CN102961743A

CN102961743A - 表达鸡毒支原体TM1蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

Info

Publication number: CN102961743A
Application number: CN2012105587677A
Authority: CN
Inventors: 步志高; 陈化兰; 葛金英; 邵国青
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明涉及一种表达鸡毒支原体TM1蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-tPA-TM1。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防鸡毒支原体引起的疾病和新城疫的双价疫苗中的应用。

Description

表达鸡毒支原体TM1蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达鸡毒支原体TM1蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-tPA-TM1。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防鸡毒支原体引起的疾病和新城疫的双价疫苗中的应用。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)可引起感染鸡的慢性呼吸道病，气囊炎和窦炎，是当前影响养禽业生产的常见疾病之一。发病鸡多表现呼吸困难、咳嗽和口罗音，常见有眶下窦炎、气囊炎等。本病流行于世界各国，随着现代养鸡规模不断加大、饲养方式改变和饲养密度日益提高，该病发病率越来越高，所有日龄的鸡均可感染，3周内雏鸡更为易感^[1]。主要影响雏鸡生长、使成年鸡产蛋减少。冀锡霖^[2]等在1986年所作的流行病学调查表明我国20个省、市的鸡群中鸡毒支原体阳性感染率接近80％。MG污染鸡场很难根除，导致种蛋孵化率低，雏禽品质差，而且世代相传，危害性日益突出，受到养鸡业者的普遍关注。

MG可以通过疫苗接种进行预防。目前国内采用弱毒苗和灭活疫苗进行预防接种。江苏省农科院兽医研究所邵国青研究员^[5]对MG弱毒疫苗进行过系统研究，曾对SC株的免疫原性进行评估，研究结果显示免疫10天后攻毒保护率达80％。由于有的毒株其致病力极弱，需反复免疫，保护效果不佳；而有的弱毒疫苗株仍具有一定毒力，特别对于火鸡，它可以引起商品火鸡感染发病^[6]。MG弱毒常常发生置换和传播，因此可能会加重MG控制和清除的难度^[7]。弱毒疫苗的应用在一定程度上控制了MG的流行，但在使用过程中存在一定的问题。

几十年前许多禽病工作者已经开始着手灭活疫苗研究，但效果不佳。Yoder等^[8]报道了以MG油乳剂灭活苗对15～30日龄鸡免疫接种能有效地抵抗强毒株攻击，但用于10日龄以前的雏鸡，免疫效果不理想，无法诱导保护性抗体。宋勤叶等^[9]用MG油乳剂灭活苗接种蛋鸡，结果表明无论在试验攻毒前还是在攻毒后接种，只能有效地降低MG经蛋传播的比率。宁宜宝等^[10]通过高速离心或是中空纤维滤器浓缩鸡毒支原体作为灭活疫苗使用，研究发现5倍浓缩的疫苗可以使鸡产生良好的免疫力，免疫力随着抗原浓度的提高而提高，不浓缩的原液培养物所制备的疫苗几乎不能诱导鸡产生免疫保护力。浓缩抗原在提高免疫原性的同时大大增加了疫苗成本，使得原本昂贵的灭活疫苗价格更上一层楼。

在生产实践中，很多鸡场应用抗生素来治疗和控制MG的感染和扩散。药物治疗不能完全清除支原体的感染，并存在药物残留的弊端，阻碍禽类产品出口。因此，研究廉价、安全、高效的鸡毒支原体疫苗具有积极的现实意义。

因此，目前用于防治MG的灭活疫苗和弱毒疫苗均存在不同程度的不足。而且MG培养困难，不同区域分离的毒株抗原性差异较大，常规疫苗在防治MG上已经力不从心，因此利用先进技术手段开发新型疫苗已经迫在眉睫，而MG基因工程疫苗的研制一直处于初级阶段。

新城疫病毒(NDV)载体系统是近年进展迅速的活病毒载体系统，作为外源基因的表达载体具有非凡的优势。NDV可同时诱导体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，是所有疫苗形式中最为理想的免疫方式；经过多年的临床应用检验，NDV遗传相对稳定，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小，使用安全、方便；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低廉，便于规模化生产。

