JPH11504631A - Ｄｎａ／脂質複合体の単一バイアル製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトにおける臨床使用のためのプラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の単一バイアル製剤に関し、該製剤は種々の異なる方法により製造され、例えば、(a) オートクレーブでの滅菌の間の脂質の分解を実質的に防止するのに十分に高い濃度のカチオン性脂質溶液をオートクレーブで滅菌し、(b) 下記ステップ(d)の間の脂質の凝集を実質的に防止するのに十分な程度、ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質溶液を希釈し、(c) プラスミドDNA溶液を濾過滅菌し、(d)ステップ(c)の滅菌されたプラスミドDNA溶液を、等張より低いイオン強度でステップ(b)の希釈され滅菌されたカチオン性脂質溶液に加えてDNA/脂質複合体を形成し、(e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体をほぼ等張に調節する各ステップを含む方法により製造される。

Description

【発明の詳細な説明】 DNA/脂質複合体の単一バイアル製剤 発明の分野 本発明はヒトにおいて臨床的に使用するためのプラスミドDNA/カチオン性脂質 複合体の単一バイアル製剤及び関連する方法に関する。 発明の背景 悪性腫瘍や心臓血管性疾患を含む人間の疾病の治療のために、プラスミドDNA/ カチオン性脂質複合体を使用してin vivo（イン・ビボ）で遺伝子を移入するこ とが、ヒトにおいて活発に臨床試験されつつある。 国立衛生研究所(NIH)の組換DNA諮問委員会(RAC)は、新生物の免疫療法のため の、脂質により媒介される免疫原コード遺伝子の腫瘍への移入を使用するヒト臨 床プロトコールを行うことをNabelらに承認した。Nabel et al.，Proc ．Natl. A cad．Sci．USA 90:11307(1993); Nabel et al.，Human Gene Therapy 3:399(199 2)を参照。Nabel et al.，Human Gene Therapy 5:57(1994)、PCT特許出願WO94/2 9469も参照。DC-Chol/DOPEカチオン性脂質混合物を使用したDNA/リポソーム複合 体を注射することにより、進行性黒色腫に罹患したHLA-B7陰性の患者に外来の主 要組織適合複合体タンパク質をコードする遺伝子HLA-B7が導入された。上記Nabe l et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA。第IV期の黒色腫を有する５人のHLA-B7 陰性患者に、合併症を伴うことなく６回（即ち１人の患者は２回目の投与を受け た）の投与が完了された。注射後3〜7日の治療された腫瘍結節の生検中で、ポリ メラーゼ連鎖反応によりプラスミドDNAが検出されたが、血清中ではどの時点で も見い出されなかった。５人全ての患者で腫瘍生検組織における免疫組織化学的 方法により組換えHLA-B7タンパク質の存在が明らかにされ、HLA-B7及び自己由来 の腫瘍に対する免疫反応が検出できた。DNAに対する抗体はどの患者にも検出さ れなかった。１人の患者は独立した２つの治療において注射された結節の退縮を 示し、遠部位での退縮を伴うものであった。これらの研究は、ヒトにおける脂質 媒介遺伝子移入の実行可能性、安全性、及び治療能力 を明らかにした。Stewart et al.，Human Gene Therapy，3:267（1992）(DNA/脂 質複合体によるin vivoでの遺伝子移入の安全性及び無毒性); Nabel et al.，Hu man Gene Therapy ，3:649（1992）(DNA/脂質複合体によるin vivoでの遺伝子移 入による自己免疫の不在及び生殖腺局在化); San et al.，Human Gene Therapy ，4:781（1993）(ヒト遺伝子治療用の新規なカチオン性脂質混合物、DMRIE/DOPE の安全性及び無毒性)も参照。 Nabelらの研究の結果として、Vical Incorporatedは、改善されたカチオン性 脂質混合物、DMRIE/DOPEを使用した複数箇所での臨床試験を計画した。Vogelzan g et al.，Human Gene Therapy，5:1357(1994); Hersh et al.，Human Gene The rapy ，5:1371(1994); 及びRubin et al.，Human Gene Therapy，5:1385(1994)。 食品医薬品局(FDA)はこれらの臨床プロトコールを認可した。 FDAは最近、悪性腫瘍の治療のために、サイトカインコード遺伝子の脂質に媒 介される腫瘍への移入を使用する臨床プロトコールを行うこともVical Incorpor atedに許可した。実施例８を参照。前臨床試験において、ヒトインターロイキン -2(IL-2)遺伝子を含むプラスミドDNA発現ベクターの腫瘍内注射により腫瘍形成 の発生率が減少し、腫瘍の成長が遅延された。腫瘍部位でのサイトカインの局所 的発現によって、効能を得るために全身投与に比べて低レベルのサイトカインし か必要とせず、そのようなレベルは十分に低く患者に毒性を与えないものである と考えられる。これらの知見は、プラスミドDNA発現ベクターを腫瘍内注射する ことによるIL-2の腫瘍への導入が抗腫瘍反応を活性化し得ることを示唆するもの である。計画された試験では、ヒトIL-2タンパク質をコードするプラスミドDNA 及びDMRIE/DOPEカチオン性脂質混合物を使用して、この方法を固体悪性腫瘍を有 するヒト患者に適用するものである。 ポリヌクレオチド/脂質法の広範な有用性は、DNA(Felgner et al.，Proc ．Nat l．Acad．Sci．U.S.A. ，84:7413(1987); Felgner，P.L.，Adv ．Drug Delivery R ev. ，5:167(1990); Felgner et al.，Nature，337:387(1989); Brigham et al. ，Am．J．Respir．Cell．Mol．Biol.，1:95(1989); Muller et al.，DNA Cell B iol. ，9:221(1990); Burger et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.， 89:2145(1992))、mRNA(Weiss et al.，J ．Virol.，63:5310(1989); Malone et a l.，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，86:6077(1989))、及びアンチセンスオリ ゴマー(Chiang et al.，J ．Biol．Chem.，266:18162(1991); Bennett et al.，M ol ．Pharmacol. ，41:1023(1992))の生体細胞へのカチオン性脂質依存のデリバリ ーを示す研究により確認されてきた。1987年の最初の刊行物以来、いくつかの試 薬が市販されるようになり(Behr et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，86: 6982(1989); Rose et al.，Biotechniques，10:520(1991); Leventis et al.，B iochim ．Biophys．Acta. ，1023:124(1990))、さらに別のカチオン性脂質試薬が 報告され、前記の市販品に対する優位性を記載している(Farhood et al.，Bioch im ．Biophys．Acta. ，1111:239(1992); Gao et al.，Biochem ．Biophys．Res．C ommum. ，179:280(1991); Legendre et al.，Pharmaceutical Res.，9:1235(1992 ); Zhou et al.，Biochim ．Biophys．Acta.，1065:8(1991); Pinnaduwage et al .，Biochim ．Biophys．Acta.，986:33(1989))。この方法の広範な適用可能性は 、血管カテーテル(Nabel et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，89:5157(19 92); Lim et al.，Circulation，83:2007(1991); Yao et al.，Proc ．Natl．Aca d．Sci．U.S.A. ，88:8101(1991); Nabel et al.，Science，249:1285(1990))、 肺上皮細胞(Stribling et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，89:11277(199 2); Brigham et al.，Am ．J．Med．Sci.，298:278(1989); Yoshimura et al.，N ucleic Acids Res. ，20:3283(1992))、脳組織(Jiao et al.，Exp ．Neurol.，115 :400(1992); Ono et al.，Neurosci ．Lett.，117:259(1990))、ツメガエル胚(De meneix et al.，Int ．J．Dev．Biol.，35:481(1991); Holt et al.，Neuron，4: 203(1990))、及び体循環系(Zhu et al.，Science，261:209(1993); Philip et a l.，J ．Biol．Chem.，268:16087(1993))への、カチオン性脂質に依存する遺伝子 デリバリーを示すin vivoでの前臨床試験でさらに確認されてきた。 しかし、治療目的のためのプラスミドDNA製剤のためには、DNAを製造現場から 臨床現場へ運ぶ際にその中でDNAが市販品として有効であるだけの貯蔵期間を有 するようにできる、医薬として許容されるビヒクルを見つけることが必要と なる。実験室でプラスミドDNAを取り扱うためには通常キレート化物質を結合す るトリス-(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)を含むバッファーが一般に使 用されるが、これらのバッファーは臨床での非経口的使用を認められていない。 それらが使用できないとすると、製造装置中でプラスミドDNAを効率よく取り扱 うことができるようにし、輸送や貯蔵の間プラスミドDNAを化学的、生物学的に 完全なまま保ち、好ましい投与経路により所望の組織標的へそのDNAを効率よく デリバリーするビヒクルを見出す必要がある。 