JP5913316B2 - ニューカッスル病ウイルスをベクターとするヘルペスウイルスワクチン - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、2010年8月31日出願の米国仮出願出願番号第61/378,575号の利益を主張する。

技術分野
本発明は、NDVをベクターとするヘルペスウイルスワクチンまたは組成物を含む。

近年、いくつかの研究によって、鳥類疾患のワクチンベクターとして使用するためのニューカッスル病ウイルス(NDV)の潜在能力が強調されている(Krishnamurthy et al., Virology 278, 168-182,2000; Huang et al., J. Gen. Virol. 82, 1729-1736, 2001; Nakaya et al., J. Virol. 75, 11868-11873, 2001; Park et al. PNAS 103, 8203-8208, 2006; Veits et al PNAS 103, 8197-8202, 2006; Ge et al. J. Virol. 81, 150-158, 2007; Romer-Oberdorfer et al. Vaccine 26, 2307-2313, 2008)。

NDVは、パラミクソウイルス科アブラウイルス属に属する。NDVは、気道、消化管、卵管において複製され、分離株の一部では神経系において複製される。感染は、経気感染および経口糞便感染による。NDVは、鳥のすべての種が罹患する感染性の高い致死性の疾患であり、哺乳動物種の一部に感染することもできる。この疾患は、ウイルス株と宿主種によって、臨床症状を示さないものから悪性の高いものまで異なることができる。NDV株が示すビルレンスの連続スペクトルから、それらを3つの異なる病原型(レントジェニック(lentogenic)、メソジェニック(mesogenic)およびベロジェニック(velogenic))に分類することが可能であった(Alexander, D. J., Diseases of Poultry, Iowa State Uni. Press, Ames IA, 541-569, 1997)。レントジェニック株は、通例、成体ニワトリには疾患を引き起こさず、アメリカ合衆国および他の国々の家禽産業において生ワクチンとして広く使用されている。中間のビルレンスのウイルスはメソジェニックと呼ばれ、高い死亡率を示すウイルスはベロジェニックと呼ばれる。この疾患は世界中に分布し、相変わらず商業家禽生産にとって大きな脅威である。

NDVゲノムは、おおよそ15kbの非分節マイナス鎖RNAである。このゲノムRNAは、ヌクレオカプシドタンパク質(NP)、リン酸化タンパク質(P)、マトリックスタンパク質(M)、融合タンパク質(F)、赤血球凝集素/ノイラミニダーゼ(HN)および大ポリメラーゼタンパク質(L)の順にタンパク質をコードする6つの遺伝子を含む。未知の機能の2つのさらなるタンパク質、VおよびWが、P遺伝子の転写中にRNAエディティングによって産生される(Steward et al., 1993, Journal of General Virology 74:2539-2547)。

近年確立された、もっぱらクローン化cDNAから非分節マイナス鎖RNAウイルスを再生する方法の開発によって、NDVを含むこのウイルス群を遺伝的に操作する可能性が開かれた(Conzelmann, K.K., Ann. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Roberts and Rose, Virology 247, 1-6, 1998)。“逆遺伝学”と呼ばれるこの独特の分子遺伝学的方法は、ウイルスによってコードされる種々の遺伝子の機能を研究する手段(Palese et al., PNAS 93, 11354-11358, 1996; Nagai, Y., Rev. Med. Virol. 9, 83-99, 1999)ばかりでなく、異種遺伝子を発現するためのこれらのウイルスの使用を可能にする手段(Bukreyev et al., J. Virol. 70, 6634-6641, 1996; Mebatsion et al., PNAS 93, 7310-7314, 1996; Schnell et al., PNAS 93, 11359-11365, 1996; Hasan et al., J. Gen. Virol. 78, 2813-2820, 1997; He et al., Virology 237, 249-260, 1997; Sakai et al., FEBS Lett. 45, 221-226, 1999)もまた提供する。これは、改善されたワクチンおよびワクチンベクターを作成する新規方法を提供する。最近、NDVが、鳥インフルエンザ抗原発現のベクターとして使用された(US2010/0255029、Merial社)。

ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)は、FHV-1(ネコヘルペスウイルス1型)の侵入に必須であり、宿主細胞との相互作用(受容体との結合)に関与する。gDタンパク質は、ネコ赤血球に対して赤血球凝集活性を有する(Maeda et al., Virology 202, 1034-8, 1994; Maeda et al., Virus Res. 46, 75-80, 1996)。ヘルペスウイルス糖タンパク質B(gB)はFHVの侵入に必須であり、融合過程に関与する(Spatz and Maes, Virology 197, 125-36, 1993; Maeda et al., Virus Res 39, 55-61, 1995)。どちらの糖タンパク質も中和抗体を誘発することができる(Horimoto et al., Arch Virol 111, 127-32, 1990)。

ヒトを含む動物のヘルペスウイルスへの感染性を考慮すれば、ヘルペスウイルス感染を予防し、動物を保護する手段は必須である。従って、ヘルペスウイルスに有効なワクチンが求められている。

本願におけるいずれの文書の引用または参照も、その文書が本発明の先行技術として利用できると認めるものではない。

本発明は、特定のヘルペスウイルス抗原、例えばネコヘルペスウイルス抗原を含み、発現する1以上の操作された組換えNDVベクターおよび場合により薬学的または獣医学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを含む、NDVをベクターとするワクチンまたは組成物に関する。NDVは、Merial社によって商業化された弱毒生ワクチンであるAVINEW(登録商標)NDV株であることができる。

ヘルペスウイルス抗原は糖タンパク質であることができる。ヘルペスウイルス抗原は、ネコヘルペスウイルス由来の糖タンパク質B(gB)または糖タンパク質D(gD)抗原であることができる。

本発明はまた、動物にワクチン接種する方法であって、組換えNDVベクターの有効量を含むことができる1以上のワクチンまたは組成物の有効量および場合により薬学的または獣医学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを動物に投与することを含む前記方法に関する。投与は、卵内(in ovo)、口鼻内（oro-nasal）、点眼薬、スプレー、飲料水または非経口(皮下、筋肉内、経皮、皮内)投与であることができる。

本発明はさらに、プライム-ブースト（prime-boost）プロトコルを用いるワクチンまたは組成物の投与に関する。本発明はさらに、免疫応答を誘導または誘発する方法を実施するためのキットであって、組換えヘルペスウイルス免疫組成物もしくはワクチンまたは不活化免疫組成物もしくはワクチンのいずれか1つを含むことができる前記キットおよび前記方法を実施するための使用説明書を含む。

従って、従来知られている製品、その製品の製造プロセスまたはその製品の使用方法をなんら本発明に包含しないことは本発明の目的であり、従って出願人はその権利を留保し、これによって従来知られている製品、プロセスまたは方法の権利の放棄を開示する。さらにまた、本発明は、USPTO(35 U.S.C. §112、第1パラグラフ)またはEPO(EPC83条)の記載要件および実施可能要件に適合しない製品、プロセス、製品の製造方法または製品の使用方法を本発明の範囲に含むことを意図するものではなく、従って、出願人はその権利を留保し、これによって前述の製品、その製品の製造プロセスまたはその製品の使用方法の権利の放棄を開示することに注意されたい。

これらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明によって開示され、またはそれらから明らかになり、かつそれらに含まれる。

例として提供されるものであって、記載された特定の実施形態にのみ本発明が限定されるものではない以下の詳細な説明は、添付図面と関連させて最もよく理解することができる。
DNAおよびタンパク質配列に対して付与した配列番号を示す表を示す図である。 完全長NDVゲノムの遺伝子地図を示す図である。 完全長NDVゲノム上の2つの代表的な遺伝子間挿入部位へのヘルペスウイルスgBまたはgDの挿入を有する2つの操作されたNDVベクターの遺伝子地図を示す図である。 NDV逆遺伝学系のフロー図の例を示す図である。 ネコヘルペスウイルス(FHV)gB遺伝子(pFR14プラスミド)またはgD遺伝子(pFR16プラスミド)を含むNDV転写プラスミドの作成を示す図である。 pFR14およびpFR16プラスミドの地図を示す図である。 チャレンジ後のネコの平均直腸温を示す図である。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり、群Dは陰性対照(ワクチン接種なし)である。 チャレンジ後のネコの平均体重を示す図である。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり、群Dは陰性対照(ワクチン接種なし)である。 チャレンジ後のネコの臨床徴候に関して採取したデータを示す図である。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり、群Dは陰性対照(ワクチン接種なし)である。 チャレンジ後のネコの臨床徴候の統計解析を示す図である。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり、群Dは陰性対照(ワクチン接種なし)である。 チャレンジ後のネコのウイルス排出を示す図である。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり、群Dは陰性対照(ワクチン接種なし)である。 チャレンジ後のネコのウイルス排出の統計解析を示す図である。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり、群Dは陰性対照(ワクチン接種なし)である。 各群の平均FHV Ab(抗gB)力価の漸進的変化を示す図である。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり、群Dは陰性対照(ワクチン接種なし)である。 gBタンパク質配列のアラインメントおよび配列同一性百分率を示す図である。 gDタンパク質配列のアラインメントおよび配列同一性百分率を示す図である。

発明の詳細な説明
本開示、特にその特許請求の範囲および/またはパラグラフにおいて、用語“含む(comprises)”、“含んだ(comprised)”、“含むこと(comprising)”などは、米国特許法においてそれらに対して付与された意味を有しうることに注意されたい。例えば、それらは“含む(includes)”、“含んだ(included)”、“含むこと(including)”などを意味することができる。また、用語“本質的に〜からなること(consisting essentially of)”および“本質的に〜からなる(consists essentially of)”などは、米国特許法においてそれらに付与された意味を有することにも注意されたい。例えば、それらは、明記されていない要素を許容するが、先行技術中に存在するかまたは本発明の基本的または新規な特徴に影響を及ぼす要素を除外する。

本明細書で用いられるすべての学術用語は、一般に、本発明が属する当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。単数用語“ある(a)”、“ある(an)”および“その(the)”は、文脈から明白でない限り複数指示対象を含む。同様に、単語“または(or)”は、文脈から明白でない限り、“および(and)”を含むものとする。

本発明において、NDVベクターとしてAVINEW(登録商標)株が用いられる(US2010/0255029)。

本発明は、1以上の操作されたNDVベクターの有効量および場合により薬学的または獣医学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを含むことができるワクチンまたは組成物に関する。

本発明は、動物において免疫原性応答を誘導するヘルペスウイルスタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を発現する操作されたNDVベクターを含む。ヘルペスウイルスタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原は、ネコヘルペスウイルスタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原であることもできる。

