CN112153985B - 用于颗粒制剂的防冻剂 - Google Patents

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Abstract

提供了组合物，其包含：(i)悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和(ii)选自被一个或两个羟基取代的C3‑C5烷烃的至少一种防冻添加剂，所述防冻添加剂使颗粒制剂稳定。进一步的方面涉及可以通过冷冻稳定的组合物来获得的固体组合物，以及涉及用于制备根据本发明的组合物的方法。

Description

用于颗粒制剂的防冻剂
技术领域
本发明涉及组合物的稳定化，该组合物包含治疗活性剂的颗粒制剂，具体是包含纳米颗粒或微颗粒的制剂。
背景技术
纳米颗粒制剂和微颗粒制剂因其通过施用至呼吸道或经由呼吸道施用而允许治疗活性剂进入体内的能力而被知晓。然而，多种配制为纳米颗粒或微颗粒的活性剂在室温下，甚至在冷藏状态(例如2-8℃)下遭受有限的稳定性。冷冻制剂将显著提高长期稳定性，并因此提高配制为纳米颗粒或微颗粒的治疗活性剂的适用性。然而，冷冻通常导致聚集过程，聚集过程伴随功能的丧失。尽管常规防冻添加剂的添加防止冷冻期间的颗粒聚集(例如，W.Abdelwahed等人，Adv.Drug Del.Rev.58(2006)，1688-1713；J.C.Kasper等人，J.Contr.Rel.151(2011)，246-255)，但仍然存在问题——在肺部施用后，所得的制剂不具功能性。因此，用标准冷冻保护剂(如糖类)不能可靠地实现冷冻期间纳米颗粒或微颗粒的稳定化，同时维持维持其施用至呼吸道或经由呼吸道施用的功能性。
发明内容
在本发明的背景下，已经确定了一类添加剂，其出乎意料地允许纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的冷冻，同时在施用至呼吸道或经由呼吸道施用期间维持其功能。将颗粒制剂与这样的防冻添加剂组合的组合物允许在制剂施用之前以固体，冷冻的状态方便地将其存储和/或运输。
因此，根据第一方面，本发明提供了组合物，其包含：
(i)悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
(ii)选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂。
根据第二方面，本发明提供了固体组合物，其包含：
(i)治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
(ii)选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，所述固体组合物能够通过冷冻根据第一方面的组合物获得。
在下文中，根据第一方面的组合物在本文中也可以被称为“悬浮液组合物”，而根据第二方面的组合物可以被称为“固体组合物”。
本发明的进一步方面涉及用于制备根据上述第一方面的组合物的方法，所述方法包括：
a)提供悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
b)将选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂添加至液相中，其中将防冻添加剂添加至液相中可以在提供悬浮在液相中的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂之前、期间或之后完成。
类似地，根据进一步的方面，本发明提供了用于制备根据上述第二方面的固体组合物的方法，所述方法包括：
通过包括以下的方法制备根据上述第一方面的组合物的第一步骤：
a)提供悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
b)将选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂添加至液相中，其中向液相中添加防冻添加剂可以在提供悬浮在液相中的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂之前、期间或之后完成，
和冷冻第一步骤中获得的组合物的第二步骤。
本发明的进一步方面涉及保存治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的方法，所述方法包括提供根据上述第一方面的悬浮液组合物，并冷冻所述组合物。又进一步的方面涉及选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的化合物作为防冻添加剂用于包含治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的组合物的用途。
本发明的又进一步的方面提供了用于由悬浮在液体中的颗粒组合物形成气溶胶或用于雾化这样的组合物的装置，所述装置包含根据本发明的第一方面的组合物。相关方面提供了用于治疗或预防疾病的根据本发明的第一方面的组合物，其中组合物将被给予至呼吸道或经由呼吸道给予。
在下文中，将提供本发明及其以上讨论的方面的详细描述。在此上下文中将理解的是，这些方面是紧密相关的。因此，将理解的是，除非另有说明，否则关于一个方面的特征所提供的详细信息也将适用于依赖此特征的其它方面。
具体实施方式
治疗活性剂
根据本发明的组合物包含治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂。已知多种治疗活性剂适用于这样的颗粒制剂。在此背景下，对治疗活性的提及包括给予至患者以治疗疾病或障碍的试剂，以及经给予以防止疾病或障碍影响患者的试剂。
优选用于本发明的背景下的治疗活性剂是核酸。在包含于纳米颗粒制剂或微颗粒制剂中作为治疗活性剂的核酸中，进一步优选RNA，更优选单链RNA，并且最优选mRNA，包括修饰的mRNA。
术语“核酸”涵盖所有形式的天然存在的类型的核酸以及化学和/或酶促合成的核酸，并且还涵盖核酸类似物和核酸衍生物，如，例如，锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、寡核苷硫代磷酸和磷酸三酯、吗啉代寡核苷酸、阳离子寡核苷酸(US6017700 A，WO/2007/069092)、取代的核糖寡核苷酸或硫代磷酸。此外，术语“核酸”还指代包括核苷酸或核苷酸类似物的任何分子。对于本发明的组合物中包含的核酸的序列或大小没有限制。核酸主要由本发明的组合物递送到的生物学目标处所要达到的生物学效果来定义。例如，在应用于基因疗法或核酸疗法的情况下，核酸或核酸序列可以由以下限定：要表达的基因或基因片段，或缺陷基因或任何基因目标序列的预期取代，或被抑制、敲低或下调的基因的目标序列。
术语“核酸”涵盖寡核苷酸或多核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。关于RNA，原则上任何类型的RNA都可以在本发明的背景下采用。在优选的实施方式中，RNA是单链RNA。术语“单链RNA”意为与由于分开的链的杂交，两条或更多条分开的链形成双链分子的RNA分子对比的单条连续的核糖核苷酸链。术语“单链RNA”不排除单链分子本身形成双链结构，如环、二级结构或三级结构。
术语“RNA”涵盖编码氨基酸序列的RNA以及不编码氨基酸序列的RNA。已经提出，超过80％的基因组含有不编码蛋白质的功能性DNA元件。这些非编码序列包括调节性DNA元件(转录因子、调节子和共调节子等的结合位点)和编码从未被翻译成蛋白质的转录物的序列。这些由基因组编码并转录为RNA但未翻译成蛋白质的转录物被称为非编码RNA(ncRNA)。因此，在一个实施方式中，RNA是非编码RNA。优选地，非编码RNA是单链分子。研究表明，ncRNA在基因调控、维持基因组完整性、细胞分化、和发育中起关键作用，而其在各种人类疾病中被错义调控。存在不同类型的ncRNA：短链(20-50nt)、中等(50-200nt)、和长链(＞200nt)ncRNA。短链ncRNA包括微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、和转录起始RNA(tiRNA)。中等ncRNA的实例是小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、转移RNA(tRNA)、转录起始位点相关RNA(TSSaRNA)、启动子相关小RNA(PASR)、和启动子上游转录物(PROMPT)。长链非编码RNA(lncRNA)包括基因间区长链非编码RNA(1incRNA)、反义lncRNA、内含子(intronic)lncRNA、转录的超保守RNA(T-UCR)等(Bhan A，Mandal SS，ChemMedChem.2014 Mar 26.doi：10.1002/cmdc.201300534)。在上述非编码RNA中，只有siRNA是双链的。因此，由于在优选的实施方式中，非编码RNA是单链的，因此优选非编码RNA不是siRNA。在另一实施方式中，RNA是编码RNA，即编码氨基酸序列的RNA。这种RNA分子也称为mRNA(信使RNA)，并且是单链RNA分子。核酸可以通过本领域普通技术人员已知的合成化学和酶促方法制备，或者通过使用重组技术来制备，或者可以从天然来源分离，或者通过其组合来制备。寡核苷酸或多核苷酸可以任选地包含非天然核苷酸，并且可以是单链或双链或三链的。“核酸”还指代有义和反义寡核苷酸或多核苷酸，即与DNA和/或RNA中的特定核苷酸序列互补的核苷酸序列。
优选地，在本发明的上下文中，术语核酸指代RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA。将理解，除非在具体上下文中另有说明，本文所用的术语mRNA涵盖修饰的mRNA。换言之，在本发明的上下文中使用的纳米颗粒或微颗粒优选地包含核酸作为治疗活性剂，并且核酸优选地是RNA，更优选地是单链RNA，并且最优选地是mRNA，该mRNA可以是修饰的mRNA。
信使RNA(mRNA)是由磷酸核苷构造单元构造的共聚物，主要以腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷为核苷，其作为中间载体将遗传信息从细胞核中的DNA引入细胞质中，在细胞质中翻译成蛋白质。因此，信使RNA适合作为基因表达的替代物。
在本发明的上下文中，mRNA应被理解为意指任意的多核糖核苷酸分子，如果其进入细胞，则适合蛋白质或其片段的表达，或者能够翻译成蛋白质或其片段。术语“蛋白质”在本文中涵盖任意种类的氨基酸序列，即两个或更多个各自通过肽键连接的氨基酸的链，并且还包括肽和融合蛋白。
mRNA含有核糖核苷酸序列，该核糖核苷酸序列编码在细胞中或细胞附近需要的或有益的功能的蛋白质或其片段，例如这样的蛋白质：在细胞中或其附近，该蛋白质的缺失或有缺陷的形式诱发疾病或不适(illness)，其提供可以减轻或预防疾病或不适；或是这样的蛋白质：在细胞中或其附近，该蛋白质可以促进对身体有益的过程。mRNA可以含有完整蛋白质或其功能性变体的序列。进一步，核糖核苷酸序列可以编码充当因子、诱导物、调节剂、刺激剂或酶的蛋白质或其功能性片段，其中此蛋白质是其功能对于弥补障碍(特别是代谢障碍)或者启动体内过程(如新血管、组织等的形成)所必需的蛋白质。此处，功能性变体被理解为意指这种片段：其在细胞中可以承担蛋白质的功能，该蛋白质的功能在细胞中是需要的，或者该蛋白质的缺失或缺陷的形式是致病性的。另外，mRNA还可以具有其它功能区和/或3’或5’非编码区。3’和/或5’非编码区可以是天然地位于蛋白质编码序列或人工序列侧翼的区域，其有助于RNA的稳定。本领域技术人员可以通过常规实验确定在每种情况下适合于此的序列。
在优选的实施方式中，mRNA含有m7GpppG帽子、内部核糖体进入位点(IRES)和/或3’端的polyA尾，具体地用以提高翻译。mRNA可以具有促进翻译的其它区域。
在优选的实施方式中，mRNA是含有修饰的和未修饰的核苷酸的组合的mRNA。优选地，它是含有如WO2011/012316中所描述的修饰的和未修饰的核苷酸的组合的mRNA。其中描述的mRNA据报道显示出提高的稳定性和减弱的免疫原性。在优选的实施方式中，在这种修饰的mRNA中，5至50％的胞苷核苷酸和5至50％的尿苷核苷酸是修饰的。含腺苷和鸟苷的核苷酸可以是未修饰的。腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰的或部分修饰的，并且其优选以未修饰的形式存在。优选地，10至35％的胞苷和尿苷核苷酸是修饰的，并且特别优选地，修饰的胞苷核苷酸的含量在7.5至25％的范围内，并且修饰的尿苷核苷酸的含量在7.5至25％的范围内。已发现实际上相对低的含量，如修饰的胞苷和尿苷核苷酸各自仅10％就可以实现期望的性质。特别优选的是，修饰的胞苷核苷酸是5-甲基胞苷残基，而修饰的尿苷核苷酸是2-硫代尿苷残基。最优选地，修饰的胞苷核苷酸的含量和修饰的尿苷核苷酸的含量分别是25％。
在另一优选的实施方式中，mRNA可以与目标结合位点、靶向序列和/或与微小RNA结合位点组合，以便只在相关细胞中允许期望的mRNA的活性。在进一步优选的实施方式中，RNA可以与3’polyA尾下游的微小RNA或shRNA组合。
