CN105579584B - 用于将rna引入细胞的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及低聚物、聚合物和类脂质，其包括特征低聚(亚烷基胺)部分，该部分可用作RNA转染细胞的载体。本发明还涉及至少包括核酸和包括这种低聚(亚烷基胺)部分的低聚物或聚合物或类脂质的组合物，和利用所述组合物转染细胞的方法。此外，本发明涉及药物组合物和应用。

Description

用于将RNA引入细胞的组合物
本发明涉及可用作以RNA转染细胞的载体、包括特征性低聚(亚烷基胺)部分的低聚物、聚合物和类脂质(lipidoid)。本发明此外涉及至少包括RNA和包含这种低聚(亚烷基胺)部分的低聚物或聚合物或类脂质的组合物，和利用所述组合物转染细胞的方法。此外，本发明涉及药物组合物、应用和试剂盒。
核酸疗法的可行性从根本上取决于将核酸递送到细胞中的有效方法的可利用性。
在核酸递送中，总体而言，裸核酸的使用在一些情况下适于并且足以转染细胞(Wolff等，1990，Science，247，1465-1468)。然而，在大多数设计实践应用中，将核酸与至少第二试剂(保护核酸以免在递送过程中降解和/或促进向目标组织和在目标组织中分配和/或促进细胞摄取和实现适当胞内加工)一起配制是有利或甚至是有必要的。用于核酸递送的这种制剂在科学文献中被称为载体。多种用于核酸载体化的化合物，所谓转染剂，在此前已被述及。这些化合物通常是聚阳离子或包括阳离子脂质或脂质样化合物如类脂质的组合物(US 8,450,298)。核酸与聚阳离子的复合物被称为聚复合物，与阳离子脂质的复合物被称为脂质复合物(Felgner等，1997，Hum Gene Ther，8，511-512)。包括聚阳离子和脂质的复合物也已被述及(Li和Huang in“Nonviral Vectors for Gene Therapy”，AcademicPress1999，第13章，295-303)。转染剂被用于结合和致密(compact)核酸，产生纳米尺寸范围内的初级复合物。在含盐介质中，这些复合物倾向聚集，也被称为盐致聚集，这可有利于细胞培养中的转染或体内的局部化给予(Ogris等，1998，Gene Ther，5，1425-1433；Ogris等，2001，AAPS PharmSci，3，E21)。通过利用诸如聚(乙二醇)的聚合物的表面遮蔽，聚集可被避免，并且核酸与转染剂的复合物可被稳定。遮蔽也用于避免核酸与转染剂的复合物的调理作用和补体激活(Finsinger等，2000，基因Ther，7，1183-1192)。转染剂造成的核酸致密化不仅保护其以免于核酸酶降解，而且使其适于通过内吞作用进行细胞摄取。多种线性和分支聚阳离子适于结合和致密核酸，包括但不限于，聚(乙烯亚胺)、聚(酰氨基胺)树枝状聚合物、聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(pDMAEMA)或聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(pHPMA)的阳离子衍生物、聚(β-氨基酯)(Akinc等、2003、Bioconj Chem14(5)：979-88)、天然和合成的阳离子型聚(氨基酸)或肽如聚(赖氨酸)、组蛋白、HMG蛋白或阳离子碳水化合物如壳聚糖。除上述包含伯胺、仲胺和/或叔胺的聚合物外，包含胍基部分的结构也是用于核酸复合和递送的重要分子种类。胍基修饰的聚合物，如基于精氨酸的结构(Yamanouchi等，2008，Biomaterials 29(22)：3269-77)、精氨酸修饰的PAMAM(Son等，2013，Bull.KoreanChem.Soc.Vol 34No.3)或胍基化PEI(Lee等，2008，Bull.Korean Chem.Soc.2008，Vol.29，No.3)，已经显著突出了这种系统的效率。尤其在RNA相互作用的情况下，胍基部分的分子特征呈现独特的结合性质(Calnan等，19991，Science252(5009)，1167-1171)。可采用Katritzky和Rogovoy评述的这种结构的生成方法(Katritzky&Rogovoy 2005，ARKIVOC(iv)49-87)。通常，聚复合物(polyplexes)被进一步修饰，以包含细胞靶向部分或胞内靶向部分和/或膜去稳组分如失活病毒(Curiel等，1991，ProcNatl Acad Sci USA，88，8850-8854)、病毒衣壳或病毒蛋白或肽(Fender等，1997，Nat Biotechnol，15，52-56，Zhang等，1999，基因Ther，6，171-181)、或膜破坏性合成肽(Wagner等，1992，Proc Natl Acad Sci USA，89，7934-7938，Plank等，1994，J Biol Chem，269，12918-12924)。
在内吞摄取后，复合物被隔离到胞内囊泡如内含体和溶酶体中，在此其暴露于细胞降解机制。因此，已知从胞内囊泡逃脱对于有效的功能性核酸递送至关重要，也是适用于功能性病毒感染的要求(Wagner等，1992，Proc Natl Acad Sci USA，89，7934-7938，Plank等，1994，J Biol Chem，269，12918-12924)。性质演变为病毒感染性的机制已被模拟以通过合成载体实现有效的核酸递送。为此，两性膜去稳肽如INF、GALA和KALA肽或蜂毒肽和蜂毒肽衍生物(Boeckle等，2006，J Control Releasee，112，240-248)的使用已获得巨大成功，以补充具有内含体逃脱功能的聚阳离子型转染剂(Plank等，1998，Adv Drug Deliv Rev，34，21-35)。在脂质复合物中，这种功能是固有的——通过其脂质部分与细胞膜融合的能力(Xu和Szoka 1996，Biochemistry，35，5616-5623，Zelphati和Szoka 1996，Proc Natl AcadSci USA，93，11493-11498)。自Boussif等的关键性论文(Boussif等，1995，Proc Natl AcadSci USA，92，7297-7301)，已知聚复合物的内含体逃脱功能可通过物理-化学方法实现。当聚(乙烯亚胺)(PEI)用作聚阳离子以形成聚复合物时，其在酸性pH下的缓冲能力足以触发内含体逃脱。已知内含体腔被处于内含体膜中的质子泵酸化(Lafourcade等，2008，PLoSOne，3，e2758)。这种酸化是一些病毒如流感或腺病毒的内含体逃脱的触发点。所谓质子海绵理论(被实验证据支持)描述了包括PEI化学结构特征的聚合物的假定作用机制：PEI的相当大部分的氨基在中性(生理)pH下是非质子化的(Ziebarth和Wang 2010，Biomacromolecules，11，29-38)。通过质子化并且因此带正电的氨基，PEI样聚合物可结合和致密(compact)核酸。非质子化的胺可在酸性pH下变成质子化的，因此在内含体内具有缓冲能力。通过质子泵的内含体酸化随着氯离子的积累发生(Sonawane等，2003，J BiolChem，278，44826-44831)。在内含体腔中存在缓冲分子如PEI的情况下，随着氯离子积累，质子泵会往复运输更多质子到内含体腔中，就像其在达到天然酸性内含体pH前不存在一样。内含体内离子的不成比例的积累被认为导致囊泡的渗透去稳，最终导致囊泡破裂和核酸复合物释放到细胞质中。
在质子海绵理论的基础上，很多研究人员在创建包括在酸性pH下具有缓冲能力的胺的新聚合物库时已经获得PEI的结构特征。在US 7,780,957和US 7,829,657中，Kataoka等描述了基于聚(谷氨酸)或聚(天冬氨酸)骨架的聚合物，其中羧酸侧链通过在酸性pH下可质子化的胺侧链衍生而来。然而，包含交替的、不相同的亚烷基胺单元以充当聚阳离子中的转染强化部分的低聚(亚烷基胺)的富集结构空间未开发利用。具体地，其此前未被关于mRNA转染进行研究。
相比之下，Kataoka等的科学工作中很多都致力于聚{N-[N′-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}。在Uchida等的出版物(2011，J Am Chem Soc，133，15524-15532)中，同一工作组已经考察了在通式-(CH2-CH2-NH)m-H的侧链中具有重复氨基乙烯单元的一系列N-取代的聚天冬酰胺。值得注意地，在作者考察聚合物家族在质粒DNA转染中的效率时，“观察到聚合物侧链中重复氨基乙烯单元对内含体逃脱和几种细胞系转染效率的独特奇偶效应。与具有奇数个重复氨基乙烯单元(PA-O)的聚合物的聚复合物相比，来自具有偶数个重复氨基乙烯单元(PA-E)的聚合物的聚复合物实现数量级较高的转染效率，而无显著细胞毒性。这种奇偶效应也充分适用于这些聚合物的缓冲能力以及其在内含体pH下选择性破坏膜完整性的能力，导致PA-E聚复合物的内含体逃脱高度有效。此外，显示聚合物侧链的质子化氨基之间具有精确间距的多价电荷阵列的形成对于有效破坏内含体膜来说至关重要，因此促进聚复合物运输到细胞质中”(Uchida等，2011，J Am Chem Soc，133，15524-15532的摘要)。值得注意地，当同组研究人员比较具有1，2-二氨基乙烷侧链的聚(天冬酰胺)衍生物[PAsp(DET)]与具有1，3-二氨基丙烷侧链的类似物[PAsp(DPT)]时，他们观察到PAsp(DPT)聚复合物显示高N/P比下的质粒DNA的转染效力由于随N/P比逐渐增加的细胞毒性而显著下降，即使与[PAsp(DET)]在颗粒尺寸和ζ-电位方面的物理化学差异可忽略不计(Miyata等，2008，JAm Chem Soc，130，16287-16294)。因此，基于奇偶规律会预料到包括3个可质子化氨基和丙烯间隔基团的聚合物劣于PAsp(DET)，并且包括1，3-二氨基丙烷的侧链与毒性问题有关。关于这种聚合物对于mRNA转染的结构-活性关系是未知的。
Geall和同行已经描述了胆固醇-聚胺氨基甲酸酯，其中聚胺部分具有通式：
-NH-CH2-(CH2)n-CH2-NH-CH2-(CH2)m-CH2-NH-CH2-(CH2)n-NH2，
其中m＝0、1或2，并且其中n＝0或1(Geall等，1999，FEBS Lett，459，337-342)。他们已经考察了这些物质的pKa值和其在牛胸腺DNA凝聚中的特征。他们发现，正电荷沿胆固醇聚胺氨基甲酸酯的区域化学分布在调节DNA结合亲和力和脂质转染效率方面具有重要作用。他们发现，在考察的胆固醇-聚胺氨基甲酸酯中，构成聚胺部分的精胺，-HN-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2(丙基/丁基/丙基)，迄今为止在细胞培养中转染β半乳糖苷酶编码质粒DNA后产生最高的报告基因表达，而例如-HN-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2(乙基/丙基/乙基)的效力少3至10倍。因此，基于Kataoka等的教导(奇偶规律)和Geall等的发现，本领域技术人员会在核酸递送情况中放弃后者结构。
Wang等已经描述了聚(甲基丙烯酸甲酯)-接枝-寡胺作为有效的和低细胞毒性的质粒DNA转染剂(Wang等，2010，Molecular BioSystems，6，256-263)。这些聚合物用通式H2N-CH2-CH2-(NH-CH2-CH2)m-NH2的寡胺氨解聚(甲基丙烯酸甲酯)而获得，其中m＝1、2、或3。作者发现，转染效率随胺长度增加而增加。
Ou等已经描述了聚(二硫酰胺胺)，其由具有结构Dde-NH-(CH2)a-NH-(CH2)b-NH-(CH2)a-NH-Dde的末端保护的寡胺通过与N，N’-胱胺双丙烯酰胺共聚而获得(Ou等，2009，Biomaterials 30，5804-5814；WO 2010/065660)。他们考察了组合a＝2和b＝2、a＝2和b＝3、a＝3和b＝2、a＝3和b＝3、a＝3和b＝4(精胺)。Dde为2-乙酰双甲酮保护基团。在去除保护基团后，合成导致聚(二硫酰胺胺)产生，其中内部原来的仲胺变成叔胺，作为聚合物主链的部分，并且末端胺变成未定的乙烯或丙烯胺侧链的部分。这种聚合物在核酸递送相关的pH范围内具有缓冲能力，并且可用于转染质粒DNA到细胞中。
近来，一种新型的脂质样但非脂质的合成结构，所谓类脂质，对于体外和体内核酸递送的效用已被发现(US 8,450,298；Love等，2010，PNAS 107，1864-1869；WO2006/138380；Akinc等，2008，Nat Biotechnol 26，561-569)。类脂质通过使含胺化合物与脂肪族环氧化物、丙烯酸酯、丙烯酰胺或醛反应获得。作者/发明人已经提供了用于获得类脂质库的合成程序和用于选择有核酸体外递送至细胞效用的可用化合物的筛选程序。
由上显而易见，过去对于其他核酸分子如质粒DNA、寡核苷酸、siRNA或核酸类似物的递送已进行了很多研究和研发工作。而未对mRNA递送进过很大深度的研究。一些作者声称对DNA或siRNA递送作用良好的化合物和制剂将同样作用于mRNA递送。然而，与质粒DNA或siRNA相反，mRNA是单链分子。因此，仅基于结构考虑因素，将会预期对用于mRNA递送的化合物和制剂与用于DNA或siRNA递送的化合物和制剂具有不同要求。
上文引用的以往文献描了双链核酸如质粒DNA或siRNA到细胞中的递送，但所述方法和化合物是否能够递送单链核酸如mRNA到细胞中是未知的。尤其，以往已经观察到，mRNA转染明显区别于质粒DNA在细胞中的转染(Bettinger等，2001，Nucleic Acids Res，29，3882-91、Uzgün et al，2011，Pharm Res，28，2223-32)。
根据这一点，本发明人发现，当在WO 2011/154331公开的聚合物家族的超过100个成员中筛选其对于RNA递送(优选地单链RNA如mRNA至细胞的递送)的适应性时，没有化合物可用于以导致该mRNA编码的基因表达的方式转染mRNA。相比之下，这些化合物均在质粒DNA和/或siRNA递送中有效。因此，已确立的关于双链核酸递送到细胞中的规律不先验地适用于单链mRNA。WO 2011/154331的公开内容包括化学限定为如下的低聚物：2-60个单元的低聚(亚烷基氨基)酸单元，该低聚(亚烷基氨基)酸单元相应于通式HOOC-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H，其中Z是亚甲基串或多种其它基团，R是亚甲基或羧基残基，并且a和b分别独立地是1-7或2-7的整数。此家族的低聚物包括能够发挥所谓质子海绵效应的可质子化氨基，并且在质粒DNA和siRNA体外和体内转染中已显示高度活性。重要地，WO 2011/154331和相关科学出版物详细教导了可如何由相应于通式HOOC-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H的构成单元建立序列限定的低聚物/聚合物库。
因此，本发明的基本技术任务是提供适于高效递送RNA，优选地单链RNA如mRNA，到细胞或组织的组合物。
此任务已通过提供权利要求中描述和下文概述和实施例进一步详细示例的实施方式而完成。具体地，在本文进一步限定的其各种实施方式中，本发明提供：
-低聚物、聚合物或类脂质，其包括包含交替的、不相同的亚烷基胺单元的低聚(亚烷基胺)，可用于将RNA，优选地单链RNA如mRNA递送至细胞或至组织，
-组合物，其包括下列：与RNA和具体地mRNA组合的、包括包含交替的不相同的亚烷基胺单元的低聚(亚烷基胺)的这些低聚物、聚合物或类脂质，该低聚物、聚合物或类脂质可用于递送RNA，优选地单链RNA如mRNA，到细胞或到组织中，
-制备所述化合物和组合物的方法，以及
-利用所述化合物和组合物递送RNA(优选地单链RNA如mRNA)到细胞中的方法，以及利用根据本发明的组合物递送RNA(优选地单链RNA如mRNA)的能力的医疗用途和治疗方法。
在低聚物或聚合物化合物(包括线性、分支和树枝状，无规或序列限定的化合物)中或可用于递送RNA(优选地单链RNA如mRNA)至细胞的组合物中包括的类脂质化合物中包含交替的、不相同的亚烷基胺单元的低聚(亚烷基胺)的富集结构空间还未被开发利用。因此这种化合物的序列空间也未被开发利用。
作为关于低聚物、聚合物、和类脂质以往未知的普遍原理，惊讶地发现，在用于以RNA(优选地单链RNA如mRNA)转染细胞的组合物中3个或更多单元的基团交替长度的亚烷基胺单元的排列和包含亚乙基胺单元总是比非交替长度的亚烷基胺单元的类似排列更加有效。因此，提供具有共同结构实体的低聚物、聚合物或类脂质，该共同结构实体由式(I)示例：
Figure BPA0000218995900000051
并且在下文得到进一步说明。
