCACCGACCAAACCGACCGCACCGAAACCGGCAGCACCGAAAGGTGGTGGTGGTGTTAGCGGTACCAATGCAGATGATGGTATGGGTGGTGGTGGTTTTCGTAAAGCAGATCATCCGAGCTGGTTTAATAATGATAGCAATTTTGGTGGTGGTGGTGTTAAACTGAATAATCAGAGCAGCAGCCTGGGTGGTGGTGGTGTTCAGCAGGAACAGAAAACCAAAGATCAGGTTTTTGGTGGTGGTGGTCTGAGCATTGATGGTACCAATCCGGGTGCAGGTGGTGGTGGTGTTCAGCAGGAACAGAAAACCAAAGATCAGGTTTTTGGTGGTGGTGGTTTTGCAATTAGCAATAAAAAAGTTGATATTGGTGGTGTCGACGGTGGTGGTGGTATGCCGCCGCGTCCGAATTTTCCGAATCAGATGCCGAATATGGGTGGTGGTGGTCAGTTTGGTCCGAATCCGCAGCAGCGTATTGGTGGTGGTGGTGGTGGTATGCCGCCGCGTCCGAATTTTCCGAATCAGATGCCGAATATGGGTGGTGGTGGTCAGTTTGGTCCGAATCCGCAGCAGCGTATTGGTGGTGGTGGTCCGCAGAATAGCCAGCCGCGTCCGATGCCGAATAAAGGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTAGCAATCAGCCGCGTCCGATGGGTGGTGGTGGTATGCCGAATCGTCCGCAGAATCCGCAGGGTCCGCGTCCGATGGGTGGTGGTGGTGCAGGTGGTAGCAATCAGCCGCGTCCGATGTGAAAGCTT。
1.2 pMG-mEA的诱导表达和纯化
1.2.1 重组质粒转化BL21
将保存的BL21冰上放置30 min，将5 μL pET-MG-mEA重组质粒加到感受态细胞，在冰上反应30 min；42 ℃热击90 s，热击完毕冰上放2 min，随后加入1 mL无Amp的LB液体培养基，37 ℃培养45 min；取100 μL菌液均匀地涂布在含有Amp的固体LB平板，倒置放在37 ℃培养箱中过夜培养。次日，分别挑取多个单菌落在含有Amp的LB液体培养基中培养，3 h后，取菌液作为模板，采用T7通用引物进行PCR反应，并进行琼脂糖凝胶电泳。
1.2.2 IPTG诱导蛋白的表达
将测序正确后的pET-MG-mEA重组质粒转化BL21，诱导表达蛋白，并进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果显示如图4，重组质粒经IPTG诱导组（lane 3）可见一条约48 ku大小的特异性条带，pET-32a(+)诱导组（lane 1）和重组质粒未诱导组（lane 2）未见明显的目的条带；重组质粒诱导组经超声后上清可见明显的约48 ku大小的特异性条带（lane 4），超声后沉淀可见少量的蛋白（lane 5）。结果表明重组质粒pET-MG-mEA经IPTG诱导后可表达约48 ku大小的pMG-mEA融合蛋白，并且pMG-mEA融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在。
1.2.3 pMG-mEA诱导表达条件优化
1.2.3.1 pMG-mEA诱导表达时间的优化
pET-MG-mEA重组质粒阳性BL21大肠杆菌经培养至OD600nm≈ 0.6时，加入至终浓度0.1mmol/L的IPTG，分别诱导3～8 h，提取的菌体蛋白经SDS-PAGE分析，结果显示（如图5），诱导4 h后的目的蛋白表达量最高（lane 2），因此原核表达的pMG-mEA最适宜诱导时间为4 h。
1.2.3.2 pMG-mEA IPTG浓度诱导表达的优化
含pET-MG-mEA阳性重组质粒的BL21大肠杆菌经培养至D600nm=0.6时，分别加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，0.5 mmol/L，0.8 mmol/L，1.0 mmol/L，1.2 mmol/L，1.5 mmol/L，1.8mmol/L和2.0 mmol/L，诱导4h后提取菌体总蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示（如图6），其中终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导后pMG-mEA相对表达量更高（lane 2），因此pMG-mEA诱导最适宜的IPTG浓度为0.5mmol/L。
1.2.4 pMG-mEA可溶性蛋白纯化
将超声后溶解在10mM咪唑中的pMG-mEA可溶性蛋白上样后，经可溶性蛋白平衡液洗涤（10 mM咪唑），再分别用20 mM，50 mM，80 mM，100 mM和200 mM咪唑洗脱液依次洗脱，洗脱流出液进行SDS-PAGE分析，结果显示（如图7）100 mM咪唑洗脱液可洗脱目的蛋白。