此外，术语“核酸(一种或多种)”可以指代DNA或RNA或其杂化物或其在现有技术中已知的任何修饰(修饰的实例参见，例如，US 8278036、WO 2013/052523、WO 2011/012316、US 5525711、US 4711955、US 5792608或EP 302175(Lorenz等人2004，Bioorg Med ChemLett，14，4975-4977；Soutschek等人2004，Nature，432，173-178))。这样的核酸分子(一种或多种)是单链或双链的、直链或环状的、天然或合成的，并且没有任何大小的限制。例如，核酸分子(一种或多种)可以是基因组DNA、cDNA、mRNA、反义RNA、核酶、或小干扰RNA(siRNA)、微小RNA、antagomirs、或短发夹RNA(shRNA)、tRNA或长双链RNA或编码这样的RNA或嵌合修复体的DNA构建物(Colestrauss等人1996，Science，273，1386-1389)、或适配体、规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)(“CRISPR”用于RNA引导的位点特异性DNA切割)(Cong等人2013，Science，339，819-823)、或RNA和DNA。所述核酸分子(一种或多种)可以是质粒、粘粒、人工染色体、病毒DNA或RNA、噬菌体DNA、编码和非编码单链(mRNA)或双链RNA和寡核苷酸(一种或多种)的形式，其中包括上述糖主链中和/或碱基中的任意种现有技术的修饰和3’-或5’-修饰。在特别优选的实施方式中，核酸是RNA，更优选地mRNA或siRNA，并且最优选地mRNA。
核酸(一种或多种)可以含有编码在目标细胞中表达的多肽的核苷酸序列。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建重组核酸分子；参见，例如，Sambrook等人，MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)N.Y.和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.(1989)中描述的技术。
如上所述，核酸将作为优选的治疗活性剂包含在纳米颗粒制剂或微颗粒制剂中。通常，可以通过核酸与细胞分子和细胞器的相互作用来实现治疗效果。这种相互作用单独可以例如激活先天免疫系统，对某些CpG寡核苷酸和设计为与toll样受体和其它胞外或胞内受体特异性相互作用的序列而言常常是这样的情况。此外，细胞中核酸的摄入或引入可以旨在导致核苷酸序列，如核酸中包含的基因的表达；可以旨在用于由于引入的外源核酸在细胞内的存在而导致的内源基因表达下调、沉默或敲低；或者可以旨在用于内源核酸序列的修饰，如所选择的碱基或内源核酸序列的整段序列(whole stretches)的修复、切除、插入或交换；或者可以旨在用于由于引入的外源核酸在细胞内的存在和相互作用而实际上干扰任何细胞过程。引入的外源核酸的过表达可以旨在补偿或互补内源基因表达，特别是在内源基因缺陷或沉默的情况下，导致基因表达产物不存在、不足或有缺陷或功能异常，多种代谢性和遗传性疾病，如囊性纤维化、血友病或肌肉营养不良等常常是这样的情况。引入的外源核酸的过表达也可以旨在使表达产物与任意内源细胞过程相互作用或干扰任意内源细胞过程，如基因表达的调控、信号转导和其它细胞过程。引入的外源核酸的过表达也可以旨在在转染或转导的细胞所驻留或使其驻留的生物体的背景下引起免疫应答。实例是抗原呈递细胞(如树突细胞)的遗传修饰，以使其呈递抗原用于疫苗接种目的。其它实例是肿瘤中细胞因子的过表达，以引起肿瘤特异性免疫应答。此外，引入的外源核酸的过表达也可以旨在产生用于细胞疗法的体内或离体瞬时遗传修饰的细胞，如修饰的T细胞或前体或者干细胞或其它用于再生医学的细胞。
例如，可以通过RNA干扰(RNAi)、使用核酶、反义寡核苷酸、tRNA、长双链RNA来实现内源基因表达的下调、沉默或敲低以用于治疗目的，其中这种下调可以是序列特异性或非特异性的，并且常常在当长双链RNA被引入细胞中时的情况下，还可以导致细胞死亡。内源或预先存在的基因表达的下调、沉默或敲低可以用于治疗获得性、遗传性或自发性疾病，包括病毒感染和癌症。还可以设想，可以将核酸引入细胞中作为预防措施来实践，以预防例如病毒感染或瘤形成。内源基因表达的下调、沉默或敲低可以在转录水平上和翻译水平上起作用。多种机制是本领域技术人员已知的，并且包括例如表观遗传修饰、染色质结构的改变、所引入的核酸对转录因子的选择性结合、所引入的核酸与基因组DNA、mRNA或其它RNA种属中通过碱基配对(包括非常规碱基配对机制，如三螺旋形成)的杂交。类似地，可以在基因组水平和mRNA水平(包括外显子跳跃)实现基因修复、碱基或序列改变。碱基或序列改变可以例如通过RNA引导的位点特异性DNA切割、通过利用反式剪接、反式剪接核酶、嵌合修复体(chimeraplasts)、剪接体介导的RNA反式剪接的剪切和粘贴机制、或通过利用II类或重新靶向的内含子、或通过利用由病毒介导的插入诱变或利用使用原核、真核或病毒整合酶系统的靶向基因组插入来实现。由于核酸是生命系统构建计划的载体，并且由于其以直接和间接方式参与多种细胞过程，因此从理论上讲，任何细胞过程都可以受核酸从外部引入细胞的影响。值得注意的是，这种引入可以在细胞或器官培养物中直接于体内和离体进行，然后将因此修饰的器官或细胞移植到受体中。以核酸作为治疗活性剂的用于本发明的背景下的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂可以用于上述所有目的。
将理解的是，用于本发明的背景下的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂可以包含单一的治疗活性剂，但是可以可选地包含两种或更多种治疗活性剂的组合，例如，包含组合在单一颗粒中的两种或更多种类型治疗活性剂的颗粒的形式，或其中所包含的治疗活性剂类型有所不同的颗粒的共混物的形式。
颗粒制剂
根据本发明的组合物(即，悬浮液组合物和固体组合物)包含治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂。如技术读者将理解的，除非另有具体说明，否则在此上下文中以非排他形式使用“或”。因此，对纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的提及涵盖包括含有治疗活性剂的纳米颗粒的制剂、包括含有治疗活性剂的微颗粒的制剂、和包括含有治疗活性剂的纳米颗粒和微颗粒的制剂。为了方便起见，在本文中对本发明的讨论中，“纳米颗粒制剂或微颗粒制剂”可以缩写为“颗粒制剂(particle formulation)”或“颗粒制剂(particulateformulation)”。类似地，纳米颗粒或微颗粒可以被称为“颗粒”。
纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的颗粒可以含有治疗活性剂作为仅有的组分。然而，优选的是，颗粒含有与一种或多种其它组分结合的治疗活性剂。这些其它组分通常是药学上可接受的组分，例如药学上可接受的赋形剂或添加剂。
根据本发明的组合物中的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂包括含有治疗活性剂的纳米颗粒或微颗粒。颗粒制剂可以由这样的纳米颗粒或微颗粒组成。如本文所用，术语纳米颗粒总体上指代直径在纳米尺寸范围内(即直径为1nm以上且1000nm以下)的颗粒。术语微颗粒总体上指代直径在微米尺寸范围内(即直径为1000nm以上且100μm或以下)的颗粒。
纳米颗粒制剂或微颗粒制剂通常显示1至4000nm，更优选地2至2500nm，并且最优选地5至1000nm范围内的平均粒径。
纳米颗粒制剂或微颗粒制剂中单一颗粒的直径的上限是20μm，更优选地10μm和最优选地5μm。因此，将从上述内容理解到，强烈优选的颗粒制剂将是平均粒径在5至1000nm范围内，并且颗粒的最大粒径是5μm的颗粒制剂。
本文提及的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的粒径和平均粒径可以通过动态光散射(DLS)方便地测定。总体上，本文提及的直径和平均直径表示为通过动态光散射测定的处于悬浮状态的颗粒的流体动力学直径。由于在报道结果时测量设备(例如MalvernZetaSizer)考虑温度的影响，因此测量的直径通常不依赖于温度。然而，测量通常在室温(25℃)下进行。作为DLS测量的悬浮介质，可以适当地使用例如水或含有防冻添加剂的水。在冷冻固体组合物的情况下，通常在融化组合物后测定粒径。在指示平均粒度或平均粒径的情况下，除非另外指出，否则平均值通常是z-平均值。
优选地，纳米颗粒制剂或微颗粒制剂具有以治疗活性剂的重量比颗粒制剂中颗粒的总重量来表示的0.1至95％(w/w)，更优选地0.5至90％(w/w)，最优选地1至80％(w/w)范围内的活性载荷。
除了治疗活性剂之外，用于本发明背景下的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的颗粒可以包含一种或多种其它组分，例如赋形剂或添加剂，其通常是药学上可接受的组分。例如，这种其它组分可以在已经将其给予至患者之后促进颗粒向特定部位的运输或促进颗粒进一步摄取到特定部位中，或者其可以帮助稳定颗粒或其中所含的治疗活性剂。
如果治疗活性剂是核酸，则用于包含核酸的颗粒的有用组分是病毒载体。这种病毒载体是本领域已知的，如例如在A.C.Silva等人，Current Drug Metabolism，16，2015，3-16的综述文章及其中所讨论的文献中所讨论的。
此外，各种聚合物被确立为用于在包含纳米颗粒或微颗粒的颗粒制剂中配制治疗活性剂的赋形剂。这样的聚合物还可以提供在本发明的背景下使用的颗粒制剂的其它组分。例如，合适的聚合物赋形剂包括在将颗粒给予患者后可以在体内重吸收的聚合物，如由氨基酸、碳水化合物、或由乳酸和/或乙醇酸形成的聚合物，包括天然聚合物。
对于包含核酸，优选地RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA作为治疗活性剂的颗粒制剂，优选的其它组分是阳离子赋形剂。这种阳离子赋形剂和提供负电荷的核酸可以一起形成复合物。将理解的是，提及阳离子赋形剂并不排除相应赋形剂中阴离子基团或中性区域的存在，只要阳离子基团以足够高的数量存在以提供赋形剂的总阳离子电荷即可。
因此，根据一个优选的实施方式，本发明的上下文中提及的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂是颗粒制剂，该颗粒制剂包含核酸，优选地RNA，更优选地单链RNA，最优选地mRNA作为由核酸和作为阳离子赋形剂的阳离子低聚物或聚合物，优选聚合物所形成的复合物形式的治疗活性剂。这种复合物在本领域中也称为多聚物(polyplex)。
这种多聚物和能够形成多聚物的合适的低聚物或聚合物是本领域已知的。用于形成多聚物的示例性合适的阳离子低聚物或聚合物——其也可以用于本发明的上下文中提及的颗粒制剂中——在A.C.Silva等人，Current Drug Metabolism，16，2015，3-16及其中提及的参考文献中有所讨论，在J.C.Kasper等人，J.Contr.Rel.151(2011)，246-255中有所讨论，在WO 2014/207231及其中提及的参考文献中有所讨论，以及在WO 2016/097377及其中提及的参考文献中有所讨论。
合适的阳离子低聚物或聚合物具体包括这样的阳离子低聚物或聚合物：阳离子低聚物或聚合物包括多个其中含有氨基的单元。氨基可以被质子化以提供聚合物的阳离子电荷。
在由核酸和包括多个其中含有氨基的单元的阳离子低聚物或聚合物所形成的多聚物中，阳离子低聚物或聚合物中胺氮原子的数量与核酸中磷酸根基团的数量的N/P比优选在1至100，更优选地2至80，并且最优选地3至60的范围内。
在包含多个氨基的阳离子低聚物或聚合物中，包含独立地选自以下(1)、(2)、(3)和(4)的多个单元的低聚物或聚合物是优选的：
-CH2-CH2-NH- (1)
-CH2-CH2-CH2-NH- (3)
其中重复单元(1)、(2)、(3)和/或(4)的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供聚合物的阳离子电荷。
为了提供颗粒制剂，特别优选作为阳离子低聚物或聚合物的是以下四类低聚物或聚合物，其包括多个其中含有氨基的单元。
作为第一优选类别，提及了聚(乙烯亚胺)(“PEI”)，包括支链聚(乙烯亚胺)(“brPEI”)。
阳离子低聚物或聚合物的第二优选类别是包含多个下式(II)的基团作为侧链和/或端基的低聚物或聚合物，如WO 2014/207231(申请人埃泽瑞斯公司)中所公开的：
其中变量a、b、p、m、n和R2至R6如下限定，对于多个这样的基团中每一个式(II)的基团而言都是独立的：
a是1并且b是2至4的整数；或a是2至4的整数并且b是1，