具体地，本发明第一方面提供组合物，其包括RNA，优选地单链RNA，如mRNA；和包括低聚(亚烷基胺)的组分，该组分选自：
a)低聚物或聚合物，包括多个式(II)基团作为侧链和/或作为末端基团：
Figure BPA0000218995900000061
其中在多个这样的基团中，每个式(II)基团的变量a、b、p、m、n和R2至R6独立地限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为O或1，并且m+n≥2；和
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；和聚(乙二醇)链；
R6选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体，
并且其中式(II)显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(II)的阳离子基团；
b)低聚物或聚合物，包括多个式(III)基团作为重复单元：
Figure BPA0000218995900000062
其中在多个这样的基团中，每个式(III)基团的变量a、b、p、m、n和R2至R5独立地限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；-C(NH)-NH2；和聚(乙二醇)链；
并且其中式(III)显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(III)的阳离子基团；和
c)具有式(IV)结构的类脂质：
Figure BPA0000218995900000071
其中变量a、b、p、m、n和R1至R6限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R1至R6彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体；条件R1至R6之中的至少两个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
并且其中式(IV)显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(IV)的阳离子基团。
再一方面，本发明涉及上文限定的低聚物、聚合物或类脂质作为可用于制备根据本发明的组合物的中间体，和包括根据本发明的组合物的药物组合物。本发明还包括制备根据本发明的低聚物、聚合物或类脂质以及根据本发明的组合物和药物组合物的方法。
再一方面涉及根据本发明的组合物或根据本发明的聚合物或树枝状聚合物或类脂质用于递送RNA(优选地单链RNA如mRNA)到目标细胞或到组织中的应用，和递送RNA(优选地单链RNA如mRNA)到细胞中的方法，包括使根据本发明的组合物接触细胞的步骤。
低聚(亚烷基胺)基团
式(II)、(III)和(IV)的低聚(亚烷基胺)结构的特征在于，其以交替方式组合较短的(示例时也被称为“S”)亚乙基胺单元(即，a或b为1)和较长的(示例时也被称为“L”)亚烷基胺单元(即，a或b中的另一个为2至4的整数)。出乎预料地，可质子化单元的这种排列被发现在所得基团提供用于递送RNA(优选地单链RNA如mRNA)到细胞中的载体的适宜性方面提供益处。
如上所述，可用于根据本发明一个优选实施方式的组合物的低聚物或聚合物包括多个式(II)的低聚(亚烷基胺)基团作为侧链和/或作为末端基团：
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (II)，
其中在多个这样的基团中，每个式(II)基团的变量a、b、p、m、n和R2至R6独立地限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；-C(NH)-NH2；和聚(乙二醇)链；
R6选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C16烷基或具有一个C-C双键的C3-C16烯基；氨基保护基团；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体。
优选地，R2至R5是氢，并且R6选自氢、氨基保护基团；-C(NH)-NH2和聚(乙二醇)链。更优选地，R2至R6是氢。优选地，R7选自C8-C18烷基或具有一个C-C双键的C8-C18烯基，更优选地选自C8-C12烷基或具有一个C-C双键的C8-C12烯基，最优选地选自C10-C12烷基或具有一个C-C双键的C10-C12烯基。
式(II)或其优选实施方式中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(II)的阳离子基团。
多个式(II)基团意为根据本发明的低聚物或聚合物包含两个或更多个式(II)或其优选实施方式的基团，优选三个或更多个。在包含多个式(II)基团的聚合物中，优选存在10或更多个式(II)基团。要理解，式(II)或其优选实施方式的基团可在聚合物或低聚物中具有相同结构，或可具有式(II)范围内的两种或更多种不同结构。
根据另一优选实施方式，可用于根据本发明的组合物的低聚物或聚合物包括多个式(III)低聚(亚烷基胺)基团作为重复单元：
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n- (III)，
其中在多个这样的基团中，每个式(III)基团的变量a、b、p、m、n和R2至R5独立地限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；内含体逃脱效应子和受体配体。优选地，R2至R5是氢。优选地，R7选自C8-C18烷基或具有一个C-C双键的C8-C18烯基，更优选地选自C8-C12烷基或具有一个C-C双键的C8-C12烯基，最优选地选自C10-C12烷基或具有一个C-C双键的C10-C12烯基。
式(III)或其优选实施方式中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(III)的阳离子基团。
任选地，包括多个式(III)或其优选实施方式的基团作为重复单元的低聚物或聚合物可另外包括一个或多个式(II)低聚(亚烷基胺)基团作为侧链和/或作为末端基团。
多个式(III)基团作为重复单元意为根据本发明的低聚物或聚合物包含两个或更多个式(III)或其优选实施方式的基团，优选地三个或更多个。总体上，包括2至9个重复单元的物质在本文中被称为低聚物，包括10个和更多重复单元的那些物质被称为聚合物。因此，在包含多个式(III)基团作为重复单元的聚合物中，优选存在10或更多个式(III)基团。要理解，式(III)或其优选实施方式的基团在聚合物或低聚物中可具有相同结构，或可具有式(III)范围内的两个或更多个不同结构。有利地并且根据优选实施方式，可以如下方式提供包含多个式(III)基团作为重复单元的低聚物或聚合物：在受控分步聚合中由不同式(III)基团制备的序列限定聚合物的库的形式。
根据上述式(II)和(III)，亚烷基胺单元可以交替链重复一次，从而可产生-S-L-L-S-或-L-S-S-L-型的低聚(亚烷基胺)部分，其中S表示较短亚乙基胺单元，和L表示较长亚烷基胺单元。然而，优选的式(II)和(III)基团是其中不存在重复的那些基团，即，其中p为1，使得较短或较长单元不成对出现。换句话说，式(II)基团优选是式(IIa)的低聚(亚烷基胺)基团，并且式(III)基团优选是式(IIIa)的低聚(亚烷基胺)基团：
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IIa)，
其中a、b、m、n、和R2至R6限定如式(II)，包括优选实施方式，并且其中式(IIa)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构；
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n- (IIIa)，
其中a、b、m、n、和R2至R5限定如式(III)，包括优选实施方式，并且其中式(IIIa)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构。
此外，式(II)和(III)的低聚(亚烷基胺)基团总体上优选n为1，更优选m为1并且n为1。因此，特别优选式(II)基团是式(IIb)的低聚(亚烷基胺)基团，并且式(III)基团是式(IIIb)的低聚(亚烷基胺)基团：
-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-(NR5)-R6 (IIb)，
其中a、b、和R2至R6限定如式(II)，包括优选实施方式，并且其中式(IIb)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构；
-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5- (IIIb)，
其中a、b、和R2至R5限定如式(III)，包括优选实施方式，并且其中式(IIIb)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构。
关于式(II)、(IIa)、(IIb)和(III)、(IIIa)、(IIIb)的低聚(亚烷基胺)基团中的亚烷基胺单元的长度，要理解，需要其中一个交替单元是亚乙基胺单元(即，a或b必须是1)。另一交替单元可以是丙烯胺单元、亚丁基胺单元或亚戊基胺单元(即，a或b中的另一个为2至4的整数。优选地，a或b中的另一个为2或3，最优选地，a为1并且b为2、或a为2并且b为1。因此，还更优选基团(II)是式(IIc)的低聚(亚烷基胺)基团，还更优选基团(III)是式(IIIc)的低聚(亚烷基胺)基团：
-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-R6 (IIc)，
其中R2至R6限定如式(II)和其优选实施方式，并且最优选是氢，并且其中式(IIc)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构；
-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5- (IIIc)，
其中R2至R5限定如式(III)和其优选实施方式，并且最优选是氢，并且其中式(IIIc)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构。
只要式(II)、(IIa)、(IIb)和(IIc)的基团R2至R6或式(III)、(IIIa)、(IIIb)和(IIIc)的基团R2至R5中的任一个是诸如例如WO2006/138380描述的氨基保护基团，其优选实施方式是叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、或苄氧羰基(Cbz)。
只要式(II)、(IIa)、(IIb)和(IIc)的基团R1至R6或式(III)、(IIIa)、(IIIb)和(IIIc)的基团R2至R5中的任一个是受体配体，则可用的实例在Philipp和Wagner的“Geneand Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategy”，第3版，第15章，CRC Press，Taylor&Francis Group LLC，Boca Raton 2009中被给出。肺组织的优选受体配体被述及于Pfeifer等，2010，Ther.Deliv.1(1)：133-48。优选受体配体包括诸如通过筛选肽库得到的结合至特定细胞表面结构或特定细胞类型的合成环形或线性肽、环形或线性RGD肽、合成或天然碳水化合物如唾液酸、半乳糖或甘露糖或通过碳水化合物例如与肽反应获得的合成配体、特异性识别细胞表面结构的抗体、叶酸、表皮生长因子和其衍生肽、转铁蛋白、抗转铁蛋白受体抗体、纳米抗体(nanobodies)和抗体片段、结合至已知的细胞表面分子的获批药物等。
只要式(II)、(IIa)、(IIb)和(IIc)的基团R1至R6或式(III)、(IIIa)、(IIIb)和(IIIc)的基团R2至R5中的任一个是聚(乙二醇)链，聚(乙二醇)链的优选分子量为100-20,000g/mol，更优选1,000-10,000g/mol，最优选1,000-5,000g/mol。
最优选的基团(II)是式(IId)的低聚(亚烷基胺)基团：
-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H (IId)，
其中式(IId)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子聚合物或树枝状聚合物结构。
最优选的基团(III)是式(IIId)的低聚(亚烷基胺)基团：
-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH- (IIId)，
其中式(IIId)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子聚合物或树枝状聚合物结构。
如上所述，可用于根据本发明一个优选实施方式的组合物的类脂质具有式(IV)的结构：
R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IV)，
其中变量a、b、p、m、n和R1至R6限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R1至R6彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体；条件是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基。
优选地，R1至R6独立地选自氢；基团-CH2-C(OH)H-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；和聚(乙二醇)链；条件是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-C(OH)H-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基。更优选地，R1至R6独立地选自氢；和基团-CH2-CH(OH)-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自C3-C16烷基或具有一个C-C双键的C3-C16烯基；条件是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基。更进一步优选如下排列(constellation)：R1和R6独立地选自氢；和基团-CH2-CH(OH)-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；和R2至R5都是基团-CH2-CH(OH)-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基。优选地，R7选自C8-C16烷基或具有一个C-C双键的C8-C18烯基，更优选地选自C8-C12烷基或具有一个C-C双键的C8-C12烯基，最优选地选自C10-C12烷基或具有一个C-C双键的C10-C12烯基。
式(IV)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(IV)的阳离子类脂质。
根据上述式(IV)，亚烷基胺单元可在交替链中重复一次，从而可产生-S-L-L-S-或-L-S-S-L-型的低聚(亚烷基胺)部分，其中S表示较短乙烯胺单元，并且L表示较长亚烷基胺单元。然而，优选的式(IV)类脂质是不存在重复的类脂质，即，其中p为1，使得较短或较长单元不成对出现。换句话说，式(IV)类脂质优选是(IVa)的类脂质：
R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IVa)，
其中a、b、m、n、和R1至R6限定如式(IV)，包括优选实施方式，并且其中式(IVa)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子类脂质；
此外，式(IV)类脂质总体上优选n为1，更优选m为1并且n为1。因此，特别优选式(IV)类脂质式(IVb)是的类脂质：
R1-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5-R6 (IVb)，