本明細書において、用語“ヘルペスウイルスポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原”とは、ヘルペスウイルスの任意のポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原のことを言う。ヘルペスウイルスは、ネコヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルス、アザラシヘルペスウイルスであることができる。ヘルペスウイルスポリペプチドは、ヘルペスウイルスgBまたはgDタンパク質を含むが限定されないヘルペスウイルス糖タンパク質であることができる。

“動物”とは、哺乳動物、ヒト、鳥などを意味するものとする。動物は、ウマ科動物(例えば、ウマ)、イヌ科動物(例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル)、ネコ科動物(例えばライオン、トラ、イエネコ、ヤマネコ、他の大猫ならびにチーターおよびヤマネコを含む他のネコ科動物)、ヒツジ類(例えばヒツジ)、ウシ亜科動物(例えば畜牛、ウシ、スイギュウ)、ブタ類(ブタ)、鳥類(例えばニワトリ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリ)、霊長類(例えば原猿、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿)ならびに魚類からなる群から選択されることができる。用語“動物”はまた、胚期および胎児期を含むすべての発育段階における個々の動物も含む。

一実施形態において、ヘルペスウイルス免疫組成物またはワクチンは、1以上の操作されたNDVベクターおよび場合により薬学的または獣医学的に許容される賦形剤、アジュバント、担体またはビヒクルを含む。操作されたNDVベクターは、ヘルペスウイルスタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原をコードするポリヌクレオチドを含むNDV発現ベクターであることができる。ヘルペスウイルスタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原は糖タンパク質またはそれらの任意の断片であることができる。ヘルペスウイルスタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原は、gBもしくはgDタンパク質またはそれらの任意の断片であることができる。

本明細書において、用語“抗原”または“免疫原”は、宿主動物において特定の免疫応答を誘発する物質を意味する。抗原は、全生物体(死滅、弱毒化または生);生物体のサブユニットまたは部分;免疫原性を有するエピトープ、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質またはそれらの断片を発現する挿入物を含む組換えベクター;宿主動物への提示によって免疫応答を誘発することができる核酸の一部もしくは断片;タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテンまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。あるいは、免疫原または抗原は、毒素または抗毒素を含むことができる。

本明細書において、用語“免疫原性タンパク質またはペプチド”はまた、ひとたび宿主に投与されれば、そのタンパク質に対する体液性および/または細胞性免疫応答を引き起こすことができるという意味で免疫学的に活性なペプチドおよびポリペプチドを含む。好ましくは、タンパク質断片は、実質的に全タンパク質と同じ免疫学的活性を有するタンパク質断片である。従って、本発明のタンパク質断片は、少なくとも1つのエピトープまたは抗原決定基を含むか、または本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。用語エピトープは、抗原決定基ともいい、免疫系によって認識される高分子の一部であり、体液性(B細胞)および/または細胞性(T細胞)の免疫反応を誘発することができる。

用語“免疫原性タンパク質またはペプチド”は、そのポリペプチドが機能して本明細書で定義する免疫学的応答を生じさえすれば、その配列に対する欠失、付加および置換がさらに考えられる。この点において、特に好ましい置換は、一般に性質が保存的である。すなわち、それらの置換は、アミノ酸のファミリー内で生じる。例えば、アミノ酸は、一般に、4つのファミリーに分割される:(1)酸性--アスパラギン酸およびグルタミン酸;(2)塩基性--リジン、アルギニン、ヒスチジン;(3)非極性--アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;ならびに(4)非荷電極性--グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリントレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸に分類される場合もある。ロイシンとイソロイシンまたはバリンとの孤立した置換(逆もまた同様);アスパラギン酸とグルタミン酸との孤立した置換(逆もまた同様);トレオニンとセリンとの孤立した置換(逆もまた同様);またはアミノ酸と構造的に関連したアミノ酸との同様な保存的置換は、その生物活性に大きな影響を及ぼさないことが合理的に予測される。参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、そのタンパク質の免疫原性に実質的に影響しない少数のアミノ酸置換を有するタンパク質は、従って、参照ポリペプチドの定義に含まれる。

用語エピトープは、免疫系によって認識される高分子の一部であり、体液性(B細胞)および/または細胞性(T細胞)の免疫反応を誘発することができる。本用語はまた、"抗原決定基"または"抗原決定部位"と同義で使用される。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原への他の抗体の結合をブロックするある抗体の能力を示す簡単なイムノアッセイで同定することができる。

組成物またはワクチンに対する"免疫学的応答"は、宿主での、目的とする組成物またはワクチンに対する細胞性および/または抗体性免疫応答の発生である。通例、"免疫学的応答"は、限定するものではないが、以下の作用:目的とする組成物またはワクチンに含まれる抗原(単数または複数)に特異的な抗体、B細胞、ヘルパーT細胞および/または細胞傷害性T細胞の産生、の1以上を含む。好ましくは、宿主は、新規感染に対する抵抗性が増強されかつ/または疾患の臨床的重症度が低下するような治療的または保護的免疫学的応答のいずれかを示す。これらの保護は、感染宿主によって通常示される症状の低下もしくは欠如、回復期間の短縮化および/または感染宿主におけるウイルス力価の低下によって証明される。

本明細書において、用語"免疫原性"タンパク質またはポリペプチドはまた、前述の免疫学的応答を誘導するアミノ酸配列のことを言う。本明細書において、"免疫原性"タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質の完全長配列、それらのアナログまたはそれらの免疫原性断片を含む。"免疫原性断片"とは、1以上のエピトープを含み、従って前述の免疫学的応答を誘導するタンパク質の断片を意味する。このような断片は、当該分野で公知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定できる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66(Glenn E. Morris, Ed., 1996)を参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、固体担体上にタンパク質分子の一部に対応する多数のペプチドを同時に合成し、ペプチドが担体上に接着している間にペプチドと抗体を反応させることによって決定することができる。このような技術は当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第4,708,871号;Geysenら(1984);Geysenら(1986)に記載されている。同様に、コンホメーションエピトープは、例えば、X線結晶学および2次元核磁気共鳴によってアミノ酸の空間的コンホメーションを測定することによって容易に同定される。例えば、前出のエピトープマッピングプロトコル(Epitope Mapping Protocols)を参照のこと。

合成抗原、例えば、ポリエピトープ、隣接エピトープおよび、他の組換えによってまたは合成的に誘導された抗原もまた定義に含まれる。本発明の目的上、免疫原性断片は、通例、その分子の少なくとも約3アミノ酸、少なくとも約5アミノ酸、少なくとも約10〜15アミノ酸もしくは約15〜25アミノ酸、またはそれ以上のアミノ酸を含む。断片の長さに決定的な上限はなく、タンパク質配列のほぼ完全長を含むこともできるし、タンパク質の少なくとも1つのエピトープを含む融合タンパク質であっても含むこともできる。

従って、エピトープを発現するポリヌクレオチドの最小構造は、それが、ヘルペスウイルスタンパク質またはポリペプチドのエピトープまたは抗原決定基をコードするヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるものである。全タンパク質またはポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドは、全タンパク質またはポリペプチドをコードする配列の最低限15、好都合には約30〜45、好ましくは約45〜75、少なくとも57、87もしくは150の連続もしくは隣接ヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。過度の実験を要することなく、オーバーラップペプチドライブラリーの作製(Hemmerら、1998)、Pepscan(Geysenら、1984;Geysenら、1985;Van der Zee R.ら、1989;Geysen、1990;Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron)およびアルゴリズム(De Grootら、1999)などのエピトープ決定手順を本発明の実施に用いることができる。

“ポリヌクレオチド”は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび任意の組み合わせでのアナログを含む任意の長さのヌクレオチドの重合体である。ポリヌクレオチドは三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を発揮することができる。用語“ポリヌクレオチド”は、二本鎖、一本鎖および三本鎖のらせん状分子を含む。特記しない限り、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドである任意の実施形態は、DNA、RNAまたはハイブリッド分子のいずれかの二本鎖型およびそれらの二本鎖型を形成することが知られているかまたは予測される2つの相補型のいずれかを含む。

用語“コドン最適化”とは、選択された宿主における発現/翻訳のために、タンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープ、ドメインまたは断片をコードする核酸配列を最適に構成するプロセスのことを言う。一般に、遺伝子発現レベルは、プロモーター配列および調節因子などの多くの因子に依存する。最も重要な因子の1つは、転写物遺伝子のコドン使用頻度から宿主の典型的なコドン使用頻度への適合である(Lithwich, G. and Margalit, H., Genome Res. 13, 2665-2673, 2003)。従って、翻訳選択下で原核生物ゲノムにおいて強く発現されている遺伝子は、著しいコドン使用頻度バイアスを有する。これは、原核生物ゲノムが、それらの最も豊富なtRNA種によって認識されるわずかなコドンサブセットを使用するからである(Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151, 389-409, 1981)。このコドン適合を調節する力は翻訳選択と呼ばれ、その強度は増殖の速い細菌に重要である(Rocha, E.P., Genome Res. 14, 2279-2286, 2004;Sharp, P.M. et al., Nucleic Acids Res. 33, 1141-1153)。ある遺伝子がその宿主にほとんど使用されないコドンを含む場合、その発現レベルは最大にはならないであろう。このことは、異種タンパク質発現(Gustafsson, C. et al., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004)およびDNAワクチン開発(C. Ivory and K. Chadee, Genet. Vaccines Ther. 2, 17, 2004)の制限の1つとなる場合がある。多数の合成遺伝子が、それらの発現レベルを増強するために再設計されている。Synthetic Gene Database (SGDB)(G. Wu et al., Nucleic Acids Res. 35, D76-D79, 2007)は、合成遺伝子に関する200を超える公表された実験からの情報を含んでいる。最適の量で特定のタンパク質を発現するために新規宿主に挿入される核酸配列の設計プロセスにおいて、コドン使用頻度の最適化は、通例最初のステップの1つである(Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004)。コドン使用頻度の最適化は、基本的に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変しないで、宿主のコドン使用頻度をより密接に反映するように希少コドンを改変することを含む(Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004)。従って、最適化プロセスに通例用いられる情報は、最適化されるべきDNAおよびタンパク質配列ならびに宿主のコドン使用頻度表(参照セット)である。