p是1或2，
m是1或2；n是0或1，并且m+n≥2；并且
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基的保护基；和聚(乙二醇)链；
R6选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基的保护基；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体，
并且其中式(II)中所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(II)的阳离子基团。
关于这些低聚物或聚合物的以及以上式(II)中包含的变量的进一步优选定义，除非另有具体说明，WO 2014/207231中的相应公开内容也适用于本文描述的发明。此外，就含有核酸以及多聚物形式的这些低聚物和聚合物的组合物而言，WO 2014/207231中提供的信息适用于本文所提及的颗粒制剂。
阳离子低聚物或聚合物的第三优选类别是包含多个下式(III)的基团作为重复单元的低聚物或聚合物，如WO 2014/207231(申请人埃泽瑞斯公司)中所公开的：
其中变量a、b、p、m、n和R2至R5如下限定，对于多个这样的基团中每一个式(III)的基团而言都是独立的：
a是1并且b是2至4的整数；或a是2至4的整数并且b是1，
p是1或2，
m是1或2；n是0或1并且m+n≥2；并且
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7或-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基的保护基；-C(NH)-NH2；和聚(乙二醇)链；
并且其中式(III)中所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(III)的阳离子基团。
关于这些低聚物或聚合物的以及以上式(III)中包含的变量的进一步优选定义，除非另有说明，WO 2014/207231中的相应公开内容也适用于本文描述的发明。此外，就含有核酸以及多聚物形式的这些低聚物和聚合物的组合物而言，WO 2014/207231中提供的信息适用于本文所提及的颗粒制剂。
阳离子低聚物或聚合物的第四优选类别由统计共聚物提供，如WO 2016/097377(申请人埃泽瑞斯公司)中所公开的。其包括独立地选自下式(a1)和(a2)的重复单元的多个重复单元(a)：
-CH2-CH2-NH- (a1)
和独立地选自下式(b1)至(b4)的重复单元的多个重复单元(b)：
-CH2-CH2-CH2-NH- (b1)
-CH2-CH2-CH2-CH2-NH- (b3)
并且重复单元(a)之和与重复单元(b)之和的摩尔比在0.7/1.0至1.0/0.7的范围内，并且可以使共聚物中包含的重复单元(a)和/或(b)的氮原子中的一个或多个质子化以提供阳离子共聚物。
关于此共聚物的进一步优选的定义，除非另有具体说明，WO 2016/097377中的相应公开内容也适用于本文描述的发明。如其中所指出，特别优选的共聚物是包含重复单元(a1)和(b1)，或由重复单元(a1)和(b1)组成的直链共聚物。此外，就含有核酸以及多聚物形式的这些低聚物和聚合物的组合物而言，WO 2016/097377中提供的信息适用于本文所提及的颗粒制剂。
根据另一优选的实施方式，本发明的上下文中提及的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂是包含由核酸和作为阳离子赋形剂的阳离子脂质或阳离子类脂质(lipidoid)所形成的复合物形式的核酸，优选地RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA作为治疗活性剂的颗粒制剂。除非另有定义，这种复合物具体涵盖包含核酸与阳离子脂质或阳离子类脂质的复合物的脂质复合物(lipoplexes)、脂质体和脂质纳米颗粒(“LNP”)。
在本发明的上下文中，也可用于与核酸形成复合物的合适的阳离子脂质或阳离子脂质和类脂质在本领域是已知的，并且例如在A.C.Silva等人，Current Drug Metabolism，16，2015，3-16及其中提及的文献中有所讨论，在US 2017/0267631、WO 2016/081029、WO2011/071860、WO 2016/118697、US 8450298B2、WO 2014/207231中有所讨论以及在E.R.Lee等人，Human Gene Therapy 7：1701-1717，1996年9月10日中有所讨论。对于不具有脂质的结构但显示脂质的特性的物质，建立了术语“类脂质”。
用于含有与阳离子类脂质的复合物(例如脂质复合物、脂质体或LNP)形式的核酸，优选地RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA作为治疗活性剂的颗粒制剂的一类优选类脂质是具有下式(IV)的结构的类脂质，如WO 2014/207231(申请人：埃泽瑞斯公司)中所公开的：
其中变量a、b、p、m、n和R1至R6如下定义：
a是1并且b是2至4的整数；或a是2至4的整数并且b是1，
p是1或2，
m是1或2；n是0或1并且m+n≥2；并且
R1至R6彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基的保护基；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体；前提是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
并且其中式(IV)中所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(IV)的阳离子类脂质。
关于这些类脂质的以及以上式(IV)中包含的变量的进一步优选的定义，除非另有具体说明，WO 2014/207231中的相应公开内容也适用于本文描述的发明。此外，就含有复合物形式(例如脂质复合物、脂质体或LNP的形式)的核酸和这些类脂质的组合物而言，WO2014/207231中提供的信息适用于本文所提及的颗粒制剂。
可以包含在本文所提及的颗粒制剂中的用于提供核酸与阳离子脂质的复合物的另一优选类型的脂质是阳离子脂质Genzyme Lipid 67(GL67)。此阳离子衍生的脂质对于核酸，优选地RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA的复合非常有用。
对于包含与含有氨基的阳离子脂质或阳离子类脂质(例如式(IV)的类脂质)形成的核酸的复合物的颗粒制剂，脂质复合物中的N/P比优选是1至100，更优选地2至80，并且最优选地N/P比是3至60。
作为可以包含在颗粒制剂中的任选组分，该颗粒制剂包含核酸与阳离子脂质或阳离子类脂质的复合物(如脂质复合物、LNP或脂质体)形式的治疗活性剂，可以提及辅助脂质类(helper lipids)。其可以选自例如固醇类(如胆固醇或地塞米松)、中性脂质类(如DMPE、DOPE、DSPE、DPPE、DMPC、DOPC、DSPC或DPPC)、鞘脂类和聚乙二醇化脂质类(如DMG-PEG、DMPE-PEG或神经酰胺-PEG)中的一种或多种。这些辅助脂质可以单独使用或以两种或更多种类型的组合使用。还可用作包含阳离子脂质或类脂质的治疗活性剂的颗粒制剂的赋形剂是聚乙二蜉(PEG)和亚烷基单元的共聚物。
适用于形成这种复合物的其它组分参见A.C.Silva等人，Current DrugMetabolism，16，2015，3-16及其中讨论的文献。
优选地，包含核酸与阳离子脂质或阳离子类脂质的复合物的颗粒制剂包含一定量的核酸，该量使得脂质和类脂质(包括存在的任何辅助脂质)的总重量与核酸的重量的比在0.1至200，更优选地0.2至150，最优选地0.5至100的范围内。
鉴于以上讨论，将显而易见的是，用于本发明的背景下的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂也是优选的，其中治疗活性剂是mRNA，并且mRNA以与阳离子聚合物或低聚物的复合物的形式，或以与阳离子脂质或阳离子类脂质的复合物的形式包含在颗粒制剂中。关于合适和优选类型的阳离子赋形剂，上述考虑继续适用。同样对于这些优选的颗粒制剂，颗粒制剂中的颗粒通常显示1至4000nm，更优选地2至2500nm，并且最优选地5至1000nm范围内的平均粒径。纳米颗粒制剂或微颗粒制剂中颗粒的直径的上限优选是20μm，更优选地10μm，并且最优选地5μm。
除了治疗活性剂之外，颗粒制剂可以包含一种或多种组分作为一种任选的添加剂或多种任选的添加剂，该组分在治疗剂的递送期间，并且优选地在将作为治疗剂的核酸递送至细胞或细胞中期间发挥效应物功能。这样的组分可以是，但不限于聚阴离子、上述脂质、除了以上讨论的用于形成多聚物的那些以外的其它聚阳离子，如阳离子肽、屏蔽性低聚物(shielding oligomers)或聚合物、泊洛沙姆(也称为聚氧丙烯类)、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物(poloxamines)、靶向配体、内吞体裂解剂(endosomolytic agents)、细胞穿透和信号肽、磁性和非磁性纳米颗粒、RNA酶抑制剂、荧光染料、放射性同位素或用于医学成像的造影剂。术语“效应物功能”涵盖支持在生物目标处或之中或生物目标周围实现组合物的治疗活性剂的预期生物作用的任何功能。例如，已将用于核酸递送的组合物配制以包含非编码核酸或非核酸聚阴离子作为填充材料(stuffer material)(Kichler等人2005，J Gene Med，7，1459-1467)。这种填充材料适用于减少具有预期生物学作用的核酸的剂量，同时在不存在这种填充材料的情况下维持以较高核酸剂量获得的该作用的程度或度。非核酸聚阴离子也已用于以降低的毒性获得延长的体内基因表达(Uchida等人2011，J Control Release，155，296-302)。包含核酸与阳离子聚合物或低聚物的复合物的本发明的颗粒制剂还可以包含阳离子、阴离子或中性脂质，常常是脂质多聚物(lipopolyplexes)这样的情况(Li和Huang，“Nonviral Vectors for Gene Therapy”，Academic Press 1999，第13章，295-303)。脂质多聚物可以有利地由对应于上文显示的式(II)或(III)的聚合物与对应于上文显示的式(IV)的类脂质制备。此外，本发明中使用的颗粒制剂可以包含除上文讨论的用于形成多聚物的那些以外的低聚阳离子或聚阳离子。这样的另外的聚阳离子可以用于实现期望的核酸压紧度(紧密度，degree ofcompaction)，或者在聚阳离子肽的情况下，可以具有诸如先前所描述的核定位信号功能(Ritter等人2003，J Mol Med，81，708-717)。屏蔽性聚合物，如聚(乙二醇)(PEG)也可以包含在用于本发明的背景下的颗粒制剂中，并且经常用于使例如核酸与阳离子赋形剂的复合物稳定，以抵抗生物环境中的聚集和/或不期望的相互作用(调理作用)，例如与血清组分、血细胞或胞外基质的相互作用。屏蔽也可适用于降低包含核酸的组合物的毒性(Finsinger等人2000，Gene Ther，7，1183-1192)。例如，屏蔽性聚合物(如PEG)可以直接共价地偶联至其它低聚物或聚合物，或偶联至可以存在于颗粒制剂中的脂质或类脂质。可以在聚合物主链中实现偶联，如果可行的话，优选与聚合物主链或树枝状大分子的末端偶联。然而，也可以与上述的式(1)至(4)、(II)、(III)、(Iv)或者(a1)、(a2)或(b1)至(b4)中的任一个所含的氨基偶联。
文献中描述的对于包含核酸与阳离子赋形剂的复合物的颗粒制剂可以是有用组分的其它示例性屏蔽性聚合物包括羟乙基淀粉(HES；Noga等人Journal of ControlledRelease，2012.159(1)：92-103、PAS多肽(Pro、Ala、Ser多肽：Schlapschy et a.ProteinEng Des Sel.2013Aug；26(8)：489-501或聚肌氨酸(Polysarcosine)(Psar，：Heller等人Macromol Biosci 2014；14：1380-1395)。
靶向配体可以用于例如颗粒制剂中，以用于递送核酸来实现对目标细胞的优先和提高的转染(在Philipp和Wagner的“Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanismsand Strategy”，第3版，第15章，CRC Press，Taylor&Francis Group LLC，Boca Raton 2009中)。靶向配体可以是以直接或间接方式赋予本发明的组合物目标识别和/或目标结合功能的任意化合物。示例性靶向配体是WO 2011/076391中公开的前列环素类似物，如Iloprost或Treprostinil。抗体还可以作为靶向配体。作为纳米颗粒或微颗粒的配体，可以提及叶酸和N-乙酰半乳糖胺。一般而言，目标是独特的生物学结构，靶向配体可以通过分子相互作用特异性与其结合，并且其中这种结合将最终导致组合物中所含的治疗剂(如核酸)优先积累在目标组织中和/或目标细胞处或目标细胞中。类似于PEG(或HES和PSar)链，可以将靶向配体偶联至例如聚合物主链或树枝状大分子的末端。然而，也可以实现与上述的式(1)至(4)、(II)、(III)、(IV)或者(a1)、(a2)或(b1)至(b4)中的任一个的基团偶联。
