CN103874508A - 提供多价免疫的重组非致病性mdv载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽医疫苗领域，具体涉及基于重组非致病性马立克氏病病毒（npMDV）的用于家禽的载体疫苗领域。本发明的重组npMDV稳定且有效表达各自源于不同微生物的两种异源基因：来自新城疫病毒的融合蛋白基因，和来自传染性法氏囊病病毒的病毒蛋白质2基因。基于这种重组npMDV的疫苗可以用于在家禽中诱导不仅针对马立克氏病，还针对新城疫和传染性法氏囊病的保护性免疫应答。本发明还涉及关于重组npMDV、表达盒、受感染的宿主细胞和疫苗的方法和用途。

Description

提供多价免疫的重组非致病性MDV载体

本发明涉及兽医疫苗领域，具体涉及基于重组非致病性马立克氏病病毒的用于家禽的病毒载体疫苗领域。

马立克氏病病毒（MDV）形成感染禽类物种的α疱疹病毒亚科（alphaherpesvirideae）的。病毒粒子是有包膜的，并且大小约160 nm。它们在衣壳内包含线性双链DNA的大基因组。

MDV血清型1（MDV1）也命名为禽疱疹病毒2型（Gallid herpesvirus 2），对于鸡是致病性的并且在全世界发生。它是致瘤的且引起淋巴瘤和麻痹。减毒的MDV1毒株已用作疫苗，例如Rispens疫苗（毒株CVI-988）（Kreager，1998，Poultry Sci.，第77卷，第1213页）。

MDV血清型2（MDV2）也被称为禽疱疹病毒3型，强减毒为鸡的实际无致病性MDV（Petherbridge等人，2009，J. Virol. Meth.，第158卷，第11页），其通常用作针对MDV1的疫苗。众所周知的MDV2疫苗是Nobilis? Marexine SB1（MSD Animal Health）。

MDV血清型3也被称为：吐绶鸡疱疹病毒1型（Meleagrid herpesvirus 1）、火鸡疱疹病毒，但最通常被称为：火鸡的疱疹病毒（HVT）。这大约在1970年被描述为感染火鸡的疱疹病毒（Witter等人，1970，Am. J. Vet. Res.，第31卷，第525页），其对于鸡是无致病性的。HVT毒株例如PB1或FC-126通常用于针对MDV1接种。或者，当需要针对超强毒MDV1的保护时，HVT与MDV2疫苗株组合使用，例如在Nobilis? Marexine CA126+SB1（MSD Animal Health）中与SB1组合，或在Nobilis? RISMAVAC+CA126（MSD Animal Health）中与MDV1疫苗株例如Rispens组合。

非致病性马立克氏病病毒（npMDV）MDV2和HVT在鸟类的外周血淋巴细胞（PBL’s）中复制，因而它们是全身性病毒，这诱导长持续时间的免疫应答，所述免疫应答主要针对细胞而不是体液免疫系统。

npMDV疫苗可在早期应用于鸡，这是其安全无致病性的性质以及对针对MDV2或HVT的母源抗体（MDA）的相对不敏感性的组合结果；雏鸡中的MDV是经由来自其母亲的蛋衍生的抗体，所述母亲作为例行程序针对常见的家禽病原体进行充分接种。因而，npMDV疫苗可早在其从蛋中孵化的当天（第一天），或甚至在孵化前仍在蛋中时接种到雏鸡内。该后一种方法，所谓的‘鸡胚接种（in ovo vaccination）’，是胚胎接种的形式，其通常在胚胎发育（ED）的第18天（在孵化前约3天）应用。

在活的重组载体中表达的异源基因通常编码这样的蛋白（或其相关部分），所述蛋白是待针对其接种的微生物的主要宿主保护免疫原；因为这种蛋白或肽携带此类微生物的一个或多个免疫显性表位，所以它可以诱导宿主的免疫系统产生将所述微生物从接种的靶动物中清除的中和抗体和/或细胞免疫。

除自身用作疫苗，HVT也用作病毒载体疫苗用于多种免疫原性蛋白的表达和向家禽动物的递送，参见WO 87/04463。编码来自家禽病原体的抗原的几种基因已在HVT载体中表达，所述基因例如来自：新城疫病毒（NDV）（Sondermeijer等人，1993，Vaccine，第11卷，第349-358页）、和传染性法氏囊病病毒（IBDV）（Darteil等人，1995，Virology，第211卷，第481-490页）。但还描述了寄生虫抗原（Cronenberg等人，1999，Acta Virol.，第43卷，第192-197页）和细胞因子的表达，以操纵鸡的免疫应答（WO 2009/156.367；Tarpey等人，2007，Vaccine，第25卷，第8529-8535页）。

HVT载体疫苗向家禽的施用生成针对所表达的异源基因、以及针对HVT（其针对MDV进行保护）的免疫应答。这应用于多种商业HVT载体疫苗产品中，例如：NDV F蛋白基因：Innovax?-ND（MSD Animal Health），和Vectormune? HVT-NDV（Ceva）；或IBDV VP2基因：Vaxxitek? HVT+IBD（Merial；先前命名为：Gallivac? HVT-IBD）、和Vectormune? HVT-IBD（Ceva）；

HVT的基因组核苷酸序列例如可作为：AF291866（毒株FC-126）得自Genbank?。已描述了用于将异源核酸插入HVT内的几种方法，例如通过使用同源重组（Sondermeijer等人，同上）、黏粒再生（US 5,961,982）或杆粒（细菌人工染色体）（Baigent等人，2006，J. of Gen. Virol.，第87卷，第769-776页）。

用于将异源基因构建体插入HVT基因组内的许多遗传位置已进行研究，并且几个合适的非必需基因座已得到描述，例如在HVT基因组的独特短区（unique short region）中（EP 431.668）；或在HVT独特长区（unique long region）中（EP 794.257）。

不同启动子已用于驱动异源基因在HVT的表达盒中的表达，例如：PRV gpX启动子（WO 87/04.463）；劳斯肉瘤病毒LTR启动子、SV40早期基因启动子和人巨细胞病毒立即早期1（hCMV IE1）基因启动子（EP 719.864）；或鸡β-肌动蛋白基因启动子（EP 1.298.139）。

类似地，MDV2毒株的基因组核苷酸序列可得自Genbank?：HQ840738（SB1）、和AB049735（HPRS24）。MDV2的基因组组构非常类似于HVT的，并且特别是Us区与HVT的相同（Kingham等人，2001，J. of Gen. Virol.，第82卷，第1123页；Spatz和Schat，2011，Virus genes，第42卷，第331页）。MDV2病毒的克隆和转染已得到描述（Petherbridge等人，同上）。

对于重组载体的构建，待插入载体的基因组内的异源构建体通常为包含至少一个（异源）基因或编码区的核酸分子，其必须能够编码抗原蛋白（的至少免疫原性部分）。而且，构建体可以包含启动子序列以驱动异源基因的表达。在后面一种情况下，构建体通常称为‘表达盒’。

表达盒插入载体的基因组内所得到的作用可以不同，因为这个基因组的大小可以变得更大、相同或更小，这取决于对基因组的最终结果是否分别是遗传材料的添加、替换或缺失。插入位置也可以改变：置于基因组的编码区内或非编码区内；并且放置可以在载体的基因或调节区域内或两者之间。这些选择决定表达盒的最终组成必须是怎样的，并且其对载体的作用以及最终对接种的靶动物的作用将是怎样的。

无论构建体多么精确，有利的表达盒均必须允许活的重组病毒载体克服对其稳定性和功效的许多生物应激：首先，在已接受异源插入片段后生成后代的能力。这指示尽管插入其基因组内，但重组病毒仍是活的。接下来，在体外在宿主细胞系中复制多个循环，同时保持异源插入片段的复制和表达的能力。这指示重组体未由于插入而在其复制方面减弱，并且插入片段是稳定维持且表达的。第三，体内复制和表达。这指示重组病毒可以克服活动物中例如由其免疫系统造成的的强选择压力。在这个环境中，外源基因的表达丧失有利于在动物中的更快速复制；此类‘逃避突变体（escape mutants）’具有在外源基因或其调节区中的获得性突变或主要缺失，并且可以使完整病毒载体过度生长。最后且最重要的是，在动物中的载体复制和异源基因的表达需要能够生成此类有效的免疫应答，使得接种的动物得到保护不受否则将由微生物引起的感染和/或疾病，所述微生物是载体表达的异源插入片段的供体。

因而，所得到的重组载体必须提供表达盒在其基因组中的稳定整合；所得到的重组载体在体外和体内的良好复制；和一种或多种异源基因在体内的有效表达，优选为高水平并随着时间保持一致，以诱导且维持保护性免疫应答。

这个特征组合将允许在体外的大量的复制轮次，这是大规模生产必需的，以及是当载体疫苗在接种的靶动物中复制时，插入的外源基因持续表达和呈递给宿主的免疫系统所必需的。此外，该复制和表达中的稳定性是载体疫苗顺应非常高的安全性和生物稳定性标准所必需的，在获得来自国家政府当局的上市许可后，待作为商业产品引入领域内的重组病毒必须满足所述标准。

新城疫和传染性法氏囊病是重要的家禽疾病，其在全世界发生且可以引起养禽业中关于动物福利和经济运行的严重负面效应（参见Disease of poultry，第12版，2008，Y. Saif编辑，Iowa State Univ.出版社，ISBN-10：0813807182）。

新城疫病毒属于单股反链病毒目（Mononegavirales），具体为副粘液病毒科（Paramyxoviridae），并且可以根据其毒力分组成不同致病型；非致病性缓发型（lentogenic）NDV在家禽中几乎不引起症状。相比之下，中发型（mesogenic）（中等致病性）和速发型（velogenic）（高致病性）NDV毒株引起广泛疾病和死亡率，并且因此是许多国家中的法定传染病。疾病症状包括呼吸和神经异常，并且喘息（gasping）和 ‘斜颈’是最值得注意的。

在商业家禽操作中，针对由致病性NDV毒株引起的感染和/或疾病的保护通过家禽的常规接种来实现，通常在孵化当天，使用活的缓发型NDV毒株，例如Nobilis? ND Clone 30（MSD Animal Health）。

NDV具有非节段、负义、单链RNA基因组，其长度约15 kb，并且含有六种基因，在其中有免疫显性蛋白F糖蛋白的基因。F蛋白涉及NDV附着宿主细胞和进入宿主细胞内，并且可以是针对NDV的有效免疫应答的基础。它作为天然F0蛋白表达，所述F0蛋白由肽酶细胞外切割成F1和F2。切割的容易性由位于F1/F2切割位点处的某些碱性氨基酸的氨基酸序列决定，并且这决定NDV毒株的毒力。

传染性法氏囊病病毒（IBDV）也被称作禽肾病病毒，是传染性法氏囊病的致病因子，并且是双核糖核酸病毒科的成员。这个科中的病毒具有由双链RNA的两个节段（A和B）组成的基因组。较大节段A编码110 kDa的多蛋白，其随后通过自体溶解切割，以形成成熟病毒蛋白VP2、VP3和VP4。在这些中，VP2和VP3是病毒粒子的结构衣壳蛋白，并且VP2是主要宿主保护性免疫原。

在IBDV的情况下，存在两种血清型，血清型1和2。两种血清型可以通过病毒中和（VN）测试加以区分。血清型1病毒已显示对鸡是致病性的，而血清型2 IBDV仅在火鸡中引起亚急性疾病。

历史上，IBDV血清型1病毒仅由称为“经典” IBD病毒的一种类型组成。近来，出现所谓的“变体” IBDV毒株；可以通过使用单克隆抗体实验对象组的病毒中和测试或通过RT-PCR，来鉴定并区分经典毒株和变体毒株；这由Wu等人（2007，Avian Diseases，第51卷，第515-526页）综述。众所周知的经典IBDV毒株是：D78、Faragher 52/70和STC。

IBDV是鸡淋巴组织的急性、高度接触传染性病毒感染，具有鸟类的基本免疫器官：法氏囊作为它的主要靶。易感群体中的死亡率高，伴随快速体重减轻和中至高的死亡率。由于法氏囊（部分）的破坏，从该疾病恢复的雏鸡可能具有免疫缺陷。这使得它们易受继发感染影响。

在野外，传播的野生型IBDV的毒力似乎从强毒株逐渐增加到超强毒株。这可能需要所使用的疫苗的改变。

针对IBD的常规接种使用活IBDV毒株在雏鸡寿命中尽可能早地进行，但这些仅在针对IBDV的MDA水平已足够降低时才可以适用，其通常在孵化后7-30天之间的某处，通常在第15-20天之间。许多活的或灭活的IBDV疫苗是商购可得的，例如活疫苗例如Nobilis? Gumboro D78（MSD Animal Health）。