プラスミドDNAを含む製剤中にカチオン性脂質を含有させることは、医薬的使 用に適したビヒクルの選択にさらに別な複雑さを持ち込むことになる。この場合 、個々の逆の極性に荷電した成分及びそれらが形成する複合体の溶解度及び安定 性が単一の媒体の中で適合している必要がある。プラスミドDNA/カチオン性脂質 複合体の形成及び保存がその製品の機能を発揮させるために必須であると考えら れる場合、医薬的使用のために選択されるビヒクルはこの相互作用を阻害しない ことが必要である。 製品の安定性は冷凍貯蔵により高めることができるが、これはプラスミドDNA とカチオン性脂質の混合物用のビヒクルの選択にさらに別な制限を課すことにな る。この場合は、個々の成分の安定性に加えて、プラスミドDNAと脂質との間に 形成された複合体の安定性を考慮する必要がある。具体的には、冷凍温度での貯 蔵期間の間、プラスミドDNA/脂質複合体の溶解度及び完全性が維持されるように 製剤を設計することが必要である。 ヒト患者におけるNabelらの初期の研究は、腫瘍細胞のトランスフェクション を成功させるにはプラスミドDNAをカチオン性脂質と組み合わせて投与すること が必要なことを明らかにした。上述。実際、多くのin vivoでの遺伝子療法の適 用において、効能を得るためにはDNAと脂質との混合物を投与することが必要で あることが示されている。これらのプロトコールでは、プラスミドDNA/脂質複合 体は安定でないため、複数のバイアルを用いた構成で臨床現場に遺伝子治療投与 量を供給していた。この構成では、ビヒクル中のプラスミドDNAが１つのバイア ルの中に存在している。脂質混合物は乾燥した薄膜としてあるいは溶液中 にもう１つの別のバイアル中に存在している。脂質混合物が乾燥形態で提供され るときには、脂質を再水和するための希釈剤を含むもう１つのバイアルが病院に 提供される。 製品のこの構成のため、病院のスタッフは複数回の連続希釈及び添加のステッ プを実行することにより、現場で患者の投与量を調製する必要がある。まず、病 院のスタッフはビヒクル中のDNAを用意しなげればならない。第２に、脂質を得 なければならない。第３に、安定性の問題のためにそのようにすることが多いの であるが、脂質が乾燥した薄膜である場合、均一になるまで撹拌することにより 製剤用バッファーを用いて脂質を再水和する必要がある。第４に、再構成された 脂質をDNA溶液の中に移し、混合する必要がある。最後に第５番目として、患者 へ規定量を投与しなくてはならない。任意に、投与量を徐々に増やして投与する ために、DNA/脂質複合体の希釈溶液を調製することができる。 このような構成はフェーズI臨床試験においては許容できるものであるが、製 造が煩わしく、法的なガイドラインに従って管理することが困難であり、輸送及 び貯蔵するのにコストがかかり、そして病院のスタッフび医師にとっては使用す るのが煩雑である。重要なこととして、患者に投与される投与量となる最終生成 物の製造において、一貫性が制御できず、あるいは確保できない。これらの制限 により、ヒトにおける臨床使用用のプラスミドDNA/カチオン性脂質の単一バイア ル製剤が必要なことは明らかである。 従って、本発明の目的は、医薬上許容できるビヒクルにDNA及び脂質を合わせ た単一バイアル製剤を提供することである。 別の目的は、DNA及び脂質の効力を維持する単一バイアル製剤を提供すること である。 また別の目的は、貯蔵期間の間、安定性を有する単一バイアル製剤を提供する ことである。 さらに別の目的は、普遍的に適用できる単一バイアル製剤を提供することであ る。 さらにまた別の目的は、適切な安全性試験により示される安全性を有する単 一バイアル製剤を提供することである。 別の目的として、病院のスタッフが調製しやすく、医師が投与しやすい単一バ イアル製剤を提供することである。 本発明のこれらの目的及びその他の目的は本明細書全体により当業者に明らか となるであろう。 発明の要旨 本発明は、in vivoまたはex vivo（半ビボ）でのヒトにおける臨床使用のため の、医薬的に許容できるビヒクル中のポリヌクレオチド/脂質複合体の単一バイ アル製剤の製造方法であって、(a) 脂質溶液を滅菌し、(b) ポリヌクレオチド溶 液を滅菌し、(c) 等張より低いイオン強度において希釈形態でステップ(b)の滅 菌されたポリヌクレオチド溶液をステップ(a)の滅菌された脂質溶液と合わせて ポリヌクレオチド/脂質複合体を形成し、(d) ステップ(c)のポリヌクレオチド/ 脂質複合体をほぼ等張に調節する各ステップを含む前記方法を提供するものであ る。 本発明はさらに、ヒトにおける臨床使用のためのプラスミドDNA/カチオン性脂 質複合体の単一バイアル製剤の製造方法であって、(a) 高濃度のカチオン性脂質 溶液をオートクレーブで滅菌し、(b) ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質 溶液を希釈し、(c) プラスミドDNA溶液を濾過滅菌し、(d) ステップ(c)の滅菌さ れたプラスミドDNA溶液を、等張より低いイオン強度でステップ(b)の希釈され滅 菌されたカチオン性脂質溶液に加えてDNA/脂質複合体を形成し、(e) ステップ(d )のDNA/脂質複合体をほぼ等張に調節する各ステップを含む前記方法を提供する ものである。 本発明はまた、ヒトにおける臨床使用のためのプラスミドDNA/カチオン性脂質 複合体の単一バイアル製剤の製造方法であって、(a) オートクレーブでの滅菌の 間の脂質の分解を実質的に防止するのに十分な高濃度のカチオン性脂質溶液をオ ートクレーブで滅菌し、(b) 下記ステップ(d)の間の脂質の凝集を実質的に防止 するのに十分な程度、ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質溶液を希 釈し、(c) プラスミドDNA溶液を濾過滅菌し、(d) ステップ(c)の滅菌されたプラ スミドDNA溶液を、等張より低いイオン強度でステップ(b)の希釈され滅菌された カチオン性脂質溶液に加えてDNA/脂質複合体を形成し、(e) ステップ(d)のDNA/ 脂質複合体をほぼ等張に調節する各ステップを含む、前記方法も提供するもので ある。 本発明はさらに、ヒトにおける臨床使用のためのプラスミドDNA/カチオン性脂 質複合体の単一バイアル製剤の製造方法であって、(a) 約0.5〜約5.0 Mの範囲の 濃度を有するカチオン性脂質溶液をオートクレーブで滅菌し、(b) ステップ(a) の滅菌されたカチオン性脂質溶液を希釈剤で希釈して約0.01〜約1.0 Mの範囲の 濃度を得、(c) プラスミドDNA溶液を濾過滅菌し、(d) 約0.05〜約10 mg/mLの範 囲の濃度を有するステップ(c)の滅菌されたプラスミドDNA溶液を、等張より低い イオン強度でステップ(b)の希釈され滅菌されたカチオン性脂質溶液に加えてDNA /脂質複合体を形成し、(e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体をほぼ等張に調節する 各ステップを含む前記方法を提供するものでもある。 本発明はさらに、ヒトにおける臨床使用のためのプラスミドDNA/カチオン性脂 質複合体の単一バイアル製剤の製造方法であって、(a) 約90:10〜約10:90の範囲 のモル比を有し、約2〜約10 mg DMRIE/mLの範囲の濃度を有するDMRIE/DOPEのカ チオン性脂質溶液をオートクレーブで滅菌し、(b) ステップ(a)の滅菌されたカ チオン性脂質溶液を希釈剤で希釈して≦約2 mg DMRIE/mLの濃度を得、(c) プラ スミドDNA溶液を濾過滅菌し、(d) ≦約10 mgプラスミドDNA/mLの濃度を有するス テップ(c)の滅菌されたプラスミドDNA溶液を、等張より低いイオン強度でステッ プ(b)の希釈され滅菌されたカチオン性脂質溶液に加えてDNA対DMRIEの質量比が 約50:1〜約1:10のDNA/脂質複合体を形成し、(e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体 をほぼ等張に調節する各ステップを含む前記方法を提供するものである。 本発明はまた、ヒトにおける臨床使用のためのプラスミドDNA/カチオン性脂質 複合体の単一バイアル製剤の製造方法であって、(a) 約50:50のモル比を有し、 約8 mg DMRIE/mLの濃度を有するDMRIE/DOPEのカチオン性脂質溶液をオートクレ ーブで滅菌し、(b) ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質溶液を希釈剤で希 釈して≦約1mg DMRIE/mLの濃度を得、(c) プラスミドDNA溶液を濾過滅菌し、(d) ≦約5 mgプラスミドDNA/mLの濃度を有するステップ(c)の滅菌されたプラスミド DNA溶液を、等張より低いイオン強度でステップ(b)の希釈され滅菌されたカチオ ン性脂質溶液に加えてDNA対DMRIEの質量比が約5:1のDNA/脂質複合体を形成し、( e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体をほぼ生理的塩分濃度に調節する各ステップを 含む前記方法を提供するものである。 本発明はまた、ヒトにおける臨床使用のための、約1%のグリセロール及び約0. 01%のビタミンEを含む約0.9%の塩化ナトリウム中のプラスミドDNA/カチオン性脂 質複合体の単一バイアル製剤の製造方法であって、(a) 約50:50のモル比を有し 、約8 mg DMRIE/mLの濃度を有するDMRIE/DOPEのカチオン性脂質溶液をオートク レーブで滅菌し、(b) ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質溶液を希釈剤で 希釈して≦約1mg DMRIE/mLの濃度を得、グリセロール及びビタミンEを含むもの とし、(c) プラスミドDNA溶液を濾過滅菌し、(d) ≦約5mgプラスミドDNA/mLの濃 度を有するステップ(c)の滅菌されたプラスミドDNA溶液を等張より低いイオン強 度でステップ(b)の希釈され滅菌されたカチオン性脂質溶液に加えてDNA対DMRIE の質量比が約5:1のDNA/脂質複合体を形成し、(e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体 を約0.9%塩化ナトリウムに調整し、グリセロールの最終濃度を約1%、ビタミンE の最終濃度を約0.01%とする各ステップを含む前記方法を提供するものである。 他の態様によれば、本発明は、上記方法のいずれかによって製造される、ヒト における臨床使用のためのプラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の単一バイアル 製剤を提供するものである。 