此外，内吞体裂解剂如内吞体裂解肽(Plank等人1998，Adv Drug Deliv Rev，34，21-35)或适合增强内吞核酸的内体释放的任意其它化合物是本发明的组合物的有用组分。类似地，细胞穿透肽(在另一种背景下也称为蛋白质转导结构域)(Lindgren等人2000，Trends Pharmacol Sci，21，99-103)可以是本发明的组合物的有用组分，以介导核酸的胞内递送。所谓的TAT肽属于这一类，并且还具有核定位功能(Rudolph等人2003，J BiolChem，278，11411-11418)。
防冻添加剂
作为除纳米颗粒制剂或微颗粒制剂以外的其它组分，根据本发明的组合物包含防冻添加剂，其选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃。如技术读者将理解的，这些取代的烷烃可以是直链或支链烷烃。这些烷烃具有3至5个碳原子。根据羟基取代基的数目，这些烷烃可以被称为一元醇或二元醇，或者被称为链烷醇或链烷二醇。
优选地，防冻添加剂包含至少一个仲羟基(例如一个仲羟基并且无其它羟基、或一个仲羟基和一个伯羟基、或两个仲羟基)。
更优选地，防冻添加剂选自1，2-丙二醇、2-丙醇、1，2-丁二醇、和1，3-丁二醇。最优选地，防冻添加剂是1，2-丙二醇。
组合物
如上所述，本发明提供了作为第一方面的悬浮液组合物和作为第二方面的固体组合物，其每一个都包含治疗活性剂和防冻添加剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，治疗活性剂和防冻添加剂已经在上文进行了更详细的讨论。
由于根据本发明的组合物含有治疗活性剂并且适合于向患者给予治疗活性剂，因此这些组合物可以被称为治疗组合物或药物组合物。
具体地，根据本发明的第一方面的悬浮液组合物包含：
(i)悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
(ii)选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂。
如将理解的，关于治疗剂的、其颗粒制剂的、以及防冻添加剂的合适和优选实施方式的信息在此上下文中继续适用。
悬浮液组合物优选地包含一定量的颗粒制剂的颗粒，以提供包含在颗粒制剂中的浓度为基于组合物的总体积0.01至50mg/ml，更优选地0.02至30mg/ml的治疗活性剂。
防冻添加剂优选地以0.5至50％w/v，更优选地1至40％w/v，最优选地1至30％w/v的浓度包含在悬浮液组合物中，其中百分比值表示每100ml组合物的总体积中防冻添加剂的以g计的重量。通常，将防冻添加剂包含在，优选地溶解于其中颗粒制剂所悬浮的液相中。然而，其也可以部分地与悬浮在液相中的颗粒结合。
根据本发明的第一方面的悬浮液组合物的液相通常含有水作为溶剂。优选地，水提供按体积(基于20℃下液相的总体积)计50％或更多，更优选地70％或更多。更优选地，水和防冻添加剂是液相中仅含有的溶剂。
作为液相的示例性进一步任选的添加剂，可以提及选自盐、糖、有机溶剂和缓冲剂中的一种或多种。
如术语“悬浮的”所暗示的，治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂在连续液相中形成不连续的固相。
总体上，优选将悬浮液组合物提供为两相悬浮液组合物，其中一种连续液相包含防冻添加剂，任选地与溶解在其中的其它添加剂组合，而其中悬浮的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂作为不连续固相。
第二方面的固体组合物包含：
(i)治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
(ii)选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，
并且能够通过冷冻根据第一方面的组合物获得。
固体组合物含有与能够冷冻以获得固体组合物的悬浮液组合物相同的组分。因此，关于针对悬浮液组合物提供的治疗剂的、其颗粒制剂的、防冻添加剂的、以及液相及其组分的合适和优选实施方式的信息继续适用于固体组合物。然而，如技术读者将理解的，固体组合物和悬浮液组合物的不同之处在于，悬浮液组合物的液相已经在固体组合物中固化。在此程度上，固体组合物包含治疗剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂在冷冻液体的固体连续相中的分散体。与上文相符，通常在其中颗粒制剂所分散的连续相中包含防冻添加剂。
鉴于上文，将进一步显而易见的是，组合物还优选作为根据本发明的悬浮液组合物或固体组合物，其包含(i)纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，其中治疗活性剂是mRNA，并且mRNA以与阳离子聚合物或低聚物的复合物的形式，或以与阳离子脂质或阳离子类脂质的复合物的形式包含在颗粒制剂中，和(ii)作为防冻添加剂的1，2丙二醇。关于阳离子聚合物或低聚物的合适和优选类型，以及关于阳离子脂质和阳离子类脂质的优选类型，上述考虑继续适用。同样对于这些优选的组合物，颗粒制剂中的颗粒通常显示1至4000nm，更优选地2至2500nm，并且最优选地5至1000nm范围内的平均粒径。纳米颗粒制剂或微颗粒制剂中颗粒的直径的上限优选是20μm，更优选地10μm，并且最优选地5μm。
药物方面
根据本发明的第一方面的悬浮液组合物适合于向对象给予其中含有的治疗活性剂。如上解释的，与含有其它冷冻保护剂的颗粒组合物相比，该组合物具有出乎意料的优点，其在于该组合物可被保持在冷冻状态中，同时防止冷冻期间或之后颗粒的聚集，并且同时维持向呼吸道给予或通过呼吸道给予，具体地肺部给予或鼻部给予的功能性。因此，悬浮液组合物的优选给予途径是向呼吸道给予或通过呼吸道给予，具体地肺部给予或鼻部给予。
然而，技术读者将理解的是，根据本发明的组合物也可以通过本领域已知的用于治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的其它给予途径来给予，如以悬浮液形式的静脉内给予，例如，以利用防冻剂防止冷冻期间或之后颗粒聚集的作用。在此背景下，已经发现被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的存在可对治疗剂的功效产生有益作用——特别是如果治疗剂是核酸，优选地RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA，如果悬浮液组合物通过可选途径给予，如静脉内给予。
如果治疗活性剂是核酸，优选地RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA，则可以在呼吸道中或通过呼吸道将核酸递送至目标细胞。术语“递送至目标细胞”优选地意为将RNA，优选地单链RNA(如mRNA)转移至细胞中。
组合物可以以合适的剂量给予至对象。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如医学领域所公知的，用于任一对象的剂量取决于多种因素，包括对象的大小、体表面积、年龄、要给予的特定化合物、性别、给予时间和途径、总体健康以及其它同时给予的药物。治疗活性物质的典型剂量可以在例如1ng至几克的范围内。应用到(m)RNA疗法的优选情况，用于表达或抑制表达的(m)RNA的剂量应与此范围相对应；然而，可以设想在此示例性范围以下或以上的剂量，特别是考虑到上述因素。总体上，作为药物组合物的常规给予的方案应在每天每千克体重0，01μg至10mg单位的范围内。如果方案是连续输注，则还应分别在每千克体重1μg至10mg单位的范围内。可以通过定期评估来监测进展。剂量将变化，但是给予作为本发明的组合物成分的(m)RNA的优选剂量是大约106至1019个拷贝的(m)RNA分子。
用于由悬浮在液体中的颗粒组合物形成气溶胶或用于使这样的组合物雾化的装置是本领域已知的并且可以商购获得。这些装置可以用于完成根据本发明的第一方面的悬浮液组合物向呼吸道给予或通过呼吸道给予，具体地肺部给予。对于通过鼻部给予，例如可以使用鼻喷雾装置或鼻输注。
因此，本发明的一个方面涉及用于由悬浮在液体中的颗粒组合物形成气溶胶或用于雾化这样的组合物的装置，该装置包含根据本发明的悬浮液组合物。装置优选地是选自计量剂量吸入器、雾化器、和鼻喷雾装置的吸入器。
同样对于在以上装置中使用的根据本发明的组合物来说，以上提供的关于优选实施方式的信息继续适用。因此，例如，用于这样的装置中的优选的悬浮液组合物包含：(i)纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，其中治疗活性剂是mRNA，并且mRNA以与阳离子聚合物或低聚物的复合物的形式，或以与阳离子脂质或阳离子类脂质的复合物的形式包含在颗粒制剂中，和(ii)作为防冻添加剂的1，2丙二醇。关于阳离子聚合物或低聚物的合适和优选类型，以及关于阳离子脂质和阳离子类脂质的优选类型，上述考虑继续适用。同样对于这些优选的组合物来说，颗粒制剂中的颗粒通常显示1至4000nm，更优选地2至2500nm，并且最优选地5至1000nm范围内的平均粒径。纳米颗粒制剂或微颗粒制剂中颗粒的直径的上限优选是20μm，更优选地10μm，并且最优选地5μm。
如上解释的，根据本发明的悬浮液组合物可以在制备后、以冷冻状态存储后、和通过解冻而回收(recovery)后方便地给予。然而，将理解的是，根据本发明的悬浮液组合物也可以在其制备之后直接给予，并且已发现用一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的存在可以对甚至在新鲜制备的组合物中的治疗剂的功效产生有益作用——特别是如果治疗剂是核酸，优选地RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA。
因此，本发明还提供了根据本发明的用于治疗或预防疾病的悬浮液组合物，优选地，其中组合物将被给予至呼吸道或通过呼吸道给予。更优选地，组合物将通过肺部给予或鼻部给予来给予。可以给予组合物的患者包括动物和人。
本发明还提供了治疗方法，包括优选地通过向呼吸道给予或通过呼吸道给予，更优选地通过肺部给予或鼻部给予，向患者给予本发明的悬浮液组合物，以使所述组合物中含有的治疗活性剂引起预防或防治作用。同样在此上下文中，术语“患者”包括动物和人。
同样对于根据本发明的用于治疗或预防疾病的组合物来说，以上提供的关于优选实施方式的信息继续适用。因此，例如，用于治疗或预防疾病的优选的悬浮液组合物包含：(i)纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，其中治疗活性剂是mRNA，并且mRNA以与阳离子聚合物或低聚物的复合物的形式，或以与阳离子脂质或阳离子类脂质的复合物的形式包含在颗粒制剂中，和(ii)作为防冻添加剂的1，2丙二醇。关于阳离子聚合物或低聚物的合适和优选类型，以及关于阳离子脂质和阳离子类脂质的优选类型，上述考虑继续适用。同样对于这些优选的组合物来说，颗粒制剂中的颗粒通常显示1至4000nm，更优选地2至2500nm，并且最优选地5至1000nm范围内的平均粒径。纳米颗粒制剂或微颗粒制剂中颗粒的直径的上限优选是20μm，更优选地10μm，并且最优选地5μm。
如上所述，可以直接在制备组合物之后完成给予，但是如果在已经将悬浮液组合物冷冻并且解冻至少一次后完成给予，则防冻添加剂的作用明显。
通过给予本发明的悬浮液组合物，可以治疗或预防疾病。术语“疾病”指代可以通过使用本发明的组合物来治疗、预防或接种的任何可想到的病理状况。所述疾病可以例如被遗传、获得、是传染性或非传染性的、年龄相关的、是心血管的、代谢的、肠的、瘤的(特别是癌症)或基因的。疾病可以例如基于生物体内的生理过程、分子过程、生化反应的不规律性，其反过来可以例如基于生物体的遗传设备、基于行为、社会或环境的因素，如暴露于化学物质或辐射。根据本发明的悬浮液组合物特别适用于治疗或预防肺部疾病。
如果与上述优选实施方式相符，治疗活性剂是RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA，则本发明的悬浮液组合物可以用于基于RNA的疗法。RNA分子，优选地mRNA分子包含编码蛋白质的序列，因此可以用于基于RNA的疗法，其中RNA，优选地mRNA编码具有治疗或预防作用的治疗或药学活性多肽或蛋白质。因此，在优选的实施方式中，本发明的悬浮液组合物可以用于基于RNA的疗法中，以治疗或预防下表中所列的疾病。因此，根据本发明的基于RNA的疗法可以用于治疗或预防下表中所列的疾病。