1.3 pMG-mEA可溶性蛋白浓度测定
根据BCA蛋白定量方法试剂盒说明书，经过纯化、梯度透析和浓缩后的pMG-mEA可溶性蛋白经测定OD562nm值为0.53，计算可知其浓度为0.53 mg/mL。
2动物实验
2.1 制备感染菌液
对MG-R株（购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC）进行复壮，采用商品支原体液体培养基进行扩大培养，置于37 ℃培养箱培养，待其培养基pH值颜色由红变黄后，进行CCU测定，将其稀释至109 CCU/mL后备用。
2.2 实验分组
将SPF鸡种蛋140枚一同入孵，于18日胚龄时，取发育良好SPF鸡胚20枚，以100 μL/枚鸡胚进行胚内注射pMG-mEA（不使用免疫佐剂），出雏后归为胚内注射免疫组。待剩余鸡胚出雏后，随机分为空白对照组（Aa组）、弗氏佐剂对照组（Ab组）、黏膜免疫佐剂组（Ac组）、MG商品弱毒疫苗免疫对照组（Ad组）、点眼滴鼻免疫组（Ba组）、肌肉注射免疫组（Bb组）。
2.3 各组的处理方式及免疫剂量
空白对照组（Aa组）：7日龄时采用生理盐水点眼滴鼻，120 μL/羽；
弗氏佐剂对照组（Ab组）：7日龄时将完全弗氏佐剂与生理盐水1:1混合，进行腿部肌肉多点注射，100 μL/羽。
黏膜免疫佐剂组（Ac组）：7日龄时将CTB黏膜免疫佐剂与生理盐水1:10混合，进行点眼滴鼻，120 μL/羽。
MG商品弱毒疫苗免疫对照组（Ad组）：7日龄时使用MG商品弱毒疫苗进行点眼，150μL/羽。并专人隔离饲养。
点眼滴鼻免疫组（Ba组）：7日龄时将CTB黏膜免疫佐剂与pMG-mEA 1:10混合，进行点眼滴鼻，120 μL/羽。
肌肉注射免疫组（Bb组）：7日龄时将完全弗氏佐剂与pMG-mEA 1:1混合，进行腿部肌肉多点注射，100 μL/羽。
胚内注射免疫组（Bc组）：18日胚龄时进行胚内免疫，人工注射pMG-mEA 100 μL/枚，未使用佐剂，7日龄时采用生理盐水点眼滴鼻，120 μL/羽；
各组免疫后24 h内观察接种疫苗的鸡是否出现应激或其他不适的症状。免疫后第14天通过翼下静脉采血的方式取所有鸡只的静脉血，分离血清后以IDEXX公司ELISA检测试剂盒检测抗体水平。同时，各组取半数鸡只点眼滴鼻接种MG-R株菌液120 μL/羽（109 CCU/mL），攻毒后的鸡严格隔离由专人负责饲养，避免支原体的传染。所有鸡只于4天后采取低温生理盐水喷雾和关灯1日的方式进行应激刺激（表4）。
表4 动物实验分组情况
Figure 458732DEST_PATH_IMAGE002
2.4 临床症状观察
每日观察各组鸡只的临床症状，并对发病时间和临床症状特征进行详细记录。
2.5 剖检病变观察
所有鸡只于MG-R株攻菌后7 d全部进行剖杀。观察不同试验组鸡只的喉气管、肺和气囊等组织的病理变化情况，并做好记录；通过翼下静脉采血的方式取所有鸡只的静脉血，提取血清后用于间接ELISA检测；分别取其气管和肺浸泡于福尔马林溶液中，并做好标记，用于后续制作病理切片观察其病理变化。
根据H. W Yorder的研究方法，将气囊病理变化划为级，级别评定标准如下（表5）。
表5 鸡气囊病理变化等级评判标准
Figure 687719DEST_PATH_IMAGE003
2.6 病理切片制作与观察
按苏木精-伊红染色法（HE染色法）制备病理切片，病理切片制作完成后置于显微镜下观察显微结构并拍照。
2.7 间接ELISA抗体水平检测
在MG-R株攻菌后第7天通过翼下静脉采血的方式取所有鸡只的静脉血，提取血清后用IDEXX公司ELISA检测试剂盒检测，评价各组鸡血清中MG抗体水平的情况。
3 结果
3.1 安全性评价
Bc组在进行胚内注射后均未出现死胚的情况。Ba组、Bb组雏鸡在以不同方式进行处理后的24 h内均未见明显的应激反应和接种部位的不适反应，饮食饮水都表现正常，免疫两周后剖检在免疫接种部位以及全身都未发现有肿瘤等情况，说明本实验制备的pMG-mEA对鸡无明显的刺激性，接种部位和全身都无不适，安全性良好。
3.2临床症状与病理变化
在动物实验过程中，前21日龄各组雏鸡均无明显临床症状出现。
21日龄后，未使用MG攻击的各组雏鸡均无明显的临床症状出现；使用MG-R菌株攻击Aa组、Ab组、Ac组个别雏鸡只首先出现轻微的呼吸道症状；Ad组、Ba组、Bb组、Bc组雏鸡均无明显临床症状出现。
24日龄进行应激刺激后，未使用MG攻击的各组均无明显临床症状出现； MG-R株攻击的Aa组、Ab组、Ac组开始表现呼吸音加重，Ad组、Ba组、Bb组、Bc组均无明显临床症状出现。
29日龄时未使用MG攻击的各组均无明显临床症状；使用MG攻击的Aa组、Ab组、Ac组表现出明显的呼吸啰音，个别鸡只出现咳嗽、眼部肿胀等症状，Ad组、Ba组、Bb组、Bc组均无明显临床症状出现。直至全群剖杀前，各组鸡只均未出现死亡。
