KR20160121584A - Rna의 위장 투여용 조성물 - Google Patents

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KR20160121584A
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pharmaceutical composition
mrna
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크리스티안 도멘
막시밀리안 우츠징거
귄터 하센푸쉬
카르스텐 루돌프
크리스티안 플랭크
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에트리스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 폴리리보뉴클레오티드 (RNA) 및 양이온제를 포함하는 약학적 조성물로서, 위장관 (GI tract)에의 투여를 위한 고체 투약 형태로 제제화되는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 RNA의 전신 전달을 위한 이러한 약학적 조성물의 용도 및 이러한 약학적 조성물을 GI 관에 투여하는 단계를 포함하는 RNA의 전신 전달을 위한 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 키트에 관한 것이다.

Description

RNA의 위장 투여용 조성물{Compositions for gastrointestinal administration of RNA}
본 발명은 폴리리보뉴클레오티드 (RNA) 및 양이온제 (cationic agent)를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 약학적 조성물은 위장관 (GI tract)으로의 투여를 위한 고체 투약 형태로 제제화된다. 본 발명은 또한 RNA의 전신 전달을 위한 이러한 약학적 조성물의 용도 및 GI 관으로 이러한 약학적 조성물을 경구 투여하는 단계를 포함하는 개체로 RNA를 전신 전달하는 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 키트에 관한 것이다.
핵산 요법의 유용성은 궁극적으로 핵산을 세포 및/또는 조직 내로 전달하는 효과적인 방법의 이용가능성에 의존한다.
일반적으로 핵산 전달 시, 노출된 (naked) 핵산의 사용은 세포를 형질감염시키기에 적합하고 일부 사례에서는 충분하다 (Wolff et al. 1990, Science, 247, 1465-1468). 그러나, 대부분의 구상중에 있는 실제 응용에서는 적어도, 전달 동안 분해로부터 핵산을 보호하고/하거나, 표적 조직으로 및 그 내에서의 분포를 촉진하고/하거나, 세포 흡수를 용이하게 하고, 적합한 세포 내 처리를 가능하게 할 수 있는 제2의 제제로 핵산을 제제화하는 것이 유리하거나, 심지어는 요구된다. 이러한 핵산 전달용 제제는 과학 문헌에서 벡터로서 언급된다. 소위 형질감염 시약으로 불리는, 핵산의 벡터화를 위한 매우 다양한 화합물이 이전에 기술되어 왔다. 이들 화합물은 일반적으로 양이온성 지질 또는 리피도이드와 같은 지질-유사 화합물을 포함하는 폴리양이온 또는 조성물 중 하나이다 (미국특허 제8,450,298호). 핵산과 폴리양이온의 복합체는 폴리플렉스 (polyplexes)로 지칭되고, 양이온성 지질과의 복합체는 리포플렉스 (lipoplexes)로 지칭된다 (Felgner et al. 1997, Hum Gene Ther, 8, 511-512). 폴리양이온 및 지질 둘 모두를 포함하는 복합체 또한 기술되어 있다 (Li and Huang in "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Chapter 13, 295-303). 형질감염 시약은 핵산을 결합시키고 조밀화하여 나노미터 크기 범위의 일차 복합체를 만드는데 사용된다. 염-함유 배지에서, 이들 복합체는 응집하는 경향이 있는데, 이는 염-유도성 응집 (salt-induced aggregation)으로도 알려지며, 세포 배양 시 형질감염 또는 생체 내 국소 투여에 유리할 수 있다 (Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433; Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21). 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 폴리머로 표면을 차폐함으로써 응집이 회피될 수 있고 핵산과 형질감염 시약의 복합체가 안정화될 수 있다. 차폐는 또한 형질감염 시약과 핵산 복합체의 옵소닌화 (opsonization) 및 그에 의한 보체 활성화를 회피하기 위해 사용된다 (Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). 형질감염 시약에 의한 핵산의 조밀화는 이들을 뉴클리아제에 의한 분해로부터 보호할 뿐만 아니라 세포내이입 (endocytosis)에 의해 세포 흡수에 적합하게 한다. 이로 제한되는 것은 아니지만, 폴리(에틸렌이민), 폴리(아미도아민) 덴드리머, 폴리(2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트) (pDMAEMA) 또는 폴리(N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드) (pHPMA)의 양이온성 유도체, 폴리(베타-아미노 에스테르) (Akinc et al. 2003, Bioconj Chem 14(5): 979-88), 천연 및 합성 양이온성 폴리(아미노산), 예컨대 폴리(리신) 또는 펩티드, 히스톤, HMG 단백질 또는 양이온성 탄수화물, 예컨대 키토산을 포함하는, 다수의 선형 및 분지형 폴리양이온이 핵산에 결합하고 조밀화하는데 적합하다. 상기에 언급된 일차-, 이차- 및/또는 삼차 아민을 함유하는 폴리머 이외에, 구아니딜 모이어티를 함유하는 구조가 핵산 복합체화 및 전달을 위해 중요한 부류의 분자이다. 아르기닌-계 구조와 같은 구아니딜 변형된 폴리머 (Yamanouchi et al. 2008, Biomaterials 29(22): 3269-77), 아르기닌으로 변형된 PAMAM (Son et al., 2013, Bull. Korean Chem. Soc. Vol 34, No. 3) 또는 구아니딜화-PEI (Lee et al., 2008, Bull. Korean Chem. Soc. 2008, Vol. 29, No. 3)와 같은 구아니딜 변형 폴리머가 이러한 시스템의 효능을 강조하고 있다. 특히 RNA 상호작용의 경우에, 구아니딜 모이어티의 분자적 특성은 고유의 결합 특성을 나타낸다 (Calnan et al., 19991, Science 252(5009), 1167-1171). 이러한 구조의 형성을 위하여, Katritzky 및 Rogovoy에 의해 개요된 바와 같은 방법 (Katritzky & Rogovoy 2005, ARKIVOC (iv) 49-87)을 사용할 수 있다. 종종, 폴리플렉스는 세포 표적화 또는 세포 내 표적화 모이어티 및/또는 불활성화 바이러스 (Curiel et al. 1991, ProcNatl Acad Sci USA, 88, 8850-8854), 바이러스 캡시드 또는 바이러스 단백질 또는 펩티드 (Fender et al. 1997, Nat Biotechnol, 15, 52-56, Zhang et al. 1999, Gene Ther, 6, 171-181) 또는 막-파괴 합성 펩티드 (Wagner et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 7934-7938, Plank et al., 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924)와 같은 막-불안정화 성분을 함유하도록 추가로 변형된다.
그러나, 일부 이점에도 불구하고, 현재 유전자 전달용 바이러스 벡터는 강력한 면역원성 및 삽입성 돌연변이를 비롯한 안정성 우려와 연관이 있다. 비-바이러스 벡터는 낮은 유전자 전달 효율로 제한적이다 (Evans, 2012, 상기에 인용됨). 후자는 주로 핵 내로의 플라스미드 DNA의 불충분한 수송에 기인하는 것이라고 여겨졌다.
세포내이입 흡수 시, 복합체는 이들이 세포 분해 기전에 노출되는 엔도좀 및 리소좀과 같은 세포 내 소포체 내로 격리된다. 따라서, 세포 내 소포체로부터의 이탈이 효율적인 기능적 핵산 전달에 필수적이고 기능적 바이러스 감염에 필수적인 요건인 것으로 인식되고 있다 (Wagner et al. 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 7934-7938, Plank et al. 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924). 자연이 바이러스 감염성에 대해 진화해 온 메커니즘은 합성 벡터에 의한 효과적인 핵산 전달을 달성하도록 모사되어 왔다. 이를 위해, INF, GALA 및 KALA 펩티드 또는 멜리틴 (melittin) 및 멜리틴 유도체와 같은 양친매성 막-불안정화 펩티드 (Boeckle et al. 2006, J Control Release, 112, 240-248)가 엔도좀 이탈 기능을 이용해 폴리양이온성 형질감염 시약을 보완하는데 매우 성공적으로 사용되고 있다 (Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35). 리포플렉스에서는, 이러한 기능이 세포막과 융합되는 이들의 지질 모이어티의 능력에 의해 내재적이다 (Xu and Szoka 1996, Biochemistry, 35, 5616-5623, Zelphati and Szoka 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 11493-11498). Boussif 등에 의한 중요한 발표 (Boussif et al. 1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92, 7297-7301) 이후에, 폴리플렉스의 엔도좀 이탈 기능이 물리-화학적 수단에 의해 실현될 수 있는 것으로 알려졌다. 폴리(에틸렌이민) (PEI)이 폴리플렉스 형성을 위한 폴리양이온으로 사용되는 경우, 산성 pH에서 이의 완충능은 엔도좀 이탈을 유발하기에 충분하다. 엔도좀의 내강 (lumen)은 엔도좀 막에 존재하는 양성자 펌프에 의해 산성화되는 것으로 알려져 있다 (Lafourcade et al. 2008, PLoS One, 3, e2758). 이 산성화는 인플루엔자 또는 아데노바이러스와 같은 일부 바이러스의 엔도좀 이탈의 촉발제이다. 실험적 증거에 의해 입증되는, 소위 양성자 스폰지 이론은 PEI의 화학 구조적 특성을 포함하는 폴리머의 추정적인 기계적 작용을 기술한다: PEI의 아미노기의 상당한 부분은 중성 (생리학적) pH에서 비-양성자화된다 (Ziebarth and Wang 2010, Biomacromolecules, 11, 29-38). 양성자화되어, 그로써 양으로 하전된 아미노기 덕분에, PEI-유사 폴리머는 핵산에 결합하여 이를 조밀화할 수 있다. 비양성자화된 아민은 산성 pH에서 양성자화될 수 있고, 그로써 엔도좀 내부에서 완충능을 가질 수 있다. 양성자 펌프에 의한 엔도좀 산성화는 염화 이온의 축적을 수반한다 (Sonawane et al. 2003, J Biol Chem, 278, 44826-44831). 엔도좀 내강 내 PEI와 같은 완충 분자의 존재하에서 양성자 펌프는, 그의 부재 하에와 같이 자연적인 산성 엔도좀의 pH에 도달할 때까지 염화물 축적과 함께 더 많은 프로톤을 엔도좀 내강에 실어나를 것이다. 엔도좀 내부에서 이온의 불균형적 축적은 소포체의 삼투압 불안정화를 초래하고, 이는 궁극적으로 소포체 파열 및 핵산 복합체의 세포질 내로의 방출을 초래하는 것으로 생각된다.
양성자 스폰지 이론에 기초하여, 다수의 연구자들이 산성 pH에서 완충능을 갖는 아민을 포함하는 신규한 폴리머 라이브러리를 생성하면서 PEI의 구조적 특징을 포착하였다. 미국특허 제7,780,957호 및 제7,829,657호에서, Kataoka 등은 카복실산 측쇄가 산성 pH에서 양성자화 가능한 아민 측쇄로 유도체화되는 폴리(글루탐산) 또는 폴리(아스파르트산) 골격을 토대로 하는 폴리머를 기술한다. 그러나, 폴리양이온 내 형질감염-증강 모이어티로서 기능하는, 교번적인 (alternating), 비-동일 알킬렌 아민 단위를 함유하는 올리고(알킬렌 아민)의 풍부한 구조적 공간에 대해서는 탐구되지 않았다. 특히, mRNA 형질감염에 대해서는 이전에 조사되었던 적이 없다.
반대로, Kataoka 등의 대부분의 과학적 업적은 폴리{N-[N'-(2-아미노에틸)-2-아미노에틸]아스파르트아미드}에 집중되어 있다. Uchida 등에 의한 발표 [Uchida et al., 2011, J Am Chem Soc, 133, 15524-15532]에서, 동일 그룹은 일반식 -(CH2-CH2-NH)m-H의 측쇄 내 반복 아미노에틸렌 단위를 보유하는 일련의 N-치환된 폴리아스파르트아미드를 조사하였다. 흥미롭게도, 저자들이 플라스미드 DNA의 형질감염에 있어 폴리머 패밀리의 효율을 조사하였을 때, 여러 세포주로의 엔도좀 이탈 및 형질감염의 효율에 대한 폴리머 측쇄 내 반복 아미노에틸렌 단위의 특징적인 홀수-짝수 효과 (odd-even effect)가 관찰되었다. 짝수 개수의 반복 아미노에틸렌 단위를 갖는 폴리머 (PA-Es)로부터의 폴리플렉스는 홀수 개수의 반복 아미노에틸렌 단위를 갖는 폴리머 (PA-Os)의 것들에 비해 현저한 세포독성 없이, 10배 더 높은 형질감염 효율을 달성하였다. 이 홀수-짝수 효과는 엔도좀 pH에서 막 무결성을 선택적으로 파괴하는 이들의 능력뿐만 아니라 이들 폴리머의 완충능과 잘 부합하였고, 이는 PA-E 폴리플렉스의 매우 효과적인 엔도좀 이탈을 초래하였다. 나아가, 폴리머 측쇄 내 양성자화된 아미노기들 사이에 정확한 간격으로 다가 하전된 배열의 형성은 엔도좀 막의 효과적인 파괴에 필수적인 것으로 나타났고, 그로써 세포질 내로의 폴리플렉스의 수송을 촉진하였다 (Abstract from Uchida et al. 2011, J Am Chem Soc, 133, 15524-15532). 흥미롭게도, 동일한 그룹의 연구자들이 1,2-디아미노에탄 측쇄를 함유하는 폴리(아스파르트아미드) 유도체, [PAsp(DET)] 대 1,3-디아미노프로판 측쇄를 함유하는 유사체, [PAsp(DPT)]를 비교하였을 때, 비록 [PAsp(DET)]에 대해 입자 크기 및 ζ 전위의 물리화학적 차이가 무시할만 하더라도 N/P 비에 따라 세포독성이 점차적으로 증가하기 때문에, PAsp(DPT) 폴리플렉스가 높은 N/P 비에서 플라스미드 DNA의 형질감염 효율의 유의미한 감소를 나타내었음을 관찰하였다 (Miyata et al. 2008, J Am Chem Soc, 130, 16287-16294). 따라서, 홀수-짝수 규칙을 근거로, 본 발명자들은 3개의 양성자화 가능한 아미노기 및 프로필렌 스페이서 기를 포함하는 폴리머가 PAsp(DET)보다 열등할 것이고 1,3-디아미노프로판-함유 측쇄가 독성 문제와 연관이 있음을 예상할 수 있었다. mRNA 형질감염에 대한 이러한 폴리머의 구조-활성 상관관계에 대해서는 알려진 바가 없다.
Geall 및 동료들은 하기 일반식을 갖는 폴리아민 모이어티를 함유하는 콜레스테롤-폴리아민 카바메이트를 기술하고 있다:
-NH-CH2-(CH2)n-CH2-NH-CH2-(CH2)m-CH2-NH-CH2-(CH2)n-NH2
상기에서, m = 0, 1 또는 2이고 n = 0 또는 1이다 (Geall et al. 1999, FEBS Lett, 459, 337-342). 이들은 이들 물질의 pKa 값 및 송아지 흉선 DNA의 응축에 있어서 이들의 특징을 조사하였다. 이들은 콜레스테롤 폴리아민 카바메이트에 따른 양전하의 위치화학적 (regiochemical) 분포가 DNA 결합 친화도 및 리포펙션 (lipofection) 효율을 조절하는데 유의미한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 이들은 조사된 콜레스테롤-폴리아민 카바메이트 중에서, 폴리아민 모이어티를 구성하는 스페르민, -HN-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (프로필/부틸/프로필)이 세포 배양액 중에서 베타 갈락토시다제-인코딩 플라스미드 DNA의 형질감염 시 단연 가장 높은 리포터 유전자 발현을 양산한 반면, 예를 들어 -HN-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2 (에틸/프로필/에틸)은 3- 내지 10-배 덜 효율적이었음을 확인하였다. 따라서, Kataoka 등 (홀수-짝수 규칙)의 교시 및 Geall 등의 발견에 비추어, 숙련자는 핵산 전달의 맥락에서 후자의 구조를 간과할 것이다.
Wang 등은 플라스미드 DNA를 위한 효율적이고 낮은 세포독성을 갖는 형질감염 시약으로서 폴리(메틸 메타크릴레이트)-그라프트-올리고아민을 기술하고 있다 (Wang et al. 2010, Molecular BioSystems, 6, 256-263). 이들 폴리머는 일반식 H2N-CH2-CH2-(NH-CH2-CH2)m-NH2 (여기서, m = 1, 2, 또는 3임)의 올리고아민을 이용한 폴리(메틸 메타크릴레이트)의 아미노분해에 의해 수득되었다. 저자들은 형질감염 효율이 아민의 길이가 증가함에 따라 증가하였음을 확인하였다.
Ou 등은 N,N'-시스타민비스아크릴아미드과의 공-중합에 의해 Dde-NH-(CH2)a-NH-(CH2)b-NH-(CH2)a-NH-Dde 구조를 갖는 말단 보호된 올리고 아민으로부터 유도된 폴리(디설파이드 아미도 아민)을 기술하고 있다 (Ou et al. 2009, Biomaterials 30, 5804-5814; WO 2010/065660). 이들은 a = 2 및 b = 2, a = 2 및 b = 3, a = 3 및 b = 2, a = 3 및 b = 3, a = 3 및 b = 4의 조합 (스페르민)을 조사하였다. Dde는 2-아세틸디메돈 보호기이다. 보호기의 제거 후, 합성에 따라 내부의, 본래 이차 아민이 폴리머 주쇄의 일부로서 삼차 아민이 되고 말단 아민이 펜딩 (pending) 에틸렌 또는 프로필렌 아민 측쇄의 일부가 되는 폴리(디설파이드 아미도 아민)이 수득되었다. 이러한 폴리머는 핵산 전달과 관련된 pH 범위에서 완충능을 갖고 세포 내로의 플라스미드 DNA의 형질감염에 유용하다.
최근에, 시험관 내 및 생체 내 핵산 전달을 위한, 새로운 부류의 지질-유사체이지만 비-지질성 합성 구조, 소위 리피도이드 (lipidoid)의 유용성이 발견되었다 (미국특허 제8,450,298호; Love et al. 2010, PNAS 107, 1864-1869; WO2006/138380; Akinc et al. 2008, Nat Biotechnol 26, 561-569). 리피도이드는 아민-함유 화합물을 지방족 에폭사이드, 아크릴레이트, 아크릴아미드 또는 알데히드와 반응시킴으로써 수득된다. 저자/발명자는 리피도이드 라이브러리를 수득하기 위한 합성 과정 및 시험관 내 세포로의 핵산 전달에 유용성을 갖는 유용한 화합물을 선택하기 위한 스크리닝 과정을 제공하고 있다.
상기로부터 자명한 바와 같이, 과거 다수의 연구 및 개발 작업이 플라스미드 DNA, 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 핵산 유사체와 같은 다른 핵산 분자의 전달에 대해서 수행된 바 있다. mRNA 전달은 충분히 심도 깊게 조사되지 않았다. 일부 저자들은 DNA 또는 siRNA 전달에 잘 작동하는 화합물 및 제제가 mRNA 전달에도 유사하게 작동할 것이라고 주장하고 있다. 그러나, 플라스미드 DNA 또는 siRNA와는 달리, mRNA는 단일-가닥 분자이다. 따라서, 단지 구조적 고려만을 근거로 하면, DNA 또는 siRNA 전달 대비 mRNA 전달용 화합물 및 제제는 요건이 서로 다른 것으로 예상된다.
상기에 언급된 이전의 문헌은 플라스미드 DNA 또는 siRNA와 같은 이중-가닥 핵산의 세포 또는 조직(들) 내로의 전달을 기술한다. 더욱 구체적으로, DNA, 주로 플라스미드 DNA (pDNA)인 DNA의 경구 또는 직장 내 투여를 기반으로 하는 유전자 요법 접근법이 적용되었다. 개별적인 예시가 문헌 [Dass (Journal of Drug Targeting 16(4), 2008, 257-61), Bhavsar (AAPS ParmSciTech 9(1), 2008, 288-94; 유전자 요법 15, 2008, 1200-09; Journal of Controlled Release 119, 2007, 339-48), Dhadwar (Journal of Thrombosis and Haemostasis 8, 2010, 2743-50), Chen (World J Gastroenterol 10(1), 2004, 112-6), Roy (Nature Medicine 5(4), 1999, 387-91), Bowman (Journal of Controlled Release 132, 2008, 252-9), Kanbe (Biochem and Biophys Research Communications 345, 2006, 1517-25), Tai (Gene Therapy 20, 2013, 187-93) 및 Jean (Gene Therapy 18, 2011, 807-16)]에 기술되어 있다. 이 맥락에서, 예를 들어 키토산/DNA 나노입자를 사용하는 키토산-매개 DNA 전달이 공통적으로 적용되었다 (Dass 상기에 인용됨, Jean 상기에 인용됨, Dhadwar 상기에 인용됨, Chen 상기에 인용됨, Roy 상기에 인용됨, 및 Bowman 상기에 인용됨). 미립구 내 나노입자 경구 시스템 (nanoparticles-in-microsphere oral system, NiMOS)이 또한 이용되었다 (Bhavsar 상기에 인용됨). 또한 네이키드 (naked) 유전자 요법이 제안되었다 (Kanbe 상기에 인용됨). 그러나, 기술된 방법 및 화합물이 mRNA와 같은 단일 표준 핵산을 세포 또는 조직(들) 내로 전달할 수 있는지 여부는 알려져 있지 않고, RNA의 경구 투여에 의해 이러한 전달이 달성될 수 있는지 여부는 말할 것도 없다. 명백히도, mRNA 형질감염이 세포 내로의 플라스미드 DNA 형질감염과 실질적으로 상이함이 이전에 관찰된 바 있다 (Bettinger et al., 2001, Nucleic Acids Res, 29, 3882-91, Uzgun et al., 2011, Pharm Res, 28, 2223-32).
이에 의거하여, 본 발명자들은 WO　2011/154331호에 기술된 폴리머 류에서 100개 이상의 일원을 대상으로 RNA 전달, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일가닥 RNA의 세포로의 전달에 있어 이들의 적합성에 대해 스크리닝하였고, 그 결과, 이 화합물 모두 mRNA에 의해 인코딩되는 유전자의 발현을 불러 일으키는 방식으로 mRNA를 전달하는데 유용하지 않았음을 확인하였다. 이에 반해, 이들 화합물 모두는 플라스미드 DNA 및/또는 siRNA 전달에는 효과적이다. 따라서, 세포 내로 이중-가닥 핵산의 전달에 대해 확립된 규칙은 단일 가닥 mRNA에 선험적으로 적용되지 않는다. WO　2011/154331호의 기재는 일반식 HOOC-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H (여기서, Z는 일련의 메틸렌 또는 다양한 다른 그룹이고, R은 메틸렌 또는 카복시 잔기이고 a 및 b는 각각 독립적으로 1-7 또는 2-7의 정수임)에 상응하는 올리고(알킬렌 아미노) 산 단위가 2 내지 60개 단위인 화학적으로 정의된 올리고머를 포함한다. 이 패밀리의 올리고머는 소위 양성자 스폰지 효과를 발휘할 수 있고 시험관 내 및 생체 내에서 플라스미드 DNA 및 siRNA의 형질감염에 매우 활성인 것으로 입증된 양성자화 가능한 아미노기를 포함한다. 중요하게는, WO　2011/154331호 및 관련된 과학적 간행물은 일반식 HOOC-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H에 상응하는 빌딩 블록 (building block)으로부터 순서-규정된 올리고머/폴리머 라이브러리를 확립될 수 있는 방법을 매우 상세히 교시한다.
DNA-기반 유전자 요법에 대한 대안이 메신저 RNA (mRNA) 전달이다. 특히, mRNA는 최근에 비-바이러스 유전자 요법의 대안으로서 대두되고 있다. mRNA는 세포질에서 그의 기능을 발휘하기 때문에, 핵막을 가로지르는 수송과 관련된 제한이 극복되고; 이들은 mRNA-기반 전사 전사 요법과 무관하다.
그러나 간단하고 잘 용인되는 RNA-기반 유전자 요법을 가능케 하는 적합하고 신뢰할 만한 접근법이 여전히 미해결 상태로 남아있다.
따라서 본 발명의 기본적인 기술적 과제는, 특히 유전자 요법 접근법의 맥락에서, 세포 내로 또는 조직에 높은 효율로 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일 가닥-RNA의 전달을 위한, 간단하고, 신뢰할 만하며, 잘-용인되는 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
이 과제는 청구범위에서 특정되고 하기 일반적 기술 및 실시예에서 보다 상세히 설명되는 바와 같은 실시양태의 제공에 의해 달성되고 있다.
따라서, 본 발명은 본원에 추가로 정의된 바와 같은 그의 다양한 실시양태에서, 하기를 제공한다:
(i) RNA 및 양이온제를 포함하는 약학적 조성물 (포함하는 조성물)로서, 상기 약학적 조성물은 GI 관에 (또는 그 내로의) 투여 (예를 들어, 직장, 또는 바람직하게는, 경구 투여)에 적합한 고체 투약 형태로서 제제화됨;
(ii) RNA 및/또는 그로부터 번역된 단백질의 전신 전달, 및/또는 세포 및/또는 조직 내로, 특히 GI 관으로의 RNA 전달을 위한 본 발명의 약학적 조성물의 용도; 및
(iii) GI 관 (예를 들어, 직장으로 또는, 바람직하게는, 경구로)에 (또는 그 내로의) 본 발명의 약학적 조성물을 경구로 투여하는 단계를 포함하는, 개체에 RNA 및/또는 그로부터 번역된 단백질의 전신 전달, 또는 개체의 세포 및/또는 조직 내, 특히 GI 관으로 RNA의 전달을 위한 방법.
mRNA와 같은 RNA가 양이온제 (예를 들어, PEI 또는 C12-(2-3-2))와 조합하여 투여되는 경우, 및 고체 투약 형태 내에/고체 투약 형태로서 (예를 들어, 캡슐로 제공됨) 제제화되는 경우에, 이것이 분해되어 그의 바람직한 치료적 기능을 상실하지 않으면서 실제로 경구로 투여될 수 있음이 놀랍게도 확인되었다.
더욱 구체적으로, 리피도이드/mRNA 복합체가 고체 투약 형태 (예를 들어, 경질 젤라틴 캡슐 (도 35 참조))로서 경구로 투여되는 경우에, mRNA가 래트의 GI 관에서 효과적으로 발현되었음 (루시퍼라제 신호)이 확인되었다. 리피도이드/mRNA 복합체는 트레할로스와 함께 동결 건조될 수 있고/있거나 나노입자 (NP) 및/또는 미세입자 (MP) 내로 탑재될 수 있다. 이와 반대로, mRNA가 비-고체, 즉 액체 제제로 경구 투여되었던 경우에, 어떠한 주목할 만한 발현도 주요 장기 (심장, 폐, 간, 비장, 신장)에서 검출되지 않았다.
또 다른 놀라운 발견은 PEI와 조합하여 투여될 때, 헬퍼 지질 (helper lipid) 및/또는 MP을 사용하지 않은 경우에서조차도 효과적인 mRNA 발현이 달성되었다는 것이다 (도 36 참조). 그러나, 또한 NP 및/또는 MP 내/이들로서 이 제제는 mRNA의 발현 측면에서 매우 우수한 결과를 나타내었다 (도 36 참조).
원칙적으로, 양이온제는 양전하를 제공하고, 그로써 각각 핵산 (전형적으로 음으로 하전됨)과 복합화되어 핵산과 복합체를 형성할 수 있는, 본 발명에 따른 임의의 제제이다. 전형적으로, 본 발명의 맥락에서 이용될 수 있는 양이온제는 올리고양이온성제 또는 폴리양이온제이다. 양이온제는 양이온성 올리고머, 양이온성 폴리머 또는 양이온성 지질 또는 리피도이드일 수 있다.
하나의 비-제한적인, 그러나 바람직한 양이온성 폴리머가 폴리에틸렌이민 (PEI)이다. 원칙적으로, 임의의 PEI가 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 따라서, PEI는 비-분지형, 부분적-분지형 또는 분지형 PEI (brPEI)일 수 있다. BrPEI가 바람직하다.
다른 실시양태에서, 양이온제, 특히 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는, PCT/EP2014/063756호에 기술된 바와 같은 특징적인 올리고(알킬렌 아민) 모이어티와 같은 올리고(알킬렌 아민) 모이어티를 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 양이온제는 PCT/EP2014/063756호에 기술된 바와 같은 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드일 수 있다. 하나의 비-제한적인, 그러나 바람직한 양이온성 리피도이드는 PCT/EP2014/06375호에 기술되고 본원에 정의되고 기술된 바와 같은 "C12-(2-3-2)"이다.
하나의 특정 실시양태에서, 약학적 조성물 또는 적어도 하나의 이의 성분, 특히 포함된 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일 가닥 RNA는 단리되고/되거나 비-자연 발생적이다.
구체적으로, 본 발명 및 본원에 추가로 정의되는 바와 같은 이의 다양한 실시양태의 맥락에서, 하기가 이용된다:
- 교번적인, 비-동일 알킬렌 아민 단위를 함유하는 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드로서, 이들은 특히 RNA를 포함하고 위장관으로 투여될 수 있으며 그로써 고체 투약 형태 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 정의된 바와 같은 (경질 또는 연질 젤라틴) 캡슐, 정제, 좌약, 펠렛, 과립 또는 (분할된) 분말의 형태)의 형태를 취할 수 있는 약학적 조성물 내에 포함될 때, RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 세포 내로 또는 조직에의 전달에 유용함;
- RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 세포 내로 또는 조직에 전달하는데 유용한, RNA, 특히 mRNA와 조합하여 교번적인, 비-동일 알킬렌 아민 단위를 함유하는 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 이들 올리고머, 폴리머, 또는 리피도이드를 포함하는 조성물, 및 이를 포함하는 약학적 조성물. 특히, 상기 (약학적) 조성물은 위장관으로 투여될 수 있고, 그로써 상기에 언급된 임의의 투약 형태를 취할 수 있음;
- 상기 화합물 및 조성물을 제조하는 방법; 뿐만 아니라
- RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 세포 내로 또는 조직에 전달하기 위해 상기 화합물 및 조성물을 사용하는 방법뿐만 아니라, RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 전달하는데 본 발명에 따른 조성물의 능력을 이용하는 의학 용도 및 치료 방법.
RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 세포로의 전달에 유용한 조성물 내에 포함되는 선형, 분지형, 및 수지상 (dendritic), 무작위 또는 순서-규정된 화합물을 포함하는 올리고머 또는 폴리머 화합물 내에 또는 리피도이드 화합물 내에 교번적인, 비-동일 알킬렌 아민 단위를 함유하는 올리고(알킬렌 아민)의 풍부한 구조적 공간은 탐구된 바가 없다. 따라서 이러한 화합물의 순서 공간 역시 탐구된 적이 없다.
놀랍게도 본 발명의 맥락에서 올리고머, 폴리머, 및 리피도이드에 대한 일반적인 원리로서, RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA로 세포를 형질감염시키기 위한 조성물 중에 에틸렌아민 단위를 함유하고 3 이상의 단위들의 그룹에 교번적 길이의 알킬렌 아민 단위의 배열이 항상 비-교번적 길이를 가지는 알킬렌 아민 단위의 유사 배열보다 더 효과적이었음을 추가로 확인되었다. 따라서, 하기 화학식 (I)로 표시되는 공통의 구조적 본질을 공유하는 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드, 특히 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드가 본 발명의 문맥 내에서 이용되고, 이는 하기에 추가로 설명될 것이다:
Figure pct00001
(I)
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은, 일 측면에서, RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA, 및 하기로부터 선택되는 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 성분(을 포함하는 조성물)을 포함한다:
a) 측쇄 및/또는 말단기로서 다수의 화학식 (II)의 기를 포함하는, 올리고머 또는 폴리머, 특히 양이온성 올리고머 또는 폴리머:
Figure pct00002
(II)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은, 다수의 이러한 기에서 화학식 (II)의 각 기에 대해 독립적으로, 하기와 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이고; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5는, 서로 독립적으로, 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
R6은 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고,
화학식 (II)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 양성자화되어 화학식 (II)의 양이온성 기를 제공할 수 있고;
b) 반복 단위로 다수의 하기 화학식 (III)의 기를 포함하는, 올리고머 또는 폴리머, 특히 양이온성 올리고머 또는 폴리머:
Figure pct00003
(III)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는, 다수의 이러한 기에서 화학식 (III)의 각 기에 대해 독립적으로, 하기와 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이고; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5는, 서로 독립적으로, 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
화학식 (III)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 양성자화되어 화학식 (III)의 양이온성 기를 제공할 수 있고; 및
c) 하기 화학식 (IV)의 구조를 갖는 리피도이드, 특히 양이온성 리피도이드:
Figure pct00004
(IV)
상기 식에서 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이고; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;
R1 내지 R6은 서로 독립적으로 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고; 단 R1 내지 R6 중에 적어도 2개의 잔기는 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이고;
화학식 (IV)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 양성자화되어 화학식 (IV)의 양이온성 기를 제공할 수 있다.
추가의 측면에서, 상기에 정의된 바와 같은 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는 본 발명에 따라 사용되는 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물의 제조에 유용한 중간체로서 본 발명의 맥락에서 사용된다. 본 발명에 따른 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드뿐만 이나리 본 발명에 따른 조성물 및 약학적 조성물의 제조 방법이 또한 본원에 기술된다.
또 다른 추가의 측면은 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 표적 세포 내로 또는 조직에, 특히 고체 투약 형태로서 GI 관에 (또는 그 내로) 투여함으로써 전달하기 위한 본 발명에 따른 (약학적) 조성물 또는 본 발명에 따른 양이온성 폴리머 또는 덴드리머 또는 리피도이드의 용도, 및 본 발명에 따른 (약학적) 조성물을 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 세포 또는 조직 내로, 특히 고체 투약 형태로서 GI 관에 (또는 그 내로) 투여함으로써 전달하는 방법을 기술한다.
올리고(알킬렌 아민) 기
화학식 (II), (III) 및 (IV)의 올리고(알킬렌 아민) 구조는 이들이 더 짧은 (표기를 위해 "S"로도 언급됨) 에틸렌 아민 단위 (즉, a 또는 b가 1임)와 더 긴 (표기를 위해 "L"로도 언급됨) 알킬렌 아민 단위 (즉, a 또는 b의 다른 하나가 2 내지 4의 정수임)를 교번적 방식으로 조합된 것을 특징으로 한다. 예상치 못하게, 양성자화 가능한 단위의 이러한 배열은, 생성된 기가 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA을 세포 내로 전달하기 위한 부형제를 제공하기에 적합하다는 측면에서 이점을 제공하는 것으로 나타났다.
상기에 지적한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 일 실시양태에 따른 (약학적) 조성물에 사용될 수 있는 올리고머 또는 폴리머는 측쇄 및/또는 말단기로서 다수의 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 기를 포함한다:
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (II)
상기 식에서 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은, 다수의 이러한 기에서 화학식 (II)의 각 기에 대해 독립적으로, 하기와 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이고; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5는, 서로 독립적으로, 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
R6은 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C16 알킬 또는 C3-C16 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택된다.
바람직하게는, R2 내지 R5는 수소이고 R6은 수소, 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, R2 내지 R6은 수소이다. 바람직하게는, R7은 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C8-C18 알킬 또는 C8-C18 알케닐로부터, 더욱 바람직하게는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C8-C12 알킬 또는 C8-C12 알케닐로부터, 가장 바람직하게는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C10-C12 알킬 또는 C10-C12 알케닐로부터 선택된다.
화학식 (II) 또는 그의 바람직한 실시양태에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 화학식 (II)의 양이온성 기를 제공할 수 있다.