当業者になんらかのコドン最適化を可能にする公開webサーバおよびスタンドアロンアプリケーションがいくつか存在する。‘GeneDesign’’(S.M. Richardson et al. Genome Res. 16, 550-556, 2006)、‘Synthetic Gene Designer’(G. Wu et al. Protein Expr. Purif. 47, 441-445, 2006)および‘Gene Designer’(A. Villalobos et al. BMC Bioinformatics 7, 285, 2006)は、コドン最適化ステップを含む合成遺伝子設計のためのプラットフォームを提供するパッケージである。各サーバまたはプログラムにおいて利用可能なコドン使用頻度最適化のための方法に関しては、開発された最初のプログラムは、‘1アミノ酸-1コドン’アプローチのみを用いた。より最近のプログラムおよびサーバは、現在、何らかのコドン使用頻度の変異性を作成するさらなる方法を含む。この変動性は、天然の強く発現されている遺伝子のコドン使用頻度の変異性を反映し、最適化プロセスに取り入れるべき追加の基準(例えば制限部位の回避)を与える。本明細書に記載の大部分のアプリケーションおよびwebサーバは、3つのコドン最適化法を提供する。すなわち、すべてのコドンの完全最適化、Monte Carloアプローチを用いる、参照セットの相対コドン使用頻度に基づく最適化および、クエリー配列と最適化された配列との間の変化を最少にして最適化を最大にするように設計された新規アプローチである。

一実施形態において、組換えタンパク質、抗原、ペプチド、ポリペプチド、断片、ドメインまたはエピトープをコードする核酸配列は、動物での発現のためにコドン最適化される。他の実施形態において、動物での発現のためにコドン最適化された配列は、ネコヘルペスウイルスタンパク質、抗原、ペプチド、ポリペプチド、断片、ドメインまたはエピトープをコードする。さらに他の実施形態において、動物での発現のためにコドン最適化された配列は、ヘルペスウイルスgBもしくはgDタンパク質、抗原、ペプチド、ポリペプチド、断片、ドメインまたはエピトープをコードする。

以下は、限定するものではないポリヌクレオチドの例である:遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ、ウラシル、他の糖および連結基、例えばフルオロリボースおよびチオラートならびにヌクレオチド分枝を含むことができる。ヌクレオチドの配列は、重合後、例えば標識成分との結合によってさらに改変されることができる。この定義に含まれる他の種類の改変は、キャップ、天然に存在するヌクレオチドの1以上とアナログとの置換および、ポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチドまたは固体担体に結合させるための手段の導入である。これらのポリヌクレオチドは、化学合成によって得るかまたは微生物由来であることができる。

用語“遺伝子”は、生物学的機能と関連するポリヌクレオチドの任意のセグメントを指すために広く用いられる。従って、遺伝子は、ゲノム配列でのイントロンおよびエクソンあるいは、cDNAでのコード配列そのものおよび/またはそれらの発現に必要な調節配列を含む。例えば、遺伝子はまた、mRNAまたは機能性RNAを発現する核酸断片あるいは特定のタンパク質をコードしかつ調節配列を含む核酸断片のことも言う。

本発明はさらに、ヘルペスウイルスタンパク質、抗原、エピトープまたは免疫原をコードするポリヌクレオチドに対する相補鎖を含む。相補鎖は重合体であることができ、任意の長さであることができ、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびそれらの任意の組み合わせでのアナログを含むことができる。

用語“タンパク質”、“ペプチド”、“ポリペプチド”および“ポリペプチド断片”は、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指すために同義で使用される。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であることができ、ポリマーは、修飾アミノ酸またはアミノ酸アナログを含むことができ、ポリマーは、アミノ酸以外の化学的部分によって中断されることができる。本用語はまた、天然にまたは介入によって、例えばジスルフィド結合生成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変、例えば標識または生物活性成分との結合によって改変されたアミノ酸ポリマーを含む。

“単離された”ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは、その天然環境に付随する物質を実質的に含まないものをいう。実質的に含まないとは、これらの物質を少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%含まないことを意味する。

ハイブリダイゼーション反応は、種々のストリンジェンシー条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は公知である。例えば、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition(Sambrook et al., 1989)を参照のこと。関連条件の例は、(ストリンジェンシーを増加させる順序で):インキュベーション温度25℃、37℃、50℃および68℃;緩衝液濃度10 x SSC、6 x SSC、1 x SSC、0.1 x SSC (SSCは0.15M NaClおよび15mMクエン酸の緩衝液)および他の緩衝系を用いるそれらの等価物;ホルムアミド濃度0%、25%、50%および75%;インキュベーション時間5分〜24時間;1または2以上の洗浄段階;洗浄インキュベーション時間1、2または15分;ならびに洗浄液6x SSC、1x SSC、0.1x SSCまたは脱イオン水を含む。

本発明はさらに、それによって、コードされるポリペプチドの固有の性質を増強させるか低下させるかまたは大きくは影響しないことができる、機能的に同等なヘルペスウイルスポリペプチドのバリアントおよび誘導体ならびに機能的に同等なそれらの断片をコードするポリヌクレオチドを含む。これらの機能的に同等なバリアント、誘導体および断片は、活性を保持する能力を示す。例えば、コードされるアミノ酸配列を変化させないDNA配列の変化ばかりでなく、アミノ酸残基の保存的置換、1または数個のアミノ酸欠失または付加およびアミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置換をもたらす変化もまた、コードされるポリペプチドの性質に大きくは影響しない変化である。一実施形態において、バリアントは、目的とするヘルペスウイルスポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の相同性または同一性を有する。

一側面において、本発明は、ヘルペスウイルスポリペプチド、特にヘルペスウイルスgBポリペプチドを提供する。他の側面において、本発明は、配列番号1、7、8、9、11、13または15の配列を有するポリペプチドおよびそれらのバリアントまたは断片を提供する。

他の側面において、本発明は、本発明のヘルペスウイルスgBポリペプチド、特に配列番号1、7、8、9、11、13または15の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。

さらに他の側面において、本発明は、上記のヘルペスウイルスgBポリペプチド(配列番号1、7、8、9、11、13または15)の断片およびバリアントを提供するが、これらは公知の分子生物学技術を用いて、当業者によって容易に製造されることができる、

バリアントは、本発明の抗原ポリペプチド、特に配列番号1、7、8、9、11、13または15のアミノ酸配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列の同一性を有する相同のポリペプチドである。

ヘルペスウイルスgBポリペプチドの免疫原性断片は、配列番号1、7、8、9、11、13もしくは15またはそれらのバリアントの配列を有するヘルペスウイルスgBポリペプチドの少なくとも8、10、15もしくは20連続アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、または少なくとも30アミノ酸を含む。他の実施形態において、ヘルペスウイルスgBポリペプチドの断片は、完全長ヘルペスウイルスgBポリペプチドに見いだされる特定の抗原エピトープを含む。

他の側面において、本発明は、ヘルペスウイルスgBポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号1、7、8、9、11、13または15の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに他の側面において、本発明は、配列番号1、7、8、9、11、13または15の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するポリペプチドまたは、保存的バリアント、対立遺伝子バリアント、ホモログまたはこれらのポリペプチドの1つの少なくとも8もしくは少なくとも10連続アミノ酸を含む免疫原性断片またはこれらのポリペプチドの組み合わせをコードするポリヌクレオチドを提供する。ヘルペスウイルスgBポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の動物種での発現のためにコドン最適化されることができる。

他の側面において、本発明は、配列番号2、3、10、12、14または16のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそれらのバリアントを提供する。さらに他の側面において、本発明は、配列番号2、3、10、12、14もしくは16の配列を有するポリヌクレオチドまたはそれらのバリアントに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。

一側面において、本発明は、ヘルペスウイルスポリペプチド、特にヘルペスウイルスgDポリペプチドを提供する。他の側面において、本発明は、配列番号4、17、19、21または23の配列を有するポリペプチドおよびそれらのバリアントまたは断片を提供する。

他の側面において、本発明は、本発明のヘルペスウイルスgDポリペプチド、特に配列番号4、17、19、21または23の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。

さらに他の側面において、本発明は、上記のヘルペスウイルスgDポリペプチド(配列番号4、17、19、21または23)の断片およびバリアントを提供するが、これらは公知の分子生物学技術を用いて、当業者によって容易に製造されることができる。

バリアントは、本発明の抗原ポリペプチド、特に配列番号4、17、19、21または23のアミノ酸配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列の同一性を有する相同のポリペプチドである。

ヘルペスウイルスgDポリペプチドの免疫原性断片は、配列番号4、17、19、21もしくは23の配列を有するヘルペスウイルスgDポリペプチドまたはそれらのバリアントの少なくとも8、10、15もしくは20連続アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸または少なくとも30アミノ酸を含む。他の実施形態において、ヘルペスウイルスgDポリペプチドの断片は、完全長ヘルペスウイルスgDポリペプチドに見いだされる特定の抗原エピトープを含む。

他の側面において、本発明は、ヘルペスウイルスgDポリペプチドをコードするポリヌクレチド、例えば配列番号4、17、19、21または23の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに他の側面において、本発明は、配列番号4、17、19、21または23の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するポリペプチドまたは、保存的バリアント、対立遺伝子バリアント、ホモログまたはこれらのポリペプチドの1つの少なくとも8もしくは少なくとも10連続アミノ酸を含む免疫原性断片またはこれらのポリペプチドの組み合わせをコードするポリヌクレオチドを提供する。ヘルペスウイルスgBポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の動物種での発現のためにコドン最適化されることができる。

他の側面において、本発明は、配列番号5、6、18、20、22もしくは24のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそれらのバリアントを提供する。さらに他の側面において、本発明は、配列番号5、6、18、20、22もしくは24の配列を有するポリヌクレオチドまたはそれらのバリアントの1つに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。

一般に、アミノ酸配列の比較は、既知の構造のポリペプチドのアミノ酸配列と未知の構造のポリペプチドのアミノ酸配列とをアラインメントすることによって達成される。次いで、配列におけるアミノ酸が比較され、相同であるアミノ酸のグループがグループにまとめられる。この方法により、保存されたポリペプチド領域が検出され、アミノ酸挿入および欠失の説明となる。アミノ酸配列間の相同性は、市販のアルゴリズム(上記の相同性の説明も参照のこと)を用いて決定することができる。本明細書に別途記載したものに加えて、BLAST、ギャップ付きBLAST、BLASTN、BLASTPおよびPSI-BLASTプログラム(国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)により提供)についても指摘される。これらのプログラムは、この目的のために当該技術分野で広く使用されており、2つのアミノ酸配列の相同領域をアラインメントすることができる。