別の態様においては、本発明は、等張より低いイオン強度で合わせられてプラ スミドDNA/脂質複合体を形成しているカチオン性脂質成分及びプラスミドDNA成 分を含み、さらにほぼ等張の水性媒体を含み、任意にプラスミドDNAそれ自体以 外には緩衝剤を含まない、ヒトにおける臨床使用のためのプラスミドDNA/カチオ ン性脂質複合体の単一バイアル製剤を提供するものである。この単一バイ アル製剤は、冷凍、冷蔵、室温、あるいは体温形態において安定であることがで きる。この単一バイアル製剤は、冷凍、冷蔵または室温形態で少なくとも約8週 間安定であることができる。さらにこの単一バイアル製剤は、ほぼ生理的な食塩 水中で、約1%のグリセロール及び約0.01%のビタミンEを含んでもよい。 さらに別の態様においては、本発明は、少なくとも約8週間の間、冷凍、冷蔵 または室温の形態で貯蔵安定性を有する、プラスミドDNA/カチオン性脂質複合体 を含むヒトにおける臨床使用のための単一バイアル製剤を提供する。 さらに別の態様においては、本発明は、少なくとも約8週間の間、新しく製造 したプラスミドDNA/カチオン性脂質複合体のin vitroでのトランスフェクション の効能を維持する、プラスミドDNA/カチオン性脂質複合体を含むヒトにおける臨 床使用のための単一バイアル製剤を提供するものである。 発明の詳細な説明 本発明の目的は、好ましくは希釈形態で等張より低いイオン強度において、プ ラスミドDNA溶液とカチオン性脂質溶液とを制御して合わせてプラスミドDNA/カ チオン性脂質複合体を得ることにより達成され、そしてこの複合体は溶質と混合 して等張としてヒトにおける臨床使用に適した単一バイアル製剤とする。 最初の複合体の形成時におけるイオン強度と同様に、プラスミドDNA/カチオン 性脂質複合体を生成するために個々のプラスミドDNA及びカチオン性脂質成分を 混合する順序が最終結果に重要であることが見出された。最適なin vitroトラン スフェクション効率及び脂質の凝集防止は、等張より低いイオン強度でカチオン 性脂質溶液にプラスミドDNA溶液をゆっくりと加えることにより得られた。この 方法においては、カチオン性脂質成分にプラスミドDNA成分を合わせてDNA/脂質 複合体を形成する際に希釈形態のカチオン性脂質成分を使用することにより、in vitroにおけるトランスフェクション効率及び脂質の凝集防止がさらに最適化さ れた。 濾過による脂質混合物の滅菌により脂質混合物の完全性が劣化することも見い 出された。これに対し、本発明の脂質混合物はオートクレーブによる滅菌に 耐えられることが確認された。最大のin vitroトランスフェクション効率および 脂質の分解防止がオートクレーブでの滅菌により得られた。この方法によれば、 in vitroでのトランスフェクション効率がさらに高められ、オートクレーブでの 滅菌中に脂質混合物を高濃度に維持することによりさらに脂質の分解が防止され る。 従って、本発明の好ましい単一バイアル製剤は、カチオン性脂質成分と中性脂 質成分とを含むカチオン性脂質混合物であって、約90:10〜約10:90の範囲、好ま しくは約50:50のモル比を有するものを調製することにより得られた。カチオン 性脂質混合物から、乾燥した脂質薄膜を適当な希釈剤、好ましくは水を用いて水 和することにより、カチオン性脂質溶液を製造し、十分に濃縮された形態の溶液 を得る。カチオン性脂質溶液は約0.5〜約5.0 Mの範囲の濃度を有する場合に高度 に濃縮されているものとする。この高濃縮カチオン性脂質溶液は、その後の標準 的なオートクレーブ処理、例えば121℃で30分、通常の方法で処理することによ り滅菌される。 また任意の所望の濃度において、カチオン性脂質溶液を製造し、濾過、照射あ るいは他の適切な方法で滅菌することができるが、カチオン性脂質溶液の濃度が より高い方がオートクレーブ処理による滅菌の間その物質を保護するために有利 である。 高濃縮カチオン性脂質溶液を得る際には、好ましくは滅菌された水（例えば、 滅菌WFI）を使用して溶液を希釈することが好ましい。例えば食塩水のようなそ の他の適当な希釈剤を水に代えることができ、等張より低いイオン強度を有する ことを基準にして選択することができる。カチオン性脂質溶液を希釈して約0.01 〜約1.0 Mの範囲の濃度を得る。任意に、この時点で以下に記載するように適当 な製剤用試薬を導入することができ、特に混合ステップの間DNA及び脂質の懸濁 を促進するための乳化剤を導入することができる（後述）。 一方、医薬品級品質のプラスミドDNAを得る。水（例えば、滅菌WFI）等の水溶 液あるいは食塩水（例えば、生理的食塩水）等の他の適当な希釈剤中のプラスミ ドDNAを滅菌する。滅菌は好ましくは濾過により、例えば0.2μmメンブラン フィルターを通して行う。希釈剤は等張より高くないイオン強度を有することが 好ましい。 滅菌されたプラスミドDNA溶液及び希釈され滅菌されたカチオン性脂質溶液を 、通常は合わせる前に室温にする。約0.05〜約10 mg/mLの範囲内の濃度でDNA溶 液を使用することができる。その後好ましくは攪拌しつつプラスミドDNA溶液を 低イオン強度のカチオン性脂質溶液に調節しながら加えることにより溶液を合わ せ、DNA/脂質複合体を形成する。低イオン強度とは等張より低いことを意味する 。脂質溶液及びプラスミドDNA溶液を合わせる間これらを連続的に混合すること が好ましく、合わせた後にさらに短時間混合する。混合は、撹拌(vortexing)、 手動による撹拌（振とう(shaking)）、機械的な混合あるいは撹拌(stirring)、 あるいは他の適当な手段により行うことができる。 DNA及び脂質を合わせ、例えばin vitroトランスフェクションアッセイにより 測定されるトランスフェクション効率に最適な質量比で複合体を生成する。 生理的に適した投与をするために、その後複合体を浸透圧調整剤で等張に調整 する。例えば、適当な滅菌塩化ナトリウムストックを加えて約0.9% NaCl（即ち 生理的食塩水）の最終濃度を与えることができる。次に最終的製剤を発熱原物質 を除去された滅菌バイアルに充填することができ、その後約-10℃〜-70℃、好ま しくは約-20℃で冷凍貯蔵することができる。 臨床現場では、DNA/脂質バイアルを好適に解凍し、一般的な方法で混合する（ 例えば、撹拌(vortexing)あるいは手動による撹拌、即ち振とう(shaking)による ）。これらは室温で維持することができ、解凍の２４時間以内に投与するのが有 利である。各バイアルは単位投与量形態でDNAをデリバリーするものとすること ができ、あるいは複数回の投与量の容器を構成するものとすることができる。 医師による使用のためには、約10 mg DNA/mL、好ましくは約0.5 mg DNA/mLま での濃度の単一バイアル製剤を提供する。当業者に認識されてるように、DNAの 有効量は、取り扱われる条件、患者の特性、及びその他の要因を含む多くの要因 により変化する。一般的な投与量は約5 mg〜約10μg DNAを含むものであるが、 有用な結果を得ることができる限りこの範囲は広範囲に変化させることができる 。 許容されている医薬実務からの要請として、本発明の他の好ましい単一バイア ル製剤は生理的に許容できるビヒクルを含むものである。これらは、バッファー 、酸化防止剤、アミノ酸、乳化剤、でんぷん、糖、可溶化剤、界面活性剤、懸濁 剤、浸透圧調整剤、湿潤剤等である。本発明により提供される単一バイアル製剤 は、プラスミドDNA自体以外には緩衝剤を使用しなくても生理的なpHを維持する ことが判った。追加的な緩衝剤は除外してもよく、あるいは必要に応じて添加し てもよい。 好ましい製剤は、非経口的な投与、即ち経口的な方法以外による投与に適して いる。非経口投与としては、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、腫 瘍内、及び間質内注射のような注射、点滴、及び吸入によるものを含む。注射に は針/注射器及びカテーテルによる投与を含む。 特に好ましい態様においては、本発明は、等張のための0.9%塩化ナトリウムの 最終濃度（即ち生理的食塩水）、乳化剤（及び凍結防止剤）としての1%のグリセ ロール、及び保存剤（及び酸化防止剤）としての0.01%のビタミンEを有する単一 バイアル製剤を提供する。 カチオン性脂質 DNAトランスフェクションに今日使用されているカチオン性脂質試薬は、カチ オン性即ち正の電荷を有する脂質を他の脂質と共に含む脂質ベシクルあるいはリ ポソームとして製造されている。正の電荷を有する脂質、負の電荷を有する脂質 、中性脂質及びコレステロールあるいは同様のステロールの混合物からこれらの 製剤を製造することができる。 正の電荷を有する脂質は、米国特許第5,264,618号に記載されるDMRIEのような カチオン性脂質の一種、あるいはカチオン性脂質DOTMA、DOTAPあるいはそれらの 類縁体の一種、あるいはこれらの組合せとすることができる。DMRIEは1,2-ジミ リスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロ ミドであり、好ましいものである。Felgner et al.，J ．Biol．Chem. 269:2550( 1994)を参照。DMRIEは実施例１に従って合成することができる。 中性脂質及び負の電荷を有する脂質としては、天然あるいは合成のリン脂質、 あるいはモノ−、ジ−、またはトリアシルグリセロールの任意のものを挙げるこ とができる。天然のリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノ ールアミノ、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、あるいはホスファチ ジルイノシトール等のような動物及び植物性のソースから得ることができるもの である。合成のリン脂質は同一の脂肪酸基を有するものとすることができ、限定 するものではないが、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホス ファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホス ファチジルコリン、及び対応する合成のホスファチジルエタノールアミン類及び ホスファチジルグリセロール類を含む。中性脂質としては、ホスファチジルコリ ン、カルジオリピン、ホスファチジルエタノールアミン、モノ−、ジ−、トリア シルグリセロール類、あるいはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(D OPE)のようなそれらの類縁体を挙げることができ、DOPEは好ましいものである。 DOPEはAvanti Polar Lipids(Alabaster，Ala)から購入することができる。負の 電荷を有する脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、 あるいは同様のリン脂質類縁体を挙げることができる。