其中a、b、和R1至R6限定如式(IV)，包括优选实施方式，并且其中式(IVb)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子类脂质。
关于式(IV)、(IVa)和(IVb)类脂质中亚烷基胺单元的长度，要理解，需要其中一个交替单元是亚乙基胺单元(即，a或b必须是1)。另一交替单元可以是丙烯胺单元、亚丁基胺单元或亚戊基胺单元(即，a或b中的另一个为2至4的整数。优选地，a或b中另一个为2或3，最优选地，a为1并且b为2、或a为2并且b为1。因此，还更优选的式(IV)类脂质是式(IVc)的类脂质：
R1-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-R6 (IVc)，
其中R1至R6限定如式(IV)和其优选实施方式，并且其中式(IVc)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子类脂质；
只要式(IV)、(IVa)、(IVb)和(IVc)的基团R1至R6是诸如例如WO2006/138380描述的氨基保护基团，其优选实施方式是叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、或苄氧羰基(Cbz)。
只要式(IV)、(IVa)、(IVb)和(IVc)的基团R1至R6是受体配体，可用实例在Philipp和Wagner的“Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategy”，第3版，第15章.CRC Press，Taylor&Francis Group LLC.，Boca Raton 2009中被给出。肺组织的优选受体配体被述及于Pfeifer等，2010，Ther Deliv.1(1)：133-48。优选受体配体包括诸如通过筛选肽库获得的结合至特定细胞表面结构或特定细胞类型的合成环形或线性肽、环形或线性RGD肽、合成或天然碳水化合物如唾液酸、半乳糖或甘露糖或通过碳水化合物例如与肽反应获得的合成配体、特异性识别细胞表面结构的抗体、叶酸、表皮生长因子和其衍生肽、转铁蛋白、抗转铁蛋白受体抗体、纳米抗体和抗体片段、结合至已知细胞表面分子的获批药物等。
只要式(IV)、(IVa)、(IVb)和(IVc)的基团R1至R6是聚(乙二醇)链，聚(乙二醇)链的优选分子量为100-20,000g/mol，更优选1,000-10,000g/mol，最优选1,000-5,000g/mol。
如上所述，式(I)和包括式(IIa)-(IId)、(IIIa)-(IIId)和(IVa)-(IVc)的其优选实施方式中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以产生阳离子形式的低聚物或聚合物或类脂质，一般是低聚阳离子或聚阳离子形式。要理解，式(I)基团和包括式(IIa)-(IId)、(IIIa)-(IIId)和(IVa)-(IVc)的其优选实施方式中的伯氨基和/或仲氨基和/或叔氨基可充当质子受体——尤其在水和水溶液中，包括生理流体。因此，本发明的低聚物、聚合物和类脂质一般在7.5以下pH的水溶液中具有正电荷总量。本文中的所谓水溶液是溶剂包括50％(vol./vol.)或更多，优选80或90％或更多，最优选100％水的溶液。而且，如果根据本发明的组合物接触具有7.5以下pH的生理流体——包括例如、血液和肺液，则式(I)基团和包括式(IIa)-(IId)、(IIIa)-(IIId)和(IVa)-(IVc)的其优选实施方式一般包含一个或多个质子化氨基。这些化合物的pKa值可通过酸碱滴定利用自动pKa滴定器确定。然后可通过Henderson-Hasselbach方程式计算给定pH值下的净电荷。根据Geall等(J.Geall等，1998，Chem Commun，1403-1404)，确认有电荷被若干碱性中心共用并且其不能被归于单个点是非常重要的。1，9-二氨基-3，7-二氮杂壬烷(丙基/乙基/丙基)例如具有9.3、7.6和5.7的pKa，意味着在生理pH下很多氨基处于质子化和非质子化状态。
然而，本领域技术人员会理解，根据本发明的低聚物、聚合物和类脂质以及根据本发明的组合物也可以包含阳离子形式的低聚物、聚合物或类脂质的干燥盐形式被提供。
可进一步理解，根据本发明的包括低聚物、聚合物或类脂质和RNA(优选地单链RNA如mRNA)的组合物中的质子化氨基的正电荷的反离子(阴离子)一般由RNA包含的阴离子部分提供。如果带正电的基团与RNA的阴离子部分相比过量存在，则正电荷可被其他阴离子如一般在生理流体中碰到的Cl-或HCO3 -平衡。
适用于本发明情况下的低聚(亚烷基胺)可从已知的化学剂供应商商业获得，或可通过本领域已知的方法(例如，van Alphen 1936，Recueil des Travaux Chimiques desPays-Bas，55，835-840)合成。通过化学合成的标准方法可实现可需要的任何改动。
低聚物/聚合物结构
如上所述，式(I)基团和包括式(IIa)-(IId)和(IIIa)-(IIId)的其优选实施方式可被结合于、或可提供多种低聚物或聚合物骨架结构。
总体而言，包括多个式(II)基团或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的低聚物或聚合物也可被称为携带多个式(II)基团或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式作为侧链和/或末端基团的聚合物骨架。可携带多个式(II)基团和包括式(IIa)至(IId)基团的其优选实施方式作为侧链或末端基团的聚合物骨架包括线性、分支或交联聚合物以及树枝状的聚合物(树枝状聚合物)。聚合物包括合成或生物聚合物。优选线性或分支聚合物骨架结构。这也适用于携带式(II)基团和包括式(IIa)至(IId)基团的其优选实施方式作为侧链或末端基团的低聚物，不同之处在于聚合物骨架一般包括10或更多个重复单元，而低聚物骨架包括2至9个，优选地3至9个重复单元。总体而言，在包括多个式(II)基团和包括式(IIa)至(IId)基团的其优选实施方式作为侧链或末端基团的低聚物和聚合物中，优选聚合物。
利用已知的化学功能和反应，式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的侧链或末端基团可被方便地接枝于聚合物或低聚物骨架，从而提供根据本发明的聚合物。本领域技术人员会理解，术语“接枝于聚合物或低聚物”不排除在聚合反应前将侧链结合于单体的选择。如式(II)中的自由价所示，侧链或末端基团通过共价键附接至聚合物或低聚物骨架。
可进一步理解，本文所用的术语“聚合物”和“低聚物”包括通过多种反应如加聚和缩聚反应(包括自由基聚合、阴离子或阳离子聚合)可获得的聚合物和低聚物，以及通过分步偶联反应(例如，逐步生长方法)可获得的聚合物和低聚物。
因此，适合作为携带多个式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的基团作为侧链或末端基团的聚合物或低聚物骨架的聚合物或低聚物包括聚合物或低聚物如聚酰胺、聚酯、具有碳链骨架的聚合物类，和多糖。示例性聚合物或低聚物骨架由下列提供：包括多个谷氨酸或天冬氨酸单元的聚(氨基酸)如聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸)、蛋白质、聚炔、聚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚马来酸、聚磺酸酯、聚苯乙烯磺酸酯、聚磷酸酯、戊聚糖聚硫酸酯、聚(乙烯基磷酸)、聚(丁二烯-共-马来酸)、聚(丙烯酸乙酯-共-丙烯酸)、聚(乙烯-共-丙烯酸)、聚(乙烯-共-马来酸酐)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯磺酸-共-马来酸)、聚(氯乙烯-共-乙酸乙烯酯-共-马来酸)、碳水化合物如肝素、硫酸乙酰肝素、聚(葡萄糖醛酸)、聚(半乳糖醛酸)、透明质酸、聚(糖醛酸)——总体而言、或羧基封端的树枝状聚合物。其中，优选包括多个谷氨酸或天冬氨酸单元的聚(氨基酸)，如聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸)和聚(甲基)丙烯酸。用于本发明目的最优选的是聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸。
优选地，聚合物骨架具有10至10,000，优选50至5,000，的聚合度(以聚合单元平均数表示，其例如通过凝胶渗透色谱法(GPC)确定)。
根据本发明的聚合物可通过均聚物或共聚物来提供。共聚物可包含具有不同结构的聚合单元，致使聚合物骨架是共聚物。可选地，共聚物可基于均聚物作为聚合物骨架而获得，其中不是所有聚合单元都携带式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的基团。要理解，也可选择通过将侧链接枝至共聚物骨架中一定百分比的单元来组合这两种选项。共聚物可以是无规、梯度(gradient)或嵌段共聚物形式。
如果根据本发明的聚合物是均聚物，则所有聚合单元都携带式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的基团。如果根据本发明的聚合物是共聚物，优选所有聚合单元中5至100％携带式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的基团，更优选地25至100％，尤其50至100％。百分比以相对于所有聚合单元携带式(II)基团的单元数的方式给出。
上述共聚物除式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的基团外还可包含含有侧链或末端基团的其他胺。然而，根据本发明的优选聚合物不包含式-NH-(CH2)x-(NH(CH2)2)y-NH2的侧链或末端基团，其中x表示1至5的整数，并且y表示1至5的整数。
携带式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的侧链的优选聚酰胺包含式(V)的重复单元：
Figure BPA0000218995900000161
其中变量具有下列含义：
R8和R9独立地选自键和C1-C6烷二基；
R10选自H和C1-C6烷基；
R11选自键和C1-C6烷二基，
L1是二价连接基团，和
A1表示式(II)的低聚(亚烷基胺)基团。
优选地，R8和R9独立地选自键和C1-C5烷二基，更优选是键。优选地，R10选自H和甲基，最优选是H。R11优选是C1-C6烷二基。
在优选实施方式中，连接基团L1具有结构-Z1-R’-Z2-，其中Z1选自键、-NH-(C＝O)-、-NH-C(S)-NH-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-S(O)2-、-NH-CH2-C(OH)-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-、-CH＝N-NH-(C＝O)-、-S-S-、-硫醚键-、-S-CH2-(C＝O)-、-S-、-S-CH2-CH-NH2-、和-芳基硫醚键-；R’选自键，C1-C6烷二基和-(CH2-CH2-O)n-H，其中n＝1-3；和Z2选自键、-(C＝O)-、-NH-C(S)-、-NH-(C＝O)-、-S(O)2-、-O-P(O)2-、-CH(OH)-CH2、-O-(C＝O)-和-C(NH)-。优选地，Z1选自键、-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-；R’选自键和C1-C6烷二基，并且Z2选自键、-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-、和-O-(C＝O)-；条件是Z1和Z2中的一个不是键。关于L1最优选Z1和R’是键并且Z2是-(C＝O)-；或Z1是-NH-(C＝O)-，R’是C1-C6烷二基，而Z2是-(C＝O)-。
A1优选是本文限定的式(II)低聚(亚烷基胺)基团的优选实施方式中的一个，具体地式(IIa)-(IId)基团中的一个。
在包含式(V)重复单元的优选聚酰胺中，优选所有聚合单元中5至100％是式(V)单元，更优选25至100％，尤其50至100％。百分比以相对于所有聚合单元的式(V)单元数的方式给出。在关于式(V)变量给出的限定和优选限定之内，根据本发明的优选聚合物中的式(V)重复单元可以相同或不同。
用于本发明的特别优选的聚酰胺聚合物是式(Va)和(Vb)的聚合物。
Figure BPA0000218995900000171
在这些式中，R8、R9、R10、R11、L1和A1限定如式(V)，包括其优选实施方式。R12选自OH或C1-C6烷氧基、-NH2、聚(乙二醇)链、或受体配体。R13是H、氨基保护基团、聚(乙二醇)链、或受体配体，X1选自H、-NH2、-COOH和-COOR”，其中R”是C1-C6烷基、聚(乙二醇)链、或受体配体。在式(Va)中，s(表示聚合单元平均数，例如通过凝胶渗透色谱法(GPC)确定)是10至10,000，优选50至5,000。在式(Vb)中，括号中的单元是可以任何顺序在聚合物中排列的重复单元，包括具体地无规、交替或分区(blockwise)排列。q+r的总和(表示聚合单元平均数，例如通过凝胶渗透色谱法(GPC)确定)是10至10,000，优选50至5,000，并且q/(q+r)的比的范围为0.05至1，优选0.25至1，更优选地0.5至1。
可方便地通过式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的侧链修饰的示例性优选聚(氨基酸)是聚(谷氨酸)、聚(天冬氨酸)、聚赖氨酸、聚鸟氨酸或包含谷氨酸、天冬氨酸、鸟氨酸和/或赖氨酸单元的聚(氨基酸)。更优选聚(谷氨酸)。
具有携带式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的侧链的碳链骨架的优选聚合物包含式(VI)的重复单元：
Figure BPA0000218995900000181
其中变量具有下列含义：
R14和R15独立地选自键和C1-C6烷二基；
R16选自H和C1-C6烷基；
R17选自键和C1-C6烷二基，
L2是二价连接基团，和
A1表示式(II)的低聚(亚烷基胺)基团。
优选地，R14是键，并且R15是键或-CH2-。更优选地，R14是键，并且R15是-CH2-。优选地，R16选自H和甲基。R17优选是键或-CH2-。
在优选实施方式中，连接基团L2具有结构-Z3-R’-Z4-，其中Z3选自键、-NH-(C＝O)-、-NH-C(S)-NH-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-S(O)2-，-NH-CH2-C(OH)-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-、-S-S、-CH＝N-NH-(C＝O)-、-硫醚键-，-S-CH2-(C＝O)-、-S-、-S-CH2-CH-NH2-、和-芳基硫醚键-；R’选自键，C1-C6烷二基和-(CH2-CH2-O)n-H，其中n＝1-3；和Z4选自键、-(C＝O)-、-NH-C(S)-、-NH-(C＝O)-、-S(O)2-、-O-P(O)2-、-CH(OH)-CH2、-O-(C＝O)-和-C(NH)-。优选地，Z3选自键、-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-；R’选自键和C1-C6烷二基并且Z4选自键、-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-、和-O-(C＝O)-；条件是Z3和Z4中的一个不是键。关于L2最优选Z3和R’是键并且Z4是-(C＝O)-。
A1优选是本文限定的式(II)低聚(亚烷基胺)基团的优选实施方式中的一个，具体地式(IIa)-(IId)基团中的一个。
在包含式(VI)重复单元的优选聚酰胺中，优选所有聚合单元中5至100％是式(VI)单元，更优选25至100％，尤其50至100％。百分比以相对于所有聚合单元的式(VI)单元数的方式给出。在关于式(VI)变量给出的限定和优选限定中，根据本发明的优选聚合物中的式(VI)重复单元可以相同或不同。
作为具有携带式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的侧链的碳链骨架的聚合物，特别优选式(VIa)和(VIb)的聚合物。
Figure BPA0000218995900000191