これに代えて、あるいはこれに加えて、用語“相同性”または“同一性”は、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して、2つの配列間の相同性の定量的尺度を示すことができる。配列同一性パーセントは、(N_ref-N_dif)^*100/N_ref(式中、N_difはアラインメントしたときの2つの配列における同一でない残基の総数であり、N_refは、配列の1つにおける残基数である)で算出することができる。故に、DNA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCとは75%の配列同一性を有するであろう(N_ref=8;N_dif=2)。

これに代えて、あるいはこれに加えて、配列に関する“相同性”または“同一性”は、2つの配列の短い方の配列のヌクレオチド数またはアミノ酸数によって同じヌクレオチドまたはアミノ酸を有する位置の数を割ることによって帰することができる。ここで、2つの配列のアラインメントは、WilburおよびLipmanのアルゴリズム(Wilburら、1983)に従って、例えば、20ヌクレオチドのウインドウサイズ、4ヌクレオチドのワード長および4のギャップペナルティーを用いて決定することができ、アラインメントを含む配列データのコンピュータ支援分析および解釈は、市販プログラム(例えば、Vector NTI Software(登録商標)、Invitrogen社、カリフォルニア州、米国)を用いて好都合に実施することができる。RNA配列がDNA配列と同様であるかまたはDNA配列とある程度の配列同一性または相同性を有する場合、DNA配列におけるチミジン(T)は、RNA配列におけるウラシル(U)と同等であるとみなされる。従って、DNA配列におけるチミジン(T)をRNA配列におけるウラシル(U)と等しいとみなすことによって、RNA配列は本発明の範囲内であり、DNA配列から誘導されることができる。当業者は、過度の実験を要することなく、他の多くのプログラムまたは参考文献を参照して相同性パーセントを決定することができる。

本発明はさらに、ベクター分子または発現ベクターに含まれ、プロモーター配列および場合によりエンハンサーに作動可能に連結されたヘルペスウイルスポリヌクレオチドを含む。

“ベクター”とは、in vitroまたはin vivoのいずれかで標的細胞に送達される異種ポリヌクレオチドを含む組換えDNAもしくはRNAプラスミド、バクテリオファージ、またはウイルスのことを言う。異種ポリヌクレオチドは、予防または治療のための目的とする配列を含むことができ、場合により、発現カセットの形態であることができる。本明細書において、ベクターは、最終標的細胞または被験者において複製できる必要はない。用語“ベクター”は、クローニング用ベクターおよびウイルスベクターを含む。

用語“操作された”または“組換えの”は、天然に存在しないか、あるいは自然界に見られない配置で他のポリヌクレオチドに結合した半合成または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。

“異種”は、それが比較される実体の残りの部分とは遺伝的に異なった実体に由来することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、異なる起源由来のプラスミドまたはベクターに遺伝子工学技術で組み込むことができ、従ってこれは異種ポリヌクレオチドである。天然コード配列から取り除かれ、天然配列以外のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは異種プロモーターである。

本発明のポリヌクレオチドは、追加の配列、例えば同じ転写ユニット内の追加のコード配列、調節因子、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、5’UTR、3’UTR、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、同じまたは異なるプロモーターの制御下にある追加の転写ユニット、クローニング、発現、相同組換えおよび宿主細胞の形質転換を可能にする配列ならびに本発明の実施形態を提供するのに望ましい任意の構築物を含むことができる。

ヘルペスウイルスポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原の発現のためのエレメントは、発明のベクターに好都合に存在する。最低限、これは、開始コドン(ATG)、終止コドンおよびプロモーター、ならびに場合により、特定のベクター、例えばプラスミドおよび特定のウイルスベクターのためのポリアデニル化配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。ポリヌクレオチドが、好都合にはベクター中にポリペプチド断片、例えばヘルペスウイルスペプチドをコードする場合、そのリーディングフレームの5'にはATGが配置され、3'には終止コドンが配置される。発現を調節するための他のエレメント、例えばエンハンサー配列、安定化配列、例えばイントロンおよびまたは非翻訳5’もしくは3’配列ならびにタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列を存在させることができる。

in vivoまたはin vitroのいずれかでの本発明の遺伝子産物の発現のためのベクターまたは組換え体またはプラスミドの製造方法および/または投与方法は、任意の望ましい方法、例えば米国特許第4,603,112号;第4,769,330号;第4,394,448号;第4,722,848号;第4,745,051号;第4,769,331号;第4,945,050号;第5,494,807号;第5,514,375号;第5,744,140号;第5,744,141号;第5,756,103号;第5,762,938号;第5,766,599号;第5,990,091号;第5,174,993号;第5,505,941号;第5,338,683号;第5,494,807号;第5,591,639号;第5,589,466号;第5,677,178号;第5,591,439号;第5,552,143号;第5,580,859号;第6,130,066号;第6,004,777号;第6,130,066号;第6,497,883号;第6,464,984号;第6,451,770号;第6,391,314号;第6,387,376号;第6,376,473号;第6,368,603号;第6,348,196号;第6,306,400号;第6,228,846号;第6,221,362号;第6,217,883号;第6,207,166号;第6,207,165号;第6,159,477号;第6,153,199号;第6,090,393号;第6,074,649号;第6,045,803号;第6,033,670号;第6,485,729号;第6,103,526号;第6,224,882号;第6,312,682号;第6,348,450号;第6,312,683および第6,596,279号;米国特許出願第12/753,597号;WO90/01543;W091/11525;WO94/16716;WO96/39491;WO98/33510;EP265785;EP0370573に記載の文書に開示された方法またはそれに類似した方法によることができる。

本発明はまた、ベクター、例えば発現ベクターを含む組成物またはワクチンに関する。組成物またはワクチンは、1以上のベクター、例えば、ヘルペスウイルスポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原の1以上を含むか、または本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる(または発現する)in vivo発現ベクターなどの発現ベクターを含むか、または本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。薬学的または獣医学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤またはビヒクル中にヘルペスウイルス抗原、エピトープまたは免疫原をコードする(または発現する)ポリヌクレオチドを含むか、または本質的にそれらからなるか、またはそれらからなるベクターは、ポリヌクレオチドを含み、発現する。

他の実施形態によれば、組成物またはワクチン中のベクター(単数または複数)は、1以上のタンパク質もしくはそれらの断片(単数または複数)、ヘルペスウイルスポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原をコードするポリヌクレオチド(単数または複数)を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。本発明による組成物またはワクチンは、同じタンパク質および/または異なるタンパク質をコードする異なるヘルペスウイルス分離株からのポリヌクレオチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、好都合にはin vivoでそれらを適切な条件(単数または複数)下または適切な宿主細胞内で発現もする1以上のベクターを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。本発明はまた、異なるヘルペスウイルスタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原、例えば異なる種、例えば、限定するものではないが、ネコ科動物、ヒト、イヌ科動物、ウマ科動物、ウシ亜科動物(例えば、畜牛)、ブタ類または鳥類からのヘルペスウイルスポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらを含み、それらをコードし発現するベクターの混合物にも関する。

用語プラスミドは、本発明のポリヌクレオチドおよび、所望の宿主または標的の細胞(単数または複数)内でのそのin vivo発現に必要なエレメントを含む任意のDNA転写ユニットを含む。この点において、スーパーコイルプラスミドおよびそのトポ異性体のすべて、開環プラスミドならびに直鎖状プラスミドは、本発明の範囲内であるものとする。

各プラスミドは、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド、抗原、エピトープまたは免疫原に加えて、プロモーターに作動可能に連結された、またはプロモーターの制御下にある、またはプロモーターに依存する、異種ペプチド配列、バリアント、アナログまたは断片をコードするポリヌクレオチドに場合により融合されたそれらを含むか、有するか、または本質的にそれらからなる。一般に、真核細胞内で機能する強力なプロモーターを用いるのが好都合である。好ましい強力なプロモーターは、ヒトまたはマウス起源の前初期サイトメガロウイルスプロモーター(CMV-IE)であるか、あるいは場合により他の起源、例えばラットまたはモルモット起源のものである。このCMV-IEプロモーターは、エンハンサーセグメントと結合していることも、してないこともできる実際のプロモーターセグメントを含むことができる。EP-A-260148、EP-A-323597、米国特許第5,168,062号、第5,385,839号および第4,968,615号ならびにPCT出願第WO87/03905号を参照することができる。CMV-IEプロモーターは、好都合には、ヒトCMV-IE(Boshartら、1985)またはマウスCMV-IEである。

より一般的には、プロモーターは、ウイルス起源または細胞起源のいずれかである。本発明の実施に有用に用いることができるCMV-IE以外の強力なウイルスプロモーターは、SV40ウイルスの初期/後期プロモーターまたはラウス肉腫ウイルスのLTRプロモーターである。本発明の実施に有用に用いることができる強力な細胞プロモーターは、細胞骨格の遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター(Kwissaら、2000)またはアクチンプロモーター(Miyazakiら、1989)である。

これらのプロモーターの機能的サブ断片、すなわち、適切な促進活性を維持するこれらのプロモーターの部分、例えばPCT出願第WO98/00166号または米国特許第6,156,567号に記載の短縮型CMV-IEプロモーターは本発明の範囲に含まれる。従って、本発明の実施におけるプロモーターは、適切な促進活性、好ましくは、それから誘導体またはサブ断片が誘導される実際のまたは完全長プロモーターの促進活性と実質的に同様な、例えば、米国特許第6,156,567号の完全長CMV-IEプロモーターの活性に対する短縮型CMV-IEプロモーターの活性と類似した促進活性を維持し、故にプロモーターとして機能する完全長プロモーターの誘導体およびサブ断片を含む。従って、本発明の実施におけるCMV-IEプロモーターは、完全長プロモーターのプロモーター部分および/または完全長プロモーターのエンハンサー部分ばかりでなく、誘導体およびサブ断片を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなることができる。

好ましくは、プラスミドは、他の発現調節因子を含むか、または本質的にそれからなる。安定化配列(単数または複数)、例えば、イントロン配列(単数または複数)、好ましくはhCMV-IE(PCT出願第WO89/01036号)の第1イントロン、ウサギβ-グロビン遺伝子の第2イントロン(van Ooyenら、1979)を組み込むことが特に好都合である。

プラスミドおよびポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化シグナル(ポリA)に関しては、ウシ成長ホルモン(bGH)遺伝子のポリ(A)シグナル(米国特許第5,122,458号参照)またはウサギβ-グロビン遺伝子のポリ(A)シグナルまたはSV40ウイルスのポリ(A)シグナルを多く使用することができる。