リポソームの製造につい て従来から知られているように、コレステロール、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ 脂質、プロスタグランジン、ガングリオシド、ネオビー(neobee)、ニオソーム(n iosomes)、あるいはその他の任意の天然または合成の両性親和物(amphophile)等 のような他の添加物もリポソーム製剤に使用することができる。 カチオン性リポソームを製造するための組成物においては、カチオン性脂質は 約0.1モル%〜100モル%、好ましくは5〜100モル%、最も好ましくは20〜100モル% の濃度で存在させることができる。中性脂質は約0〜99.9モル%、好ましくは0〜9 5モル%、最も好ましくは0〜80モル%の濃度で存在させることができる。正味の電 荷が正である脂質ベシクルあるいはリポソームを生成するために、正の 電荷を有する成分の量が負の電荷を有する成分の量を上回る必要がある。負の電 荷を有する脂質は約0〜49モル%、好ましくは0〜40モル%で存在させることができ る。コレステロールあるいは同様のステロールは0〜80モル%、好ましくは0〜50 モル%で存在させることができる。 少なくとも１種の両親媒性脂質を有する脂質組成物は自発的に集合してリポソ ームを形成することができる。カチオン性脂質種を含む脂質試薬はカチオン性リ ポソームとして製造することができる。成分脂質をクロロホルムのような溶媒中 に溶解することができる。混合物を蒸発させてガラス製バイアルの内壁上の薄膜 に乾燥させることができる。水性溶媒中に懸濁すると、両親媒性脂質分子はそれ 自体がリポソームに集合する。実施例２参照。 in vitroトランスフェクションアッセイにより効力についてリポソームを分析 することができる。これらのアッセイにおいては、２つの別々に希釈された成分 を混合することによりプラスミドDNA及びカチオン性脂質の複合体を形成する。 そしてこの混合物を培地中の細胞に加え、実施例３の方法によりトランスフェク ションを測定する。 プラスミドDNA 脂質媒介遺伝子移入に必要なプラスミドDNAは、長年にわたり研究室において 広く日常的に製造されてきたものである。Sambrook，Frisch，and Maniatis，Mo lecular Cloning: a Laboratory Manual ，2nd ed.，Cold Spring Harbor Labora tory Press，New York，1989。 従ってこれらのプラスミドは、前核生物及び真核生物ベクター、pBR322及びpU Cをベースとするベクター、及びそれらの誘導体等の中から選択できる。これら のものは種々の複製起点を利用するものであってよく、例えばpMB1及びColE1の ような前核生物複製起点、例えば酵母、真菌、昆虫、及び哺乳動物細胞等におけ る複製を促進するもののような真核生物複製起点(例えばSV40 ori)等をを利用す るものてあってよい。これらはクローニング及び発現を容易にする種々の遺伝子 エレメント、例えば選択可能な遺伝子、ポリリンカー、プロモーター、 エンハンサー、リーダーペプチド配列、イントロン、翻訳促進物、Kozak配列、 ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、5'UTR、3'UTR等の任意のものを 含むものとすることができる。ベクター、起点、及び遺伝子エレメントの選択は その必要性により変化し、当分野の技術者により十分に可能なものである。 種々の構造タンパク質(あるいはペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、リ ンタンパク質、アミド化タンパク質等)の任意のものをコードする遺伝子を細胞 へのデリバリーのためにプラスミドに挿入することができる。これらの遺伝子は 、ゲノムDNA配列、cDNA配列、合成DNA配列、ポリヌクレオチド配列、オリゴヌク レオチド配列等を構成するものとすることができる。mRNA、アンチセンスオリゴ マー、及びトリプルヘリックス剤の移入も本発明の範囲にあるものとして意図さ れることを明示するものである。これらの配列は、化学合成あるいは遺伝子操作 法により得ることができる。それらをプラスミドに挿入し、そしてそのプラスミ ドを宿主細胞に導入して増殖させることができる。 宿主細胞は、細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物細胞を含む、前核生物及び 真核生物細胞から選択することができる。好ましい宿主は大腸菌のような細菌で ある。大腸菌の任意の好ましい株を使用できる。 プラスミドDNAを含む宿主の増殖は公知の方法を使用して行うことができる。 そのような方法としては、バッチ発酵、供給バッチ発酵、連続培養、I、II及びI II型発酵、無菌発酵、共同体発酵、保護発酵等によりインキュベーター、バイオ リアクター、ファーメンター等を使用するものとすることができる。増殖のため の条件(例えば培地、温度、pH、時間、攪拌、通気等)を状況に適合させることは 経験的なものであり当業者に十分可能である。 医薬品級の品質にプラスミドDNAを精製することは十分に確立された方法によ り行うことができる。あるいは、実施例８に記載した医薬品級プラスミドDNAの 製造方法が好ましい。さらに、やはり実施例８による、珪藻土材料を使用する細 胞溶解物中のRNA濃度を低下させる方法もプラスミドDNAを医薬品級標準に精製す るのに好ましい。 規制上の手続き 遺伝子治療は、食品医薬品局(FDA)等の米国内の複数の異なる法的規制機関の 認可を必要とする。FDAはなかでも、医薬品が安全で有効であり、それがどのよ うに製造されるか(例えばGMP)ということについて監督し、規制している。ほと んどの諸外国においても同様の認可が必要である。本発明の単一バイアル製剤は これらの法的手続きに合致するものである。 用途 ある用途においては、DMRIE/DOPEカチオン性脂質混合物は約90:10〜約10:90の モル比、好ましくは約50:50のモル比で製造される。カチオン性脂質溶液は、適 当な希釈剤、好ましくは水により、≧約2 mg DMRIE/mL、好ましくは約2〜約10 m g DMRIE/mL、最も好ましくは約8 mg DMRIE/mLで乾燥した脂質膜を水和すること により、カチオン性脂質混合物から製造される。この高度に濃縮されたカチオン 性脂質溶液を次に標準的なオートクレーブ処理、例えば121℃で30分により通常 の方法で殺菌処理にかける。 オートクレーブにかけた高度に濃縮されたDMRIE/DOPE脂質溶液が得られたら、 好ましくは滅菌水(例えば滅菌WFI)で、≦約2 mg DMRIE/mL、好ましくは≦約1 mg DMRIE/mL、最も好ましくは≦0.2 mg DMRIE/mLに溶液を希釈する。その他の適当 な希釈剤、例えば食塩水を水の代わりに使用することができ、低いイオン強度、 即ち等張未満であることを基準に選択することができる。任意に、この時点で、 その後のカチオン性脂質溶液への添加混合のために、有利には希釈剤に添加する ことにより適当な配合剤を加えてもよい。例えば乳化剤、好ましくはグリセロー ルを、単一バイアル製剤中約0.5〜約5%グリセロール、好ましくは1%グリセロー ルの最終濃度となるような量で添加することができる。さらに、この時点で保存 料、好ましくはビタミンEを、単一バイアル製剤中約0.005〜約0.05%ビタミンE、 好ましくは0.01%ビタミンEの最終濃度となるような量で添加することができる。 このようにして医薬品級品質に精製されたプラスミドDNAが得られる。医薬品 級プラスミドDNAの製造方法は実施例４に示す。例えば水(例えば滅菌WFI)のよう な水性溶液あるいはその他の適当な希釈剤、例えば食塩水(例えば生理食塩水)中 のプラスミドDNAを滅菌する。滅菌は例えば0.2 μmメンブランフィルターを通す 濾過によることが好ましい。希釈剤は等張よりも高くないイオン強度を有するこ とが好ましい。 滅菌したプラスミドDNA溶液及び希釈及び滅菌したDMRIE/DOPE脂質溶液は、通 常は合わせる前に室温とする。DNAは、かなり高い濃度、例えば10 mg/mLから、 かなり低い濃度、例えば0.02 mg/mLのような範囲の濃度で使用することができる 。そして好ましくは混合しながらプラスミドDNA溶液をDMRIE/DOPE 溶液に制御し ながら添加して溶液を合わせ、低イオン強度でDNA/脂質複合体を形成する。低イ オン強度とは、等張未満を意味する。 DNAと脂質を合わせて、DNA対DMRIEが約50:1〜約1:10の質量比、好ましくはDNA 対DMRIEが約10:1〜約1:5の質量比、最も好ましくはDNA対DMRIEが約5:1の質量比 で複合体を形成する。 その後、生理条件における投与のために溶質により複合体を等張に調整する。 特に好ましい態様においては、本発明は、0.9%塩化ナトリウム、1%グリセロール 、及び0.01%ビタミンEの最終濃度を有する単一バイアル製剤を提供するものであ る。 一般性 本発明の単一バイアル製剤は、複数の種類のプラスミドDNA、例えば、ルシフ ェラーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ等のようなレポーター遺伝子を含むプラスミ ド、ヒト遺伝子治療に適するポリペプチド、例えばHLA-B7及びヒトIL-2等を機能 可能なようにコードするプラスミドについての試験において成功した。実施例５ 〜10を参照。さらに多数の種々のカチオン性脂質種及びカチオン性脂質混合物、 例えばDMRIE、DMRIE/DOPE、DOSPA、DOSPA/DOPE、HP-DORIE、HP-DMRIE/DOPE、γ- MU-DMRIE、γ-MU-DMRIE/DOPE、γ-MC-DMRIE、γ-MC-DMRIE/DOPE、δ-Ser-DMRIE 、δ-Ser-DMRIE/DOPE、βAE-DMRIE、βAE-DMRIE/DOPE、アラビノース-T U-γ-DMRIE、アラビノース−TU-γ-DMRIE/DOPE、ガラクトース-TU-γ-DMRIE、ガ ラクトース-TU-γ-DMRIE/DOPE、グルコース-TU-γ-DMRIE及びグルコース-TU-γ- DMRIE/DOPE等に本発明を適用した。これらの結果は本発明の一般性を示すもので ある。 安全性 1%グリセロール、及び0.01%ビタミンEを含む0.9%塩化ナトリウム中に5:1のDNA 対カチオン性脂質の質量比でDNA/DMRIE-DOPEを含む本発明の単一バイアル製剤は 、マウスにおける急性静脈内毒性試験、マウスにおける反復投与量安全性試験、 及びカニクイザルにおける反復投与量安全性試験において毒性の兆候を示さなか った。 安定性 上記の単一バイアル製剤は安定であることが判った。-20℃、冷蔵庫及び室温 において、８週間の期間にわたり完全に安定であることが促進試験により証明さ れた。