다수의 화학식 (II)의 기는 화학식 (II) 또는 이의 바람직한 실시양태의 2개 이상의 기, 바람직하게는 3개 이상의 기가 본 발명에 따른 올리고머 또는 폴리머 내에 포함되는 것을 의미한다. 다수의 화학식 (II)의 기를 포함하는 폴리머에서, 10개 이상의 화학식 (II)의 기가 존재하는 것이 바람직하다. 화학식 (II)의 기 또는 이의 바람직한 실시양태는 폴리머 또는 올리고머 내부에 동일한 구조를 가질 수 있거나, 또는 화학식 (II)의 범주 내에서 2 이상의 상이한 구조를 가질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 (약학적) 조성물에 사용될 수 있는 올리고머 또는 폴리머는 반복 단위로 다수의 화학식 (III)의 올리고 (알킬렌 아민)을 포함한다:
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n- (III)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5은, 다수의 이러한 기에서 화학식 (II)의 각 기에 대해 독립적으로, 하기와 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이고; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5는, 서로 독립적으로 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 엔도좀 이탈 이펙터 및 수용체 리간드로부터 선택된다. 바람직하게는, R2 내지 R5는 수소이다. 바람직하게는, R7은 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C8-C18 알킬 또는 C8-C18 알케닐로부터, 더욱 바람직하게는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C8-C12 알킬 또는 C8-C12 알케닐로부터, 가장 바람직하게는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C10-C12 알킬 또는 C10-C12 알케닐로부터 선택된다.
화학식 (III) 또는 이의 바람직한 실시양태에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 양성자화되어 화학식 (III)의 양이온성 기를 제공할 수 있다.
선택적으로, 반복 단위로 화학식 (III) 또는 이의 바람직한 실시양태의 다수의 기를 포함하는 올리고머 또는 폴리머는, 또한, 측쇄 및/또는 말단기로서 화학식 (II)의 하나 이상의 올리고(알킬렌 아민) 기(들)를 포함할 수 있다.
반복 단위로 다수의 화학식 (III)의 기는 화학식 (III) 또는 이의 바람직한 실시양태의 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상의 기가 본 발명에 따른 올리고머 또는 폴리머에 포함되는 것을 의미한다. 일반적으로, 본원에서 2 내지 9개 반복 단위를 포함하는 물질은 올리고머로 지칭되고, 10개 및 초과의 반복 단위를 포함하는 물질은 폴리머로 지칭된다. 따라서, 반복 단위로 다수의 화학식 (III)의 기를 포함하는 폴리머에서, 바람직하게는 10개 이상의 화학식 (III)의 기가 존재한다. 화학식 (III) 또는 이의 바람직한 실시양태의 기는 폴리머 또는 올리고머 내부에 동일한 구조를 가질 수 있거나, 또는 화학식 (III)의 범주 내에서 2 이상의 상이한 구조를 가질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 유리하게는, 바람직한 실시양태에 따르면, 반복 단위로 다수의 화학식 (III)의 기를 포함하는 올리고머 또는 폴리머는 제어된 단계적 중합으로 상이한 화학식 (III)의 기로부터 제조되는 순서가 규정된 폴리머의 라이브러리 형태로 제공될 수 있다.
상기 화학식 (II) 및 (III)에 따라, 알킬렌 아민 단위는 교번적 쇄 내에 1회 반복되어 유형 -S-L-L-S- 또는 -L-S-S-L-의 올리고(알킬렌 아민) 모이어티를 유도할 수 있고, 여기서 S는 더 짧은 에틸렌 아민 단위를 나타내고, L은 더 긴 알킬렌 아민 단위를 나타낸다. 그러나, 화학식 (II) 및 (III)의 바람직한 기는 반복이 일어나지 않는, 즉 p가 1이어서 더 짧거나 더 긴 단위가 쌍 내에 나타나지 않는 것이다. 다시 말하면, 화학식 (II)의 기는 바람직하게는 하기 화학식 (IIa)의 올리고(알킬렌 아민) 기이고 화학식 (III)의 기는 바람직하게는 하기 화학식 (IIIa)의 올리고(알킬렌 아민) 기이다:
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IIa)
상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R6은 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (II)에서 정의된 바와 같고, 여기서 화학식 (IIa)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다;
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n- (IIIa)
상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R5는 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (III)에서 정의된 바와 같고, 화학식 (IIIa)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다.
나아가, 일반적으로 n이 1이고, 더욱 바람직하게는 m이 1이고 n이 1인 화학식 (II) 및 (III)의 올리고(알킬렌 아민) 기가 바람직하다. 따라서, 화학식 (II)의 기가 하기 화학식 (IIb)의 올리고(알킬렌 아민) 기이고, 화학식 (III)의 기가 하기 화학식 (IIIb)의 올리고(알킬렌 아민) 기인 것이 특히 바람직하다:
-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-(NR5)-R6 (IIb)
상기 식에서, a, b, 및 R2 내지 R6은 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (II)에서 정의된 바와 같고, 여기서 화학식 (IIb)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다;
-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5- (IIIb)
상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R5는 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (III)에서 정의된 바와 같고, 화학식 (IIIb)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다.
화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (III), (IIIa), (IIIb)의 올리고(알킬렌 아민) 기에서 알킬렌 아민 단위의 길이와 관련하여, 하나의 교번적 단위가 에틸렌 아민 단위일 필요가 있음 (즉, a 또는 b 중 하나는 1이어야 함)을 이해할 것이다. 다른 교번적 단위는 프로필렌 아민 단위, 부틸렌 아민 단위 또는 펜틸렌 아민 단위 (즉, a 또는 b의 다른 하나는 2 내지 4의 정수임)일 수 있다. 바람직하게는, a 또는 b의 다른 하나는 2 또는 3이고, 가장 바람직하게는 a는 1이고 b는 2이거나, a는 2이고 b는 1이다. 따라서, 기 (II)로서 화학식 (IIc)의 올리고(알킬렌 아민) 기가 더욱 더 바람직하고, 기 (III)로서 화학식 (IIIc)의 올리고(알킬렌 아민) 기가 더욱 더 바람직하다:
-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-R6 (IIc)
상기 식에서, R2 내지 R6은 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (II)에서 정의된 바와 같고, 여기서 화학식 (IIc)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다;
-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5- (IIIc)
상기 식에서, R2 내지 R5는 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (III)에서 정의된 바와 같고, 여기서 화학식 (IIIc)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다.
화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (IIc)에서 기 R2 내지 R6 또는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb) 및 (IIIc)에서 기 R2 내지 R5 중 어느 하나가 예를 들어 WO2006/138380호에 기술된 바와 같은 아미노기에 대한 보호기인 경우에, 이의 바람직한 실시양태는 t-부톡시카보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc), 또는 카보벤질옥시 (Cbz)이다.
화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (IIc)에서 R1 내지 R6 또는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb) 및 (IIIc)에서 기 R2 내지 R5 중 어느 하나가 수용체 리간드인 경우에, 유용한 예시가 문헌 [Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15, CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009]에 제공된다. 폐 조직에 바람직한 수용체 리간드는 문헌 [Pfeifer et al. 2010, Ther. Deliv. 1(1): 133-48]에 기술되어 있다. 바람직한 수용체 리간드에는 특정한 세포 표면 구조 또는 특정한 세포 유형에의 결합에 대한 스크리닝 펩티드 라이브러리로부터 유도된 것과 같은 합성 환형 또는 선형 펩티드, 환형 또는 선형 RGD 펩티드, 합성 또는 천연 탄수화물, 예컨대 시알산, 갈락토스 또는 만노스, 또는 탄수화물을 예를 들어 펩티드와 반응시켜 유도된 합성 리간드, 세포 표면 구조를 특이적으로 인식하는 항체, 엽산, 표피 성장 인자 및 이의 유도된 펩티드, 트랜스페린, 항-트랜스페린 수용체 항체, 나노바디 및 항체 단편, 공지의 세포 표면 분자에 결합하는 승인된 약물 등이 포함된다.
화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (IIc)에서 R1 내지 R6 기 또는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb) 및 (IIIc)에서 기 R2 내지 R5 중 어느 하나가 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄인 경우에, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄의 바람직한 분자량은 100 내지 20,000 g/mol, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 10,000 g/mol이고, 가장 바람직하게는 1,000 내지 5,000 g/mol이다.
기 (II)로서 하기 화학식 (IId)의 올리고(알킬렌 아민) 기가 가장 바람직하다:
-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H (IId)
상기 식에서, 화학식 (IId)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 폴리머 또는 덴드리머 구조를 제공할 수 있다.
기 (III)로서 하기 화학식 (IIId)의 올리고(알킬렌 아민) 기가 가장 바람직하다:
-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH- (IIId)
상기 식에서, 화학식 (IIId)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 폴리머 또는 덴드리머 구조를 제공할 수 있다.
상기에 지시된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 일 실시양태에 따라서 (약학적) 조성물에 사용될 수 있는 리피도이드는 하기 화학식 (IV)의 구조를 갖는다:
R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IV)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 하기와 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이고; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;
R1 내지 R6은 서로 독립적으로 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고; 단 R1 내지 R6 중에 적어도 2개의 잔기는 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이다.
바람직하게는, R1 내지 R6은 독립적으로 수소; 기 -CH2-C(OH)H-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고; 단 R1 내지 R6 중의 적어도 2개의 잔기는 기 -CH2-C(OH)H-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이다. 더욱 바람직하게는, R1 내지 R6은 독립적으로 수소; 및 기 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C16 알킬 또는 C3-C16 알케닐로부터 선택됨)이고; 단 R1 내지 R6 중에 적어도 2개의 잔기는 기 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이다. R1 및 R6이 독립적으로 수소; 및 기 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이고; R2 내지 R5가 모두 기 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)인 성상 (constellation)이 더욱 더 바람직하다. 바람직하게는, R7은 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C8-C16 알킬 또는 C8-C18 알케닐로부터, 더욱 바람직하게는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C8-C12 알킬 또는 C8-C12 알케닐로부터, 가장 바람직하게는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C10-C12 알킬 또는 C10-C12 알케닐로부터 선택된다.
화학식 (IV)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 화학식 (IV)의 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
상기 화학식 (IV)에 따라, 알킬렌 아민 단위는 교번적 쇄 내에 1회 반복되어 유형 -S-L-L-S- 또는 -L-S-S-L-의 올리고(알킬렌 아민) 모이어티를 유도할 수 있고, 여기서 S는 더 짧은 에틸렌 아민 단위를 나타내고, L은 더 긴 알킬렌 아민 단위를 나타낸다. 그러나, 화학식 (IV)의 바람직한 리피도이드는 반복이 일어나지 않는, 즉 p가 1이어서 더 짧거나 더 긴 단위가 쌍 내에 나타나지 않는 것이다. 다시 말하면, 화학식 (IV)의 리피도이드는 바람직하게는 하기 화학식 (IVa)의 리피도이드이다:
R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IVa)
상기 식에서, a, b, m, n, 및 R1 내지 R6은 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (IV)에서 정의된 바와 같고, 여기서 화학식 (IVa)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있고;
나아가, 일반적으로 n이 1이고, 더욱 바람직하게는 m이 1이고 n이 1인 화학식 (IV)의 리피도이드가 바람직하다. 따라서, 화학식 (IV)의 리피도이드는 하기 화학식 (IVb)의 리피도이드가 특히 바람직하다:
R1-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5-R6 (IVb)
상기 식에서, a, b, 및 R1 내지 R6은 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (IV)에서 정의된 바와 같고, 여기서 화학식 (IVb)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
화학식 (IV), (IVa) 및 (IVb)의 리피도이드에서 알킬렌 아민 단위의 길이와 관련하여, 교번적 단위의 하나는 에틸렌 아민 단위 (즉, a 또는 b 중 하나는 1이어야 함)일 필요가 있음을 이해할 것이다. 다른 교번적 단위는 프로필렌 아민 단위, 부틸렌 아민 단위 또는 펜틸렌 아민 단위 (즉, a 또는 b의 다른 하나는 2 내지 4의 정수임)일 수 있다. 바람직하게는, a 또는 b의 다른 하나는 2 또는 3이고, 가장 바람직하게는 a는 1이고 b는 2이거나, a는 2이고 b는 1이다. 따라서, 화학식 (IV)의 리피도이드로서 화학식 (IVc)의 리피도이드가 더욱 더 바람직하다:
R1-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-R6 (IVc)
상기 식에서, R1 내지 R6은 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (IV)에서 정의된 바와 같고, 여기서 화학식 (IVc)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있고;
화학식 (IV), (IVa), (IVb) 및 (IVc)에서 기 R1 내지 R6이, 예를 들어 WO2006/138380에 기술된 바와 같은 아미노기에 대한 보호기인 경우에, 이의 바람직한 실시양태는 t-부톡시카보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc), 또는 카보벤질옥시 (Cbz)이다.
화학식 (IV), (IVa), (IVb) 및 (IVc)에서 기 R1 내지 R6이 수용체 리간드인 경우에, 유용한 예시가 문헌 [Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009]에 제공된다. 폐 조직에 바람직한 수용체 리간드는 문헌 [Pfeifer et al. 2010, Ther Deliv. 1(1): 133-48]에 기술되어 있다. 바람직한 수용체 리간드에는 특정한 세포 표면 구조 또는 특정한 세포 유형에의 결합에 대한 스크리닝 펩티드 라이브러리로부터 유도된 것과 같은 합성 환형 또는 선형 펩티드, 환형 또는 선형 RGD 펩티드, 합성 또는 천연 탄수화물, 예컨대 시알산, 갈락토스 또는 만노스, 또는 탄수화물을 예를 들어 펩티드와 반응시켜 유도된 합성 리간드, 세포 표면 구조를 특이적으로 인식하는 항체, 엽산, 표피 성장 인자 및 이의 유도된 펩티드, 트랜스페린, 항-트랜스페린 수용체 항체, 나노바디 및 항체 단편, 공지의 세포 표면 분자에 결합하는 승인된 약물 등이 포함된다.
화학식 (IV), (IVa), (IVb) 및 (IVc)에서 기 R1 내지 R6이 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄인 경우에, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄의 바람직한 분자량은 100 내지 20,000 g/mol, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 10,000 g/mol이고, 가장 바람직하게는 1,000 내지 5,000 g/mol이다.
상기에 지시된 바와 같이, 화학식 (I), 및 화학식 (IIa) 내지 (IId), (IIIa) 내지 (IIId) 및 (IVa) 내지 (IVc)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 기에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 형태로, 전형적으로 올리고양이온 또는 폴리양이온 형태로 올리고머 또는 폴리머 또는 리피도이드를 초래할 수 있다. 화학식 (I), 및 화학식 (IIa) 내지 (IId), (IIIa) 내지 (IIId) 및 (IVa) 내지 (IVc)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 기에서 일차 및/또는 이차 및/또는 삼차 아미노기가 생리학적 유체를 포함하는, 특히 물 및 수용액 중에서 양성자 수용체로서 작용할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 올리고머, 폴리머 및 리피도이드는 전형적으로 7.5 미만의 pH의 수용액 중에서 전반적으로 양성인 전하를 갖는다. 본원에 언급되는 바와 같이, 수용액은 용매가 50% (vol./vol.) 이상, 바람직하게는 80 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 물을 포함하는 용액이다. 또한, 만약 본 발명에 따른 (약학적) 조성물이, 예를 들어 혈액 및 폐액을 비롯한 7.5 미만의 pH를 갖는 생리학적 유체와 접촉한다면, 화학식 (I), 및 화학식 (IIa) 내지 (IId), (IIIa) 내지 (IIId) 및 (IVa) 내지 (IVc)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 기는 전형적으로 하나 이상의 양성자화된 아미노기를 함유한다. 이들 화합물의 pKa 값은 자동화 pKa 적정기를 사용한 산-염기 적정에 의해 결정될 수 있다. 소정의 pH 값에서 순 전하는 그 후에 핸더슨-하셀바흐 방정식 (Henderson-Hasselbach equation)으로부터 계산될 수 있다. 문헌 [Geall et al., J. Geall et al. 1998, Chem Commun, 1403-1404]에 따르면, 임의의 전하가 여러 염기 중심에 걸쳐서 공유되고 이것이 단일 지점에서 기인한 것일 수 없음을 인식하는 것이 중요하다. 예를 들어, 1,9-디아미노-3,7-디아자노난 (프로필/에틸/프로필)은 9.3, 7.6 및 5.7의 pKa를 갖는데, 이는 생리학적 pH에서 아미노기의 실질적 분획이 양성자화된 상태 및 비-양성자화된 상태임을 의미한다.
그러나, 숙련자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 본 발명에 따라 사용되는 올리고머, 폴리머 및 리피도이드뿐만 아니라 본 발명에 따른 (약학적) 조성물은 또한 양이온성 형태로 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드를 함유하는 건조 염 형태로 제공될 수 있다.
더 한층 이해될 것인 바와 같이, 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 및 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 포함하는 본 발명에 따른 (약학적) 조성물 내 양성자화된 아미노기의 양전하에 대한 짝이온 (음이온)은 전형적으로 RNA에 포함된 음이온성 모이어티의에 의해 제공된다. 양으로 하전된 기가 RNA 내 음이온성 모이어티에 비해 과량으로 존재하는 경우, 양전하는 전형적으로 생리학적 유체 내에서 마주치는 Cl- 또는 HCO3 -와 같은 다른 음이온에 의해 균형 잡힐 수 있다.
본 발명의 맥락에 사용하기에 적합한 올리고(알킬렌 아민)은 공지의 화학 공급자로부터 상업적으로 입수될 수 있거나, 또는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, van Alphen 1936, Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 55, 835-840). 필요할 수 있는 임의의 변형이 화학적 합성의 표준 방법에 의해 달성될 수 있다.
올리고머/폴리머 구조
상기에 지시된 바와 같이, 화학식 (I), 및 화학식 (IIa) 내지 (IId) 및 (IIIa) 내지 (IIId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 기는 다양한 올리고머 또는 폴리머 골격 구조에 결합할 수 있거나, 또는 이를 제공할 수 있다.
일반적으로, 화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 기를 포함하는 올리고머 또는 폴리머는 또한, 측쇄 및/또는 말단기로서, 화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 기를 보유하는 폴리머 골격으로 언급될 수 있다. 측쇄 또는 말단기로서 화학식 (II), 및 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 기를 포함할 수 있는 폴리머 골격은 선형, 분지형 또는 가교된 폴리머뿐만 아니라 수지상 폴리머 (덴드리머)를 포함한다. 폴리머는 합성 또는 생체-폴리머를 포함한다. 선형 또는 분지형 폴리머 골격 구조가 바람직하다. 이는 측쇄 또는 말단기로서 화학식 (II), 및 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 기를 보유하는 올리고머에도 마찬가지로 적용되고, 폴리머 골격은 전형적으로 10개 이상의 반복 단위를 포함하는 반면, 올리고머 골격은 2 내지 9개, 바람직하게는 3 내지 9개 반복 단위를 포함하는 차이가 있다. 일반적으로, 측쇄 또는 말단기로서 화학식 (II), 및 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 기를 포함하는 올리고머 및 폴리머 중에서, 폴리머가 바람직하다.
화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 측쇄 또는 말단기는 본 발명에 따른 폴리머를 제공하기 위해 통상적으로 공지의 화학적 기능성 및 반응을 이용하여 폴리머 또는 올리고머 골격에 그라프팅될 수 있다. 숙련자에게 이해될 것인 바와 같이, 용어 "폴리머 또는 올리고머로의 그라프팅"은 측쇄가 중합 반응 전에 단량체에 결합하는 옵션을 배제하지 않는다. 화학식 (II)에서 유리 원자가에 의해 표시되는 바와 같이, 측쇄 또는 말단기는 공유 결합을 통해 폴리머 또는 올리고머 골격에 부착된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "폴리머" 및 "올리고머"가 라디칼 중합, 음이온성 또는 양이온성 중합을 비롯한 중부가 (polyaddition) 및 중축합 (polycondensation) 반응과 같은 광범위한 다양한 반응에 의해 수득가능한 폴리머 및 올리고머뿐만 아니라, 단계적 커플링 반응 (예를 들어, 단계적 성장 과정)에 의해 수득가능한 폴리머 및 올리고머를 포함하는 것으로 더욱 한층 이해될 것이다.
따라서, 측쇄 또는 말단기로서 화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 기를 보유하기 위한 폴리머 또는 올리고머 골격으로 적합한 폴리머 또는 올리고머는 폴리아미드, 폴리에스테르, 탄소 쇄 골격을 갖는 폴리머, 및 다당류와 같은 폴리머 또는 올리고머를 포함한다. 예시적인 폴리머 또는 올리고머 골격은 다수의 글루탐산 또는 아스파르트산 단위를 포함하는 폴리(아미노산), 예컨대 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산), 단백질, 폴리알킨, 폴리아민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리말레산, 폴리설포네이트, 폴리스티렌 설포네이트, 폴리포스페이트, 펜토산 폴리설페이트, 폴리(비닐 인산), 폴리(부타디엔-co-말레산), 폴리(에틸 아크릴레이트-co-아크릴산), 폴리(에틸렌-co-아크릴산), 폴리(에틸렌-co-무수 말레산), 폴리(메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리(메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리(스티렌설폰산-co-말레산), 폴리(비닐 클로라이드-co-비닐 아세테이트-co-말레산) 탄수화물. 예컨대 헤파린, 헤파란 설페이트, 폴리(글루쿠론산), 폴리(갈락투론산), 히알루론산, 폴리(우론산) 일반적으로, 또는 카복시-말단 치환된 (terminated) 덴드리머에 의해 제공된다. 이들 중에서, 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산)과 같이 다수의 글루탐산 또는 아스파르트산 단위를 포함하는 폴리(아미노산), 및 폴리(메트)아크릴산이 바람직하다. 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산이 본 발명의 목적에 가장 바람직하다.
바람직하게는, 폴리머 골격은 (예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 결정되는, 중합된 단위의 평균 개수 측면에서) 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000의 중합도를 갖는다.
본 발명에 따른 폴리머는 호모폴리머 (homopolymer) 또는 코폴리머 (copolymer)에 의해 제공될 수 있다. 코폴리머는 폴리머 골격이 코폴리머이도록 상이한 구조를 갖는 중합된 단위를 포함할 수 있다. 대안적으로, 코폴리머는 폴리머 골격으로서 호모폴리머를 토대로 수득될 수 있는데, 이때 모든 중합된 단위가 화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 기를 보유하는 것은 아니다. 코폴리머 골격 내 일정 비율의 단위에 측쇄를 그라프팅함으로써 이들 두 대체제를 조합하는 옵션이 또한 있음을 이해할 것이다. 코폴리머는 랜덤, 구배 또는 블록 코폴리머의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리머가 호모폴리머인 경우에, 모든 중합된 단위는 화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 기를 보유한다. 본 발명에 따른 폴리머가 코폴리머인 경우에, 모든 중합된 단위의 5 내지 100%, 더욱 바람직하게는 25 내지 100%, 특히 50 내지 100%가 화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 기를 보유하는 것이 바람직하다. 이 비율은 모든 중합된 단위에 대해, 화학식 (II)의 기를 보유하는 단위의 개수 측면에서 주어진다.
상기 코폴리머는 또한, 화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 기에 추가로, 다른 아민 함유 측쇄 또는 말단기를 포함할 수 있다. 그러나, 화학식 -NH-(CH2)x-(NH(CH2)2)y-NH2의 측쇄 또는 말단기 (여기서, x는 1 내지 5의 정수를 지칭하고 y는 1 내지 5의 정수를 지칭함)는 본 발명에 따른 폴리머 내에 함유되지 않는 것이 바람직하다.
화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 측쇄를 보유하는 바람직한 폴리아미드는 하기 화학식 (V)의 반복 단위를 포함한다:
Figure pct00005
(V)
상기 식에서, 변수는 하기 의미를 갖는다:
R8 및 R9는 결합 및 C1-C6 알카네디닐로부터 선택되고;
R10은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R11은 결합 및 C1-C6 알카네디닐로부터 선택되고,
L1은 이가 연결기이고,
A1은 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민)을 나타낸다.
바람직하게는, R8 및 R9는 독립적으로 결합 및 C1-C5 알카네디닐로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 결합이다. 바람직하게는, R10은 H 및 메틸로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 H이다. R11은 바람직하게는 C1-C6 알카네디닐이다.
연결기 L1은, 바람직한 실시양태에서, 구조 -Z1-R'-Z2-를 갖는데, 여기서 Z1은 결합, -NH-(C=O)-, -NH-C(S)-NH-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-S(O)2-, -NH-CH2-C(OH)-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-, -CH=N-NH-(C=O)-, -S-S-, -티오에테르 결합-, -S-CH2-(C=O)-, -S-, -S-CH2-CH-NH2-, 및 -아릴 티오에테르 결합-으로부터 선택되고; R'은 결합, C1-C6 알카네디닐 및 -(CH2-CH2-O)n-H (여기서, n = 1-3)로부터 선택되고; Z2는 결합, -(C=O)-, -NH-C(S)-, -NH-(C=O)-, -S(O)2-, -O-P(O)2-, -CH(OH)-CH2, -O-(C=O)- 및 -C(NH)-로부터 선택된다. 바람직하게는, Z1은 결합, -NH-(C=O)-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-로부터 선택되고; R'은 결합 및 C1-C6 알카네디닐로부터 선택되고, Z2는 결합, -(C=O)-, -NH-(C=O)-, 및 O(C=O)로부터 선택되고; 단 Z1 및 Z2의 하나는 결합 이외의 것이다. Z1 및 R'이 결합이고 Z2가 -(C=O)-인 L1, 또는 Z1이 -NH-(C=O)-이고, R'이 C1-C6 알카네디닐이고, Z2가 -(C=O)-인 L1이 가장 바람직하다.
A1은 바람직하게는 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 기에 대해 본원에 정의된 바람직한 실시양태의 하나, 특히 화학식 (IIa) 내지 (IId)의 기의 하나이다.
화학식 (V)의 반복 단위를 포함하는 바람직한 폴리아미드에서, 모든 중합된 단위의 5 내지 100%, 더욱 바람직하게는 25 내지 100%, 특히 50 내지 100%가 화학식 (V)의 단위인 것이 바람직하다. 이 비율은 모든 중합된 단위에 대해서, 화학식 (V)의 단위의 개수 측면에서 제공된다. 화학식 (V)의 변수에 대해 주어진 정의 및 바람직한 정의 내에서, 화학식 (V)의 반복 단위는 본 발명에 따른 바람직한 폴리머에서 동일하거나 상이할 수 있다.
하기 화학식 (Va) 및 (Vb)의 폴리머가 본 발명에 사용하기 위한 폴리아미드 폴리머로서 특히 바람직하다.
Figure pct00006
(Va)
Figure pct00007
(Vb)
이들 화학식에서, R8, R9, R10, R11, L1 및 A1은 이의 바람직한 실시양태를 포함하는, 화학식 (V)에 대해 정의된 바와 같다. R12는 OH 또는 C1-C6 알콕시, -NH2, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄, 또는 수용체 리간드로부터 선택된다. R13은 H, 아미노기에 대한 보호기, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄, 또는 수용체 리간드이고, X1은 H, -NH2, -COOH 및 -COOR"로부터 선택되고, 여기서 R"은 C1-C6 알킬, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄, 또는 수용체 리간드이다. 화학식 (Va)에서, s (예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 결정되는, 중합된 단위의 평균 개수를 나타냄)는 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000이다. 화학식 (Vb)에서, 괄호 안의 단위는 특히 무작위, 교번적인 또는 블록 형태의 (blockwise) 배열을 비롯한, 임의의 순서로 폴리머 내에 배열될 수 있는 반복 단위이다. q+r의 합 (예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 결정되는, 중합된 단위의 평균 개수를 나타냄)은 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000이고, q/(q+r)의 비는 0.05 내지 1, 바람직하게는 0.25 내지 1, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1의 범위이다.
화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 측쇄에 의해 용이하게 변형될 수 있는, 예시적인 바람직한 폴리(아미노산)은 글루탐산, 아스파르트산, 오르니틴 및/또는 리신 단위를 포함하는 폴리(글루탐산), 폴리(아스파르트산), 폴리리신, 폴리오르니틴 또는 폴리(아미노산)이다. 폴리(글루탐산)이 더욱 바람직하다.
화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 측쇄를 보유하는 탄소 쇄 골격를 갖는 바람직한 폴리머는하기 화학식 (VI)의 반복 단위를 포함한다:
Figure pct00008
(VI)
상기 식에서, 변수는 하기와 같은 정의를 갖는다:
R14 및 R15는 독립적으로 결합 및 C1-C6 알카네디닐로부터 선택되고;
R16은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R17은 결합 및 C1-C6 알카네디닐로부터 선택되고,
L2는 이가 연결기이고,
A1은 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 기를 나타낸다.
바람직하게는, R14는 결합이고 R15는 결합 또는 -CH2-이다. 더욱 바람직하게는, R14는 결합이고 R15는 -CH2-이다. 바람직하게는, R16은 H 및 메틸로부터 선택된다. R17은 바람직하게는 결합 또는 -CH2-이다.
연결기 L2는, 바람직한 실시양태에서, 구조 -Z3-R'-Z4-를 가지며, 여기서 Z3은 결합, -NH-(C=O)-, -NH-C(S)-NH-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-S(O)2-,-NH-CH2-C(OH)-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-, -S-S, -CH=N-NH-(C=O)-, -티오에테르 결합-, -S-CH2-(C=O)-, -S-, -S-CH2-CH-NH2-, 및 -아릴 티오에테르 결합-으로부터 선택되고; R'은 결합, C1-C6 알카네디닐 및 -(CH2-CH2-O)n-H로부터 선택되고 (여기서 n=1-3); Z4는 결합, -(C=O)-, -NH-C(S)-, -NH-(C=O)-, -S(O)2-, -O-P(O)2-, -CH(OH)-CH2, -O-(C=O)- 및 -C(NH)-으로부터 선택된다. 바람직하게는, Z3은 결합, -NH-(C=O)-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-로부터 선택되고; R'은 결합 및 C1-C6 알카네디닐로부터 선택되고, Z4는 결합, -(C=O)-, -NH-(C=O), 및 -O-(C=O)-로부터 선택되고; 단 Z3 및 Z4의 하나는 결합 이외의 것이다. Z3 및 R'이 결합이고 Z4가 -(C=O)-인 L2가 가장 바람직하다.
A1은 바람직하게는 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 기에 대해 본원에 정의된 바람직한 실시양태의 하나, 특히 화학식 (IIa) 내지 (IId)의 기의 하나이다.
화학식 (VI)의 반복 단위를 포함하는 바람직한 폴리아미드에서, 모든 중합된 단위의 5 내지 100%, 더욱 바람직하게는 25 내지 100%, 특히 50 내지 100%가 화학식 (VI)의 단위인 것이 바람직하다. 이 비율은 모든 중합된 단위에 대해서, 화학식 (VI)의 단위의 개수 측면에서 제공된다. 화학식 (VI)의 변수에 대해 주어진 정의 및 바람직한 정의 내에서, 화학식 (VI)의 반복 단위는 본 발명에 따른 바람직한 폴리머에서 동일하거나 상이할 수 있다.
화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 측쇄를 보유하는 탄소 쇄 골격을 갖는 폴리머로서 하기 화학식 (VIa) 및 (VIb)의 폴리머가 특히 바람직하다.
Figure pct00009
(VIa)
Figure pct00010
(VIb).
이들 화학식에서, R14, R15, R16, R17, L2 및 A1은 이의 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (VI)에 대해 정의된 바와 같다. X2는 -COOH 및 -COOR"로부터 선택되고, 여기서 R"은 C1-C6 알킬, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄, 또는 수용체 리간드이다. 화학식 (VIa)에서, s (예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 결정되는, 중합된 단위의 평균 개수를 나타냄)는 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000이다. 화학식 (VIb)에서, 괄호 안의 단위는 특히 무작위, 교번적인 또는 블록 형태의 배열을 비롯한, 임의의 순서로 폴리머 내에 배열될 수 있는 반복 단위이다. q+r의 합 (예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 결정되는, 중합된 단위의 평균 개수를 나타냄)은 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000이고, q/(q+r)의 비율은 0.05 내지 1, 바람직하게는 0.25 내지 1, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1이다.
화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 측쇄에 의해 용이하게 변형될 수 있는, 탄소 쇄 골격을 갖는 예시적인 바람직한 폴리머는 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 또는 폴리말레산이고, 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산이 더욱 바람직하다.
화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 측쇄를 보유하는 바람직한 다당류는 하기 화학식 (VII)의 반복 단위를 포함한다:
Figure pct00011
(VII)
상기 식에서, 변수는 하기 의미를 갖는다:
R19 및 R22는 독립적으로 결합 및 -(CH)2-로부터 선택되고; t는 0 또는 1이고;
R18, R20 및 R21의 하나는 -L3-A1을 나타내고, 여기서 L3은 이가 연결기이고, A1은 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 기를 나타내고, 다른 것들은 독립적으로 -H, -OH, 및 -(CH2)n-OH로부터 선택되고, 여기서 n = 1 또는 2이다.
바람직하게는, R19 및 R22는 결합이다. 바람직하게는, R18, R20 및 R21의 하나는 -L3-A1을 나타내고, 여기서 L3은 이가 연결기이고, A1은 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 기를 나타내고, 다른 것들은 -OH이다.
연결기 L3은, 바람직한 실시양태에서, 구조 -Z5-R'-Z6-을 가지며, 여기서 Z5는 결합, -NH-(C=O)-, -NH-C(S)-NH-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-S(O)2-, -NH-CH2-C(OH)-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-, -S-S, -CH=N-NH-(C=O)-, -티오에테르 결합-, -S-CH2-(C=O)-, -S-, -S-CH2-CH-NH2-, 및 -아릴 티오에테르 결합-으로부터 선택되고; R'은 결합, C1-C6 알카네디닐 및 -(CH2-CH2-O)n-H로부터 선택되고 (여기서, n=1-3); Z6은 결합, -(C=O)-, -NH-C(S)-, -NH-(C=O)-, -S(O)2-, -O-P(O)2-, -CH(OH)-CH2, -O-(C=O)- 및 -C(NH)-로부터 선택되고; 단 Z5 및 Z6 중 하나는 결합 이외의 것이다. 바람직하게는, Z5는 결합, -NH-(C=O)-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-로부터 선택되고; R'은 결합 및 C1-C6 알카네디닐로부터 선택되고, Z6은 결합, -(C=O)-, -NH-(C=O)-, 및 -O-(C=O)-로부터 선택되고; 단 Z5 및 Z6 중 하나는 결합 이외의 것이다. Z5 및 R'이 결합이고 Z6가 -(C=O)-인 L3이 가장 바람직하다.
A1은 바람직하게는 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 기, 특히 화학식 (IIa) 내지 (IId)의 기에 대해 본원에 정의된 바람직한 실시양태의 하나이다.
화학식 (VII)의 반복 단위를 포함하는 바람직한 다당류에서, 모든 중합된 단위의 5 내지 100%, 더욱 바람직하게는 25 내지 100%, 특히 50 내지 100%가 화학식 (VII)의 단위인 것이 바람직하다. 이 비율은 모든 중합된 단위에 대해서, 화학식 (VII)의 단위의 개수 측면에서 제공된다. 화학식 (VII)의 변수에 대해 주어진 정의 및 바람직한 정의 내에서, 화학식 (VII)의 반복 단위는 본 발명에 따른 바람직한 폴리머에서 동일하거나 상이할 수 있다.
화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 측쇄를 보유하는 다당류로서 하기 화학식 (VIIa)의 폴리머가 특히 바람직하다.