为了实现成本效益，常见方法是设计包含抗原组合的疫苗。以这种方式，单个接种轮次可以使鸟类针对许多疾病立刻免疫。这不仅节省时间和劳力成本，它还减少对接种动物的不适和应激，所述不适和应激否则将由于必须接受反复接种而发生。在这方面的最高效率在这样的接种的情况下实现，其不通过大量应用例如通过喷射或经由饮用水而给予，而是需要通过注射个别应用。这个的实例是用灭活的亚单位疫苗给蛋鸡和种鸡接种。这些目前已发展成包含高达7种不同抗原的组合疫苗；例如Nobilis? Cor4+IB+ND+EDS（MSD Animal health）。

因为基于重组npMDV作为病毒载体的疫苗也需要通过个别注射进行施用，因此在这个背景下的组合也是高度希望的。（除了来自NPMDV载体自身的MDV保护之外）立刻保护以不受几种不同疾病的能力将具有极大利益。因此，许多团体已研究多于一种异源抗原通过npMDV载体接种的组合表达和递送。

显而易见的方法是组合各自含有单个异源插入片段的现有重组npMDV载体疫苗。然而，过去已发现这并未产生良好结果，因此关于现有HVT重组疫苗的产品信息不推荐其与其他（单个）HVT重组体的组合。

可能由于在接种的靶动物中的竞争选择，重组npMDV毒株之一能够相对于其他毒株过度生长。因此，仅一种重组疫苗株能够有效复制，并且从而产生仅针对有关病原体的仅一种的免疫保护。

替代方案是构建在一个重组体基因组中携带多个异源插入片段的npMDV载体。自从开发了第一种重组npMDV构建体（WO 87/044630），这已得到研究，并且随着时间过去事实上已描述了HVT中的几种多价插入片段组合，例如：在WO 93/25665中，实施例11的“二价疫苗”，构建体HVT-007、HVT-048和HVT-096；类似地，在WO 96/05291中，实施例11-14的“二价疫苗”，以及甚至实施例16-17的“三价疫苗”。这同样适用于如EP 719.864中所述的HVT重组体。

虽然这些构建体中的大多数仅是建议，但实际上分离了所描述的具有多个插入片段的载体中的一些；一些甚至在SPF（无特异性病原体）鸡中进行测试。然而，对于这些多价表达构建体中的大多数，从未公开关于这些构建体的遗传稳定性，或关于异源插入片段随着时间在体外或在体内的表达的任何研究结果。

事实上，根据许多现有技术公开，已充分测试且证明作为疫苗是安全、稳定和有效的具有多个插入片段的唯一重组npMDV，是包含来自传染性喉气管炎病毒（ILTV）的gD和gI基因的构建体，其作为Innovax?-ILT（MSD Animal Health）商购可得。

然而，即使在这种情况下，异源插入片段仍仅提供针对单一家禽病原体即ILTV的单价保护。这是因为ILTV gD/gI基因天然重叠且需要组合表达，以允许针对ILTV的适当免疫接种。因此，多价插入是出于必要，而不是有意扩大免疫接种范围。

因而，直到今天，并且尽管极大的潜在优点和随着时间的多次尝试，仍不存在描述安全、稳定和有效的重组npMDV载体疫苗的现有技术，所述疫苗提供各自源于不同微生物的多于一种异源基因的表达，且由此允许通过用单一重组npMDV载体疫苗的接种生成（除针对MDV的免疫应答之外）多价免疫应答。

本发明的目的是适应本领域的这个需要，并且首次提供安全和稳定的重组npMDV载体疫苗，其允许（除针对MDV的保护之外）针对多于一种家禽病原体的有效家禽免疫接种。

令人惊讶地发现这个目的由根据本发明的重组npMDV满足，所述重组npMDV提供来自多于一种家禽病原体的异源免疫保护性抗原的表达。

因此，本发明涉及包含异源核酸分子的重组非致病性马立克氏病病毒（npMDV），其特征在于所述异源核酸分子在5'至3'方向上并按该次序包含：

a. 人巨细胞病毒立即早期1基因（hCMV-IE1）核心启动子，

b. 新城疫病毒（NDV）融合（F）蛋白基因，

c. 转录终止子，

d. 鸡β-肌动蛋白基因核心启动子，

e. 经典型传染性法氏囊病病毒（IBDV）病毒蛋白2（VP2）基因。

这完全不象本发明人在其实验过程中发现的那么简单，因为在现有技术中描述的用于二价或三价构建体（在其他中表达NDV F蛋白基因或IBDV VP2基因）的许多重组npMDV具有严重缺点；它们或者完全不能复制，或者仅能够复制有限数目的循环，或者在体外不显示异源插入片段的表达，并且极少在体内是有效的，或者提供足够的免疫保护。遗传稳定性在测试的大多数情况下差。因此，大多数不适合生成基于重组npMDV的有效疫苗。

类似地，由已知表达盒与单个F蛋白或VP2基因组合制成的重组npMDV也是不成功的；或者不生成后代，或者不可见表达，或者表达由于不稳定性而快速丧失，导致逃避突变体（参见实施例1和图1）。

为了克服这些问题，必须作出非显而易见的选择，并且作出超出例行活动（routine activities）的选择和修饰，以便取得用于表达NDV F蛋白和IBDV VP2蛋白两者的重组npMDV，其的确具有所需水平的遗传稳定性，载体病毒复制能力和异源基因的一致表达。

本发明人发现太强启动子的使用引起所得到的npMDV载体的多价表达盒中的不稳定性，而太弱的启动子不诱导足够的表达或免疫保护。尽管他们不希望受理论束缚，但他们推测使得根据本发明的重组npMDV相对于现有技术载体取得成功的关键特征是：所使用的特定启动子的选择，并组合为调节其相对强度而对这些启动子进行的修饰，以及由这些启动子表达的异源基因在表达盒中相对于彼此的特定次序。这个复杂和特定的特征组合提供了携带多价表达盒的重组npMDV，其具有在稳定性、复制能力和表达水平方面的恰到好处的平衡，以使得这种重组npMDV克服它在体外和体内遇到的所有生物学障碍，并且在使靶动物免疫接种中仍是有效的。

对于本发明，“重组体”是其遗传材料已进行修饰以导致它最初不具有的遗传构成的核酸分子或微生物。

对于本发明，“npMDV”是来自MDV病毒家族的病毒，其显示对家禽很少的致病性或无致病性。优选地，npMDV是天然存在的病毒，或已通过传代进行减毒例如用于用作疫苗的病毒。在更优选的实施方案中，npMDV是MDV2或HVT病毒。取决于效用，这些中的任一种均可以是更优选的，因为它们提供特定优点：MDV2比HVT自然地更加病毒血症化（vireamic），因此当需要根据本发明的重组npMDV的快速传播时，优选的亲本病毒是MDV2，更优选SB1毒株。另一方面，当根据本发明的重组npMDV的安全性是首要的时，HVT是优选亲本病毒，更优选PB1或FC-126毒株。

在甚至更优选的实施方案中，采用根据本发明的重组npMDV的组合，其中重组载体的亲本病毒具有不同类型，例如MDV2和HVT。这个实施方案的优点是极大增强在靶动物内呈递且表达的免疫原性蛋白数目的可能性。每种载体可以包含多种异源基因，直到其中它的稳定性、病毒复制和表达变得受影响的某一最大数目。因此，载体的组合可以递送且呈递比单独的一类载体更多的异源基因。这种来自不同类型的载体组合随后克服现有技术的问题，其中多于一种相同类型载体的接种导致这些之一的过度生长，使得免疫接种仅对于来自载体之一的抗原实现。通过组合根据本发明具有不同类型的npMDV载体，例如基于MDV2和HVT载体的组合，不出现一种相对于其他的明显过度生长。

如本文使用的术语“包含（comprising）”（以及变化诸如“包含（comprise）”、“包含（comprises）”、和“包含（comprised）”）意在指由在其中使用该术语的正文部分、段落、权利要求等覆盖或包括于其中的，对于本发明可设想的所有要素和以任何可能组合的所有要素，即使此类要素或组合并未明确叙述；并且不指排除任何的此类一种或多种要素或组合。

因此，任何此类正文部分、段落、权利要求等因此还可以涉及其中术语“包含（comprising）”（或其变体）替换为术语例如“由……组成（consist of）”、“由……组成（consisting of）”、或“基本上由……组成（consist essentially of）”的一个或多个实施方案。

如果基因不存在于用于生成根据本发明的重组npMDV载体的亲本npMDV中，则该基因对于携带它的npMDV是“异源的”。

术语“基因”用于指示能够编码蛋白的核酸。用于本发明的基因优选编码完整的蛋白，但还可以编码蛋白的区段，例如仅编码成熟形式的蛋白，即不含‘前导区’、‘锚’或‘信号序列’。基因甚至可以编码蛋白的特定区段，例如包含免疫保护性表位的区段。

在那方面，本发明的“蛋白”是氨基酸的分子链。蛋白可以是天然或成熟蛋白、前蛋白（preprotein）或蛋白原（proprotein）、或蛋白的功能片段。尤其地：肽、寡肽和多肽包括在蛋白的定义内。

对于本发明，“包含异源核酸分子”涉及异源核酸分子插入npMDV的基因组内。插入可以通过任何可获得的技术进行，只要所得到的重组npMDV能够展示其安全、稳定和有效的多价抗原表达的有利作用。

优选的插入技术是例如如WO 93/25.665中所述的通过黏粒再生，或如EP 996.738中所述的通过使用杆粒。这基本上采用一组npMDV基因组的重叠亚基因组大片段，以通过共转染到宿主细胞内重构完整的npMDV基因组。因为黏粒之一携带表达盒，所以这变得稳定整合到（随后重组的）npMDV的基因组内。

用于通过黏粒再生将根据本发明的核酸转染到HVT的基因组内的方案概述在图3中描述。

术语“在5'至3'方向上”，也被称为：“在下游方向上”，是本领域众所周知的。它连同术语“按该次序”一起用于指示概括的元件其后需要关于彼此和关于宿主细胞的基因表达机（gene-expression machinery）具有的相对定向，根据本发明的重组npMDV将在所述宿主细胞中复制且表达。如技术人员将认识到的，该定向涉及来自npMDV的双链DNA基因组的为‘编码链’的DNA链，并且它涉及在‘有义’方向上编码的mRNA分子。

虽然如此，并且对上文部分无偏差：在其为‘模板’链的DNA双螺旋的互补链上，所列出元件的相对次序是相同的，但DNA链定向是从3'到5'。

另外，如对于技术人员显而易见的，因为表达盒是自包含的表达模块，所以用于本发明的表达盒整体相对于npMDV基因组的定向不是关键的。这意指核酸分子就整体而言可以以两种定向的任一种整合到npMDV基因组内。例如，当根据本发明的核酸分子插入npMDV基因组的Us区中时，它可以定向为朝向TR阅读或可定向为朝向IR阅读。图1在这方面仅展示这两种可能定向之一。

本发明的“启动子”众所周知是在生物的基因组上的功能区，其指导下游编码区的转录。启动子因此是位于可读框（通常为基因）上游的核酸元件（通常为DNA）。

启动子起始它控制的基因或编码区从‘转录起始位点’（TSS）开始的mRNA合成。产生的mRNA依次从基因的起始密码子开始翻译成蛋白，所述起始密码子是可读框中的第一个ATG序列（mRNA中的第一个AUG）。通常，TSS位于起始密码子上游30-40个核苷酸处。TSS可以通过例如经由RACE技术测序基因mRNA的5'端进行测定。

一般而言，启动子包含在起始密码子的A位置上游1000个核苷酸内，所述A位置一般指示为A+1，并且大多数启动子位于-500和A+1之间。

常见启动子含有许多可识别的调节区，例如涉及调节转录的时间、持续时间、条件和水平的增强子区域。中心启动子区涉及转录因子的结合和指导RNA聚合酶。这一般含有许多保守序列元件例如TATA框、CAAT框和GC框。

启动子的命名法通常基于它控制其表达的基因。例如，术语‘hCMV-IE1基因启动子’指在自然界中驱动来自hCMV的IE1基因表达，并且位于该基因紧密上游的启动子。因为IE1-基因是如此充分记录且可明确识别的基因，并且因为许多疱疹病毒科（herpesvirideae）的基因组已（整体或部分）进行测序，所以此类启动子可以容易地通过常规技术进行鉴定。例如，启动子可以简单地通过大致亚克隆在两个连续基因之间的区进行选择，所述区例如从上游基因的聚A信号到下游基因的TSS。启动子随后通过标准测试进行鉴定：通过怀疑的启动子的亚克隆的更小或更大区段表达标记基因。