因此，在下表中描述的基因缺陷导致疾病的情况下，本发明的悬浮液组合物可以用于基于RNA的疗法中，该疾病然后可以通过使用本发明的RNA分子，优选地mRNA分子的转录物替代疗法/酶替代疗法来治疗或预防，其中RNA分子编码完整形式的蛋白质或其功能片段，从而补偿所公开的缺陷基因。
在其它实施方式中，本发明的悬浮液组合物可以用于根据本发明的基于RNA的疗法中，其中RNA，优选地mRNA编码具有治疗或预防作用的治疗或药学活性多肽、蛋白质或肽，其中所述多肽、蛋白质或肽选自下表概述的基因编码的组。
本发明的悬浮液组合物特别适用于基于RNA的疗法中，以治疗或预防肺部疾病。作为示例性疾病，可以提及下表中所列的α-1-抗胰蛋白酶、哮喘、囊性纤维化、表面活性剂代谢功能障碍或原发性纤毛运动障碍。
在其它示例性实施方式中，本发明的悬浮液组合物可以用于基于RNA的疗法中，以治疗或预防溶酶体病，如高歇病、法布里病、MPS I、MPS II(亨特综合征)、MPS VI和糖原贮积病，如，例如糖原贮积病I型(冯吉尔克氏综合征病)、II型(蓬珀氏病)、III型(柯里氏病)、IV型(安德森氏病)、V型(麦卡德尔氏病)、VI型(赫斯氏病)、VII型(Tauri氏病)、VII型、IX型、X型、XI型(Fanconi-Bickel综合征)、XI型、0型。转录物替代疗法/酶替代疗法有益地不影响潜在的遗传缺陷，但是增加患者缺陷的酶的浓度。作为实例，在蓬珀氏病中，转录物替代疗法/酶替代疗法替代缺乏的溶酶体酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)。
根据进一步的实例，根据本发明的基于RNA的疗法可以用于治疗癌症、心血管疾病、病毒感染、免疫机能障碍、自身免疫疾病、神经学障碍、遗传性代谢障碍或基因障碍或任何疾病，其中细胞中产生的蛋白质或蛋白质片段可具有本专利的有益作用。癌症的实例包括头颈癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、脑癌、子宫颈癌、肛门癌、结肠癌、结直肠癌、阑尾癌、眼癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、肝癌、皮肤癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、阴道癌、外阴癌、子宫内膜癌、心脏癌和肉瘤。心血管疾病的实例包括动脉粥样硬化、冠心病、肺心病和心肌病。免疫机能障碍和自身免疫疾病的实例包括但不限于风湿性疾病、多发性硬化和哮喘。病毒感染的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒以及乙型和丙型肝炎病毒的感染。神经学障碍的实例包括但不限于帕金森氏病、多发性硬化和痴呆。遗传性代谢障碍的实例包括但不限于高歇氏病和苯丙酮尿症。
表：人类基因和遗传障碍的非限制性实例
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制备方法
本发明的进一步方面涉及用于制备根据上述第一方面的组合物的方法，所述方法包括：
a)提供悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
b)向液相中添加选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，其中可以在提供悬浮在液相中的颗粒制剂之前、期间或之后完成防冻添加剂向液相中的添加。
关于提供包含纳米颗粒或微颗粒的治疗活性剂的颗粒制剂，本领域建立了技术。
关于提供核酸作为治疗剂(优选地RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA)的颗粒制剂的方法，可以再次参考上文讨论的文献，如A.C.Silva等人，Current DrugMetabolism，16，2015，3-16及其中提及的文献、J.C.Kasper等人，J.Contr.Rel.151(2011)，246-255、WO 2014/207231及其中提及的文献、WO 2016/097377及其中提及的文献、US2017/0267631、WO 2016/081029、WO 2011/071860、WO 2016/118697、US 8450298 B2和E.R.Lee等人，Human Gene Therapy 7：1701-1717，1996年9月10日。
可以利用带负电荷的核酸与带正电荷的低聚物、聚合物、脂质或类脂质的自组装，方便地形成含有与阳离子聚合物、低聚物、脂质或类脂质的复合物(如多聚物、脂质复合物、脂质体或LNP)形式的核酸，优选地RNA，更优选地单链RNA，并且最优选地mRNA作为活性剂的优选颗粒制剂。
自组装可以在将组分的溶液混合时发生。自组装可以通过以下来完成：例如通过利用吸移(pipetting)和摇动/涡旋进行手动混合，或者诸如例如由Hirota等人(Hirota等人，1999，Biotechniques，27，286-290)或Kasper等人(Kasper等人，2011，Eur J PharmBiopharm，77，182-185)描述的使用自动装置进行微观混合(micro-mixing)，或者通过诸如Xuan等人(Xuan等人，2010，Microfluidics andNanofluidics，9，1-16)综述的微观流体聚焦。为了将除核酸和低聚物、聚合物、脂质或类脂质之外的其它组分并入颗粒制剂的颗粒中，可以使用顺序混合。在这种情况下，可以在低聚物、聚合物、脂质或类脂质和核酸的自组装之后添加任意其它组分，或者可以在混合之前将任意其它组分添加至这些中的任一种中。
例如，可以通过将在水中含有核酸的溶液与在水中含有阳离子聚合物或低聚物的溶液进行混合来方便地实现多聚物的形成。
同样对于脂质体的形成来说，已建立的技术也是可用的。这些技术包括，例如脂质或类脂质组分(如脂质或类脂质膜)的再水合，然后是均质化技术，如，例如在需要时进行超声作用或挤出。可选方法是将溶于有机溶剂的脂质或类脂质组分输注到水或水溶液中。
作为可依赖于脂质纳米颗粒或脂质复合物的形成的示例性方法，可以提及溶剂置换法(solvent displacement method)。
可以通过已知的生物学方法提供依赖于病毒载体的颗粒。
作为制备颗粒制剂的进一步实例，可以通过乳化含有活性剂(任选地与基质形成剂组合)的溶液，然后固化该颗粒来形成包含治疗活性剂的颗粒。固化可以例如通过从其中包含基质形成材料的乳化油相中去除溶剂，或通过交联或聚合用于形成基质的组分来完成。用于形成脂质体制剂的材料和方法也是技术实践人员已知的。
防冻添加剂可以被方便地添加至纳米颗粒制剂或微颗粒制剂悬浮其中或待要在其中提供悬浮液的液相中。换言之，可以在提供悬浮在液相中的颗粒制剂之前、期间或之后，完成防冻添加剂向液相中的添加。
根据本发明的第二方面的固体组合物可以通过方法制备，所述方法包括：
通过包括以下的方法制备根据上述第一方面的组合物的第一步骤：
a)提供悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
b)向液相中添加选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，其中向液相中添加防冻添加剂可以在提供悬浮在液相中的颗粒制剂之前、期间或之后完成，
和冷冻第一步骤中获得的组合物的第二步骤。
关于第一步骤，将理解的是，以上提供的关于悬浮液组合物的制备的信息等同地适用于固体组合物的制备。
作为第二步骤的冷冻步骤通常通过在合适的容器中使悬浮液组合物经受足够冷的温度(例如-10℃或更低，优选地-20℃或更低)来完成。作为冷却介质，例如，可以使用冷空气或冷液体。
附带地，如上解释的，根据本发明的第二方面的固体组合物是允许存储含有纳米颗粒或微颗粒的治疗活性剂的颗粒制剂的组合物。在此程度上，将理解的是，通过解冻固体组合物，也可以从根据本发明的第二方面的固体组合物回收根据本发明的第一方面的组合物。
因此，作为进一步的方面，本发明还提供了用于制备根据上述第一方面的组合物的方法，所述方法包括：
通过包括以下的方法制备根据上述第一方面的组合物的第一步骤：
a)提供悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
b)向液相中添加选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，其中向液相中添加防冻添加剂可以在提供悬浮在液相中的颗粒制剂之前、期间或之后完成，
冷冻第一步骤中获得的组合物的第二步骤，
和解冻第二步骤中获得的冷冻组合物的第三步骤。
方法和用途
此外，本发明提供了保存治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的方法，所述方法包括：提供根据本发明的上述第一方面的组合物，即包含以下的组合物：
(i)悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
(ii)选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，
并且冷冻组合物。
同样关于本发明的此方面，以上提供的关于治疗剂的、其颗粒制剂的、防冻添加剂的、关于液相、关于可用于提供组合物的方法、和关于冷冻步骤的合适和优选实施方式的信息继续适用。
如技术读者将理解的是，术语“保存”在此上下文中表示治疗活性剂的颗粒制剂的相关治疗特性在其存储期间被保留至实质的程度(substantial degree)，优选地被完全保留。保存颗粒制剂的方法通常还涉及冷冻组合物的存储，同时在期望的时间段内，例如，在数小时、数天、数周、数月或甚至数年内将其保持在冷冻状态中。
又一方面，本发明提供了选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的化合物作为防冻添加剂用于包含治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的组合物的用途。
同样关于本发明的此方面，以上提供的关于治疗剂的、其颗粒制剂的、以及防冻添加剂的合适和优选实施方式的信息继续适用。
如将理解的，作为防冻添加剂的用途涉及在组合物中将选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的化合物与治疗活性剂的颗粒制剂组合。其中组合了这两种组分的组合物是根据本发明的第一方面的组合物。该应用进一步涉及使组合物冷冻，使得选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的化合物可以用作冷冻保护剂，即，其可以保护颗粒组合物的颗粒，并且可以尤其确保该颗粒向呼吸道施用或通过呼吸道施用的功能性得以维持至有效的程度(significant degree)，优选地得以完全维持。
在以下项目中提供了本发明的重要方面的概述。将理解的是，这些项目形成本发明的一般性公开内容的部分，使得在说明书的前面部分中提供的例如关于进一步优选的实施方式或任选的特征的信息也适用于以下项目。
1.组合物，包含：
(i)悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
(ii)选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂。
2.根据项目1的组合物，其中治疗活性剂是核酸。
3.根据项目2的组合物，其中核酸是RNA。
4.根据项目3的组合物，其中RNA是mRNA。
5.根据项目1至4中任一项的组合物，其中纳米颗粒制剂或微颗粒制剂显示1至4000nm，更优选地2至2500nm，并且最优选地5至1000nm范围内的平均粒径。
6.根据项目1至5中任一项的组合物，其中纳米颗粒制剂或微颗粒制剂中的颗粒的最大粒径是20μm，更优选地10μm，并且最优选地5μm。
7.根据项目1至6中任一项的组合物，其中纳米颗粒制剂或微颗粒制剂具有以治疗活性剂的重量比颗粒制剂中颗粒的总重量来表示的0.1至95％，更优选地0.5至90％，最优选地1至80％范围内的活性载荷。
8.根据项目2至7中任一项的组合物，其中治疗活性剂是核酸，并且纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的颗粒包含核酸和阳离子赋形剂。
9.根据项目8的组合物，其中颗粒制剂的颗粒包含由核酸和作为阳离子赋形剂的阳离子低聚物或阳离子聚合物所形成的复合物形式的核酸。
10.根据项目9的组合物，其中复合物由核酸和阳离子低聚物或聚合物形成，阳离子低聚物或聚合物包含多个其中含有氨基的单元。
11.根据项目10的组合物，其中阳离子低聚物或聚合物中胺氮原子N的数量与核酸中磷酸根基团P的数量的N/P比在1至100，更优选地2至80，并且最优选地3至60的范围内。
12.根据项目10或11的组合物，其中阳离子聚合物包含独立地选自以下(1)、(2)、(3)和(4)的多个单元：
-CH2-CH2-NH- (1)
-CH2-CH2-CH2-NH- (3)
并且其中重复单元(1)、(2)、(3)和/或(4)的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供聚合物的阳离子电荷。