Figure pct00012
(VIIa)
이 화학식에서, R18, R19, R20, R21, R22 및 t는 이의 바람직한 실시양태를 비롯해 화학식 (VII)에 대해서와 같이 정의된다. s (예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 결정되는, 중합된 단위의 평균 개수를 나타냄)는 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000이다.
화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 측쇄에 의해 용이하게 변형될 수 있는, 다당류 골격을 갖는 예시적인 폴리머는 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트린, 사이클로덱스트린, 키틴, 키토산, 인슐린, 풀루란, 스클레로글루칸, 커드란, 칼로스, 라미나린, 크리소라미나린, 크실란, 아라비노크실란, 만난, 푸코이단 및 갈락토만난, 프로테오글리칸, 폴리글루쿠로난, 폴리글루쿠로난, 셀로우론산, 키토우론산, 폴리우론산, 펙틴, 글리코스아미노글리칸, 헤파린, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 히알루론산 아가, 소디움 알지네이트, 알긴산, 아라비아 검, 카라기난, 푸코이단, 푸코갈락탄, 키토바이오스 옥타아세테이트, 키토트리오스 운데카아세테이트, 말토올리고당이다. 키토산, 히드록시에틸 전분, 덱스트란, 덱스트린, 사이클로덱스트린 (α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 및 δ-사이클로덱스트린)이 바람직하다.
이의 분지형 구조 내에 화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 말단기를 포함하도록 변형될 수 있는 다양한 덴드리머 구조가 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들어 폴리아미도아민 (PAMAM) (Tomalia et al. 1990, Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 29, 138-175) 또는 파단된 (fractured) PAMAM (Tang et al, 1996, Bioconjug. Chem. 7, 703-714), 폴리아민 (Hawker et al. 1990, J. Am. Chem. Soc. 112, 7638-7647), 폴리아미드 (폴리펩티드) (Sadler et al. 2002, J. Biotechnol. 90, 195-229), 폴리(아릴 에테르) (Hawker et al. 1990, J. Am. Chem. Soc. 112, 7638-7647), 폴리에스테르 (Ihre et al. 1996, J. Am. Chem. Soc. 118, 6388-6395, Grinstaff et al. 2002, Chemistry 8, 2838-2846), 탄수화물 (Turnbull et al. 2002, J. Biotechnol. 90, 231-255), DNA (Nilsen et al., 1997, J. Theor. Biol. 187, 273-284; Li et al., 2004, Nat. Mater. 3, 38-42), 지질 (Ewert et al. 2006, Bioconjug Chem. 17, 877-88), 폴리(에테르 이민) (Thankappan et al. 2011, Bioconjug Chem. 22, 115-9.) 트리아진 (Lim et al. 2012, Adv Drug Deliv Rev. 15, 826-35) 및 폴리글리세롤 (Fischer et al. 2010, Bioconjug Chem. 21, 1744-52)이 기술되어 있다.
말단기로서 화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 기를 포함하는 올리고머가 또한 다수의 이러한 기가 화학식 (II) 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 기의 부착을 위해 적합한 관능기를 제공하는 다관능성 코어 구조에 말단기로서 공유적으로 부착되는 올리고머를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 이들 다관능성 코어 구조는 특히 이가, 삼가 또는 더 높은 원자가의 카복실산 또는 폴리아민을 포함한다. 필요에 따라, 다관능성 코어 구조의 관능기는 화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 기의 그룹의 부착을 허용하기 위하여 활성화되거나 연결기와 반응할 수 있다. 다수의 이러한 기를 보유하도록 변형될 수 있는 예시적인 분지형 코어 구조는 하기 화학식 (VIIIa-g)로 도해된다:
Figure pct00013
(VIIIa)
Figure pct00014
(VIIIb)
Figure pct00015
(VIIIc)
Figure pct00016
(VIIId)
Figure pct00017
(VIIIe)
Figure pct00018
(VIIIf)
Figure pct00019
(VIIIg)
숙련자에 의해 인식될 것인 바와 같이, 측쇄 및/또는 말단기로서 기 (II), 또는 화학식 (IIa) 내지 (IId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태를 포함하는 폴리머 또는 올리고머는, 커플링 화학에 적용될 수 있는 관능기를 포함하거나 이를 포함하도록 변형되어 있는, 폴리머 골격에 올리고(알킬렌 아민)의 커플링을 통한 다양한 합성 경로에 의해 용이하게 수득될 수 있다. 이러한 관능기에는 -COOH, -CO-, -CHO, -SO3H, -PO4H, -NH-, -NH2, -OH, 또는 -SH가 포함된다. 이해될 것인 바와 같이, 화학식 (II)의 측쇄 및/또는 말단기를 함유하는 본 발명에 따른 폴리머 또는 올리고머를 제공하기 위해 이들의 중합 전에 적합한 단량체를 화학식 (II)의 기로 변형하는 것이 또한 가능하다. 그러나, 폴리머의 변형이 일반적으로 바람직하다.
예를 들어, 카복실산 기를 포함하는 모체 폴리머 (즉, 본 발명에 따른 폴리머에서 폴리머 골격을 제공하는 폴리머)는, 필요한 경우, 예를 들어 카보디이미드를 이용한 활성화 및 하기 화학식 (프리-II)의 올리고(알킬렌 아민) (여기서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은 화학식 (II)에 대해 정의된 바와 같음)과의 후속 아미드 결합 형성에 의한 직접 커플링에 적용되어 화학식 (II)의 측쇄 및/또는 말단기를 제공할 수 있다.
H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (프리-II)
필요에 따라, 화학식 (프리-II)의 화합물은, 예를 들어 WO2006/138380호에 기술된 바와 같은 아미노기에 대한 통상적인 보호기, 바람직하게는 t-부톡시카보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc), 또는 카보벤질옥시 (Cbz)를 사용하여 그의 말단 및/또는 내부 이차 아미노기의 하나 또는 전부에서 보호될 수 있다.
만약 가교-결합 반응이 바람직하지 않다면, 이러한 반응은 바람직하게는 모체 폴리머의 카복실산 기에 비해 화학식 (프리-II)의 올리고(알킬렌 아민)의 반응성 아미노기의 과량 존재 시에 수행된다. 모체 폴리머의 성질에 의존하여, 커플링 반응이 수성 또는 유기 용매 중에서 수행될 수 있다. 적합한 커플링 조건은 펩티드 및 생체접합체 (bioconjugate) 화학 분야에 잘 알려져 있다 (Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2nd Edition, Academic Press 2008). 상기에 지시된 바와 같이, 적합한 폴리머 골격에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 다수의 글루탐산 또는 아스파르트산 단위를 포함하는 폴리(아미노산), 예컨대 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산), 단백질, 폴리알킨, 폴리아민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리말레산, 폴리설포네이트, 폴리스티렌 설포네이트, 폴리포스페이트, 펜토산 폴리설페이트, 폴리(비닐 인산), 폴리(부타디엔-co-말레산), 폴리(에틸 아크릴레이트-co-아크릴산), 폴리(에틸렌-co-아크릴산), 폴리(에틸렌-co-무수 말레산), 폴리(메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리(메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리(스티렌설폰산-co-말레산), 폴리(비닐 클로라이드-co-비닐 아세테이트-co-말레산) 탄수화물. 예컨대 헤파린, 헤파란 설페이트, 폴리(글루쿠론산), 폴리(갈락투론산), 히알루론산, 일반적으로 폴리(우론산), 또는 카복시-말단 치환된 (terminated) 덴드리머가 포함된다.
본 발명의 다른 실시양태의 경우에, 화학식 (II)의 측쇄 및/또는 말단기를 포함하는 폴리머는 모체 폴리머의 환원성 아민화 (reductive amination)에 의해 수득될 수 있다. 탄수화물 또는 당은 알데히드로 산화되고, 이어서 올리고(알킬렌 아민)과의 반응을 통해 이민을 유도할 수 있고, 이는 예를 들어 나트륨 시아노 보로하이드리드를 이용해 환원되어 아민을 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태의 경우에, 올리고(알킬렌 아민)은 첫 번째 단계에서 유도체화되어, 예를 들어 하기 화학식 (프리-II')의 카복시-말단 치환된 올리고(알킬렌 아민)을 유도할 수 있고 이는 모체 폴리머 내 히드록실 및 아미노기에 커플링되기 쉽다:
HOOC-(CH2)u-L'-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (프리-II')
상기 식에서, u는 1 내지 6의 정수이고, L'은 결합 또는 -(CH)2-이고, 다른 변수는 화학식 (II)에 대해서와 같이 정의된다. 필요에 따라, 화학식 (프리-II) 또는 (프리-II')의 화합물 내 임의의 말단 및/또는 내부 이차 아미노기(들)는, 예를 들어 WO2006/138380호에 기술된 것들과 같은 아미노기에 대한 통상적인 보호기, 바람직하게는 t-부톡시카보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc), 또는 카보벤질옥시 (Cbz)를 사용하여 보호될 수 있다.
이러한 목적을 위하여, 올리고(알킬렌 아민)은 디카복실산 무수물, 디카복실산 또는 알데히드와 반응하여 구조 (프리-II')를 유도할 수 있다. 구조 (프리-II')가 직교 (orthogonal) 보호기를 갖는 올리고(알킬렌 아민) (프리-II) 내 아민을 제공하지 않으면서 수득될 수 있다고 하더라도, 이렇게 하는 것이 바람직할 수 있다. 구조 (프리-II')는, 예를 들어 직접 커플링에 의해 폴리(리신), 폴리(오르니틴) 또는 폴리(비닐아민)의 변형을 허용하여, 아미드 결합 형성을 유도한다. 커플링 반응의 완료 시, 임의의 보호기는 통상적인 방법을 통해 제거될 수 있다. 그 후에 수득된 폴리머는, 예를 들어 투석 또는 이온 교환 또는 크기 배제 또는 역상 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
중간체 및 최종 생성물은 아민 보호기가 제거된 후, 및 덴드리머의 경우 최종 커플링 단계 전에 침전, 투석, 크기 배재 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
화학식 (III), 또는 화학식 (IIIa) 내지 (IIId)을 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 반복 단위를 포함하는 폴리머 또는 올리고머는 선형, 분지형, 또는 가교된 폴리머, 또는 수지상 폴리머 (덴드리머)일 수 있다. 바람직하게는, 화학식 (III), 또는 화학식 (IIIa) 내지 (IIId)을 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 반복 단위를 포함하는 폴리머 또는 올리고머는 상기 폴리머 또는 올리고머 내 반복 단위의 총 개수에 대해 화학식 (III)의 단위의 개수 측면에서 이러한 반복 단위의 적어도 25%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%를 포함한다. 화학식 (III), 또는 화학식 (IIIa) 내지 (IIId)을 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 반복 단위를 포함하는 폴리머 또는 올리고머 내 모든 반복 단위의 50% 이하가 이러한 단위인 것이 특히 바람직하다. 나머지 반복 단위, 특히 이가, 삼가 또는 더 높은 원자가의 카복실산으로부터 유래된 단위는 화학식 (III), 또는 화학식 (IIIa) 내지 (IIId)을 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 반복 단위의 커플링을 허용하는 분자에 의해 제공된다.
화학식 (III), 또는 화학식 (IIIa) 내지 (IIId)을 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 반복 단위를 포함하는 폴리머 또는 올리고머는 하기 화학식 (프리-III)의 화합물을 사용하여 용이하게 수득될 수 있다:
H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (프리-III)
상기 식에서, "프리 (pre)"는, 이의 바람직한 실시양태를 포함하는, 화학식 (III)의 전구체 (여기서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는 화학식 (III)에 대해서와 같이 정의되고, R6은 화학식 (II)에 대해서와 같이 정의됨), 또는 바람직하게는 화학식 (프리-IIIa) 내지 (프리-IIId)의 화합물 (여기서, 변수는 각각 하기 화학식 (IIIa), (IIIb) (IIIc) 또는 (IIId)에 대해서와 같이 정의됨)을 사용하는, 화학식 (프리-III)를 나타낸다:
H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6(프리-IIIa)
H-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5-R6 (프리-IIIb)
H-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-R6 (프리-IIIc)
H-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H (프리-IIId)
말단 아민기를 보유하는 이들 화합물은 통상적인 커플링 반응을 이용하여 선형, 분지형, 가교된 또는 수지상 폴리머를 형성하도록 연결될 수 있다. 이러한 커플링 반응에서 반응물로 사용될 수 있는 적합한 화합물에는 이가, 삼가 또는 더 높은 원자가의 카복실산이 포함된다. 상업적으로 이용 가능하고 화학식 (프리-III), (프리-IIIa), (프리-IIIb), (프리-IIIc) 및 (프리-IIId) 각각의 링커 화합물과 반응할 수 있는 예시적인 화합물이 하기 화학식 (VIIIa-g)로 도시된다:
Figure pct00020
(VIIIa)
Figure pct00021
(VIIIb)
Figure pct00022
(VIIIc)
Figure pct00023
(VIIId)
Figure pct00024
(VIIIe)
Figure pct00025
(VIIIf)
Figure pct00026
(VIIIg)
다가 카복실산과 디아민의 직접적인 반응이 용이하게 달성될 수 있다고 하더라도, 링커 화합물이 카복실산 기 (또는 이의 활성화 형태)를 제공하는 것들로 제한되지 않음이 이해될 것이다. 예를 들어, 화학식 (VIIIg)의 화합물은, 화학식 (프리-III)의 화합물의 디-아미드가 석신산과 같은 디카복실산을 이용해 형성된 후에 화학식 (프리-III)의 화합물과 반응할 수 있다.
또한, 올리고(알킬렌 아민)은 첫 번째 단계에서 유도체화되어, 예를 들어 화학식 (프리-II')의 화합물의 제조를 위해 상기에 기술된 바와 같은, 하기 화학식 (프리-III')의 카복시-말단 치환된 올리고(알킬렌 아민)을 유도할 수 있다:
HOOC-(CH2)u-L"-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (프리-III')
상기 식에서, u는 1 내지 6의 정수이고, L"은 결합 또는 -(CH)2-이고, 다른 변수는 화학식 (III)에 대해서와 같이 정의되고, R6은 화학식 (II)에 대해서와 같이 정의된다. 필요에 따라, 화학식 (프리-III')의 화합물 내 임의의 내부 이차 아미노기(들)가, 예를 들어 WO2006/138380에호 기술된 바와 같은 아미노기에 대한 통상적인 보호기, 바람직하게는 t-부톡시카보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc), 또는 카보벤질옥시 (Cbz)를 사용하여 보호될 수 있다. 잔여 말단 아미노기 -NR5R6이 비보호된 형태/카복실산 기와의 아미드 형성을 가능케 하는 형태로 존재하는 경우, 화학식 (프리-III')의 화합물은 중합되거나 올리고머화되어 반복 단위로서 화학식 (III), 또는 화학식 (IIIa) 내지 (IIId)를 비롯한 바람직한 실시양태의 다수의 올리고(알킬렌 아민) 기를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 제공할 수 있다. 이러한 폴리머는 선형이거나 또는 분지될 수 있다.
예를 들어, 구조 (프리-III')는 랜덤 중합 또는 정의된 방식 중 하나에 의해 분지형 구조를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 공-중합은 선택적으로 보호된 내부 아미노기 및 폴리-카복실산 (VIIIa 내지 VIIIg)과 함께 수성 또는 유기 용매 중에서 올리고(알킬렌 아민)의 혼합물로서 카보디이미드 활성화에 의해 인 시츄 (in situ)로 활성화될 수 있다.
반복 단위로 화학식 (III), 또는 화학식 (IIIa) 내지 (IIId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 기를 포함하는 덴드리머응 또한, 예를 들어 다가 커플링 분자를 사용하여 제조될 수 있다. 덴드리머는 중심 코어로부터 방사상으로 뻗어나와 나무를 연상시키는 다수의 완전한 분지형 단량체로 이루어진 폴리머 분자이며, 이로부터 덴드리머 (그리스어, dendra)라는 이의 파생되었다. 덴드리머의 코어가 제거되면, 덴드론 (dendron)이라 불리는 다수의 동일한 단편이 중심 코어의 다중도 (multiplicity) (2, 3, 4 또는 그 이상)에 의존적으로 다수의 덴드론으로 남게 된다. 덴드론은 3개의 상이한 영역으로 구분될 수 있다: 코어, 내부 (또는 분지) 및 주변 (또는 종단 또는 말단기). 덴드론의 코어로부터 그의 주변으로 외향적으로 이동할 때 발생하는 분기점의 수가 그의 세대를 정의하는데 (G-1, G-2, G-3); 더 높은 세대의 덴드리머가 더 크고, 더 분지되며, 더 낮은 세대의 덴드리머보다 이들의 주변에 더 많은 종단기를 갖는다.
합성은 지수-유사 성장을 초래하는 분기형이거나, 덴드론이 개별적으로 성장하고 최종 단계에서 코어에 부착하는 수렴형 중 하나일 수 있다. 덴드리머는 고상 폴리펩티드 및 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 방법과 유사하게, 단계적 방식으로 제조되고, 따라서 생성물은 쇄 성장이 통계적이고 다분산 생성물이 수득되는 전통적인 폴리머 합성과는 반대로, 이론적으로 크기가 단분산이다. 합성 재현성뿐만 아니라, 실험적 및 치료적 변동성의 감소에 단분산 생성물이 매우 바람직하다. 실제로, 단분산 생성물은 저-세대 덴드리머 (최대 G-3)에 대해서 용이하게 수득될 수 있지만, 때로는 더 높은 세대에서 구조적으로 매우 유사한 사소한 결함을 갖는 덴드리머로부터 완전한 덴드리머를 정제하는 것이 불가능하기 때문에, 비록 전형적으로는 미미한 수준이지만, 절대적 단분산성으로부터의 이탈을 초래한다.
화학식 (III), 또는 화학식 (IIIa) 내지 (IIId)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 다수의 올리고(알킬렌 기)를 포함하는 본 발명에 따른 폴리머로서 바람직한 덴드리머는 G1 내지 G10, 더욱 바람직하게는 G2 내지 G8, 특히 G3 내지 G6 범위의 세대 수를 갖는다. (반응 단계에 조합된 반응물을 기준으로 계산될 수 있는 바와 같은) 이들 덴드리머의 분자량은 바람직하게는 1,500 내지 1,000,000, 더욱 바람직하게는 3,000 내지 230,000, 특히 6,000 내지 60,000, 가장 바람직하게는 15,000 내지 30,000 범위이다.
정의된 폴리(아미도아민) 덴드리머의 생산을 위해 (보호된) 구조 (프리-III) 및/또는 (프리-III')가 이미 문헌에 기술된 바와 같은 분지형 코어의 단계적 생성을 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, Lee et al., 2005, Nat Biotechnol 23, 1517-1526). 출발 분자로서, 디-카복실산, 무수물 또는 아크릴산에 의해 활성화된 올리고(알킬아민) (예를 들어, 프리-III) 또는 폴리-카복실산 (예를 들어, VIIIa 내지 VIIIg) 중 하나가 사용될 수 있다. 이 코어는 구조 (프리-III)의 올리고(알킬아민)과 이를 단계적으로 반응시키기 위해 사용되고 이어서 정제 및 예를 들어 아크릴산에 의한 말단 아미노기의 활성화가 수반된다. 정제 후 이 코어는 올리고(알킬렌 아민)의 추가 층을 부가하기 위해 사용될 수 있다. 덴드리머를 수득하기 위한 반응 조건이 문헌에 상세하게 기술되어 있다 (예를 들어, 앞서 인용된 Lee et al., 및 그에 포함된 참고문헌 참조).
추가의 실시양태에 따르면, 카복시기가 양측에 말단 치환된 올리고(알킬렌 아민)이 일측에 보호될 수 있고/있거나, 필요에 따라, 내부 아민이 보호될 수 있고, 말단에 아민기를 갖는 디아민 또는 수지상 출발 구조와, 또는 올리고(알킬렌 아민) 자체와 중합될 수 있다.
중간체 및 최종 생성물은 아민 보호기가 제거된 후, 및 덴드리머의 경우 최종 커플링 단계 전에 침전, 투석 또는 크기 배제 크로마토그래피로 정제될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, WO2011/154331 및 문헌 (Schaffert et al., 2011, Angew Chem Int Ed Engl 50(38), 8986-9)에 기술된 바와 유사하게, 말단 카복시기 (또는 이의 적절히 보호되거나 활성화된 형태) 및 말단 아미노기 (또는 이의 적절히 보호된 형태)를 갖는 올리고(알킬렌 아민), 예를 들어 화학식 (프리-III')의 올리고(알킬렌 아민)이 완전히 정의된 펩티드성 선형 또는 분지형 구조의 단계적 생성에 사용될 수 있다. 단계적 반응이 펩티드 화학의 원리에 따라서 수행될 수 있고 자동화 펩티드 합성기 상에서 수행될 수 있다. 펩티드 합성 분야의 숙련자에게 공지된 바와 같이, 리신 또는 오르니틴과 같은 디-아미노산이 분지형 구조를 구축하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 각종 선형 및 분지형 호모폴리머, 또한 폴리머의 원하는 위치에 화학식 (I)의 상이한 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 헤테로폴리머가 제공될 수 있다. 또한, 표준형 (canonical) 아미노산이 임의의 위치에서 이렇게 정의된 구조 내로 통합될 수 있다.
화학식 (IV), 및 화학식 (IVa), (IVb) 및 (IVc)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 리피도이드의 제조를 위해, US2010/0331234 A1, US8,450,298; 문헌 [Love et al., 2010, PNAS 107, 1864-1869]; WO2006/138380; 문헌 [Akinc et al., 2008, Nat Biotechnol 26, 561-569]에 기술된 것들과 유사한 방법이 사용될 수 있다.
예를 들어, 화학식 (IV), 및 화학식 (IVa), (IVb) 및 (IVc)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태의 리피도이드는 R7-에폭사이드 또는 R7-O-(C=O)-CH=CH2 또는 R7-NH-(C=O)-CH=CH2 또는 R7-(C=O)-H를, 하기 화학식 (프리-IV)의 올리고(알킬렌 아민)과 반응시켜 유도될 수 있다:
H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (프리-IV)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n은 화학식 (IV)에서와 같이 정의되고 R2 내지 R6은 서로 독립적으로 수소 또는 아미노기에 대한 보호기이고 R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다. 바람직하게는, R7은 C8-C16 알킬 또는 알케닐, 더욱 바람직하게는 C8-C12 알킬 또는 알케닐이고, C10-C12 알킬 또는 알케닐이 가장 바람직하다. 유리하게는, 일 말단이 에폭사이드, 아크릴레이트, 알데히드의 아크릴아미드로 말단 치환된 다수의 지방족 화합물이 상업적으로 이용가능하다.
바람직하게는, 화학식 (IV)의 리피도이드는 하기 올리고(알킬렌 아민) (프리-IV')로부터 제조된다:
H-NH-{CH2-(CH2)a-NH-[CH2-(CH2)b-NH]p}m-[CH2-(CH2)a-NH]n-H (프리-IV')
더욱 바람직하게는, 화학식 (프리-IV)의 전구체는 4개 이상의 아미노기를 갖는다. 가장 바람직하게는, 화학식 (IV)의 리피도이드는 하기 올리고(알킬렌 아민) (프리-IV")로부터 제조된다:
H-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H (프리-IV")
반응은 50℃ 내지 90℃의 승온에서 용매 존재 또는 부재하에 수행될 수 있다. 적합한 용매는, 예를 들어 CH2Cl2, CH2Cl3, 메탄올, 에탄올, THF, 핵산, 톨루엔, 벤젠 등이다.
하기 화학식 (프리-IV')의 올리고(알킬렌 아민) 내 질소가, 예를 들어 WO2006/138380호에 기술된 바와 같은 직교 보호기를 이용해 제공될 수 있음이 숙련자에게 알려져 있다:
H-NH-{CH2-(CH2)a-NH-[CH2-(CH2)b-NH]p}m-[CH2-(CH2)a-NH]n-H (프리-IV')
이 맥락에서 보호기는 화학식 (프리-IV')의 화합물 내 하나 또는 여러 질소를 일시적으로 차단하기에 적합하여 반응이 동일한 분자 내의 다른, 비-보호된 질소에서 선택적으로 수행될 수 있다. 반응 후, 보호가는 동일한 분자 내의 질소 원자에 연결된 다른 잔기에 영향을 미치지 않는 화학적 반응에 의해 제거된다. 직교 보호기는 소정의 분자 내의 일 유형의 보호기에 특이적으로 영향을 미치는 화학적 반응에 의해 선택적으로 제거될 수 있는 상이한 보호기이다. 예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같이, 화학식 (프리-IV')의 올리고(알킬렌 아민) 내 일차 말단 아미노기는 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 보호기로 선택적으로 보호될 수 있고, 그에 반해 내부 이차 아민은 t-부톡시카보닐 (Boc) 보호기로 보호될 수 있다. Fmoc 기는 염기에 의해, Boc 보호기는 산에 의해 선택적으로 제거될 수 있다. 보호 및 부분적으로 보호된 중간체는 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 따라서, 직교 보호기의 정해진 위치지정 (positioning) 및/또는 선택적 제거 덕분에, 예를 들어 내부 이차 아미노기의 전두 또는 일부 또는 두 원자가의 말단 일차 아미노기 전두 또는 일부를 선택적으로 반응시켜 일측이 에폭사이드 또는 아크릴레이트 또는 아크릴아미드로 말단 치환된 지방족 쇄를 가지는 화학식 (프리-IV')의 올리고(알킬렌 아민)을 제공하는 것이 가능하다. 동일한 원리에 의해 R7-에폭사이드 또는 R7-O-(CO)-CH=CH2 또는 R7-NH-(CO)-CH=CH2 또는 R7-(CO)-H의 단일 종 이상을 커플링하여 말단 에폭사이드, 아크릴레이트, 아크릴아미드 또는 알데하이드에 알킬 또는 알케닐 및 지방족 쇄 길이 면에서 상이한 타입의 잔기 R7로 칭해지는 "종"을 가지는 화학식 (프리-IV')의 올리고(알킬렌 아민)을 제공하는 것이 가능하다. 이러한 반응에서 화학식 (프리-IV')의 올리고(알킬렌 아민)의 유도체화 정도는 당해 분야의 이전 상태에 기술된 바와 같은 반응물의 화학량론에 의해 제어될 수 있다. 보호기의 제거 후, 질소 원자의 잔여 원자가는 구아니디늄기 (-C(NH)-NH2), 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄 또는 수용체 리간드를 부착하는데 사용될 수 있다. 화학식 (IV)의 리피도이드는 침전, 추출 또는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 화학식 (IV)의 리피도이드가 보호기의 도움으로 제어된 단계적 반응에 의해 제어될 수 있고 화학식 (프리-IV')의 올리고(알킬렌 아민)의 유도체화 정도가 반응물의 화학량론에 의해 제어될 수 있다는 선택성에 기초하여, 본 발명의 리피도이드는 일차, 이차, 삼차, 및/또는 사차 아민, 및 이의 염을 포함할 수 있다. 그에 의해, RNA를 결합시키고 조밀화하고 보호하기에 적합한 화학식 (IV)의 양이온성 리피도이드를 제공하기 위해 화학식 (IV) 내 하나 이상의 질소 원자가 양성자화될 수 있도록, 리피도이드의 pKa 값이 또한 유도체화 정도의 합리적인 설계에 의해 조율될 수 있다. 나아가, pKa 값은 화학식 (IV) 내 하나 이상의 질소 원자가 산성 pH에서 완충능을 가질 수 있고 그로써 세포 내로의 세포내이입 흡수 (endocytotic uptake) 시 양성자 스폰지 효과를 발휘할 수 있도록 조율될 수 있다. 바람직하게는, 화학식 (IV)의 리피도이의드 pKa 값은 3.0 내지 9.0이고, 더욱 바람직하게는 적어도 하나의 pKa 값은 5.0 내지 8.0이다.
화학식 (IV)의 리피도이드를 수득하기 위하여 화학식 (프리-IV')의 올리고(알킬렌 아민)에 커플링될 수 있는 지방족 측쇄의 최대 개수는 (p + 1) x m + n + 3이고, 최소 개수는 1이며, 여기서 p, m 및 n은 화학식 (IV)에서와 같이 정의된다. 바람직하게는, 잔기 R1 내지 R6의 어느 하나도 수소 이외의 것 또는 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-C(O)-O-R7, -CH2-CH2-C(O)-NH-R7 또는 -CH2-R7이 아니라면, 지방족 측쇄의 개수는 적어도 2이고, 최대 (p + 1) x m + n + 2이고, 바람직하게는 잔기 R1 내지 R6의 하나가 아미노기에 대한 보호기 또는 -C(NH)-NH2 또는 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄 또는 수용체 리간드라면, 지방족 측쇄의 개수는 최대 (p + 1) x m + n + 1이다.
본 발명에 따라 사용되는 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드의 비-제한적이지만 바람직한 하나의 예시는, 100 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623 mmol)을 575.07 mg의 1,2-에폭시도데칸 (3.12 mmol, (N-1) 당량, 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민) 당 2× 양의 일차 아민 더하기 1× 양의 이차 아민임)과 혼합하고 일정한 진탕 하 80℃에서 96시간 동안 혼합하여 제조된 양이온성 지질이다. 이러한 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는 또한 리피도이드 "C12-(2-3-2)"로도 언급된다. 이 지질 (및 본 발명에 따라 사용되는 다른 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드)의 제조에 대한 추가적인 지침이 본원 및 첨부된 실시예에서 제공된다.
핵산
본 발명의 (약학적) 조성물은 핵산, 바람직하게는 RNA, 더욱 더 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 포함한다.
용어 "핵산"은 자연 발생적인 유형의 핵산뿐만 아니라 화학적 및/또는 효소적으로 합성된 핵산의 모든 형태를 포함하고, 또한 예를 들어, 잠금 (locked) 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA), 올리고뉴클레오시드 티오포스페이트 및 포스포트리에스테르, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 양이온성 올리고뉴클레오티드 (US6017700 A, WO2007/069092), 치환된 리보-올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트와 같은 핵산 유사체 및 핵산 유도체를 포함한다. 나아가, 용어 "핵산"은 또한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 본 발명의 조성물에 포함된 핵산의 서열 또는 크기에 제한은 없다. 핵산은 본 발명의 조성물이 전달되는 생물학적 표적에서 달성되는 생물학적 효과에 의해 주로 정의된다. 예를 들어, 유전자 또는 핵산 요법에 적용하는 경우, 핵산 또는 핵산 서열은 발현되는 유전자 또는 유전자 단편에 의해 또는 결손 유전자 또는 임의의 유전자 표적 서열의 의도된 치환 또는 복구에 의해 또는 억제되고, 녹-다운되거나 하향-조절되는 유전자의 표적 서열에 의해 정의될 수 있다.
바람직하게는, 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 비롯한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. RNA에 관하여, 원칙적으로 임의의 유형의 RNA가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 바람직한 일 실시양태에서 RNA는 단일-가닥 RNA이다. 용어 "단일-가닥 RNA"는 2개 이상의 별개의 쇄가 별개의 쇄의 혼성화에 의해 이중-가닥 분자를 형성하는 RNA 분자와는 달리, 리보뉴클레오티드의 단일의 연속적인 쇄를 의미한다. 용어 "단일-가닥 RNA"는 단일-가닥 분자 자체가 루프, 이차 또는 삼차 구조와 같은 이중-가닥 구조를 형성하는 것을 배제하지 않는다.
용어 "RNA"는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA뿐만 아니라 아미노산 서열을 코딩하지 않는 RNA도 포함한다. 80% 초과의 게놈이 단백질을 코딩하지 않는 기능적 DNA 요소를 포함하는 것으로 제안되었다. 이들 비코딩 서열은 조절성 DNA 요소 (전사 인자, 조절인자 및 공-조절인자 등에 대한 결합 부위) 및 단백질로 전혀 번역되지 않는 전사물을 코딩하는 서열을 포함한다. 게놈에 의해 인코딩되고 RNA로 전사되지만 단백질로는 번역되지 않는 이들 전사물은 비코딩 RNA (ncRNA)로 불린다. 따라서, 일 실시양태에서 RNA는 비코딩 RNA이다. 바람직하게는, 비코딩 RNA는 단일-가닥 분자이다. ncRNA가 유전자 조절, 게놈 완전성의 유지, 세포 분화, 및 발생에 결정적인 역할을 하며, 이들이 다양한 인간 질환에서 잘못 조절되고 있음이 연구에서 입증된다. 다양한 유형의 ncRNA가 있다: 짧은 (20-50 nt), 중간 (50-200 nt), 및 긴 (>200 nt) ncRNA. 짧은 ncRNA에는 마이크로RNA (miRNA), 소 간섭 RNA (siRNA), piwi-상호작용 RNA (piRNA), 및 전사 개시 RNA (tiRNA)가 포함된다. 중간 ncRNA의 예시는 작은 핵 RNA (snRNA), 작은 핵소체 RNA (snoRNA), 전달 RNA (tRNA), 전사 개시-부위-연관 RNA (TSSaRNA), 프로모터-연관 소 RNA (PASR), 및 프로모터 상류 전사체 (PROMPT)이다. 긴 비코딩 RNA (lncRNA)에는 긴-유전자간 비코딩 RNA (lincRNA), 안티센스-lncRNA, 인트론 lncRNA, 전사된 초-보존 (ultra-conserved) RNA (T-UCR), 및 기타가 포함된다 (Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. 2014 Mar 26. doi: 10.1002/cmdc.201300534). 전술한 비코딩 RNA 중에서 유일하게 siRNA만이 이중-가닥이다. 따라서, 바람직한 실시양태에서 비코딩 RNA가 단일-가닥이면, 비코딩 RNA는 siRNA가 아닌 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, RNA는 코딩 RNA, 즉 아미노산 서열을 코딩하는 RNA이다. 이러한 RNA 분자는 또한 mRNA (메신저 RNA)로도 언급되고 단일-가닥 RNA 분자이다. 핵산은 숙련자에게 공지된 합성 화학 및 효소적 방법에 의해 또는 재조합 기술의 사용에 의해 제조될 수 있거나, 또는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 비천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있고 단일 또는 이중 또는 삼중 가닥일 수 있다. "핵산"은 또한 센스 및 안티-센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드, 즉 DNA 및/또는 RNA 내 특정 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
바람직하게는, 용어 핵산은 mRNA를 지칭하고 가장 바람직하게는 변형된 mRNA를 지칭한다.
메신저 RNA (mRNA)는 주로 뉴클레오시드로서 아데노신, 시티딘, 유리딘 및 구아노신을 함유하는 뉴클레오시드 포스페이트 빌딩 블록으로 구성된 폴리머인데, 이는 중간 캐리어로서 유전 정보를 세포 핵 중에 있는 DNA로부터 단백질 번역이 일어나는 세포질로 전달한다. 따라서, 상기 메신저 RNA는 유전자 발현을 위한 대안으로서 적합하다.