因而，“hCMV-IE1”基因启动子是本领域众所周知的，并且可以容易地得自多种商业来源，例如得自用于克隆和表达的商业质粒的供应商。IE1基因也被称作主要IE基因。通常，这个hCMV-IE1基因启动子大小约1.5 kb，并且由增强子、启动子和内含子组成，由此启动子活性进行到内含子区内。hCMV-IE1增强子-启动子区的详细研究由Koedood等人（1995，J. of Virol.，第69卷，第2194-2207页）描述。hCMV-IE1基因启动子可以例如来源于如由Cox等人（2002，Scand. J. Immunol.，第55卷，第14-23页）描述的质粒pI17，或来源于哺乳动物表达载体例如pCMV（Clontech）、或pCMV-MCS（Stratagene；Genbank?登记号AF369966）系列。或者，启动子可以使用常规分子生物学工具和方法得自hCMV病毒的基因组，得自在IE1基因前的区域。

对于本发明，现有技术hCMV-IE1基因启动子不是有效的，因为它在npMDV载体的背景下和在进一步的异源基因由其表达的表达盒中没有展示出所需的强度和稳定性。令人惊讶地发现通过使用hCMV-IE1基因启动子的特定中心部分，“核心”启动子（元件a.），实现了所需特征。在具体实施方案中，这个核心启动子大小仅约361 bp，并且呈现于SEQ ID NO：1中。

然而，对于hCMV-IE1基因核心启动子，许多高度相似的形式是已知的；例如，使用Blast比对用SEQ ID NO：1作为查询针对NCBI's Genbank?的检索，展示在95%同一性水平内的超过60种相似的启动子序列。这些hCMV-IE1启动子的同系物和变体同样可用于本发明，只要使用这种启动子的相似核心区段。

因此，在优选实施方案中，用于本发明的hCMV-IE1基因核心启动子是约361个碱基对的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列全长具有至少95%核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98、99或甚至100%的核苷酸序列同一性，这是优先的次序。

如技术人员清楚地知道的，可以出现hCMV-IE1基因核心启动子以及其他元件的长度中的一些变化，所述其他元件构成插入根据本发明的重组npMDV中的异源核酸分子。这可以由用于克隆和构建的确切条件中的差异所产生；例如由使用不同限制酶位点、PCR克隆引物、或用于适应使用的克隆分子端的不同条件所产生。因而，可以出现构成元件长度中的一些变化。

因此，对于本发明“约361”是：361 ± 25%，优选± 20、15、12、10、8、6、5、4、3、2、1或甚至0%，这是优先的次序。

然而，这在这样的条件下：此类长度差异不影响总体异源核酸分子插入片段的稳定性和功效，则这些长度差异是不重要的，并且视为本发明的部分。

用于在（病毒）载体中表达异源基因的启动子必须能够有效驱动下游编码区的转录。这通常被称为启动子与基因“可操作地连接”，或：基因“处于启动子的控制下”。这通常意指在表达盒中，启动子和基因在相同DNA上连接，处于有效接近中，并且在它们之间没有将干扰有效转录和翻译的信号或序列。

因此，在优选实施方案中，用于本发明的hCMV-IE1基因核心启动子与NDV F蛋白的下游基因“可操作地连接”。

用于本发明的“NDV F蛋白基因”（元件b.）编码来自NDV的融合蛋白。此类基因是众所周知的，并且它们的序列信息是现有技术中从多种通常可获得的质粒构建体中可广泛获得的。或者，它可以使用用于操作RNA病毒的常规技术获得自从自然界中分离的NDV。NDV病毒可以使用血清学或分子生物学容易地鉴定。

用于本发明的F蛋白基因来源于NDV克隆30，常见的缓发型NDV疫苗株；该基因的序列呈现于SEQ ID NO：2中。对于本发明，来自缓发型、中发型或速发型NDV 的F蛋白基因的同系物和变体将同样适用，因为F蛋白基因序列自身在这些不同的NDV致病型中是高度保守的。

因此，对于本发明，NDV F蛋白基因优选是包含这样的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与如SEQ ID NO：2中的核苷酸序列全长具有至少90%核苷酸序列同一性。更优选的是至少92、94、95、96、97、98、99或甚至100%的核苷酸序列同一性，这是优先的次序。

或者，为了进一步改善由根据本发明的核酸分子表达的异源蛋白的免疫功效，可对异源基因实施密码子优化。密码子优化的方法是本领域众所周知的，并且涉及编码蛋白的核苷酸序列的改变，以编码与原始编码序列相同的氨基酸，但它具有其他核苷酸；即进行的突变是基本上沉默的。这可以改进编码序列在不同于所表达基因起源的生物背景下表达的水平。

本发明人已发现为了实现所需复制稳定性和表达效率，必需有意将在根据本发明的核酸分子中的两种异源基因的转录分开，从而生成两种单独的mRNA。因此，需要在下述两个编码区之间引入转录终止子：NDV F蛋白基因的下游和Ch ?-肌动蛋白基因核心启动子的上游。

“转录终止子”（元件c.）众所周知是调节核酸区，其引起通过RNA聚合酶的编码DNA序列转录的终止。通常，‘内在型终止’由所生成的mRNA中的茎环结构引起，所述茎环结构包含富含G-C的序列，随后为富含U的序列。大多数基因包含在其编码序列下游端处的转录终止子，并且对于本发明，使用何种终止子不是关键的，只要实现下游F蛋白基因的有效转录终止，并且阻止进入VP2编码区的‘通读’转录。可以用于本发明的方便的转录终止子的一个实例是在SEQ ID NO：3中所述的hCMV-IE1基因转录终止子。

“鸡β-肌动蛋白基因启动子”（ Ch ?-肌动蛋白基因启动子）是现有技术众所周知的，并且许多质粒构建体和商业表达载体采用这种启动子。它首先由Kost等人（1983，Nucl. Acids Res.，第11卷，第8287-8301页）描述，参见Genbank登记号：X00182。随后制备许多变体，例如杂合启动子（Tsukamoto等人，2002，J. of Virol.，第76卷，第5637-5645页）。在EP 351.585中，发明人通过改变剪接受体位点来修饰Ch ?-肌动蛋白基因启动子，以使得其高达10倍多的多产性：位于Ch ?-肌动蛋白基因启动子-7处的原始剪接受体位点替换为来自兔珠蛋白基因的第三内含子的剪接受体位点；所得到的经修饰的Ch ?-肌动蛋白基因启动子在Genbank登记号：E03011中描述，并且用于Genbank登记号：AJ575208中所述的质粒中。

对于本发明，测试了这种经修饰的Ch ?-肌动蛋白基因启动子，但它是无效的；它需要进一步的重大改变，以提供所需强度和稳定性平衡，用于npMDV多价表达载体的背景下。这通过缺失该Ch ?-肌动蛋白基因启动子中的大部分内含子来实现。所得到的仅包含该启动子的核心区的经改变的启动子是Ch ?-肌动蛋白基因核心启动子（元件d.），其大小约696 bp并且呈现为SEQ ID NO.：4。

然而，如同上文描述的经修饰的hCMV-IE1基因核心启动子的情况，许多高度相似形式的Ch ?-肌动蛋白基因核心启动子是已知的。此类Ch ?-肌动蛋白基因核心启动子的同系物和变体同样可用于本发明，只要使用这种启动子的相似核心区段。

因此，在优选实施方案中，用于本发明的Ch ?-肌动蛋白基因核心启动子是具有约696个碱基对的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：4中的核苷酸序列全长具有至少95%核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98、99或甚至100%的核苷酸序列同一性，这是优先的次序。

如上所述，不影响根据本发明的总体核酸分子的稳定性和功效的长度差异视为本发明的部分。因此，对于本发明“约696”是：696 ± 25%，优选± 20、15、12、10、8、6、5、4、3、2、1或甚至0%，这是优先的次序。

根据本发明的Ch ?-肌动蛋白基因核心启动子需要与下游经典IBDV VP2基因“可操作地连接”。

用于本发明的“经典型IBDV VP2基因”（元件e.）编码来自为经典类型的IBDV的VP2蛋白。此类基因是众所周知的，并且它们的序列信息是现有技术中可容易获得的，参见例如. Genbank登记号：D00869（F52/70）、D00499（STC）或AF499929（D78）。或者，这种基因可以使用用于操作双RNA病毒的常规技术得自从自然界中分离的经典IBDV的基因组。经典型IBDV可以使用血清学或分子生物学容易地鉴定。

用于本发明的VP2基因来源于经典IBDV毒株Faragher 52/70；该基因的序列呈现于SEQ ID NO：5中。对于本发明，VP2基因的同系物和变体将同样适用，只要它们是经典血清型。

因为此类VP2蛋白基因通常共享多于90%核苷酸序列同一性，因此，对于本发明，经典IBDV VP2基因优选是包含这样的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与如SEQ ID NO：5中的核苷酸序列全长具有至少90%核苷酸序列同一性。更优选的是至少92、94、95、96、97、98、99或甚至100%的核苷酸序列同一性，这是优先的次序。

根据本发明的重组npMDV可以通过常见技术产生，主要通过在鸡原代细胞通常为鸡胚成纤维细胞（CEF）的体外培养中扩增。这些可以通过鸡胚的胰蛋白酶消化进行制备。将CEF铺为单层并且用npMDV感染。该方法可以将规模扩大到工业规模的生产。

通常，收获仍完整的受感染的宿主细胞，以获得以其细胞伴随的（cell-associated）形式的重组npMDV。将这些细胞吸收于适当的载体组合物中以提供稳定作用用于贮存和冷冻。接下来，受感染细胞通常被装填到玻璃安瓿内，将所述玻璃安瓿密封、冷冻且贮存于液氮中。这样它们可以在所谓的‘冷链’物流中转运至世界各地的使用者。

在其中冷链不可行，并且根据本发明的npMDV是重组HVT的情况下，替代方案是使用冷冻干燥。这采用HVT的有利特征，即它可以例如通过在培养结束时的超声处理从其宿主细胞中分离，吸收到稳定剂内，并且冷冻干燥用于稳定贮存。

在根据本发明的重组npMDV的优选实施方案中，在表达盒中包含进一步的遗传元件：另外的转录终止子（元件f.）存在于根据本发明的核酸中的经典IBDV VP2基因下游。这用于保证VP2基因表达的转录终止，其不依赖于侧接表达盒3'侧的npMDV基因组区的组成。

与F蛋白基因下游的终止子（元件c.）相比较，VP2下游的转录终止子（元件f.）可以是相同或不同的，只要提供适当的转录终止并且稳定性和表达不受影响。

在进一步优选的实施方案中，在根据本发明的核酸中的经典IBDV VP2基因的3'侧处的转录终止子（元件f.）来源于猫疱疹病毒1（FHV1），来自FHV1 Us9下游的FHV1 Us/TRs连接部。这例如在Genbank登记号：D42113中描述，并且用于本发明的一个实施方案的序列呈现于SEQ ID NO：6中。

在优选实施方案中，根据本发明的重组npMDV包含如呈现于SEQ ID NO：7中和如图2中所述的核苷酸序列。

应当指出SEQ ID NO：7中提供的序列是对于来自重组npMDV构建体HVP309的表达盒确定的实际核苷酸序列，其已从转染后选择的蚀斑扩增用于6次组织培养传代。

因此，在进一步方面，本发明涉及用于根据本发明的重组npMDV的构建的核酸分子，所述核酸分子在5'至3'方向上并按该次序包含：

a. hCMV-IE1核心启动子，

b. NDV F蛋白基因，

c. 转录终止子，

d. 鸡β-肌动蛋白基因核心启动子，

e. 经典型IBDV VP2 基因，

f. 转录终止子。

根据本发明的核酸分子是用于本发明的表达盒。

在优选实施方案中，根据本发明的核酸分子具有如呈现于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列。

所有根据本发明的重组npMDV、核酸分子和重组DNA分子的生成、构建和装配可以通过众所周知的分子生物学技术来完成，其涉及克隆、转染、重组、选择和扩增。

这些及其他分子生物学技术在如下述标准教科书中更详细地说明：Sambrook和Russell：“Molecular cloning：a laboratory manual”（2001，Cold Spring Harbour Laboratory Press；ISBN：0879695773）；Ausubel等人，于：Current Protocols in Molecular Biology（J. Wiley and Sons Inc，NY，2003，ISBN：047150338X）；C. Dieffenbach和G. Dveksler：“PCR primers：a laboratory manual”（CSHL Press，ISBN 0879696540）；和“PCR protocols”，由：J. Bartlett和D. Stirling（Humana press，ISBN：0896036421）。

为了根据本发明的核酸分子的方便构建和为了其生成根据本发明的重组npMDV的用途，核酸自身可以包含在更大的核酸分子中。

因此，在进一步方面，本发明涉及包含根据本发明的核酸分子的重组DNA分子。

优选地，此类根据本发明的重组DNA分子是常见克隆质粒，例如如来源于pBR322或pUC系列。这些是广泛商购可得的。

当根据本发明的重组DNA分子设置用于在转染方案中使用时，它通常被称为‘转移载体’、‘穿梭载体’或‘供体质粒’。在这种情况下，根据本发明的核酸分子可以在两侧上由来源于npMDV基因组的序列侧接。这些允许同源重组，并且指导插入（在所需定向上）npMDV基因组上的靶遗传插入基因座。