29日龄后对所有鸡只进行剖杀，观察各组气管、肺和气囊的病变，剖检结果显示，未使用MG攻击的鸡只均无明显病理变化，气囊透明无分泌物，肺部正常。MG-R株攻击的Aa组、Ab组、Ac组的鸡只气囊呈现明显的病理变化，气囊颜色浑浊、气囊壁增厚，部分鸡只气囊出现泡沫，气管与肺部病变于肉眼观察并不明显，心包轻微粘连（图8）。在使用MG攻击前进行免疫的Ad组、Ba组、Bb组均无明显病理变化，只有Bc组的极个别鸡只出现气囊璧增厚的情况。
结果表明未使用MG的鸡只气囊均表现正常，使用MG-R株攻击的Aa组、Ab组、Ac组个别鸡只出现眼部肿胀，剖检可见气囊混浊、增厚，出现泡沫。
实验组鸡只气囊病理变化评级（表6、7）。结果显示，未接种MG的各组鸡只均为0级，气囊颜色正常、未增厚、无分泌物。接种MG-R株的Aa组、Ab组、Ac组的鸡只气囊均出现病变，Ad组、Ba组、Bb组的气囊均表现正常，Bc组有2只鸡的气囊呈1级气囊病变。
表6 未经MG攻击不同组鸡只的气囊病理变化评级结果
Figure 876124DEST_PATH_IMAGE004
表7 经MG-R株攻击不同组鸡只的气囊病理变化评级结果
Figure 12707DEST_PATH_IMAGE005
3.3 间接ELISA检测抗体水平
采用IDEXX公司鸡支原体血清抗体ELISA检测试剂盒进行MG抗体水平检测。攻毒后8 d采血分离的鸡血清，进行血清中pMG-mEA抗体水平检测，检测结果如表8。检测结果使用GraphPad软件进行差异显著性分析，分析结果（图9）。
未使用MG攻击的对照组（Aa、Ab、Ac组）pMG-mEA抗体呈阴性，未使用MG攻击的免疫组（Ad、Ba、Bb、Bc组）均能产生pMG-mEA抗体，肌肉注射免疫组Bb组pMG-mEA抗体水平最高，Ab组和Bb组相比抗体水平差异极显著（p＜0.01），Ac组和Ba组相比差异极显著（p＜0.01），Aa组和Bc组差异极显著（p＜0.01）；
MG-R株接菌后的对照组除Ab组外pMG-mEA抗体均呈阴性（OD450≤0.401），攻菌后的免疫组（Ba、Bb、Bc组）依旧能产生pMG-mEA抗体，肌肉注射免疫组（Bb组）pMG-mEA抗体水平最高，Ab组和Bb组相比抗体水平差异极显著（p＜0.01），Ac组和Ba组相比差异极显著（p＜0.01），Aa组和Bc组差异极显著（p＜0.01）。而攻菌前后，同组的差异均不显著（p＞0.05）。
表8 间接ELISA检测免疫接种前后各组鸡血清MG-mEA抗体水平的变化
Figure 478324DEST_PATH_IMAGE006
3.4 病理切片结果
对使用MG-R株攻击的各组鸡只的气管病理切片进行观察，放大于显微镜下观察到Aa组、Ab组、Ac组的气管上皮组织有不同程度的脱落（图10b）、增生（图10c）；而Ad组、Ba组、Bb组、Bc组均未见到明显组织学病变，气管上皮组织完整未出现增厚现象。结果表明，pMG-mEA抗体可以有效抑制MG对气管上皮细胞的损害。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA及其应用
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 313
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Ser Met Lys His Gly Lys His Gly Lys His Gly Lys His Gly Lys
1 5 10 15
His Gly Lys His Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro Thr Lys Pro Thr Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Ala Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Val Ser Gly Thr Asn
35 40 45
Ala Asp Asp Gly Met Gly Gly Gly Gly Ala Pro Thr Lys Pro Thr Ala
50 55 60
Pro Lys Pro Ala Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Val Ser Gly Thr Asn
65 70 75 80
Ala Asp Asp Gly Met Gly Gly Gly Gly Phe Arg Lys Ala Asp His Pro
85 90 95
Ser Trp Phe Asn Asn Asp Ser Asn Phe Gly Gly Gly Gly Val Lys Leu
100 105 110
Asn Asn Gln Ser Ser Ser Leu Gly Gly Gly Gly Val Gln Gln Glu Gln
115 120 125
Lys Thr Lys Asp Gln Val Phe Gly Gly Gly Gly Leu Ser Ile Asp Gly
130 135 140
Thr Asn Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Val Gln Gln Glu Gln Lys Thr