本発明の他の実施形態によれば、発現ベクターは、適切な細胞系におけるタンパク質のin vitro発現のために用いられる発現ベクターである。発現されたタンパク質は、分泌後にまたは分泌後ではなく(分泌がない場合には、一般的には細胞溶解が起きるかまたは行われる)、場合により、濃縮法、例えば限外濾過により濃縮し、かつ/または精製手段、例えば親和性、イオン交換またはゲル濾過クロマトグラフィー法によって精製して、培養上清中に、または培養上清から採取することができる。

“宿主細胞”は、外因性ポリヌクレオチド、例えば組換えプラスミドまたはベクターの投与によって遺伝子改変されたまたは遺伝子改変することができる原核または真核細胞を意味する。遺伝子改変細胞について言う場合、この用語は、最初に改変された細胞およびその子孫の両方をいう。宿主細胞は、限定するものではないが、新生仔ハムスター腎臓(BHK)細胞、結腸癌(Caco-2)細胞、COS7細胞、MCF-7細胞、MCF-10A細胞、Madin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)株、ミンク肺(Mv1Lu)細胞、MRC-5細胞、U937細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、サルVero細胞(アフリカミドリザルの腎臓に起源を有する細胞株)、ウズラ(ウズラ筋肉細胞株QM7)、ニワトリ細胞株DF1およびVERO細胞を含む。所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なクローニングベクターまたは発現ベクターに挿入することができ、次に、複製および増幅のためにこのベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意の手段で宿主細胞に導入することができる。目的とするポリヌクレオチドを含むベクターは、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、f-交配、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション;パーティクルガン;リポフェクション;および感染(ベクターが感染性である場合、例えばレトロウイルスベクターである場合)を含む多くの任意の適切な手段によって宿主細胞に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入の選択は、多くの場合、宿主細胞の特徴に依存するであろう。

本発明の一実施形態において、ベクターは、US2010/0255029(参照によりその全体が本願に組み込まれる)に記載のニューカッスル病ウイルス(NDV)ベクターである。トリパラミクソウイルス1(APMV1、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科アブラウイルス属)で表わされるニューカッスル病ウイルスは、その天然に存在する株が広範囲の疾患の重症度を示すトリ病原体である。NDVは、獣医用のワクチンベクターとして特に好都合である。なぜなら、このベクター自身が、必要とされる家禽ワクチンとして役立つからである。NDV株の病原型は、無症候性腸管系(例えば、Ulster 2C、Queensland V4)、レントジェニック(例えば、Hitchner B1、F (例えば、Asplin)、La Sota)、メソジェニック(例えば、株H、Mukteswar、Roakin、Beaudette C)またはベロジェニック(例えば、Texas GB、NYオウム70181、Italien、Milano、Herts 33/56)である。NDVベクターに基づくヘルペスウイルスワクチンの利点は、限定するものではないが、(1)体液性、細胞性および粘膜反応を含む広範な免疫を誘発すること、(2)NPおよびMタンパク質を発現せず、従ってDIVA(感染動物とワクチン接種動物とを区別する)戦略と矛盾しないこと、(3)急速な免疫開始を誘発すること、(4)二価であることおよび、(5)不活化ワクチンと比較して、偶発的放出の場合に、製造により環境に与えるリスクが少ないことを含む。

NDVの特定の特徴は、異種タンパク質を発現する組換えNDV(rNDV)または操作されたNDVが大変優れたワクチン候補であることを示唆している。NDVは、多くの細胞株および卵において大変高力価に増殖し、in vivoで強力な体液性および細胞性免疫応答を誘導する。NDVは、気道および消化管粘膜表面を介して自然感染する。従って、NDVは、呼吸器疾患病原体、例えばFHVの感染防御抗原を送達するのに特に有用である。加えて、アメリカ合衆国および大部分の他の国々において、市販生NDVワクチンが広く使用されている。生NDV組換え体に基づくワクチンは、他の生組換えワクチンベクターと比較しても利点を有することができる。第1に、異種タンパク質は発現されるが、いくつかのNDVタンパク質に限られる。対照的に、ポックスウイルスおよびヘルペスウイルスベクターは、それらの大きなサイズのゲノムから多数のさらなるタンパク質を発現する。ワクチンへの応用において特定の免疫応答を得るためには、限られた数のタンパク質しか発現されないことが好都合である。第2に、NDVは、感染細胞の細胞質中でDNA相なしに複製するため、ウイルスゲノムの宿主細胞DNAへの組み込みの問題が生じない。このウイルスは、検出可能な遺伝子組換えを行わない。

一実施形態において、NDVベクターは、US2010/0255029に記載のNDV AVINEW(登録商標)である。NDVベクターはまた、米国特許第5,118,502号のベクター、特にATCC番号VR 2239として寄託された株のベクターであることもできる。

一側面において、本発明は、ワクチンまたは医薬組成物を接種した宿主動物において免疫学的応答を誘発するための前記ワクチンまたは医薬組成物であって、1以上の改変AVINEW組換えウイルスベクターを含む前記ワクチンまたは医薬組成物に関する。本発明のさらに他の側面において、操作されたまたは組換えAVINEWウイルスベクターは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、宿主に投与されたとき、その組成物またはワクチンが病原体によってコードされるタンパク質に特異的な免疫学的応答を誘発するすることができる病原体由来のヘルペスウイルス抗原タンパク質をコードするヘルペスウイルスDNA配列を含む。前記組成物は、場合により、薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたはアジュバントまたは賦形剤を含む。

用語“非必須領域”は、組織培養におけるウイルスの複製および増殖に必須ではなく、その欠失または不活化によって、種々の動物系におけるビルレンスを低下させることができるウイルスゲノムの領域のことを言う。任意の非必須領域またはその部分をAVINEWゲノムから欠失させることもできるし、それに外来配列を挿入することもでき、その欠失または挿入によって得られた操作されたAVINEWの生存性および安定性は、欠失された領域またはその部分が実際に非必須であるかどうかを確認するために使用することができる。他の実施形態において、AVINEWゲノムの非必須領域は、AVINEWゲノムのP遺伝子とM遺伝子の間の領域またはM遺伝子とF遺伝子の間の領域である。一実施形態において、非必須領域はAVINEWゲノム上のNP遺伝子の上流に位置する。他の実施形態において、非必須領域は、AVINEWゲノム上のL遺伝子の下流にある。さらに他の実施形態において、非必須領域は、非コード領域または遺伝子間領域である。この側面において、非コード領域または遺伝子間領域は、AVINEWゲノム上のNP遺伝子とP遺伝子の間、P遺伝子とM遺伝子の間、M遺伝子とF遺伝子の間またはF遺伝子とHN遺伝子の間の領域であることができる。他の実施形態において、非必須領域は、配列番号27の1nt〜121nt、1591nt〜1886nt、3074nt〜3289nt、4384nt〜4543nt、6205nt〜6411nt、8262nt〜8380ntまたは14995nt〜15186ntの領域内であることができる。

本発明の一側面は、ヘルペスウイルス抗原を発現する操作されたまたは組換えNDVベクターに関する。抗原は、ヘルペスウイルス糖タンパク質、例えば前述のgBまたはgDタンパク質であることができる。操作されたNDVベクターは、1以上のヘルペスウイルス抗原をコードする1以上のポリヌクレオチドを含むことができる。他の側面において、操作されたNDV-ヘルペスウイルスベクターは、ヘルペスウイルスgB抗原もしくはそれらのバリアント、ヘルペスウイルスgD抗原もしくはそれらのバリアントまたはそれらの組み合わせをコードする1以上のポリヌクレオチドを含む。

一実施形態において、本発明は、標的細胞におけるタンパク質、抗原、エピトープまたは免疫原の送達および発現のための製剤の治療的有効量の投与を提供する。予防的または治療的有効量の決定は、当業者にはルーチン試験である。他の実施形態において、製剤は、ヘルペスウイルス抗原、エピトープまたは免疫原を発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、ビヒクル、アジュバントまたは賦形剤を含む。他の実施形態において、薬学的または獣医学的に許容される担体、ビヒクル、アジュバントまたは賦形剤は、トランスフェクションを容易にし、かつ/またはベクターまたはタンパク質の保存を改善する。

薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたはアジュバントまたは賦形剤は当業者に公知である。例えば、薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたはアジュバントまたは賦形剤は、滅菌水、0.9%NaCl(例えば生理食塩水)溶液またはリン酸緩衝液であることができる。本発明の方法に使用できる他の薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたはアジュバントまたは賦形剤は、限定するものではないが、ポリ(L-グルタメート)またはポリビニルピロリドンを含む。薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたはアジュバントまたは賦形剤は、ベクター(またはin vitroで発明のベクターから発現されるタンパク質)の投与を容易にする任意の化合物または化合物の組み合わせであることができる。好都合には担体、ビヒクルまたはアジュバントまたは賦形剤は、トランスフェクションを容易にするかつ/またはベクター(またはタンパク質)の保存を改善することができる。本明細書において、用量および投与容量は一般的な記載において説明されているが、当業者は、過度の実験を要することなく、当該技術分野の知識と組み合わせて読まれた本開示から決定することもできる。

プラスミドに適するが、限定するものではない、第四級アンモニウム塩を含むカチオン性脂質は、次式:

(式中、R1は、12〜18炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基であり、R2は2または3炭素原子を含有する他の脂肪族基であり、Xは、アミンまたはヒドロキシル基(例えばDMRIE)である)を有するカチオン性脂質である。他の実施形態において、カチオン性脂質は、中性脂質、例えばDOPEを会合させることができる。

これらのカチオン性脂質の中で、好都合には中性脂質、好都合にはDOPE(ジオレオイル-ホスファチジル-エタノールアミン;Behr、1994)と会合してDMRIE-DOPEを形成するDMRIE(N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム;WO96/34109)が好ましい。

アジュバントとプラスミドの混合物は、その場で、かつ/または製剤の投与と同時にまたは製剤の投与の直前に調製される。例えば、好都合には、投与前に混合物が複合体を形成するのに十分な時間、例えば投与前約10〜約60分間、例えば投与前おおよそ30分間が与えられるように、投与直前または投与前にプラスミド-アジュバント混合物が調製される。

DOPEが存在する場合、DMRIE:DOPEモル比は、約95:約5〜約5:約95であり、あるいは約1:約1であり、例えば1:1であることができる。

DMRIEまたはDMRIE-DOPEアジュバント:プラスミド重量比は、約50:約1〜約1:約10であり、例えば約10:約1〜約1:約5であり、好都合には約1:約1〜約1:約2であり、例えば1:1〜1:2であることができる。