NDV基因组全长15186核苷酸，与其它副粘病毒一样，包括核蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神经氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六个独立转录编码单元。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。

申请人之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”(ZL200510097997.8，CN1293195C，申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功救获了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及NDV病毒相关基础研究奠定了坚实的基础。

发明内容

MG其基因组中的一个开放阅读框TM-1表达一个29kDa的多肽。本发明利用NDV疫苗株LaSota作为载体表达MG结构蛋白的经密码子人工优化后的TM-1基因，拯救重组病毒并进行免疫试验，结果发现可以诱导雏鸡产生保护性抗体，由此探索了活载体疫苗控制MG流行的可行性。

更具体地，本发明以NDV弱毒LaSota疫苗株为表达载体，以MG疫苗株作为基因供体，利用反向遗传操作技术，成功拯救表达MG tPA-TM1蛋白的重组新城疫病毒。重组病毒在SPF雏鸡上进行免疫评价，ELISA抗体检测结果证明重组疫苗免疫可以诱导产生显著的抗体反应，此重组疫苗将MG的预防与NDV的免疫合二为一，一次免疫防治两种疫病，在不增加防疫成本的情况下完成另一严重威胁禽类养殖的重要疫病的防控，重组活载体二联疫苗rLa-tPA-TM1可以作为预防NDV和MG的二联活疫苗使用。

因此，本发明的一个目的是提供一种表达编码鸡毒支原体TM1蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗(即表达鸡毒支原体TM1蛋白的新城疫LaSota弱毒疫苗)。

在一个实施方案中，所述鸡毒支原体TM1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在另一个实施方案中，所述编码鸡毒支原体TM1蛋白的基因的序列是密码子优化后的序列，优选如SEQ ID No.2所示(SEQ ID No.5是鸡毒支原体TM1基因的天然序列)。

在另一个实施方案中，在所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗中，在TM1蛋白编码基因的3′端引入人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)序列作为信号肽，优选所述tPA序列如SEQ ID No.3所示。

在另一个实施方案中，所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗为rLa-tPA-TM1。

本发明还有一个目的是提供本发明的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防鸡毒支原体引起的疾病和新城疫的双价疫苗中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种生产本发明的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码鸡毒支原体TM1蛋白的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

在一个实施方案中，所述转录质粒是pBRN-FL-tPA-TM1，其序列如SEQ ID No.4所示。

在另一个实施方案中，所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP和pBSL。

在另一个实施方案中，所述宿主细胞是稳定表达T7聚合酶的细胞系，如BHK-21。

本发明还有一个目的是提供根据本发明的方法制备的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，优选为rLa-tPA-TM1。

应当理解，上述实施方案中的技术特征可以任意组合，并且该组合对于本领域技术人员是显而易见的。

本发明在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上，以Genebank数据库鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)TM1基因序列(FJ536195)为模板，对其密码子进行手动优化并在基因3′端引入人组织型纤溶酶原激活因子(tissue plasminogen activator，tPA)(序列号E00896)序列作为信号肽，将tPA-TM1基因克隆到载体pBRN-FL-PmeI上，构建了表达tPA-TM1基因重组新城疫病毒全长cDNA克隆pBRN-FL-tPA-TM1。利用磷酸钙转染法，在辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL的共同作用下，成功拯救出重组病毒rLa-tPA-TM1(在本文中有时表示为rLa-tPATM1)。RT-PCR检测证实重组病毒接种的鸡胚尿囊液中含有tPA-TM1基因，western blot和IFA检测结果均表明tPA-TM1基因在新城疫载体中得到了正确的表达，重组病毒在SPF雏鸡上进行了免疫评估实验，为进一步研制预防鸡毒支原体的重组基因工程活载体疫苗奠定了基础。