或者，根据本发明的重组DNA分子可以是用于黏粒再生的黏粒构建体。

通常，在转染中使用的转移载体自身不整合到活的重组载体微生物的基因组内，它仅促进它携带的表达盒的整合。

充当用于本发明的转移载体的根据本发明的重组DNA分子的实例是图4中所示的质粒p435vec9。

根据本发明的重组npMDV包含在单个遗传插入基因座中的根据本发明的核酸分子。许多插入基因座对于npMDV是已知的，并且原则上这些都适合于在本发明中使用，只要插入的多价表达盒能够展示它的稳定和有效性质。由于实际原因，某些基因座是优选的，例如因为用于构建和分析的必需分子生物学工具是可获得的。在这点上，对于本发明，在npMDV基因组的Us区中的遗传插入基因座的使用是优选的。

因此，在根据本发明的重组npMDV的优选实施方案中，将异源核酸分子插入重组npMDV的基因组内的Us区中。

通过采用npMDV基因组的Us2基因或Us10基因作为用于本发明的单个遗传插入基因座，可以制备对于本发明特别合适和有效的npMDV重组体。

因此，在根据本发明的重组npMDV的优选实施方案中，将异源核酸分子插入重组npMDV的基因组内的Us2基因或Us10基因中。

对于本发明，术语“在Us2基因中”和“在Us10基因中”意在指示插入已在包含Us2或Us10基因的npMDV基因组区中进行；这可以指这些基因中任一个的启动子或编码区。另外，如所述的，插入的内托作用（netto effect）自身可以是插入、缺失或中性替换。此类插入的期望后果是Us2或Us10基因的正常编码功能在所得到的重组npMDV中被扰乱。

根据本发明的重组npMDV是活的重组载体微生物，或“载体”病毒，其有利地用于家禽接种。在这个效用中，它是安全的，因为即使在超幼龄时应用，它也不引起负面接种反应，例如任何疾病或感染体征，或接种动物的生长或发育中的降低。进一步地，重组npMDV在细胞培养中（在体外）或在靶动物中（在体内）的复制中是稳定的。另外，重组npMDV提供了它携带的两种异源基因的强烈且一致的表达（在体外和在体内）：NDV F蛋白基因和经典IBDV VP2基因。最后，通过它在靶动物中的复制和表达，它提供了所表达异源基因对靶免疫系统的有效呈递。这生成有效的免疫应答，其保护接种的靶动物不受由NDV和IBDV引起的感染和/或疾病。此外，npMDV重组体提供了针对MDV的免疫保护。

对于本发明“稳定的”意指根据本发明的重组npMDV的遗传构成在后续病毒复制轮次中不显著改变；在实践中，这将意指一种或两种插入的异源基因的表达丧失。这可以例如方便地用常规技术进行监控，例如通过对根据本发明的重组npMDV实施在细胞培养中的后续传代，随后为在动物中的传代。再分离的病毒随后在细胞培养皿中铺平板，用琼脂覆盖，并且孵育直到蚀斑变得可见；全部使用常规技术。接下来，在免疫荧光测定（IFA）方案中使用合适的抗体制剂，将蚀斑对F或VP2蛋白的表达染色。记录不再表达一种或两种蛋白的蚀斑数目，由此应例如通过UV显微镜检查来监控至少100个单独的蚀斑。

严格稳定性测试是应用15次连续组织培养传代，随后接种到靶动物内，以在攻击-感染实验中评价剩余效价。

如技术人员将理解的，在此类密集传代的情况下，不能保证绝对（100%）稳定性，因为始终可以出现一定水平的自然本底突变。这并非显著不稳定性的征兆；事实上，展示优于95%遗传稳定性的重组载体病毒原则上适合于疫苗生产和在靶动物中的使用，尽管在目前情况下实现好得多的稳定性。

令人惊讶地发现在如上所述的严格稳定性测试中，根据本发明的重组npMDV在多于95%的再分离蚀斑中维持两种异源基因的稳定表达。事实上，在几个测试中，仅发现极低百分比的蚀斑（0%-0.3%）不再表达异源基因之一（实施例5）。另外，当这些传代的重组npMDV在靶动物中进行测试时，它们仍能够提供极佳的针对NDV和IBDV感染的免疫保护（实施例6和7）。

这是相对于用现有技术npMDV重组体和在本发明的实验过程中制备且测试的不成功重组体（参见实施例1）发现的结果的有力改进。此类不成功的重组npMDV通常在转染后不产生可以扩增多轮的蚀斑，或仅显示异源蛋白的极弱表达，或在少数几轮扩增循环后丧失表达。一些构建体可以在动物中测试时扩增，但不提供免疫应答，因为发现这些重组npMDV中的大多数在再分离后已丧失表达异源基因（之一）的能力。

因此，在优选实施方案中，根据本发明的重组npMDV特征在于在细胞培养中15次连续传代后，多于95%的所述重组病毒维持两种异源蛋白的表达。

在进一步优选的实施方案中，多于96、97、98、99、99.5、99.7或100%的重组病毒维持两种异源蛋白的表达，这是优先的次序。

通过转染方法例如如上文描述和下文例示的黏粒再生，根据本发明的核酸分子和/或重组DNA分子可以用于获得根据本发明的重组npMDV，其包含在其基因组上的单个遗传插入基因座中稳定整合的根据本发明的核酸分子。

因此，本发明的进一步方面涉及用于制备根据本发明的重组npMDV的方法，所述方法包括将根据本发明的核酸分子插入在npMDV的基因组上的单个遗传插入基因座中。

通过使用根据本发明的重组DNA分子作为转移载体，可以方便地进行根据本发明的核酸分子插入npMDV基因组内，以生成根据本发明的重组npMDV。

尽管根据本发明的完整核酸分子直接插入npMDV基因组内是生成根据本发明的重组npMDV的优选方法，但存在其中可以生成此类重组npMDV的其他众所周知的方法。例如通过在单个或多个轮次转染中，将根据本发明的核酸分子的部分插入npMDV内。这些部分可以以这样的方式设计，使得在所有部分都整合后，全部插入片段形成本发明的完整表达盒，例如通过采用重叠区以控制部分的次序和定向。

如所述的，npMDV通常在原代细胞培养物中扩增，并且所得到的npMDV疫苗可以作为无细胞产品供应，或（在HVT作为亲本病毒的情况下）以冷冻干燥形式储存。然而，并且优选地，npMDV疫苗作为细胞结合产品供应，其包含由npMDV感染的收获的CEF细胞。

类似地，根据本发明例如以质粒形式的核酸分子和重组DNA分子通常通过将其引入细菌细胞内进行扩增，所述细菌细胞随后提供复制和扩增；黏粒可以使用λ噬菌体进行扩增。例如，大肠杆菌（Escherichia coli）细菌的专用实验室株是通常应用的，并且可广泛得自商业供应商。方便地，这些可以作为准备通过常见技术例如电穿孔或热激引入DNA的感受态细胞来购买。

因此，在进一步方面，本发明涉及包含所有根据本发明的重组npMDV、核酸分子或重组DNA分子的宿主细胞。

本发明的“宿主细胞”优选是用于与根据本发明的核酸或重组DNA分子使用的大肠杆菌细菌细胞。另外，用于本发明的宿主细胞优选是用于与根据本发明的重组npMDV使用的CEF。

如所述的，根据本发明的重组npMDV的有利用途是在用于家禽的疫苗中。

因此，在进一步方面，本发明涉及用于家禽的疫苗，其包含两者均根据本发明的重组npMDV或宿主细胞、和药学上可接受的载体。

“疫苗”众所周知是在药学上可接受的载体中包含免疫活性化合物的组合物。“免疫活性化合物”或“抗原”是由靶免疫系统识别且诱导免疫应答的分子。应答可以源于先天性或获得性免疫系统，并且可以是细胞和/或体液类型。

疫苗诱导帮助预防、改善、降低对疾病或病症的敏感性、或治疗疾病或病症的免疫应答，所述疾病或病症产生于由微生物的感染。保护作为施用来源于该微生物的至少一种抗原的结果而实现。这将引起靶动物显示由微生物引起的临床体征数目或强度中的降低。这可以是通过微生物的侵入、集落形成或感染率降低的结果，导致由微生物或对其的靶应答引起的损害和影响的数目或严重性中的降低。

用于本发明的术语“家禽”指对用npMDV接种敏感的鸟类的任何物种；优选靶物种是鸡、火鸡和鸭；其中鸡是最优选物种。

靶鸟类可以是产蛋者、育种者、组合品种或此类品种中的任何的亲本品系。

待接种的家禽的年龄、重量、性别、免疫状态及其他参数不是关键的，尽管给健康靶接种，并且尽可能早地接种以预防任何野外感染（的后果）是明显有利的。

根据本发明的疫苗优选以细胞伴随的形式应用，由此将由此类重组npMDV感染的宿主细胞接种到靶动物内。

“药学上可接受的载体”意在帮助疫苗的稳定和施用，而不引起对它对其施用的靶动物的健康的（严重）不良反应。此类载体可以例如是无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以例如是缓冲液，其可以包含进一步的添加剂，例如稳定剂或防腐剂。细节和实例例如在众所周知的手册中描述例如：“Remington：the science and practice of pharmacy”（2000，Lippincott，USA，ISBN：683306472），和：“Veterinary vaccinology”（P. Pastoret等人编辑，1997，Elsevier，Amsterdam，ISBN 0444819681）。

对于本发明，当疫苗是基于细胞的时，则载体优选是培养基与血清（约10%）和DMSO（约6%）的混合物。血清可以是常规用于细胞培养的任何血清，例如胎牛血清或新生小牛血清。

根据本发明的疫苗通过如本文描述的方法从根据本发明的活的重组npMDV制备，所述方法可容易地由本领域技术人员应用。例如，根据本发明的重组npMDV通过转染和重组进行构建，并且所需重组npMDV如本文描述的进行选择。接下来，重组npMDV载体病毒以更小或更大体积工业生产。尽管在宿主动物中的生产是可能的，但在体外培养物例如CEF中的增殖是优选的。从此类培养物中收获作为全细胞或细胞超声处理物的包含病毒的悬浮液，将这种悬浮液配制成疫苗且将最终产品包装。在对质量、数量和无菌度的广泛测试后，此类疫苗产品投放出售。

适用于疫苗制备的一般技术和考虑是本领域众所周知的，并且例如在政府法规（药典）和手册例如“Veterinary vaccinology”和“Remington”（两者同上）中描述。

根据本发明的疫苗原则上可以通过不同应用途径和在其寿命的不同点时给予靶家禽，只要接种的重组npMDV可以建立保护性感染。

然而，因为由MDV、NDV或IBDV的感染可以已在超幼龄时建立，所以尽可能早地应用根据本发明的疫苗是有利的。根据本发明的疫苗优选在孵化当天时（“第1天”）或在鸡胚中例如在ED18天时应用。在工业规模上用于自动注射到蛋内的合适设备是商购可得的。这提供了最早的可能保护，同时使劳力成本降到最低。

因此，在优选实施方案中，根据本发明的疫苗在鸡胚中施用。

不同的鸡胚接种途径是已知的，例如向卵黄囊中、向胚胎中或向尿囊液腔中；这些可以根据需要进行优化。优选地，鸡胚接种进行，使得针实际上接触胚胎。

或者，可以应用个别幼鸟的肠胃外接种。这优选肌内或皮下应用。

根据本发明适合于注射的疫苗制剂是例如悬浮液、溶液、分散液或乳状液。

依赖根据本发明的疫苗的应用途径，可能需要改变疫苗组合物。这完全在技术人员的能力内，并且一般涉及疫苗功效或安全性的细调。这可以通过下述来完成：改变疫苗剂量、数量、频率、途径，通过使用以另一种形式或制剂的疫苗，或通过改变疫苗的其他组成成分（例如稳定剂或佐剂）。

例如，为了适合于在鸡胚应用，疫苗组合物需要是非常温和的，以便不降低蛋的孵化率。然而，即使这样，仍可以出现孵化率中的一些降低，例如由通过接种自身、感染等对胚胎的机械损害导致。

除了由根据本发明的核酸分子提供的遗传稳定性外，通过采用建立的安全npMDV疫苗株，例如HVT疫苗株PB1或FC-126，作为根据本发明的重组npMDV的亲本病毒，还提供了根据本发明的疫苗的安全性。或者，MDV2疫苗株SB1。所有这些都是一般可获得的（来自ATCC：VR # 584-C的FC-126；并且PB1和SB1由MSD Animal Health商业化），并且已知适合于接种幼鸟或胚胎。异源核酸的掺入不增加亲本npMDV的毒力或致病性（相反），并且不期望毒力的逆转，因为npMDV是天然无致病性的。