他の実施形態において、薬学的もしくは獣医学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤またはビヒクルは、油中水型エマルションであることができる。適切な油中水型エマルションの例は、抗原を含む水相6〜50容量%、好ましくは12〜25容量%、全部または一部に非代謝性油(例えばパラフィン油などの鉱油)および/または代謝可能油(例えば植物油または脂肪酸、ポリオールもしくはアルコールエステル)を含む油相50〜94容量%、界面活性剤0.2〜20p/v%、好ましくは3〜8p/v%(後者は全部または一部で、または混合物でポリグリセロールエステル(前記ポリグリセロールエステルは好ましくはポリグリセロール(ポリ)リシノール酸エステルである)またはポリオキシエチレンリシンオイルあるいは水添ポリオキシエチレンリシンオイルである)を含む4℃で安定かつ流動性のオイルベース油中水型ワクチンエマルションを含む。油中水型エマルションに用いることができる界面活性剤の例は、エトキシル化ソルビタンエステル(例えばポリオキシエチレン(20)モノオレイン酸ソルビタン(ツイーン80(登録商標))、AppliChem社、チェシア、コネチカット州から入手できる)およびソルビタンエステル(例えばモノオレイン酸ソルビタン(SPAN 80(登録商標))、Sigma Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州から入手できる)を含む。加えて、油中水型エマルションに関しては、米国特許第6,919,084号もまた参照のこと。いくつかの実施形態において、抗原を含む水相は、1以上の緩衝化剤を含む生理食塩水を含む。いくつかの実施形態において、抗原を含む水相は、1以上の緩衝化剤を含む生理食塩水を含む。一実施形態において、油中水型エマルションは水/油/水(W/O/W)3層エマルション(例えば、米国特許第6,358,500号参照)であることができる。他の適切なエマルションの例は米国特許第7,371,395号に記載されている。

本発明の免疫組成物およびワクチンは、1以上のアジュバントを含むかまたは本質的にそれらからなることができる。本発明の実施に使用するための適切なアジュバントは、(1)アクリル酸もしくはメタクリル酸、無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のポリマー、(2)免疫刺激配列(ISS)、例えば1以上の非メチル化CpGユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列(Klinmanら、1996;WO98/16247)、(3)水中油型エマルション、例えばM.Powell、M.Newman(プレナムプレス1995)によって出版された“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”の147ページに記載されているSPTエマルションおよび同書の183ページに記載されているMF59エマルション、(4)第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質、例えばDDA、(5)サイトカイン、(6)水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、(7)サポニンもしくは(8)本願に引用され、参照により組み込まれた前述の任意の文書に記載の他のアジュバント、または(9)それらの任意の組み合わせもしくは混合物である。

特にウイルスベクターに適した水中油型エマルション(3)は、軽質流動パラフィン油(欧州薬局方タイプ)、スクアラン、スクアレンなどのイソプレノイド油、アルケンのオリゴマー化によって得られるイソブテンもしくはデセンなどの油、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール、ジ(カプリラート/カプラート)、グリセロールトリ(カプリラート/カプラート)およびプロピレングリコールジオレアートなどの直鎖アルキル基を有する酸もしくはアルコールのエステル、または分枝鎖、脂肪アルコールもしくは酸のエステル、特にイソステアリン酸エステルに基づくことができる。

油は、エマルションを形成させるために乳化剤と組み合わせて用いられる。乳化剤は、非イオン界面活性剤:例えば、一方ではソルビタン、マンニド(例えばアンヒドロマンニトールオレアート)、グリセロール、ポリグリセロールもしくはプロピレングリコール、他方ではオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸もしくはヒドロキシステアリン酸のエステル(前記エステルは場合によりエトキシル化されている)またはポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、例えばプルロニック、例えばL121であることができる。

タイプ(1)アジュバントポリマーの中では、架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーが好ましく、特に糖またはポリアルコールがポリアルケニルエーテルで架橋されたポリマーが好ましい。これらの化合物は、カルボマー(carbomer)(Pharmeuropa, vol.8, no. 2, June 1996)の名称で知られている。当業者はまた、少なくとも3つのヒドロキシル基を有し、好ましくは8つ以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも3つのヒドロキシル基の水素原子が、少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって置換されているポリヒドロキシル化合物で架橋されたアクリルポリマーが記載されている米国特許第2,909,462号を指摘することもできる。好ましいラジカルは、2〜4炭素原子を含むラジカル、例えばビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルはまた、メチルなどの他の置換基を含むこともできる。カルボポル(Carbopol)(BF Goodrich社、オハイオ州、米国)の名称で販売されている製品が特に適している。カルボポルはアリルサッカロースまたはアリルペンタエリスリトールによって架橋されている。その中で、特にカルボポル974P、934Pおよび971Pがあげられる。

無水マレイン酸-アルケニル誘導体コポリマーに関しては、直鎖または架橋されたエチレン-無水マレイン酸コポリマーであって、例えばジビニルエーテルによって架橋されたEMA(Monsanto社)が好ましい。J. Fieldsら(1960)もまた参照することができる。

構造に関しては、アクリル酸またはメタクリル酸ポリマーおよびEMAは、好ましくは、次式を有する基本単位によって形成される:

(式中、R1およびR2は同一または異なることができ、HまたはCH3を表し;
x=0または1であり、好ましくはx=1であり;
y=1または2であり、ここでx+y=2である)。
EMAに関しては、x=0であり、y=2である。カルボマーに関しては、x=y=1である。

これらのポリマーは水または生理食塩液(20g/l NaCl)に可溶性であり、例えばソーダ(NaOH)によってpHを7.3〜7.4に調整して、発現ベクター(単数または複数)を混合することができるアジュバント溶液を作成することができる。最終免疫組成物またはワクチン組成物におけるポリマー濃度は、約0.01〜約1.5%w/v、約0.05〜約1%w/vおよび約0.1〜約0.4%w/vであることができる。

サイトカイン(単数または複数)(5)は、免疫組成物またはワクチン組成物中のタンパク質形であることもできるし、免疫原(単数もしくは複数)またはそれらのエピトープ(単数もしくは複数)を用い、宿主内で同時発現させることもできる。免疫原(単数もしくは複数)またはそれらのエピトープ(単数もしくは複数)を発現する同じベクターまたはそれらの異なるベクターにいずれかによるサイトカイン(単数または複数)の同時発現が好ましい。

本発明は、例えば好都合には活性成分をアジュバント、担体、サイトカイン、および/または希釈剤と混合することによるこのような組み合わせ組成物の製造を含む。

本発明に用いることができるサイトカインは、限定するものではないが、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターフェロンα(IFNα)、インターフェロンβ(IFNβ)、インターフェロンγ、(IFNγ)、インターロイキン-1α(IL-1α)、インターロイキン-1β(IL-1β)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-5(IL-5)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-9(IL-9)、インターロイキン-10(IL-10)、インターロイキン-11(IL-11)、インターロイキン-12(IL-12)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、腫瘍壊死因子β(TNFβ)およびトランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)を含む。サイトカインは、本発明の免疫組成物またはワクチン組成物と共投与および/または順次投与できることは言うまでもない。従って、本発明のワクチンは、例えば、適切なサイトカイン、例えばワクチン接種される宿主または免疫学的応答が誘導される宿主に適合するサイトカイン(例えば、ネコ科動物に投与される製剤のためのネコのサイトカイン)をin vivoで発現する外因性核酸分子を含むこともできる。

他の実施形態において、本発明の組成物は、Staufferら(Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 1, 291-296, 2006)の記載による化学的処置または物理的処置を用いて製造することができる。以下の表に、不活化技術の一部の概略を示す。

本発明の免疫組成物および/またはワクチンは、本明細書に記載の1以上の発現ベクターおよび/またはポリペプチドの防御反応または治療反応を誘導するための有効量を含むか、または本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、有効量は、過度の実験を要することなく、本開示に組み込まれた文書および当該技術分野の知識を含む本開示から決定することができる。

本発明の組成物またはワクチンは、卵内、飲料水、口鼻内、スプレー、エアゾール、鼻腔内滴下、点眼薬、くちばし浸漬(beak-dipping)、翼膜穿刺(wing-web stabbing)、経皮、皮下もしくは筋肉内注入で動物に投与することができる。好都合には、ワクチンは口鼻内、皮下、点眼薬、スプレーまたは飲料水で投与される。

本発明は、本発明によって製造される治療用組成物の有効量の、動物への少なくとも1つの投与を考える。本発明の治療用組成物は、無針装置(例えば、Pigjet、Dermojet、Biojector、VetjetまたはVitajet装置(Bioject社、オレゴン州、米国))によって投与することができる。

本発明の一実施形態において、少なくとも1つの第1投与および、少なくとも1つの共通のタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を用いる少なくとも1つのブースター投与を含むプライム-ブーストレジメンを用いることができる。第1投与に用いられる免疫組成物またはワクチンは、ブースターとして用いられるものとは性質が異なる。しかしながら、第1投与およびブースト投与として同じ組成物を用いることができることに注意されたい。この投与プロトコルは“プライム-ブースト”と呼ばれる。

本発明のプライム-ブーストプロトコルの他の側面において、操作されたAvinew NDVヘルペスウイルスワクチンまたは組成物を含む組成物の投与に続いて、ヘルペスウイルス抗原を含み、in vivoで発現する組換えウイルスベクターを含むワクチンもしくは組成物またはヘルペスウイルス抗原を含む不活化ウイルスワクチンもしくは組成物またはヘルペスウイルスサブユニット(タンパク質)を含むワクチンもしくは組成物またはヘルペスウイルス抗原を含むかもしくは発現するDNAプラスミドワクチンもしくは組成物が投与される。同様に、プライム-ブーストプロトコルは、ヘルペスウイルス抗原を含みin vivoで発現する組換えウイルスベクターを含むワクチンもしくは組成物またはヘルペスウイルス抗原を含む不活化ウイルスワクチンもしくは組成物またはヘルペスウイルスサブユニット(タンパク質)を含むワクチンもしくは組成物またはヘルペスウイルス抗原を含むかもしくは発現するDNAプラスミドワクチンもしくは組成物の投与に続いて、操作されたAvinew NDVヘルペスウイルスワクチンまたは組成物を含む組成物の投与を含むことができる。第1投与および第2投与は、どちらも操作されたAvinew NDVヘルペスウイルスワクチンまたは組成物を含む組成物を含むことができることに注意されたい。さらに、第1投与および第2投与は、どちらも本発明の操作されたNDV-HVベクターを含む1以上の組成物を含むことができることにも注意されたい。