13.根据项目8的组合物，其中颗粒制剂的颗粒包含由核酸和作为阳离子赋形剂的阳离子脂质或阳离子类脂质所形成的复合物形式的核酸。
14.根据项目13的组合物，其中颗粒制剂的颗粒包含脂质复合物、脂质体、或脂质纳米颗粒。
15.项目13或14的组合物，其中颗粒制剂的颗粒进一步包含选自固醇类、中性脂质类、鞘脂类和聚乙二醇化脂质类的一种或多种辅助脂质。
16.根据项目13至15中任一项的组合物，其中脂质和类脂质的总重量与核酸的总重量的比在0.1至200，更优选地0.2至150，最优选地0.5至100的范围内。
17.根据项目1至16中任一项的组合物，其中防冻添加剂包含至少仲羟基。
18.根据项目17的组合物，其中防冻添加剂选自1，2-丙二醇、2-丙醇、1，2-丁二醇、和1，3-丁二醇。
19.根据项目17的组合物，其中防冻添加剂是1，2-丙二醇。
20.根据项目1至19中任一项的组合物，其中防冻添加剂以基于液相的体积0.5至50％w/v，更优选地1至40％w/v，并且最优选地1至30％w/v的浓度包含。
21.根据项目1至20中任一项的组合物，其包含一定量的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的颗粒，以提供包含在颗粒制剂中的浓度为基于组合物的总体积0.01至50mg/ml，更优选地0.02至30mg/ml的治疗活性剂。
22.根据项目1至21中任一项的组合物，其中水和防冻添加剂是液相中仅含有的溶剂。
23.固体组合物，包含：
(i)治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
(ii)选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，
所述固体组合物能够通过冷冻根据项目1至22中任一项的组合物获得。
24.用于制备根据项目1至22中任一项的组合物的方法，所述方法包括：
a)提供悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
b)向液相中添加选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，其中向液相中添加防冻添加剂可以在提供悬浮在液相中的颗粒制剂之前、期间或之后完成。
25.用于制备根据项目23的固体组合物的方法，所述方法包括：
通过包括以下的方法制备根据上述第一方面的组合物的第一步骤：
a)提供悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
b)向液相中添加选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，其中向液相中添加防冻添加剂可以在提供悬浮在液相中的颗粒制剂之前、期间或之后完成，
和冷冻第一步骤中获得的组合物的第二步骤。
26.保存治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的方法，所述方法包括提供根据项目1至22中任一项的悬浮液组合物，并冷冻所述组合物。
27.选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的化合物作为防冻添加剂用于包含治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的组合物的用途。
28.用于由悬浮在液体中的颗粒组合物形成气溶胶或用于雾化这样的组合物的装置，所述装置包含根据项目1-22中任一项的组合物。
29.根据项目28的装置，其中装置是选自计量剂量吸入器、雾化器、和鼻喷雾装置的吸入器。
30.治疗方法，包括优选地通过向呼吸道给予或通过呼吸道给予，更优选地通过肺部给予或鼻部给予，向患者给予根据项目1至22中任一项的组合物。
31.用于治疗或预防疾病的根据项目1-22中任一项的组合物，其中组合物将被给予至呼吸道或通过呼吸道给予。
32.根据项目31使用的组合物，其中组合物将通过肺部给予或鼻部给予来给予。
33.根据项目31或32的组合物，其中治疗活性剂是RNA，更优选地mRNA，用于通过基于RNA的疗法治疗或预防疾病。
34.根据项目31至33中任一项使用的组合物，其中要治疗或要预防的疾病是肺部疾病。
实施例
缩写
缩写 描述
RT 室温
mRNA 信使核糖核酸
brPEI 支链聚乙烯亚胺
FLuc 萤火虫萤光素酶
w/o 没有
cmRNA 化学修饰的核糖核酸
FLuc 萤火虫萤光素酶
PG 1，2-丙二醇、丙二醇
N/P 载体胺氮与mRNA磷酸根的比
实施例I：筛选不同类别的分子作为用于纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的防冻添加剂。
复合物形成
形成终浓度为0.25mg/mL的支链聚(乙烯亚胺)(brPEI)和编码萤光素酶的mRNA的复合物。在标准混合过程中，用水将mRNA稀释至0.5mg/mL的浓度。以在水中0.65mg/mL的浓度制备相同体积的brPEI溶液。通过将mRNA溶液注入brPEI溶液中，然后使用电子移液器(Mettler-Toledo，E4 LTS 1000μL)进行混合来形成纳米颗粒或微颗粒。混合后，使用前在冰上将复合物孵育20min。
尺寸测量
为了测定粒径，将100μL颗粒的悬浮液填充至比色皿(Brand，UV-cuvette Micro)中，并使用Malvern ZetaSizer Nano ZS(Malvem仪器)进行测量，得到流体动力学直径和平均流体动力学直径(z-平均值)，以nm为单位。作为悬浮介质，使用水或含防冻剂的水，如所示的。
冷冻-解冻挑战
用2X(20/10/2％)添加剂溶液(表1)以1∶2稀释制剂，并分成两次重复(duplicates)。在添加剂的存在下，将各个所得制剂的一个样品用于尺寸测定(MalvemZetasizer NanoZS)。其余样品在-20℃下冷冻16h，在室温下解冻，并在溶液达到室温之前立即存储在冰上。然后将各个解冻的制剂用于尺寸测定(Malvern Zetasizer NanoZS)，并根据以下等式比较冷冻之前和解冻之后制剂的％尺寸偏差，其中dh表示z-平均粒径：
转染和萤光素酶活性测定
A549细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素(P/S)的MEM培养基中于37℃，5％CO2下培养。转染前24h，将细胞以20000个细胞/孔接种在96孔板中的100μL培养基中。在转染当天，用不含FBS和青霉素/链霉素的MEM替换培养基，然后以60μL/孔添加复合的mRNA，两次重复。转染后4h，用含10％FBS和1％P/S的MEM替换培养基。将板在37℃和5％CO2下孵育24h。孵育24h后，移除培养基，并在100μL裂解缓冲液(25mM Tris HCI，0.1％TritonX-100，pH 7.8)中将细胞裂解，并在平板震动器上以600 rpm孵育30min。接下来，将每个孔中的50μL细胞裂解液转移至96孔板中，并在添加萤光素缓冲液(0.47mM D-萤光素、0.27mM辅酶A、3.33mM DTT、0.53mMATP、1.1mM MgCO3、2.7mM MgSO4、20mM曲辛(Tricine)、0.1mM EDTA)后，在Tecan Infinite 200 PRO上通过生物发光强度来测量报告萤火虫萤光素酶的活性。
体内实验的样品制备
如“复合物形成”和“冷冻-解冻挑战”中描述的制备复合物，进行以下修改。以0.5mg/mL的mRNA浓度制备4mL的复合物溶液，并用双倍浓缩的添加剂溶液以1∶2稀释，以使最终的mRNA浓度为0.25mg/mL(8mL)。保持样品冷冻，直至对动物雾化。
雾化
将动物置于Buxco小型质量给药室(Buxco Small Size Mass Dosing Chamber)(Data Sciences International，德国)中。在室温下将制剂解冻，在达到室温之前将其置于碎冰上，然后使用Aeroneb Solo雾化器(Aeroneb，德国)以3L/min的空气循环速率和100％的工作循环(duty cycle)进行雾化。
移植肺中的生物发光测量
施用后24h，通过腹膜内注射芬太尼/咪达唑仑/美托咪定(0.05/5.0/0.5mg/kgBW)使动物处于完全麻醉状态。通过嗅探途径(将溶液直接施用至鼻孔后吸入溶液)施用50μL D-萤光素(30mg/mL溶于磷酸盐缓冲盐水中，pH 7)，并通过腹膜内注射全身施用100μL D-萤光素。给予萤光素后10min，通过颈椎脱位(cervical dislocation)使小鼠安乐死。通过右心灌注PBS后，肺被移植。使用Xenogen IVIS Luminar XR(Caliper LifeSciences)，在合并(binning)设置为8且曝光时间为5min的情况下测量生物发光。使用Living Image软件4.4(Xenogen)对生物发光进行定量和分析。在图片过饱和(检测到表达超出线性范围)的情况下，将曝光时间减少到1min。生物发光被测量为总通量/器官(以光子/秒为单位)。仅使用无过饱和的图片进行分析。将肺速冻并存储在-80℃下。
均质化肺中的萤光素酶活性
称重解冻的器官，并使用FastPrep°-24均质器(MP Biomedicals)在裂解缓冲液中使一半的移植肺均质化。通过Lumat LB 9507光度计(Berthold Technologies)自动地将100μL萤光素缓冲液添加至75μL离心的裂解液中。以RLU/s测量萤光素酶活性，并转换成RLU/器官。
结果
显示了不同类型的添加剂(包括在本领域中被确立为防冻添加剂的化合物)在一个冷冻-解冻周期后防止聚合物/mRNA制剂的颗粒聚集的能力。使用1，2-丙二醇的组合物是根据本发明的组合物，其它组合物是参考组合物。在冷冻之前评估流体动力学粒径。在-20℃下16 h后，将制剂解冻，并再次测量流体动力学粒径。表lb中显示了冷冻之前和解冻之后颗粒之间的尺寸差异。大的数字表示尺寸大幅增加，因此聚集。
表1a：用ZetaSizer Nano ZS(Malvern)测量的新鲜制备的复合物在水中的标准尺寸
载体 流体动力学直径(z-平均值[nm])
brPEI，N/P 10 122.6
表1b：与不同类型和浓度的添加剂的新鲜复合物相比，一个冷冻-解冻周期后的粒度偏差。
含有所示％(w/v)添加剂的0.25mg/mL mRNA浓度下的brPEI 25kDa/mRNA N/P 10制剂的冷冻-解冻挑战(-20℃)。由于在水中的溶解度有限，在降低的浓度下测试α乳糖一水合物和D-甘露醇。在降低的浓度下测试氯化钠以保持在等渗浓度范围内。n＝1。
*参考成分
表2：以上实验的mRNA/聚合物/1，2-丙二醇重量比。
大于100％的尺寸增加被定义为聚集过程。一个冷冻-解冻周期后，选择导致尺寸差异在此阈值以下的添加剂进行对A549细胞的转染效率的体外测试(图1和表3)。糖类未进行体外测试。
图1显示了含有添加剂的brPEI/FLuc mRNA N/P 10制剂对A549细胞的转染效率。
表3：图1的列表数据。
*参考成分
从列表数据中可以看出，所有添加剂均保持了转染效率，并因此被选择通过雾化对小鼠进行测试。将含有2mg编码萤火虫萤光素酶的mRNA的8mL复合物溶液对一组BALB/c小鼠(n＝3)进行雾化。处理后24h，对小鼠实施安乐死。通过对切除的器官中(通过Ivis)以及器官匀浆中的萤光素酶活性定量来分析mRNA递送的效率(参见图2和表4)。表5中报道了所采用的mRNA/聚合物/1，2-丙二醇的重量比。
图2显示了在一个冷冻-解冻周期后通过雾化施用的brPEI/mRNA制剂的体内转染效率。
在所示添加剂的存在下，在一个冷冻-解冻周期后，将N/P 10且0.25mg/mL下与brPEI 25kDa复合的2mg FLuc mRNA对小鼠雾化。作为参考，一组用新鲜制备的不加入添加剂的颗粒来处理。含有10％PEG4k或PEG10k的制剂的高粘度防止Aeroneb雾化器的雾化。n＝3。
表4：包括生物发光数据的图2的列表数据。
*参考成分
表5：以上实验的mRNA/聚合物/1，2-丙二醇重量比。
讨论和结论
与新鲜配制的brPEI/mRNA纳米颗粒或微颗粒相比，在一个冷冻-解冻周期后，在体内雾化之后，1，2-丙二醇(丙二醇，PG)被确定为防止颗粒聚集并维持制剂的转染效率的添加剂。
实施例Ⅱ：结构上与1，2-丙二醇相关的不同添加剂作为用于纳米颗粒或微颗粒的冷冻保护剂的比较。
复合物形成
形成终浓度为0.25mg/mL的支链聚(乙烯亚胺)(brPEI)和编码萤光素酶的mRNA的复合物。在标准混合过程中，用水将mRNA稀释至0.5mg/mL的浓度。以在水中0.65mg/mL的浓度制备相同体积的brPEI溶液。通过将mRNA溶液注入brPEI溶液中，然后使用电子移液器(Mettler-Toledo，E4 LTS 1000μL)进行混合来形成纳米颗粒。混合后，使用前在冰上将复合物孵育20min。
尺寸测量
为了测定粒径，将100μL颗粒的悬浮液填充至比色皿(Brand，UV-cuvette Micro)中，并使用Malvern ZetaSizer Nano ZS(Malvern仪器)进行测量，得到流体动力学直径和平均流体动力学直径(z-平均值)，以nm为单位。作为悬浮介质，使用水或含有防冻添加剂的水，如所示的。