在这些式中，R14、R15、R16、R17、L2和A1限定如式(VI)，包括其优选实施方式。X2选自-COOH和-COOR”，其中R”是C1-C6烷基、聚(乙二醇)链、或受体配体。在式(VIa)中，s(表示聚合单元平均数，例如通过凝胶渗透色谱法(GPC)确定)是10至10,000，优选50至5,000。在式(VIb)中，括号中的单元是可以任何顺序在聚合物中排列的重复单元，包括具体地无规、交替或分区型排列。q+r的总和(表示聚合单元平均数，例如通过凝胶渗透色谱法(GPC)确定)是10至10,000，优选50至5,000，并且q/(q+r)的比的范围为0.05至1，优选0.25至1，更优选地0.5至1。
具有可方便地通过式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的侧链修饰的碳链骨架的示例性优选聚合物是聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸或聚马来酸，更优选是聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸。
携带式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的侧链的优选多糖包含式(VII)重复单元：
Figure BPA0000218995900000201
其中变量具有下列含义：
R19和R22独立地选自键和-(CH)2-；t为0或1；
并且R18、R20和R21中的一项表示-L3-A1，其中L3是二价连接基团并且A1表示式(II)低聚(亚烷基胺)基团，其他项独立地选自-H、-OH、和-(CH2)n-OH，其中n＝1或2。
优选地，R19和R22是键。优选地，R18、R20和R21中的一项表示-L3-A1，其中L3是二价连接基团并且A1表示式(II)低聚(亚烷基胺)基团，其他项是-OH。
在优选实施方式中，连接基团L3具有结构-Z5-R’-Z6-，其中Z5选自键、-NH-(C＝O)-、-NH-C(S)-NH-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-S(O)2-、-NH-CH2-C(OH)-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-、-S-S、-CH＝N-NH-(C＝O)-、-硫醚键-、-S-CH2-(C＝O)-、-S-、-S-CH2-CH-NH2-、和-芳基硫醚键-；R’选自键，C1-C6烷二基和-(CH2-CH2-O)n-H，其中n＝1-3；和Z6选自键、-(C＝O)-、-NH-C(S)-、-NH-(C＝O)-、-S(O)2-、-O-P(O)2-、-CH(OH)-CH2、-O-(C＝O)-和-C(NH)-；条件是Z5和Z6中的一个不是键。优选地，Z5选自键、-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-；R’选自键和C1-C6烷二基并且Z6选自键、-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-、和-O-(C＝O)-；条件是Z5和Z6中的一个不是键。关于L3最优选Z5和R’是键并且Z6是-(C＝O)-。
A1优选是本文限定的式(II)低聚(亚烷基胺)基团的优选实施方式中的一个，具体地式(IIa)-(IId)基团。
在包含式(VII)重复单元的优选多糖中，优选所有聚合单元中5至100％是式(VII)单元，更优选25至100％，尤其50至100％。百分比以相对于所有聚合单元的式(VII)单元数的方式给出。在关于式(VII)变量给出的限定和优选限定中，根据本发明的优选聚合物中的式(VII)重复单元可以相同或不同。
作为携带式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的侧链的多糖，特别优选式(VIIa)聚合物。
Figure BPA0000218995900000211
在此式中，R18、R19、R20、R21、R22和t限定如式(VII)，包括其优选实施方式。s(表示聚合单元平均数，例如通过凝胶渗透色谱法(GPC)确定)是10至10,000，优选50至5,000。
具有可方便地通过式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的侧链修饰的多糖骨架的示例性聚合物是淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原、纤维素、葡聚糖、糊精、环糊精、几丁质、壳聚糖、菊糖、普鲁兰糖(Pullulan)、硬葡聚糖、凝胶多糖(curdlan)、胼胝质、昆布多糖、金藻昆布糖；、木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、墨角藻聚糖和半乳甘露聚糖、蛋白多糖、聚葡糖醛、聚葡糖醛、纤维素糖醛酸(cellouronic acid)、壳聚糖醛酸(chitouronicacid)、聚糖醛酸、果胶、葡糖胺聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸琼脂、海藻酸钠、海藻酸、阿拉伯胶、角叉胶、墨角藻聚糖、岩藻半乳聚糖(fucogalactan)、壳二糖八乙酸酯、壳三糖十一乙酸酯、麦芽寡糖。优选壳聚糖、羟乙基淀粉、葡聚糖、糊精、环糊精(α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、和6-环糊精)。
可经修饰使其分支结构中包含多个式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的末端基团的各种树枝状聚合物结构在本领域已知，并且被描述为例如，聚酰胺胺(PAMAM)(Tomalia等，1990，Angew.Chem.Int.Edn.Engl.29，138-175)或断裂的PAMAM(Tanget al，1996，Bioconjug.Chem.7，703-714)、聚胺(Hawker等，1990，J.Am.Chem.Soc.112，7638-7647)、聚酰胺(聚肽)(Sadler等，2002，J.Biotechnol.90、195-229)、聚(芳基醚)(Hawker等，1990，J.Am.Chem.Soc.112，7638-7647)、聚酯(Ihre等，1996，J.Am.Chem.Soc.118，6388-6395，Grinstaff等，2002，Chemistry 8，2838-2846)、碳水化合物(Turnbull等，2002，J.Biotechnol.90，231-255)、DNA(Nilsen等，1997，J.Theor.Biol.187，273-284，Li et al.，2004，Nat.Mater.3，38-42)、脂质(Ewert等，2006，Bioconjug Chem.17，877-88)、聚(醚亚胺)(Thankappan等，2011，Bioconjug Chem.22，115-9.)、三嗪(Lim等，2012，Adv Drug Deliv Rev.15，826-35)和聚甘油(Fischer等，2010，Bioconjug Chem.21，1744-52)。
要理解，包括多个式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的基团作为末端基团的低聚物还包括这样的低聚物：其中多个这种基团共价作为末端基团附接至多官能核心结构，该多官能核心结构提供适当官能团来附接多个式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的基团。这些多官能核心结构具体地包括二价、三价或更高价羧酸或聚胺。如需，多官能核心结构的官能团可被连接基团激活或与连接基团反应，从而允许式(II)基团或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的基团附接。可经修饰携带多个这种基团示例性分支核心结构由如下式(VIIIa-g)示例：
Figure BPA0000218995900000221
Figure BPA0000218995900000231
本领域技术人员知道，包括式(II)或包括式(IIa)-(IId)的其优选实施方式的基团作为侧链和/或末端基团的聚合物或低聚物可容易通过偶联低聚(亚烷基胺)至包括或经修饰包括适于偶联化学的官能团的聚合物骨架由多种合成方式获得。这种官能团包括-COOH、-CO-、-CHO、-SO3H、-PO4H、-NH-、-NH2、-OH、或-SH。要理解，也可将适当的单体在其聚合前用式(II)基团修饰，以提供根据包含式(II)侧链和/或末端基团的本发明的聚合物或低聚物。然而，总体而言优选修饰聚合物。
例如，包括羧酸基团的母体聚合物(即，提供根据本发明的聚合物中的聚合物骨架的聚合物)适于定向偶联至需要之处——通过激活，例如利用碳二亚胺和随后与下式(前II)的低聚(亚烷基胺)进行的酰胺键形成，其中变量a、b、p、m、n和R2至R6限定如式(II)——以提供式(II)的侧链和/或末端基团。
H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (前II)，
如需，式(前II)化合物可在其一个末端或每个末端和/或中部仲氨基基团处得到保护——利用氨基的常规保护基团，如例如WO2006/138380所述的保护基团，优选叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、或苄氧羰基(Cbz))。
如果交联反应是不期望的，优选在式(前II)的低聚(亚烷基胺)的活性氨基相对于母体聚合物羧酸基团过量存在的情况下进行这种反应。根据母体聚合物的性质，偶联反应可在含水或有机溶剂中进行。适当的偶联条件是肽和生物缀合物化学领域公知的(GregT.Hermanson，Bioconjugate Techniques，2nd Edition，Academic Press 2008)。如上所述，适当的聚合物骨架包括但不限于，包括多个谷氨酸或天冬氨酸单元的聚(氨基酸)，如聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸)、蛋白质、聚炔、聚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚马来酸、聚磺酸酯、聚苯乙烯磺酸酯、聚磷酸酯、戊聚糖聚硫酸酯、聚(乙烯基磷酸)、聚(丁二烯-共-马来酸)、聚(丙烯酸乙酯-共-丙烯酸)、聚(乙烯-共-丙烯酸)、聚(乙烯-共-马来酸酐)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯磺酸-共-马来酸)、聚(氯乙烯-共-乙酸乙烯酯-共-马来酸)碳水化合物如肝素、硫酸乙酰肝素、聚(葡萄糖醛酸)、聚(半乳糖醛酸)、透明质酸、聚(糖醛酸)——总体而言、或羧基封端的树枝状聚合物。
关于本发明的其它实施方式，可通过母体聚合物的还原氨化获得包括式(II)侧链和/或末端基团的聚合物。碳水化合物或糖可被氧成醛，然后与低聚(亚烷基胺)反应，生成亚胺，该亚胺可用例如氰基硼氢化钠还原，生成胺。
关于本发明的更进一步实施方式，低聚(亚烷基胺)可在第一步中被衍生，生成羧基封端的低聚(亚烷基胺)，例如式(前II’)的羧基封端的低聚(亚烷基胺)，其适于偶联至母体聚合物的羟基和氨基：
HOOC-(CH2)u-L’-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6
(前II’)，
其中u是1至6的整数，L’是键或-(CH)2-，并且其它变量限定如式(II)。如需，式(前II)或(前II’)化合物中的任何末端和/或内部仲氨基(一个或多个)可用氨基的常规保护基团保护起来，如例如WO2006/138380描述的保护基团，优选叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、或苄氧羰基(Cbz)。
为此，可使低聚(亚烷基胺)与二羧酸酐、二羧酸或醛反应，产生结构(前II’)。虽然可在不为低聚(亚烷基胺)(前II)的胺提供正交保护基团的情况下获得结构(前II’)，但可优选提供正交保护基团。结构(前II’)允许通过直接偶联进行例如聚(赖氨酸)、聚(鸟氨酸)或聚(乙烯胺)的修饰，导致酰胺键形成。在偶联反应完成后，可通过常规方法去除任何保护基团。然后可纯化所得聚合物，例如通过透析或离子交换或尺寸排阻或反相或疏水相互作用色谱法。
在胺保护基团已被去除后和树枝状聚合物情况的最终偶联步骤前，可通过沉淀、透析或尺寸排阻色谱法纯化中间体和终产物。
包含多个式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)的其优选实施方式的重复单元的聚合物或低聚物可以是线性、分支、或交联聚合物、或树枝状聚合物(树枝状聚合物)。优选地，包含多个式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)的其优选实施方式的重复单元的聚合物或低聚物包含至少25％，更优选至少40％的这种重复单元——按照相对于聚合物或低聚物中重复单元总数的式(III)单元数。尤其优选包含多个式(III)或其优选实施方式(包括式(IIIa)-(IIId))的重复单元的聚合物或低聚物中所有重复单元的50％或更多是这种单元。其余重复单元由允许式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)的其优选实施方式的重复单元偶联的分子提供，具体地是得自二价、三价或更高价羧酸的单元。
包含多个式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)的其优选实施方式的重复单元的聚合物或低聚物可方便地利用式(前III)化合物而获得：
H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (前III)，
其中“前(pre)”表示式(前III)是式(III)的前体，并且其中变量a、b、p、m、n和R2至R5限定如式(III)，并且R6限定如式(II)，包括其优选实施方式；或优选地利用式(前IIIa)-(前IIId)的化合物，其中变量限定分别如式(IIIa)、(IIIb)(IIIc)或(IIId)：
H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (前IIIa)，
H-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5-R6 (前IIIb)，
H-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-R6 (前IIIc)，
H-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H (前IIId)，
携带末端胺基团的这些化合物可利用常规偶联反应，连接形成线性、分支、交联或树枝状的聚合物。可用作这种偶联反应的反应物的适当化合物包括二价、三价或更高价羧酸。市售并且可分别与式(前III)、(前IIIa)、(前IIIb)、(前IIIc)和(前IIId)的连接体化合物反应的示例性化合物由下式(VIIIa-g)示例：
Figure BPA0000218995900000261
Figure BPA0000218995900000271
虽然多价羧酸与二胺直接反应可方便实现，但要理解，连接体化合物不限于提供羧酸基团的那些连接体化合物(或其活化形式)。例如，可在式(前III)化合物的二酰胺已用二羧酸如琥珀酸形成后，使式(VIIIg)化合物与式(前III)化合物反应。
而且，低聚(亚烷基胺)可在第一步被衍生，生成式(前III’)的羧基封端的低聚(亚烷基胺)，例如，如上文关于制备式(前II’)化合物所述：
HOOC-(CH2)u-L”-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6
(前III’)，
其中u是1至6的整数，L”是键或-(CH)2-，并且其它变量限定如式(III)，和R6限定如式(II)。如需，式(前III’)化合物中的任何内部仲氨基(一个或多个)可用氨基的常规保护基团保护，如例如WO2006/138380描述的保护基团，优选叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、或苄氧羰基(Cbz)。如果其余末端氨基-NR5R6以无保护形式/允许与羧酸基团形成酰胺的形式存在，可将式(前III’)化合物聚合或低聚，以提供包括多个式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)的优选实施方式的低聚(亚烷基胺)基团作为重复单元的低聚物或聚合物。这种聚合物可以是线性或分支的。