본 발명의 맥락에서, mRNA는 이것이 세포 내에 도입되는 경우, 단백질 또는 그의 단편을 발현하는데 적합하거나, 단백질 또는 그의 단편으로 번역될 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 용어 "단백질"은 임의의 종류의 아미노산 서열, 즉 2종 이상의 아미노산 각각이 펩티드 결합을 통해 연결되어 있는 쇄를 함유하며, 이는 또한 펩티드 및 융합 단백질을 포함한다.
mRNA는, 세포에서 또는 세포 주변에서 그의 기능이 요구되거나 유익한 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 그의 결여 또는 결손 형태가 질환 또는 질병에 대한 촉발제이거나, 그의 제공이 질환 또는 질병을 완화 또는 예방할 수 있는 단백질, 또는 세포에서 또는 세포 주변에서 신체에 유익한 과정을 촉진시킬 수 있는 단백질을 인코딩하는 리보뉴클레오티드 서열을 함유한다. mRNA는 완전 단백질 또는 이의 기능성 변이체에 대한 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 리보뉴클레오티드 서열은 인자, 유도제, 조절인자, 자극인자 또는 효소로서 작용하는 단백질, 또는 이의 기능성 단편을 코딩할 수 있는데, 여기서 이 단백질은 그의 기능이 장애, 특히 대사 장애를 치료하는데, 또는 예를 들어, 새로운 혈관, 조직의 형성 등과 같은 생체 내 과정을 개시하는데 필요하다. 여기서, 기능성 변이체는 세포에서 그의 기능이 요구되거나, 그의 결여 또는 결손 형태가 병적인 것인 단백질의 기능을 세포에서 시행할 수 있는 단편을 의미하는 것으로서 이해되어야 한다. 나아가, mRNA는 또한 기능성 영역 및/또는 3' 또는 5' 비코딩 영역을 추가로 가질 수 있다. 3' 및/또는 5' 비코딩 영역은 단백질 코딩 서열의 측면에 자연적으로 위치하는 영역 또는 RNA의 안정화에 기여하는 인공 서열일 수 있다. 숙련자는 각 경우에서 통상의 실험에 의해 이에 적합한 서열을 결정할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, mRNA는 특히 번역을 개선하기 위해 m7GpppG 캡, 내부 리보좀 진입 부위 (IRES) 및/또는 3' 말단에 폴리A 테일을 함유한다. mRNA는 번역을 촉진하는 추가 영역을 가질 수 있다.
바람직한 실시양태에서, mRNA는 변형 및 비변형된 뉴클레오티드의 조합을 함유하는 mRNA이다. 바람직하게는 이는 WO2011/012316호에 기술된 바와 같은 변형 및 비변형된 뉴클레오티드의 조합을 함유하는 mRNA이다. 이러한 mRNA가 또한 알려져 있고 "SNIM®-RNA"으로 상업화되어 있다. WO2011/012316호에 기술된 mRNA는 증가된 안정성 및 감소된 면역원성을 나타내는 것으로 보고되었다. 바람직한 실시양태에서, 이와 같이 변형된 mRNA에서 5 내지 50%의 시티딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%의 유리딘 뉴클레오티드가 변형된다. 아데노신- 및 구아노신-함유 뉴클레오티드는 비변형될 수 있다. 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 비변형되거나 또는 부분적으로 변형될 수 있으며, 바람직하게는 비변형된 형태로 존재한다. 바람직하게는 10 내지 35%의 시티딘 및 유리딘 뉴클레오티드가 변형되고, 특히 바람직하게는 변형 시티딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25%의 범위이고, 변형된 유리딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25%의 범위이다. 실제로 상대적으로 낮은 함량, 예를 들어 각각 단지 10%의 변형된 시티딘 및 유리딘 뉴클레오티드만이 원하는 특성을 달성할 수 있는 것으로 나타났다. 변형된 시티딘 뉴클레오티드가 5-메틸시티딘 잔기이고, 변형된 유리딘 뉴클레오티드가 2-티오유리딘 잔기인 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직하게는, 변형된 시티딘 뉴클레오티드의 함량 및 변형된 유리딘 뉴클레오티드의 함량은 각각 25%이다.
다른 바람직한 실시양태에서, mRNA는 오직 관련 세포에서만 원하는 mRNA의 활성을 허용하기 위해 표적 결합 부위, 표적화 서열 및/또는 마이크로-RNA 결합 부위와 조합될 수 있다. 추가의 실시양태에서, RNA는 3' 폴리A 테일 하류의 마이크로-RNA 또는 shRNA와 조합될 수 있다.
또한, 용어 "핵산(들)"은 DNA 또는 RNA 또는 그의 하이브리드 또는 당 기술 분야에 알려진 임의의 그의 변형을 지칭할 수 있다 (예를 들어, US 8278036, WO 2013/052523, WO 2011/012316, US 5525711, US 4711955, US 5792608 또는 EP 302175, 예를 들어 (Lorenz et al. 2004, Bioorg Med Chem Lett, 14, 4975-4977; Soutschek et al. 2004, Nature, 432, 173-178)의 변형 참조). 이러한 핵산 분자(들)은 단일- 또는 이중가닥, 선형 또는 원형, 천연 또는 합성일 수 있고, 어떤 크기 제한도 없다. 예를 들어, 핵산 분자(들)은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 또는 소 간섭 RNA (siRNA), 마이크로 RNA, 안타고미르 (antagomir) 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), tRNA 또는 긴 이중가닥 RNA 또는 이러한 RNA를 코딩하는 DNA 작제물 또는 키메라플라스트 (chimeraplast)(Colestrauss et al. 1996, Science, 273, 1386-1389), 또는 앱타머, 규칙적으로 공간 배치된 짧은 클러스터 회문성 반복체 (RNA-유도 부위-특이적 DNA 절단에 대한 "CRISPR")(Cong et al. 2013, Science, 339, 819-823), 또는 RNA 및 DNA일 수 있다. 상기 핵산 분자(들)은 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 바이러스 DNA 또는 RNA, 박테리오파지 DNA, 코딩 및 비코딩 단일가닥 (mRNA) 또는 이중가닥 RNA 및 올리고뉴클레오티드(들)의 형태일 수 있고, 여기서 상기에 기술된 바와 같고 3'- 또는 5'-변형된 당 골격 및/또는 염기에서의 임의의 당 기술분야의 변형이 포함된다. 특히 바람직한 실시양태에서 핵산은 RNA, 더욱 바람직하게는 mRNA 또는 siRNA, 더욱 더 바람직하게는 mRNA이다.
핵산(들)은 표적 세포에서 발현되는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 숙련자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 제조합 핵산 분자를 작제할 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재된 기술 참조.
바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 치료 또는 예방 효과를 가질 수 있는 숙련자에게 공지되고 상기에 언급된 모든 핵산 유형 및 변형을 포함하는 치료학적 또는 약학적으로 활성인 핵산이다. 따라서, 상기 핵산은 유전자 요법 및 관련 적용에 사용될 수 있다. 이 맥락에서, 본 발명에 따르면, RNA는 보통 사용되는 DNA (예를 들어, pDNA) 대신에 사용될 수 있다. 일반적으로, 치료 또는 예방 효과는 핵산과 세포 분자 및 소기관의 상호작용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 상호작용은 단독으로 예를 들어, 톨-유사 및 다른 세포 외 또는 세포 내 수용체와 특이적으로 반응하도록 설계된 특정 CpG 올리고뉴클레오티드 및 서열의 경우와 같이, 선천적인 면역계를 활성화할 수 있다. 나아가, 세포 내 핵산의 흡수 또는 도입은 핵산에 포함된 유전자와 같은 뉴클레오티드 서열의 발현을 초래하도록 의도될 수 있거나, 도입된 외인성 핵산의 세포 내 존재의 결과로서 내인성 유전자 발현의 하향조절, 침묵 (silencing) 또는 녹다운이 의도될 수 있거나, 또는 선택된 염기의 수리, 제거, 삽입 또는 교환 또는 내재성 핵산 서열의 전체 신축 (stretches)과 같은 내재성 핵산 서열의 변형이 의도될 수 있거나, 또는 도입된 외인성 핵산의 세포 내 존재 및 상호작용의 결과로 실질적으로 임의의 세포 과정의 방해가 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현은, 몇 가지 예를 들자면 낭포성 섬유증, 혈우병 또는 근육 위축병과 같은 다수의 대사 및 유전적 질병에서와 같이, 특히 내인성 유전자가 결함이거나 또는 침묵하여 유전자 발현의 불충분하거나, 결함이 있거나 또는 기능이상의 생성물을 초래하는 경우, 내인성 유전자 발현을 보상 또는 보완하도록 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현은 또한 유전자 발현, 신호 전달 및 다른 세포 과정의 조절과 같은 임의의 내인성 세포 과정과 상호작용하거나 이를 간섭하는 발현 생성물을 가지도록 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현은 또한 형질감염 또는 형질도입된 세포가 거주하거나 또는 거주하게 되는 유기체의 맥락에서 면역 반응을 일으키도록 의도될 수 있다. 그 예는 이들이 예방접종 목적의 항원을 제시하도록 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포의 유전적 변형이다. 다른 예는 종양-특이적 면역 반응을 유도하기 위한 종양 내 사이토카인의 과발현이다. 나아가, 도입된 외인성 핵산의 과발현은 또한 재생 의약을 위해 변형된 T-세포 또는 전구체 또는 줄기 또는 다른 세포와 같은 세포 요법을 위해 생체 내 또는 생체 외에서 일시적으로 유전적으로 변형된 세포를 생성하도록 의도될 수 있다.
치료적 목적상, 내인성 유전자 발현의 하향조절, 침묵 또는 녹다운은 예를 들어, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드, tRNA, 긴 이중가닥 RNA를 이용하여 RNA 간섭 (RNAi)에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 하향조절은 서열-특이적 또는 비특이적일 수 있고, 또한 긴 이중가닥 RNA가 세포 내로 도입되는 경우에는 세포사를 초래할 수 있다. 내인성 또는 이미-존재하는 유전자 발현의 하향조절, 침묵 또는 녹다운은 바이러스 감염 및 암을 비롯한 후천성, 유전성 또는 자발적 유발 질병의 치료에 유용할 수 있다. 세포 내로의 핵산 도입은, 예를 들어 바이러스 감염 또는 신생물을 예방하기 위한 예방적 조치로서 실시될 수 있음이 또한 구상될 수 있다. 내인성 유전자 발현의 하향조절, 침묵 또는 녹다운은 전사 수준 및 번역 수준에서 발휘될 수 있다. 여러 메카니즘이 숙련자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 도입된 핵산에 의한 후생적 변형, 염색질 구조의 변경, 전사 인자의 선택적 결합, 삼중 나선 형성과 같은 통상적이지 않은 염기 짝짓기 메카니즘을 포함하는 염기 짝짓기에 의한 게놈 DNA, mRNA 또는 기타 RNA 종에서 상보성 서열에 대한 도입된 핵산의 혼성화를 포함한다. 유사하게, 유전자 복구, 염기 또는 서열 변화는 게놈 수준에서, 그리고 엑손 스키핑 (exon skipping)을 포함하는 mRNA의 수준에서 달성될 수 있다. 염기 또는 서열 변화는, 예를 들어 트랜스-스플라이싱, 트랜스-스플라이싱 리보자임, 키메라플라스트, 스플리코좀-매개 (splicosome-mediated) RNA 트랜스-스플라이싱을 이용하거나, 또는 그룹 II 또는 재표적 인트론을 이용하거나, 또는 바이러스에 의해 매개된 삽입 돌연변이화를 이용하거나, 또는 진핵, 원핵, 또는 바이러스 인테그라제 시스템을 사용하는 표적화된 게놈 삽입을 이용한 잘라 붙이기 (cut and paste) 메카니즘에 의해 RNA-유도 부위-특이적 DNA 절단으로 달성될 수 있다. 핵산은 생물계의 건축 계획의 매개체이고 직접 및 간접적인 방식으로 다수의 세포 과정에 참여하기 때문에, 이론상 임의의 세포 과정이 외부로부터 세포 내로의 핵산 도입에 의해 영향을 받을 수 있다. 특히, 이러한 도입은 세포 또는 장기 배양 시 생체 내 및 생체 외에서 직접 수행되고, 이어서 수용체 내로 변형된 장기이나 세포가 이식될 수 있다. 활성제로서 핵산을 가지는 본 발명의 복합체는 상기에 기술된 모든 목적상 유용할 수 있다.
조성물 또는 각각의 약학적 조성물 (조성물을 포함함)
상기에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물 및 각각의 약학적 조성물은 핵산, 및 예를 들어 PEI 또는 하기로부터 선택되는 성분인 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 성분과 같은 양이온제를 포함한다:
a) 측쇄 및/또는 말단기로서 다수의 화학식 (II)의 기를 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
Figure pct00027
(II)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은 바람직한 실시양태, 특히 화학식 (IIa) 내지 (IId)의 바람직한 기를 포함하여, 상기와 같이 정의되고; 화학식 (II)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 화학식 (II)의 양이온성 기를 제공할 수 있고;
b) 반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 기를 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
Figure pct00028
(III)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는 바람직한 실시양태, 특히 화학식 (IIIa) 내지 (IIId)의 바람직한 기를 포함하여, 상기와 같이 정의되고; 화학식 (III)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 화학식 (III)의 양이온성 기를 제공할 수 있고; 또는
c) 화학식 (IV)의 구조를 갖는 리피도이드:
Figure pct00029
(IV)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 바람직한 실시양태, 특히 화학식 (IVa) 내지 (IVd)의 바람직한 기를 포함하여, 상기와 같이 정의되고; 화학식 (IV)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 화학식 (IV)의 양이온성 기를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA, 및 그의 바람직한 실시양태를 포함하여 본원에 정의된 바와 같은 성분 a) 내지 c)로부터 선택되는 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 성분 또는 PEI와 같은 양이온제로 구성된 (또는 포함하는) (약학적) 조성물을 포함한다. (약학적) 조성물은 또한 추가의 성분, 예를 들어 지질 제형화를 위한 성분 및/또는 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA가 세포 및/또는 조직(들) 내로 전달되는 동안 이펙터 기능을 발휘할 수 있는 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 (약학적) 조성물이 일반적으로 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA와 PEI 또는 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 같은 양이온제 및 적용 동안, 예를 들어 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 소정 경로를 통한 전달 동안 생물학적 표적 또는 생물학적 표적의 주변에 도달할 때까지 상기 성분의 상당한 부분의 조합을 유지하기에 충분히 안정한, 유한 실체로 조합되는 선택적 추가 성분의 조합체를 제공하는 것이 이해될 것이다.
본 발명에 따른 PEI 또는 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 같은 양이온제 내 양성자화 가능한 아미노기의 존재로 인해, 이들 양이온제는 (예를 들어, 화학식 (II) 또는 (III)의 기 내 또는 화학식 (IV)의 구조 내에) 양이온성 전하를 포함할 수 있고, 그로써 이들은, 예를 들어 물 또는 수용액 중에서 양성자의 존재하에, 또는 양성자 공여 산의 존재하에 양이온, 전형적으로 다수의 양이온성 모이어티를 함유하는 올리고- 또는 폴리양이온을 형성한다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명에 따른 (약학적) 조성물은 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA와 본 발명에 따른 양이온제의 복합체를 함유하거나 이로 구성된다. 다시 말하면, 본 발명의 문맥 내에서 사용되는 RNA 및 양이온제는 복합체를 형성할 수 있다. 양이온제 및 음이온성 핵산이 일반적으로 이러한 복합체에서 정전기적 상호작용을 통해 조합됨이 이해될 것이다. 그러나, 제제 및 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 특이적 구조에 따라, 수소 결합 및 공유 결합을 비롯한 다른 유인적 상호작용이 복합체를 안정화시키는데 또한 참여할 수 있다. 본 발명에 따른 복합체의 비-제한적인 예시는 리포좀 또는 리포플렉스이거나 그에 포함된다. 각각의 양이온제는 양이온성 리피도이드 또는 지질일 수 있다.
특정 측면에서, 예를 들어 리포좀 또는 리포플렉스와 같은 복합체 형태의 RNA 및 양이온제는 NP이거나 (NP로 제제화되거나) 또는 NP 내에 포함될 수 있다. 이러한 NP는 하나 이상의 "헬퍼 지질", 예를 들어 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 하나 이상의 헬퍼 지질과 같은 추가의 성분(들)을 추가로 포함할 수 있다. NP는 약 1-1000 nm, 바람직하게는 약 5-900 nm의 직경을 갖는 입자이다.
또 다른 특정 측면에서, 예를 들어 리포좀 또는 리포플렉스와 같은 복합체 형태의 RNA 및 양이온제는 MP (미소구체로도 명명됨)로 제제화되거나 MP 내에 포함될 수 있다. 이러한 MP는 폴리락타이드 산을 (추가로) 포함하거나 폴리락타이드 산 MP일 수 있다. 본 발명에 따른 폴리락타이드 산의 비-제한적이지만 바람직한 예시는 폴리(락틱-co-글리콜산) (PLGA)이다. 바람직하지만 비-제한적인 MP는 MP로 제제화된 RNA, 양이온제 및 폴리락타이드 산 (예를 들어, PLGA)이다. 더욱 특정한 측면에서, 본원에 정의된 바와 같은 NP는 본원에 정의된 바와 같은 MP 내에 포함된다. 유사한 접근법이 DNA의 경구 투여를 위해 알려져 있으며 "나노입자-중-미소구체 경구 시스템" (NiMOS; Bhavsar 상기에 인용됨)으로 명명된다. 원칙적으로, NiMOS가 또한 본 발명의 맥락에서 적용될 수 있지만, 그러나, DNA 대신에 RNA가 그 후에 이용될 것이다. MP는 약 1-1000 μm, 바람직하게는 2-1000 μm의 직경을 갖는 입자이다.
숙련자는 본 발명에 따라서 복합체, NP 및 MP를 용이하게 생산하고 제제화할 수 있다. 이 맥락에서, 숙련자는 본원에 기술된 수단 및 방법 및 첨부된 실시예에 의존할 수 있다. 더욱이, 숙련자는 위의 인용문헌 중에서 Bhavsar에 의존할 수 있다. 예를 들어, NP는 양이온제와 RNA (및 선택적으로 하나 이상의 헬퍼 지질)의 혼합 시에 생산되고/제제화될 수 있다. 각각의 비율의 예시가 본원의 다른 곳에 기술된다. 마찬가지로, MP는 양이온제와 RNA (및 선택적으로 하나 이상의 헬퍼 지질), 또는 이를 포함하는 NP와 MP 재료 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 폴리락타이드 산)의 혼합 시에 생산되고/제제화될 수 있다. 각각의 비율의 예시가 마찬가지로 본원의 다른 곳에 기술된다.
본 발명의 (약학적) 조성물에, 양이온제 및 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA는, 예를 들어, 0.25/1 내지 50/1, 바람직하게는 0.5/1 내지 30/1, 더욱 바람직하게는 1/1 내지 20/1의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 중량/ 핵산 중량의 비 (w/w)로 함유될 수 있다.
더욱 바람직하게는, (약학적) 조성물이 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA와 본 발명에 따른 양이온제를 함유하는 경우, 본 발명의 (약학적) 조성물 중의 제제 및 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 상대적 비는 상호 전하 중화도를 고려하여 선택될 수 있다. 양이온제와 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 복합체를 이용한 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 전달에서, 일반적으로 적어도 RNA 음전하의 전하 중화, 바람직하게는 RNA 음전하의 과잉 보상을 초래하는 양의 양이온제가 주어진 양의 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA와 혼합된다.
양이온제와 RNA 사이의 적합한 비는 겔 지체 분석법, 형광 소광법, 예컨대 에티듐 브로마이드 변위/소광 분석, 입도 측정 및 제타 전위 측정에 의해 용이하게 측정할 수 있다. 양이온제와 RNA 사이의 유용한 비는 일반적으로 아가로스 겔에서 전기이동에 적용되는 경우 양이온제와의 복합체에 포함된 RNA의 적어도 부분적 지체, 바람직하게는 완전 지체에 의해, 또는 RNA에 층간삽입되는 (intercalated) 경우 에티듐 브로마이드, RiboGreen 또는 YOYO와 같은 염료의 고도의 형광 소광에 의해, 또는 제제와 RNA의 혼합 시 (나노)입자의 형성에 의해 특정된다. 화학적으로 잘-정의된 양이온의 경우, 산출된 N/P 비는 제제와 RNA의 상대적 비를 선택하고 정의하는데 적합한 인자이다. 예를 들어, N/P 비는 본 발명의 (약학적) 조성물 내 RNA의 포스페이트 기에 대한 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드의 화학식 (II)의 기 (또는 이의 바람직한 실시양태), 화학식 (III)의 기 (또는 이의 바람직한 실시양태) 또는 화학식 (IV)의 구조 (또는 이의 바람직한 실시양태)에서 양성자화 가능한 질소 원자의 몰비를 가리킨다. N/P 비는 RNA와 양이온성 비히클의 이러한 복합체의 특성화를 위해 확립된 파라미터이며, 숙련자라면, 예를 들어 아미드 결합 내 질소 원자가 양성자화 가능한 질소 원자로서 간주되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 양이온성 올리고머 또는 폴리머의 경우, N/P 비는 편의상 예를 들어 하기 식에 따라 계산될 수 있다:
Figure pct00030
상기 식에서, wp는 올리고머 또는 폴리머의 중량이고, n은 반복 단위당 양성자화 가능한 아미노기의 개수이고, Mwp는 반복 단위 (반대 이온 포함)의 분자량이고, wna는 RNA의 중량이고, M염기는 RNA 중 뉴클레오티드의 평균 분자량 (RNA의 경우 346)이다. 본 발명에 따른 RNA 전달을 위한 이원성 폴리양이온/RNA 복합체에서, 최종 이원성 (약학적) 조성물의 제타 전위가 양이 되도록 N/P 비를 제공하는 양이온제 대 RNA의 상대적인 양이 바람직하게는 사용되어야 한다. 화학식 (IV)의 리피도이드 및 RNA를 포함하는 (약학적) 조성물의 경우, N/P 비는 편의상 리피도이드 내 양성자화 가능한 질소 원자의 수와 조성물에 사용된 리피도이드의 몰수를 고려하여 계산될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 이원성 (약학적) 조성물에서, 1 내지 100의 N/P 비가 바람직하고, 3 내지 60의 N/P 비가 더욱 바람직하며, 4 내지 44의 N/P 비가 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 (약학적) 조성물은 지질 제제화를 위한 추가의 성분을 선택적으로 포함한다. 예를 들어, 화학식 (IV)의 리피도이드 또는 화학식 (IVa) 내지 (IVc)를 비롯한 이의 바람직한 실시양태를 포함하는 (약학적) 조성물은 과학 문헌에서 "헬퍼 지질"로 지칭되는 콜레스테롤, DOPE, DOPC, DSPC, DPPC, DPG (예를 들어, DPG-PEG 2k와 같은 DPG-PEG) 또는 DMG (예를 들어, DMG-PEG200) 및/또는 페길화 (PEGylated) 지질 (예를 들어, DMG-PEG200, DMG-PEG) 또는 리포플렉스의 제조에 유용한 임의의 기타 지질과 같은 추가의 지질을 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 바람직한 헬퍼 지질은 DSPC, DPPC, 콜레스테롤, DMG (예를 들어, DMG-PEG200) 및 DPG (예를 들어, DPG-PEG 2k와 같은 DPG-PEG)이다. 특정 실시양태에서, 리피도이드를 함유하는 조성물은 약 40-60%의 리피도이드, 약 40-60%의 콜레스테롤, 및 약 5-20%의 PEG-지질 (조성물의 총 중량에 기반한 중량 퍼센트)이다. 특정 실시양태에서, 리피도이드를 함유하는 조성물은 약 50-60%의 리피도이드, 약 40-50%의 콜레스테롤, 및 약 5-10%의 PEG-지질 (조성물의 총 중량에 기반한 중량 퍼센트)이다. 특정 실시양태에서, 리피도이드를 함유하는 조성물은 약 50-75%의 리피도이드, 약 20-40%의 콜레스테롤, 및 약 1-10%의 PEG-지질이다. 특정 실시양태에서, 리피도이드를 함유하는 조성물은 약 60-70%의 리피도이드, 약 25-35%의 콜레스테롤, 및 약 5-10%의 PEG-지질이다. 조성물은 [예를 들면 문헌 (Akinc et al, 2007, Nat Biotech, 26, 561-569; Akinc et al, 2009, Mol Ther, 17, 872-9; Love et al, 2010, PNAS, 107, 1864-9; US 8,450,298, WO2006/138380)에 기술된 바와 같이) 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 제공될 수 있다. RNA/리피도이드 복합체는 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 세포 내로 전달하는데 유용한 입자를 형성할 수 있다. 다수의 리피도이드 분자가 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA 분자와 조합될 수 있다. 예를 들어, 복합체는 1-100개의 리피도이드 분자, 1-1,000개의 리피도이드 분자, 10-1,000개의 리피도이드 분자, 또는 100-10,000개의 리피도이드 분자를 포함할 수 있다. (m)RNA 및 리피도이드의 복합체는 입자를 형성할 수 있다. 입자의 직경은 예컨대, 10-1,200 nm, 더욱 바람직하게는 10-500 nm, 및 가장 바람직하게는 20-150 nm의 범위일 수 있다.
본 발명의 조성물은 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA가 세포에 및 그 내로 전달되는 동안 이펙터 기능을 발휘하는 성분을 선택적으로 포함한다. 이러한 성분은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 폴리음이온, 상기에 기재된 바와 같은 지질, 본원의 다른 곳에 구체적으로 정의된 바와 같은 양이온성 펩티드를 포함하는 사용된 양이온제 이외의 폴리양이온, 차폐 올리고머 또는 폴리머, 폴록사머 (플루로닉으로도 알려짐), 폴록사민, 표적 리간드, 엔도좀분해제 (endosomolytic agent), 세포 투과 및 신호 펩티드, 자성 및 비-자성 나노입자, RNAse 저해제, 형광 염료, 방사성 동위원소 또는 의료 영상화를 위한 조영제일 수 있다. 용어 "이펙터 기능"은 생물학적 표적에서 또는 그 내에서 또는 생물학적 표적의 주변에서 조성물의 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 의도된 생물학적 효과의 달성을 지원하는 임의의 기능을 포함한다. 예를 들어, 핵산 전달용 조성물은 스터퍼 (stuffer) 물질로서 비코딩 핵산 또는 비-핵산 폴리음이온을 포함하도록 제제화된다 (Kichler et al. 2005, J Gene Med, 7, 1459-1467). 이러한 스터퍼 물질은 의도된 생물학적 효과를 가지는 핵산의 용량을 감소시키는 한편, 이러한 스터퍼 물질의 부재 시 더 높은 핵산 용량에서 수득되는 효과의 범위 또는 정도를 유지하는데 적합하다. 비-핵산 폴리음이온이 또한 감소된 독성으로 연장된 생체 내 유전자 발현을 수득하기 위해 사용되고 있다 (Uchida et al. 2011, J Control Release, 155, 296-302). 본 발명의 조성물은 또한 리포폴리플렉스의 경우에서와 같이 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질을 포함할 수도 있다 (Li and Huang in "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Chapter 13, 295-303). 리포폴리플렉스는 본 발명의 화학식 (IV)에 상응하는 리피도이드와 함께 PEI, 특히 brPEI, 또는 본 발명의 화학식 (II) 및 (III)에 상응하는 폴리머로부터 유리하게 제조될 수 있다. 나아가, 본 발명의 조성물은 본 발명의 맥락에서 기술된 양이온제 이외의 올리고- 또는 폴리양이온을 포함할 수 있다. 이러한 추가의 폴리양이온은 목적하는 핵산 조밀도를 달성하는데 유용할 수 있거나, 폴리양이온성 펩티드 경우에는 앞서 기술된 바와 같은 핵 편재화 신호 기능을 가질 수 있다 (Ritter et al. 2003, J Mol Med, 81, 708-717). 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)과 같은 차폐 폴리머가 또한 본 발명의 조성물에 포함될 수 있고, 이들은 응집 및/또는 생물학적 환경에서의 원치않는 상호작용 (옵소닌화), 예를 들어 혈청 성분, 혈액 세포 또는 세포외 기질과의 상호작용에 대해 폴리플렉스 및 리포플렉스를 안정화시키기 위해 빈번히 사용된다. 차폐는 또한 핵산을 포함하는 조성물의 독성을 감소시키는데 적합할 수 있다 (Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). PEG와 같은 차폐 폴리머는 본 발명의 폴리머 또는 리피도이드에 직접 공유적으로 결합할 수 있다. 커플링은 폴리머 골격에서, 바람직하게는, 가능하다면 폴리머 골격 또는 덴드리머의 말단 단부에서 이뤄질 수 있다. 그러나, 커플링은 또한 화학식 (II), (III) 및 (IV)의 아미노기에 대해 행해질 수도 있다.
PVP 및 폴록사머와 같은 폴리비닐 유도체는 근육 내 주사 시에 형질감염을 향상시키는데 유용한 것으로 입증되었고 (Mumper et al. 1996, Pharm Res, 13, 701-709, Lemieux et al. 2000, Gene Ther, 7, 986-991), 따라서 본 발명의 조성물에 포함되기에 유용할 수 있다.
핵산 전달용 조성물에 포함된 항체를 포함하는 표적 리간드는 표적 세포의 우선적이고 개선된 형질감염에 유용하다 (Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009). 표적 리간드는 본 발명의 조성물에 직접 또는 간접적인 방식으로 표적 인식 및/또는 표적 결합 기능을 부여하는 임의의 화합물일 수 있다. 가장 일반적인 용어로, 표적은 표적 리간드가 분자 상호작용을 통해 특이적으로 결합할 수 있는 별개의 생물학적 구조로서, 이러한 결합은 궁극적으로 표적 조직 내 및/또는 표적 세포에서 또는 그 내에서 조성물에 포함된 핵산의 우선적인 축적을 초래할 것이다. PEG 쇄와 마찬가지로, 표적 리간드는 폴리머 골격 또는 덴드리머의 말단에 결합될 수 있다. 그러나, 커플링은 또한 화학식 (II), (III) 및 (IV)의 기에 대해 달성될 수도 있다.
또한, 엔도좀분해제, 예컨대 엔도좀 분해성 펩티드 (Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35) 또는 세포내이입 (endocytosed) 핵산의 엔도좀 방출을 증강시키는데 적합한 임의의 다른 화합물이 본 발명의 조성물의 유용한 성분이다. 유사하게, 세포 투과 펩티드 (다른 맥락에서는 단백질 형질도입 도메인으로도 알려짐) (Lindgren et al. 2000, Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103)가 핵산의 세포 내 전달을 매개하기 위하여 본 발명의 조성물의 유용한 성분일 수 있다. 소위 TAT 펩티드가 이 분류에 속하며 핵 국재화 기능도 갖는다 (Rudolph et al. 2003, J Biol Chem, 278, 11411-11418).
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 자기 나노입자는 자기력에 의한 전달의 물리적 표적화와 자기주입법 (Magnetofection)으로도 알려진 메커니즘인 핵산 전달의 급격한 효율 증강에 유용하다 (EP1297169; Plank et al. 2011, Adv Drug Deliv Rev, 63, 1300-1331). 유사하게, 본 발명의 조성물은 또한 초음파 및 임의의 자기장 적용을 통한 핵산 전달의 물리적 증강과 표적화에 사용된 비자기성 또는 자기성 미세기포 (microbubble)일 수 있다 (Holzbach et al. 2010, J Cell Mol Med, 14, 587-599, Vlaskou et al. 2010, Adv Funct Mater, 20, 3881-3894). 양자점 (Quantum dots) (Zintchenko et al. 2009, Mol Ther, 17, 1849-1856), 방사성 추적자 및 의료 영상용 조영제는 핵산 전달을 추적하고 핵산 전달용 조성물의 생체분포를 결정하는데 유리하게 사용될 수 있다. 요컨대, 핵산 전달을 위한 다양한 이펙터가 기술되고 있으며, 이는 본 발명에 따른 핵산 및 양이온제를 포함하는 조성물에서 유용한 성분일 수 있다.
본 발명에 따른 (약학적) 조성물에 포함된 각 성분 물질의 양과 관련하여 상당한 수준의 융통성이 존재하는 것이 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 소위 단일분자 이성분 (binary) 폴리플렉스는 조성물이 폴리양이온의 혼합 시 형성된 나노입자로 이루어지는 플라스미드 DNA 및 단일 플라스미드 DNA 분자를 정확히 포함하는 플라스미드 DNA에 대해, 그리고 전하 중화 또는 전하 과잉보상 (음전하를 초과하는 양전하)에 필요한 많은 폴리양이온 분자로서 기술되었다 (DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10): 4548-54). 형질감염에 종종 사용되는 N/P 비의 PEI-DNA 복합체의 경우에, 형광 상관 분광학에 의해 이들이 평균적으로 3.5 (+/-1) DNA 플라스미드 분자 및 30 PEI 분자를 함유하는 반면, 복합체의 제조에 사용된 약 86%의 PEI 분자가 유리 형태로 있는 것이 확인되었다 (Clamme et al. 2003, Biophys J 84,1960-1968). 다른 극단으로, 추정상 다수 (10 내지 100개)의 성분 분자를 포함하는, PEI와 플라스미드 DNA의 응집 복합체가 작은 별개의 PEI-DNA 나노입자보다 형질감염을 더 우수하게 수행하였음을 확인하였다 (Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433; Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21). 따라서, 본 발명에 따른 (약학적) 조성물은 소수의 RNA, 바람직하게 mRNA 분자와 같은 단일-가닥 RNA 를 포함하는 (나노 및/또는 마이크로)입자이거나 이를 포함할 수 있지만, 또한 엄청난 수의 RNA, 바람직하게 mRNA 분자와 같은 단일-가닥 RNA를 포함하는 침전물 또는 건조 분말과 같은 거시적 대상이거나 이를 포함할 수 있다. 요컨대, 본 발명의 조성물은 자가-조립 전 이들 성분의 투입비를 특징으로 한다. RNA, 바람직하게 mRNA 성분과 같은 단일-가닥 RNA에 대한 개별 성분의 전형적인 투입 w/w 비는 1 내지 50이다. N/P 비는 양이온제가 화학적으로 잘 정의된 경우에 이성분 양이온제 조성물에 대한 투입비의 적합한 기준이 된다. 본 발명의 조성물이 추가 성분을 포함하는 경우, N/P 비의 결정이 모호해질 수 있다. 이 경우, 적합한 투입비는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 겔 지체 분석, 형광 소광 분석, 예컨대 브롬화 에티듐 변위/소광 분석을 비롯한 실험에 의해, 입자 분립화 (sizing) 및 제타 전위 측정에 의해, 그리고 본원에 기술된 형질감염 어세이와 같은 기능성 어세이에 의해 결정된다. 추가의 폴리음이온 또는 차폐 폴리머를 포함하는 3성분 복합체의 경우에, 순전하 비율 (양전하 나누기 음전하)은 1 미만이고 제타 전위는 중성이거나 음성일 수 있다.
본 발명의 (약학적) 조성물은 하기에 기술된 바와 같이 생산될 수 있다. 자가-조립 공정 후에 본 발명의 조성물은 임의의 비-혼입된 성분으로부터 분리될 수 있고, 동일 단계에서 현탁 매질을 원심분리 또는 한외여과 또는 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석 또는 임의의 관련 방법으로 교체할 수 있다. 정제 또는 미정제된 본 발명의 조성물 성분의 화학양론은 UV/VIS 분광광도법 또는 형광 상관 분광학 (DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10): 4548-54)과 같은 분광분석 방법, 개별 성분의 직교 형광 또는 방사성 동위원소 표지, NMR 및 IR 분광학 또는 크로마토그래피 분석 및 조성물의 분해 (disassembly)시 정량을 포함하는 다양한 분석 방법으로 측정할 수 있다. 분해는, 예를 들어 과량의 폴리음이온, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 헤파린 또는 콘드로이틴 설페이트의 첨가 또는 소듐 도데실설페이트의 첨가에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 (약학적) 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. PEI 또는 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 같은 양이온제는 본원에 기술된 바와 같이 제조 및 정제할 수 있다. 이들은 수용액 중에 또는 건조 분말로 보관할 수 있으며, 이 경우 조성물을 제조하기 전에 수성 매질, 바람직하게는 물에 재용해된다. 용액의 pH는 필요에 따라 산, 바람직하게 염산 또는 시트르산으로 중성 또는 약산성 (pH 4.5 이하)으로 조절된다. RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA가 조성물에 포함되는 핵산인 경우에, pH는 약 4.5 내지 5.5, 바람직하게 약 4.9 내지 5.1, 더욱 바람직하게 약 5.0으로 조절하는 것이 바람직하다. 핵산은 숙련자에게 잘 알려진 당해 분야의 수준에 따라 생산 및 정제된다. 핵산은 수성 매질, 바람직하게 물 중의 용액으로 제공된다. 선택적으로, 양이온제 또는 핵산 중 하나 또는 둘 모두는 표적 리간드, 시그널 펩티드, 세포 투과 펩티드, 엔도좀 분해성 물질 또는 차폐 폴리머와 같은 이펙터 분자와 화학적으로 결합한다. 그러나, 이펙터 분자의 화학적 성질에 따라 이들은 화학적 결합에 의해 부착될 필요 없이 비공유 결합, 즉 정전기, 소수성 또는 조성물 중의 임의의 다른 성분과의 반데르발스 작용에 기반한 자가-조립에 의해 본 발명의 조성물 내에 혼입될 수 있다. 이를 위하여 개별 성분 용액의 이온강도, 반대이온의 유형, pH 또는 유기 용매 함량을 조절하는 것이 유리할 수 있다.