疫苗的每动物剂量的根据本发明的重组npMDV的确切量不是关键的，因为它将是用于灭活型疫苗的；因为重组npMDV是活的，所以它将自身复制，并且从而在靶动物中繁殖直到生物学上可以忍受的病毒血症水平。原则上，疫苗剂量仅需要足以起始此类产毒性感染。更高的接种物剂量并不缩短在宿主中达到最佳病毒血症感染花费的时间。因此，极高剂量不是有效的，因为病毒血症不能高于自然平衡，并且另外，此类极高接种物剂量由于经济原因而没有吸引力。

优选的接种物剂量因此是每动物剂量1x10^2至1x10^6蚀斑形成单位（pfu）的npMDV载体病毒，更优选1x10^2至1x10^5 pfu/剂量，甚至更优选1x10^3至1x10^4 pfu/剂量；最优选1500至5000 pfu/剂量。当根据本发明的疫苗是细胞伴随时，这些数目的重组npMDV包含在受感染的宿主细胞中。在那种情况下，一个动物剂量包含100-10.000个受感染的宿主细胞，优选每剂量100-5000个受感染细胞，更优选：每剂量200-2000个受感染细胞。

计数根据本发明的重组npMDV的病毒颗粒的方法是众所周知的。

根据本发明的疫苗的免疫有效量的测定完全是技术人员力所能及的，例如通过监控在接种后的免疫应答，或在攻击感染后例如通过病原体的再分离，或通过监控疾病的靶临床体征或血清学参数，并且比较这些与模拟接种动物中可见的应答。

用于将根据本发明的疫苗应用于靶生物的给药方案可以在单个或多个剂量中，所述剂量可以同时或顺次给予，以与疫苗制剂相容的方式，以及以此类将是免疫学有效的量。

根据本发明的疫苗可以用于预防和/或治疗性处理，并且因此干扰感染或其疾病临床症状的建立和/或进展。

根据本发明的疫苗可以有效充当引发接种，其随后可以跟随加强接种并且通过加强接种扩大，例如再一次使用相同疫苗，或使用经典灭活且佐剂化的全病毒疫苗。

用于施用根据本发明的疫苗的方案理想地整合到其他疫苗的现有接种时间表内。

优选地，根据本发明的疫苗仅在孵化当天时或在ED第18天时鸡胚中应用一次。

每动物剂量的根据本发明的重组npMDV的体积可以根据预期应用途径进行优化：鸡胚接种通常用0.05-0.5 ml/蛋的体积应用，并且肠胃外注射通常用0.1-1 ml/鸟的体积完成。

疫苗剂量体积的优化完全在技术人员的能力内。

不言而喻的是将其他化合物例如稳定剂、载体、稀释剂、乳化剂等与根据本发明的疫苗混合也在本发明的范围内。此类添加剂描述于众所周知的手册例如：“Remington”和“Veterinary Vaccinology”（两者同上）。

使用如上所述的适当的制剂、剂量和应用优化，根据本发明的疫苗能够由于在超幼龄时的单次接种而保护家禽不受MDV、NDV和IBDV。因为npMDV提供持续性感染，所以提供的保护具有极佳的免疫持续时间，其良好持续到在约20-25周龄时的产蛋开始。保护的有效性可以不同方式例如临床评分、血清学、（组织）病理学等进行评价。

根据本发明有效的疫苗是对于NDV和IBDV的‘标记疫苗’，因为它生成的免疫仅针对来自这些病毒的一种蛋白。这允许“区分受感染和接种的动物”，所谓的DIVA法。这可以方便地通过血清学测定例如ELISA或免疫荧光测定进行检测。

除了根据本发明的疫苗提供的多价免疫保护（针对NDV和IBDV；和加上针对MDV）外，通过添加进一步的抗原化合物制备进一步组合是有利的，以便增强已提供的免疫保护或以扩展到其他病原体。原则上，这可以是任何活的或被杀死的微生物或亚单位抗原，只要这不负面干扰根据本发明的疫苗的安全性、稳定性和功效。

因此，在优选实施方案中，根据本发明的疫苗包含至少一种另外的免疫活性组分。

此类“另外的一种或多种免疫活性组分”可以是抗原、免疫增强物质、细胞因子和/或疫苗。这提供了在成本、效率和动物福利方面的优点。或者，根据本发明的疫苗自身可以加入疫苗中。

在更优选的实施方案中，至少一种另外的免疫活性组分是对家禽致病性的微生物；微生物自身可以是重组生物，例如表达免疫保护性蛋白。或者，至少一种另外的免疫活性组分是来源于对家禽致病性的微生物的（亚单位）抗原。这可以以任何合适的方式例如‘来源’于微生物提取物或匀浆物，或作为来自重组表达核酸的产物，所述核酸已来源于编码来自对家禽致病性的微生物的抗原蛋白的区域。

另外的微生物优选选自下述，和/或另外的抗原优选来源于选自下述的微生物：

- 病毒：传染性支气管炎病毒、NDV、腺病毒、减蛋综合征病毒、IBDV、鸡贫血病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒、鸭瘟病毒（鸭病毒性肠炎）、鸽痘病毒、MDV、禽白血病病毒、ILTV、禽肺病毒和呼肠孤病毒；

- 细菌；大肠杆菌、沙门氏菌属（Salmonella）物种、鼻气管鸟杆菌（Ornitobacterium rhinotracheale）、副鸡嗜血杆菌（Haemophilis paragallinarum）、多杀巴斯德杆菌（Pasteurella multocida）、红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、丹毒种（Erysipelas spec.）、支原体属（Mycoplasma）物种和梭菌属（Clostridium）物种；

- 寄生虫：艾美虫属（Eimeria）物种；和

- 真菌：例如曲霉属（Aspergillus）物种。

在根据本发明的疫苗的更优选的实施方案中，另外的免疫活性组分选自MDV、NDV和IBDV，或其任何组合。此类另外的组分用于改进且扩展提供的免疫原性。这在其中MDV、NDV或IBDV的超强毒野生株流行的那些情况下或地理区域中是有利的。

在这点上，npMDV与MDV1、MDV2或HVT的组合是已知的的；对于本发明，MDV毒株Rispens（MDV1）、毒株SB1（MDV2）或毒株FC-126或PB1（HVT）优选作为另外的免疫活性组分。

为了改进针对NDV的应答，根据本发明的重组npMDV可以与NDV疫苗株例如温和的活NDV疫苗株C2组合。

类似地，为了改进针对IBDV的应答，根据本发明的重组npMDV可以与温和的活IBDV疫苗株例如D78、PBG98、Cu-1、ST-12或89-03组合。

如技术人员将理解的，这些‘组合’还包括其中根据本发明的重组npMDV和另外的免疫活性组分不同时应用的接种时间表；例如重组npMDV可以在鸡胚中应用，并且NDV C2和/或IBDV 89-03毒株可以在第一天应用。

因此，在根据本发明包含至少一种另外的免疫活性组分的疫苗的更优选实施方案中，所述至少一种另外的免疫活性组分是选自下述疫苗株的微生物：MDV、NDV和IBDV，或其任何组合。

更优选地，另外的免疫活性组分选自：MDV Rispens、MDV SB1、NDV C2、IBDV D78和IBDV 89-03。

组合疫苗可以以多种方式进行制备：通过组合病毒或宿主细胞制剂，或这些的混合物；全部都并入本发明中。在优选实施方案中，此类组合疫苗的组分方便地分开产生，并且随后组合且装填到相同的疫苗容器内。

通过上文描述和下文例示的方法，可以获得根据本发明的疫苗。

因此，本发明的进一步方面涉及用于制备根据本发明的疫苗的方法，所述方法包括下述步骤：

- 用根据本发明的重组npMDV感染宿主细胞，

- 收获受感染的宿主细胞，和

- 将收获的受感染的宿主细胞与药学上可接受的载体混合。

用于本发明的合适宿主细胞和药学上可接受的载体已在上文得到描述。另外，用于感染、培养和收获的合适方法是本领域众所周知的，并且在本文中描述且例示。

如上文详细概述的，根据本发明的重组npMDV可以有利地应用于家禽疫苗中，提供针对MDV、NDV和IBDV的安全、稳定和有效的接种，其可以在超幼龄时施用于家禽。

因此，本发明的进一步方面涉及用于家禽疫苗中的根据本发明的重组npMDV。

‘用于疫苗中’的不同方面和实施方案已在上文进行概述，并且包含作为无细胞病毒或作为细胞伴随的病毒用于用于接种家禽的不同疫苗组合物中。

因而，本发明的不同方面和实施方案可以有利地用于产生安全、稳定和有效的用于家禽的疫苗。

因此，在进一步方面，本发明涉及所有根据本发明的重组npMDV、核酸分子、重组DNA分子或宿主细胞或其任何组合用于制造用于家禽的疫苗的用途。

如上文描述的，和如下文例示的，根据本发明的疫苗可以通过在超幼龄时的单次接种，有利地用于在家禽中提供针对许多疾病的安全和有效的免疫保护。

因此，在进一步方面，本发明涉及家禽接种的方法，其包括用根据本发明的疫苗接种所述家禽的步骤。

关于用根据本发明的疫苗接种家禽的细节已在上文描述；具体地，通过一日龄雏鸡的肌内接种或皮下接种，以及18日龄胚胎的鸡胚中接种。

本发明现在将参考下述非限制性实施例进行进一步描述。

实施例

1. 测试的不同表达盒装配：

（关于所述构建体的图示参见图1，并且关于结果概述参见表1）

1.1. HVT-F和HVT-VP2：

两种重组HVT已用单一基因表达盒进行构建；其包含NDV克隆30 F蛋白基因，或来自经典型IBDV毒株Faragher 52/70的VP2基因。两者使用不同的启动子：F蛋白基因由劳斯肉瘤病毒LTR启动子驱动，并且VP2基因由hCMV-IE1基因核心启动子驱动。两个表达盒均已（通过体外同源重组）引入亲株PB1的HVT基因组的Us10基因内。HVT-F重组体与商业疫苗Innovax? ND中使用的那种相同。

两种重组体关于稳定性、病毒血症和表达均表现良好。

当这两种重组HVT在一次接种中组合；在4周后接种的鸡的再分离显示两种中的仅一种可以以显著数目再分离，而另一种为较小量。相互排斥不是总影响同一构建体：有时HVT-F存活，有时HVT-VP2存活。

体内病毒血症测定为在接种后二或三周时，取自接种雏鸡的血样中由（重组）HVT感染的外周血淋巴细胞（PBL）百分比。

体内保护如下测定：NDV保护通过对在用致死剂量的强毒NDV病毒攻击后的存活雏鸡进行评分来测量。IBDV保护通过粘液囊中的淋巴细胞耗竭的组织学测定进行测量；使用的评分系统从对于完全耗竭（无保护）的5运行到对于完全保护（无耗竭）的0。

1.2. HVP163：

命名为HVP163的重组HVT包含在PB1 HVT毒株的Us10中的表达盒，其为HVT-F和HVT-VP2重组体中的两个盒的组合：IE/VP2启动子+基因区段是LTR/F区段的上游。将转录终止子引入F蛋白基因下游，其来源于FHV1的Us/TRs连接部；VP2已具有终止子，即hCMV-IE1基因的终止子。

这个重组体表现不佳；无法检测到F蛋白基因的表达。

1.3. HVP193：

在关于HVP193的表达盒中，通过NcoI-EcoRI限制酶消化将LTR启动子替换为强启动子：嵌合鸡β-肌动蛋白基因启动子，其作为长1.34 kb的元件，来源于Genbank登记号AJ575208。

虽然VP2和F异源蛋白两者的表达均是明确可检测的，但与亲本PB1株的复制相比较，在体内的复制差。

这还由使用HVP193的接种攻击测试的结果反映（在下文关于HVP204的部分中描述），其中接种HVP193的雏鸡仅17%被保护不受致死性NDV攻击感染。

1.4. HVP204：

HVT重组HVP204包含超过HVP193的两种进一步改变：交换VP2和F蛋白基因的相对次序，以及驱动这些基因的启动子。在所得到的表达盒中，F蛋白基因目前位于VP2基因上游，并且F蛋白基因目前由hCMV-IE1基因核心启动子驱动；下游VP2基因由（嵌合）β-肌动蛋白基因启动子驱动。用VP2-和F-蛋白特异性抗体的IFA染色证实两种基因在受感染的CEF单层中的功能表达。病毒血症水平在接种后（p.i.）15或22天时在接种的鸡的PBL中进行测试。结果显示HVP204的体内复制比HVP193的复制改进很多，但未接近野生型病毒血症水平。