冷冻-解冻挑战
用2X(20/10/2％)添加剂溶液(表6)以1∶2稀释制剂，并分成两次重复。由于一些添加剂的溶解度受到限制，因此在降低的浓度下测试以下物质(参见表6)：2-甲基-1，4-丁二醇、季戊四醇。在添加剂的存在下，将各个所得制剂的一个样品用于尺寸测定(MalvernZetasizer NanoZS)。其余样品在-20℃下冷冻16h，在室温下解冻，并在溶液达到室温之前立即存储在冰上。然后将各个解冻的制剂的一个样品用于尺寸测定(Malvern ZetasizerNanoZS)，并根据以下等式比较冷冻之前和解冻之后制剂的％尺寸偏差，其中dh表示z-平均粒径：
体内实验的样品制备
如“复合物形成”和“冷冻挑战”中描述的制备复合物，进行以下修饰。以0.5mg/mL浓度制备4mL的复合物溶液，并用双倍浓缩的添加剂溶液以1∶2稀释，以使最终mRNA浓度为0.25mg/mL(8mL)。保持样品冷冻，直至对动物雾化。
雾化
将动物置于Buxco小型质量给药室(Data Sciences International，德国)中。在室温下将制剂解冻，在达到室温之前将其置于碎冰上，然后使用Aeroneb Solo雾化器(Aeroneb，德国)以3L/min的空气循环速率和100％的工作循环进行雾化。
移植肺中的生物发光测量
施用后24h，通过腹膜内注射芬太尼/咪达唑仑/美托咪定(0.05/5.0/0.5mg/kgBW)使动物处于完全麻醉状态。通过嗅探途径(将溶液直接施用至鼻孔后吸入溶液)施用50μL D-萤光素(30mg/mL溶于磷酸盐缓冲盐水中，pH 7)，并通过腹膜内注射全身施用100μL D-萤光素。给予萤光素后10min，通过颈椎脱位使小鼠安乐死。通过右心灌注PBS后，肺被移植。使用Xenogen IVIS Luminar XR(Caliper LifeSciences)，在合并设置为8且曝光时间为5min的情况下测量生物发光。使用Living Image软件4.4(Xenogen)对生物发光进行定量和分析。在图片过饱和(检测到表达超出线性范围)的情况下，将曝光时间减少到1min。生物发光被测量为总通量/器官(以光子/秒为单位)。仅使用无过饱和的图片进行分析。将肺速冻并存储在-80℃下。
均质化肺中的萤光素酶活性
称重解冻的器官，并使用FastPrep°-24均质器(MP Biomedicals)在裂解缓冲液中使一半的移植肺均质化。通过Lumat LB 9507光度计(Berthold Technologies)自动地将100μL萤光素缓冲液添加至75μL离心的裂解液中。以RLU/s测量萤光素酶活性，并转换成RLU/器官。
结果
实施例I显示1，2-丙二醇防止冷冻期间的纳米颗粒或微颗粒聚集，同时维持体内活性，而甘油(具有化学相似性的分子)防止冷冻期间的聚集，而不维持体内活性。此测试的结果显示，结构上与1，2-丙二醇相关的C3-C5链烷醇和链烷二醇能够在一个冷冻-解冻挑战期间防止聚集，并能够在后续雾化后维持转染效率。形成复合物并与添加剂溶液混合(在水中)，产生表6中列出的最终添加剂浓度。
在-20℃冷冻之前测量颗粒的流体动力学直径。16h后，将所有制剂解冻并再次测量粒度。表6b中显示了冷冻之前相对解冻之后的％尺寸偏差。大的数字表示尺寸大幅增加，因此聚集。
表6a：新鲜制备的复合物在水中的标准尺寸。用ZetaSizer Nano ZS(Malvern)进行三次测量
表6b：测试的添加剂浓度的冷冻之前相对解冻之后的％尺寸偏差。
2-甲基-1，4-丁二醇和季戊四醇由于在水中溶解度有限而以降低的浓度进行测试。n＝1。
/>
*参考实例
大于100％的粒度变化被定义为聚集过程。选择导致％尺寸偏差在此阈值以下的添加剂，以通过对小鼠雾化来进行测试(图3和表7)。
图3显示了一个冷冻-解冻周期后，brPEI/mRNA制剂的体内转染效率。
在所示添加剂的存在下，在一个冷冻-解冻周期后，将N/P 10且0.25mg/mL下与brPEI25kDa复合的2mg/8mL FLuc mRNA对小鼠雾化。处理后24h，麻醉小鼠，移植肺，均质化并测量萤光素酶活性。n＝3。
表7：包括生物发光数据的图3的列表数据。
*参考实例
讨论和结论
在此研究中，可以证明结构上与1，2-丙二醇相关的链烷醇/链烷二醇在一个冷冻-解冻周期后，对鼠肺雾化后具有维持复合物转染效率的能力。首先在冷冻之前和在一个冷冻-解冻周期之后分析生物物理性质，因为颗粒的聚集或破坏导致非功能性制剂。实施例I中的发现可以被复制为1，2-丙二醇和甘油保存粒度。如先前研究已证明的，粒度的保存在对小鼠雾化后不自动产生功能性颗粒。
实施例III：以变化的mRNA浓度和/或变化的N/P比来冷冻制剂
复合物形成
形成浓度为0.25mg/mL的编码萤光素酶的mRNA与支链(聚乙烯亚胺)(brPEI)、P7(直链(聚乙烯亚胺-共-丙烯亚胺)，MW：20kDa)或P12直链(聚乙烯亚胺-共-丙烯亚胺)，MW：24kDa)的复合物。在标准混合过程中，在水中将mRNA稀释至0.5mg/mL的浓度。以在水中0.65mg/mL的浓度制备相同体积的聚合物溶液。为了配制纳米颗粒，将mRNA溶液注入brPEI溶液中，然后使用电子移液器(Mettler-Toledo，E4 LTS 1000μL)进行混合。混合后，在使用前将复合物在冰上孵育20min。
制剂的浓度
使用前，用15mL水(500×g)洗涤Ultra-15离心过滤单元的膜(MerckMillipore，PLHK Ultracel-PL膜，100kDa截留分子量)。然后，将多聚物制剂转移至过滤单元，并在500×g和4℃下离心。在5min的间隔期内，检查流体水平以避免过度浓缩，并用1mL移液器将溶液充分混合。在每个间隔期，通过分光光度评估核酸浓度(A260)来监测样品浓度。重复此过程，直至达到期望的浓度。
尺寸测量
为了测定粒径，将200μL颗粒的悬浮液填充至比色皿(Brand，UV-cuvette Micro)中，并使用Malvem ZetaSizer Nano ZS(Malvern仪器)进行测量，得出流体动力学直径和平均流体动力学直径(z-平均值)，以nm为单位。作为悬浮介质，使用水或含有防冻添加剂的水，如所示的。
冷冻-解冻挑战
在初步测定多聚物尺寸(Malvern Zetasizer NanoZS)后，将制剂分配到96孔低剖面PCR板(透明，无RNA酶和DNA酶)，并用2X(20/10/2％)添加剂溶液以1∶2稀释(表1)。各个所得制剂的一个样品用于尺寸测定(Malvem Zetasizer NanoZS)。其余样品在-20℃下冷冻～16h，在室温下解冻，并在溶液达到室温之前立即存储在冰上。然后将各个解冻的制剂的一个样品用于尺寸测定(Malvern Zetasizer NanoZS)，并根据以下等式比较冷冻之前和解冻之后制剂的％尺寸偏差，其中dh表示z-平均粒径：
结果
在此实验中可以显示要求保护的一类所确定的分子在增加的mRNA浓度和/或降低的N/P比下充当纳米颗粒或微颗粒的冷冻保护剂的能力。为此目的，选择1，2-丙二醇作为代表性添加剂。表8显示了在不同mRNA浓度(0.25、1.1或2.3mg/mL)和不同N/P比(N/P 4或10)下冷冻的复合物在冷冻之前相对在解冻之后的％粒度偏差。表9中报道了所采用的mRNA/聚合物/1，2-丙二醇重量比。
表8：冷冻之前相对解冻之后的％尺寸偏差。n＝3。
数据显示，所有测试条件均导致使用添加剂的聚集的避免。
表9：以上实验的mRNA/聚合物/1，2-丙二醇重量比。
/>
讨论和结论
实施例III证明，在冷冻期间，可以维持粒度独立于聚合物与mRNA的比以及mRNA浓度。
实施例IV：所确定的用于不同聚阳离子的添加剂的防冻特性(混合前添加)
复合物形成
使用三种不同的聚合物结构形成阳离子聚合物和编码萤光素酶的mRNA的复合物：支链聚(乙烯亚胺)(brPEI，25kDa)、直链聚(乙烯亚胺-丙烯亚胺)(P7，20kDa)或直链聚(乙烯亚胺-丙烯亚胺)(P12，24kDa)。
P7和P12是具有以下结构的直链聚(乙烯亚胺-丙烯亚胺)聚合物：
合成：
将干燥的2-乙基-2-唑啉和干燥的2-乙基-2-/>嗪的混合物与三氟甲磺酸甲酯在乙腈中混合。在氮气气氛下，在130℃下进行聚合30h。通过添加水停止聚合，并在130℃下孵育3h。通过在冷的二乙醚中进行三个沉淀步骤获得聚合物。为了水解，将聚合物溶于浓缩盐酸中并在130℃下孵育30h。用NaOH将聚合物溶液的pH调节至pH 10。纯化是通过对去离子水进行透析，然后冻干来进行的。通过将2-乙基-2-/>唑啉与2-乙基-2-/>嗪的比进行修改，可以修改聚合物内所得的乙烯亚胺(C2)与丙烯亚胺(C3)的比。通过使用的三氟甲磺酸甲酯的量，可以控制分子量。
所得聚合物具有以下性质：
以三种不同的N/P比4、6和10来混合复合物，终浓度为0.25mg/mL。在标准混合过程中，在水中将mRNA稀释至0.5mg/mL的浓度。在含有20％或10％(w/v)的1，2-丙二醇的水中制备相同体积的聚合物溶液(浓度参见表10)。通过将mRNA溶液注入聚合物溶液中，然后使用电子移液器(Mettler-Toledo，E4 LTS 1000μL)混合来形成纳米颗粒。混合后，在使用前将复合物在冰上孵育20min。
表10：用于制备不同N/P比的复合物的聚合物溶液的浓度
尺寸测量
为了测定粒径，将100μL颗粒的悬浮液填充至比色皿(Brand，UV-cuvette Micro)中，并使用Malvem ZetaSizer Nano ZS(Malvern仪器)进行测量，得到流体动力学直径和平均流体动力学直径(z-平均值)，以nm为单位。作为悬浮介质，使用水或含有防冻添加剂的水，如所示的。
冷冻-解冻挑战
各个所得制剂的一个样品用于尺寸测定(Malvern Zetasizer NanoZS)。其余样品在-20℃下冷冻16h，在室温下解冻并在溶液达到室温之前立即存储在冰上。然后将各个解冻的制剂的一个样品用于尺寸测定(Malvern Zetasizer NanoZS)，并根据以下等式关于冷冻之前和解冻之后制剂的％尺寸偏差进行比较：
体内实验的样品制备：
在8mL体积下，以N/P 4，如“复合物形成”和“冷冻-解冻挑战”中描述的制备复合物。保持样品冷冻，直至对动物雾化。
雾化
将动物置于Buxco小型质量给药室(Data Sciences International，德国)中。在室温下将制剂解冻，在达到室温之前将其置于碎冰上，然后使用Aeroneb Solo雾化器(Aeroneb，德国)以3L/min的空气循环速率和100％的工作循环进行雾化。
移植肺中的生物发光测量
施用后24h，通过腹膜内注射芬太尼/咪达唑仑/美托咪定(0.05/5.0/0.5mg/kgBW)使动物处于完全麻醉状态。通过嗅探途径(将溶液直接施用至鼻孔后吸入溶液)施用50μL D-萤光素(30mg/mL溶于磷酸盐缓冲盐水中，pH 7)，并通过腹膜内注射全身施用100μL D-萤光素。给予萤光素后10min，通过颈椎脱位使小鼠安乐死。通过右心灌注PBS后，肺被移植。使用Xenogen IVIS Luminar XR(Caliper LifeSciences)，在合并设置为8且曝光时间为5min的情况下测量生物发光。。使用Living Image软件4.4(Xenogen)对生物发光进行定量和分析。在图片过饱和(检测到表达超出线性范围)的情况下，将曝光时间减少到1min。生物发光被测量为总通量/器官(以光子/秒为单位)。仅使用无过饱和的图片进行分析。将肺速冻并存储在-80℃下。
均质化肺中的萤光素酶活性
称重器官，并使用FastPrep°-24均质器(MP Biomedicals)在裂解缓冲液中使一半的移植肺均质化。通过Lumat LB 9507光度计(Berthold Technologies)自动地将100μL萤光素缓冲液添加至75μL离心的裂解液中。以RLU/s测量萤光素酶活性，并转换成RLU/器官。
结果
实施例I-III证明了仅在用支链聚(乙烯亚胺)形成的颗粒的情况下，添加剂在防止聚集同时在不同条件下维持体内效率的有效性。为了证明这些添加剂的功能性独立于聚合物特性，对不同类型的聚合物进行测试。选择1，2-丙二醇作为示例性添加剂。在支化类型(支链或直链)、分子量(20kDa、24kDa和25kDa)、单体组成(聚(乙烯亚胺)和聚(乙烯亚胺-丙烯亚胺))以及N/P比(4、6和10)方面对聚合物进行改变。选择的聚合物已经证明在雾化后具有功能性。表10中以尺寸偏差显示了对于两种不同的添加剂浓度，在冷冻之前和解冻之后颗粒的％尺寸偏差的结果。还对N/P比(N/P4)进行了体内功能性测试。效率数据的总结在图4以及表13中给出。表12和表14b中报道了所采用的mRNA/聚合物/1，2-丙二醇重量比。
表11：含有5％或10％(w/v)1，2-丙二醇的具有不同聚合物的复合物制剂在冷冻之前相对在解冻之后的％尺寸偏差。
表12：以上实验的mRNA/聚合物/1，2-丙二醇重量比。
图4显示了浓缩的聚合物/mRNA制剂的体内转染效率。