유기 용매가 양이온제, 특히 화학식 (IV)의 리피도이드 스톡 (stock) 용액을 제조하기 위해 사용될 수 있고, 수 난용성 또는 수 불용성 성분, 예컨대 지질 또는 소수성 올리고머 또는 폴리머의 동시-조립에 요구될 수 있다. 적합한 유기 용매는, 예를 들어 수혼화성 용매, 예컨대 에탄올과 기타 알콜, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 또는 글리코퓨롤 및 WO2013/045455호에 기술된 다른 용매이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 리피도이드를 포함하는 조성물은 리피도이드 및 추가 성분, 예컨대 임의의 이들 용매, 바람직하게는 에탄올에 용해된 헬퍼 지질, 및 바람직하게는 산성 pH로 완충된 수성 매질에 용해된 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA로부터 제조한다. 제1 단계에서, 유기상에 용해된 성분들을 목적하는 화학양론적 비로 혼합하고 선택된 유기 용매를 사용하여 목적하는 최종 부피로 희석한다. 리피도이드와 관련하여 목적하는 최종 비에 해당하는 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 양을 수성 매질로 희석한다. 바람직하게는, 수성 매질의 부피는 적어도 유기 용매 중의 조합된 성분 용액의 부피와 같다. 바람직하게는, RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 포함하는 수성상의 부피는 유기 용매 중의 조합된 성분 용액의 부피를 초과하며, 가장 바람직하게는 수성상과 유기상의 v/v 비는 4:1이다. 제2 단계에서, 리피도이드를 포함하는 유기 혼합물을 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 수용액에 바람직하게는 보텍싱 (vortexing)하면서 신속하게 주입한다. 선택적으로, RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA와 리피도이드를 포함하는 성분의 용액을 이 단계 전후에 70℃까지 가열한다. 필요하거나 바람직하다면, 이때 유기 용매를 증발, 투석, 한외여과, 투석여과 (diafiltration) 또는 크기 배제 크로마토그래피로 제거할 수 있으며, 동일 단계에서 분산 매질을 최종 목적하는 완충제 조성물, 예컨대 PBS로 교환할 수 있다. 선택적으로, 조성물은 단분산 제제의 멸균 및/또는 제조를 위해 원하는 기공 크기의 막 필터를 통해 통과될 수 있다.
상기에 기술된 혼합 방법의 대안으로, RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA, 및 리피도이드 성분을, 예를 들어 문헌 [Hirota et al., 1999, Biotechniques, 27, 286-290] 또는 [Kasper et al., 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185]에 기술된 바와 같은 마이크로-혼합용 자동화 장치에 의해 또는, 예컨대 문헌 [Xuan et al., 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16]에 요약한 바와 같은 미세유체 포커싱에 의해 혼합할 수 있다.
본 발명에 따른 리피도이드를 포함하는 조성물을 수득하기 위한 대안은 중간체로서 리포좀 또는 미셀을 통하는 것이다. 리포플렉스는 종종 수성 현탁액 중의 미셀 또는 리포좀인 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약으로부터 제조된다. 본 발명의 리피도이드는 미셀 또는 리포좀을 제조하는데 사용할 수 있다. 미셀과 리포좀을 제조하는 다양한 기술이 당해 분야에 알려져 있으며, 임의의 방법이 본 발명의 리피도이드를 사용하여 미셀과 리포좀을 제조할 수 있다. 또한 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 포함하는 임의의 제제, 소분자, 단백질, 펩티드, 금속, 유기금속성 화합물 등이 미셀 또는 리포좀 내에 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 리포좀 (지질 또는 리피도이드 소포체)은 자발적 조립을 통해 형성된다. 다른 실시양태에서, 리포좀은 얇은 지질 필름 또는 지질 케이크가 수화하여 지질 결정질 이중층의 적층이 유동 및 팽윤될 때 형성된다. 수화된 지질 시트는 교반 및 자기-폐쇄 (self-close) 동안에 분리되어 거대한 다중층 소포체 (LMV)를 형성한다. 이는 말단에서 이중층의 탄화수소 코어와 물의 상호작용을 방해한다. 일단 이러한 리포좀이 형성되면 입자 크기의 감소는 초음파 에너지 (초음파 처리) 또는 기계적 에너지 (압출)를 투입하여 변형될 수 있다 (Szoka et al, 1980, Ann Rev Biophys Bioeng, 9, 467-508). 리포좀의 제조는 수화를 위한 리피도이드 제조, 교반에 의한 리피도이드 수화, 및 리포좀의 균일 분산을 얻기 위한 소포체 사이징 (sizing)을 포함한다. 이를 위하여, 본 발명의 조성물에 포함될 지질성 성분들은 스톡 용액으로서 유기 용매, 예컨대 클로로포름에 용해된다. 이후, 성분들을 목적하는 화학양론적 비로 혼합되고 유기 용매를 적합한 용기, 예컨대 둥근바닥 플라스크에서 회전식 증발에 의해 제거하여 용기 벽에 얇은 지질 필름을 생성한다. 바람직하게는, 필름을 고진공에서 건조시킨다. 리피도이드 필름/케이크의 수화는 수성 매질을 건조 리피도이드의 용기에 첨가하고 혼합물을 교반하여 달성된다. 초음파 에너지를 사용한 LMV 현탁액의 분해는 전형적으로 15-50 nm 범위의 직경을 갖는 작은 단일층상 소포체 (SUV)를 생성한다. 지질 압출은 액체 현탁액을 규정된 기공 크기를 갖는 폴리카보네이트 필터에 통과시켜서 사용된 필터의 기공 크기와 비슷한 직경을 갖는 입자를 얻는 기술이다. 100 nm 기공을 갖는 필터를 통한 압출은 전형적으로 평균 직경이 120-140 nm인 거대 단일층상 소포체 (LUV)를 제공한다. 특정한 리피도이드는 특정 분자, 예컨대 핵산 (예를 들어, DNA 및 mRNA) 주위에서 자발적으로 자가-조립하여 리포좀을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 전달에 적용된다. 이러한 리피도이드의 사용은 추가적인 단계 또는 장치, 예컨대 압출기의 필요 없이 리포좀의 간단한 조립을 가능케 한다.
RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 그 후에 성분들의 용액을 혼합하여 자가-조립에 의해 제조될 수 있다. 자가-조립은 피펫팅과 교반/보텍싱을 사용한 수동 혼합에 의해 또는, 예를 들어 문헌 [Hirota et al., 1999, Biotechniques, 27, 286-290] 또는 [Kasper et al., 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185]에 기술된 것과 같은 마이크로 혼합용 자동화 장치 또는, 예컨대 문헌 [Xuan et al., 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16]에 요약된 것과 같은 미세유체 포커싱을 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 조성물이 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA, 및 본 발명의 양이온제에 더하여 추가 성분을 포함하는 경우, 순차적 혼합이 필요할 수 있다. 이 경우, 임의의 추가 성분은 양이온제 및 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 자가-조립 후에 첨가되거나, 혼합 전에 이들 중 어느 하나에 첨가할 수 있다. 혼합 단계의 가장 적합한 순서는 추가 성분들의 화학적 성질에 좌우될 것이다. 예를 들어 추가 성분이 음으로 하전된 경우, 이를 양이온제와 혼합하기 전에 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA, 또는 양이온제와 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 사전-형성된 복합체에 첨가하는 것이 가장 적합할 수 있고, 여기서 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는 (m)RNA와 음이온성 추가 성분의 음전하 합에 대한 양전하 비율 측면에서 과량으로 존재한다. 역으로, 추가 성분이 양이온성이면, (m)RNA와 혼합하기 전에 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드에 첨가하는 것이 가장 적합하다. 또는 추가 성분은 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 용액과 혼합하기 전에 (m)RNA의 음전하를 부분적으로 중화하는 화학양론으로 사용할 수 있다. 자기주입법 (magnetofection)을 위한 (m)RNA를 포함하는 복합체의 경우, 염-유도성 콜로이드 응집이 (m)RNA, 폴리양이온 또는 양이온성 지질 및 자기입자를 포함하는 조성물을 제조하는데 적합한 수단인 것으로 나타났다 (EP1297169). (m)RNA 성분이 양이온성 올리고뉴클레오티드인 특별한 경우에, 폴리음이온이 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 (m)RNA를 자가-조립하는데 사용될 수 있다. 이 경우, 본 발명의 양이온제는 양이온성 올리고뉴클레오티드와 혼합되고, 이어서 폴리음이온과 혼합된다. 다양한 제제화 방법이 본 발명의 조성물을 수득하는데 사용될 수 있음이 숙련자에게 잘 알려져 있다. 개별 성분들의 농도는 본 발명의 조성물의 의도된 용도에 따라 선택된다. 관련 파라미터는 (m)RNA 성분의 최종 농도와 상기에 기술된 바와 같은 성분들의 비율이다. 세포 배양에서 (m)RNA 전달을 위해 1 내지 100 μg/ml의 최종 (m)RNA 농도가 일반적으로 바람직하다. 생체 내 적용의 경우, 유용한 최종 (m)RNA 농도는 최대 5 mg/ml일 수 있다.
본 발명의 (약학적) 조성물, 또는 이의 하나 이상의 성분 (예를 들어, RNA 및 양이온제, 하나 이상의 헬퍼 지질, NP 및 MP)은 수성 현탁액 중에 보관되거나 건조될 수 있다. 따라서, 바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 (약학적) 조성물, 또는 이의 하나 이상의 성분은 건조된 형태, 선택적으로 냉동-건조 (동결건조)된 형태로 보관된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, (약학적) 조성물, 또는 이의 하나 이상의 성분, 예컨대 RNA 및 양이온제 (또는 이의 복합체)는 예를 들어 동결건조보호제 (lyoprotectant)와 함께 동결건조된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 건조 또는 동결건조된 복합체 또는 (약학적) 조성물은 또한 동결건조보호제를 포함한다. 동결건조보호제는 (냉동-)건조된 물질을 보호하는 분자이다. 이러한 분자는 전형적으로 폴리히드록시 화합물, 예컨대 당 (단당류, 이당류 및 다당류), 폴리알콜 및 이들의 유도체이다. 트레할로스 및 수크로스가 건조 과정의 자연 보호제로 알려져 있다. 트레할로스는 가뭄기 동안 가사상태 (탈수가사로도 알려짐)로 잔존하는 다양한 식물, 균류 및 무척추동물에 의해 생산된다. 당, 예컨대 트레할로스, 락토스, 라피노스, 수크로스, 만노스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트린, 우레아, 말토덱스트린, 푸럭탄 (fructan), 말토올리고당, 만노-올리고당, 사이클로이눌로헥사오스, 히드록시에틸 전분, 덱스트란, 이눌린, 폴리비닐피롤리돈 또는 아미노산, 예컨대 트립토판, 글리신 및 페닐알라닌이 본 발명의 범위에 특히 적합한 동결건조보호제이다. 가장 바람직하게는 트레할로스가 이 맥락에서 사용된다. 따라서, 더욱 특정한 측면에서, 본 발명의 약학적 조성물은 트레할로스 (또는 다른 동결건조보호제(들))을 추가로 포함한다.
약학적 측면
본 발명의 약학적 조성물은 또한 본원에서 위장 (GI) 관 투여로도 언급되는 GI 관에 또는 그 내로의 투여를 위한 고체 투약 형태로 제제화된다. GI 투여는 그에 의해 본 발명의 약학적 조성물이 GI 관 내에 도달하게 되는 임의의 투여 (형태)이다. GI 투여는 경구 투여, 직장내 투여 및 프로브/튜브 (예를 들어, 위관, 장 프로브 및 복강 프로브 (복벽을 통한 프로브))를 통한 투여를 포함한다. 일반적으로, 직장내 투여가 바람직하고 경구 투여가 본 발명에 따라서 가장 바람직하다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은
(i) 위장 내로 (예를 들어, 경구로, 직장 내로 또는 프로브/튜브를 통해) 투여되거나 투여될 수 있고;
(ii) (예를 들어, 경구 또는 직장 내 투여 또는 프로브/튜브를 통한) GI 투여용으로 고안되거나 제제화되고 또는 그럴 수 있고;
(iii) (예를 들어, 경구 또는 직장 내 투여 또는 프로브/튜브를 통한) GI 투여용이고; 및/또는
(iv) 위장 내로 (예를 들어, 경구로, 직장 내로 또는 프로브/튜브를 통해) 투여되는 것이다.
따라서, 약학적 조성물은 (예를 들어, 경구 또는 직장 내 투여 또는 프로브/튜브를 통한) GI 투여에 적합하도록 고안된다. GI 투여의 경우, 본 발명에 따른 화합물, 예를 들어 RNA, 바람직하게는 mRNA, 및 바람직하게는 RNA와 착화된 양이온제, 또는 RNA 및 양이온제를 포함하는 본원에 정의된 바와 같은 조성물을 함유하는 약학적 조성물은 고체 투약 형태로 제제화된다. 본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들어, 과립, 스피어, 펠렛, 정제, 좌약, 코팅 정제, 필름, 분할 분말, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 본 발명에 따른 투약 형태, 특히 고체 투약 형태는 숙련자에게 잘 알려진, 예를 들어 문헌 ["Pharmazeutische Technologie", 11th Edition Deutscher Apotheker Verlag 2010, or "Pharmazeutische Techologie", 9th Edition]에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 제제화될 수 있다. 문헌 [Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart, 2012]은, 예를 들어 문헌 [Fiedler's "Lexikon der Hilfstoffe" 5th Edition, Editio Cantor Verlag Aulendorf 2002, "The Handbook of Pharmaceutical Excipients", 4th Edition, American Pharmaceuticals Association, 2003]에 언급된 바와 같은 제제에 통상적으로 사용되는 하나 이상의 부형제(들)을 사용한다. 이들은 원칙적으로 담체, 부형체 또는 충진제, 결합체, 붕해제, 윤화제, 활택제, 안정화제, 계면활성제, 필름-형성제, 연화제, 습윤제, 감미제, 색소/착색제, 항산화제, 방부제 등으로부터 선택될 수 있다. 이러한 부형제(들)은 바람직하게는 고체이다. 그러나, 이/이들은 고체 투약 형태를 초래하는 한 다른 부형제(들)과 또한 사용될 수 있다.
원칙적으로, "고체 투약 형태"는 고체로서 제공되고/되거나 투여될 수 있는 임의의 투약 형태이다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 "고체 투약 형태"는 본 발명의 약학적 조성물에 포함된 RNA에 (예를 들어, GI 관에서 이의 분해로부터) 일종의 보호를 제공하고/하거나 (예를 들어, GI 관에서 이의 분해에 대한) 상기 RNA의 내성에 기여하고/이를 증강시키는 투약 형태이다. 본 발명의 맥락에서 사용되는 고체 투약 형태는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 ["Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie", 8th edition, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart (chapter 14)]에 기술되어 있다.
고체 투약 형태는, 예를 들어 과립, 구체, 펠렛들 또는 펠렛, 정제들 또는 정제, 좌약들 또는 좌약, 코팅된 정제들 또는 코팅된 정제, 필름들 또는 필름, 분말들 또는 분말, 분할 분말들 또는 분할 분말, 환제들 또는 환제 및 캡슐들 또는 캡슐 (예를 들어, 2-조각 캡슐(들))로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 투약 형태는 또한 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 ["Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie" 상기에 인용됨; "Pharmazeutische. Technologie", 10th edition, Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart; and "Innovative Arzneiformen", 2010 (ISBN 978-3-8047-2455-6), Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart]에 기술되어 있다.
더욱 구체적으로, 분말 (및 이의 생성물)은 상기에 인용된 "Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie"의 챕터 14.2에, 과립 (및 이의 생성물)은 챕터 14.3에 기술되어 있다. 환제 및 정제 (및 이의 생성물)는 상기에 인용된 "Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie"의 챕터 14.4에 기술되어 있다. 펠렛 (및 이의 생성물)은 상기에 인용된 "Innovative Arzneiformen"의 팹터 8에 기술되어 있다. 캡슐 (및 이의 생성물)은 상기에 인용된 "Pharmazeutische Technologie"의 챕터 11에 기술되어 있다. 좌약 (및 이의 생성물)은 상기에 인용된 "Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie"의 챕터 13 및 14와, "Pharmazeutische Technologie"의 챕터 13에 기술되어 있다.
예를 들어, 본 발명에 따르면, 분말은 과립을 생산하기 위해 사용될 수 있고, 분말 및/또는 과립은 펠렛을 생산하기 위해 사용될 수 있고/있거나, 분말 및/또는 과립 및/또는 펠렛은 정제(들), 환제(들) 또는 캡슐(들)을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 캡슐(들)은 젤라틴 캡슐(들)일 수 있다. 전형적으로, 젤라틴 캡슐은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐이다. 본 발명의 맥락에서 경질 젤라틴 캡슐이 특히 바람직하다. 적합한 캡슐, 특히 젤라틴 캡슐은 당해 분야에 잘 알려져 있고 상품화되어 있으며, 예를 들어, Capsugel® 벨지움 NV (Bornem, Belgium)에 의해 배급되는 "Coni-Snap®" 캡슐, "OBcaps®" 캡슐 또는 "PCcaps®" 캡슐로서 (또는 기타 캡슐로서) 이용가능하고, 상기에 인용된 "Pharmazeutische Technologie"의 챕터 11에 기술되어 있다.
다른 특정 측면에서, 좌약은, 예를 들어 상기에 인용된 "Pharmazeutische Technologie"의 챕터 13에 기술된 바와 같은 렉탈리아 (rectalia)일 수 있다.
적합한 결합제에는, 제한 없이, 결합제 폴리비닐 피롤리돈 (PVP), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 히드록시프로필메틸 셀룰로스 (HPMC), 히드록시프로필 셀룰로스 (HPC), 전-젤라틴화된 (옥수수) 전분 및 이들의 조합이 포함된다.
적합한 담체/충진제/희석제에는, 제한 없이, 미세결정 셀룰로스, 만니톨, 수크로스 또는 기타 당 또는 당 유도체, 예컨대 락토스, 인산수소칼슘, 전분, 바람직하게는 옥수수 전분, 저-치환된 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록실 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 및 이들의 조합이 포함된다.
적합한 윤활제에는, 제한 없이, 마그네슘 스테아레이트, 알루미늄 또는 칼슘 실리케이트, 스테아르산, 수소화 피마자유, PEG 4000-8000, 탈크, 글리세릴 베헤네이트, 소디움 스테아레이트 푸마레이트 및 이들의 조합이 포함된다.
적합한 활택제에는, 제한 없이, 콜로이드성 SiO2, (예를 들어, 에어로실 200), 마그네슘 트리실리케이트, 분말화된 셀룰로스, 탈크 및 이들의 조합이 포함된다.
적합한 붕해제에는, 제한 없이, 칼슘 카복시메틸셀룰로스 (CMC-Ca), 나트륨 카복시메틸셀룰로스 (CMC-Na), 가교된 PVP (예를 들어, 크로스포비돈, 폴리플라스돈 또는 콜리돈 XL), 알긴산, 소디움 알지네이트, 감자 전분, 구아 검, 가교결합된 CMC (크로스카멜로스 나트륨, 예를 들어 Ac-Di-Sol), 카복시메틸 전분-Na (나트륨 전분 글리콜레이트, 예를 들어 프리모젤 또는 엑스플로탭)이 포함된다.
적합한 습윤제에는 소디움 라우릴 설페이트와 같은 계면활성제가 포함된다.
나아가, 본 발명에 따른 GI 투여용 고체 약학적 조성물/투약 형태는, 예를 들어 필름 형성 폴리머, 불투명재 (opacifiers), 착색제 및 가소제의 혼합물 등과 같은 상업적으로 이용 가능한 코딩 물질을 사용하고 숙련자에게 잘 알려진 코팅 방법을 이용하여 필름 코팅 또는 변형된 이형 코팅에 의해 코팅될 수 있다. 각각의 코팅은 위액 내성 코팅일 수 있다. 그러나, 본 발명의 맥락에서 입증되는 바와 같이, 코팅, 특히 위액 내성 코팅은 본 발명에 따라서 고체 투약 형태로 경구 투여될 때 (또는 직장 내로 또는 프로브/튜브를 통해 투여될 때), 즉 본 발명의 약학적 조성물 내에 포함될 때, RNA의 효과적인 발현을 달성하기 위하여 반드시 요구되는 것은 아니다.
GI 투여용 제조물은 본 발명에 따른 화합물 (예를 들어, (m)RNA 및 양이온제의 복합체)의 제어/변형 방출을 제공하기 위해 방출 제어 매트릭스와 같은 다른 수단에 의해 적절히 제제화될 수 있다.
적합한 부형제의 목록은 또한, 참조로서 본원에 포함되는, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (Alfonso R. Gennaro, ed.; Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990); Remington: the Science and Practice of Pharmacy 19th Ed. (Lippincott, Williams & Wilkins, 1995); Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed. (Arthur H. Kibbe, ed.; Amer. Pharmaceutical Assoc, 1999); the Pharmaceutical Codex: Principles and Practice of Pharmaceutics 12th Ed. (Walter Lund ed.; Pharmaceutical Press, London, 1994); The United States Pharmacopeia: The National Formulary (United States Pharmacopeial Convention); 및 Goodman and Gilman's: the Pharmacological Basis of Therapeutics (Louis S. Goodman and Lee E. Limbird, eds.; McGraw Hill, 1992)]과 같은 교재에서 확인할 수 있다. 적합한 부형제 (예를 들어, 젤라틴), 담체 및 코팅제가 또한 상기에 언급된 문헌 "Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie"에 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 음식/식품 보충제 또는 식품의 형태이다. 이 맥락에서, 이는 음식/식품에 첨가되고/되거나 이와 함께 투여될 수 있다. 또한, 이는 식품과 함께 또는 식품으로서 투여될 수 있다. 다시, 이 실시양태와 관련하여 또한, 약학적 조성물이 고체 투약 형태로 제제화되는 것이 중추적이다. 따라서, 또한 각각의 음식/식품은 고체인 것으로 구상된다. 다르게는, 적어도 음식/식품 내에 포함된 약학적 조성물은 이것이 소화되고 있는 동안 및/또는 그 후에 그의 고체 형태를 유지하도록 제제화되는 것으로 구상된다. 각각의 형태의 예시는 (경질 또는 불용성의) 과립, 펠렛, (작은) 캡슐 등이다.
각각의 음식/식품의 예시는 시리얼 바, 비스킷, 스낵, 캔디, 페스트리, 빵, 뮤즐리, 파스타 등이다.
특정 측면에서, 이 실시양태의 약학적 조성물은 소아과적 사안의 맥락에서, 즉 소아 질환의 치료 (또는 예방)에 사용하기 위한 것이다.
음식/식품으로서 (음식/식품의 형태로) 제공되는 경우, 약학적 조성물은 특히 소아에 의해 용인된다.
음식/식품에는 동물 사료뿐만 아니라 인간을 위한 음식/식품도 포함된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RN를 조직에 또는 표적 세포 내로, 특히 GI 투여를 통해 고체 투약 형태로 전달하기 위한 본 발명의 (약학적) 조성물 또는 기술된 양이온제의 용도에 관한 것이다. 용어 "RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA의 세포에의 전달"은 바람직하게는 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 세포 내로 전달하는 것을 의미한다. 상기 용도는 생체 내 또는 시험관 내일 수 있다.
본 발명은 또한 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 표적 세포 또는 조직에 전달하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 특히 GI 투여를 통해 고체 투약 형태로 본 발명에 따른 (약학적) 조성물을 표적 세포 또는 조직과 접촉하게 하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 생체 내에서 수행될 수 있다. 접촉하게 하는 것은 숙련자에게 알려진 수단 및 방법에 의해 달성될 수 있다. 생체 내에서, 세포 또는 조직과 접촉하게 하는 것은, 예를 들어 숙련자에 공지된 투여 경로, 특히, 원칙적으로, 유전자 요법 분야에서 또한 사용되는, GI 투여에 의해 개인에 상기 조성물을 투여함으로써 달성될 수 있다. 조성물을 제제화하고 이를 개인에 투여하는 가능한 방식이 또한 본원의 다른 곳에 추가로 기술되어 있다.
용어 "생체 내"란 살아있는 유기체의 몸체에 영향을 주는 임의의 적용을 지칭하며, 여기서 상기 유기체는 바람직하게는 다세포, 더욱 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다. 용어 "시험관 내"란 단리된 살아있는 유기체의 몸체 일부에, 그리고 상기 유기체의 외부에서, 예를 들어 세포, 조직 및 장기에 영향을 주는 임의의 적용을 지칭하며, 여기서 상기 유기체는 바람직하게는 다세포, 더욱 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 조성물 또는 PEI와 같은 RNA 양이온제 또는 본원에 기술된 바와 같은 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 용어 "약학적 조성물"은 개체에 투여될 수 있는 본원에 기술된 조성물의 약학적으로 허용가능한 형태를 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 형태"는 약학적 조성물로서 제제화된 조성물을 의미하며, 여기서 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 추가로 포함한다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물을 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예시는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 결과의 약학적 조성물이 본 발명에 따른 고체 투약 형태로 제제화되는 한, 결합제, 담체, 충진제, 희석제, 윤활제, 활택제, 붕햐제, 부형제 및 다양한 유형의 습윤제 (상기에 기술된 바와 같음)를 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 공지된 통상의 방법으로 제제화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개체에 적합한 용량으로 투여될 수 있다. 투약 용법은 주치의와 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의료분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 개체에 대한 복용량은 다양한 인자, 예를 들어 대상의 사이즈, 체표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간과 경로, 일반적 건강 및 동시 투여되는 다른 약물 등에 따라 달라진다.
활성 물질의 전형적인 용량은, 예를 들어 1 ng 내지 수 그램의 범위 내일 수 있다. (m)RNA 요법에 적용하면, 발현 또는 발현 저해를 위한 (m)RNA의 복용량은 이 범위에 상당해야 하지만; 그러나 이 예시적인 범위 미만 또는 초과의 용량이, 특히 상기한 인자들을 고려하여 구상된다. 일반적으로, 약학적 조성물의 정상적 투여로서의 용법은 하루에 체중 1 kg 당 0.1 μg 내지 10 mg 단위의 범위 내여야 한다. 용법이 연속 주입일 경우에는 또한 각각 체중 1 kg 당 1 μg 내지 10 mg 단위의 범위 내여야 한다. 진행은 주기적인 평가에 의해 모니터링할 수 있다. 복용량은 변경될 수 있지만, 본 발명의 조성물의 구성성분으로서 (m)RNA의 정맥 내 투여를 위한 바람직한 용량은 약 106 내지 1019 카피의 (m)RNA 분자이다.
용어 "투여되는"은 개체의 몸체에 조성물을 도입하는데 적합한 임의의 방법을 포함한다. 그러나, 언급된 바와 같이, 본 발명의 문맥에서 사용될 때, 이는 주로 GI 투여 방법을 포함한다. 따라서 적합한 조성물의 투여는 다양한 방식으로 가능하지만, 특히 경구 또는 직장 내 투여에 의해 또는 프로브/튜브를 통해서 가능하다. 본 발명의 조성물은 특히 문헌 [Shea et al., 1999, Nat Biotechnol, 17, 551-554] 및 EP1198489에 기술된 바와 같은 유전자-활성화 매트릭스로서 투여될 수 있다.
원칙적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 전신적으로 투여될 수 있다. 본 발명은 또한, 본원의 다른 곳에 정의되고 기술된 바와 같은 RNA, 및/또는 그로부터 번역된 단백질의 전신적 전달을 위한 본 발명의 조성물의 용도, 및 본 발명의 약학적 조성물을 위장관 내로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 RNA, 및/또는 이로부터 번역된 단백질의 개체에의 전신적 전달을 위한 방법에 관한 것이다. 예를 들어, (전신적으로 전달된) RNA로부터 번역된 (번역될) 단백질은 분비 단백질일 수 있다. RNA가 전달되었던 GI 관의 표피 세포 (예를 들어, 창자세포)에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 이는, 예를 들어 혈류를 통해 전신적으로 전달될 수 있다 (신장에서의 신호를 나타내는, 도 36 "brPEI" 참조). 따라서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물을 사용하여 단백질의 전신적 전달을 위한 수단 및 방법을 추가로 제공한다. 단백질은 본 발명의 약학적 조성물에 포함된 것과 같은 RNA에 의해 인코딩된다.
나아가, 약학적 조성물은 약학적 조성물의 의도된 용도에 따라서 인터류킨 또는 인터페론과 같은 추가의 제제를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물에 포함된 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA가 예방 또는 치료 효과를 유발하도록 (이를 필요로 하는) 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 경구로 투여하는 것을 포함하는 치료 (또는 예방) 방법에 관한 것이다. 특히, 용어 "환자"는 동물 및 사람을 포함한다.
본 발명은 추가로 질환, 예를 들어 본원의 다른 곳에 기술되고 정의된 바와 같은 질환의 치료 (또는 예방)에 사용하기 위한 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
이 맥락에서, 약학적 조성물은 위장관 내로 투여되고 고체 투약 형태로 제제화되는 것으로 구상된다
본 발명의 약학적 조성물을 투여하여 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 용어 "질환"은 본 발명의 실시양태를 적용함으로써 치료, 예방 또는 백신처리되는 (vaccined) 임의의 고려 가능한 병리학적 상태를 지칭한다.
상기 방법 또는 약학적 조성물의 바람직한 실시양태에서, 상기 질환은 유전적, 후천적, 감염성 또는 비-감염성, 연령-관련, 심혈관성, 대사성, 장내, 신생물성 (특히, 암) 또는 유전자적인 것일 수 있다. 질환은 유기체 내에서의, 예를 들어 생리학적 과정, 분자적 과정, 생화학적 반응의 불규칙성에 기반할 수 있고, 이는 결국, 예를 들어 유기체의 유전적 장비, 행동적, 사회적 또는 환경적 인자, 예컨대 화학물질 또는 방사능에 대한 노출에 기반할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 특허출원 WO2011/012316호에 기술된 치료 (또는 예방)을 위해 또는 그에 사용된다.
원칙적으로, 본 발명의 약학적 조성물 및 각각의 용도 및 사용은 특정 질환(들) 또는 장애(들)의 치료 (또는 예방)으로 제한되지 않는다. 그보다는 본 발명에 따라서 RNA의 GI 투여에 의해, 즉 본 발명의 약학적 조성물의 위장관 내 투여에 의해 치료 (또는 예방)될 수 있는 임의의 질환 또는 장애를 치료 (또는 예방)하는 것으로 고려된다. 하기 3개 주된 분야의 요법 (또는 예방)이 이 측면에서 고려된다.
첫 번째, (위-)장관과 관련된 국소 질환을 치료 (또는 예방)하기 위한 환자에의 GI 투여. 가장 두드러진 각각의 예시는 크론병 및 궤양성 대장염 (염증성 장질환)이다. 이 분야의 맥락에서, mRNA는, 예를 들어 관련된 신호전달 경로와 상호작용하는 임의의 항-염증성 인자를 인코딩할 수 있다. IL-10 등이 예시일 수 있다. 유사하게 상응하는 신호전달 경로(들)와 상호작용하는 GI 관에서 항체 (예를 들어, 항-TNF알파 항체; Humira)의 국소 발현이 구상된다. 추가적인 국소 (예를 들어, 국소 염증성) 질환이 있을 수 있다.
두 번째, 단백질, 특히 보통 전신적으로 일어나는 결손 (missing) 단백질을 대체하기 위한 환자에의 GI 투여. 이 분야의 맥락에서, GI 관의 표피 세포가 mRNA를 발현하고 번역된 단백질이 그 후에 기능을 전신적으로 발휘하기 위해 환자의 혈액 순환 내로 분비되는 것으로 예상된다. 비-제한적인 예시는 EPO, hGH, hCSF, 혈액 응고 인자 (FVIII, FIX) 등이다. 각각의 질환은 대사성 또는 유전적 질환일 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예시는, 예를 들어 리소좀 저장 질환 등인 효소 대체 요법의 경우와 같이, 기능적 효소의 발현일 수 있다 (Leader, Nature Reviews Drug Discovery 7, 2008, 21-39 참조). 나아가, 항체가 국소적으로 발현되고 혈류 내로 분비 시 원위 장기에서 이들의 기능을 발휘하는 것이 유추 가능하다 (예를 들어, 염증성 질환, 암 등, 또한 http://www.pharmazeutische-zeitung.de/index.php?id=35238 또는 http://www.vfa.de/de/arzneimittel-forschung/datenbanken-zu-arzneimitteln/amzulassungen-gentec.html 참조).