例如，结构(前III’)可用于通过无规聚合或以限定方式形成分支结构。共聚可在含水或有机溶剂中、在低聚(亚烷基胺)(任选地具有受保护的内部氨基)和聚羧酸(VIIIa-VIIIg)的混合物中通过碳二亚胺活化被原位活化。
包含多个式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)的其优选实施方式的基团作为重复单元的树枝状聚合物也可例如利用多价偶联分子制备。树枝状聚合物是由像树一样从中央核心径向发散的充分分支的单体组成的聚合物分子——树枝状聚合物的名称由此而来(Greek，dendra)。当树枝状聚合物的核心被去除时，留下多个被称为树突的相同片段，树突数量取决于中央核心(2、3、4或更多)的多样性。树突可分成3个不同区域：核心、中部(或分支)和外周(或一个或多个末端基团)。从树突核心向外至其外周遭遇的分支点数量限定了其代(generation)(G-1、G-2，G-3)；较高代的树枝状聚合物比较低代的树枝状聚合物更大，分支更多，并且其外周具有更多末端基团。
合成可以是发散的，导致指数样生长；或收敛的，其中使树突单独生长并且在最后一步中附接至核心。与用于固相聚肽和寡核苷酸合成的方法相似，以分步方式制备树枝状聚合物，因此产物的尺寸理论上是单分散的，与传统聚合物合成相反，在传统聚合物合成中链生长是统计学的并且获得多分散性产物。单分散性产物是非常期望的，不仅是为合成再现性，而且还为减少实验和治疗可变性。在实践中，低代树枝状聚合物(上至G-3)可容易获得单分散性产物，而较高代不能从带有结构非常相似的微小缺陷的树枝状聚合物中纯化出纯树枝状聚合物，这有时导致偏离于绝对单分散性，尽管一般是微小的偏离。
作为包括多个式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)的其优选实施方式的低聚(亚烷基基团)的根据本发明的聚合物，优选的树枝状聚合物具有G1至G10范围的多个代，更优选G2-G8，尤其G3-G6。这些树枝状聚合物的分子量(其可在反应步骤中混合的反应物的基础上被计算)优选在如下范围内：1,500至1,000,000，更优选3,000至230,000，尤其6,000至60,000，最优选选自15,000至30,000。
关于限定的聚(酰胺胺)树枝状聚合物的产生，可按照文献描述(例如，Lee等，2005，Nat Biotechnol 23，1517-1526)，将(受保护)结构(前III)和/或(前III’)用于分支核心的逐步生成。作为起始分子，可采用通过二羧酸、酐或丙烯酸活化的低聚(烷基胺)(例如，前III)或聚羧酸(例如，VIIIa-VIIIg)。利用此核心使其与结构(前III)的低聚(烷基胺)分步反应，然后然后末端氨基的纯化和活化——例如通过丙烯酸。在纯化后，可利用此核心再添加低聚(亚烷基胺)层。获得树枝状聚合物的反应条件已在文献中被详细描述(参见例如Lee等，loc.cit.和其中包括的参考文献)。
根据进一步实施方式，两侧以羧基封端的低聚(亚烷基胺)的一侧可被保护，和/或内部胺可被保护——如需，并且可与二胺或末端具有胺基团的树枝状起始结构或与低聚(亚烷基胺)本身共聚。
在胺保护基团去除后和树枝状聚合物情况的最终偶联步骤前，可通过沉淀、透析或尺寸排阻色谱法纯化中间体和终产物。
在更进一步实施方式中，与WO 2011/154331和(Schaffert等，2011，Angew ChemInt Ed Engl 50(38)，8986-9)所述相似，可利用具有末端羧基基团(或其适当保护或活化形式)和末端氨基(或其适当保护形式)的低聚(亚烷基胺)——例如，式(前III’)的低聚(亚烷基胺)——进行完全限定的肽线性或分支结构的分步生成。分步反应可根据肽化学原理进行，并且可在自动化肽合成器中实施。肽合成领域技术人员已知，可利用二氨基酸如赖氨酸或鸟氨酸构建分支结构。因此，可提供多种线性和分支均聚物，而且可提供在聚合物的期望位置包括不同式(I)低聚(亚烷基胺)的杂聚物。另外，可在这种限定的结构中的任何位置并入典型的氨基酸。
关于式(IV)和包括式(IVa)、(IVb)和(IVc)的其优选实施方式的类脂质的制备，可采用与US 2010/0331234 A1、US 8,450,298；Love等，2010，PNAS 107，1864-1869；WO2006/138380；Akinc等，2008，Nat Biotechnol 26，561-569所述那些相似的方法。
例如，式(IV)和包括式(IVa)、(IVb)和(IVc)的其优选实施方式的类脂质可通过使R7-环氧化物或R7-O-(C＝O)-CH＝CH2或R7-NH-(C＝O)-CH＝CH2或R7-(C＝O)-H与式(前IV)的低聚(亚烷基胺)反应获得
H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (前IV)，
其中变量a、b、p、m、n限定如式(IV)，并且R2至R6彼此独立地是氢或氨基保护基团，R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基。优选地，R7是C8-C16烷基或烯基，更优选C8-C12烷基或烯基，最优选C10-C12烷基或烯基。有利地，一端以环氧基、丙烯酸基、丙烯酰胺或醛封端的很多脂肪族化合物是市售的。
优选地，由低聚(亚烷基胺)(前IV’)制备式(IV)类脂质：
H-NH-{CH2-(CH2)a-NH-[CH2-(CH2)b-NH]p}m-[CH2-(CH2)a-NH]n-H (前IV’)；
更优选地，式(前IV)前体具有4个或更多个氨基。最优选地，由低聚(亚烷基胺)(前IV”)制备式(IV)类脂质：
H-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H (前IV”)。
反应可在有或无溶剂的情况下在50℃和90℃之间的高温下进行。适当的溶剂例如是CH2Cl2、CH2Cl3、甲醇、乙醇、THF、己烷、甲苯、苯等。
本领域技术人员已知式(前IV’)低聚(亚烷基胺)
H-NH-{CH2-(CH2)a-NH-[CH2-(CH2)b-NH]p}m-[CH2-(CH2)a-NH]n-H (前IV’)，
中的氮可配置有正交保护基团，如例如WO2006/138380所述。这种情况下的保护基团适于暂时阻断式(前IV’)化合物中的一个或多个氮，使得反应可选择性在相同分子中其他无保护的氮处进行。反应后，通过不影响连接至相同分子中的氮原子的其他残基的化学反应，去除保护基团。正交保护基团是可通过具体影响给定分子中一种保护基团类型的化学反应选择性去除的不同保护基团。例如，如实施例所述，式(前IV’)的低聚(亚烷基胺)中的末端伯氨基可选择性地用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基团保护，而内部仲胺可用叔丁氧基羰基(Boc)保护基团保护。Fmoc基团可选择性地通过碱去除，Boc保护基团通过酸去除。可通过色谱法分离被保护和部分保护的中间体。因此，通过限定定位和/或选择性去除正交保护基团，例如可以选择性地使式(前IV’)的低聚(亚烷基胺)中的中部仲氨基全部或部分或末端伯氨基的两个效价的全部或部分与一端以环氧基或丙烯酸基或丙烯酰胺封端的脂肪族链反应。通过相同原理，可以将多于一种的R7-环氧基或R7-O-(CO)-CH＝CH2或R7-NH-(CO)-CH＝CH2或R7-(CO)-H偶联至给定式(前IV’)的低聚(亚烷基胺)，其中“种”指代残基R7在烷基或烯基方面和在脂肪族链长度方面的不同类型和末端环氧基、丙烯酸基、丙烯酰胺或醛。在这种反应中式(前IV’)的低聚(亚烷基胺)的衍生程度可通过反应物的化学计量来控制，如本领域现有技术所述。在去除保护基团后，氮原子的剩余效价可用于附接胍(guanidinium)基团(-C(NH)-NH2)、聚(乙二醇)链或受体配体。可通过沉淀、萃取或色谱法纯化式(IV)类脂质。基于可借助于保护基团通过受控分步反应制备式(IV)类脂质和可通过反应物的化学计量控制1式(前IV’)低聚(亚烷基胺)的衍生程度的选择，本发明的类脂质可包含伯胺、仲胺、叔胺、和/或季胺、和其盐。因此，类脂质的pKa值也可通过衍生程度的合理设计被调节，使得式(IV)中氮原子中的一个或多个可被质子化以提供适于结合和致密以及保护RNA的式(IV)阳离子类脂质。此外，pKa值可被调节，使得式(IV)中氮原子中的一个或多个可在酸性pH下具有缓冲能力，因此可对细胞内吞摄取发挥质子海绵作用。优选地，式(IV)类脂质的pKa值在3.O和9.0之间，更优选至少一个pKa值在5.0和8.0之间。
可偶联至式(前IV’)的低聚(亚烷基胺)以获得式(IV)类脂质的脂肪族侧链的最大数量为(p+1)x m+n+3，最小数量为1，其中p、m和n限定如式(IV)。优选地，脂肪族侧链的数量至少为2，并且至多为(p+1)x m+n+2——如果残基R1至R6都是氢或-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-C(O)-O-R7、-CH2-CH2-C(O)-NH-R7或-CH2-R7，并且优选地脂肪族侧链的数量至多为(p+1)x m+n+1——如果残基R1至R6中的一个是氨基保护基团或-C(NH)-NH2或聚(乙二醇)链或受体配体。
核酸
本发明的组合物包括核酸，优选RNA，还更优选单链RNA如mRNA。
术语″核酸″包括天然存在的核酸类型以及化学和/或酶促合成的核酸的所有形式，还包括核酸类似物和核酸衍生物，如例如，闭锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、寡核苷酸硫代磷酸酯和磷酸三酯、吗啉代寡核苷酸、阳离子寡核苷酸(US6017700 A，WO/2007/069092)、取代核糖寡核苷酸或硫代磷酸酯。此外，术语″核酸″还指代任何包括核苷酸或核苷酸类似物的分子。关于本发明组合物包括的核酸的序列或尺寸无限制。核酸主要由在本发明组合物所递送的生物靶处实现的生物效应限定。例如，在应用基因或核酸疗法的情况下，核酸或核酸序列可由下列限定：待表达的基因或基因片段、缺陷基因或任何基因靶序列的目标取代或修复、或待抑制、敲除或下调的基因靶序列。
优选地，术语″核酸″指代寡核苷酸或多核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。关于RNA，原则上任何RNA类型都可用于本发明环境。在一个优选实施方式中，RNA是单链RNA。与两个或更多个单独链由于单独链杂交而形成双链分子的RNA分子相比，术语“单链RNA”意为核糖核苷酸的单连续链。术语“单链RNA”不排除单链分子自己内部形成双链结构如环结构、二级结构或三级结构。
术语“RNA”包括编码氨基酸序列的RNA以及不编码氨基酸序列的RNA。已提出基因组的多于80％包含不编码蛋白质的功能型DNA成分。这些非编码序列包括调节型DNA成分(元件，elements)(转录因子、调节因子和共调节因子等的结合位点)和编码永不翻译成蛋白质的转录体的序列。这些被基因组编码并且转录成不翻译成蛋白质的RNA的转录体被称为非编码RNA(ncRNA)。因此，在一个实施方式中，RNA是非编码RNA。优选地，非编码RNA是单链分子。研究证明，ncRNA在基因调控、维持基因组完整性、细胞分化和发育中具有关键作用，并且其在多种人类疾病中被误调。存在不同类型的ncRNA：短型(20-50nt)、中型(50-200nt)和长型(＞200nt)ncRNA。短型ncRNA包括微型RNA(miRNA)、小型干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、和转录启动RNA(tiRNA)。中型ncRNA的实例是小型核RNA(snRNA)、小型核仁RNA(snoRNA)、转移RNA(tRNA)、转录起始位点相关RNA(TSSaRNA)、启动子相关小型RNA(PASRs)、和启动子上游转录体(PROMPT)。长型非编码RNA(IncRNA)包括长型基因间非编码RNA(lincRNA)、反义-lncRNA、内含子lncRNA、转录的超保守RNA(T-UCRs)、和其他。长型非编码RNA(Bhan A，Mandal SS，ChemMedChem.2014Mar 26。doi：10.1002/cmdc.201300534)。在上述非编码RNA中，只有siRNA是双链的。因此，由于在优选实施方式中非编码RNA为单链的，优选非编码RNA不是siRNA。在另一实施方式中，RNA是编码RNA，即，编码氨基酸序列的RNA。这种RNA分子也被称为mRNA(信使RNA)，并且是单链RNA分子。核酸可通过本领域技术人员已知的合成化学法和酶法或通过利用重组技术制备，或可从天然来源分离，或通过其组合制备。寡核苷酸或多核苷酸可任选地包括非天然核苷酸，并且可以是单链或双链或三链的。“核酸”还指代正义和反义寡核苷酸或多核苷酸，即，与DNA和/或RNA的具体核苷酸序列互补的核苷酸序列。
优选地，术语核酸指代mRNA，最优选指代修饰的mRNA。
信使RNA(mRNA)是主要利用腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷作为核苷、由磷酸核苷构建段构建的聚合物，其作为中间载体，将细胞核中的遗传信息从DNA引入细胞质，在此使之翻译成蛋白质。因此，其适于作为基因表达的替代形式。
在本发明的情境下，mRNA应被理解意为任何这样的聚核糖核苷酸分子：如果其进入细胞，则适于蛋白质或其片段表达，或可翻译成蛋白质或其片段。术语“蛋白质”在此包括任何种类的氨基酸序列，即，两个或更多个各自通过肽键连接的氨基酸的链，并且还包括肽和融合蛋白。
mRNA包含编码这样的蛋白质或其片段的核糖核苷酸序列：其在细胞中或细胞附近的功能被需要或有益，例如，在细胞或其附近的其缺失或缺陷形式是疾病或患病的触发因素的蛋白质、其供应可缓解或预防疾病或患病的蛋白质、或可促进对身体有益的过程的蛋白质。mRNA可包含完全蛋白质或其功能性变体的序列。进一步，核糖核苷酸序列可编码充当因子、诱导因子、调节因子、刺激因子或酶的蛋白质、或其功能性片段，其中该蛋白质的其功能为治疗障碍(具体地代谢障碍)或启动体内过程(如形成新血管、组织等)所需的蛋白质。在此，功能性变体被理解意为在细胞中可承担其功能被细胞需要或其缺失或缺陷形式引起疾病的的蛋白质的功能的片段。另外，mRNA还可具有其他功能性区域和/或3’或5’非编码区域。3’和/或5’非编码区域可以是天然在蛋白质编码序列侧翼的区域或有助于RNA稳定的人工序列。本领域技术人员可通过常规实验确定在每种情况下对此适宜的序列。
在优选实施方式中，mRNA包含m7GpppG帽，内部核糖体进入位点(IRES)和/或处于3’端的多A尾部，具体地为了提高翻译。mRNA可具有另外的促进翻译的区域。
在优选实施方式中，mRNA是包含修饰和未修饰核苷酸的组合的mRNA。优选地，其是包含WO2011/012316描述的修饰和未修饰核苷酸的组合的mRNA。其中描述的mRNA据报道显示增加的稳定性和减少的免疫原性。在优选实施方式中，在这种修饰的mRNA中，5至50％的胞苷核苷酸和5至50％的尿苷核苷酸被修饰。包含腺苷和鸟苷的核苷酸可以是未修饰的。腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰的或部分修饰的，并且其优选以未修饰形式存在。优选10至35％的胞苷和尿苷核苷酸是被修饰的，并且特别优选修饰胞苷核苷酸在7.5至25％范围内，并且修饰尿苷核苷酸的含量在7.5至25％范围内。已发现，事实上相对低的含量，例如，修饰胞苷和尿苷核苷酸每种仅10％，可实现期望的性质。特别优选修饰胞苷核苷酸是5-甲基胞苷残基，并且修饰尿苷核苷酸是2-硫代尿苷残基。最优选地，修饰胞苷核苷酸的含量和修饰尿苷核苷酸的含量分别为25％。
在另一优选实施方式中，mRNA可与目标结合位点、靶向序列和/或微型RNA结合位点组合，从而使期望的mRNA的活性仅存在于相关细胞中。在进一步优选实施方式中，RNA可与微型RNA或3’聚A尾部下游的shRNA组合。