在所示添加剂的存在下，在新鲜制备(0.25mg/mL mRNA；8mL/组)或一个冷冻-解冻周期(1mg/mL mRNA；2mL/组)后，将在N/P4下与brPEI 25kDa/P7/P12复合的2mg编码萤火虫萤光素酶的mRNA对小鼠雾化。处理后24h，麻醉小鼠并移植肺。在肺匀浆中测量萤光素酶活性。n＝3
表13：图4的列表数据。
表14a：用ZetaSizer(Malvern)测量的新鲜制备的复合物的标准尺寸
载体 流体动力学直径(z-平均值[nm]) PdI
brPEI，N/P 4 158.7 0.180
P7，N/P 4 161.1 0.171
P12，N/P 4 163.5 0.177
表14b：以上实验的mRNA/聚合物/1，2-丙二醇重量比。
讨论和结论
如此实验中所示，1，2-丙二醇的稳定作用独立于聚合物支化类型、分子量、单体组成以及N/P比。所有这些参数的改变在一个冷冻解冻挑战后产生完好的(intact)复合物。另外，这些复合物在肺部施用后的功能性可以在体内实验中证明。检测到新鲜复合物在报告蛋白的表达水平方面与在5％或10％1，2-丙二醇中冷冻的相同复合物相比没有显著差异。支链聚(乙烯亚胺)相对聚(乙烯亚胺-丙烯亚胺)的效率的总体差异与WO2013182683A1的陈述完全一致。另外，此实验证实了添加剂加入的时间点对其功能性没有影响。尽管实验I和II中在复合后将添加剂加入至纳米颗粒中，但在此实验中，在将1，2-丙二醇与mRNA溶液混合之前，将其添加至聚合物溶液中。
实施例V：冷冻复合物的稳定性
复合物形成
形成浓度为0.25mg/ml的支链(聚乙烯亚胺)(brPEI)和编码萤光素酶的mRNA的复合物。在标准混合过程中，在水中将mRNA稀释至0.5mg/mL的浓度。以在水或10％1，2-丙二醇中0.65mg/mL的浓度制备相同体积的brPEI溶液。为了配制纳米颗粒，将mRNA溶液注入brPEI溶液中，然后使用电子移液器(Mettler-Toledo，E4 LTS 1000μL)进行混合。混合后，在使用前将复合物在冰上孵育20min。
冷冻-解冻挑战
在初步测定多聚物尺寸(Malvern Zetasizer NanoZS)后，将各个制剂的100μL三次重复在-20℃下冷冻存储指示的时间，在室温下解冻，并在溶液达到室温之前立即存储在冰上。然后将各个解冻的制剂的一个样品用于尺寸测定(Malvern Zetasizer NanoZS)，并根据以下等式关于冷冻之前和解冻之后制剂的％尺寸偏差进行比较，其中dh表示z-平均粒径：
mRNA完整性测量
在水中将纳米颗粒制剂稀释至0.2mg/mL mRNA。用3μL 40mg/mL肝素、2μL 2％v/vTriton X-100和10μL甲酰胺处理5μL此溶液。在70℃下将混合物孵育15min以完全破坏颗粒，然后将其保持在碎冰上。然后通过毛细管凝胶电泳(Advanced Analytical FragmentAnalyzer，PROSize 2.0)进行核酸片段分析。将来自处理过的制剂的全长mRNA(mRNA处理)的信号与用于作为参考而配制的同一批次的新鲜，未复合的mRNA(mRNA参考)的信号进行比较，并根据下式表示为mRNA完整性[％]：
结果
基于mRNA的纳米颗粒或微颗粒的关键参数是复合物中mRNA的稳定性。如表15中所示，将复合物存储在25℃下导致复合的mRNA快速降解。在此实验中，测试使复合物冷冻的能力对复合的RNA的稳定性的影响。在第一组中，用RNA形成复合物，并在添加作为表现良好的添加剂群组的示例性候选者的1，2-丙二醇之后冷冻。在冷冻之前和在-20℃下存储一周后，测试复合物中mRNA的完整性(全长mRNA的量)。测量新鲜，未复合的mRNA，并将其设置为100％作为参考。结果总结在表16中。
在第二组中，在将复合物于-20℃下存储8周后，重复实验。结果描述于表17中。
表15：室温下复合物中mRNA的完整性。
表16：冷冻复合物(5％1，2-丙二醇，-20℃，1周)中的mRNA相对新鲜制备的复合物中的mRNA或新鲜mRNA的完整性。
样品 mRNA完整性[％]
新鲜mRNA 100
新鲜多聚物 98
1周的FT多聚物(三次重复) 94.7±0.7
表17：冷冻复合物(5％1，2-丙二醇，-20℃，8周)中的mRNA相对新鲜mRNA的完整性。
样品 mRNA完整性[％]
新鲜mRNA 100
8周的FT多聚物(三次重复) 98.9±7.5
结论和讨论
所描述的实验显示冷冻纳米颗粒或微颗粒以长期存储的能力具有强大的益处。虽然在室温下存储的复合物在数小时内导致mRNA的降解过程，但以冷冻状态存储的复合物导致mRNA完全保存至少8周。
实施例VI：1，2-丙二醇作为脂质基制剂的冷冻保护剂
复合物形成
将脂质组分(阳离子类脂质、辅助脂质胆固醇和PEG-脂质)溶解并混合在异丙醇中，然后以1∶4的体积比注入mRNA在柠檬酸盐缓冲液(10mM柠檬酸，150mM NaCl，pH 4.5)中的溶液中，导致mRNA浓度为0.2mg/mL。在室温下将复合物孵育20min。孵育后，使溶液对水透析16h。透析后的mRNA浓度为0.13mg/mL。为了达到0.2或0.5mg/mL的mRNA浓度，在SpeedVac(Concentrator Plus，Eppendorf)中于45℃下浓缩颗粒。
尺寸测量
为了测定粒径，将200μL颗粒的悬浮液填充至比色皿(Brand，UV-cuvette Micro)中，并使用Malvem ZetaSizer Nano ZS(Malvern仪器)进行测量，得到流体动力学直径和平均流体动力学直径(z-平均值)，以nm为单位。作为悬浮介质，使用水或含有防冻添加剂的水，如所示的。
冷冻-解冻挑战
用2X(20或10％)1，2-丙二醇溶液以1∶2稀释制剂，并分成不同的样品。在添加剂的存在下，将各个所得制剂的一个样品用于尺寸测定(Malvem Zetasizer NanoZS)。其余样品在-20℃下冷冻16h，在室温下解冻，并在溶液达到室温之前立即存储在冰上。然后将各个解冻的制剂的一个样品用于尺寸测定(Malvern Zetasizer NanoZS)，并根据以下等式关于冷冻之前和解冻之后制剂的％尺寸偏差进行比较，其中dh表示z-平均粒径：
气管内喷雾施用
在异氟烷(Isofluran)吸入麻醉下，使用MicroSprayer 1A装置(PennCentury，USA)气管内施用50μL复合物溶液。
移植肺中的生物发光测量
施用后24h，通过腹膜内注射芬太尼/咪达唑仑/美托咪定(0.05/5.0/0.5mg/kgBW)使动物处于完全麻醉状态。通过嗅探途径(将溶液直接施用至鼻孔后吸入溶液)施用50μL D-萤光素(30mg/mL溶于磷酸盐缓冲盐水中，pH 7)，并通过腹膜内注射全身施用100μL D-萤光素。给予萤光素后10min，通过颈椎脱位使小鼠安乐死。通过右心灌注PBS后，肺被移植。使用Xenogen IVIS Luminar XR(Caliper LifeSciences)，在合并设置为8且曝光时间为5min的情况下测量生物发光。使用Living Image软件4.4(Xenogen)对生物发光进行定量和分析。在图片过饱和(检测到表达超出线性范围)的情况下，将曝光时间减少到1min。生物发光被测量为总通量/器官(以光子/秒为单位)。仅使用无过饱和的图片进行分析。将肺速冻并存储在-80℃下。
均质化肺中的萤光素酶活性
称重解冻的器官，并使用FastPrep°-24均质器(MP Biomedicals)在裂解缓冲液中使一半的移植肺均质化。通过Lumat LB 9507光度计(Berthold Technologies)自动地将100μL萤光素缓冲液添加至75μL离心的裂解液中。以RLU/s测量萤光素酶活性，并转换成RLU/器官。
结果
此实施例证明了本文限定的添加剂作为脂质基复合物的冷冻保护剂的适合性。在第一步中，在存在或不存在添加剂的情况下，形成纳米颗粒并用一个冷冻-解冻周期进行挑战。在冷冻之前和解冻之后测量尺寸。选择1，2-丙二醇作为物质群组的代表。在不同复合物浓度(0.2和0.5mg/mL)以及在不同添加剂浓度(5％和10％(w/v))下进行实验。尺寸差异总结于表18b中。
表18a：用ZetaSizer Nano ZS(Malvern)测量的新鲜制备的复合物的标准尺寸
表18b：含有5％或10％1，2-丙二醇的不同多聚物制剂在冷冻之前相对在解冻之后的以％计的尺寸偏差。
如表18b中所示，同样对于脂质基复合物来说，在一个冷冻-解冻挑战期间，1，2-丙二醇使粒度稳定。因此，在下一步中测试了肺部递送后转染的效率。为此目的，通过向气管内微量喷雾注射，将10μg剂量的编码萤火虫萤光素酶的mRNA施用于BALB/c小鼠。图5和表19中显示了产生的蛋白质作为递送效率的测量并因此作为载体功能性的测量的检测结果。
图5显示了与1，2-丙二醇冷冻后脂质基纳米颗粒或微颗粒的体内转染效率。
在含有或不含1，2-丙二醇的情况下制备含有编码萤火虫萤光素酶的mRNA的复合物，并在4℃下存储或一个冷冻-解冻周期之后通过微量喷雾将其气管内施用至小鼠。处理后24h，麻醉小鼠，并移植肺以测量萤光素酶活性。n＝3。
表19：图5的列表数据(包括移植肺中的生物发光)
如图5和表19中可见，在体内施用后，在1，2-丙二醇的存在下冷冻的复合物维持全部功能性。因此，添加剂对转染效率没有负面影响。
结论和讨论
在此实施例中呈现的数据显示，1，2-丙二醇不仅允许聚合物基复合物的冷冻，而且允许脂质基复合物的冷冻，从而防止其聚集并保存体内活性。
附图说明
图1：含有添加剂的brPEI/FLuc mRNAN/P 10制剂对A549细胞的转染效率
图2：一个冷冻-解冻周期后brPEI/mRNA制剂的体内转染效率
图3：一个冷冻-解冻周期后，brPEI/mRNA制剂的体内转染效率。虚线：新鲜颗粒的活性的50％。
图4：浓缩的聚合物/mRNA制剂的体内转染效率
图5：在1，2-丙二醇中冷冻之后，脂质基纳米颗粒或微颗粒的体内转染效率。

Claims (16)

1.用于由悬浮在液体中的颗粒组合物形成气溶胶或用于雾化这样的组合物的装置，所述装置包含组合物，所述组合物包含：
(i)悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
(ii)选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，
其中所述治疗活性剂是核酸。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述治疗活性剂是mRNA。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述纳米颗粒制剂或微颗粒制剂显示1至4000nm范围内的平均粒径。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述纳米颗粒制剂或微颗粒制剂显示2至2500nm范围内的平均粒径。
5.根据权利要求3所述的装置，其中所述纳米颗粒制剂或微颗粒制剂显示5至1000nm范围内的平均粒径。
6.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述纳米颗粒制剂或微颗粒制剂的颗粒包含所述核酸和阳离子赋形剂。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述颗粒制剂的所述颗粒包含由所述核酸和作为所述阳离子赋形剂的阳离子低聚物或阳离子聚合物所形成的复合物形式的所述核酸。
8.根据权利要求6所述的装置，其中所述颗粒制剂的所述颗粒包含由所述核酸和作为所述阳离子赋形剂的阳离子脂质或阳离子类脂质所形成的复合物形式的所述核酸。
9.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述防冻添加剂包含至少仲羟基。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述防冻添加剂选自1,2-丙二醇、2-丙醇、1,2-丁二醇、和1,3-丁二醇。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述防冻添加剂是1,2-丙二醇。
12.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述防冻添加剂以基于所述液相的体积0.5至50％w/v的浓度被包含在所述组合物中。
13.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述装置是选自计量剂量吸入器、雾化器、和鼻喷雾装置的吸入器。
14.由根据权利要求1至13中任一项所述的装置获得的气溶胶。
15.组合物在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述组合物包含：
(i)悬浮在液相中的治疗活性剂的纳米颗粒制剂或微颗粒制剂，和
(ii)选自被一个或两个羟基取代的C3-C5烷烃的至少一种防冻添加剂，
其中所述治疗活性剂是核酸，并且
其中所述组合物被配制以被给予至呼吸道或通过呼吸道给予。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述组合物被配制以通过肺部给予或通过鼻部给予来给予。
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