이 분야의 맥락에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하기 화합물을 나타내고, 즉 각각의 RNA는 이들을 인코딩할 수 있다. 개별적 질환이 하기에 의해 치료 (또는 예방)될 수 있다:
베바시주맙 (Avastin®), 라니비주맙 (Lucentis®) 또는 페카타닙 (Macugen®)과 같은 혈관신생의 억제제. 오말리주맙 (Xolair®)과 같은 항-천식제. 에포에틴 알파 (Eprex®, Erypo®), 에포에틴 알파, 바이오시밀러 (Epoetin alfa Hexal®, Binocrit®, Abseamed®), 에포에틴 쎄타 (Biopoin®, Eporatio®), 에포에틴 제타, 바이오시밀러 (Silapo®, Retacrit®), 에포에틴 베타 (Neorecormon®), 에포에틴 델타 (Dynepo®), 다르베포에틴 알파 (Aranesp®, Nespo®), 또는 메톡시-폴리에틸렌글리콜-에포에틴 베타 (Mircera®)와 같은 항-빈혈 약물. 인간 인슐린, 재조합 (예를 들어 Insuman®, Actraphane®, Insulin Human Winthrop®), 인슐린 리스프로 (Humalog®), 인슐린 아스프르트 (NovoRapid®), 인슐린 글루리신 (Apidra®), 인슐린 글라르긴 (Lantus®, Optisulin®), 인슐린 데테미르 (Levemir®), 글루카곤 (Glucagen®), 엑세나티드 (Byretta®) 또는 리라글루티드 (Victoza®)와 같은 항-당뇨병제. 인터페론-알파-2a (Roferon A®), 페길화 인터페론-알파-2a (Pegasys®), 인터페론-알파-2b (Intron A®), 페길화 인터페론-알파-2b (Pegintron®, Viraferonpeg®, Vitron®), 인터페론 감마-1b (Imukin®), 팔리비주맙 (Synagis®) 또는 엔푸비르티드 (Fuzeon®)과 같은 항-감염제/호흡계 치료제. 에팔리주맙 (Raptiva®), 알레파셉트 (Amevive®), 우스테키누맙 (Stelara®), 인플릭시맙 (Remicade®), 아달리무맙 (Humira®) 또는 에타네로셉 (Enbrel®)과 같은 항-건선 약물. 리툭시맙 (MabThera®), 인플릭시맙 (Remicade®), 아달리무맙 (Humira®), 골리무맙 (Simponi®), 세르톨리주맙 페골 (Cimzia®), 에타네르셉트 (Enbrel®), 아나킨라 (Kineret®), 아바타셉트 (Orenica®), 토실리주맙 (Roactemra®) 또는 카나키누맙 (Ilaris®)와 같은 항-류마티스 약물. 스트렙토키나제 (Streptase®), 유로키나제 (Corase 500.000®), 압식시맙 (Reopro®), 항트론빈 알파 (Atryn®), 레피루딘 (Refludan®), 데시루딘 (Revasc®), 비발리루딘 (Angiox®), 알테플라스 (Actilyse®), 레테플라제 (Rapilysin®) 또는 테넥테플라제 (Metalyse®)와 같은 항-혈전 약물/섬유소용해 약물. 엡타코그 알파 (액티비어트) (Novoseven®), 옥토코그 알파 (Recombinate®, Advate®, Helixate®, Kogenate®), 모록토코그 알파 (Refacto®) 또는 노나코그 알파 (Benefix®)와 같은 항응고 인자. 에쿨리주맙 (Soliris®)과 같은 용혈소 억제제. 폴리트로핀 베타 (Puregon®, Fertavid®), 폴리트로핀 알파 (Gonal-f®), 코리폴리트로핀 알파 (Elonva®), 루트로핀 알파 (Luveris®), 폴리트로핀 알파/루트로핀 알파 (Pergoveris®) 또는 융모고나도트로핀 알파 (Ovitrelle®)와 같은 생식능 장애의 치료 (또는 예방)을 위한 호르몬. 인터페론 베타-1b (Betaferon®, Extavia®), 인터페론 베타-1a (Rebif®, Avonex®), 나탈리주맙 (Tysabri®) 또는 글라티라머아세테이트 (Copaxone®)과 같은 면역체계 (예를 들어, 다발 경화증)의 조정자. 항-인간-T-림프구-글로불린 (토끼 유래) (ATG-Fresenius® S), 항-티모자이텐-글로불린 (토끼 유래) (Thymoglobuline®), 바실릭시맙 (Simulect®) 또는 다클리주맙 (Zenapax®)와 같은 면역억제제 (예를 들어, 이식편대숙주 질환의 예방). 간염-B-(rDNA)-백신 (HBVAXPRO®, Fendrix®, Engerix®-B), 인간 파필로마 바이러스-백신 (Cervarix®, Gardasil®), 폐렴구균 컨쥬게이트 백신 (Synflorix®) 또는 경구 콜레라-백신 (Dukoral®)과 같은 백신. 디보테르민 알파 (Inductos®) 또는 엡토테르민 알파 (Osigraft®)와 같은 골 성장 인자. 도르나제 알파 (Pulmozyme®)와 같은 점액점착증 (mucoviscidosis)의 치료제. 테르파라티드 (Forsteo®), 부갑상샘 호르몬 (Preotact®), 락스 (Lachs)-칼시토닌 (Forcaltonin®) 또는 데노수맙 (Prolia®)와 같은 골다공증 치료제. 드로트레코닌 알파 (Xigris®)와 같은 폐혈증 치료제. 이미글루세라제 (Cerezyme®), 아갈시다제 알파 (Replagal®), 아갈시다제 베타 (Fabrazyme®), 라로니다제 (Aldurazyme®), 이두르설파제 (Elaprase®), 갈설파제 (Naglazyme®) 또는 아글루코시다제 알파 (Myozyme®)과 같은 대체 치료제. 오미플로스팀 (Nplate®)와 같은 혈소판 성장 인자. 알데슬레우킨 (Proleukin®), 타소네르민 (Beromun®), 인터페론 알파-2a (Roferon®-A), 인터페론 알파-2b (IntronAA®), 세툭시맙 (Erbitux®), 파니투무맙 (Vectibix®), 니모투주맙 (Theraloc®), 트라스트주맙 (Herceptin®), 퍼투주맙 (Omnitarg®), 에르투막소맙 (Rexomun®), 리툭시맙 (MabThera®), 이브리투모맙-티욱세탄 (Zevalin®), 토시투모맙 (Bexxar®), 알렘투주맙 (MabCampath®)), 베바시주맙 (Avastin®), 아스파라기나제 (Asparaginase medac®), 페가스파르가제 (Oncaspar®), 필그라스팀 (Neupogen®), 필그라스팀, 바이오시밀러 (Biograstim®, Filgrastim Hexal®, Filgrastim ratiopharm®, Ratiograstim®, Zarzio®, Tevagrastim®), 페길화 필그라스팀 (Neulasta®), 레노그라스팀 (Granocyte®), 팔리페르민 (Kepivance®), 라스부리카제 (Fasturtec®), 티로트로핀 알파 (Thyrogen®) 또는 오파투무맙 (Arzerra®)와 같은 암/종양 치료제. 소마토트로핀 (Humatrope®, Genotropin® MiniQuick, NutropinA®, Zomacton®, Norditropin Nordiflex®, Norditropin Simplexx®, Saizen®, Omnitrope®, Valtropin®), 메카세르민 (Increlex®) 또는 페그비소맛 (Somavert®)와 같은 성장 호르몬. 베카플레르민 (Regranex®)와 같은 상처 치유제.
세 번째, 예를 들어 (재조합) 단백질의 면역원성 제공을 위한 환자에서의 국소 관용 (예를 들어, 경구 관용)의 유도 (Wang, Advanced Drug Delivery Reviews 65, 2013, 759-73 참조). 경구 관용은 음식 단백질과 같은 무해한 항원의 경구 투여에 의해 유도되는 국소 및 전신 면역 무반응의 상태이다 (Pabst, Mucosal Immunology 5(3), 2012, 232-9 참조). 경구 관용은 경구 경로를 통해서 동일한 항원의 투여에 의한 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역반응의 특이적인 억제로서 정의된다. 이는 GI 관이 환자의 혈류 내로 단백질을 전이시키고 분비하는데 사용되는 경우 mRNA 기술의 추가적인 이점이다. 이렇게 함으로써, 발현된 단백질과 관련한 임의의 면역학적 우려를 회피할 수 있다. 이는 특히 유전적 결함에 의해 발현되지 않았다는 이유로, 신체가 이전에 발현된 치료학적 단백질과 직면한 적이 없었던 유전적 질환을 갖는 환자에서 중요하다. 이러한 환자에게 알려지지 않은 단백질이 주어진다면 (또는 발현된다면), 면역 체계는 이러한 단백질이 면역 체계의 성숙 동안에 존재하지 않았기 때문에 이를 외래물질로 인식할 가능성이 있다. 이러한 경우에 면역 관용이 확립되어 있다면 도움이 될 것이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 (예를 들어, 상기 두 번째 분야의 맥락에서 치료되는 (또는 예방되는) 또는 본원의 다른 곳에 기술되고 정의된 바와 같은 유전적 질환 및/또는 질환의 치료와 병용하여) 환자에서 국소 (면역) 관용 (예를 들어, 경구 (면역) 관용)의 유도에 사용하기 위한 것이다.
상기에 기술된 치료 방법에 따라서, 본 발명은 다른 실시양태에서 상기 조성물 내에 함유된 상기 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 질환에 걸린 환자의 신체 내부의 조직 또는 장기에 제공함으로써 치료될 수 있는 질환의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 조성물의 용도를 언급한다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용 설명서 또는 사용 전단지와 함께 제공될 수 있다. 사용 설명서/전단지는 어떻게 본 발명에 따라서 본원에 기술된 바와 같이 질환 또는 장애를 치료하거나 예방할 수 있는지에 대한 숙련자/주치의를 위한 지침을 포함할 수 있다. 구체적으로, 사용 설명서/전단지는 본원에 기술된 투여/투약 용법의 방식 (예를 들어, 투여 경로, 복용량 용법, 투여 시간, 투여 빈도)에 대한 지침을 포함할 수 있다. 구체적으로, 사용 설명서/전단지는 약학적 조성물이 GI 관 (예를 들어, 경구로 또는 직장 내로 또는 프로브/튜브를 통해 (예를 들어, 위관))에/내로 투여되는 것임에 대한 지시를 포함할 수 있다. 이러한 지시는 약학적 조성물이, 예를 들어 경구 또는 직장 내 투여를 위해 (고안된) 고체 투약 형태로서 투여되는 것임에 대한 지시를 포함할 수 있다. 원칙적으로, 투여/투약 용법의 방식과 관련하여 본원의 다른 곳에 언급된 것들이 사용 설명서/전단지에 숙련자/주치의를 위한 지침으로서 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 키트 (또는 키트의 형태)로 제공될 수 있다. 키트는 본 발명의 약학적 조성물의 하나 이상의 성분을, 예를 들어 하나 이상의 별도의 용기에 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 RNA, 양이온제 및/또는 헬퍼 지질(들)을, 예를 들어 1개, 2개 또는 3개 (또는 그 이상의) 별도의 용기에 각각 포함할 수 있다. 키트는 또한 사용 설명서 또는 사용 전단지를 포함할 수 있다.
추가의 설명을 위하여, 본 발명의 바람직한 측면이 하기 항목에서 요약되는데, 이는 전술한 포괄적 개시의 일부를 형성하고 본원에 기술된 바람직한 실시양태가 또한 잘 적용된다.
도 1: mRNA를 사용한 다른 세포 유형의 형질감염 효율에 대한 폴리(아크릴산)의 올리고(알킬렌 아민) 측쇄 변형 유형의 효과. 폴리플렉스를 측쇄 변형 (2-3-2) 및 (3-2-3) 또는 대조군 그룹 (3-3-3), (2-2-2), (2-2) 또는 (3-4-3)을 갖는 폴리(아크릴산) (MW: 8,000 Da)과 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 4 내지 44의 N/P 비로 지시된 세포 유형에 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 RNA (500, 250, 125 또는 62.5 ng)로 형질감염된 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 2: (2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 PAA8k의 복합체 형성능을 측정하기 위한 겔 이동 어세이. 폴리플렉스를 기술된 바와 같이 지시된 N/P 비로 형성하였다. 폴리머와 mRNA의 상호작용을 아가로스 겔에서의 이동으로 분석하였다. 상호작용이 우수할수록 mRNA의 완전하게 방해된 이동을 위한 폴리머의 필요량은 감소한다.
도 3: (2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 PAA8k의 복합체 형성능의 결정을 위한 리보그린 (RiboGreen) 어세이. 폴리플렉스를 기술된 바와 같이 지시된 N/P 비로 형성하였다. 폴리머와 mRNA의 상호작용을 리보그린을 첨가하여 분석하였다. 이 분자는 핵산과 상호작용하여 다량의 mRNA에서 형광 시그널을 증가한다. 핵산과 폴리머의 상호작용이 우수할수록, 형광 시그널의 검출은 감소한다. 시그널은 동일한 양의 자유 mRNA를 함유하는 대조군과 비교한 상대적 형광으로 표시된다.
도 4: 상이한 N,N' -비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 변형 폴리머의 형질감염 효능. 폴리플렉스를 표시된 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 변형 폴리머 (PAA8k: 폴리(아크릴산), MW 8,000 Da; Glu9.8k: 폴리(글루탐산), MW 9,800 Da; PMA9.5k: 폴리(메타크릴레이트), MW 9,500 Da; Glu64k: 폴리(글루탐산), MW 64,000 Da; GluLys: 폴리(글루탐산)-폴리(리신)-co-폴리머) (20,000-50,000 Da) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 4 내지 20의 N/P 비로 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 mRNA (500, 250, 125 또는 62.5 ng)로 형질감염된 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 5: 상이한 분자량의 N,N' -비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 변형 폴리(아크릴산)의 형질감염 효능. 폴리플렉스를 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2)로 변형된 지시된 분자량의 폴리(아크릴산)과 반딧불이 루시퍼라제를 4 내지 20의 N/P 비로 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 mRNA (500, 250, 125 또는 62.5 ng)로 형질감염된 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 6: mRNA 폴리머 제제의 세포독성. 지시된 올리고(알킬렌 아민)으로 변형된 폴리(아크릴산) (MW 8,000 Da, 20,000 Da 및 70,000 Da) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 포함하는 복합체를 4 내지 44의 N/P 비 및 상이한 양의 mRNA 형질감염에 사용하였다. 24시간 후에 세포 생존률을 기술한 바와 같이 결정하였다. 데이터를 형질감염되지 않은 세포와 비교한 생존률 (%)로 나타내었다.
도 7: 마우스 폐에서 리포터 단백질 발현 수준. PAA20k-(2-3-2)와 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA의 폴리플렉스를 지시된 N/P 비로 혼합하고 에어로졸을 통해 마우스에 적용하였다.
도 8: N,N' -비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 변형 폴리(아크릴산)의 물리화학적 특성. 폴리플렉스를 생체 내 조건 하에 N/P 10으로 형성하였다. 사용 폴리머: 폴리(아크릴산), MW 20,000 Da.
도 9: PAA20k-(2-3-2)와 mRNA의 투과전자 현미경 사진. 폴리플렉스를 N/P 10으로 혼합하여 투과전자 현미경으로 분석하였다. 스케일 바 (bar): 100 nm. 사용 폴리머: 폴리(아크릴산), MW 20,000 Da.
도 10: 폴리플렉스 제제의 에어로졸 적용 후 돼지 폐 조직에서 반딧불이 루시퍼라제의 발현. 좌측 사진 brPEI N/P 10. 우측 사진 PAA20k-(2-3-2) N/P 10. 사용 폴리머: 폴리(아크릴산), MW 20,000 Da.
도 11: PAA20k-(2-3-2) 복합제를 동결건조하는 능력에 대한 트레할로스 효과. 복합체를 기술된 바와 같이 형성하여 1% 트레할로스의 존재 또는 부재 하에 동결건조하였다. 입증된 바와 같이, 트레할로스는 동결건조 및 재수화 후 이들 복합체의 mRNA 형질감염 효능을 보존할 수 있다.
도 12: DNA 형질감염 효능에 대한 (2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 폴리머의 효과. 폴리플렉스를 지시된 측쇄 변형을 갖는 폴리(아크릴산) (MW: 8,000 Da)과 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 pDNA (pCMVLuc)를 4 내지 20의 N/P 비로 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 DNA (500, 250, 125 또는 62.5 ng)로 형질감염된 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 대조군으로 분지형 PEI (brPEI) 25 kDa를 형질감염 시약으로 사용하였다.
도 13: GL3-Luc-siRNA와 N,N' -비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 변형 폴리(아크릴산)의 복합체를 사용한 RNAi 유도 유전자 침묵 (silencing). 반딧불이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 반딧불이 루시퍼라제 siRNA (siLuc) 또는 대조군 siRNA (siGFP)에 대한 siRNA와 PAA20k-(2-3-2)의 복합체를 지시된 N/P 비와 상이한 siRNA 양으로 사용하여 형질감염하였다. 루시퍼라제 발현을 24시간 후에 분석하고 미처리 세포와 비교한 상대적 발현으로 나타내었다.
도 14: NIH3T3 세포를 상이한 리피도이드/mRNA 복합체로 형질감염한 후의 반딧불이 루시퍼라제 활성. 복합체를 mRNA와 (2-3-2) 또는 대조군 올리고(알킬렌 아민) (2-2-2) 및 (3-3-3)에 기반한 리피도이드 사이에서 16의 w/w-비 (리피도이드 중량/mRNA 중량)로 형성하였다.
도 15: DNA 형질감염 효율에 대한 폴리(아크릴산)의 올리고(알킬렌 아민) 측쇄 변형의 효과. 폴리플렉스를 지시된 측쇄 변형을 갖는 폴리(아크릴산) (MW: 8,000 Da) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 pDNA (pCMVLuc)를 지시된 N/P 비로 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 DNA (500, 250, 125 또는 62.5 ng)로 형질감염된 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다. mRNA 형질감염 (도 1 참조)에 대하여 올리고(알킬렌 아민) 측쇄 변형은 형질감염 효율에 현저하게 영향을 주지 않았다.
도 16: 리피도이드 제제의 정맥내 주사 후 쥐의 간 및 비장에서 반딧불이 루시퍼라제의 발현. 좌측: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C12-(2-3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 3.6:0.18:0.76:1 중량비)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA; 우측: 주사용수 중의 리피도이드 C12-(2-3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 3.6:0.18:0.76:1 중량비)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA. PBS 중의 제제만이 간과 비장에서 발현을 유도하였다 (PBS: 1.6404x10^5 광자/s; 물: 검출할 수 없음).
도 17: 리피도이드 제제의 정맥내 주사 후 쥐의 간 및 비장에서 반딧불이 루시퍼라제의 발현. A. 생체 내 생체발광 영상: 좌측: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C14-(2-3-2) (C14-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA; 중앙: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C16-(2-3-2) (C16-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA; 우측: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C12-(2-3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA. B. 생체 내 생체발광 시그널의 정량. 알킬쇄 길이가 C12-C16으로 증가함에 따라 발현 수준은 감소하였다.
도 18: 리피도이드 제제의 정맥내 주사 후 쥐의 간 및 비장에서 반딧불이 루시퍼라제의 발현. 도 17에 나타낸 처리 마우스로부터 간, 비장, 신장, 위, 심장, 폐 및 뇌를 절제하여 루시퍼라제 발현에 대해 영상화하였다. A. 생체발광 영상: 좌측: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C12-(2-3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA; 중앙: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C14-(2-3-2) (C14-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA; 우측: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C16-(2-3-3) (C16-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA. 간에서의 루시퍼라제 발현은 리피도이드의 알칸쇄 길이가 증가함에 따라 감소하였고 (C16<C14<C12), C16은 거의 검출할 수 없었다. 비장에서의 루시퍼라제 발현은 C14가 가장 높았다. 폐에서 일부 루시퍼라제 발현이 관찰되었으나, 심장, 신장, 위 또는 뇌에서는 관찰되지 않았다. B. A에서의 생체발광 시그널의 정량.
도 19: 상이한 형질감염 시약의 pDNA와 mRNA를 전달하는 능력에 대한 효율 비교. 폴리플렉스를 지시된 형질감염 시약 (대응 특허 WO 2011/154331의 명명법에 따른 구조: #46 C-Stp3-C-K-OleA2; #454: C-Y3-Stp2-K(K-OleA2)-Stp2-Y3-C; #512: C-Sph3-K(Sph3-C)2)를 사용하여 형성하였다. 핵산 페이로드 (payload)로서 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA 또는 pDNA (pCMVLuc)를 지시된 N/P 비로 사용하였다. 24시간 후에 상이한 양의 mRNA (500, 250, 125 또는 63 ng)로 형질감염된 NIH3T3 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 20: N,N ' -비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 또는 N,N ' -비스(2-아미노에틸)-1,3-부탄디아민 (2-4-2)으로 변형된 PAA8k의 형질감염 효율의 비교. 폴리플렉스를 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 또는 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-부탄디아민 (2-4-2)으로 변형된 PAA8k 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 표시된 N/P 비로 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 mRNA (500, 250, 125 또는 63 ng)로 형질감염된 NIH3T3 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 21: 리포플렉스의 투과전자현미경 사진. 리피도이드/mRNA 복합체를 기술된 바와 같이 형성하여 투과전자 현미경으로 분석하였다. 상위 레인: C10-(2-3-2)/DOPE/Chol/DPG-PEG, 하위 레인: C10-(2-3-2)/DPPC/Chol/DPG-PEG; 좌측 사진 오버뷰 스케일: 100 nm; 우측 사진: 상세한 줌 (zoom) 스케일 20 nm.
도 22: 1-브로모데칸으로부터 합성된 C10-(2-3-2)의 형질감염 효율. C10-(2-3-2)를 1-브로모데칸을 사용하여 제조예 VII에 기술된 바와 같이 합성하였다. 형질감염 효율을 NIH3T3 세포에서 웰 당 500 ng, 250 ng 및 125 ng의 용량으로 시험하였다.
도 23: N-도데실 아크릴아미드로부터 합성된 C12-(2-3-2)의 형질감염 효율. C12-(2-3-2)를 N-도데실 아크릴아미드를 사용하여 제조예 VIII에 기술된 바와 같이 합성하였다. 형질감염 효율을 NIH3T3 세포에서 웰 당 500 ng, 250 ng 및 125 ng의 용량으로 시험하였다.
도 24: 도데실-아크릴레이트로부터 합성된 C12-(2-3-2)의 형질감염 효율. C12-(2-3-2)를 도데실-아크릴레이트를 사용하여 제조예 IX에 기술된 바와 같이 합성하였다. 형질감염 효율을 NIH3T3 세포에서 웰 당 500 ng, 250 ng 및 125 ng의 용량으로 시험하였다.
도 25: 리피도이드 제제를 기반으로 하는 C12-(2-3-2)의 형질감염 효율. 리피도이드 제제를 N/P 17 또는 8로 DOPE 또는 DSPC와 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA와 함께 C12-(2-3-2) 및 DMG-PEG2k를 사용하여 생성하였다.
도 26: 생체 내 형질감염 효율에 대한 C12 변형 올리고(알킬아민) (2-3-2), (3-3-3) 및 (2-2-2)의 비교.
도 27: 변경된 C12-알킬쇄 포화도 및 포지셔닝 (positioning)을 갖는 C12-(2-3-2) 버젼의 형질감염 효율의 비교. A: 상이한 C12-(2-3-2) 버젼의 화학적 구조; b: 상이한 지질을 포함하는 제제으로 NIH3T3 세포를 형질감염한 후의 리포터 단백질 (반딧불이 루시퍼라제)의 발현 수준
도 28: 리포플렉스의 동결건조 안정성. 리피도이드 제제를 기술된 바와 같이 형성하고 물에 대해 투석하여 상이한 농도의 동결건조보호제 (트레할로스 (A, D), 수크로스 (B, E) 및 락토스 (C, F))와 혼합하였다. 냉동, 동결건조 및 재현탁 후, NIH3T3 세포에서의 형질감염 효율 (A-C)과 수력학적 직경 (D-F)을 측정하고 동일 조건하에서 새로이 제조된 리포플렉스와 비교하였다.
도 29: C12-(2-3-2) 함유 리피도이드 제제으로의 형질감염 후 생체 외 시료에서 mRNA 발현. A: 돼지 근육, 모든 시료 처리; B: 돼지 지방 조직, 모든 시료 처리; C: 양의 동맥; D: 양 근육, 상위 시료: 처리군, 하위 시료: 미처리군; E: 양의 폐, 상위 시료: 처리군, 하위 시료: 미처리군
도 30: ACE-2 단백질에 대한 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석. 좌측 레인: ACE-2 mRNA 처리 세포의 용해물; 우측 레인: mRNA가 없는 (비어있음) 리피도이드 제제으로 처리된 세포의 용해물. 윗줄: ACE-2의 염색; 아랫줄: GAPDH, 대조군 로딩.
도 31: 마우스에서 쥐 에리트로포이에틴의 발현. 혈액 시료를 mEPO mRNA를 함유하는 C12-(2-3-2) 제제의 정맥내 투여 6시간 후에 mEPO에 대해 분석하였다. 상이한 3개 RNA 용량 (20 μg, 10 μg 또는 5 μg) 및 대조군 그룹 (PBS)을 분석하였다.
도 32: 상이하게 변형된 폴리(알릴아민) (PALAM)의 형질감염 효율 비교. NIH3T3 세포를 PALAM-(2-3-2), PALAM-(2-2-2) 또는 PALAM-(3-3-3)과 복합된 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA로 구성된 폴리플렉스를 사용하여 형질감염하였다.
도 33: 상이하게 변형된 폴리프로필렌이민 (PPI)의 형질감염 효율 비교. NIH3T3 세포를 PPI-(2-3-2), PPI-(2-2-2) 또는 PPI-(3-3-3)과 복합된 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA로 구성된 폴리플렉스를 사용하여 형질감염하였다.
도 34: C12-(2-3-2) 제제의 피하 주사 후 루시퍼라제의 발현. 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 함유하는 C12-(2-3-2)/DOPE/콜레스테롤/DMG-PEG2k.
도 35: FFL을 인코딩하는 변형 mRNA (리피도이드) 제제의 경구 투여 후 GI 관에서 반딧불이 루시퍼라제 (FFL)의 발현.
A: 캡슐로서 경구 적용
우측: FFL을 인코딩하는 mRNA를 실시예 29에 기술된 바와 같은 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88의 몰비로 리피도이드 C12-(2-3-2) 및 헬퍼 지질 DSPC, 콜레스테롤 및 DPG-PEG 2000와 함께 제제화하였다. 동결건조 후, 50 μg의 mRNA에 상응하는 분주액을 PCcaps® 젤라틴 캡슐에 채우고 암컷 버팔로 래트에 경구 위관영양 (gavage)에 의해 투여하였다. 24시간 후 동물을 희생시키고, 장기을 적출하고 D-루시페린 함유 PBS에 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성을 생체발광 영상화에 의해 기록하였다. 결과는 GI 관 (상부 우측 도면)에서 광범위한 발현을 나타낸 반면, 다른 장기 (간, 비장, 신장, 심장, 폐; 하부 우측 도면)는 어떠한 루시퍼라제 신호도 나타내지 않았다. 채색된-스케일 코드 (상부 사진의 우측) 및 회색-스케일 코드 (하부 사진의 우측)는 루시퍼라제 발현 수준을 나타낸다.
좌측: 동일한 리피도이드 제제를 PLGA 미세입자 내로 봉입하고 동결-건조시켰다. 대략 25 μg의 mRNA에 상응하는 13.6 mg의 분주액을 PCcaps® 젤라틴 캡슐에 채우고 실시예 29에 기술된 바와 같이 암컷 버팔로 래트에 경구 위관영양에 의해 투여하였다. 24시간 후 동물을 희생시키고, 장기을 적출하고 D-루시페린 함유 PBS에 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성을 생체발광 영상화에 의해 기록하였다. 결과는 위장관 (상부 우측 도면)에서 광범위한 발현을 나타낸 반면, 다른 장기 (간, 비장, 신장, 심장, 폐; 하부 우측 도면)는 어떠한 루시퍼라제 신호도 나타내지 않았다.
B: 액체로서 경구 적용
좌측: FFL을 인코딩하는 mRNA를 실시예 29에 기술된 바와 같이 리피도이드 C12-(2-3-2) 및 헬퍼 지질과 함께 제제화하고 SpectraGel® (SpectrumLabs, Breda, NL)을 사용하여 1.1 mg/mL의 농도로 농축하고 10× PBS로 1× PBS 및 1 mg/ml의 mRNA 농도가 되도록 조정하였다. 스프라그-다우리 래트를 플로우 챔버 내에서 5% 이소플루란으로 마취시키고 1 ml의 검사 항목을 위관영양을 이용하여 위 내로 직접 적용하였다. 손상된 일반 조건으로 인해 동물을 4 ½시간 후 희생시켰다. 장기를 D-루시페린 함유 PBS (100 μg/ml)에서 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성을 생체발광 영상화를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 장에서뿐만 아니라 다른 장기에서도 루시퍼라제 단백질의 어떠한 발현도 나타나지 않았다.
중앙: 키토산 입자를 실시예 29에 설명된 바와 같이 제제화하고, 동결건조한 후 3 ml의 물에 용해시켰다. 일정에 따라서 검사 항목을 점적주입하고 24시간 후 래트를 희생시켰다. 생체발광 영상화는 장에서뿐만 아니라 다른 장기에서도 루시퍼라제의 발현을 나타내지 않았다.
우측: PLGA 미세입자를 실시예 29에 기술된 바와 같이 형성하고 동결건조 후 3 mL의 물에 재현탁하였다. 일정에 따라서 검사 항목을 점적주입하고 24시간 후 래트를 희생시켰다. 생체발광 영상화는 장에서뿐만 아니라 다른 장기에서도 루시퍼라제의 발현을 나타내지 않았다.
도 36: 캡슐, 2차 실험으로서 경구 적용. 트레할로스 (대조군), 미세입자 없이 C12-(2-3-2)에 복합화된 SNIM®-RNA, 미세입자와 함께 C12-(2-3-2)에 복합화된 SNIM®-RNA (WO2011/012316에 따라 변형된 RNA) ("MP") 및 PEI와 함께 복합화된 SNIM®-RNA 중 하나를 함유하는 캡슐을 위관영양을 이용해 암컷 스프라그-다우리 래트의 위 내로 직접 적용하였다. 복합체를 실시예 29에 기술된 바와 같이 제조하였다. 루시퍼라제 단백질의 발현을 전체 창자 및 장기 (간, 비장, 위 및 신장)에서 24시간 후에 생체 외로 결정하였다. 이 방법을 이용하여 트레할로스로 충진된 캡슐이 투여된 래트에서는 어떠한 발현도 확인되지 않았다. SNIM®-RNA가 미세입자 내로 도입되는 것이 아니라 C12-(2-3-2)와 복합화된 경우에, 창자 및 위 내부에서의 발현이 확인되었다. C12-(2-3-2)와 복합화된 SNIM®-RNA의 미세입자 내로의 도입은 창자 내에서 루시퍼라제의 증가된 발현을 초래한 반면 위에서는 아무런 발현도 없었다. PEI와 복합화된 SNIM®-RNA는 창자, 위 및 놀랍게도 신장에서 루시퍼라제의 발현을 생성하였다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다.
제조예 I:
N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 변형 폴리(아크릴산), MW 8,000 Da, PAA8k-(2-3-2)의 합성:
10 mg의 폴리(아크릴산) 나트륨염 (MW: 8,000 Da, Sigma Aldrich)을 50 mM MES (pH 6.0)를 함유하는 2 mL의 반응 완충제로 희석하였다. 1.69 g의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (100 당량/카복시기, Sigma Aldrich)을 2 mL의 동일 완충제로 희석하였다. 올리고(알킬렌 아민)을 유리 염기로 구입함에 따라, 32% HCl을 적가하여 pH를 pH 6.0으로 조절하였다. 폴리(아크릴산) 및 올리고(알킬렌 아민) 용액을 혼합하였다. 반응을 개시하기 위하여 카복실기당 10배 몰 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC, Sigma Aldrich, 2 mL 반응 완충제로 희석)를 첨가하였다. 최종 부피를 10 mL로 조절하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온으로 오버헤드 진탕기에서 인큐베이션하였다. 생성물을 투석에 의해 정제하였다. 이를 위하여 반응 혼합물을 slide-a-lyzer 투석 카세트 (3-12 mL, MWCO: 3,500 Da, Thermo Fisher) 내에 충전하고 물에 대해 72시간 동안 투석하였다. 물을 1일 2회 교환하였다. 투석 후, 정제된 폴리머를 동결건조하였다. 동일 조건 하에서 하기 표 1에 열거된 폴리머를 합성 및 시험하였다:
[표 1]
합성된 올리고(알킬렌 아민) 변형 폴리머의 목록
Figure pct00031
제조예 II:
고체상 지지 펩티드 합성에 의한 브러쉬형 폴리머의 생성을 위한 올리고(알킬렌 아민) 빌딩 블록의 합성:
I. 트리(Boc) 보호된 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (EPE(Boc)3)의 합성.
5 g의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (31.2 mmol)을 100 Ml의 디클로로메탄 (DCM)에 용해하여 0℃로 냉각하였다. 4.43 g의 에틸 트리플루오로아세테이트 (31.2 mmol, 1 당량/분자)를 100 mL의 DCM으로 희석하고 교반된 용액에 4시간에 걸쳐서 적가하였다. 첨가 후 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날, 19.46 mL의 트리에틸아민 (14.2 g, 0.1404 mol, 1.5 당량/유리 아민)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 30.64 g의 디-tert-부틸디카보네이트 (0.1404 mol, 1.5 당량/아민)를 100 mL의 DCM에 용해하고, 교반된 용액에 적가하여 실온에서 24시간 동안 일정한 교반 하에 인큐베이션하였다. 반응 후 유기상을 약 100 mL로 농축하고 5% NaHCO3로 3회 및 물로 3회 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4로 건조하고 여과하여 용매를 증발시켰다. 생성물을 100 mL의 메탄올과 200 mL의 3 M NaOH (20 당량/분자)로 희석하고 밤새 실온에서 교반하였다. 메탄올을 증발시키고 수용액을 DCM으로 3회 세척하였다. 유기상을 모아서 무수 Na2SO4로 건조하고 여과 및 증발시켰다. 수득된 분자 (EPE(Boc)3)를 H1-NMR로 분석하였다.
II. Fmoc-글루탐산 변형 보실화 (bocylated) N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (Fmoc-Glu(EPE(Boc)3-OH)의 합성
3.5 g의 N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-L-글루탐산 (Fmoc-Glu-OH, 9.47 mmol)을 100 mL의 아세트산 무수물과 혼합하고, 유탕조에서 환류 및 일정한 교반 하에 용액이 투명해질 때까지 100℃로 가열하였다. 용액을 얼음 중에서 냉각시키고 용매를 60℃에서 진공 증발을 통해 제거하였다. 생성물을 100 mL의 테트라히드로푸란에 용해하였다. 5.24 g의 EPE(Boc)3 (11.37 mmol, 1.2 당량/분자)를 100 mL의 테트라히드로푸란으로 희석하고 3.3 mL의 N,N-디이소프로필에틸아민 (18.94 mmol, 2 당량/분자)과 혼합하고 글루탐산을 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 증발시켜서 농축한 후, DCM으로 희석하고 트리소듐-시트레이트 완충제 (0.1 M, pH 5.5)으로 3회 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4로 건조한 후, 시료를 실리카 칼럼 상의 건식 칼럼 플래쉬 크로마토그래피로 헵탄/에틸 아세테이트 (50/50 내지 0/100) 및 에틸 아세테이트/메탄올 (100/0 내지 80/20)의 계단식 구배를 사용하여 정제하였다. 실리카 TLC 상에서 UV 신호를 함유하는 분획을 모으고 (pooled), 용매를 증발시키고 생성물을 H1-NMR로 분석하였다.
제조예 III:
고체 지지 펩티드 합성에 의해 선형 및 분지형 폴리머의 생성을 위한 올리고(알킬렌 아민) 빌딩 블록의 합성:
I. 디(Boc) 보호된 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (EPE(Boc)2)의 합성.
5 g의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (31.2 mmol)을 100 mL의 디클로로메탄 (DCM)에 용해하여 0℃로 냉각하였다. 8.86 g의 에틸 트리플루오로아세테이트 (31.2 mmol, 1 당량/분자)를 100 mL의 DCM으로 희석하고 교반된 용액에 4시간에 걸쳐서 적가하였다. 첨가 후 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날, 13 mL의 트리에틸아민 (9.74 g, 0.0936 mol, 1.5 당량/유리 아민)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 20.43 g의 디-tert-부틸디카보네이트 (0.0936 mol, 1.5 당량/아민)를 100 mL의 DCM에 용해하고, 교반된 용액에 적가하여 실온에서 24시간 동안 일정한 교반 하에 인큐베이션하였다. 반응 후 유기상을 약 100 mL로 농축하고 5% NaHCO3로 3회 및 물로 3회 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4로 건조하고 여과하여 용매를 증발시켰다. 생성물을 100 mL이 메탄올과 200 mL의 3 M NaOH (20 당량/분자)로 희석하고 밤새 실온에서 교반하였다. 메탄올을 증발시키고 수용액을 DCM으로 3회 세척하였다. 유기상을 모아서 무수 Na2SO4로 건조하고 여과 및 증발시켰다. 수득된 분자 (EPE(Boc)3)를 H1-NMR로 분석하였다.