附图说明

图1.重组病毒感染性克隆构建示意图；

图2.重组病毒RT-PCR鉴定(M，核酸分子量标准；1，重组病毒)；

图3.重组病毒感染BHK细胞IFA检测结果；

图4.western blot检测重组病毒中外源蛋白的表达；

图5.重组病毒生长动力学曲线；

图6.免疫组和对照组NDV特异HI抗体检测；

图7.免疫组和对照组MG特异ELISA抗体水平；和

图8.雏鸡剖检气囊病理变化图(rLa-tPA-TM1免疫组攻毒保护，气囊清亮，与空白SPF对照组无差异；rLaSota免疫攻毒对照组气囊增厚，有大量干酪样渗出物)。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1表达编码鸡毒支原体TM1蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的构建和生物学活性

1材料与方法

1.1细胞、病毒、血清、鸡胚及实验动物

Vero-E6细胞(非洲绿猴肾细胞ATCC No.CRL-1586)、BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞ATCCCCL-10)和CEF细胞(鸡胚成纤维细胞)由哈尔滨兽医研究所人畜共患病研究室保存；攻毒用MG毒株由江苏省农业科学院邵国青研究员惠赠；重组新城疫病毒rLaSota是通过反向遗传操作技术拯救的不含外源基因的重组LaSota病毒，其由本发明人根据ZL200510097997.8制备并保存；稳定表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3(ATCC，VR-2153)购于ATCC；鸡抗MG高免血清由发明人制备并保存，鼠抗NDV-HN和抗NDV-HI单抗购自Santa Cruz；9～10日龄SPF鸡胚和SPF雏鸡由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供；3周龄BALB/c小鼠(均为雌性)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有的动物试验均在P2级负压隔离器内进行。

1.2主要试剂和仪器

限制性内切酶，DNAMarker，高保真DNA聚合酶(Primer Star HS DNAPolymerase)均购自TaKaRa公司；预染蛋白Marker，购自Fermentas公司；胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司；磷酸钙转染试剂盒，TRIzol LS Reagent，鼠源反转录酶(M-MLV)试剂盒均购自Invitrogen公司；胎牛血清，Opti-MEM均购自Gbico公司；FITC标记的兔抗鸡IgG抗体、TRITC标记的山羊抗鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG和HRP标记兔抗鸡IgG均购自Sigma公司；荧光显微镜购自ZEISS公司。

1.3合成基因设计

根据Genebank数据库鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)TM1基因序列(FJ536195)，对其进行密码子优并在基因3′端引入人组织型纤溶酶原激活因子(tissue plasminogen activator，tPA)(GenBank Accession No.E00896)序列作为信号肽，并在tPA-TM1基因的3′端插入Pme I酶切位点和基因终止序列(GE：TTAAGAAAAAA)和基因起始序列(GS：ACGGGTAGAA)，在tPA-TM1基因的5′端插入Pme I酶切位点，作为整体，由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成。

1.4表达TM-1基因的重组病毒全长cDNA克隆的构建

用Pme I处理以上合成的质粒，回收基因片段，并与同样经Pme I处理的载体pBRN-FL-PmeI(参考文献：葛金英，温志远，王永，等。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J].微生物学报，2006，46(4)：547～551)连接，构建了表达tPA-TM1基因的重组新城疫病毒全长cDNA克隆，命名为pBRN-FL-tPA-TM1。

1.5重组病毒的拯救

将BHK-21细胞接种于6孔细胞板中，当细胞生长达50％～80％单层时，接种痘病毒vTF-3，感作1h。重组质粒pBRN-FL-tPA-TM1及辅助质粒pBSNP、pBSP、pBSL^[3，4](辅助质粒pBSNP、pBSP、pBSL还参见申请人之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”(ZL200510097997.8，CN1293195C，申请日2005年9月2日))，共转染BHK-21细胞，具体操作步骤参照磷酸钙转染试剂盒(Calcium Phosphate Transfection System)说明书进行。转染8～12h后，用1mL含10％DMSO的PBS溶液休克2.5min，然后每孔加入阿拉伯糖苷(10μg/mL)，37℃孵育24h后换成Opti-MEM，并加入阿拉伯糖苷和TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮，购自NEB公司)(1μg/mL)。37℃继续孵育72h后，收获培养物上清，接种于9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔中。5天后，取尿囊液进行新城疫病毒的血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)。重组病毒命名为rLa-tPA-TM1，收获HA和HI均呈阳性结果的尿囊液，分装后-70℃冻存。