在一日龄时接种后三周，使用两种单独的HVP204分离物，针对用NDV的致死攻击或用IBDV的严重攻击，测试体内保护能力。

通过HVP204的NDV保护是47%；IBDV保护几乎是完全的，具有0-0.5的损害得分。

然而，HVP205重组HVT的遗传稳定性是不足够的，因为在第10次连续细胞培养传代后，高达26%的重组体丧失表达两种异源基因之一的能力。

1.5. HVP216：

令人惊讶地发现对Chβ-肌动蛋白启动子的重大改变得到这样的重组HVT，其具有需要的遗传稳定性，同时维持（且甚至改进）其他复制和表达性质。如在HVP193和HVP204中使用的对嵌合鸡β-肌动蛋白基因启动子作出的修改，是内含子的大部分的缺失，所述内含子在这个Chβ-肌动蛋白基因启动子中位于起始密码子上游。这可以方便地通过用Eco47III和NaeI的限制酶消化来完成。这导致来自启动子的内含子的675 bp的缺失（由来自NcoI-EcoRI片段的核苷酸807-1483表示），所述NcoI-EcoRI片段自身延伸自核苷酸394-1734（均关于Genbank登记号：AJ575208中的质粒）。将所得到的β-肌动蛋白基因启动子的核心版本用于替换在PB1亲株的Us10基因座中在HVP204表达盒内的长版本。

所得到的重组HVP216具有所需遗传稳定性，以及极佳的复制和表达性质：用VP2-和F-特异性抗体的IFA染色证实来自HVP216病毒的两种基因的功能表达，所述HVP216病毒已在CEF细胞培养物上细胞传代多于10次。

通过HVP216的免疫保护在一系列实验中进行测试：IBDV攻击试验使用在一日龄时（sc）接种和在第21天攻击的MDA+雏鸡。耗竭得分证实PB1不给予保护（得分4.5），但极佳的IBDV攻击保护由下述提供：HVT-VP2：1.0；HVP204：0；HVP216：0和0.5（两个平行分离物）。

NDV攻击保护在SPF雏鸡接种后3或4周时进行测试：PB1提供可忽略不计的保护，而HVP216在接种后(p.v) 4周时保护高达90%的雏鸡。

1.6. HVP309：

HVP309重组HVT再次与HVP216的那些的不同之处在于：使用不同基因组插入基因座用于将HVP216的表达盒插入HVT亲本病毒株FC-126毒株的Us2基因内，由此重组体通过黏粒再生而生成。所得到的重组HVP309显示在复制、表达、遗传稳定性和接种功效的测试中的极佳结果（参见下文实施例），如同HVP216一样。

表1：关于测试的不同表达盒的结果概括

x  不适用/未测试

LTR  RSV LTR启动子

IE     hCMV-IE1核心启动子

?-act  鸡β肌动蛋白基因启动子

F  NDV F基因

VP2   经典IBDV VP2基因。

2. 通过黏粒再生的转染

用于转染、重组、选择和扩增的一般方法基本上如Sondermeijer等人，1993（同上）和EP 431.668中所述。

HVP309的黏粒再生基本上如WO 93/25665（例如该参考文献的图8）中所述进行。为了允许整合到FC-126 HVT基因组的Us区内，由WO 93/25665中的黏粒编号378-50覆盖的区域目前由三个更小质粒提供：pSY640和556-60.6，以及一个转移质粒（p435vec9），其重叠这两个，并且含有Us2基因座中的表达盒。

亚基因组克隆pSY640得自黏粒378-50，其含有HVT FC-126基因组的（29.6 kb）BamHI-A大片段，编码Us的全部以及侧翼IRs和TRs的大部分。这通过将378-50插入片段中的Us2中的StuI限制酶位点更换为HindIII位点来完成。使用HindIII的消化随后将HVT基因组的这个区段大致切割为两半；对于pSY640，使用从1到13.7 kb的Us区段，其从IRs延伸直到Us2中的（原始）StuI位点。将HVT基因组的这个区段亚克隆到pSP64载体（Promega）内。

亚基因组克隆p556-60.6由378-50插入片段的其他部分的大部分组成：从BamHI-A（在Us6中= gD）的约16.4 kb延伸直到TRs的区域。将这个区段亚克隆到pBR322质粒内。

Us 2位于其中的378-50的BamHI-A片段的中间部分不由pSY640和p556-60.6覆盖，并且与从Us10延伸到Us8（gE）的来自Us的一些另外区段一起包含在转移质粒p435vec9中，使得它与pSY640和p556-60.6重叠，并且将IE/F-?Act/VP2表达盒（如SEQ ID NO：7中所示）掺入Us2基因座中。所得到的被称作p435vec9的质粒在图4中描述。

使用标准CaCl₂转染方案，将一组七个线性化构建体：4个黏粒和3个质粒全部一起转移到CEF内；简言之：将新鲜制备的CEF接种到10 cm培养板上，并且在38℃下用5% CO₂孵育。对于每块板，将黏粒和质粒的1 μg DNA总量混合，并且逐滴加入150mM CaCl₂，直到沉淀即将产生。将这个混合物加入在培养板上的CEF细胞悬液中，并且孵育12小时。去除上清液并且加入15%甘油的覆层，并且在细胞上保持1分钟。随后将其去除，用PBS洗涤，并且加入新鲜培养基，并且将细胞孵育5天。接下来，通过胰蛋白酶消化来收获细胞，并且将来自各个板的细胞各自接种到T175培养瓶中的新鲜CEF细胞单层上，并且孵育2天。将T175瓶培养物胰蛋白酶消化，洗涤且在不含额外CEF的新鲜培养基中再接种，并且进一步孵育3天。接下来，通过胰蛋白酶消化来收获扩增的经转染的细胞，并且将10^-2至10^-4的稀释物在具有CEF单层的10 cm板上铺平板，并且孵育。在孵育直到蚀斑变得可见时（接种后约3天），将板用琼脂覆盖，并且分离大量单独HVP309蚀斑且在CEF上扩增。

3. 插入片段验证

为了证实表达盒在HVP309重组HVT中的整合已正确且完全发生，完成多种验证：分离大量HVP309病毒的单独蚀斑，并且在细胞培养物中扩增。接下来，这些用于使用标准程序的DNA印迹；简言之：用分离自亲本HVT FC-126或重组HVP309中的基因组DNA的EcoRI消化物运行凝胶。将其印记在硝酸纤维素上，并且与已用³²P标记的表达盒的片段一起孵育。放射自显影展示几个特异性条带：来自FC-126的7.3 kb的一个条带，和来自HVP309的5.4和6.1 kb的两个条带，参见图5。这证明HVP309已整合约4.2 kb的完全表达盒。因为探针含有来自侧翼插入区的部分，所以这还证实插入已在预期遗传位置处发生。

为了验证在HVP309中的表达盒的5'和3'端是完整的，应用PCR测序。使用PCR引物检测上游Us2侧翼区和5'-hCMV-IE1启动子：

。

同样地，使用PCR引物检测具有下游Us2侧翼区的VP2基因和FHV1转录终止子的3'端：

。

对HVP309基因组DNA进行PCR扩增，并且两个PCR都扩增其约0.6 kb的期望片段。PCR反应根据制造商的推荐；简言之：使用来自VWR International的Taq? 2x Master Mix，用下述程序：30秒95℃，随后为下述的30个循环：15秒95℃，30秒55℃和45秒72℃。最后5分钟72℃，并且将样品维持在20℃直到分析时。

使用来自Qiagen Inc.的Qiaquick?试剂盒，从琼脂糖凝胶纯化扩增子。测序PCR用所述引物进行，使用来自Applied Biosystems的Big Dye? Terminator v.1.1 Cycle Sequencing试剂盒。测序PCR程序是：10秒94℃，随后为5秒50℃和2分钟60℃的25个循环。将样品维持在20℃直到分析时。使用来自Qiagen的Dye Ex?试剂盒去除未掺入的核苷酸，并且使用来自Applied Biosystems的3500系列Genetic Analyzer?和相应软件进行测序。使用来自Gene Codes Corporation的Sequencher? v.4.10.1软件，将序列针对其参考序列进行比对。

测序结果证实如同所预期的，插入HVP309中的表达盒的5'和3'末端是正确和完整的，并且插入基因座的确在Us2基因中。

4. 通过IFA的表达验证

根据标准方案进行IFA，以验证通过HVP309重组体的F和VP2的表达，简言之：通过标准程序制备CEF（10个ED SPF鸡胚的胰蛋白酶消化），且维持在含有2% FCS和抗生素的标准培养基中。96孔板的每个孔提供标准培养基和在1:5稀释范围中的扩增的HVP309分离物。接下来，以1x10^5/孔加入CEF细胞，并且将板在38℃下用5% CO₂孵育3天。去除上清液，将细胞单层用80%乙醇-20℃固定至少5分钟。如果未贮存于-20℃下，则板用基于磷酸盐的洗涤缓冲液洗涤3x。接下来，使孔与抗体一起孵育，所述抗体是多克隆抗NDV或IBDV，或可获得时的单克隆抗F蛋白或VP2。抗体以在标准孵育缓冲液（含有Tween 20和BSA的磷酸盐洗涤缓冲液）中的合适预稀释使用。将板孵育在37℃下约1小时，洗涤3次，并且与在孵育缓冲液中稀释的合适的FITC缀合的二级抗体一起孵育，例如以1:50稀释度的山羊抗小鼠IgG - FITC（Sigma，F-0257）。这个混合物还含有伊文思蓝，以复染背景细胞。在37℃下孵育1小时后，将板洗涤3次，并且将孔用甘油覆盖并且贮存于4℃直到在UV显微镜下阅读。

来自HVP309的分离物显示从转染后的第一蚀斑直到在稳定性测试后通过扩大的细胞和动物传代获得的蚀斑的F蛋白和VP 2两者的表达。

5. 在16次连续细胞培养传代后遗传稳定性的验证

细胞培养传代和扩增通过在原代CEF中的相继传代来完成。简言之：将原代CEF接种到滚瓶中含有5% FBS + 抗生素的标准培养基中，培养18-24小时，使得形成单层，并且感染且孵育。当CPE是约20-50%时（通常为孵育18-25小时后，使用胰蛋白酶收获受感染的细胞。收获的受感染的CEF细胞随后用于感染新鲜细胞等。

为了测定HVP309分离物的遗传稳定性，对这些实施连续细胞培养传代直到第16次传代（p16），并且随后通过IFA测试F蛋白和VP2的表达。完成具有相似设定的两个实验：用次代CEF接种60 mm板，并且在接种后约20小时（以80-90%汇合的CEF细胞），用p16 HVP309分离物感染板。制备至少10块板用于染色F蛋白，并且10块板用于染色VP2；每块板具有约10个蚀斑。保留两块板不受感染。

在感染后，将板孵育5天。随后通过光学显微镜检查计数每块板上的蚀斑总数目。随后将板固定，并且用F蛋白或VP2特异性单克隆抗体、以及小鼠特异性二级抗体-FITC缀合物进行IFA染色。随后检查所有板上的所有蚀斑，首先在明视野显微镜检查下，并且接下来通过用于荧光的落射荧光显微镜检查，并且从而检查F蛋白或VP2表达。

结果：试验1：通过明视野显微镜检查来检查总共344个蚀斑。在对VP2表达染色的180个蚀斑中，以及在对F蛋白表达染色的164个蚀斑中，所有蚀斑均展示特异性荧光，指示在p16时的异源基因表达。

试验2：在对VP2表达染色的306个蚀斑中，全部是阳性的；在对F蛋白表达染色的326个蚀斑中，一个蚀斑（0.3%）未显示表达。

在两个试验中，未感染的板未显示F蛋白或VP2表达的任何特异性荧光。

结论：在16次连续细胞培养传代后，发现来自HVP309的插入的异源基因之一的未表达水平为0%或0.3%。这指示HVP309的令人印象深刻的遗传稳定性。

6. 用HVP309 针对IBDV 的接种-攻击测试

P16传代的HVP309在接种-攻击实验中就其提供针对IBDV和NDV的有效免疫保护的剩余能力进行测试（参见实施例7）。

6.1. 试验设定

测试的生物制品：在p16时的HVP309；Vaxxitek? HVT+IBD；和HVT毒株FC-126。

动物：在18 ED时的SPF白色来亨鸡。雏鸡在孵化时进行翅上记号（wingbanded），并且每天观察，观察注明症状、行为或与试验无关的不良反应。饲养在隔离装置中且根据标准操作方案维持。

接种：在18 ED时的鸡胚接种，使用测试的三种疫苗之一：使用22G 1.25”针，将0.1 ml剂量施用到绒膜尿囊内。将疫苗回滴定，并且给予的疫苗剂量是约2000 pfu/剂量。