この試験によれば、体温において１月の期間にわたり完全に安定であるこ とが示された。これらの試験は、製剤の酸化防止剤成分の有用性を示した。 実施例11。 ヒト遺伝子治療 本発明の単一バイアル製剤はin vivo(実施例12〜13)及びex vivo(Anderson et al.の「遺伝子治療」についての米国特許第5,399,346号を参照)におけるヒトに ついての臨床使用に適している。 以下の実施例を参照することにより本発明の特定の形態をより容易に理解し得 るものであるが、これらの実施例は本発明を例示する目的のものであり、その範 囲を例示した特定の態様に限定するものではない。 実施例1 1,2- ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチル アンモニウムブロミド(DMRIE)の製造 DOTMAの製造のために開発された方法(Felgner et al.，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 84:7413(1987))を若干改変してDMRIEを合成した。即ち、塩基性触媒を使 用して3-ジメチルアミノ-1,2-プロパンジオールをミリスチルメシレートと縮合 させ、対応するジエーテルを生成した。この親油性アミンをクロマトグラフィー 精製した後、高温で2-ブロモエタノールで処理して四級化した。クロマトグラフ ィーにより精製した精製物は、所望のヒドロキシアルキルアンモニウム塩に予測 されるものに一致するIR、TLC及び元素分析値を示した。 実施例2 カチオン性リポソーム調製物 実施例1に従ってDMRIEを合成した。DOPEはAvanti Palar Lipids(Alabaster，A la)から購入した。カチオン性リポソームは脂質のクロロホルム溶液を滅菌ガラ スフラスコ中で混合することにより製造した。溶媒を減圧下に蒸発させて除去し 、乾燥脂質膜を生成した。バイアルを真空下に一晩置き、溶媒の痕跡も全て除去 した。液体混合物を注射用滅菌水を加えることにより水和した。 実施例3 in vitro トランスフェクションプロトコール ポリヌクレオチド溶液のアリコートをリポソーム溶液のアリコートと室温で混 合することによりプラスミドDNA/カチオン性脂質複合体を製造した。正に荷電し たリポソームのポリヌクレオチドに対する比率を種々変更することにより必要に 合わせたものとすることができる。使用した方法は、Felgner et al.，Prec ．Na tl．Acad．Sci．USA 84:7413(1987)及びFelgner and Holm，Focus 11(2)Spring ，1989に記載されたものを改変したものである。 トランスフェクションは、以下のようにして96ウェルプレート中で行った。 (1) 96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに、ウェルあたり20,000〜40,0 00の細胞を播種した。 (2) 滅菌バイアルあるいはチューブ中にプラスミドDNA/カチオン性複合体の単一 バイアル配合物を調製した。 (3) (2)のように製造した単一バイアル配合物を、96ウェルプレート中に適当な 量で入れられた細胞培養培地(胎児ウシ血清を含むか含まない)に連続的に加える ことにより希釈した。 (4) (1)で播種され、集密状態まで増殖した細胞を覆っている細胞培養培地を吸 引により除去した。 (5) 別の胎児ウシ血清を含まない細胞培養培地で細胞を洗浄し、洗浄培地を吸引 により除去した。 (6) 希釈されたプラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の一定量を、マイクロタイ タープレートのウェル中の洗浄細胞に加えた。移した量は通常は80〜100μlとし た。 (7) 各ウェルに適当量の50%胎児ウシ血清を加え、ウェル中の血清濃度を10%とし た。 (8) プレートを37℃でインキュベートした(5% CO2)。トランスフェクション後12 時間及び24時間で、Opti-MEM 還元血清培地(GIBCO BRL Life Technologies，Gai thersburg，MD)中の10%血清アリコートを各ウェルに加えた。 (9) インキュベーションの後(通常は48あるいは72時間)、細胞を覆う培地あるい は細胞溶解物の全体を発現活性についてアッセイした。 β-ガラクトシダーゼをレポーター遺伝子とした場合、クロロフェニルレッド/ β-ガラクトピラノシド(CPRG)を基質として使用し、405 nmでマイクロタイター リーダーによりプレートを読み取って、発現を比色定量によりモニターした。 実施例4 医薬品級プラスミドDNAの精製方法 細胞溶解。細胞ペーストを、湿潤細菌重量1グラムあたり6 mlの冷溶液I(61 m M グルコース + 25 mMトリスバッファー、pH 8.0 + 10 mM EDTA、5℃)中に室温 で攪拌して完全に再懸濁した。この溶液に、湿潤細菌重量1グラムあたり12 mLの 溶液II(0.2 N NaOH + 1% SDS)を加え、均一になるまで倒立を繰り返して混合し た。これを濡れた氷上で約10分間インキュベートした。溶解細胞溶液に、湿潤細 菌重量1グラムあたり9 mlの冷溶液III(3.0 M酢酸カリウム、pH 5.0、5℃)を加え 、白色の凝集沈殿が現れるまで倒立を繰り返すことにより混合し、濡れた氷上で 約5分間インキュベートした。 濾過。濾過、遠心分離あるいは沈降により細胞破片を溶解物から除去した。上 清を回収し、約25 g/lのCelite 珪藻土を加え、卓上ブフナー漏斗にセットした( 好ましくは予備コーティングした)フィルターメンブラン(Whatman #1,113あるい はその同等物)を通して濾過することにより清澄化した。あるいは、Celite を使 用した直接の濾過により細胞破片を溶解物から除去した。この場合、約90 g/lの Celite 珪藻土を溶解溶液に直接加え、均一になるまで回転させることにより混 合した。その後溶解物を卓上ブフナー漏斗にセットした(好ましくは予備コーテ ィングした)フィルターメンブラン(Whatman # 1,113あるいはその同等物)を通し て濾過した。 DNA沈降。5〜15%のポリエチレングリコール(PEG、例えばPEG-8000)及び0.3〜1 .5 MのNaClを濾液に加えた。このPEG懸濁物を好ましくは一晩、2〜8℃で攪拌し た。約25 g/lのCelite 珪藻土をPEG懸濁物に加え、卓上ブフナー漏斗にセットし た(好ましくは予備コーティングした)フィルターメンブランを通して濾過するこ とによりDNA沈殿物を回収した。DNA沈殿物はCelite ケーキ中に捕獲され、ケー キをTEバッファー(0.01 Mトリスベース、pH 8.0 + 0.001 M EDTA)中に懸濁する ことにより回収した。 RNA、タンパク質及びリポポリサッカライドの除去。2.5 Mまで酢酸アンモニウ ムをTEバッファーに加え、2〜8℃で約30分間攪拌した。珪藻土を含んだままの懸 濁液を卓上ブフナー漏斗にセットした(好ましくは予備コーティングした)フィル ターメンブランを通して濾過した。その後任意にミクロン未満の濾過によりDNA 濾液を清澄化した。 最終的DNA沈降。0.6容量の冷イソプロパノールを使用して、最低2時間-20℃で 最終的なDNAの沈殿を行った。沈殿したDNAをSorvall卓上遠心分離器で30分間200 0 x gあるいは同等な遠心力で遠心分離した。ゲル濾過クロマトグラフィーの前 にDNAペレットをカラムバッファー中に再懸濁した。 ゲル濾過クロマトグラフィー。Pharmacia S-1000タンデムサイズ排除カラム、 20,000 bpのDNA排除限界(Pharmacia，Piscataway，NJ)に流した。S-1000マトリ ックスは、アリルデキストランをN,N'-メチレンビスアクリルアミドで共有結合 させて架橋して製造された不活性で非常に安定なマトリックスである。カラムを 2つのPharmacia XK26/100カラム(Pharmacia，Piscataway，NJ)に80〜85 cm(2.6 x 80 cm)の最終床高で注ぎ、約900 mLの合計カラム容量と約160 cmの合計高さを 得た。カラムはそれぞれ一方向に圧力充填し、倒立させて直列に連結し、平衡化 して操作に使用した。カラムはカラムバッファーで平衡化し、適当な流速で流し た。清澄化された溶解物プラスミドDNAを0.2μmフィルターで濾過し、カラムに 入れた。カラムの運転及びフラクション化はPharmacia FPLC(Pharmacia，Piscat away，NJ)により自動的に行った。フラクション(カラム容量の約0.5〜5%)を生成 物溶出ゾーンにおいて回収し、0.8%アガロースゲル電気泳動により分析した。適 当なフラクションをプールし、2容量の冷エタノールで沈殿させた。このカラム 精製DNAは、バルクプラスミドDNAの製造に必要となるまで-20℃で冷凍保存した 。 バルクプラスミドDNA製造。エタノールで沈殿させ、カラムで精製したDNAを、 Sorvall卓上遠心分離器でその最高速度で30分間、4〜10℃程度の温度で回転させ た。ペレットを風乾し、プールした。プールしたペレットをビヒクル、例えば滅 菌WFIあるいは生理食塩水中に再懸濁した。その後DNAを0.2μmフィルターを通し て濾過して発熱原物質を含まない容器に入れた。品質管理試験のためのサンプル を任意に取り、残りを-10℃〜-70℃、好ましくは-20℃で冷凍保存した。 実施例5 HLA-B7/DMRIE-DOPE 複合体 ヒト遺伝子治療に使用することを意図され、本発明の単一バイアル配合物とし てin vitro効力が示されたHLA-B7プラスミドDNA/DMRIE-DOPE脂質複合体。Nabel et al.，Human Gene Therapy 3:399(1992); Nabel et al.，Proc ．Natl．Acad． Sci．USA 99:11307(1993); PCT特許出願WO94/29469; Nabel et al.，Human Gene Therapy 5:57(1994); Vogelzang et al.，Human Gene Therapy 5:1357(1994); Hersh et al.，Human Gene Therapy 5:1371(1994);及びRubin et al.，Human Ge ne Theragy 5:1385(1994)参照。 HLA-B7コードプラスミドは約5000 bpのサイズに構築した。これは細菌複製起 点を含むpBR322をベースとするプラスミドから得た。これは、HLA-B7と指称され るクラス1 MHC抗原の重鎖(ヒトHLA-B7 cDNA)及び軽鎖(チンパンジーβ-2マイク ログロブリンcDNA)をコードするものであった。これらの2つのタンパク質は二シ ストロン性mRNA上に発現された。