1.6间接免疫荧光(IFA)检测外源蛋白的表达

重组病毒按照M.O.I为0.01的量感染生长于24孔板中的BHK-21细胞，24h后用3％多聚甲醛固定细胞，以鸡抗MG高免血清和鼠抗NDV-HN单抗为一抗，以SPF鸡阴性血清为阴性对照；以荧光素(TRITC)标记的山羊抗鼠IgG和荧光素(FITC)标记的兔抗鸡IgG(Sigma)为二抗，共聚焦法进行IFA检测。

1.7Western blot鉴定外源基因的表达

取收获的尿囊液，过量感染BHK-21细胞，72h后收集细胞，裂解细胞产物进行SDS-PAGE，再转印至NC(硝酸纤维素)膜上。NC膜用含3％BSA的PBS溶液于4℃封闭过夜。分别以1∶100稀释的鼠抗NDV-HN单抗和1∶100倍稀释的鸡抗MG高免血清为一抗，以1∶2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG和兔抗鸡IgG(Sigma)为二抗；DAB显色，待出现特异性条带后，立即用双蒸水终止反应。

1.8重组病毒生物学特性试验

取F3代重组病毒按照O.I.E标准进行EID₅₀(半数感染量)，MDT(平均致死时间)，IVPI(静脉内致病指数)和ICPI(脑内致病指数)检测。确定重组病毒的毒力特征。

取F3代重组病毒按10²EID₅₀的剂量接种9～11日龄SPF鸡胚，间隔12h随机取样，测定每时间点的病毒滴度，绘制重组病毒的复制动力学曲线。

2.结果

2.1重组病毒的构建与拯救

根据Genebank数据库信息和成基因tPA-TM1，并在tPA-TM1基因末端插入酶切位点和基因调控序列。用Pme I处理合成基因片段，插入同样经Pme I处理的载体pBRN-FL-PmeI，获得表达犬瘟热病毒结构基因重组新城疫病毒全长cDNA克隆pBRN-FL-tPA-TM1(图1)。

将pBRN-FL-tPA-TM1与辅助质粒pBSNP、pBSP、pBSL共转染BHK-21细胞，获得血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)阳性的重组病毒rLa-tPA-TM1。以特异性引物(上游引物NDV3135-PF：5′-TCACACGGAATCTGCACCGAG-3′，下游引物NDV-TM1-PR：5′-TCTCAACCGTTTAAACatctaGgtC-3′)对重组病毒进行RT-PCR检测，电泳结果所获PCR产物接近2000bp(图2)，与预期1950bp的目的片段相符，证明重组病毒内含有tPA-TM1基因。

2.2IFA检测结果

拯救的重组病毒rLa-tPA-TM1以M.O.I.为0.01感染BHK细胞，同时设定rLaSota接种细胞作为阴性对照。接种细胞37℃培养24h后共聚焦法进行间接免疫荧光检测，结果显示重组病毒组呈现MG相应蛋白和NDV蛋白的共表达，rLaSota对照细胞仅呈现针对NDV抗体的阳性结果(图3)。

2.3Western blot检测结果

蛋白样品经电泳转印后，重组病毒rLa-tPA-TM1接种的细胞样品以鸡抗MG和鸡抗NDV高免血清为一抗进行Western blot检测。结果相比较LaSota对照细胞样品，rLa-tPA-TM1接种的细胞样品在75kDa处出现特异性条带，与相应外源蛋白预期大小相符。以鸡抗NDV为一抗的Westernblot检测结果中，两个样品泳道上均出现NDV特异性条带(图4)。Western blot检测结果说明tPA-TM1蛋白在重组病毒中得到了正确表达，并具有良好的反应原性。

2.4重组病毒生物学特性检测

重组病毒MDT均大于90h，ICPI和IVPI均为0，呈典型的NDV弱毒特征。F3代重组病毒致病力指标具体结果见表1。

表1重组病毒致病力指标

毒株	EID50(log10)	MDT(小时)	ICPI	IVPI
					rLaSota	8.60	≥120	0	0
rLa-tPA-TM1	8.69	139.6	0	0