此外，术语″核酸″可指代DNA或RNA或其混合物或本领域已知的其任何修饰(参见，例如，US 8278036、WO 2013/052523、WO 2011/012316、US 5525711、US 4711955、US5792608或EP 302175，(Lorenz等，2004，Bioorg Med Chem Lett，14，4975-4977；Soutschek等，2004，Nature，432，173-178)——修饰实例)。这种核酸分子(一种或多种)是单链或双链的，线性或环形的，天然或合成的，并且无任何尺寸限制。例如，核酸分子(一种或多种)可以是基因组DNA、cDNA、mRNA、反义RNA、核酶、或小型干扰RNA(siRNA)、微型RNA、antagomirs、或短发夹RNA(shRNA)、tRNA或长型双链RNA或编码这种RNA的DNA构建体或嵌合体(chimeraplasts)(Colestrauss等，1996，Science，273，1386-1389)、或适配体、成簇的规律间隔的短回文重复(用于RNA引导的位点特异性DNA切割的“CRISPR”)(Cong等，2013，Science，339，819-823)、或RNA和DNA。所述核酸分子(一种或多种)的形式可以是质粒、粘粒、人工染色体、病毒DNA或RNA、噬菌体DNA、编码和非编码的单链(mRNA)或双链RNA和寡核苷酸(一种或多种)，其中包括如上所述的糖骨架和/或碱基的任何现有技术修饰和3’-或5修饰。在特别优选的实施方式中，核酸是RNA，更优选是mRNA或siRNA。
核酸(一种或多种)可包含编码目标细胞所要表达的多肽的核苷酸序列。可利用本领域技术人员公知的方法构建重组核酸分子；参见，例如，Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)N.Y.和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates和WileyInterscience，N.Y.(1989描述的)技术。
在优选实施方式中，所述核酸是治疗或药学活性核酸，包括上述所有核酸类型和修饰和本领域技术人员已知可具有治疗或预防效果的那些核酸。总体上，治疗或预防效果可通过核酸与细胞分子和细胞器的相互作用实现。这种相互作用独自可例如活化固有的免疫系统，正如被设计以与toll样和其他胞外或胞内受体特异性相互作用的某些CpG寡核苷酸和序列的情形。此外，细胞内摄取或引入核酸可意图在于导致核酸包括的核苷酸序列(如基因)表达，可意图在于下调、沉默或敲除内源基因表达——胞内存在引入的外源核酸的结果，或可意图在于修饰内源核酸序列如修复、删除、插入或交换选定的碱基或整段内源核酸序列，或可意图在于干扰实质上任何细胞过程——引入的外源核酸在胞内存在和相互作用的结果。引入的外源核酸的过表达可意图在于补偿或补充内源基因表达，特别是在内源基因缺陷或沉默导致无基因表达产物、基因表达产物不足或缺陷或机能失调的情况下，如很多代谢和遗传疾病情形，如少量举例：囊性纤维化、血友病或肌肉萎缩症。引入的外源核酸的过表达还可意图在于使表达产物与诸如基因表达调控、信号转导和其他细胞过程的任何内源细胞过程相互作用或对其进行干扰。引入的外源核酸的过表达也可意图在于在转染或转导后的细胞所在或致使转染或转导后的细胞所在的生物体环境中引起免疫应答。实例是抗原呈递细胞(如树枝状细胞)的遗传修饰，从而使其呈递抗原，用于接种目的。其他实例是肿瘤细胞因子过表达，从而引起肿瘤特异性免疫应答。此外，引入的外源核酸的过表达还可意图在于体内或离体(先体外后体内，ex vivo)暂时生成遗传修饰的细胞以用于细胞治疗，如修饰的T-细胞或前体或干细胞或其他细胞，用于再生药物。
治疗目的的内源基因表达下调、沉默或敲除可例如通过RNA干扰(RNAi)，利用核酶、反义寡核苷酸、tRNA、长型双链RNA(其中这种下调可以是序列特异性或非特异性的，并且还可导致细胞死亡，如长型双链RNA引入细胞时的情形)实现。内源或先已存在的基因表达的下调、沉默或敲除可有效用于治疗获得性、遗传性或自然发生性疾病，包括病毒感染和癌症。还可设想核酸引入细胞可作为预防措施实施，从而预防例如病毒感染或瘤形成。内源基因表达下调、沉默或敲除可在转录水平上和翻译水平上实施。多种机制是本领域技术人员已知，包括例如外遗传修饰、染色质结构变化、通过引入核酸选择性结合转录因子、引入核酸通过碱基配对(包括非常规碱基配对机制如三股螺旋形成)与基因组DNA中的互补序列、mRNA或其他RNA种类杂交。类似地，基因修复、碱基或序列变化可在基因组水平和在mRNA水平上实现，包括外显子跳读。碱基或序列变化可例如通过如下实现：通过RNA引导的位点特异性DNA切割，通过剪切和粘贴机制——采用反式剪接、反式剪接核酶、嵌合体、剪接体(splicosome)介导的RNA反式剪接，或通过采用基团II或再靶向的(retargeted)内含子，或通过采用病毒介导的插入式突变或利用目标基因组插入——利用原核，真核或病毒整合酶系统。由于核酸是生命系统构建设计的载体并且由于其以直接和间接方式参与很多细胞过程，在理论上任何细胞过程可受到核酸从外部引入细胞的影响。尤其，这种引入可直接在体内实施和在细胞或器官培养中离体实施然后将由此修饰的器官或细胞移植到接受者中。本发明的核酸复合物作为活性剂可有效用于所有上述目的。
组合物
如上所述，根据本发明的组合物包括核酸和包含低聚(亚烷基胺)的组分，该组分选自：
a)低聚物或聚合物，其包括多个式(II)基团作为侧链和/或作为末端基团：
Figure BPA0000218995900000341
其中变量a、b、p、m、n和R2至R6限定同上，包括优选实施方式，和具体地式(IIa)-(IId)的优选基团；并且其中式(II)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(II)的阳离子基团；
b)低聚物或聚合物，其包括多个式(III)基团作为重复单元：
Figure BPA0000218995900000351
其中变量a、b、p、m、n和R2至R5限定同上，包括优选实施方式，和具体地式(IIIa)-(IIId)的优选基团；并且其中式(III)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(III)的阳离子基团；或
c)类脂质，其具有式(IV)的结构：
Figure BPA0000218995900000352
其中变量a、b、p、m、n和R1至R6限定同上，包括优选实施方式，和具体地式(IVa)-(IVc)的优选结构；并且其中式(IV)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(IV)的阳离子基团。
本发明还包括由下列组成的组合物：RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)和包括低聚(亚烷基胺)的组分，该组分选自下列组分：本文限定的a)至c)，包括其优选实施方式。然而，组合物还可包括进一步组分，例如，用于脂质制剂的组分和/或在RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)递送至细胞和递送到细胞中期间实施效应子功能的组分。
要理解，根据本发明的组合物总体上提供RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)与下列的联合：低聚物、聚合物或类脂质，和任选的在有限的实体中联合的、在应用过程中(例如，在RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)递送的期望途径中)稳定到足以保持显著比例的所述组分的联合直到达到生物靶或生物靶周围的另外组分。
由于根据本发明的低聚物、聚合物或类脂质中存在可质子化氨基，这些低聚物、聚合物或类脂质可在式(II)或(III)基团中或在式(IV)结构中包括阳离子电荷，使得低聚物、聚合物或类脂质在存在质子(例如，在水或含水溶液中)、或在存在质子供质子酸的情况下形成阳离子，一般是包含多个阳离子部分的寡阳离子或聚阳离子。因此，优选地，根据本发明的组合物包含下列或由下列组成：RNA(优选地单链RNA如mRNA)和根据本发明的阳离子低聚物、聚合物或类脂质的复合物。要理解，这种复合物中的阳离子低聚物、聚合物或类脂质和阴离子核酸总体上通过静电相互作用相关。然而，取决于低聚物、聚合物或类脂质和RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)的具体结构，其他吸引相互作用也可参与稳定化合物，包括氢键和共价键。
在本发明的组合物中，低聚物、聚合物或类脂质和RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)，可以例如下列低聚物、聚合物或类脂质重量/核酸重量比(w/w)被包含：0.25/1-50/1，优选0.5/1-30/1，更优选1/1-20/1。
更优选地，在其中组合物包含RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)和根据本发明的阳离子低聚物、聚合物或类脂质的复合物的情况下，可考虑彼此电荷中和程度来选择本发明组合物中低聚物、聚合物或类脂质与RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)的相对比。在利用RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)与阳离子低聚物、聚合物或类脂质的复合物进行的RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)递送中，总体上，与给定量RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)混合的阳离子低聚物、聚合物或类脂质的量至少导致RNA负电荷的电荷中和，优选导致RNA负电荷的过度补偿。
阳离子低聚物、聚合物或类脂质和RNA之间的适当比例可容易通过凝胶阻滞分析、荧光淬灭方法如溴化乙锭位移/淬灭试验、颗粒尺寸调整和ζ电位测量确定。低聚物、聚合物或类脂质和RNA之间的可用比例通常通过如下表征：阳离子低聚物、聚合物或类脂质复合物包括的RNA在进行琼脂糖凝胶电泳时的至少部分阻滞，优选完全阻滞；染料如溴化乙锭、RiboGreen或YOYO在插入RNA时的高度荧光淬灭；或混合低聚物、聚合物或类脂质和RNA后的(纳米)颗粒形成。关于化学上充分限定的阳离子，计算的N/P比是适于选择和限定低聚物、聚合物或类脂质与RNA的相对比例的因子。N/P比表示本发明低聚物、聚合物或类脂质中的式(II)(或其优选实施方式)基团，式(III)(或其优选实施方式)基团或式(IV)(或其优选实施方式)结构中的可质子化氮原子与本发明组合物中的RNA的磷酸基团的摩尔比。N/P比是已确立的用于表征这种RNA与阳离子载体的复合物的参数，并且技术人员读者会理解，例如，酰胺键中的氮原子不算作可质子化氮原子。在阳离子低聚物或聚合物的情况下，N/P比可方便地例如根据下式计算
Figure BPA0000218995900000361
其中wp是低聚物或聚合物的重量，n是每个重复单元的可质子化氨基数量，Mwp是重复单元(包括反离子)的分子量，Wna是RNA的重量，并且M碱基是RNA中的核苷酸的平均分子量，在RNA情形下是346。在用于根据本发明的RNA递送的二元聚阳离子/RNA复合物中，应优选采用这样的低聚物、聚合物或类脂质相对于RNA的相对量：提供的N/P比导致最终二元组合物的正ζ电位。关于包括式(IV)类脂质和RNA的组合物，可考虑类脂质中的可质子化氮原子数量和组合物所用类脂质的摩尔数量方便地计算N/P比。在本发明的情况下，关于本发明的二元组合物，优选1至100的N/P比，更优选3至60的N/P比，和最优选4至44的N/P比。
根据本发明的组合物任选地包括脂质制剂的进一步组分。例如，包括式(IV)或其优选实施方式(包括式(IVa)至(IVc))类脂质的组合物包括进一步的脂质，如胆固醇、DOPE、DOPC或DSPC(其在科学文献中被称为辅助脂质)和/或PEG化脂质或可用于制备脂质复合物的任何其他脂质。在本发明情况下优选的辅助脂质是胆固醇、DOPE、DOPC和DSPC。在某些实施方式中，包含类脂质的组合物为约40-60％类脂质，约40-60％胆固醇，和约5-20％PEG-脂质(以重量百分比表示，基于组合物的总重量)。在某些实施方式中，包含类脂质的组合物为约50-60％类脂质，约40-50％胆固醇，和约5-10％PEG-脂质。在某些实施方式中，包含类脂质的组合物为约50-75％类脂质，约20-40％胆固醇，和约1-10％PEG-脂质。在某些实施方式中，包含类脂质的组合物为约60-70％类脂质，约25-35％胆固醇，和约5-10为PEG-脂质。可以本领域已知的任何方式提供组合物(例如，如下列描述：Akinc et al，2007，NatBiotech，26，561-569；Akinc et al，2009，Mol Ther，17，872-9；Love et al，2010，PNAS，107，1864-9；US 8,450,298，WO2006/138380)。RNA/类脂质复合物可形成颗粒，其可用于递送RNA，优选地，单链RNA，如mRNA，到细胞中。多种类脂质分子可与RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)分子联合。例如，复合物可包括1-100个类脂质分子、1-1,000个类脂质分子、10-1,000个类脂质分子、或100-10,000个类脂质分子。(m)RNA和类脂质的复合物可形成颗粒。颗粒直径范围可为例如10-1,200nm，更优选颗粒直径范围为10-500nm，最优选地选自20-150nm。
本发明组合物任选地包括在RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)递送到细胞和到细胞中的过程中发挥效应子功能的组分。这种组分可以是但不限于，上述聚阴离子、脂质、当前低聚物、聚合物或树枝状聚合物之外的聚阳离子，包括阳离子肽、遮蔽低聚物或聚合物、泊洛沙姆(也被称为普朗尼克)、泊洛沙胺、靶向配体、内含体分解剂、细胞渗透肽和信号肽、磁性和非磁性纳米颗粒、RNA酶抑制剂、荧光染料、放射性同位素或医学成像对比剂。术语“效应子功能”包括支持组合物的RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)在生物靶处或生物靶中或生物靶周围实现目标生物学效应的任何功能。例如，用于核酸递送的组合物已被配制以包括非编码核酸或非核酸聚阴离子作为填充材料(Kichler等，2005，J Gene Med，7，1459-1467)。这种填充材料适于减少具有目标生物学效应的核酸的剂量，同时保持在这种填充材料不存在时较高核酸剂量所获得的该效应的程度(extent或degree)。非核酸聚阴离子也已被用于获得在较低毒性下的延长的体内基因表达(Uchida等，2011，J Control Release，155，296-302)。本发明的组合物还可包括阳离子、阴离子或中性脂质，正如脂质多聚复合物情形(Li和Huang，“Nonviral Vectors for Gene Therapy”，Academic Press 1999，第13章，295-303)。脂质多聚复合物可有利地由本发明相应于式(II)和(III)的聚合物与本发明相应于式(IV)的类脂质制备。此外，本发明组合物可包括本发明的包括寡(氨基亚烷基)的阳离子低聚物、聚合物或类脂质之外的低聚阳离子或聚阳离子。这种额外的聚阳离子可有效用于实现核酸的期望的致密化程度，或在聚阳离子肽情况下可具有过往描述(Ritter等，2003，JMol Med，81、708-717)的核定位信号功能。遮蔽聚合物如聚(乙二醇)(PEG)也可被包括在本发明组合物内，并且经常被用于稳定化复合物和脂质复合物，防止在生物学环境(调理作用)中聚集和/或不期望的相互作用，例如与血清组分、血液细胞或胞外基质相互作用。遮蔽也可适于降低含核酸组合物的毒性(Finsinger等，2000，Gene Ther，7，1183-1192)。遮蔽聚合物如PEG可直接共价偶联至本发明的聚合物或类脂质。偶联可在聚合物骨架中实现，优选地，若可行，偶联至聚合物骨架或树枝状聚合物的末端。然而，也可实现与式(II)、(III)和(IV)的氨基的偶联。
聚乙烯基衍生物如PVP和泊洛沙姆已被发现在肌内注射后可用于增强转染(Mumper等，1996，Pharm Res，13，701-709，Lemieux等，2000，基因Ther，7，986-991)，因此可有效用于被包含在本发明组合物内。
核酸递送组合物中包括的包括抗体在内的靶向配体用于目标细胞的优先和提高转染(Philipp和Wagner，“Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms andStrategy”，第3版，第15章.CRC Press，Taylor&Francis Group LLC.，Boca Raton 2009)。靶向配体可以是赋予本发明组合物以直接或间接方式目标识别和/或目标结合功能的的任何化合物。在大多上位术语中，目标是靶向配体可通过分子相互作用特异性结合的特别生物学结构，并且其中这种结合最终导致组合物包括的核酸优先在目标组织中和/或在目标细胞处或目标细胞中积累。类似于PEG链，靶向配体可偶联至聚合物骨架或树枝状聚合物的末端。然而，也可实现与式(II)、(III)和(IV)基团的偶联。