攻击：鸡在接种后（p.v.） 2或3周时用经典IBDV毒株STC进行攻击，其中每只雏鸡约10^2.5 EID50，经由通过滴眼剂单独应用的60 μl体积给予。

观察：各组的鸡在攻击后（p.c.）4天时测试在攻击后 4天时肉眼可见的明显粘液囊（bursa）损伤，和在攻击后 10天时的粘液囊组织学（淋巴细胞耗竭和损伤）。

数据分析：当未受攻击的鸡未发生疾病，而多于70%的受攻击的接种FC-126的鸡发生严重疾病时，试验视为有效的。

评价：

- 阳性的鸡（对于攻击病毒）：通过粘液囊损伤得分进行测定：如果鸡显示任何粘液囊损伤例如：（粘液囊周）水肿、肉眼可见的出血、粘液囊条纹或粘液囊变色（至黄色/奶油色），则鸡视为阳性的。  

- 保护（不受攻击感染）：当淋巴细胞耗竭得分<3时，鸡视为受保护的，或在0-5的级别上处于3-5的得分时，则鸡视为不受保护的。

6.2. 结果和结论

用HVT载体化的IBDV疫苗Vaxxitek? HVT+IBD或HVP309鸡胚接种的雏鸡证明，针对在接种后2和3周时的严重IBDV攻击感染是受到良好保护的。详细结果呈现于表2中。

6.3. 结论

即使在16次连续细胞传代后，用HVP309重组HVT的接种仍提供非常有效的针对IBDV严重攻击的免疫保护，因为至少95%的靶动物是受保护的。

表2：在用p16 HVP309鸡胚中给SPF雏鸡接种后，通过粘液囊损害的IBDV攻击感染结果。

7. 使用HVP309 针对NDV的接种-攻击测试

在可与实施例6那种相比较的动物试验中，测量p12和p16 HVP309保护不受NDV的能力。另外，这个试验比较鸡胚（18和19 ED）接种与一日龄接种。

7.1. 试验设定

测试的生物制品：在p12和p16时的HVP309；Vaxxitek? HVT-IBD；和Innovax?- ND；安慰剂：马立克氏稀释剂。

动物：在18或19  ED时以及在一日龄时的SPF白色来亨鸡。雏鸡在孵化时进行翅上记号，并且每天观察，观察注明症状、行为或与试验无关的不良反应。饲养在BSL2级隔离装置中且根据标准操作方案维持。

接种：在18或19 ED时的鸡胚接种，使用测试的疫苗之一：使用22G 1.25”针，将0.1 ml剂量施用到绒膜尿囊内。第一天接种通过0.2 ml的皮下（sc）途径。将疫苗回滴定，并且给予的疫苗剂量是约1300 pfu/剂量。

攻击：在攻击时，接种鸡和对照在笼中混合。所有鸡均在接种后 4周时用Texas GB毒株（速发型）NDV以每只雏鸡约10^4 EID50进行攻击，以单独应用的200 μl体积通过肌内（i.m.）注射到胸肌中给予。

观察：各组的鸡每天就ND的临床体征进行观察至攻击后 14天。

数据分析：因为多于90%接种安慰剂-受攻击的鸡发生ND的临床体征，所以试验视为有效的。

评价：如果观察到任何NDV临床体征，例如任何神经学体征或死亡，则将鸡计数为阳性的。

7.2. 结果

p12和p16 HVP309两者均能够保护雏鸡不受严重的NDV攻击。这在疫苗接种通过鸡胚中或皮下途径完成时均观察到。仅对于Innovax? ND，在鸡胚中应用时存在年龄效应：18或19 ED。

7.3. 结论

用HVP309的接种在鸡中有效提供针对严重NDV攻击感染的免疫保护。p12和p16 HVP309两者均同样表现良好。通过鸡胚中途径和通过在一日龄时的皮下途径的接种同样表现良好。

表3：在用p12或p16 HVP309在鸡胚中或在第一天时接种SPF雏鸡后，通过NDV临床体征的NDV攻击感染结果。

8. 体内遗传稳定性测试

在产品开发实验过程中，对根据本发明的重组非致病性马立克氏病病毒构建体HVP309实施反复动物回复传代（back-passages），以测试其在体内在其靶动物中的稳定性和安全性。为了测定安全性，对用传代的重组病毒接种的鸡测试在连续动物至动物传代后的其毒力回复（reversionto）或其毒力增加的任何征兆。为了测定遗传稳定性，将在最高动物传代水平时的病毒与在第一次动物传代前的原始接种物相比较。所有实验均根据国际指导方针进行，下文给出简短描述。

8.1. 动物传代

选择一个HVP309蚀斑分离物（被称作B1），并且通过在滚瓶中的原代CEF上的受控数目的扩增传代而扩增成原种子病毒（master seed virus）（MSV）制剂。将这个MSV材料滴定且用于通过皮下途径接种一日龄SPF来亨型鸡，每只使用在0.2 ml剂量中的约50.000 pfu。鸡是健康的，并且随机分配到处理组，并且维持在隔离条件下；包括合适的未接种的对照。将鸡维持14天并且就任何病体征或其他不良反应紧密监控。在接种后14天时，获得各个血样（3 - 5 ml），并且分离白细胞。将这些按照每一处理组进行合并，并且用于蚀斑滴定和进一轮的动物传代；白细胞在1日龄雏鸡的新组中通过皮下途径以0.2 ml接种，并且这些另外监控14天。将这重复另外3轮，直到MSV已接受5次连续动物传代（MSV-AP5）。

8.2. 一般传代结果

如同由在每轮后的中间蚀斑测定结果所显而易见的，可以在每个动物传代水平后获得重组病毒。另外，如同通过在每次传代后来自接种的和未接种的鸡的组织的肉眼观察和显微镜组织病理学检查所测定的，能够鉴定到其毒力没有变化。

8.3. 遗传稳定性

通过分离且比较来自MSV和来自MSV-AP5样品的病毒DNA，证实关于插入的表达盒和在HVT病毒基因组上的插入位点的侧翼区的HVP309B1重组病毒的遗传稳定性。

从已用MSV或含有MSV-AP5的白细胞接种的CEF中分离病毒基因组DNA，所述白细胞得自最后一轮动物传代后的鸡。使用标准试剂盒和程序分离DNA，并且用于多个PCR反应（使用在方便位置处选择的引物和标准循环反应参数），以扩增出表达盒和插入位点的侧翼区。这产生一组长度约600 bp的重叠片段，其一同跨过来自目的区域的5.5 kb延伸段（stretch）：4.5 kb插入的表达盒，和来自每一侧翼区的约500 bp。DNA测序使用自动循环测序设备（Applied Biosystems）完成，并且将序列读取使用Sequencher?软件（Gene Codes Corp.）进行装配、比对和分析。在装配序列中的一些错读（ambiguities）通过掺入另外的PCR片段来解决。对于MSV和MSV-AP5病毒DNA的每种装配最终的共有序列，具有每核苷酸4-5x的最终序列读取冗余度。

发现来自MSV和MSV-AP5中的HVP309B1病毒的插入片段和侧翼区的共有序列是相同的。

即使在5次连续动物传代后，遗传稳定性这一完全保存也符合在较早实验（参见实施例5）中已确定的表型稳定性结果，并且证实HVP309重组病毒构建体的极高稳定性。

附图图例

图1：

测试的根据本发明的不同核酸分子（表达盒）的图示。Ul和Us：HVT基因组的独特长区、各个独特短区；Us2和Us 10：HVT Us2或Us10基因中的遗传插入位置；LTR：劳斯肉瘤病毒长末端重复序列启动子；F：NDV Clone 30融合糖蛋白基因；IE：人巨细胞病毒立即早期1基因核心启动子；IE*：指示使用的‘核心’启动子；VP2：传染性法氏囊病病毒的经典型病毒蛋白2基因；小方框：转录终止子 – 竖条纹：hCMV-IE1基因终止子；- 横条纹：猫疱疹病毒1 US/TRs连接部终止子；?-act.：鸡β肌动蛋白基因核心启动子，包含经修饰的剪接受体位点；?-act.*：使用的核心启动子。

注意：图1中的元件未按比例绘制。另外，表达盒相对于HVT基因组的定向可以逆转。

图2：

根据本发明的核酸分子的一个实施方案的图示。这对应于SEQ ID NO：7中所示的4.5 kb分子。名称和指示物基本上与图1中相同。

图3：

如在npMDV重组HVP309的装配中使用的，用于通过黏粒再生转染的方案的图示。

向下指示的三角形表示遗传插入基因座；对于HVP309，其是Us2。

图4：

根据本发明的重组DNA分子的一个实施方案的图示；在这种情况下：p435vec9转移载体，其用于在HVP309装配中的通过黏粒再生的转染。

名称和指示物基本上与图1和2中相同。

图5：

如实施例3中所述，来自DNA印迹的放射自显影的照片。泳道：M：具有以指示在照片左侧上的kb大小的条带的标记物泳道；泳道1：用EcoRI消化的FC-126病毒DNA；泳道2：用EcoRI消化的HVP309病毒DNA。使用的探针是已用³²P标记的插入载体p435-47。黑色三角形指示观察到的条带：泳道1：7.3 kb；泳道2：6.1和5.4 kb。

                         序列表

 

<110>  Intervet International BV

 

<120>  提供多价免疫的重组非致病性MDV载体

 

<130>  2011-023-PD

 

<160>  11   

 

<170>  PatentIn版本3.5

 

<210>  1

<211>  361

<212>  DNA

<213>  人巨细胞病毒

 

<400>  1

cgcgccaggt caattccctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact       60

 

tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac      120

 

atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac      180

 

gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac      240

 

tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga      300

 

gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat      360

 

a                                                                      361

 

 

<210>  2

<211>  1662

<212>  DNA

<213>  新城疫病毒

 

<400>  2

atgggcccca gaccttctac caagaaccca gtacctatga tgctgactgt ccgagtcgcg       60

 

ctggtactga gttgcatctg tccggcaaac tccattgatg gcaggcctct tgcggctgca      120

 

ggaattgtgg ttacaggaga caaagccgtc aacatataca cctcatccca gacaggatca      180

 

atcatagtta agctcctccc gaatctgccc aaggataagg aggcatgtgc gaaagccccc      240

 

ttggatgcat acaacaggac attgaccact ttgctcaccc cccttggtga ctctatccgt      300

 

aggatacaag agtctgtgac tacatctgga ggggggagac aggggcgcct tataggcgcc      360

 

attattggcg gtgtggctct tggggttgca actgccgcac aaataacagc ggccgcagct      420

 

ctgatacaag ccaaacaaaa tgctgccaac atcctccgac ttaaagagag cattgccgca      480

 

accaatgagg ctgtgcatga ggtcactgac ggattatcgc aactagcagt ggcagttggg      540

 

aagatgcagc agtttgttaa tgaccaattt aataaaacag ctcaggaatt agactgcatc      600

 

aaaattgcac agcaagttgg tgtagagctc aacctgtacc taaccgaatt gactacagta      660

 

ttcggaccac aaatcacttc acctgcttta aacaagctga ctattcaggc actttacaat      720

 

ctagctggtg gaaatatgga ttacttattg actaagttag gtgtagggaa caatcaactc      780

 

agctcattaa tcggtagcgg cttaatcacc ggtaacccta ttctatacga ctcacagact      840

 

caactcttgg gtatacaggt aactctacct tcagtcggga acctaaataa tatgcgtgcc      900

 

acctacttgg aaaccttatc cgtaagcaca accaggggat ttgcctcggc acttgtccca      960

 

aaagtggtga cacaggtcgg ttctgtgata gaagaacttg acacctcata ctgtatagaa     1020

 

actgacttag atttatattg tacaagaata gtaacgttcc ctatgtcccc tggtatttat     1080

 

tcctgcttga gcggcaatac gtcggcctgt atgtactcaa agaccgaagg cgcacttact     1140

 

acaccataca tgactatcaa aggttcagtc atcgccaact gcaagatgac aacatgtaga     1200

 

tgtgtaaacc ccccgggtat catatcgcaa aactatggag aagccgtgtc tctaatagat     1260

 

aaacaatcat gcaatgtttt atccttaggc gggataactt taaggctcag tggggaattc     1320

 

gatgtaactt atcagaagaa tatctcaata caagattctc aagtaataat aacaggcaat     1380

 

cttgatatct caactgagct tgggaatgtc aacaactcga tcagtaatgc tttgaataag     1440

 

ttagaggaaa gcaacagaaa actagacaaa gtcaatgtca aactgactag cacatctgct     1500

 

ctcattacct atatcgtttt gactatcata tctcttgttt ttggtatact tagcccgatt     1560

 

ctagcatgct acctaatgta caagcaaaag gcgcaacaaa agaccttatt atggcttggg     1620

 

aataatactc tagatcagat gagagccact acaaaaatgt ga                        1662

 

 

<210>  3

<211>  281

<212>  DNA

<213>  人巨细胞病毒

 

<400>  3

ggaattctag atcccacgtc actattgtat actctatatt atactctatg ttatactctg       60

 

taatcctact caataaacgt gtcacgcctg tgaaaccgta ctaagtctcc cgtgtcttct      120

 

tatcaccatc aggtgacatc ctcgcccagg ctgtcaatca tgccggtatc gattccagta      180

 

gcaccggccc cacgctgaca acccactctt gcagcgttag cagcgcccct cttaacaagc      240

 

cgacccccac cagcgtcgcg gttactaaca ctcctctccc c                          281

 