このmRNAの真核生物細胞発現は3'の長い末端反 復配列(LTR)から得られたラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター配列に依存した 。発現は、ウシ成長ホルモン遺伝子から得た転写終結/ポリアデニル化シグナル 配列にも依存した。重鎖の発現は5'キャップ依存性タンパク質翻訳開始部位によ り制御された。軽鎖の発現は脳心筋炎ウイルスから得たキャップ非依存性翻訳エ ンハンサー(CITE)配列により制御された。プラスミドはTn903から得たカナマイ シン耐性遺伝子もコードするものであった。 実施例6 医薬品級精製HLA-B7プラスミドDNA 下記表1に挙げた基準により判断される医薬品級標準までHLA-B7コードプラス ミドを精製した。 実施例7 HLA-B7/DMRIE-DOPE 複合体のin vitro効力 1%グリセロール及び0.01%ビタミンEを含む0.9%塩化ナトリウム中の本発明の方 法により製造したHLA-B7プラスミドDNA/DMRIE-DOPE脂質複合体を使用したin vit roトランスフェクションの後、SW480細胞、ヒト結腸腺癌細胞系、ATCC # 228-CC L、またはUM449細胞、ヒト黒色腫細胞系、Alfred Chang，University of Michig an中でのHLA-B7遺伝子発現によりトランスフェクション効率を測定した。 トランスフェクションの前日に6ウェルプレートにウェルあたり200,00〜400,0 00 のUM449細胞を播種した。細胞はトランスフェクションの前に>75%集密単層と なった。2μg DMRIE(自家合成)及び2μg DOPE(Avanti Polar Lipids，Alabaster ，Alaから購入)の存在下で、10μgプラスミドDNAにより細胞をトランスフェクト した。細胞は全体を通じて37℃、5% CO2で培養した。胎児ウシ血清を補充した還 元血清培地、例えばOpti-MEM 還元血清培地(GIBGO BRL Life Technologies，Gai thersburg，MD)を、トランスフェクション後1〜4時間と24時間に細胞に添加した 。トランスフェクション後48時間で細胞を回収した。 細胞表面におけるHLA-B7発現を、抗-HLA-B7マウス抗体により標識し、その後 蛍光第二抗体(抗-マウスIgGモノクローナル抗体R-フィコエリスリン抱合体)を使 用することにより測定した。細胞の免疫蛍光染色はフローサイトメトリーにより 分析した。トランスフェクト細胞について、陰性対照(非トランスフェクト細胞 あるいは無関係な遺伝子をトランスフェクトした細胞)に対して2倍の平均蛍光強 度増加が見られた。効力は新たに製造されたプラスミドDNA/カチオン性複合体の ものと同等であった。 実施例8 IL-2/DMRIE-DOPE 複合体 ヒト遺伝子治療に使用することを意図され、本発明の単一バイアル配合物とし てin vitro効力が示されたIL-2プラスミドDNA/DMRIE-DOPE脂質複合体。 IL-2をコードするプラスミドは5000 bpのサイズに構築した。これは細菌複製 起点を含むpUCをベースとするプラスミドから得た。これはIL-2融合タンパク質 をコードするものであった。このタンパク質は、ラットインシュリンII遺伝子の 5'非翻訳領域の短いセグメント及びリーダーペプチドの最初の6個のアミノ酸、 ヒトIL-2コード配列の5'からそのリーダーペプチドの最初の2個のアミノ酸を除 いたものをコードする部分をクローニングすることにより構築した。この融合タ ンパク質を、サイトメガロウイルス(CMV)即時初期1プロモーター/エンハンサー 配列の真核生物転写制御下においた。この配列は、800+ bp イントロンを含むCM V即時初期1遺伝子からの5'非翻訳配列、IL-2融合タンパク質コード配列、及び転 写終結/ポリアデニル化シグナル配列を有するウシ成長ホルモン遺伝子から得た3 '非翻訳配列を含む複合体mRNAの発現を促進する。このプラスミドはTn903から得 たカナマイシン耐性遺伝子もコードする。 実施例9 医薬品級精製IL-2プラスミドDNA 下記表2に挙げた基準により判定される医薬品級標準までIL-2コードプラスミ ドを精製した。 実施例10 IL-2/DMRIE-DOPE 複合体のin vitro効力 1%グリセロール及び0.01%ビタミンEを含む0.9%塩化ナトリウム中の本発明の方 法により製造したIL-2プラスミドDNA/DMRIE-DOPE脂質複合体を使用したin vitro トランスフェクションの後、B16FO細胞、マウス黒色腫細胞系、ATCC # CRL6322 中でのIL-2遺伝子発現によりトランスフェクション効率を測定した。 トランスフェクションの前日に6ウェルプレートにウェルあたり200,00〜400,0 00のB16FO細胞を播種した。細胞はトランスフェクションの前に>75%集密単層と なった。0.5μg DMRIE(自家合成)及び0.5μg DOPE(Avanti Polar Lipids，Alaba ster，Alaから購入)の存在下で、2.5μgプラスミドDNAにより細胞をトランスフ ェクトした。細胞は全体を通して37℃、5% CO2で培養した。胎児ウシ血清を補充 した還元血清培地、例えばOpti-MEM 還元血清培地(GIBGO BRL Life Technologie s，Gaithersburg，MD)を、トランスフェクションの開始時及びトランスフェクシ ョンの後24時間に細胞に添加した。トランスフェクション後48〜80時間で細胞上 清を回収した。 細胞上清におけるIL-2発現を、酵素増幅感度免疫アッセイ(Medgenix ELISA，M edgenix Diagnostics，Fleurus，Belgium)により測定した。効力は新たに製造さ れたプラスミドDNA/カチオン性複合体のものと同等であった。 実施例11 IL-2/DMRIE-DOPE 複合体の安定性 本発明の方法により製造され、1%グリセロール及び0.01%ビタミンEを含む0.9% 塩化ナトリウム中で貯蔵したIL-2プラスミドDNA/DMRIE-DOPE脂質複合体の安定性 を-20℃、2℃、25℃及び37℃において評価した。1%グリセロールを含み、ビタミ ンEを含まない0.9%塩化ナトリウム中の別のDNA/DMRIE-DOPE調製物を37℃の貯蔵 温度で評価した。試験における物質の安定性は、96ウェルトランスフェクション アッセイを含むいくつかの方法により分析した。試験の結果、1%グリセロール及 び0.01%ビタミンEを含む0.9%塩化ナトリウム中のIL-2/DMRIE-DOPE複合 体及び遊離のDNAは、-20℃及び2℃での57日の貯蔵の間完全に安定であることが 判った。25℃においては、IL-2/DMRIE-DOPE複合体は57日の貯蔵の間見かけ上完 全な活性を保持しており、遊離のDNAはこの温度で環状から直線形態への変換に ついて500日の半減期を示した。37℃においては、IL-2/DMRIE-DOPE複合体は34日 の半減期を示し、遊離のDNAはこの温度で290日の半減期で環状から直線形態へ変 換された。比較としてビタミンE の存在しない場合は、IL-2/DMRIE-DOPE複合体 は37℃で12日の半減期を示し、遊離のDNAはこの温度で環状から直線への変換に ついて108日の半減期を示した。即ち、主題となる態様中に0.01%のレベルのビタ ミンEが存在すると、2.7〜3倍高いバイアル中の成分の安定性が得られた。 実施例12 IL-2/DMRIE-DOPE 複合体の製造 A．脂質配合及びオートクレーブ殺菌 1．DMRIE/DOPE バルク溶液の製造 分析用秤を使用してDMRIE Brのバッチ量を秤量した。 換気層流フード中で作業を行い、DMRIE Brを清浄な50 mL丸底フラスコに入れ た。 5-mLガラスピペットを使用して5 mLのクロロホルムを上記の丸底フラスコに加 えた。フラスコを回転させてDMRIE Brを溶解した。 SMIピペットを使用し、DOPEのバッチ量を添加した。 丸底フラスコの首を5 mLのクロロホルムで洗い流し、少なくとも1分間内容物 をゆっくりと回転させて混合した。回転後に首に付着した溶液は、クロロホルム を追加して全てフラスコ内に洗い入れた。 ロータリーエバポレーターを使用し、上記の溶液からクロロホルムを除去した 。凝集物が凝集器に認められなくなるまでフラスコをロータリーエバポレーター 上に維持した。 デシケーターをアルコールで完全に拭い、換気層流フード中に置いた。上記の 丸底フラスコをデシケーター中に置いた。デシケーターを真空ポンプにつな ぎ、デシケーターを脱気し、丸底フラスコを少なくとも12時間真空下に維持した 。 少なくとも12時間真空にした後、デシケーターを真空ポンプから離した。 換気層流フード中で作業を行い、デシケーターを窒素ガス源につなぎ、ガスを いれて真空を解放した。デシケーターに窒素ガスを充填した後、ガス源を離した 。 丸底フラスコをデシケーターから取り出し、滅菌使い捨てピペットを使用して 注射用滅菌水をフラスコに加えた。フラスコにキャップし、液体を回転させ、再 水和が得られるまで少なくとも5分間攪拌した。 2．オートクレーブ処理用のDMRIE/DOPEバルク脂質混合物バイアルの製造 上記の溶液を〜0.5 mLアリコートとして清浄な2-mLタイプ1ガラスバイアルに 移した。各バイアルを清浄なテフロン被覆グレーブチルゴム栓でキャップし、ア ルミニウムクリンプでキャップを固定した。 上記の充填バイアルを、オートクレーブで標準液体サイクルを使用してオート クレーブ殺菌した(121℃以上、30分間)。オートクレーブしたバイアルをすぐに 使用しない場合は2〜8℃で保存した。オートクレーブしたバイアルは室温では6 時間を越えて保持しないようにした。 B．プラスミドDNA配合 1．IL-2 プラスミドDNA標準バルク溶液の滅菌濾過 換気層流フード中で作業を行い、プラスミドDNA標準バルク溶液を0.2μm滅菌 濾過ユニットにより濾過した。濾液を滅菌使い捨てチューブ中に回収した。チュ ーブを15〜30℃に保存した。 C．プラスミドDNA/DMRIE-DOPE脂質混合物配合及び充填 1．DMRIE/DOPE 脂質溶液の調製 物質は全て室温(15〜30℃)として換気層流フード中で作業を行い、注射用滅菌 水を滅菌使い捨て250-mLボトル中に移した。 ストックグリセリンの適当量及びストックビタミンEの適当量を上記のボトル 中に入れ、回転させて混合した。 適当量の上記のオートクレーブ滅菌したDMRIE/DOPEバルク脂質混合物を上記の 溶液に加え、回転させて混合した。 適当量の上記の濾過IL-2プラスミドDNA溶液を上記のDMRIE/DOPE脂質溶液に加 えた。ボトルをキャップし、混合物を少なくとも1分間手操作で激しく回転させ た。 適当量のストック(5%)塩化ナトリウム注射を上記のIL-2プラスミドDNA/DERIE- DOPE脂質複合体溶液に加えた。ボトルをキャップし、混合物を少なくとも1分間 手操作で激しく回転させた。 2．