此外，内含体分解剂如内含体分解肽(Plank等，1998，Adv Drug Deliv Rev，34，21-35)或任何其他适于增强内吞核酸的内含体释放的化合物是本发明组合物的有用组分。类似地，细胞渗透肽(在其他情形下也被称为蛋白质转导域)(Lindgren等，2000，TrendsPharmacol Sci，21、99-103)可以是本发明组合物的有用组分，从而介导核酸的胞内递送。所谓TAT肽属于此类，并且还具有核定位功能(Rudolph等，2003，J Biol Chem，278，11411-11418)。
本发明组合物可包括的磁性纳米颗粒可用于通过磁力物理靶向递送，和急剧增强核酸转移的效率，也被称为磁转染(Magnetofection)的一种机制(EP1297169；Plank等，2011，Adv Drug Deliv Rev，63，1300-1331)。类似地，本发明的组合物还可以是非磁性或磁性微泡，用于通过超声和任选地磁场应用物理强化和靶向核酸递送(Holzbach等，2010，JCell Mol Med，14，587-599；Vlaskou等，2010，Adv Funct Mater，20，3881-3894)。量子点(Zintchenko等，2009，Mol Ther，17，1849-1856)、放射性示踪物和医学成像对比剂可有利地用于追踪核酸递送和确定核酸递送组合物的生物分布。总之，很多核酸递送效应子已被描述，并且可以是包括核酸和根据本发明的低聚物或聚合物或树枝状聚合物的组合物中的有用组分。
本领域技术人员公知，关于根据本发明的组合物包括的各组分的物质量有高度弹性。例如，质粒DNA的所谓单分子二元聚复合物已被描述，其中组合物由在混合聚阳离子和质粒DNA后形成的、精确地包括一个质粒DNA分子和电荷中和或电荷过度补偿(正电荷超过负电荷)所需数量的聚阳离子分子的纳米颗粒组成(DeRouchey等，2006，J Phys ChemB.110(10)：4548-54)。关于常用于转染N/P比下的PEI-DNA复合物，通过荧光相关光谱发现，其在用于制备复合物的PEI分子中约86％是游离形式时平均包含3.5(+/-1)个DNA质粒分子和30个PEI分子(Clamme等，2003，Biophys J 84，1960-1968)。在其他极端情况下，发现聚集的PEI和质粒DNA复合物(推定包括大量(数十至数百)组分分子)在转染中比小型离散的PEI-DNA纳米颗粒表现更好(Ogris等，1998，Gene Ther，5，1425-1433；Ogris等，2001，AAPSPharmSci，3，E21)。因此，根据本发明的组合物可以是包括少量RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)分子的(纳米)颗粒，但也可以是包括大量RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)分子的宏观对象，如沉淀物或干燥粉末。总之，本发明的组合物的特征在于，其组分在自组装前的输入比。各个组分相对于RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)组分的一般输入w/w比在1和50之间。在低聚物或聚合物/树枝状聚合物或类脂质在化学上被充分限定时，N/P比是二元聚合物/树枝状聚合物或类脂质组合物的输入比的适当度量。如果本发明的组合物包括进一步组分，N/P比的分配可以是不确定的。在这种情况下，适当的输入比通过如下确定：实验——包括但不限于凝胶阻滞分析、荧光淬灭试验如溴化乙锭位移/淬灭试验、颗粒尺寸调整和ζ电位测量、和功能性试验如转染试验，如本文所述。在包括额外聚阴离子或遮蔽聚合物的三元复合物中，净电荷比(正电荷比负电荷e)可小于1，并且ζ电位可以是中性或负性的。
本发明的组合物可如下所述生成。在自组装过程后，可将本发明的组合物从任何未合并的组分分离，并在相同步骤中可通过离心或通过超滤或尺寸排阻色谱法或透析或任何相关方法更换悬浮介质。纯化的或未纯化的本发明的组合物的组分的化学计量可通过多种分析方法确定，包括光谱方法如UV/VIS光谱法或荧光相关光谱法(DeRouchey等，2006，JPhys Chem B。110(10)：4548-54)，通过各个组分的正交荧光或放射性同位素标记、通过组合物分解(disassembly)后的NMR和IR光谱法或色谱分析和定量。分解可例如通过如下实现：添加过量聚阴离子如肝素(如本文所述)或硫酸软骨素或通过添加十二烷基磺酸钠。
本发明还涉及生产本发明的组合物的方法。本发明的低聚物、聚合物或类脂质可如本文所述生产和纯化。低聚物、聚合物或类脂质可被储存在水溶液中或以干燥粉末储存，在这种情况下，其在生产组合物前被再溶解于含水介质中，优选水中。如需，溶液的pH用酸(优选用盐酸或柠檬酸)调节至中性或略酸性(降至pH 4.5)。在RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)是组合物包括的核酸的情况下，优选pH被调节至约4.5至5.5，优选约4.9至5.1，更优选约5.0。核酸按照本领域技术人员公知的现有技术生成和纯化。核酸作为含水介质(优选水)中的溶液被提供。任选地，低聚物、聚合物或类脂质、或核酸、或两者与效应分子如靶向配体、信号肽、细胞渗透肽、内含体分解物质或遮蔽聚合物化学连接。然而，根据效应分子的化学性质，其可无需通过化学键附接，而可基于非共价结合通过自组装(即，与组合物的任何其他组分的静电、疏水或范德华相互作用)被并入本发明的组合物。为此，调节各个组分溶液的离子强度、反离子类型、pH或有机溶剂含量可以是有利的。
有机溶剂可用于制备式(IV)类脂质的原液，并且可被需要用于进一步的水难溶性或水不溶性组分如脂质或疏水低聚物或聚合物的共组装。适当的有机溶剂是例如水混溶性溶剂，如乙醇和其他醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、或糖原质(glycofurol)和WO2013/045455描述的其他溶剂。在一个实施方式中，本发明的含类脂质组合物由类脂质、和溶解于这些溶剂中的任一种(优选地乙醇)的进一步组分如辅助脂质和溶解于含水介质(优选缓冲至酸性pH)的RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)制备。在第一步中，将溶解于有机相的组分以期望的化学计量比混合，并用选择的有机溶剂稀释至期望的最终体积。在含水介质中稀释相应于相对于类脂质的期望最终比的RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)量。优选地，含水介质的体积至少等于有机溶剂中的组分溶液组合的体积。优选地，包括RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)的水相的体积超过有机溶剂中的组分溶液组合的体积，最优选地，水相和有机相的v/v比为4∶1。在第二步中，包含类脂质的有机混合物被快速注入RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)水溶液，优选同时进行涡流。任选地，RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)和含类脂质组分的溶液在此步骤之前或之后被加热至上至70C。如需或期望，可在此时通过蒸发、透析、超滤、渗滤(diafiltration)或尺寸排阻色谱法去除有机溶剂，同时在相同步骤中可将分散介质与最终期望的缓冲组合物如PBS交换。任选地，可通过期望孔径的膜过滤器挤出组合物，以灭菌和/或获得单分散的制剂。
作为上述混合程序的替代方式，RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)和类脂质组分可通过下列混合：用于微混合的自动装置，如例如Hirota等(Hirota等，1999，Biotechniques，27，286-290)或Kasper等(Kasper等，2011，Eur J Pharm Biopharm，77，182-185)所述；或微流体聚集(microfluidic focussing)，如Xuan等(Xuan等，2010，Microfluidics andNanofluidics，9，1-16)评述。
获得根据本发明的含类脂质组合物的一个替代形式是通过脂质体或胶束(微胞，micelle)作为中间体。脂质复合物通常由作为水悬浮液中的胶束或脂质体的市售转染剂制备。本发明的类脂质可用于制备胶束或脂质体。很多制备胶束和脂质体的技术在本领域已知，并且任何方法可用于本发明的类脂质以制备胶束和脂质体。另外，胶束或脂质体中可包括包含RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)、小型分子、蛋白质、肽、金属、有机金属化合物等的任何试剂。在某些实施方式中，脂质体(脂质或类脂质囊泡)通过自发组装形成。在其他实施方式中，脂质体在薄脂质膜或脂质饼被水合并且脂质晶体双层堆叠体流动和溶胀时形成。水合的脂质层在搅动过程中拆分并且自我封闭，形成大型多层囊泡(LMV)。这防止水与边缘的双层烃核相互作用。在这些脂质体形成后，降低的颗粒尺寸可通过输入声能(声处理)或机械能(挤出)而改变(Szoka et al，1980，Ann Rev Biophys Bioeng，9，467-508)。脂质体制备涉及制备类脂质用于水合，通过搅动水合类脂质，和尺寸调整囊泡以实现脂质体均质分布。为此，将本发明组合物所要包括的脂质组分作为原液溶解在有机溶剂如氯仿中。然后将该组分以期望化学计量比混合，并通过在适当的容器如圆底烧瓶中旋转蒸发去除有机溶剂，在容器壁上产生脂质薄膜。优选地，将膜在高度真空下干燥。类脂质膜/饼的水合通过添加含水介质至干燥类脂质的容器和搅动混合物来实现。利用声能破坏LMV悬浮一般产生直径在15-50nm范围内的小型单层囊泡(SUV)。脂质挤出是迫使脂质悬浮液通过限定孔径的聚碳酸酯过滤器以产生直径接近所用过滤器孔径的颗粒的技术。通过100nm孔过滤器挤出一般产生120-140nm平均直径的大型单层囊泡(LUV)。某些类脂质可围绕特定分子如核酸(例如，DNA和mRNA)自发地自组装，以形成脂质体。在一些实施方式中，应用是递送RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)。这些类脂质的应用允许简单组装脂质体，而无需额外步骤或装置，如挤出器。
然后可通过在混合组分溶液后自组装来制备本发明的包括RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)的组合物。自组装可通过下列实现：手动混合——利用吸液(pipetting)和振动/涡流或利用微混合自动装置，如例如Hirota等(Hirota等，1999，Biotechniques，27，286-290)或Kasper等(Kasper等，2011，Eur J Pharm Biopharm，77，182-185)描述；或通过微流体聚集，如Xuan等(Xuan等，2010，Microfluidics and Nanofluidics，9，1-16)评述。如果本发明的组合物包括RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)和本发明低聚物、聚合物或类脂质之外的进一步组分，可需要相继混合。在这种情况下，任何进一步组分可在低聚物、聚合物或类脂质和RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)自组装后被添加，或其可被添加至混合前的任一种中。混合步骤的最适顺序将取决于额外组分的化学性质。例如，如果额外组分带负电，则下列可以是最适的：将其添加至与低聚物、聚合物或类脂质混合前的RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)组分，或添加至低聚物、聚合物或类脂质和RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)的预形成复合物——其中低聚物、聚合物或类脂质过量存在(在正电荷与(m)RNA和阴离子额外组分的负电荷总和之比方面)。反之亦然，如果额外组分是阳离子，则下列可以是最适的：将其添加至与(m)RNA混合前的低聚物、聚合物或类脂质。或者，其可以化学计量使用以部分中和(m)RNA的负电荷，然后与本发明的低聚物、聚合物或类脂质溶液混合。在(m)RNA包括磁转染复合物的情况下，已显示，盐致胶体聚集是制备包括(m)RNA、阳离子或阳离子脂质和磁性颗粒的组合物的适当手段(EP1297169)。在(m)RNA组分是阳离子寡核苷酸的特殊情况下，聚阴离子可用于自组装本发明的低聚物、聚合物或类脂质与(m)RNA。在这种情况下，将本发明的低聚物、聚合物或类脂质与阳离子寡核苷酸混，然后与聚阴离子混合。本领域技术人员公知，对于获得本发明的组合物，多种制剂选择是可利用的。各个组分的浓度根据本发明的组合物的目的用途来选择。相关参数是(m)RNA组分的最终浓度和上述组分比。关于细胞培养物中的(m)RNA递送，总体上优选1和100μg/ml之间的最终(m)RNA浓度。关于体内应用，可用的最终(m)RNA浓度可上至5mg/ml。
本发明的组合物可被储存在水悬浮液中，或可被干燥。因此，在一个优选实施方式中，本发明的组合物以干燥形式储存，任选地以冷冻干燥(冻干)形式。在更优选的实施方式中，干燥或冻干的复合物或组合物还包括冻干保护剂。冻干保护剂是保护(冷冻)干燥材料的分子。这种分子一般是聚羟基化合物如糖(单糖、二糖和多糖)、聚醇和其衍生物。海藻糖和蔗糖已知是干燥过程的天然保护剂。海藻糖由在干旱期间保持滞生状态(也被称为脱水生活)的各种植物、真菌和无脊椎动物生产。糖如海藻糖、乳糖、棉子糖(raffinose)、蔗糖、甘露糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、糊精、尿素、麦芽糊精、果聚糖、麦芽寡糖、甘露寡糖、cycloinulohexaose、羟乙基淀粉、葡聚糖、菊糖、聚乙烯基吡咯烷酮或氨基酸如色氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸是在本发明范围内特别适当的冻干保护剂。最优选地，将海藻糖用于此情形。
药物方面
在进一步方面，本发明涉及本发明的组合物或本发明的低聚物、聚合物或类脂质用于递送RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)至组织或到目标细胞中的应用。术语“递送RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)至细胞“优选地意为RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)转移到细胞中。所述应用可以在体内或体外。
本发明还涉及递送RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)至目标细胞或组织的方法，包括使根据本发明的组合物接触目标细胞或组织的步骤。这种方法可在体外或体内实施。接触可通过本领域技术人员已知的手段和方法实现。例如，如果方法在体外实施，接触可通过在培养基中存在组合物的情况下培养细胞，或通过添加组合物至细胞来实现。如果方法在体内实施，接触细胞或组织可例如通过如下实现：通过本领域技术人员已知的给药途径给予组合物至个体，具体地通过常用于遗传治疗领域的任何给药途径。配制组合物和将其给予个体的可能方式也在下文被进一步描述。
术语″体内″指代对活生物体产生的任何应用，其中所述生物优选是多细胞型，更优选是哺乳动物，最优选是人。术语“体外”指代对活生物体的分离部分并且在所述生物之外的部分(例如，细胞、组织和器官)产生的任何应用，其中所述生物优选是多细胞型，更优选是哺乳动物，最优选是人。
本发明还涉及药物组合物，其包括本发明的组合物或低聚物、聚合物或类脂质和任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂。术语“药物组合物”指代可给予对象的、本发明组合物的药学上可接受的形式。