 

<210>  4

<211>  696

<212>  DNA

<213>  原鸡（Gallus gallus）

 

<400>  4

ctagtggcgc gccggatcag atctccatgg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact       60

 

ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt      120

 

tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga      180

 

ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg      240

 

aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg      300

 

gcgggcggga gtcgctgcgt tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgcgccg cctcgcgccg      360

 

cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc      420

 

tcctccgggc tgtaattagc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc      480

 

cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg acggctgcct      540

 

tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc      600

 

ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt      660

 

tgttgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attgca                                696

 

 

<210>  5

<211>  1362

<212>  DNA

<213>  传染性法氏囊病病毒

 

<400>  5

atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg       60

 

ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca      120

 

gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc      180

 

cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac      240

 

aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcaga      300

 

ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta      360

 

aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc      420

 

tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aagttgggaa tgtcctggta      480

 

ggggaagggg tcactgtcct cagcctaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt      540

 

ggtgacccca ttcccgctat agggcttgac ccaaaaatgg tagctacatg cgacagcagt      600

 

gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac      660

 

caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgctat cacaagcctc      720

 

agcattgggg gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttgtact gggcgccacc      780

 

atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcagataat      840

 

gggctgacgg ccggcaccga caatcttatg ccattcaatc ttgtcattcc aaccaatgag      900

 

ataacccagc cgatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag      960

 

gcaggggatc agatgtcatg gtcggcaagt gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc     1020

 

aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacagga     1080

 

tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagtaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca     1140

 

aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg     1200

 

atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact     1260

 

gattttcgtg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga     1320

 

gcatttggct tcaaagacat aatccgggct ataaggaggt aa                        1362

 

 

<210>  6

<211>  55

<212>  DNA

<213>  猫疱疹病毒1

 

<400>  6

caataaacat agcatacgtt atgacatggt ctaccgcgtc ttatatgggg acgac            55

 

 

<210>  7

<211>  4525

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  重组HVT构建体HVP-309的表达盒插入片段

 

 

<220>

<221>  启动子

<222>  (30)..(390)

<223>  hCMV-IE1基因核心启动子

 

<220>

<221>  尚未归类的特征

<222>  (415)..(2076)

<223>  来自NDV Clone 30的融合蛋白基因

 

<220>

<221>  终止子

<222>  (2088)..(2368)

<223>  hCMV-IE1基因转录终止子

 

<220>

<221>  启动子

<222>  (2378)..(3073)

<223>  鸡β-肌动蛋白基因核心启动子

 

<220>

<221>  尚未归类的特征

<222>  (3085)..(4446)

<223>  来自IBDV Faragher 52/70的VP2基因

 

<220>

<221>  终止子

<222>  (4470)..(4524)

<223>  FHV1-Us转录终止子

 

<400>  7

agcttaatta agtaccgagc tcgaattggc gcgccaggtc aattccctgg cattatgccc       60

 

agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta      120

 

ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac      180

 

ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc      240

 

aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc      300

 

gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga      360

 

gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggcgcgccgg atccatgggc      420

 

cccagacctt ctaccaagaa cccagtacct atgatgctga ctgtccgagt cgcgctggta      480

 

ctgagttgca tctgtccggc aaactccatt gatggcaggc ctcttgcggc tgcaggaatt      540

 

gtggttacag gagacaaagc cgtcaacata tacacctcat cccagacagg atcaatcata      600

 

gttaagctcc tcccgaatct gcccaaggat aaggaggcat gtgcgaaagc ccccttggat      660

 

gcatacaaca ggacattgac cactttgctc accccccttg gtgactctat ccgtaggata      720

 

caagagtctg tgactacatc tggagggggg agacaggggc gccttatagg cgccattatt      780

 

ggcggtgtgg ctcttggggt tgcaactgcc gcacaaataa cagcggccgc agctctgata      840

 

caagccaaac aaaatgctgc caacatcctc cgacttaaag agagcattgc cgcaaccaat      900

 

gaggctgtgc atgaggtcac tgacggatta tcgcaactag cagtggcagt tgggaagatg      960

 

cagcagtttg ttaatgacca atttaataaa acagctcagg aattagactg catcaaaatt     1020

 

gcacagcaag ttggtgtaga gctcaacctg tacctaaccg aattgactac agtattcgga     1080

 

ccacaaatca cttcacctgc tttaaacaag ctgactattc aggcacttta caatctagct     1140

 

ggtggaaata tggattactt attgactaag ttaggtgtag ggaacaatca actcagctca     1200

 

ttaatcggta gcggcttaat caccggtaac cctattctat acgactcaca gactcaactc     1260

 

ttgggtatac aggtaactct accttcagtc gggaacctaa ataatatgcg tgccacctac     1320

 

ttggaaacct tatccgtaag cacaaccagg ggatttgcct cggcacttgt cccaaaagtg     1380

 

gtgacacagg tcggttctgt gatagaagaa cttgacacct catactgtat agaaactgac     1440

 

ttagatttat attgtacaag aatagtaacg ttccctatgt cccctggtat ttattcctgc     1500

 

ttgagcggca atacgtcggc ctgtatgtac tcaaagaccg aaggcgcact tactacacca     1560

 

tacatgacta tcaaaggttc agtcatcgcc aactgcaaga tgacaacatg tagatgtgta     1620

 

aaccccccgg gtatcatatc gcaaaactat ggagaagccg tgtctctaat agataaacaa     1680

 

tcatgcaatg ttttatcctt aggcgggata actttaaggc tcagtgggga attcgatgta     1740

 

acttatcaga agaatatctc aatacaagat tctcaagtaa taataacagg caatcttgat     1800

 

atctcaactg agcttgggaa tgtcaacaac tcgatcagta atgctttgaa taagttagag     1860

 

gaaagcaaca gaaaactaga caaagtcaat gtcaaactga ctagcacatc tgctctcatt     1920

 

acctatatcg ttttgactat catatctctt gtttttggta tacttagccc gattctagca     1980

 

tgctacctaa tgtacaagca aaaggcgcaa caaaagacct tattatggct tgggaataat     2040

 

actctagatc agatgagagc cactacaaaa atgtgaggat ctctcgagga attctagatc     2100

 

ccacgtcact attgtatact ctatattata ctctatgtta tactctgtaa tcctactcaa     2160

 

taaacgtgtc acgcctgtga aaccgtacta agtctcccgt gtcttcttat caccatcagg     2220

 

tgacatcctc gcccaggctg tcaatcatgc cggtatcgat tccagtagca ccggccccac     2280

 

gctgacaacc cactcttgca gcgttagcag cgcccctctt aacaagccga cccccaccag     2340

 

cgtcgcggtt actaacactc ctctccccga cctgcaacta gtggcgcgcc ggatcagatc     2400

 

tccatgggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc     2460

 

acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg     2520

 

ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga     2580

 

gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc     2640

 

ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgttgc     2700

 

cttcgccccg tgccccgctc cgcgccgcct cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg     2760

 

cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagcggc     2820

 

aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccat     2880

 

ctccagcctc ggggctgccg cagggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg     2940

 

ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct     3000

 

tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttgt tgtgctgtct catcattttg     3060

 

gcaaagaatt gcagatctgg atctatgaca aacctgcaag atcaaaccca acagattgtt     3120

 

ccgttcatac ggagccttct gatgccaaca accggaccgg cgtccattcc ggacgacacc     3180

 

ctggagaagc acactctcag gtcagagacc tcgacctaca atttgactgt gggggacaca     3240

 

gggtcagggc taattgtctt tttccctgga ttccctggct caattgtggg tgctcactac     3300

 

acactgcaga gcaatgggaa ctacaagttc gatcagatgc tcctgactgc ccagaaccta     3360

 

ccggccagct acaactactg cagactagtg agtcggagtc tcacagtgag gtcaagcaca     3420

 

ctccctggtg gcgtttatgc actaaacggc accataaacg ccgtgacctt ccaaggaagc     3480

 

ctgagtgaac tgacagatgt tagctacaat gggttgatgt ctgcaacagc caacatcaac     3540

 

gacaaagttg ggaatgtcct ggtaggggaa ggggtcactg tcctcagcct acccacatca     3600

 

tatgatcttg ggtatgtgag gcttggtgac cccattcccg ctatagggct tgacccaaaa     3660

 

atggtagcta catgcgacag cagtgacagg cccagagtct acaccataac tgcagccgat     3720

 

gattaccaat tctcatcaca gtaccaacca ggtggggtaa caatcacact gttctcagcc     3780

 

aacattgatg ctatcacaag cctcagcatt gggggagagc tcgtgtttca aacaagcgtc     3840

 

caaggccttg tactgggcgc caccatctac cttataggct ttgatgggac tgcggtaatc     3900

 

accagagctg tggccgcaga taatgggctg acggccggca ccgacaatct tatgccattc     3960

 

aatcttgtca ttccaaccaa tgagataacc cagccgatca catccatcaa actggagata     4020

 

gtgacctcca aaagtggtgg tcaggcaggg gatcagatgt catggtcggc aagtgggagc     4080

 

ctagcagtga cgatccatgg tggcaactat ccaggggccc tccgtcccgt cacactagta     4140

 

gcctacgaaa gagtggcaac aggatccgtc gttacggtcg ctggggtgag taacttcgag     4200

 

ctgatcccaa atcctgaact agcaaagaac ctggttacag aatacggccg atttgaccca     4260

 

ggagccatga actacacaaa attgatactg agtgagaggg accgtcttgg catcaagacc     4320

 

gtctggccaa caagggagta cactgatttt cgtgagtact tcatggaggt ggccgacctc     4380

 

aactctcccc tgaagattgc aggagcattt ggcttcaaag acataatccg ggctataagg     4440

 

aggtaagatc cgatctctcg attaattaac aataaacata gcatacgtta tgacatggtc     4500

 

taccgcgtct tatatgggga cgaca                                           4525

 

 

<210>  8

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  PCR/测序引物

 

<400>  8

tcacactagt tgggtttatc                                                   20

 

 

<210>  9

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  PCR/测序引物

 

<400>  9

acgtagatgt actgccaagt ag                                                22

 

 

<210>  10

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  PCR/测序引物

 

<400>  10

ccgggctata aggaggtaag                                                   20

 

 

<210>  11

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  PCR/测序引物

 

<400>  11

gtacgcgtcc gggtatacac                                                   20

Claims (12)

1.重组非致病性马立克氏病病毒（npMDV），其包含异源核酸分子，其特征在于所述核酸分子在5'至3'方向上并按该次序包含：

a. 人巨细胞病毒立即早期1基因（hCMV-IE1）核心启动子，

b. 新城疫病毒（NDV）融合（F）蛋白基因，

c. 转录终止子，

d. 鸡β-肌动蛋白基因核心启动子，

e. 经典型传染性法氏囊病病毒（IBDV）病毒蛋白2（VP2）基因。

2.核酸分子，其用于构建根据权利要求1的重组npMDV，所述核酸分子在5'至3'方向上并按该次序包含：

a. hCMV-IE1核心启动子，

b. NDV F蛋白基因，

c. 转录终止子，

d. 鸡β-肌动蛋白基因核心启动子，

e. 经典型IBDV VP2 基因，

f. 转录终止子。

3.重组DNA分子，其包含根据权利要求2的核酸分子。

4.根据权利要求1的重组npMDV，其中将所述异源核酸分子插入到所述重组npMDV基因组内的Us区中。

5.用于制备根据权利要求1的重组npMDV的方法，所述方法包括将根据权利要求2的核酸分子插入到npMDV基因组上的单个遗传插入基因座内。

6.宿主细胞，其包含根据权利要求1或4中任一项的重组npMDV、根据权利要求2的核酸分子、或根据权利要求3的重组DNA分子。

7.用于家禽的疫苗，其包含根据权利要求1或4中任一项的重组npMDV、或根据权利要求6的宿主细胞、和药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7的疫苗，其包含至少一种另外的免疫活性组分。

9.用于制备根据权利要求7的疫苗的方法，所述方法包括下述步骤：

- 用根据权利要求1或4中任一项的重组npMDV感染宿主细胞，

- 收获所述受感染的宿主细胞，和

- 将所述收获的受感染的宿主细胞与药学上可接受的载体混合。

10.根据权利要求1或4中任一项的重组npMDV，其用于用于家禽的疫苗。

11.根据权利要求1或4中任一项的重组npMDV、根据权利要求2的核酸分子、根据权利要求3的重组DNA分子、根据权利要求6的宿主细胞或其任何组合用于制造用于家禽的疫苗的用途。

12.家禽接种的方法，其包括用根据权利要求7或8中任一项的疫苗接种所述家禽的步骤。

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