充填/仕上げ 換気層流フード中で作業を行い、上記のIL-2プラスミドDNA/DMRIE-DOPE脂質複 合体の1.2 mLを、Drummond Pipet-Aid及び滅菌使い捨て2-mLピペットを使用して 用意した2-mLタイプIガラスバイアルに無菌的に充填した。 バイアルを用意した13 mmテフロン被覆グレーブチルゴム栓及び13 mmタブトッ プアルミニウムキャップでで密閉した。全てのバイアルキャップはハンドクリン パーで挟んだ。 実施例13 フェーズIヒト臨床試験におけるIL-2/DMRIE-DOPE複合体 プラスミドDNA発現ベクターの直接の腫瘍内注射により、腫瘍内へのIL-2遺伝 子の導入方法が得られる。このプロトコールにおいて計画したフェーズI試験は 、安全性及びIL-2遺伝子を固体腫瘍及びリンパ腫中に直接デリバリーするための 直接の遺伝子移入法の最適投与量決定のためのスポンサー試験である。IL-2遺伝 子の発現を確認する。生成されたIL-2は免疫原性抗腫瘍反応を起こし、これが他 の腫瘍細胞の全身性免疫的排除を誘導し得る。投与量応答は特異的免疫反応と関 連付けられる。 具体的にはフェーズIプロトコールは以下を目指して設計される。 1) 患者の危険性を最小限にする。 2) 組換え体遺伝子のin vivo発現について最大の情報を得る。 3) 患者に対する可能性のある効果を最大にする。 4) in vivoにおける組織への遺伝子デリバリー及び腫瘍に対する免疫反応につ いて新たな知見を得る。 臨床的計画の目的は以下を含む。 1) 腫瘍細胞中のIL-2遺伝子のin vivo 発現を確認する。 2) 増大量のDNA/脂質混合物、IL-2/DMRIE-DOPEの、進行性悪性腫瘍を有する患 者への直接の病巣内注射の安全性と毒性を判定する。 3) IL-2/DMRIE-DOPEによる治療の生物学的活性及び薬物動態を判定する。 4) 注射された腫瘍及び存在し得るその他の腫瘍塊のサイズを調べることにより 、試験薬剤の増加投与量に対する臨床反応を特性化する。 製品は、カチオン性脂質混合物DMRIE/DOPEを含む注射用ビヒクル中に配合され たIL-2をコードするプラスミドDNAからなる。標的腫瘍組織中に導入されると、 前記脂質はプラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進する。プラスミ ドの細胞への導入されると、組換え体遺伝子が発現される。脂質混合物は２つの 化合物、DOPE(CAS名称:1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミ ン)及びDMRIE-Br(CAS名称:(+/-)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビ ス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)として合成されるDMRI Eの組み合わせであり、これらは迅速に代謝されるものと推定される。 プラスミド/脂質混合物及び注射ビヒクルは本発明の方法により製造される。 プラスミドDNAは、生理食塩水（注射用滅菌水中の0.9%塩化ナトリウム）中の1% グリセロール及び0.01%ビタミンＥからなる注射用ビヒクル中のDMRIE/DOPEと配 合する。この投与形態は注射により個体腫瘍組織中にデリバリーされる。 各投与量パッケージ中のプラスミドDNA及びDMRIE/DOPEの濃度を下記の表に示 す。 これはフェーズＩオープンラベル試験であり、25人までの患者について脂質を 配合したIL-2プラスミド複合体を直接腫瘍結節に注射する。調べる腫瘍の種類は 固体腫瘍（骨腫瘍を除く）及び悪性黒色腫の転移、腎細胞癌、進行結直腸癌の肝 臓転移、及びリンパ腫である。 好適な患者は一次腫瘍結節を有するものであり、試験薬剤の特定の投与量を特 定の間隔で複数回、一次腫瘍結節に注射したものである（下記参照）。５人の患 者からなる４つの群についてそれぞれ規定の投与量(10、30、100または300μg) で処置し、５人の患者の一つの群を最大許容投与量(MTD)で再処置するかあるい はMTDに達していない場合は300μgで再処置する。グレード３あるいはそれより 高い毒性を示さない最高の投与量をMTDとする。全ての毒性は世界保健機構(WHO) 、急性及び亜急性毒性効果の段階化についての勧告に従って段階化する。 試験薬剤を投与し、毒性を監視する。腫瘍病巣は、接近可能で直接の針での注 射により腫瘍内投与できる場合に、治療のために選択する。これらの転移病巣は 任意の接近可能な部位、例えば皮膚、結節、肺、肝臓、軟組織等に位置する。骨 腫瘍は除外する。各腫瘍に注射される試験薬剤物質は以下に概略を示すアルゴリ ズムに基づくものである。所定投与量(10、30、100あるいは300μg)を溶解し注 射用ビヒクルで適当な容量に希釈する。必要な場合は、転移の音波ホログラフィ ーまたはCATスキャンによる可視化を使用して試験薬剤を注射する。注射の前、 針を所定位置に置いた後に、シリンジを軽く吸引して静脈内に注射される物質が ないようにする。薬剤の注射の後、針がまだその位置にある間に、0.25〜0.50 m Lの滅菌生理食塩水(注射用滅菌水中の0.9%塩化ナトリウム)でデッドスペースを 洗い流す。 腫瘍直径（cm） 注射容量（cc） 1.0〜1.5 1.0 1.6〜2.0 2.0 2.1〜3.0 3.0 3.1〜X 4.0 生命的兆候は注射開始時、注射中、そして注射後は少なくとも２時間あるいは 患者が安定になるまで15分毎に測定する。心収縮期血圧が80 mmHg未満に低下し た場合は注射を直ちに停止し、血圧が正常に戻るまで患者を注意深く監視し適切 に処置する。 患者は、注射後3〜4時間、その後一回目及び二回目の注射の後24時間及び７日 間、毒性について注意深く監視する。注射３〜６については、注射１及び２の後 の４時間及び24時間の観察期間に毒性が観察されない限り、注射後３〜４時間、 その後注射後７日間、患者を監視する。 それぞれの次の注射の前に、先の注射による毒性について患者を評価し、グレ ード３以上の毒性が起こっていないときにのみ次の投与量を注射する。結節の各 腫瘍内注射において腫瘍のサイズ測定を行う。注射ができないような程度まで腫 瘍が収縮した場合は、存在する場合には別の腫瘍結節に次の投与量を注射する。 ６回目の注射の後、患者フォローアップとして８週及び16週に腫瘍サイズ測定 による評価を行う。16週の後は、最低４か月毎に患者を評価する。 最初の治療期間の最後の注射の後４〜８週において患者が安定な疾患あるいは 部分的な反応を経験した場合（下記参照）は、最初の治療期間と同一あるいは次 のより高い投与量の追加の治療期間を患者に与えてもよい。しかし患者は試験へ の導入基準を満たし続けていなければならない。 副作用を監視し、許容できない毒性(グレードIIIまたはIV)が発生した場合は その患者を試験から除外する。 薬剤分布、半減期、代謝、及び排泄についての古典的な薬理学的試験は、in v ivo遺伝子注射及び発現には完全に適当なものではない。しかし、プラスミドの 運命、及び遺伝子産物(IL-2)の検出はこの物質の開発に関連する。さらに、免疫 活性化が重要である。従って、この試験の効能の測定の一部として、遺伝子移入 及び発現の成功を分子及び免疫学的分析により評価する。以下のパラメーターを 測定して腫瘍トランスフェクション及びIL-2の発現を評価する。1）IL-2遺伝子 からのDNAの存在は、試験薬剤の注射の後に治療部位の生検により得た細胞のPCR 増幅により調べる。2）腫瘍生検試料の免疫組織化学的染色を使用して免疫学的 反応及び可溶性IL-2発現を調べる。3）血清IL-2レベルは治療前及び治療の開始 後２回測定する。但し、IL-2の不安定性のために血清IL-2のレベルは検出されな いと予測される。4)末梢血試料のPCR分析を使用して治療開始後のDNAプラスミド の存在を試験し、治療前と比較する。但し、末梢血試料中に該遺伝子は検出され ないと予測される。5）治療前及び治療後の末梢血におけるチミジン取り込みア ッセイ及びNK/LAK反応により基準及び処置後のPBMCのIL-2誘導活性を測定するこ とにより細胞免疫反応を評価する。6）診断、免疫化学的試験、 凍結保存のため、及び処置の前及び後に腫瘍に対する末梢血リンパ球の免疫学的 反応を評価するために、処置の前に別の部位から腫瘍組織を切除することを試み る。 本試験の有効性の評価の追加的な部分として、臨床的反応を測定する。標準的 な発癌性の基準を適用して患者が試験薬剤に応答するかどうかを判断する。全て の腫瘍の測定をセンチメーターで記録し、腫瘍の最も幅のある部分において最大 の直径と垂直方向の直径の測定を行う。以下に記載した腫瘍反応の定義を使用し てそのときの全腫瘍サイズを処置前全腫瘍サイズと比較する。 最低４週間について活性腫瘍の全ての臨床的証拠が消失したとき完全な腫瘍反 応があったものとし、患者は癌の全ての徴候がないものである。 測定可能な病巣の全ての直径の積の合計において50%以上の減少がある場合に 部分的な腫瘍反応があるものとする。これらの腫瘍サイズの減少は最低４週間継 続しなければならない。いずれかの病巣においてサイズが同時に増加すること、 あるいは新たな病巣の出現は起ってはならない。反応を示すのに使用した適当な 診断試験を、最初の観察の後４週間反復し、その期間を記録しなければならない 。 測定可能な病巣の全ての直径の積の合計において50%未満の減少しかない場合 、あるいは新たな病巣の出現なしに25%未満の腫瘍体積の増加がある場合に安定 な疾患が存在するものとする。 以下の基準の１以上に合致する場合に、腫瘍進行についての進行性疾患が存在 するものと定義する: 1）新たな病巣の出現、2）測定可能な病巣の全ての直径の 積の合計における25%以上の腫瘍サイズの増加、3）治療あるいはその他の医学的 症状によるものとすることができず、増加した腫瘍負荷に関連するものと推定さ れる有意な臨床的悪変、及び4）医師により臨床的に有意であるとみなされる腫 瘍関連徴候の悪化。 食品医薬品局(FDA)規則21 C.F.R.パート50に記載されたインフォームドコンセ ントの原則に従った。 関連のInstitutional Review Board(IRB)、国立衛生研究所(NIH)の組換えDN A諮問委員会(RAC)及び食品医薬品局(FDA)により適当な承認を得た。 本発明の特定の態様について詳細に記載したが、これらの態様は限定的なもの ではなく例示的なものであり、本発明の実際の範囲は添付の請求の範囲により規 定されるものであることは当業者には明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年５月７日 【補正内容】 請求の範囲（補正後） １．