145 150 155 160
Lys Asp Gln Val Phe Gly Gly Gly Gly Phe Ala Ile Ser Asn Lys Lys
165 170 175
Val Asp Ile Gly Gly Val Asp Gly Gly Gly Gly Met Pro Pro Arg Pro
180 185 190
Asn Phe Pro Asn Gln Met Pro Asn Met Gly Gly Gly Gly Gln Phe Gly
195 200 205
Pro Asn Pro Gln Gln Arg Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Met Pro Pro
210 215 220
Arg Pro Asn Phe Pro Asn Gln Met Pro Asn Met Gly Gly Gly Gly Gln
225 230 235 240
Phe Gly Pro Asn Pro Gln Gln Arg Ile Gly Gly Gly Gly Pro Gln Asn
245 250 255
Ser Gln Pro Arg Pro Met Pro Asn Lys Gly Gly Gly Gly Val Gly Gly
260 265 270
Ser Asn Gln Pro Arg Pro Met Gly Gly Gly Gly Met Pro Asn Arg Pro
275 280 285
Gln Asn Pro Gln Gly Pro Arg Pro Met Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly
290 295 300
Ser Asn Gln Pro Arg Pro Met Lys Leu
305 310
<210> 2
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggatccatga aacatggtaa acatggtaaa catggtaaac atggtaaaca tggtaaacat 60
ggtggtggtg gtggtgcacc gaccaaaccg accgcaccga aaccggcagc accgaaaggt 120
ggtggtggtg ttagcggtac caatgcagat gatggtatgg gtggtggtgg tgcaccgacc 180
aaaccgaccg caccgaaacc ggcagcaccg aaaggtggtg gtggtgttag cggtaccaat 240
gcagatgatg gtatgggtgg tggtggtttt cgtaaagcag atcatccgag ctggtttaat 300
aatgatagca attttggtgg tggtggtgtt aaactgaata atcagagcag cagcctgggt 360
ggtggtggtg ttcagcagga acagaaaacc aaagatcagg tttttggtgg tggtggtctg 420
agcattgatg gtaccaatcc gggtgcaggt ggtggtggtg ttcagcagga acagaaaacc 480
aaagatcagg tttttggtgg tggtggtttt gcaattagca ataaaaaagt tgatattggt 540
ggtgtcgacg gtggtggtgg tatgccgccg cgtccgaatt ttccgaatca gatgccgaat 600
atgggtggtg gtggtcagtt tggtccgaat ccgcagcagc gtattggtgg tggtggtggt 660
ggtatgccgc cgcgtccgaa ttttccgaat cagatgccga atatgggtgg tggtggtcag 720
tttggtccga atccgcagca gcgtattggt ggtggtggtc cgcagaatag ccagccgcgt 780
ccgatgccga ataaaggtgg tggtggtgtt ggtggtagca atcagccgcg tccgatgggt 840
ggtggtggta tgccgaatcg tccgcagaat ccgcagggtc cgcgtccgat gggtggtggt 900
ggtgcaggtg gtagcaatca gccgcgtccg atgtgaaagc tt 942

Claims (2)

1.一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA，其特征在于，所述pMG-mEA其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA在制备鸡毒支原体基因工程疫苗中的应用。
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