II. 석시닐화, fmoc-보호된, 보실화 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (FmocEPE(Boc)2OH)의 합성.
3.0 g의 (EPE(Boc)2) (8.3 mmol)을 50 mL의 테트라히드로푸란에 용해하고 0℃로 냉각시켰다. 0.996 g의 석신산 무수물 (10 mmol, 1.2 당량/분자)을 200 mL의 테트라히드로푸란에 용해시키고 교반된 용액에 적가하였다. 첨가 후 반응물을 실온에서 추가 1시간 동안 교반하였다. 4.34 mL의 N,N-디이소프로필에틸아민 (33.2 mmol, 4 당량/분자)을 첨가한다. 그 후에 아세토니트릴/테트라히드로푸란에 용해된 4.2 g의 Fmoc N-히드록시석시니미드 에스테르 (12.45 mmol, 1.5 당량/분자)를 반응 혼합물에 적가한다. 그 용액을 밤새 교반한다. 반응 혼합물을 대략 100 ml로 농축하고, 100 ml의 디클로로메탄과 혼합한 후 0.1 M 소디움 시트레이트 완충제 (pH 5.2)로 5회 세척한다. 유기상을 건조시키고, 농축하여 수득된 생성물을 건조-칼럼 플래쉬 크로마토그래피로 실리카 칼럼 상에서 n-헵탄 내지 에틸 아세테이트 (50/50 내지 0/100) 및 메탄올 중의 에틸 아세테이트 (100/0 내지 80/20)로의 계단식 구배를 사용하여 정제한다. 실리카 TLC 상에서 UV 신호를 함유하는 분획을 모으고, 용매를 증발시켜서 생성물을 H1-NMR로 분석하였다.
제조예 IV:
N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민에 기반한 리피도이드의 합성
100 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623 mmol)을 575.07 mg의 1,2-에폭시도데칸 (3.12 mmol, (N-1) 당량, 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2배 양의 일차 아민 + 1배 양의 이차 아민임)과 혼합하고 96시간 동안 80℃에서 일정한 교반 하에 혼합하였다. 반응 후에 수득된 리피도이드를 25 mM 소디움 아세테이트 완충제 (ph 5)를 이용해 100 μg/mL의 농도로 희석하고 형질감염에 사용하였다.
동일한 조건하에서, 표 2에 열거된 리피도이드를 합성하였다:
[표 2]
합성된 리피도이드의 목록
Figure pct00032
제조예 V:
N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 변형 폴리(알릴아민); (PALAM-(2-3-2))의 합성
500 mg의 폴리(알릴아민)-용액 (Sigma-Aldrich, 20% w/w, 분자량: 17,000 Da)을 50 mM MES를 함유하는 2 mL의 반응 완충제 (pH 6.0)로 희석하였다. 10.33 g의 석신산 (아민 당 50 당량, Sigma-Aldrich)을 5 mL의 동일 반응 완충제로 희석하였다. 용액을 모으고 pH를 6.0으로 다시 조정하였다. 반응을 개시하기 위하여, 5 mL의 반응 완충제로 희석된, 3.36 g의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (아민 당 EDC, 10 당량, Sigma Aldrich)를 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온으로 오버헤드 진탕기에서 인큐베이션하였다. 생성물을 투석에 의해 정제하였다. 이를 위하여, 반응 혼합물을 slide-a-lyzer 투석 카세트 (3-12 mL, MWCO: 10,000 Da, Thermo Fisher)에 충전하여 물에 대해 72시간 동안 투석하였다. 물을 1일 2회 교환하였다. 투석 후, 정제된 폴리머를 동결건조하였다.
5 mg의 동결건조된, 석신산 변형 폴리(알릴아민)을 50 mM MES를 함유하는, 2 mL의 반응 완충제 (pH 6.0)로 희석하였다. 510.38 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (100 당량/카복실기, Sigma Aldrich)을 2 mL의 동일 완충제로 희석하였다. 올리고(알킬렌 아민)을 유리 염기로 구입함에 따라, 32% HCl을 적가하여 pH를 6.0으로 다시 조정하였다. 폴리(알릴아민) 및 올리고(알킬렌 아민) 용액을 혼합하였다. 반응을 개시하기 위하여, 카복실기당 10배 몰 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC, Sigma Aldrich, 4 mL 반응 완충제로 희석)를 첨가하였다. 최종 부피를 10 mL로 조정하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온으로 오버헤드 진탕기에서 인큐베이션하였다. 생성물을 투석에 의해 정제하였다. 이를 위하여, 반응 혼합물을 slide-a-lyzer 투석 카세트 (3-12 mL, MWCO: 3,500 Da, Thermo Fisher)에 충전하여 물에 대해 72시간 동안 투석하였다. 물을 1일 2회 교환하였다. 투석 후, 정제된 폴리머를 동결건조하였다.
동일한 조건하에서, 하기의 표 3에 기재된 폴리머를 합성 및 시험하였다:
[표 3]
합성된 올리고(알킬렌 아민) 변형 폴리머에 기반한 폴리(알릴아민)의 목록
Figure pct00033
제조예 VI:
Synthesis of N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 modified poly프로필enimine (PPI-(2-3-2))
N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 변형 폴리프로필렌이민 (PPI-(2-3-2))의 합성
100 mg의 폴리프로필렌이민 헥사데카아민 덴드리머 (PPI, generation 3.0, Sigma Aldrich)를 50 mM MES를 함유하는 1.5 mL의 반응 완충제 (pH 6.0)에 용해하였다. 11.2 g의 석신산 (1차 아민당 100 당량, Sigma-Aldrich)을 30 mL의 동일한 반응 완충제에 용해하였다. 용액을 모아서 pH를 6.0으로 다시 조정하였다. 반응을 개시하기 위하여 2 mL의 반응 완충제에 희석된 1.81 g의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC, 1차 아민당 10 당량, Sigma Aldrich)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 오버헤드 진탕기에서 밤새 인큐베이션하였다. 생성물을 투석에 의해 정제하였다. 이를 위하여, 반응 혼합물을 slide-a-lyzer 투석 카세트 (3-12mL, MWCO: 2,000 Da, Thermo Fisher)에 충전하여 물에 대해 72시간 동안 투석하였다. 물을 1일 2회 교환하였다. 투석 후, 정제된 폴리머를 동결건조하였다.
10 mg의 동결건조된, 석신산 변형 PPI를 50 mM MES를 함유하는, 2 mL의 반응 완충제 (pH 6.0)로 희석하였다. 0.776 g의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (100 당량/카복실기, Sigma Aldrich)을 2 mL의 동일한 완충제로 희석하였다. 올리고(알킬렌 아민)을 유리 염기로 구입함에 따라, 32% HCl을 적가하여 pH를 6.0으로 다시 조정하였다. 폴리프로필렌이민 및 올리고(알킬렌 아민) 용액을 혼합하였다. 반응을 개시하기 위하여, 카복실기당 10배 몰 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC, Sigma Aldrich, 4 mL의 반응 완충제로 희석)를 첨가하였다. 최종 부피를 10 mL로 조정하였다. 혼합물을 5시간 동안 실온으로 오버헤드 진탕기에서 인큐베이션하였다. 생성물을 투석에 의해 정제하였다. 이를 위하여, 반응 혼합물을 slide-a-lyzer 투석 카세트 (3-12 mL, MWCO: 3,500 Da, Thermo Fisher)에 충전하여 물에 대해 72시간 동안 투석하였다. 물을 1일 2회 교환하였다. 투석 후, 정제된 폴리머를 동결건조하였다.
동일한 조건하에서, 이하의 표 4에 기재된 폴리머를 합성 및 시험하였다:
[표 4]
폴리(알릴아민)에 기반한 합성된 올리고(알킬렌 아민) 변형 폴리머의 목록
Figure pct00034
제조예 VII:
N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 및 1-브로모데칸에 기반한 리피도이드의 합성
100 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623 μmol)을 10 mL의 테트라히드로푸란 (THF)과 혼합하였다. 815.2 μL의 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA)과 690.1 mg의 1-브로모데칸 (3.12 μmol, (N-1) 당량, 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2배 양의 일차 아민 + 1배 양의 이차 아민임)과 혼합하고 22시간 동안 실온에서 일정한 교반 하에 혼합하였다. 생성물을 냉각된 n-핵산에서 2회 침전시키고 DCM에 용해하였다. 용매를 증발에 의해 60℃에서 제거하였다. 수득된 리피도이드를 에탄올로 50 mg/mL의 농도로 희석하고 4℃에서 보관하였다.
제조예 VIII:
N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 및 N-도데실 아크릴아미드에 기반한 리피도이드의 합성
100 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623 μmol)을 746.9 mg의 N-도데실 아크릴아미드 (3.12 μmol, (N-1) 당량, 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2배 양의 일차 아민 + 1배 양의 이차 아민임)와 혼합하고 192시간 동안 90℃에서 일정한 교반 하에 혼합하였다. 수득된 리피도이드를 에탄올로 50 mg/mL의 농도로 희석하고 4℃에서 보관하였다.
제조예 IX:
N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 및 도데실 아크릴레이트에 기반한 리피도이드의 합성
100 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623 μmol)을 750 mg 도데실 아크릴레이트 (3.12 μmol, (N-1) 당량, 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2배 양의 일차 아민 + 1배 양의 이차 아민임)와 혼합하고 22시간 동안 90℃에서 일정한 교반 하에 혼합하였다. 수득된 리피도이드를 에탄올로 50 mg/mL의 농도로 희석하고 4℃에서 보관하였다.
제조예 X:
N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 및 1,2-에폭시도데칸에 기반한 리피도이드의 합성
100 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623 mmol)을 575.07 mg의 1,2-에폭시도데칸 (3.12 mmol, (N-1) 당량, 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2배 양의 일차 아민 + 1배 양의 이차 아민임)과 혼합하고 96시간 동안 80℃에서 일정한 교반 하에 혼합하였다. 수득된 리피도이드를 에탄올로 50 mg/mL의 농도로 희석하여 4℃에서 보관하였다.
실시예 1
mRNA를 상이한 세포주 내로 운반하는 양이온성 폴리머의 능력에 대한 시험
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
시험관 내 형질감염을 위해, 폴리플렉스를 44 μL의 부피로 형성하였다. 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는, 1100 ng의 mRNA (25%의 5-메틸시티딘 및 2-티오유리딘 각각을 포함하는 화학적으로 변형된 mRNA)를 함유하는 주사용수 22 μL를 목적하는 양의 폴리머를 함유하는 22 μL의 주사용수와 혼합하였다. 폴리머 대 RNA 비를 핵산 포스페이트기당 폴리머 질소 (N/P)로 정의하였고, 일정한 양의 핵산을 사용하여 시험하였다. 핵산과 폴리머를 혼합한 후, 시료를 30분간 실온에서 인큐베이션하고 형질감염에 사용하였다.
폴리플렉스의 시험관 내 형질감염:
폴리머를 2개의 상이한 세포주 (NIH3T3 및 A549)에 대한 형질감염 효능에 대해 시험하였다. 처리 24시간 전에, 100 μL 배지 중의 5,000개 세포 (NIH3T3) 또는 7,000개 세포 (A549)를 96-웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 형질감염 당일에 폴리플렉스를 기술된 바와 같이 형성하였다. 상이한 mRNA 양을 시험하기 위해 연속 희석을 50%의 폴리플렉스 용액과 동량의 (FCS 무함유) 배지와 혼합하여 수행하고, 이 용액을 취하여 유사한 추가 희석 단계 등을 최종 농도가 62.5 ng/20 μL에 이를 때까지 수행하였다. 20 μL의 매 희석 단계를 배지 교환없이 세포에 첨가하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 제거하였다. 세포에 100 μL의 용균 완충제 (25 mM Tris HCl, 0.1% TritonX 100, pH 7.8)를 첨가하고 20분간 실온에서 인큐베이션하여 세포를 용균하였다. 80 μL의 용해물을 화이트 96-웰 플레이트의 웰에 충전하고 Wallac Victor2 (Perkin Elmer)에서의 루시퍼라제 활성 측정에 사용하였다. 이를 위하여 100 μL의 루시퍼라제 분석 시약 (0.5 mM D-루시페린, 0.3 mM 코엔자임 A, 33 mM DTT, 0.5 mM ATP, 1 mM 탄산마그네슘, 2.7 mM 황산마그네슘, 0.1 mM EDTA, 20 mM 트리신)을 첨가하고 화학발광을 결정하였다. 실험을 3회 반복 수행하였다.
결과
도 1에 나타난 바와 같이, 루시퍼라제의 발현 수준은 상이한 변형 폴리머 간에 극도로 달랐다. 모든 세포 유형에 대해 가장 효율적인 형질감염 수준은 PAA8k-(2-3-2) 또는 PAA8k-(3-2-3)을 사용하여 달성될 수 있는 반면, 알킬쇄 중 하나가 대체 ((2-2-2) 및 (3-3-3))되거나, 제거 (2-2)된 올리고(알킬렌 아민) 측쇄를 함유하는 변형 폴리머는 효능이 10-1000배까지 급격하게 감소하였다. 올리고(알킬렌 아민) (3-4-3)에서 모든 알킬쇄의 연장은 또한 효능을 100배까지 저하시켰다.
실시예 2
(2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 PAA8k의 복합체 형성 및 mRNA 결합능
재료 및 방법
겔 이동 어세이:
폴리플렉스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 N/P 1, 2, 4, 8 및 12로 형성하였다. 인큐베이션한 후, 5 μL의 시료를 10분간 70℃에서 인큐베이션한 5 μL의 2× RNA 로딩 염료 (Fermentas)와 혼합하고 에티듐 브로마이드를 함유하는 1% 아가로스 겔에 로우딩하였다. TBE-완충제에서 150 V로 30분간 겔 이동을 수행하였다. 이동된 핵산을 UV 흡수로 260 nm에서 가시화하였다.
리보그린 (RiboGreen) 어세이:
폴리플렉스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 N/P 1, 2, 4, 8 및 12로 형성하였다. 인큐베이션한 후, 2 μL의 시료를 148 μL의 물 및 50 μL의 리보그린 용액 (1:200, QuantiT Ribogreen RNA Assay Kit, Invitrogen)과 화이트 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 시료를 5분간 실온에서 빛을 차단한 상태에서 인큐베이션하고 형광을 Wallac Victor2 (Perkin Elmer, 1s, Ex.: 485 nm, Em.: 535 nm)을 사용하여 측정하였다.
결과
핵산과 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 폴리머의 능력은 효율적인 운반 시스템의 중요한 특징이다. 변형 폴리머와 mRNA의 상호작용을 겔 이동 (도 2) 및 리보그린 어세이 (도 3)으로 분석하였다. 폴리머가 핵산과 상호작용하여 안정한 복합체를 형성할 수 있는 경우, 이는 나노크기 입자 및 전하 역전을 초래한다. 두 효과로 인해 아가로스 겔 전기영동에서 이동능이 방해된다. 도 2에 나타난 바와 같이, (2-3-2) 또는 (3-2-3)으로 변형된 PAA8k는 폴리머 부재의 대조군 (N/P 0)에 비해 유리 mRNA의 부재/강력한 감소를 유발하였으며, 이는 강력한 상호작용을 시사한다. 이 결합은 판단기준 (gold standard) 분지형 PEI (brPEI)만큼 효율적이었다.
이러한 데이터는 리보그린 어세이를 사용하여 확인할 수 있다. 이 분석에서, 증가된 결합 효율은 감소된 형광 신호를 초래한다. 도 3에 나타난 바와 같이, 형광 신호의 감소는 PAA8k-(2-3-2) 및 -(3-2-3)에 대해 brPEI만큼 강력하였다. 따라서, 유사한 안정성을 갖는 복합체가 형성되었다.
실시예 3
형질감염 효율은 폴리머 골격에 독립적임
재료 및 방법
실시예 1에 따라 폴리플렉스 형성을 수행하였다.
폴리플렉스의 시험관 내 형질감염
폴리플렉스의 시험관 내 형질감염 및 효율 시험을 위해 NIH3T3 세포를 사용하였다. 처리 24시간 전에 10% FCS를 함유하는 100 μL 배지 중의 5000개 세포를 96-웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 형질감염 당일에 배지를 FCS 무함유의 100 μL의 배지로 교환하였다. 폴리플렉스를 상기한 바와 같이 형성하였다. 상이한 mRNA를 시험하기 위해 20 μL (500 ng), 10 μL (250 ng), 5 μL (125 ng) 및 2.5 μL (62.5ng)를 배지에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 10% FCS를 함유하는 새로운 배지로 교체하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 제거하였다. 세포를 용균하여 실시예 1에서와 같이 분석하였다.
결과
(2-3-2) 변형 폴리머를 사용하여 핵산을 세포 내로 운반하는 능력이 골격 구조와 독립적임을 확인하기 위해, 다양한 유형의 폴리머 (폴리(아크릴산) 외, 8,000 Da 실시예 1)가 기술된 조건 (표 1) 하에서 (2-3-2)로 변형되었다. 그 결과, 올리고(알킬렌 아민) (2-3-2)로 변형된 경우, 상이한 유형의 골격-폴리머 (도 4)뿐만 아니라 상이한 쇄 길이 (도 5)가 유의미한 리포터 유전자의 발현을 초래하는 것으로 나타났다.
실시예 4
상이한 유형의 올리고(알킬렌 아민)으로 변형된 폴리머의 세포 독성 확인
재료 및 방법
형질감염을 실시예 3에 따라 수행하였다. 살아있는 세포에 대한 결정을 TACS MTT 세포 증식 어세이 (Trevigen)를 사용하여 수행하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 100 μL의 새로운 배지로 교체하였다. 10 μL의 MTT 시약을 첨가한 후, 세포를 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 100 μL의 계면활성제를 첨가한 다음, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 570 nm에서 Wallac Victor2 (Perkin Elmer)를 사용하여 흡광도 측정에 의해 판독하였다. 결과를 미처리된 대조군과 비교하여 살아있는 세포 (%)로 나타내었다.
결과
도 6에 나타난 바와 같이, 상이한 변형 폴리머는 세포 독성 측면에서 다양하다. (2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 폴리(아크릴산)을 함유하는 복합체로 처리된 세포는 약 100%의 생존률을 나타낸 반면 (PAA8k-(2-3-2), PAA8k-(3-2-3), PAA20k-(2-3-2), PAA70k-(2-3-2)), 측쇄 유형에서의 다른 변경 (PAA8k-(3-4-3), PAA8k-(3-3-3))은 독성 표준 (brPEI)과 비교하여 강력한 독성을 나타내었다.
실시예 5
마우스에서 메신저 RNA 운반 효율
재료 및 방법
동물:
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 Janvier (Route Des Chenes SecsBP5, F-53940 Le Genest St. Isle, France)로부터 입수하였고, 특정 병원균-부재 조건하에서 유지하였다. 마우스를 적어도 실험 7일 전에 동물 시설 환경에 적응시켰다. 모든 동물 과정은 지역윤리위원회가 승인 및 관리하였으며 동물 생태 보호에 대한 독일법의 가이드라인을 준수하였다.
폴리플렉스 형성:
폴리플렉스를 다음과 같이 제제화하였다: mRNA 및 PAA20k-(2-3-2)를 4.0 ml의 2차 증류수로 희석하여 500 μg/ml의 mRNA 및 PAA20k-(2-3-2)의 농도를 N/P 10, 20, 30 또는 40에 해당하는 농도로 얻었다. mRNA 용액을 폴리머 용액에 피펫팅하고 위아래 피펫팅으로 혼합하여 250 μg/ml의 최종 mRNA 농도를 얻었다. 복합체를 사용 전에 주위 온도에서 20분간 인큐베이션하였다.
에어로졸 장치의 설계:
전신 장치의 분무 방법을 위해, 마우스를 뚜껑으로 밀폐될 수 있는 9.8×13.2×21.5 cm 플라스틱 박스에 넣었다. 박스의 좁은 한 측면에 4개의 작은 구멍을 에어로졸 유출구로 배치하였다. 반대쪽 좁은 측면 전체에 걸쳐서 박스를 2.1 cm 직경 연결 조각을 통해 폭 15.4 cm×길이 41.5 cm 플라스틱 실린더에 연결하였다. 실린더 바닥은 실린더의 다른 말단에 연결된 제트 네뷸라이저 (PARI BOY® LC plus, PARI GmbH)로 생성된 에어로졸의 건조를 위한 150 g의 실리카 겔 (1-3 mm, #85330; Fluka, Switzerland)로 고르게 덮었다. (Rudolph et al., J Gene Med. 2005, 7: 59-66에 상세히 기술됨).
마우스 폐에서 생체 내 생체발광 영상화를 사용한 Luc 활성의 측정:
투여 24시간 후에 마우스를 경추탈골에 의해 안락사시켰다. 중앙부위 절개로 개복한 후, 동물로부터 폐를 적출하여 PBS로 관류하였다. 폐를 액체 질소 중에서 급속 냉동하고 냉동된 상태에서 균질화하였다. 400 μL의 용균 완충제 (250 mM 트리스 pH 7.8, 0.1 % 트리톤 X-100, Roche 완전 프로테아제 저해제 칵테일 정제)를 첨가하고 20분간 빙냉에서 인큐베이션한 후, 상청액 중의 루시퍼라제 활성을 Lumat LB9507 튜브 루미노미터 (EG&G Berthold, Munich, Germany)를 사용하여 측정하였다.
결과
본 실험은 mRNA가 PAA20k-(2-3-2)와의 조합으로서 폐 에어로졸 전달시 마우스의 폐 세포에서 효과적으로 발현되는 것을 나타내는 것으로, 폴리머가 생체 내 폐 세포에 mRNA를 효율적으로 운반할 수 있음을 시사한다 (도 7 참조).
실시예 6
돼지에서 메신저 RNA 운반 효율
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
생체 내 형질감염을 위해 폴리플렉스를 28 mL의 부피로 형성하였다. 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 5.83 mg의 mRNA와 β-갈락토시다제를 코딩하는 1.17 mg의 mRNA를 함유하는 14 mL의 주사용수 및 목적하는 양의 폴리머를 함유하는 14 mL의 주사용수를 제조하여 2채널 시린지 펌프 (KDS-210-CE; KD Scientifc)로 혼합하였다. 2개의 20 mL 시린지를 장치의 회수 (withdrawal) 기능을 사용하여 충전하였다. T-피스 (T-piece) (Discofix C 3SC, B.Braun)를 통해 시린지를 연결하고 혼합 장치의 주입 기능을 사용하여 혼합을 수행하였다. 폴리머 대 mRNA 비는 핵산 포스페이트기당 폴리머 질소 (N/P)로 정의되며, N/P 10으로 시험하였다. 핵산과 폴리머를 혼합한 후, 시료를 30분간 실온에서 인큐베이션하고 24 mL를 분무에 사용하였다. 잔여 부피를 물리화학적 분석에 사용하였다. 순수 시료의 입자 크기와 제타 전위를 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments)를 사용하여 측정하였다.
돼지에의 에어로졸 적용을 위한 실험적 방법:
돼지에 체중 1 kg 당 2 mg의 아자페론, 체중 1 kg 당 15 mg의 케타민, 체중 1 kg 당 0.1 mg의 아트로핀으로 사전투약하여 진정시킨 다음, 측면 귀 정맥에 정맥내 선을 삽입하였다. 필요에 따라 돼지에 체중 1 kg 당 3-5 mg의 프로포폴을 정맥내 주사하여 마취시켰다. 필요에 따라 1% 프로포폴의 정맥내 연속주입으로 마취를 유지하였다. 환기 파라미터는 종말호기 (endexpiratory) 이산화탄소와 일치하였고, 필요에 따라 조절하였다. 마취, 호흡 및 심혈관 파라미터를 맥박 산소측정법, 카프노그래피 (capnography), 직장 온도 프로브 및 반사 상태를 이용하여 지속적으로 관찰하였다. 돼지에게는 10 ml/kg/h의 균형 전해질 용액을 주입하였다. 마취 기간은 대략 80-120 분이었다. 에어로졸 적용 (에어로넵 메쉬 네뷸라이저)이 완료되고 진정시킨 후, 돼지를 측부 귀 정맥을 통해 100 mg/kg 체중의 펜토바비탈을 볼루스 주사하여 치사하였다. 폐를 절제하고 약 1 cm 두께의 슬라이스 조직편을 다양한 폐 영역에서 수집한 후 이어서 인큐베이터에서 24시간 동안 37℃, 5% CO2로 세포 배양 배지에서 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성의 측정을 위해 조직편을 PBS (100 μg/ml) 중의 D-루시페린 기질을 포함하는 배지 bath 중에서 37℃로 30분간 인큐베이션하고 생체 외 루시퍼라제 생체발광 영상화를 수행하였다 (IVIS 100, Xenogen, Alameda, USA).
폴리플렉스의 투과전자 현미경:
투과전자 현미경 (TEM)에서는, 에어로졸 적용을 위해 제조된 혼합물의 1 액적을 사용하였다. 액적을 격자판 (Plano GmbH, Wetzlar) 위에 올려두었다. 5분간 인큐베이션한 후, 여과지를 사용하여 액적을 제거하였다. 시료를 우라닐 아세테이트 용액으로 염색하고 투과전자 현미경으로 분석하였다 (Jem 1011, Jeol).
결과
도 8에 나타난 바와 같이, 10의 N/P-비에서 PAA20k-(2-3-2) 및 mRNA는 100 nm 미만의 수력학적 복합체 직경과 40 mV의 표면 전하 (제타 전위)를 갖는 복합체를 생성하였다. 두 파라미터는 생체 내에서 핵산을 세포 내로 효과적으로 운반하는 것으로 이미 입증된 brPEI 기반 복합체와 동일한 크기의 범위이다. TEM으로 분석했을 때 입자들은 둥근 모양 및 균일한 크기를 나타내었다 (도 9). 도 10에 나타난 바와 같이, 이 입자들은 에어로졸 적용 후에 폐 조직에 mRNA (반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는)를 효율적으로 전달하여 표적 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 발현 수준은 판단기준 brPEI로 형성된 폴리플렉스의 분무화에 필적하였다.
실시예 7
복합체의 동결건조 안정성
재료 및 방법
시료의 제조
PAA20k-(2-3-2)/mRNA (메트리디아 (metridia) 루시퍼라제를 코딩하는) 복합체를 실시예 1에 기술된 바와 같이 4개의 상이한 바이알에서 N/P 20으로 1 mL의 부피로 형성하였다. 하나의 바이알은 형질감염을 위한 추가 처리없이 사용하였고, 2번째 바이알에는 100 μL의 11% 트레할로스를 1% 트레할로스의 최종 부피가 되도록 첨가하였다. 3번째 바이알은 동결건조하고 1 mL의 물로 재수화하였다. 4번째 바이알은 동결건조 및 또한 1 mL의 물로의 재수화 전에 100 μL의 11% 트레할로스로 처리하였다.
형질감염:
형질감염 24시간 전에 100 μL 배지 중의 5,000개 NIH3T3 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 형질감염 당일에 배지를 FCS 무함유의 100 μL의 새로운 배지로 교환하였다. 20, 10, 5 및 2.5 μL의 모든 복합체 용액을 세포에 3회 반복 첨가하여 500, 250, 125 및 62.5 ng으로 형질감염을 유발하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 제거하고 수집한 후 새로운 배지로 교체하였다. 48시간 및 72시간 후에 이를 반복하였다. 모아진 배지를 메트리디아 루시퍼라제 활성에 대해 분석하였다. 이를 위하여 50 μL의 배지를 화이트 96-웰 플레이트에 충전하고 20 μL의 코엘렌테라진 (coelenterazine) 용액 (50 mM 소듐 포스페이트-완충제 중의 50 μM 코엘렌테라진)과 혼합하여 Wallac Victor2 (Perkin Elmer)를 사용하여 화학발광 신호를 측정하였다.
결과
도 11에 나타난 바와 같이, 새로운 복합체는 24시간 후에 메트리디아 루시퍼라제 발현을 유도하였다. 발현은 추가 24시간 동안 계속 안정하였고, 이후 서서히 감소하였다. 이 효과는 트레할로스의 첨가에 의해 부정적인 영향을 받지는 않았지만 약간 감소된 발현 수준을 초래하였다. 동결건조 후 미처리 복합체는 세포를 형질감염할 수 없어서 리포터 단백질 발현의 부재를 유발하였다. 이에 반해 트레할로스 첨가는 복합체 및 초래된 형질감염 효율을 보존하였다.
실시예 8
플라스미드 DNA의 운반 시스템으로서 PAA8k-(2-3-2) 및 PAA8k-(3-2-3)의 용도
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
폴리플렉스를 mRNA 대신에 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 플라스미드 DNA (pCMVLuc, Plasmid Factory)를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 형성하였다.
폴리플렉스를 사용한 시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과
이 실험에서, DNA 운반 및 초래된 단백질 발현에서 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 변형 폴리머 (폴리(아크릴산)의 효율을 판단기준 분지형 PEI (brPEI, 도 12)와 비교하여 분석하였다. pDNA 및 올리고(알킬렌 아민) (2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 폴리머로 구성된 복합체를 사용한 NIH3T3 세포의 형질감염이 리포터 단백질 발현에서 유의미한 증가를 초래하는 결과가 명백히 확인되었다. 발현 수준은 판단 기준보다 더 높았다.
실시예 9
RNA 간섭을 유도하기 위한 siRNA의 운반 시스템으로서의 PAA20k-(2-3-2)의 용도
재료 및 방법
복합체를 실시예 1에 기술된 바와 같이 GL3-Luc siRNA (Qiagen)를 사용하여 형성하였다. siRNA 양의 적정을 위해 복합체를 실온에서 30분간 인큐베이션한 후에 단계적으로 희석하였다. 이를 위하여 22 μL의 복합체 용액을 FCS 무함유의 22 μL의 배지와 혼합하였다. 22 μL의 이 희석액을 다시 FCS 무함유의 22 μL의 배지와 혼합하였다. 이 연속 희석을 20 μL당 7.8 ng의 siRNA 농도가 달성될 때까지 반복하였다. 매 단계 희석의 20 μL를 반딧불이 루시퍼라제를 안정하게 발현하는 HeLa 세포 (HeLa-Luc)를 사용하여 실시예 1에서 기술된 바와 같이 형질감염에 사용하였다. 루시퍼라제 발현의 하향 조절에 기초한 RNA 간섭 특이성에 대한 대조군으로서, 세포 발현에 영향을 미치지 않는 대조군 siRNA (GFP22-siRNA; Qiagen)를 동일 조건 하의 형질감염에 사용하였다. 결과를 미처리 대조군 세포와 비교한 상대적 루시퍼라제 발현으로 나타내었다.
결과
도 13에 나타난 바와 같이 GL3-Luc-siRNA (siLuc)와 PAA20k-(2-3-2)의 복합체는 루시퍼라제 발현의 하향 조절을 초래하였다. 이 효과는 용량 의존적 (더 적은 양의 siRNA에서 감소된 효과) 및 특이적 (비특이적 siRNA (siGFP)에 대해 효과 없음)이었다. 더 높은 N/P 비에서 추가적인 비특이적 효과가 siGFP 처리 세포의 감소된 신호에 의해 나타나는 바와 같이 관찰할 수 있다.
실시예 10
올리고(알킬렌 아민) (2-3-2)에 기반한 리피도이드 구조의 유리한 mRNA 운반 효율
재료 및 방법
리피도이드/mRNA 복합체 형성
리피도이드를 제조예 IV에 기술된 바와 같이 합성하고 희석하였다. 형질감염을 위하여 50 μL의 물 중의 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 250 ng의 mRNA를 최적 조건 하에 50 μL의 물 중의 4,000 ng 리피도이드와 혼합하여 16의 w/w 비 (리피도이드 중량/mRNA 중량)을 얻었다. 실온에서 30분간 인큐베이션한 후, 시료를 형질감염에 사용하였다.
리피도이드/mRNA 복합체를 사용한 시험관 내 형질감염
처리 24시간 전에 100 μL 배지 중의 5,000개 NIH3T3 세포를 96-웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 형질감염 당일에 폴리플렉스를 기술된 바와 같이 형성하였다. 상이한 mRNA 양을 시험하기 위하여 연속 희석을 50%의 복합체 용액과 동량의 (FCS 무함유) 배지와 혼합하고, 이 용액을 취하여 15.6 ng/50 μL의 최종 농도를 달성할 때까지 유사한 추가 희석 단계 등을 수행하였다. 형질감염 전에 배지를 세포로부터 제거하고 FCS 무함유의 100 μL의 배지로 교환하였다. 매 희석 단계의 50 μL을 세포에 첨가하고 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 배지를 10% FCS를 함유하는 새로운 배지로 다시 교체하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 제거하였다. 세포를 용균하여 용해물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 리포터 단백질 활성에 대해 분석하였다.
결과
도 14에 나타난 바와 같이 구조 (2-3-2)에 기반한 리피도이드는 (2-2-2) 또는 (3-3-3)에 기반한 유사한 구조보다 더 높은 반딧불이 루시퍼라제의 발현 수준을 유발하였다. 이 효과는 부착된 알킬쇄 (C12 또는 C14)에 독립적으로 입증될 수 있다. 반딧불이 루시퍼라제의 활성이 세포 내에서 그의 발현 수준, 그에 따른 세포 내로의 mRNA 운반 효율과 연관되어 있으므로, 이러한 결과는 (2-3-2) 기반 리피도이드가 mRNA를 시험관 내에서 세포 내로 더 효율적으로 운반함을 나타낸다.
실시예 11
정맥 내 투여 후 리피도이드 제제의 메신저 RNA 운반 효율
재료 및 방법
동물:
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 Janvier (Route Des Chenes SecsBP5, F-53940 Le Genest St. Isle, France)로부터 입수하였고, 특정 병원균-부재 조건하에서 유지하였다. 마우스를 적어도 실험 7일 전에 동물 시설 환경에 적응시켰다. 모든 동물 과정은 지역윤리위원회가 승인 및 관리하였으며 동물 생태 보호에 대한 독일법의 가이드라인을 준수하였다.
리피도이드 제제:
리피도이드를 mRNA를 사용하여 다음과 같이 제제화하였다: C12-(2-3-2), DOPE, Chol 및 DSPE-PEG2k (3.6:0.18:0.76:1 중량비)를 에탄올에 용해하고 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 화학적으로 변형된 mRNA를 10.5의 지질/mRNA 중량비로 포함하는 시트르산염 완충 용액 (10 mM 시트르산, 150 mM NaCl, pH=4.5)에 신속히 주사하여 20%의 최종 에탄올 농도를 양산하고 물에 투석하였다. 수득된 리피도이드/mRNA 복합체는 양으로 하전된 나노입자 (92.6±0.7 nm; 21.0±0.2 mV)를 생성하였고 이를 진정된 마우스의 꼬리 정맥에 정맥 내 주입하였다. 2차 실험에서 리피도이드/mRNA 복합체를 정맥 내 주입 전에 PBS로 조절하여 거의 하전되지 않은 나노입자 (91.5±0.6 nm; -0.7±0.2 mV)를 초래하였다.
생체 내 생체발광 영상화를 사용한 마우스에서 Luc 활성의 측정:
투여 24시간 후에 마우스를 메데토미딘 (11.5 μg/kg BW), 미다졸람 (115 μg/kg BW) 및 펜타닐 (1.15 μg/kg BW)의 복강 내 주입으로 마취시켰다. D-루시페린 기질 (마우스당 3 mg/100 μL PBS)을 복강내 주입을 통해 적용하였다. 생체발광을 10분 후에 IVIS 100 영상화 시스템 (Xenogen, Alameda, USA) 및 다음의 카메라 세팅을 사용하여 측정하였다: Bin(HS), 관측시야 10, f1 f-스톱, 고해상 비닝 (binning) 및 노출시간 5 분. 시그널을 정량하고 리빙 이미지 소프트웨어 버젼 2.50 (Xenogen, Alameda, USA)을 사용하여 분석하였다.