プライム-ブーストプロトコルは、少なくとも1つのプライム投与および、少なくとも1つの共通の抗原を用いる少なくとも1つのブースト投与を含む。プライム投与に用いられるワクチンまたは組成物は、後でブースターワクチンまたは組成物として用いられるものとは性質が異なることができる。プライム投与は1以上の投与を含むことができる。同様に、ブースト投与は1以上の投与を含むことができる。

それぞれの投与は、好ましくは、約1〜約6週間離して行われるか、または約2〜約4週間離して行われる。2〜6週間毎に反復されるブースターまたは年一回のブースターもまた考えられる。動物は、好ましくは、第1投与の時点で少なくとも1日齢である。

免疫組成物および/またはワクチンは、1用量当たり、ヘルペスウイルス抗原、エピトープまたは免疫原を発現する組換えアデノウイルスのウイルス粒子を約10⁴〜約10¹¹、好都合には約10⁵〜約10¹⁰、より好都合には約10⁶〜約10⁹含む。ポックスウイルスに基づく免疫組成物および/またはワクチンの場合は、用量は約10²pfu〜約10⁹pfuであることができる。この免疫組成物および/またはワクチンは、1用量当たり、ヘルペスウイルス抗原、エピトープまたは免疫原を発現するポックスウイルスまたはヘルペスウイルス組換え体を約10²〜約10⁷、好都合には約10³〜約10⁵pfu含む。

ウイルスベクターは、弱毒化アビポックス発現ベクターであることができる。一実施形態において、アビポックス発現ベクターは鶏痘ベクター、例えばTROVAC(登録商標)であることができる。他の実施形態において、アビポックス発現ベクターはキャナリーポックスベクター、例えばALVAC(登録商標)であることができる。ヘルペスウイルス抗原、エピトープまたは免疫原は、ヘルペスウイルス糖タンパク質、例えばgBまたはgDであることができる。本発明の方法に用いることができる他のウイルスは、限定するものではないが、ワクシニアウイルス(例えば弱毒化ワクシニアウイルス、例えばNYVAC)、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスを含む。

ワクチンの有効性は、最終免疫処置の約2〜4週間後にヘルペスウイルスの毒性株で動物をチャレンジすることによって試験することができる。ワクチンの有効性を試験するためのチャレンジには、同種株、異種株のどちらも用いることができる。動物には、スプレー、鼻腔内、点眼薬、眼鼻、IM、気管内および/または経口でチャレンジすることができる。チャレンジウイルスは、投与経路に依存した容量に約10³〜約10⁸含まれることができる。例えば、投与がスプレーによる場合、ウイルス懸濁液は、エアゾール化されて約1〜100μmの液滴が生成される。投与が鼻腔内、気管内または経口である場合、チャレンジウイルスの容量は約0.05〜約5mlである。標的種用の組成物の投与容量、例えばネコ科動物用組成物の投与容量は、卵内には約50μl、点眼薬には約20〜約50μl、スプレーには約0.25ml〜約1mlであることができる。チャレンジ後、臨床徴候および死亡率に関して、動物を1日一回14日間観察することができる。さらに、動物群を安楽死させて、病理所見を評価することができる。チャレンジ後、ウイルス検出のために、全動物から中咽頭、気管または総排出腔スワブを採取することができる。組織におけるウイルス抗原の存否は、免疫組織化学、ウイルスの単離もしくは滴定または核酸検出、例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって評価することができる。チャレンジ後に血液試料を採取することができ、抗ヘルペスウイルスgBまたはgDウイルス特異抗体の存在に関して分析することができる。

本明細書における開示は、例として提供されるものであって、本発明がそれらに限定されないことは当業者には明らかであろう。本明細書における開示および当該技術分野での知識から、当業者は、過度の実験を要することなく、各免疫処置プロトコルに用いられる投与回数、投与経路および用量を決定することができる。

本発明の他の実施形態は、動物においてヘルペスウイルスに対する免疫学的または防御反応を誘発する方法を実施するためのキットであって、組換えNDV免疫組成物もしくはワクチンまたは不活化ヘルペスウイルス免疫組成物もしくはワクチンを含む前記キットおよび、動物において免疫応答を誘導するための有効量の送達方法を実施するための使用説明書である。

限定するものではない以下の実施例で、本発明をさらに説明する。

DNA挿入物、プラスミドおよび組換えウイルスベクターの構築は、当該技術分野で公知の標準的分子生物学技術、例えば、J.Sambrookらによって記載された技術(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)によって行った。

ネコヘルペスウイルス(FHV)gB遺伝子(pFR14プラスミド)およびgD遺伝子(pFR16プラスミド)を含むNDV転写プラスミドの構築
NDVゲノムに挿入されるFHV gB遺伝子を哺乳動物での発現のためにコドン最適化した。合成FHV gB遺伝子(配列番号2)をpBR322ベースベクターにクローニングして、図3に示すように、挿入カセットを含むプラスミドpFR13を得た。プラスミドpFR13をPacIおよびFseIで消化し、大きさが3105bpのPacI-FseI断片を作成した。プラスミドpIV029(US2010/0255029)をPacIおよびFseIで消化し、大きさが19140bpのFseI-PacI断片を作成した。2つの断片をライゲーションしてプラスミドpFR14を作成した(図4)。

NDVゲノムに挿入されるFHV gD遺伝子を哺乳動物での発現のためにコドン最適化した。合成FHV gD遺伝子(配列番号5)をpBR322ベースベクターにクローニングし、図3に示すように、挿入カセットを含むプラスミドpFR15を得た。プラスミドpFR15をPacIおよびFseIで消化し、大きさが1373bpのPacI-FseI断片を作成した。プラスミドpIV029をPacIおよびFseIで消化し、大きさが19140bpのFseI-PacI断片を作成した。2つの断片をライゲーションしてプラスミドpFR16(図4)を作成した。

FHV gB遺伝子を発現するNDVベクター(vAVW07)の作成および解析
NDVはマイナス鎖RNAウイルスであり、遺伝子改変NDVウイルスの作成には逆遺伝学系が必要である。完全長ウイルスゲノムRNAの転写ならびにNP、PおよびLタンパク質の同時発現により、RNPのアセンブリおよび、プラス鎖RNAゲノムのマイナス鎖RNAゲノムへの転写が可能になる。これにより、NDVウイルスの通常の複製サイクルが開始され、感染性粒子の生成が可能となる(図2参照)。

FHV gB遺伝子を発現する操作されたNDVベクターを作成するために、以下の試薬および条件を用いた。転写プラスミドとしてプラスミドpFR14(実施例1参照)を用いた。NP、PおよびLタンパク質の発現プラスミドとして、それぞれ、プラスミドpIV32、pIV33およびpIV34(US2010/0255029)を用いた。T7 RNAポリメラーゼプラスミドとしてプラスミドpNS151(US2010/0255029)を用いた。図2Cに概略を示すように、これらの5つのプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に同時トランスフェクトした。72時間後、10日齢の孵化鶏卵にCHO上清を接種し、ウイルスを増殖させた。3日後、尿膜液を採取し、ニワトリの赤血球を用いて赤血球凝集活性(HA)をチェックした。NDV-FHV gBの感染性粒子が首尾よく得られた。QuiaAMPウイルスRNA抽出キット(Qiagen社)を用いてRNAを抽出した。One-Step RT-PCRキット(Qiagen社)を用いてRT-PCRを行った。配列決定結果により、gB遺伝子は、転写プラスミドにクローニングされたgB遺伝子の元の配列と100%同一であることが示された。この組換えNDV-FHV gBウイルスベクターをvAVW07と呼ぶ。

FHV gD遺伝子を発現するNDVベクター(vAVW08)の作成および解析
FHV gD遺伝子を発現する操作されたNDVベクターを作成するために、以下の試薬および条件を用いた。転写プラスミドとしてプラスミドpFR16(実施例1参照)を用いた。NP、PおよびLタンパク質の発現プラスミドとしてプラスミドpIV32、pIV33およびpIV34(US2010/0255029)を用いた。T7 RNAポリメラーゼプラスミドとしてプラスミドpNS151(US2010/0255029)を用いた。図2Cに概略を示すように、これらの5つのプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に同時トランスフェクトした。CHO細胞のトランスフェクションの72時間後、10日齢の孵化鶏卵にCHO上清を接種し、ウイルスを増殖させた。3日後、尿膜液を採取し、ニワトリの赤血球を用いて赤血球凝集活性(HA)をチェックした。NDV-FHV gDの感染性粒子が首尾よく得られた。

QuiaAMPウイルスRNA抽出キット(Qiagen)を用いてRNAを抽出した。One-Step RT-PCRキット(Qiagen)を用いてRT-PCRを行った。このRT-PCR反応には2つのプライマー:
FR09:CGCAGCTGCAATCAATTCAG(配列番号25)
FR10:TGGGTGGACAGGGATCTGCT(配列番号26)
を用いた。

配列決定結果は、このgD遺伝子が、転写プラスミドにクローニングされたgD遺伝子の元の配列と100%同一であることを示している。この組換えNDV-HV gDウイルスベクターをvAVW08と呼ぶ。

ネコにおけるNDV-HVワクチンの臨床評価
9〜11週齢のSPF(特定病原体不在)ネコ32匹を本研究に含めた。要素数4の割付表を用いて、同腹子、性別、年齢に従って、ネコをネコ8匹の4群(群A〜D)に無作為に割り付けた。地域の飼育および動物福祉の手順に従って、ネコをケアし、収容した。

表1に実験計画を示す。

D0およびD28において、NDV-HV gBおよびNDV-HV gDワクチンをそれぞれ1/25および1/35に希釈して、両方のワクチンの力価を10^7.8EID₅₀/mLにした。次いで、群Aからの各ネコに、全身麻酔下、口鼻内経路(経鼻腔に0.25mL、口内に0.5ml)でNDV-HVワクチン(NDV-HV gBおよびNDV-HV gD)1mLを投与した。群Bからのネコに、両肩間に皮下経路でNDV-HVワクチン1mLを投与した。群Cからのネコに、両肩間に皮下経路で対照ワクチン1用量を投与した。群Dからのネコにはワクチン接種しなかった。

D45に、各ネコに、全身麻酔下、1/50希釈チャレンジ株10^5.56CCID50/mLを1mL(経鼻腔で0.25mL、眼当たり0.25mL)投与した。

直腸温検査を図5に示す。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり、群Dは対照(ワクチン接種なし)である。その結果、対照群において、ネコの7/8が高体温を示した。ワクチン接種群においては、陽性対照およびONでのNDV-HVでは高体温は認められず、SCでNDV-HVをワクチン接種されたネコの4/8において、高体温が認められた。