将F3代重组病毒按10²EID50的剂量接种9～11日龄SPF鸡胚，间隔12h随机取样，测定重组病毒的复制动力学曲线(图5)。结果重组病毒保持了其亲本毒株的生长复制特性，与其亲本株具有相似的生长动力学曲线。

实施例2重组病毒免疫试验及血清抗体检测

1.材料与方法

1.1材料

同以上实施例1。

1.2方法

将重组病毒原液稀释至10⁶EID₅₀剂量接种3日龄SPF雏鸡20只，接种后的SPF雏鸡置于负压隔离器内饲养，间隔一周采集翅静脉血，分离血清，检测抗NDV的HI抗体和MG特异ELISA抗体。以LaSota接种组作为对照。

免疫接种三周后，取MG强毒株经气管途径接种攻毒，每只鸡接种0.5ml。观察雏鸡的呼吸道症状，并在14天后采集翅静脉血，然后进行剖检，观察气囊病变情况，并进行评分记录。

2结果

将重组病毒原液按10⁶EID₅₀剂量接种3日龄SPF雏鸡20只，接种后的SPF雏鸡置于负压隔离器内饲养，间隔一周采集翅静脉血，分离血清，检测抗NDV特异的HI抗体(图6)和MG特异ELISA抗体。结果rLa-tPA-TM1免疫SPF雏鸡可以诱导产生针对NDV和MG的显著抗体反应(图7)。

抗体随着免疫时间而持续上升，在免疫后3周进行MG攻毒实验，攻毒后2周进行剖检。按照气囊病变程度进行打分，结果，rLa-tPA-TM1免疫组雏鸡气囊大部分保持透明而清亮，保护率高达85％以上；而rLaSota免疫组雏鸡绝大部分均发生气囊病变，个别雏鸡的气囊甚至布满干酪样渗出物，气囊壁显著增厚，呈灰白色，20只鸡中只有3只鸡气囊尚属正常(图8)。气囊评分的详细结果见表2。

表2.重组病毒免疫SPF雏鸡攻毒MG结果

参考文献

[1]宁宜宝。鸡群健康的潜在杀手-鸡毒支原体病的防制[J]。中国兽医杂志，2003，39(10)：44～46。

[2]冀锡霖，宁宜宝。鸡感染鸡毒霉形体和滑液霉形体情况的调查[J]。中国兽医科技，1986，(12)：212～23。

[3]葛金英，温志远，王永，步志高。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J]。微生物学报，2006，46(4)：547～551。

[4]葛金英。新城疫病毒反向遗传操作基础与应用研究[D]。中国博士论文全文数据库，2006。

[5]邵国青，毛洪先，钱建飞，薛家宾，许伟成，蔡宝祥。鸡败血霉形体SC克隆致弱株免疫原性试验。中国兽医学报，1998，18(5)：452～454。

[6]陈凤梅，牛钟相，程光民，王勇。鸡毒支原体研究进展[J]。动物医学进展，2004，25(3)：56～59。

[7]Ley D H，Berkhoff J E，McLaren J M.Mycoplasma conjunctivitis in wild songbirds：the spread of anew contagious disease in a mobile host population[J].Avi Dis，1996，40：480-483.

[8]Yoder H W，Hopkins Jr S R，Mitchell B W.Evaluation of inactivated Mycoplasma gallisepticumOil-Emusion Bacterins for protect ion Against Air saccul it is in broiler s[J].Avian Dis eases，1983，28(1)：224-234.

[9]宋勤叶，张中直，张冰，等。鸡毒支原体油乳剂灭活苗对降低MG垂直传播作用的研究[J]。畜牧兽医学报，2002，33(3)：285～290。

[10]宁宜宝，高和义，蔡祈英。鸡毒支原体油乳剂灭活疫苗的研制。中国畜牧兽医学会禽病学分会第十次学术研讨会论文集，214～216。