결과
실험 결과, 리피도이드/mRNA 복합체는 물 중에서 제제화되는 것이 아니라 거의 중성 전하를 갖는 PBS 중에서 제제화된 경우에만 mRNA가 마우스의 복부 영역에서 효과적으로 발현되는 것으로 나타났다 (도 16 참조).
실시예 12
정맥 내 투여 후 마우스에서 상이한 장기에 대한 리피도이드 제제의 메신저 RNA 운반 효율
재료 및 방법
동물:
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 Janvier (Route Des Chenes SecsBP5, F-53940 Le Genest St. Isle, France)로부터 입수하였고, 특정 병원균 부재 조건하에서 유지하였다. 마우스를 적어도 실험 7일 전에 동물 시설 환경에 적응시켰다. 모든 동물 과정은 지역윤리위원회가 승인 및 관리하였으며 동물 생태 보호에 대한 독일법의 가이드라인을 준수하였다.
리피도이드 제제:
리피도이드를 mRNA를 사용하여 다음과 같이 제제화하였다: 리피도이드, DOPE, Chol 및 DMPE-PEG2k (8:6:5:1 몰비)를 에탄올에 용해하고 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 화학적으로 변형된 mRNA를 15의 N/P 비로 포함하는 시트르산염 완충 용액 (10 mM 시트르산, 150 mM NaCl, pH=4.5)에 신속하게 주입하여 20%의 최종 에탄올 농도를 얻어서 물에 투석하였다. 수득된 리피도이드/mRNA 복합체는 양으로 하전된 나노입자를 생성하였다. 리피도이드/mRNA 복합체는 정맥 내 주입 전에 PBS로 조절되어 거의 하전되지 않은 나노입자를 생성하였다 (표 5 참조).
[표 5]
Figure pct00035
생체 내 생체발광 영상화를 사용한 마우스에서 Luc 활성의 측정:
투여 24시간 후에 마우스를 메데토미딘 (11.5 μg/kg BW), 미다졸람 (115 μg/kg BW) 및 펜타닐 (1.15 μg/kg BW)의 복강 내 주입으로 마취시켰다. D-루시페린 기질 (마우스당 3 mg/100 μL PBS)을 복강 내 주입을 통해 적용하였다. 생체발광을 10분 후에 IVIS 100 영상화 시스템 (Xenogen, Alameda, USA) 및 다음의 카메라 세팅을 사용하여 측정하였다: Bin(HS), 관측시야 10, f1 f-스톱, 고해상 비닝 (binning) 및 노출시간 30초. 신호를 정량하고 리빙 이미지 소프트웨어 버젼 2.50 (Xenogen, Alameda, USA)을 사용하여 분석하였다. 이후, 장기를 절제하여 별도로 다시 영상화하였다.
결과
실험 결과, mRNA는 마우스의 복부 영역에서 효과적으로 발현되고 알킬쇄 길이가 감소함에 따라 증가하는 것으로 나타났다 (도 17 A, B 참조). 또한, 실험에서는 간으로의 mRNA 전달이 리피도이드의 알칸쇄 길이가 증가함에 따라 감소하였고 (C16<C14<C12) C16은 거의 검출 가능하지 않은 것으로 나타났다. 비장에서 루시퍼라제 발현은 C14가 가장 높았다. 일부 루시퍼라제 발현이 폐에서 관찰되었지만, 심장, 신장, 위 또는 뇌에서는 관찰되지 않았다 (도 18 A, B 참조).
실시예 13
pDNA 및 mRNA를 전달하는 이들의 능력에 대한 상이한 형질감염 시약의 효율 비교
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
폴리플렉스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 플라스미드 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 DNA (pCMVLuc, Plasmid Factory) 또는 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 사용하여 형성하였다.
폴리플렉스를 사용한 시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과
본 실험은 형질감염 효율이 형질감염 배지 (폴리머/리피도이드) 또는 또한 핵산의 유형에 독점적으로 연관되는지를 입증하기 위해 수행하였다. 결과 (도 19)는 pDNA를 효율적으로 운반하는 형질감염 시약이 반드시 mRNA 운반의 효율적인 비히클인 것은 아님을 명백히 나타내고 있다. 따라서, pDNA에 대해 높은 형질감염 효율을 갖는 담체 시스템이 효율적인 예측 mRNA를 허용하는 것은 아니다.
실시예 14:
N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 또는 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-부탄디아민 (2-4-2)으로 변형된, PAA8k의 형질감염 효율 비교
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
폴리플렉스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 형성하였다.
폴리플렉스를 사용한 시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과
(2-3-2)로 변형된 폴리머의 효율이 구조 (2-3-2)와 강력하게 연관되어 있거나 X>2인 다른 구조 2-X-2에 대해 비슷한 효율을 보이는지를 추가로 조사하기 위해, PAA8k를 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-부탄디아민 (2-4-2)으로 변형하였다. PAA8k-(2-3-2)와 PAA8k-(2-4-2)의 비교 (도 20)에서, 두 폴리머는 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA의 형질감염 후에 거의 동일하게 높은 수준의 루시퍼라제 발현을 유발하는 것으로 나타났다. 이는 X>2인 구조 (2-X-2)로 변형된 폴리머가 일반적으로 다른 올리고(알킬 아민)으로의 변형에 비해 향상된 mRNA 운반 효율을 갖는 형질감염 시약을 초래함을 입증한다.
실시예 15:
리피도이드 제제의 투과전자 현미경
재료 및 방법
리피도이드 제제:
리피도이드를 mRNA로 다음과 같이 제제화하였다: C10-(2-3-2), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DSPE-PEG2k) 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DPG-PEG2k) (9:6:5:1 몰비)을 에탄올에 용해하고 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 화학적으로 변형된 mRNA를 17의 지질-질소/mRNA-포스페이트 몰비로 포함하는 시트르산염 완충 용액 (10 mM 시트르산, 150 mM NaCl, pH=4.5)에 신속하게 주입하여 20%의 최종 에탄올 농도를 양산하고 물에 24시간 투석하였다.
투과전자 현미경:
크기 분석을 위해, TEM (투과전자 현미경)을 10,000 및 60,000의 배율로 사용하였다. 제1 단계로, 구리계 플레이트 (Plano GmbH; S162-3)를 플라즈마로 세정하였다. 이렇게 처리한 후, 8 μL의 리피도이드 제제를 구리 플레이트와 3분간 접촉시켰다. 리피도이드 제제 액적의 제거 후, 리피도이드가 로우딩된 구리 플레이트를 8 μL의 우라닐 아세테이트 용액 1방울과 30초간 2회 접촉시켜서 시료를 염색하였다. 매 단계 후에 액체를 압지로 회수하여 제거하였다. 마지막으로 담체 플레이트를 실온에서 추가 30분간 건조하고 Jem1011 (Jeol)로 분석하였다.
결과
TEM 사진 (도 21)은 형성된 리피도이드 제제가 균일한 크기 분포를 갖는 구형 입자임 (개략도)을 나타낸다. 확대 사진에서 이들 입자의 크기는 60-80 nm로 추정할 수 있다.
실시예 16
알실할라이드 (alcylhalide)를 통해 합성된 C10-(2-3-2)의 mRNA 운반 효율
재료 및 방법
합성:
C10-(2-3-2)의 합성을 제조예 VII하에 기술된 바와 같이 수행하였다.
리피도이드 제제:
리피도이드/mRNA 복합체를 실시에 15에 기술된 바와 같이 C10-(2-3-2), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DPG-PEG2k) (9:6:5:1 몰비) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 17로 사용하여 형성하였다.
시험관 내 형질감염:
처리 24시간 전에 100 μL 배지 중의 5,000개 NIH3T3 세포를 96-웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 형질감염 당일에 리피도이드 제제를 상기한 바와 같이 형성하고 10× PBS 용액을 이용해 1× PBS로 조절하였다. 리피도이드 제제를 희석하여 50 μL 중의 500 ng, 250 ng 또는 125 ng을 얻고, 세포에 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 제거하였다. 세포를 용균하고 용해물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 리포터 단백질 활성에 대해 분석하였다.
결과
도 22에 나타난 바와 같이, 알실할라이드를 통해 합성된 C10-(2-3-2)는 mRNA를 세포에 운반하여 리포터 단백질 루시퍼라제의 발현을 유발할 수 있다.
실시예 17
N-도데실아크릴아미드를 통해 합성된 C12-(2-3-2)의 mRNA 운반 효율
재료 및 방법
합성:
C12-(2-3-2)의 합성을 제조예 VIII 하에 기술된 바와 같이 수행하였다.
리피도이드 제제:
리피도이드/mRNA 복합체를 실시에 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DPG-PEG2k) (9:6:5:1 몰비) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 17로 사용하여 형성하였다.
시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 16에 기술된 바와 같이 웰당 500, 250 또는 125 ng의 mRNA 용량을 사용하여 수행하였다.
결과
도 23에 나타난 바와 같이 N-도데실 아크릴아미드를 통해 합성된 C12-(2-3-2)는 mRNA를 세포 내로 운반하여 루시퍼라제의 리포터 유전자 발현을 유발할 수 있다.
실시예 18
도데실-아크릴레이트를 통해 합성된 C12-(2-3-2)의 mRNA 운반 효율
재료 및 방법:
C12-(2-3-2)의 합성을 제조예 IX 하에 기술된 바와 같이 수행하였다.
리피도이드 제제:
리피도이드/mRNA 복합체를 실시에 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DPG-PEG2k) (9:6:5:1 몰비) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 17로 사용하여 형성하였다.
시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 16에 기술된 바와 같이 웰당 500, 250 또는 125 ng의 mRNA 용량을 사용하여 수행하였다.
결과
도 24에 나타난 바와 같이 도데실 아크릴레이트를 통해 합성된 C12-(2-3-2)는 mRNA를 세포 내로 운반하여 리포터 단백질 루시퍼라제의 발현을 유발할 수 있다.
실시예 19
상이한 헬퍼 지질 및 상이한 리피도이드 대 mRNA (N/P) 비를 사용하여 제제화된 C12-(2-3-2)의 mRNA 운반 효율
재료 및 방법
리피도이드 제제:
리피도이드/mRNA 복합체를 실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2)를, PEG-지질로서 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤-메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG2k), 헬퍼 지질로서 DOPE 또는 DSPC와 조합하고 N/P 비 17 또는 8을 사용하여 형성하였다.
시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 16에 기술된 바와 같이 웰당 250 ng의 mRNA 용량을 사용하여 수행하였다.
결과
도 25에 나타난 바와 같이 C12-(2-3-2)는 mRNA를 세포 내로 운반하여 상이한 헬퍼 지질 (DOPE, DSPC)과 조합하여 상이한 N/P 비 (17 또는 8)로 루시퍼라제의 리포터 유전자 발현을 초래할 수 있다. 따라서, C12-(2-3-2)는 헬퍼 지질 및 N/P 비에 대해 독립적으로 세포 내에 RNA를 효율적으로 운반한다.
실시예 20
C12-(2-2-2) 및 C12-(3-3-3)에 비해 C12-(2-3-2)를 갖는 리피도이드 제제의 정맥 내 투여 후 마우스에서 개선된 mRNA 운반 효율
재료 및 방법
동물:
실시예 11에 기술된 바와 같음.
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DMG-PEG2k) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 17로 사용함.
생체 내 생체발광 영상화를 사용한 마우스에서 Luc 활성의 측정:
실시예 11에 기술된 바와 같이, 투여 6시간 후 동물을 마취함.
결과
도 26에 나타난 바와 같이, C12-(2-3-2)가 포함된 리피도이드 제제는 C12-(3-3-3) 및 C12-(2-2-2)에 비해 마우스에서 유의미하게 증가된 리포터 유전자 발현을 유발하였다. 이는 C12-(2-3-2)의 유리한 mRNA 운반능을 입증한다.
실시예 21
상이한 양의 알킬쇄 C12로 포화된 올리고(알킬렌 아민) (2-3-2)의 mRNA 운반 효율 비교
재료 및 방법:
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 투석 없이 상이한 변형 정도 및 위치를 갖는 올리고(알킬 아민) (2-3-2) 사용 (도 27 A 참조, SynCom).
시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 16에 기술된 바와 같이 웰당 250 ng의 mRNA 용량을 사용하여 수행하였다.
결과
도 27 A에 나타난 바와 같이, 상이한 3개 버젼의 C12-(2-3-2)를 합성하여 mRNA 운반능에 대한 올리고(알킬렌 아민)당 알킬쇄의 양 및 위치의 영향을 평가하였다. 형질감염 효율 (도 27 B)은 리포터 단백질 발현에서 차이를 보이지 않았는데, 이는 mRNA 운반 효율의 차이를 관찰할 수 없음을 증명하였다. 따라서, 상이한 유형의 C12-(2-3-2) 리피도이드 제제는 동일한 효율로 mRNA를 운반한다.
실시예 22
리피도이드 제제의 동결건조
재료 및 방법
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같음.
동결건조 방법:
트레할로스, 수크로스 및 락토스의 보호제 용액을 물 (c: 20% w/v) 중에서 제조하였다. 2배수로 연속 희석물을 제조하여 20%에서 0.625% (w/v)까지의 보호제 용액을 생성하였다. 이 용액에 동일한 부피의 리피도이드 제제를 첨가하고 피펫팅으로 혼합하였다. 용액을 액체 질소로 냉동하고 시그마 알파 1-4 (Martin Christ)를 사용하여 동결건조하였다. 동결건조 후에 입자들을 동일 부피의 물로 재현탁하여 분석에 사용하였다. 대조군으로서 리포플렉스를 보호제 용액과 동일한 농도로 냉동 및 동결건조 없이 혼합하였다.
시험관 내 형질감염:
실시예 15에 기술된 바와 같이 웰당 233 ng의 mRNA를 사용함.
크기 측정:
입자의 수력학적 직경을 ZetaSier Nano ZS (Malvern)를 사용하여 측정하였다.
결과
도 28에 나타난 바와 같이, 시험된 당은 모두 상이한 농도에서 입자 크기와 형질감염 효율을 유지할 수 있었다. 비교적으로, 보호제 부재 (0%) 입자는 덜 효율적이 되고 응집 과정으로 인해 크기가 격렬히 증가하였다.
실시예 23
생체 외에서 포유동물 조직 내로 RNA의 운반
재료 및 방법
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), DOPE, 콜레스테롤, DPG-PEG2k 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 비 17로 투석 없이 사용함.
조직 시료의 처리:
약 1 cm3의 조직편 (근육, 지방, 동맥 또는 폐; 표 참조)을 바로 희생된 동물 (돼지 또는 양; 표 참조)로부터 취하고 PBS로 세척하였다. 모든 조직편 내에 10 μg의 RNA를 함유하는 100 μL의 리피도이드 제제 또는 20 μg의 RNA를 함유하는 200 μL의 리피도이드 제제를 주입하였다 (표 참조). 양 (sheep)의 동맥을 처리하는 경우에는, 리피도이드 제제를 실로 양쪽 말단을 폐색시킨 혈관 내강에 주입하였다. 조직을 24시간 동안 10% FCS를 함유하는 세포 배양 배지 (DMEM)에서 배양하였다.
루시퍼라제 발현의 분석:
24시간 후에 시료를 루시페린 (100 μg/mL)을 함유하는 PBS 중에서 30분간 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성을 생체 내 영상화 시스템 (IVIS, Perkin Elmer)을 사용하여 측정하였다.
결과
도 29에 나타난 바와 같이, C12-(2-3-2)는 상이한 종의 다양한 상이한 조직의 세포 내로 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA의 운반이 가능하여 루시퍼라제 발현을 초래하였다. 이와는 달리 미처리 시료 (D, E, 하위 조직편)는 영상 신호를 나타내지 않았다.
실시예 24
시험관 내에서 안지오텐신 (Angiotensin) I 전환 효소 2 (ACE-2)의 발현
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), DOPE, 콜레스테롤, DPG-PEG2k를 mRNA 첨가없이 사용하여, 공 (empty) 리포플렉스를 얻었다. 리피도이드 mRNA 복합체의 제제를 포스트 로우딩 (post loading)을 통해 수행하였다. 이를 위하여 ACE-2를 인코딩하는 1 μL의 mRNA (1 mg/ml)를 4 μL의 리포플렉스 함유 용액과 혼합하여 10분간 실온에서 인큐베이션하였다.
세포의 시험관 내 형질감염:
시험관 내 형질감염을 위하여 300,000개 HepG2 세포를 10% FCS를 함유하는 2 mL의 배지에서 6 웰 플레이트의 웰에 처리하기 24시간 전에 접종하였다. 형질감염 당일에 배지를 2 mL의 새로운 배지로 교환하였다. 리피도이드 제제를 기술된 바와 같이 제조하고 500 ng의 mRNA를 함유하는 2.5 μL를 각 웰에 첨가하였다. 대조군 웰에는 동량의 리피도이드 제제를 mRNA 첨가 없이 제제화 동안에 주입하였다.
웨스턴 블롯에 의한 ACE-2 발현의 검출:
형질감염 24시간 후에 배지를 제거하고 세포를 1 mL의 PBS로 세척하였다. 세포를 10분간 빙냉 하에 250 μL의 용균 완충액 (25 mM Tris-HCl, 0.1% TritonX, pH 7.4)을 사용하여 용균하였다. 용해물을 스크래핑 (scraping)한 후 찌꺼기를 14,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 제거하였다.
단백질 평가 (BCA-Assay, Thermo-Fisher scientific) 후에 레인당 10 μg을 10% SDS-PAGE 겔 (Thermo-Fisher scientific)에 로우딩하였다. 100 V에서 1.5시간 동안 전기영동한 후, 겔을 PVDF 막 (TransBlot Turbo, Biorad) 위에 블롯팅하였다.
블롯팅 후, 막을 TBS-T (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.5, 0.1% Tween20) 중의 5% 우유 분말을 사용하여 30분간 블로킹하였다. 블로킹 후, 막을 1:10,000 희석의 항-ACE2 항체 (R&D systems)로 4℃에서 밤새 탐침하였다. 3회의 세척 단계 (각각 10분, TBS-T) 후에 막을 1:10,000 희석의 항-염소-HRP 항체 (SCBT)로 1시간 동안 실온에서 탐침하고 3회 세척 (각각 10분, TBS-T)하였다. 신호를 발광성 HRP-기질 (GE healthcare)을 사용하여 현상하고 카메라 (ChemiDoc XRS+, Bio-Rad)를 사용하여 분석하였다. ACE2 신호의 검출 후, 동등한 로우딩을 1:1,000 희석의 항-GAPDH 항체 (NEB)를 사용하여 4시간 동안 실온에서 분석하였다.
결과
도 30에 형질감염의 웨스턴 블롯 결과를 나타내었다. 좌측 2개 레인은 처리된 세포의 용해물을 나타내고, 우측 레인은 미처리된 세포의 용해물이다. 명백히 입증된 바와 같이, ACE-2 발현은 ACE-2를 코딩하는 RNA가 로딩된 후 리피도이드 제제으로 처리된 시료에서만 관찰할 수 있었다. 이 실험은 ACE-2 mRNA가 또한 C12-(2-3-2) 함유 리피도이드 제제를 통해 운반될 수 있음을 보여준다. 또한, 공 리포플렉스의 포스트 로우딩 방법이 또한 세포 내로의 효율적인 mRNA 운반을 초래함이 입증되었다.
실시예 25
Balb/c 마우스에서 쥐 에리트로포이에틴 (mEPO)의 발현
재료 및 방법
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), DOPE, 콜레스테롤, DMPE-PEG2k 및 뮤린 에리트로포이에틴 (mEPO)을 인코딩하는 mRNA (N/P 비 15) 사용함.
동물:
실시예 11에 기술된 바와 같음.
동물의 처리:
리피도이드 제제를 1× PBS로 조절하고 희석하여 각각 130 μL 중의 5, 10 및 20 μg의 mRNA를 얻었다. 투여 당 3마리의 마우스를 정맥 내 주사로 처리하였다. 대조군으로서 마우스를 PBS로 처리하였다. 처리 6시간 후에 채혈하고 쥐 EPO 농도를 분석하였다.
쥐 EPO의 정량:
쥐 에리트로포이에틴의 정량을 제조사의 프로토콜에 따라 마우스 EPO ELISA (Quantikine ELISA, R&D Systems Inc.)에 의해 수행하였다.
결과
이 실험에서는 쥐 EPO mRNA로 처리한 후 마우스에서 쥐 에리트로포이에틴의 발현이 C12-(2-3-2) 함유 리피도이드 제제으로 형성되었다. 도 31에 나타난 바와 같이 쥐 EPO는 PBS로 처리된 대조군 그룹보다 유의미하게 더 높은 농도로 모든 그룹에서 6시간 후에 검출될 수 있었다. 따라서, 쥐 EPO mRNA는 세포 내로 효율적으로 운반되어 단백질 발현을 유도하였다.
실시예 26
올리고(알킬렌 아민) (2-3-2) 변형 선형 폴리머 폴리(알릴아민)의 메신저 RNA 운반 효율
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
실시예 1에 기술된 바와 같이 올리고(알킬렌 아민) (2-3-2), (2-2-2) 또는 (3-3-3)으로 변형된 폴리(알릴아민) (PALAM) 사용함. 합성은 제조예 V 참조.
폴리플렉스의 시험관 내 형질감염:
실시예 1에 기술된 바와 같이, NIH3T3세포 형질감염, 500 ng의 mRNA 및 N/P 12 사용함.
결과
도 32에 나타난 바와 같이 mRNA와 PALAM-(2-3-2)의 폴리플렉스로의 형질감염 후 세포는 PALAM-(2-2-2)/mRNA 또는 PALAM-(3-3-3)/mRNA 복합체로의 형질감염 후보다 유의미하게 더 높은 루시퍼라제 발현을 나타내었다. 따라서, 이들 결과는 교대의 알킬쇄를 갖는 올리고(알킬렌 아민)을 사용한 선형 아민 말단 폴리머의 변형이 선형 카복실 말단 폴리머 골격에서와 동일한 유리한 효과를 초래함을 입증한다.
실시예 27
올리고(알킬렌 아민) (2-3-2) 변형 수지상 폴리머 폴리프로필렌이민의 메신저 RNA 운반 효율
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
실시예 1에 기술된 바와 같이 올리고(알킬렌 아민) (2-3-2), (2-2-2) 또는 (3-3-3)으로 변형된 폴리프로필렌이민 (PPI) 사용함. 합성은 제조예 VI 참조.
폴리플렉스의 시험관 내 형질감염:
실시예 1에 기술된 바와 같이, NIH3T3세포 형질감염, 500 ng의 mRNA 및 N/P 32 사용함.
결과
도 33에 나타난 바와 같이 mRNA 및 PPI-(2-3-2)의 폴리플렉스로의 형질감염 후 세포는 PPI-(2-2-2)/mRNA 또는 PPI-(3-3-3)/mRNA 복합체로의 형질감염 후보다 유의미하게 더 높은 루시퍼라제 발현을 나타내었다. 따라서, 이 결과는 교대의 알킬쇄를 갖는 올리고(알킬렌 아민)을 이용한 수지상 폴리머의 변형이 선형 폴리머 골격에서와 동일한 유리한 효과를 초래함을 입증한다.
실시예 28
래트에 피하 주사 후 C12-(2-3-2) 제제의 세포 내 RNA 운반 효율
재료 및 방법
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2k 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 비 17로 사용함.
동물의 처리:
리피도이드 제제를 1× PBS로 조절하였다. 63 μg의 RNA를 함유하는 500 μL의 제제를 암컷 버팔로 래트에 피하 주사하였다. 투여 6시간 후에 래트를 메데토미딘 (11.5 μg/kg BW), 미다졸람 (115 μg/kg BW) 및 펜타닐 (1.15 μg/kg BW)의 복강 내 주입으로 마취시켰다. D-루시페린 기질 (마우스당 30 mg/PBS)을 복강 내 주입으로 적용하였다. 생체발광을 10분 후에 IVIS 100 영상화 시스템 (Xenogen, Alameda, USA)을 사용하여 측정하였다.
결과
도 34에 나타난 바와 같이 래트는 밝은 발광 산신호를 주입 측면에 나타내었는데, 이는 주위 조직 내로의 RNA 운반이 매우 효율적이었음을 입증하는 것이다. 또한 인코딩 단백질이 생산될 수 있음에 따라 RNA의 기능이 온전히 남아있음을 보여준다.
실시예 29
래트에서 경구 위관영양 후 위장관에서 mRNA-인코딩된 단백질의 발현
재료 및 방법
리피도이드 제제 (복합 제제):
리피도이드 C12-(2-3-2)를 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC; Avanti Polar Lipid, Alabaster, AL, USA), 콜레스테롤 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DPG-PEG 2000; SUNBRIGHT® GP-020; NOF America Corporation, White Plains, NY, USA)을 이용해 제제화하였다. 이를 위해, 화합물을 각각 50, 20, 20 및 20 mg/ml의 농도로 에탄올에 용해시켰다.
53.2 μL의 C12-(2-3-2), 64.2 μL의 DSPC, 26.2 μL의 콜레스테롤 및 34.8 μL의 DPG-PEG 2000을 미세원심분리 튜브에서 조합하고 에탄올로 200 μL의 최종 부피로 희석하여 성분들의 몰비가 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88이 되게 하였다. 5-메틸시티딘 및 2-티오유리딘 각각으로 대체된 25%의 시티딘 및 25%의 유리딘으로의 시험관 내 전사에 의해 제조된 200 μg의 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 변형 mRNA를 800 μL의 시트레이트 완충제 (10 mM 시트레이트 pH 4.5, 0.9% w/v 염화나트륨) 중의 용액으로 제공하였다. 리포플렉스 형성을 신속 용매 교환에 의해 수행하였다. 에탄올 중의 액체 혼합물을 800 μL의 mRNA 용액 내로 30 G 바늘 (U-40 인슐린 시린지 BD Micro-Fine™ +)을 통해 주사한 후 이어서 볼텍싱하였다. 실온에서 30분의 인큐베이션 후, 혼합물을 10 L 물에 대해 12시간 동안 투석하였다. 이는 17의 N/P 비를 갖는 150 μg/ml의 최종 mRNA 농도를 초래하였다.
리피도이드 제제의 동결건조 및 젤라틴 캡슐 내로의 충진:
실온에서 새로 제조된 리피도이드 제제의 30분 인큐베이션 후, 물 중의 25.6 μL의 40% (w/v) 트레할로스를 첨가하고 (1% w/v의 최종 농도를 초래함) 이어서 액체 질소 중에서 동결시켰다. 그 후에, 시료를 밤새 동결건조시켰다. 67 μg의 mRNA에 상응하는, 건조 재료의 1/3을 제조사에 의해 제공된 키트 (PCcaps® 키트)를 사용하여 젤라틴 캡슐 (PCcaps®; Capsugel® Belgium NV, Bornem, Belgium) 내로 충진하였다.
PEI 복합체 제제:
FFL을 인코딩하는 1 mg의 SNIM®-RNA 및 1.3 mg의 brPEI (Sigma-Aldrich)를 각각 2 mL의 물로 희석하였다. 복합체를 형성하기 위해 RNA 용액을 PEI 용액 내로 피펫팅하고 위 아래로 3회 피펫팅하여 혼합하였다. 이 용액을 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 복합체 형성 후 복합체 용액을 동일한 부피의 2% 트레할로스 용액과 혼합하여1% (w/v)의 최종 트레할로스 농도를 초래하였다. 액체 질소 중에서 동결 후, 시료를 동결건조기 (alpha 2-4, Christ)에서 동결-건조시켰다.
MP 제제:
유중수중유형 (oil-in-water-in-oil) 에멀젼화에 의해 폴리-(락트-co-글리콜)-산 (PLGA)으로 MP를 만들었다. 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88의 몰비로 200 μg의 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 변형 mRNA 및 C12-(2-3-2), DSPC, 콜레스테롤 및 DPG-PEG 2000을 포함하는 리피도이드 제제를 정확히 상기에 기술된 바와 같이 제조하였다. 1 ml의 제제를 2 ml의 PBS로 희석하였다. 이 수성상을 2 ml의 디클로로메탄에 용해된 100 mg의 PLGA 755-S (Boehringer Ingelheim, Germany)와 혼합하였다. 혼합물을 20% 진폭 강도 및 0.5초의 버스트 (burst)로 뿔형 초음파파쇄기 (Branson Digital Sonifier, model 250-D. Sonicator horn model 102-C)를 이용하여 초음파처리로 에멀젼화하였다. 그 후에 에멀젼을 물 중에 6 ml의 4%-폴리비닐알코올 (PVA) 용액을 함유하는 50 ml 팔콘 튜브 내로 한 방울씩 부었다. 이어서 혼합물을 10초간 볼텍싱하였다. 수득된 생성물을 자기 교반 플레이트 위에서 완만한 속도로 교반하면서 한 방울씩 8 ml의 0.6%-PVA 용액을 함유하는 유리 비이커 (9.2 cm 직경)에 부었다. 실온에서 3시간의 교반 후, 수득된 입자를 1,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상청액을 교체함으로써 2회 주사용수 (WFI)로 세척하였다. 입자를 5 ml의 WFI에 재-현탁한 후, 생성물을 액체 질소에서 냉동시키고 14시간 동안 동결건조하였다. 수득된 건조 분말은 사용에 대해 준비되었다. 13.6 mg을 제조사에 의해 제공된 키트 (PCcaps® 키트)를 사용하여 젤라틴 캡슐 (PCcaps® Capsugel® Belgium NV, Bornem, Belgium) 내로 충진하였다. 이는 사용된 성분의 물질 밸런스에 기초한 25 μg의 추정 mRNA 용량에 상응한다.
키토산 입자 제제:
키토산 (Protasan UP G 213) 및 50 mM 시트레이트 완충제 (pH 4.5) 중의 100 μg/mL의 SNIM®RNA 용액을 개별적으로 55℃로 가열하였다. 10 mL의 각 용액을 일정한 볼텍싱 하에서 혼합하였다. 실온에서 30분간 인큐베이션 후 입자를 물에 대해 12시간 동안 투석하고, 냉동 건조하고 사용 전까지 냉동 보관하였다. 사용 당일에 입자를 적용 전에 3 mL의 물에 재현탁하였다.
동물 실험:
스프라그-다우리 래트 (또는 암컷 버팔로 래트)를 5% 이소플루란이 흘러드는 챔버 내에서 마취시켰다. 캡슐을 위관영양으로 투여하였다. 24시간 후 동물을 나트리움-펜토바르비탈 주사를 이용하여 희생시켰다. 장기를 적출하였다. 루시퍼라제 활성의 측정을 위해, 조직편을 PBS (100 μg/ml) 중에 D-루시페린 기질을 포함하는 배지 욕조 내 37℃에서 30분간 인큐베이션하고 생체 외 루시퍼라제 생체발광 영상화 (IVIS 100, Xenogen, Alameda, USA)에 적용하였다.
결과:
본 실험은, 리피도이드/mRNA 복합체가 트레할로스와 동결건조되거나 MP 내로 로우딩되어 캡슐을 이용해 경구 투여되는 경우 mRNA가 GI 관에서 효과적으로 발현됨 (도 35 참조)을 나타낸다. mRNA가 액체 제제으로서 경구 투여될 때 어떠한 실질적인 루시퍼라제 신호도 다른 주요 장기 (심장, 폐, 간, 비장, 신장)에서 검출되지 않았다.

Claims (26)

  1. 폴리리보뉴클레오티드 (RNA) 및 양이온제를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물이 위장관 (GI tract)에의 투여를 위한 고체 투약 형태로 제제화되는 것인, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 경구 투여용 고체 투약 형태로 제제화되는, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 직장 내 투여용 고체 투약 형태로 제제화되는, 약학적 조성.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제가 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드인 것인, 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제가 폴리에틸렌이민 (PEI)인 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분인 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 성분인 것인, 약학적 조성물:
    a) 측쇄 및/또는 말단기로서 다수의 화학식 (II)의 기를 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
    Figure pct00036
    (II)
    상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은 다수의 이러한 기에서 화학식 (II)의 각 기에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
    a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이고; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
    p는 1 또는 2이고,
    m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;
    R2 내지 R5는, 서로 독립적으로, 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
    R6은 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고,
    화학식 (II)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 화학식 (II)의 양이온성 기를 제공할 수 있고;
    b) 반복 단위로 다수의 화학식 (III)의 기를 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
    Figure pct00037
    (III)
    상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5은 다수의 이러한 기에서 화학식 (III)의 각 기에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
    a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이고; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
    p는 1 또는 2이고,
    m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;
    R2 내지 R5는, 서로 독립적으로, 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7 또는 -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
    화학식 (III)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 화학식 (III)의 양이온성 기를 제공할 수 있고; 및
    c) 화학식 (IV)의 구조를 갖는 리피도이드:
    Figure pct00038
    (IV)
    상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 다음과 같이 정의된다:
    a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이고; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
    p는 1 또는 2이고,
    m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;
    R1 내지 R6은 서로 독립적으로 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7,-CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고; 단 R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7이고, 여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택되고;
    화학식 (IV)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 화학식 (IV)의 리피도이드를 제공할 수 있다.
  7. 제6항에 있어서, 상기 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 성분이 하기 성분 a) 및 b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물:
    성분 a): 측쇄 및/또는 말단기로서 다수의 화학식 (IIa)의 기를 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
    -NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IIa)
    상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R6은 제1항에 정의된 바와 같고, 화학식 (IIa)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다;
    성분 b): 반복 단위로서 다수의 화학식 (IIIa)의 기를 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
    -NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n- (IIIa)
    상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R5는 제1항에 정의된 바와 같고, 화학식 (IIIa)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다.
  8. 제6항에 있어서, 상기 리피도이드가 하기 화학식 (IVa)의 구조를 갖는 것인, 약학적 조성물:
    R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IVa)
    상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R6은 제1항에 정의된 바와 같고, 화학식 (IVa)에 표시된 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) 또는 (IVa)에서 n이 1인 것인, 약학적 조성물.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) 또는 (IVa)에서 m이 1이고 n이 1인 것인, 약학적 조성물.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서. 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) 또는 (IVa)에서 a가 1이고 b가 2이거나 a가 2이고 b가 1인 것인, 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온제가 상기 RNA와 복합체를 형성하는 것인, 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 복합체가 리포좀인 것인, 약학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 및 상기 양이온제가 나노입자 (NP)로 제제화되는 것인, 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 및 상기 양이온제가 미세입자 (MP)로서 제제화되거나 동결건조된 형태인 것인, 약학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(락트산-co-글리콜산) (PLGA) 및/또는 동결건조보호제를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 RNA, 상기 양이온제 및 상기 PLGA가 MP로 제제화되는 것인, 약학적 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 동결건조보호제가 트레할로스인 것인, 약학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 투약 형태가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물:
    (i) 캡슐;
    (ii) 정제;
    (iii) 좌약;
    (iv) 펠렛(들);
    (v) 환제;
    (vi) 과립; 및
    (vii) 분말.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 투약 형태가 젤라틴 캡슐인 것인, 약학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 투약 형태가 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐인 것인, 약학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제1항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA가 단일-가닥 RNA인 것인, 약학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA가 mRNA인 것인, 약학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA가 5 내지 50% 변형 시티딘 뉴클레오티드 및/또는 5 내지 50% 변형 유리딘 뉴클레오티드를 갖는 것인, 약학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 상기 RNA, 및/또는 그로부터 번역된 단백질의 전신 전달을 위한 용도.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 GI 관에 투여하는 단계를 포함하는, RNA 및/또는 그로부터 번역된 단백질을 개체에 전신 전달하기 위한 방법.
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