（a）滅菌されたカチオン性脂質溶液を作製し、 (b) 滅菌されたプラスミドDNA溶液を作製し、 (c) そしてステップ(b)のプラスミドDNA溶液をステップ(a)のカチオン性脂質溶 液に無菌的に加えて等張より低いイオン強度を有する溶液中のプラスミドDNA/カ チオン性脂質複合体を形成し、 (d) ステップ(c)のプラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の溶液をほぼ等張に無 菌的に調整し、 (e) ステップ(d)のプラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の溶液を貯蔵する、 各ステップを含む、プラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の単一バイアル製剤の 製造方法。 ２．ステップ(e)が、プラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の溶液を凍結するこ とを含む請求項１に記載の方法。 ３．ステップ(a)のカチオン性脂質溶液が約0.01〜約1.0 Mの範囲の濃度を有し、 ステップ(b)のプラスミドDNA溶液が約0.05〜約10 mg/mLの範囲の濃度を有する請 求項１に記載の方法。 ４．ステップ(a)のカチオン性脂質溶液が約0.5〜約5.0 Mの範囲の濃度を有する カチオン性脂質溶液をオートクレーブで滅菌することにより製造される請求項１ に記載の方法。 ５．ステップ(a)のカチオン性脂質溶液が約90:10〜約10:90の範囲のモル比を有 するDMRIE/DOPEのカチオン性脂質溶液である請求項１に記載の方法。 ６．ステップ(a)のDMRIE/DOPEのカチオン性脂質溶液が≦約2 mg DMRIE/mLの濃度 を有し、ステップ(b)のプラスミドDNA溶液が≦約10 mgプラスミドDNA/mLの濃度 を有し、ステップ(c)のプラスミドDNA/カチオン性脂質複合体がDNA対DMRIEの質 量比約50:1〜約1:10で形成される請求項５に記載の方法。 ７．ステップ(a)のDMRIE/DOPEのカチオン性脂質溶液が約2〜約10 mg DMRIE/mLの 範囲の濃度を有するDMRIE/DOPEのカチオン性脂質溶液をオートクレーブで滅菌す ることにより製造される請求項５に記載の方法。 ８．ステップ(a)のカチオン性脂質溶液が約50:50のモル比を有するDMRIE/DOPEの カチオン性脂質溶液である請求項１に記載の方法。 ９．ステップ(a)のDMRIE/DOPEのカチオン性脂質溶液が≦約1 mg DMRIE/mLの濃度 を有し、ステップ(b)のプラスミドDNA溶液が≦約5 mgプラスミドDNA/mLの濃度を 有し、ステップ(c)のプラスミドDNA/カチオン性脂質複合体がDNA対DMRIEの質量 比約5:1で形成される請求項８に記載の方法。 １０．ステップ(a)のDMRIE/DOPEのカチオン性脂質溶液が約8 mg DMRIE/mLの濃度 を有するDMRIE/DOPEのカチオン性脂質溶液をオートクレーブで滅菌することによ り製造される請求項８に記載の方法。 １１．ステップ(a)のカチオン性脂質溶液が乳化剤を含む請求項１〜10のいずれ かに記載の方法。 １２．ステップ(a)のカチオン性脂質溶液が水を溶媒として含む請求項１〜10の いずれかに記載の方法。 １３．冷凍形態で少なくとも約８週間安定な請求項１〜12のいずれかに記載の方 法により製造される単一バイアル製剤。 １４．少なくとも約８週間にわたり新しく製造されたプラスミドDNA/カチオン性 脂質複合体のin vitroトランスフェクション効率を維持する請求項１〜12のいず れかに記載の方法により製造される単一バイアル製剤。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．(a) 脂質溶液を滅菌し、但し該脂質溶液は滅菌の前または後に等張よりも低 いイオン強度を有する希釈剤で希釈されており、希釈剤が滅菌の後に添加される 場合は該希釈剤は滅菌されたものであり、 (b) ポリヌクレオチド溶液を滅菌し、 (c) ステップ(b)の滅菌されたポリヌクレオチド溶液をステップ(a)の希釈され滅 菌された脂質溶液と合わせてポリヌクレオチド/脂質複合体を形成し、 (d) ステップ(c)のポリヌクレオチド/脂質複合体をほぼ等張に調整する、 各ステップを含む、ポリヌクレオチド/脂質複合体の単一バイアル製剤の製造方 法。 ２．(a) 高濃度のカチオン性脂質溶液を滅菌し、 (b) ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質溶液を等張よりも低いイオン強度 を有する滅菌希釈剤で希釈し、 (c) プラスミドDNA溶液を滅菌し、 (d) ステップ(c)の滅菌されたプラスミドDNA溶液をステップ(b)の希釈され滅菌 されたカチオン性脂質溶液に加えてDNA/脂質複合体を形成し、 (e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体をほぼ等張に調整する、 各ステップを含む、プラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の単一バイアル製剤の 製造方法。 ３．(a) 高濃度のカチオン性脂質溶液を滅菌し、但し前記の高濃度は滅菌の間の 脂質の分解を防止するのに有効なものであり、 (b) ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質溶液を、下記ステップ(d)の間の脂 質の凝集を防止するのに有効な等張よりも低いイオン強度を有する滅菌希釈剤で 希釈し、 (c) プラスミドDNA溶液を滅菌し、 (d) ステップ(c)の滅菌されたプラスミドDNA溶液をステップ(b)の希釈され滅菌 されたカチオン性脂質溶液に加えてプラスミドDNA/脂質複合体を形成し、 (e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体をほぼ等張に調整する、 各ステップを含む、プラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の単一バイアル製剤の 製造方法。 ４．(a) 約0.5〜約5.0 Mの範囲の濃度を有するカチオン性脂質溶液を滅菌し、 (b) ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質溶液を等張よりも低いイオン強度 を有する滅菌希釈剤で希釈して約0.01〜約1.0 Mの範囲の濃度を得、 (c) プラスミドDNA溶液を滅菌し、 (d) 約0.05〜約10 mg/mLの範囲の濃度を有するステップ(c)の滅菌されたプラス ミドDNA 溶液をステップ(b)の希釈され滅菌されたカチオン性脂質溶液に加えてD NA/脂質複合体を形成し、 (e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体をほぼ等張に調整する、 各ステップを含む、プラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の単一バイアル製剤の 製造方法。 ５．(a) 約90:10〜約10:90の範囲のモル比を有し、約2〜約10 mg DMRIE/mLの範 囲の濃度を有するDMRIE/DOPEのカチオン性脂質溶液を滅菌し、 (b) ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質溶液を等張よりも低いイオン強度 を有する滅菌希釈剤で希釈して≦約2 mg DMRIE/mLの濃度を得、 (c) プラスミドDNA溶液を滅菌し、 (d) ≦約10 mg プラスミドDNA/mLの濃度を有するステップ(c)の滅菌されたプラ スミドDNA溶液をステップ(b)の希釈され滅菌されたカチオン性脂質溶液に加えて DNA対DMRIEの質量比が約50:1〜約1:10のDNA/脂質複合体を形成し、 (e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体を塩化ナトリウムでほぼ等張に調整する、 各ステップを含む、プラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の単一バイアル製剤の 製造方法。 ６．(a) 約50:50のモル比を有し、約8 mg DMRIE/mLの濃度を有するDMRIE/DOPEの カチオン性脂質溶液を滅菌し、 (b) ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質溶液を等張よりも低いイオン強度 を有する滅菌希釈剤で希釈して≦約1 mg DMRIE/mLの濃度を得、 (c) プラスミドDNA溶液を滅菌し、 (d) ≦約5 mgプラスミドDNA/mLの濃度を有するステップ(c)の滅菌されたプラス ミドDNA溶液をステップ(b)の希釈され滅菌されたカチオン性脂質溶液に加えてDN A対DMRIEの質量比が約5:1 のDNA/脂質複合体を形成し、 (e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体をほぼ生理的塩分状態に調整する、 各ステップを含む、プラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の単一バイアル製剤の 製造方法。 ７．(a) 約50:50のモル比を有し、約8 mg DMRIE/mLの濃度を有するDMRIE/DOPEの カチオン性脂質溶液を滅菌し、 (b) ステップ(a)の滅菌されたカチオン性脂質溶液を等張よりも低いイオン強度 を有する滅菌希釈剤で希釈して≦約1 mg DMRIE/mLの濃度を得、そしてグリセロ ール及びビタミンEを含むものとし、 (c) プラスミドDNA溶液を滅菌し、 (d) ≦約5 mgプラスミドDNA/mLの濃度を有するステップ(c)の滅菌されたプラス ミドDNA 溶液をステップ(b)の希釈され滅菌されたカチオン性脂質溶液に加えてD NA対DMRIEの質量比が約5:1のDNA/脂質複合体を形成し、 (e) ステップ(d)のDNA/脂質複合体を約0.9%塩化ナトリウムに調整し、グリセロ ールの最終濃度を約1%、ビタミンEの最終濃度を約0.01%とする、 各ステップを含む、約0.9%塩化ナトリウム中の、約1%グリセロール及び約0.01% ビタミンEを含む、プラスミドDNA/カチオン性脂質複合体の単一バイアル製剤の 製造方法。 ８．冷凍、冷蔵、室温あるいは体温形態で安定な請求項１〜７のいずれかに記載 の単一バイアル製剤。 ９．冷凍、冷蔵あるいは室温形態で少なくとも約８週間安定な請求項１〜７のい ずれかに記載の単一バイアル製剤。 １０．少なくとも約８週間にわたり新しく製造したプラスミドDNA/カチオン性 脂質複合体のin vitroトランスフェクション効能を保持する請求項１〜７のいず れかに記載の単一バイアル製剤。 １１．希釈剤が水である請求項１〜７のいずれかに記載の単一バイアル製剤。 １２．ポリヌクレオチド溶液またはプラスミドDNA溶液が溶媒として水を含む請 求項１〜７のいずれかに記載の単一バイアル製剤。