体重結果を図6および表2に示す。免疫処置期間中、すべてのネコは体重が増加し、成長は群間で同様であった。

チャレンジ後(pc)、群Dにおいて、pc4日目からpc8日目まですべてのネコが体重減少した。ネコの一部(8匹中3匹)は、pc10日目まで体重減少した。次いで、すべてのネコが体重増加した。チャレンジ後のモニタリング期間中に1度か2度、ネコ8匹中6匹において>5%の体重減少が記録された。群Cにおいて、ネコ8匹中6匹において、pc4日目から6日目または8日目の間に体重減少が観察された。この体重減少は、ネコ4匹において>5%であった。群Bにおいて、すべてのネコは、pc4日目と6日目または8日目との間に体重減少した。ネコ2匹のみにおいて、>5%の体重減少が1度認められた。

図7は、チャレンジ後の各群の平均臨床スコアを示し、表3は、観察された臨床症状の概略を示す。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり群Dは対照(ワクチン接種なし)である。群Dにおいて、すべてのネコは、チャレンジ後に臨床徴候を示した。群Aにおいて、ネコ1匹は、チャレンジ後になんら臨床徴候を示さず、ネコ3匹は、1日間の軽度の鼻漏または2日間の軽度の眼脂を示したのみだった。群Aからの他のネコ、群Bからのネコおよび群Cからのネコは、群Dのネコよりも重症度の低い、より一過性の臨床徴候を示した。

図8は、各群の総臨床スコアの分布を示す。平均総臨床スコアは、群Aでは7.5であり、群Bでは18.6であり、群Cでは17.4であり、群Dでは33.8であった。群Dとワクチン接種された3つの群との間には有意差が認められた。ワクチン接種された3つの群の間には、総臨床スコアに関して有意差が認められた(ANOVA、p=0.018)。群Aからのネコは、群Bおよび群Cからのネコよりも著しく低下した臨床総スコアを示した。群Bと群Cの間には、総臨床スコアに関して有意差は認められなかった。

図9は、チャレンジ後の各群の平均ウイルス排出を示し、表4は、各群の平均AUCの概略を示す。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり、群Dは対照(ワクチン接種なし)である。

チャレンジ前にネコヘルペスウイルスを排出するネコはなかった。チャレンジ後、すべてのネコにおいてFHVが単離された。群Dにおいては、排出は急激に増加し、pc4日目にピークに達し、次いでpc14日目まで規則正しく減少した。pc14日目では、ネコ8匹中5匹が、なお少量のウイルスを排出した。ワクチン接種された群においては、群BおよびCでは、ウイルス排出はpc4日目にピークに達し、群Aでは、pc6日目にピークに達した。次いで、群Dの場合よりもより急速に減少した。pc14日目には、ウイルスを排出するネコはなかった。

図10は、各群の総ウイルス排出スコアの分布を示す。ウイルス排出は、群D(ワクチン接種なし)と比較して、ワクチン接種された群において著しく低下していた。群Aからのネコは、ワクチン接種された他の群のよりも遅れてウイルスを排出したが、ワクチン接種された3つの群の間で、ウイルス排出に関して統計的に有意な差はなかった(ANOVA、p=0.464)。

血清検査(抗gB FHV Ab)データを図11に示す。群AはONでのNDV-HVであり、群BはSCでのNDV-HVであり、群Cは陽性対照(弱毒化ネコヘルペスウイルスF2株を含むワクチン、Merial社)であり、群Dは対照(ワクチン接種なし)である。すべてのネコは、D0においてgB-FHVに対して血清反応陰性であった。群Dにおけるすべてのネコは、チャレンジ日まで血清反応陰性のままであった。群Dにおけるすべてのネコは、D28の後に、gB FHV Abに対して陽性であった。SCまたはONでのNDV-HVの1回の注射で、すべてのネコにおいてセロコンバージョンを誘発するのに十分であった。チャレンジによって、ワクチン接種を受けた動物すべてにブースター効果が誘発され、すべての対照ネコにおいてFHV Abの産生が誘発された。この血清検査データは、臨床結果によく対応している。

本発明の好ましい実施形態をここまで詳細に説明してきたが、上記のパラグラフによって規定される本発明は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく多くの見かけの変形が可能であるため、上記の説明で述べた特定の詳細に限定されるべきではないことを理解しなければならない。

本明細書に引用または参照したすべての文献(“本明細書に引用した文献”)および本明細書に引用した文献において引用または参照されたすべての文献は、本明細書または本明
細書に参照により組み込まれた任意の製品に関する任意の製造業者の使用説明書、説明書、製品仕様書および製品シートと共に参照により本願に組み込まれ、本発明の実施に用いることができる。

本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕(i)1以上の組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)-ヘルペスウイルスベクターおよび(ii)薬学的または獣医学的に許容される担体を含む組成物またはワクチン。
〔２〕組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターが、1以上のヘルペスウイルス抗原、ポリペプチドまたはそれらのバリアントをコードする1以上の異種ポリヌクレオチドを含む、前記〔1〕に記載の組成物またはワクチン。
〔３〕ヘルペスウイルス抗原またはポリペプチドが、ヘルペスウイルス糖タンパク質B(gB)もしくは糖タンパク質D(gD)またはそれらのバリアントである、前記〔2〕に記載の組成物またはワクチン。
〔４〕組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記〔2〕または〔3〕に記載の組成物またはワクチン。
〔５〕組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号2、3、5または6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、前記〔2〕または〔3〕に記載の組成物またはワクチン。
〔６〕組成物またはワクチンが、1つまたは2つのNDV-ヘルペスウイルスベクターを含む、前記〔1〕〜〔5〕のいずれか1つに記載の組成物またはワクチン。
〔７〕組成物またはワクチンが、ヘルペスウイルスgB抗原またはそれらのバリアントを含む第1NDV-ヘルペスウイルス組換えベクターおよび、ヘルペスウイルスgD抗原またはそれらのバリアントを含む第2NDV-ヘルペスウイルス組換えベクターを含む、前記〔6〕に記載の組成物またはワクチン。
〔８〕組成物またはワクチンが、ヘルペスウイルスgB抗原もしくはそれらのバリアント、ヘルペスウイルスgD抗原もしくはそれらのバリアントまたはそれらの組み合わせを含むNDV-ヘルペスウイルス組換えベクターを含む、前記〔6〕に記載の組成物またはワクチン。
〔９〕NDV-ヘルペスウイルス組換えベクターが、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記〔6〕〜〔8〕のいずれか1つに記載の組成物またはワクチン。
〔１０〕組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号2、3、5または6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、前記〔6〕〜〔8〕のいずれか1つに記載の組成物またはワクチン。
〔１１〕ヘルペスウイルスgB抗原もしくはそれらのバリアント、ヘルペスウイルスgD抗原もしくはそれらのバリアントまたはそれらの組み合わせをコードする1以上のポリヌクレオチドを含む組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
〔１２〕1以上のポリヌクレオチドが、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有する1以上のポリペプチドをコードする、前記〔11〕に記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
〔１３〕1以上のポリヌクレオチドが、配列番号2、3、5または6に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、前記〔11〕に記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
〔１４〕NDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記〔11〕〜〔13〕のいずれか1つに記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
〔１５〕NDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記〔11〕〜〔13〕のいずれか1つに記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
〔１６〕NDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする2つのポリヌクレオチドを含む、前記〔11〕〜〔13〕のいずれか1つに記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
〔１７〕1以上のポリヌクレオチドがNDV Avinewゲノムの非必須領域に挿入される、前記〔11〕〜〔16〕のいずれか1つに記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
〔１８〕動物においてヘルペスウイルスに対する防御反応を誘導する方法であって、少なくとも1つのヘルペスウイルス抗原を発現する組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを前記動物に投与することを含む前記方法。
〔１９〕NDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有する1以上のポリペプチドをコードする1以上のポリヌクレオチドを含む、前記〔18〕に記載の方法。
〔２０〕投与が口鼻内、点眼薬、スプレー、飲料水、卵内、筋肉内投与であるか、あるいは皮下投与、皮内、経皮である、前記〔18〕または〔19〕のいずれか1つに記載の方法。
〔２１〕投与がプライム-ブーストである、前記〔18〕〜〔20〕のいずれか1つに記載の方法。
〔２２〕動物がネコ科動物またはイヌ科動物である、前記〔18〕〜〔21〕のいずれか1つに記載の方法。

Claims (14)

1. 組成物またはワクチンであって、該組成物又はワクチンが、
   （ｉ）ネコヘルペスウイルスgB抗原をコードする異種ポリヌクレオチドを含む第１の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター、及び、ネコヘルペスウイルスgD抗原をコードする異種ポリヌクレオチドを含む第２の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター、
   又は、
   ネコヘルペスウイルスgB抗原をコードする異種ポリヌクレオチド及びネコヘルペスウイルスgD抗原をコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターと、
   （ii）薬学的または獣医学的に許容される担体とを含み、
   該組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号２７に示されるゲノムを含む、該組成物又はワクチン。
2. 組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物またはワクチン。
3. 組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号2、3、5または6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物またはワクチン。
4. ヘルペスウイルスgB抗原及びヘルペスウイルスgD抗原をコードする1以上のポリヌクレオチドを含む組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターであって、該組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターが配列番号２７に示されるゲノムを含む、該組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
5. 1以上のポリヌクレオチドが、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有する1以上のポリペプチドをコードする、請求項４に記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
6. 1以上のポリヌクレオチドが、配列番号2、3、5または6に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項４に記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
7. NDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４〜６のいずれか1つに記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
8. NDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４〜６のいずれか1つに記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
9. 1以上のポリヌクレオチドが、配列番号２７に示されるNDVゲノムの非必須領域に挿入されている、請求項４〜８のいずれか1つに記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクター。
10. 非ヒト動物においてヘルペスウイルスに対する防御反応を誘導する方法であって、請求項４に記載の組換えNDV-ヘルペスウイルスベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤若しくはビヒクル、又は、請求項１に記載の組成物若しくはワクチンを前記非ヒト動物に投与することを含む前記方法。
11. NDV-ヘルペスウイルスベクターが、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有する1以上のポリペプチドをコードする1以上のポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 投与が口鼻内、点眼薬、スプレー、飲料水、卵内、筋肉内投与であるか、あるいは皮下投与、皮内、経皮である、請求項１０または１１のいずれか1つに記載の方法。
13. 投与がプライム-ブーストである、請求項１０〜１２のいずれか1つに記載の方法。
14. 動物がネコ科動物またはイヌ科動物である、請求項１０〜１３のいずれか1つに記載の方法。

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