术语″药学上可接受的形式″意为组合物被配制为药物组合物，其中所述药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体和/或稀释剂。适当的药物载体的实例在本领域公知，包括磷酸盐缓冲液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。包括这种载体的组合物可通过公知的常规方法来配制。这些药物组合物可以适当剂量被给予对象。剂量方案将通过主治医师和临床因素确定。如医学领域公知，用于任一个对象的剂量取决于多种因素，包括对象尺寸、身体表面积、年龄、所要给予的具体化合物、性别、给予时间和途径、总体健康状况、和同时给予的其他药物。活性物质的一般剂量可以例如在1ng至数克范围内。适用于(m)RNA治疗的用于表达或表达抑制的(m)RNA的剂量应相应于此范围；然而，此示例范围以下或以上的剂量也在设想之列，尤其在考虑上述因素的情况下。总体而言，作为定期给予药物组合物的方案应在每日每千克体重0,1μg至10mg单位范围内。如果方案是连续输注，其也应分别在每千克体重1μg至10mg单位范围内。可通过定期评估监测进程。剂量将变化，但静脉内给予(m)RNA作为本发明组合物的组分的优选剂量为(m)RNA分子的约106至1019个拷贝。
术语″给予″包括适于将组合物引入对象身体的任何方法。适当组合物的给予可以不同方式发生，例如，通过静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、经皮、鞘内、肌内、局部、皮内、鼻内、通过吸入或支气管内肺部、或口服或直肠给予。本发明的组合物可具体地作为基因活化基质被给予，如Shea等(Shea等，1999，Nat Biotechnol，17，551-554)和EP1198489描述。
原则上，本发明的药物组合物可被局部或全身给予。给予优选地是胃肠外式，例如，静脉内，尽管其他给予方式属于本发明的范围之内。直接给予至目标位点，例如，通过导管给予至血管中的位点，也是可能的。给予也可例如通过直接注入目标位点如肿瘤而进行。通过雾化或喷雾作用给予或口服给予也在本发明范围内。胃肠外给予制剂包括无菌含水或不含水的溶液、悬浮、和乳液。不含水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、碳氟化合物、植物油如橄榄油、和可注射有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/含水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格液、或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那些)及类似物。防腐剂和其他添加剂也可存在，如，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体及类似物。此外，根据药物组合物的目的用途，药物组合物可包括进一步的试剂，如白介素或干扰素。
在另一实施方式中，本发明涉及治疗方法，包括将本发明的药物组合物给予患者，从而使所述组合物包含的RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)产生预防或治疗作用。特别地，术语“患者”包括动物和人。
通过给予本发明的药物组合物，可治疗或预防疾病。术语“疾病”指代通过利用本发明的实施方式可治疗、预防或免疫化的任何可能的病例状况。在所述方法的优选实施方式中，所述疾病可以是先天性、获得性、感染性或非感染性、年龄相关性、心血管的、代谢性、肠的、肿瘤性(具体地，癌症)或遗传性的。疾病可基于例如生物体内的生理过程、分子过程、生物化学反应不正常，进而可例如基于生物体的遗传配备，基于行为、社会或环境因素如化学剂或辐射暴露。在特别优选的实施方式中，本发明的药物组合物用于治疗，如专利申请WO2010EP04681公开。
根据上述治疗方法，本发明在另一实施方式中涉及本发明的组合物对于制备治疗疾病的药物组合物的应用，该疾病可通过提供所述组合物包含的所述RNA(优选地，单链RNA，如mRNA)至患病患者体内的组织或器官来治疗。
为进一步示例，本发明的优选方面被总结为如下项，其构成前文一般公开的部分并且其中公开的优选实施方式也适用。
1-低聚物或聚合物，包括多个式(II)基团作为侧链和/或作为末端基团：
Figure BPA0000218995900000441
其中在多个这样的基团中，每个式(II)基团中的变量a、b、p、m、n和R2至R6独立地限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7，-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；和聚(乙二醇)链；
R6选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体，
并且其中式(II)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(II)的阳离子基团。
2.项1所述的低聚物或聚合物，其中，在式(II)中，p为1。
3.项1或2所述的低聚物或聚合物，其中，在式(II)中，n为1。
4.项1或2所述的低聚物或聚合物，其中，在式(II)中，m为1并且n为1。
5.项1至4中任一项所述的低聚物或聚合物，其中，在式(II)中，a为1并且b为2，或a为2并且b为1。
6.项1至5中任一项所述的低聚物或聚合物，其中，在式(II)中，R2至R5是氢。
7.项1至6中任一项所述的低聚物或聚合物，其中，在式(II)中，R6是氢。
8.项1至5中任一项所述的低聚物或聚合物，其是聚合物。
9.项8所述的聚合物，其中携带多个式(II)基团作为侧链和/或作为末端基团的聚合物骨架选自包括多个谷氨酸或天冬氨酸单元的聚(氨基酸)，如聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸)、蛋白质、聚炔、聚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚马来酸、聚磺酸酯、聚苯乙烯磺酸酯、聚磷酸酯、戊聚糖聚硫酸酯、聚(乙烯基磷酸)、聚(丁二烯-共-马来酸)、聚(丙烯酸乙酯-共-丙烯酸)、聚(乙烯-共-丙烯酸)、聚(乙烯-共-马来酸酐)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯磺酸-共-马来酸)、聚(氯乙烯-共-乙酸乙烯酯-共-马来酸)、碳水化合物如肝素、硫酸乙酰肝素、聚(葡萄糖醛酸)、聚(半乳糖醛酸)、透明质酸、聚(糖醛酸)——总体而言、或羧基封端的树枝状聚合物。
10.项9所述的聚合物，其选自包括多个谷氨酸或天冬氨酸单元的聚(氨基酸)、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸。
11.低聚物或聚合物，包括多个式(III)基团作为重复单元：
Figure BPA0000218995900000451
其中在多个这样的基团中，每个式(III)基团的变量a、b、p、m、n和R2至R5独立地限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7，
-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7或-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；-C(NH)-NH2；和聚(乙二醇)链；
并且其中式(III)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(III)的阳离子基团。
12.项11所述的低聚物或聚合物、其中，在式(III)中，p为1。
13.项11或12所述的低聚物或聚合物，其中，在式(III)中，n为1。
14.项11或12所述的低聚物或聚合物，其中，在式(III)中，m为1并且n为1。
15.项11至14中任一项所述的低聚物或聚合物，其中，在式(III)中，a为1并且b为2，或a为2并且b为1。
16.项11至15中任一项所述的低聚物或聚合物，其中，在式(III)中、R2至R5是氢。
17.项11至16中任一项所述的低聚物或聚合物，其是聚合物。
18.项17所述的聚合物，其是树枝状聚合物。
19.类脂质，其具有式(IV)的结构：
Figure BPA0000218995900000461
其中变量a、b、p、m、n和R1至R6限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R1至R6彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7，-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C16烷基或具有一个C-C双键的C3-C6烯基；氨基保护基团；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体；条件是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
并且其中式(IV)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(IV)的阳离子类脂质。
20.项19所述的类脂质，其中，在式(IV)中，p为1。
21.项19或20所述的类脂质，其中，在式(IV)中，n为1。
22.项19或20所述的类脂质，其中，在式(IV)中，m为1并且n为1。
23.项19至22中任一项所述的类脂质，其中，在式(IV)中，a为1并且b为2，或a为2并且b为1。
24.项19至22中任一项所述的类脂质，其中，在式(IV)中，R1至R6彼此独立地选自氢和基团-CH2-CH(OH)-R7、或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自C8-C16烷基或具有一个C-C双键的C8-C16烯基；条件是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7、或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自C8-C16烷基或具有一个C-C双键的C8-C16烯基。
25.组合物，包括mRNA和项1至18中任一项所述的低聚物或聚合物。
26.项25所述的组合物，其中所述低聚物或聚合物是阳离子低聚物或聚合物。
27.项25所述的组合物，包括所述mRNA和所述阳离子低聚物或聚合物的复合物。
28.组合物，包括mRNA和项19至24中任一项所述的类脂质。
29.项28所述的组合物，其中所述类脂质是阳离子类脂质。
30.项29所述的组合物，包括所述mRNA和所述阳离子类脂质的复合物。
31.项25至30中任一项所述的组合物，其是冻干形式。
32.项31所述的组合物，其进一步包括冻干保护剂。
33.项32所述的组合物，其中所述冻干保护剂是海藻糖。
34.药物组合物，包括项25至33中任一项所述的组合物。
35.项25至33中任一项所述的组合物用于递送mRNA到细胞中的应用。
36.项1至18中任一项所述的低聚物或聚合物或项19至24中任一项所述的类脂质用于递送mRNA到细胞中的应用。
37.递送mRNA至目标细胞或组织的方法，包括使项25至33中任一项所述的组合物接触目标细胞或组织的步骤。
附图描述：
图1：聚(丙烯酸)的低聚(亚烷基胺)侧链修饰类型对于mRNA对不同细胞类型的转染效率的影响。基于所示细胞类型利用具有侧链修饰(2-3-2)和(3-2-3)或对照基团(3-3-3)、(2-2-2)、(2-2)或(3-4-3)的聚(丙烯酸)(MW：8,000Da)和编码萤火虫荧光素酶的mRNA以4与44之间的N/P比形成聚复合物。24h后，将用不同量的RNA(500、250、125或62.5ng)转染的细胞裂解，并分析荧光素酶活性。
图2：用于确定(2-3-2)和(3-2-3)修饰的PAA8k的复合物形成能力的凝胶迁移试验。如所述以所示N/P比形成聚复合物。通过在琼脂糖凝胶中的迁移分析聚合物和mRNA的相互作用。相互作用越好，mRNA完全受阻迁移需要的聚合物量越低。
图3：用于确定(2-3-2)和(3-2-3)修饰的PAA8k的复合物形成能力的RiboGreen试验。如所述以所示N/P比形成聚复合物。通过添加RiboGreen分析聚合物和mRNA的相互作用。此分子与核酸相互作用，导致在高量mRNA下荧光信号增加。核酸与聚合物的相互作用越好，检测的荧光信号越低。信号表现为与包含等量游离mRNA的对照相比的相对荧光。
图4：不同的N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修饰的聚合物的转染效率。利用所示N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺修饰的聚合物(PAA8k：聚(丙烯酸)，MW 8,000Da；Glu9.8k：聚(谷氨酸)，MW 9,800Da；PMA9.5k：聚(甲基丙烯酸酯)，MW 9,500Da；Glu64k：聚(谷氨酸)，MW 64,000Da；GluLys：聚(谷氨酸)-聚(赖氨酸)-共-聚合物)(20,000-50,000Da)和编码萤火虫荧光素酶的mRNA以4与20之间的N/P比形成聚复合物。在24h后，将用不同量的mRNA(500、250、125或62.5ng)转染的细胞裂解，并分析荧光素酶活性。
图5：不同分子量的N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修饰的聚(丙烯酸)的转染效率。利用所示分子量的N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修饰型聚(丙烯酸)和编码萤火虫荧光素酶的mRNA以4与20之间的N/P比形成聚复合物。在24h后，将用不同量的mRNA(500、250、125或62.5ng)转染的细胞裂解，并分析荧光素酶活性。
图6：mRNA聚合物制剂的细胞毒性。利用由所示低聚(亚烷基胺)修饰的聚(丙烯酸)(MW 8,000Da，20,000Da和70,000Da)和编码萤火虫荧光素酶的mRNA以4与44之间的N/P比和不同量的mRNA构成的复合物进行转染。24h后，如所述的确定细胞活力。数据以与未转染细胞相比的存活者％显示。
图7：小鼠肺的报告蛋白表达水平。以所示N/P比混合PAA20k-(2-3-2)和编码萤火虫荧光素酶的mRNA的聚复合物，并通过气溶胶施用于小鼠。
图8：N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修饰的聚(丙烯酸)的物理化学性质。在体内条件下以N/P 10形成聚复合物。所用聚合物：聚(丙烯酸)，MW 20,000Da。
图9：PAA20k-(2-3-2)和mRNA的透射电镜图。以N/P 10混合聚复合物，并通过透射电镜进行分析。比例尺：100nm。所用聚合物：聚(丙烯酸)，MW 20,000Da。
图10：气溶胶施用聚复合物制剂后猪肺组织中的萤火虫荧光素酶表达。左图brPEIN/P10。右图PAA20k-(2-3-2)N/P 10。所用聚合物：聚(丙烯酸)，MW 20,000Da。
图11：海藻糖对冻干PAA20k-(2-3-2)复合物的能力的影响。如所述的形成复合物，并将其在存在或不存在1％海藻糖的情况下冻干。证实，海藻糖能够在冻干和再水合后保持这些复合物的mRNA转染效率。
图12：(2-3-2)和(3-2-3)修饰的聚合物对DNA转染效率的影响。利用具有所示侧链修饰的聚(丙烯酸)(MW：8,000Da)和编码萤火虫荧光素酶的pDNA(pCMVLuc)以4与20之间的N/P比形成聚复合物。在24h后，将用不同量的DNA(500、250、125或62-5ng)转染的细胞裂解，并分析荧光素酶活性。作为对照，将分支PEI(brPEI)25kDa用作转染剂。
图13：利用GL3-Luc-siRNA和N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修饰的聚(丙烯酸)的复合物进行的RNAi致基因沉默。利用所示N/P比和不同siRNA量的抗萤火虫荧光素酶siRNA的siRNA(siLuc)或对照siRNA(siGFP)和PAA20k-(2-3-2)复合物转染稳定地表达萤火虫荧光素酶的HeLa细胞。24h后分析荧光素酶表达，并将其显示为与未处理细胞相比的相对表达。
图14：用不同的类脂质/mRNA复合物转染NIH3T3细胞后的萤火虫荧光素酶活性。在mRNA和类脂质(基于(2-3-2)或对照低聚(亚烷基胺)(2-2-2)和(3-3-3))之间、以16的w/w比(类脂质重量/mRNA重量)形成复合物。
图15：聚(丙烯酸)的低聚(亚烷基胺)侧链修饰对DNA转染效率的影响。利用具有所示侧链修饰的聚(丙烯酸)(MW：8,000Da)和编码萤火虫荧光素酶的pDNA(pCMVLuc)以所示N/P比形成聚复合物。在24h后，将用不同量的DNA(500、250、125或62.5ng)转染的细胞裂解，并分析荧光素酶活性。与mRNA转染(参见图1)相比，低聚(亚烷基胺)侧链修饰不显著影响转染效率。
图16：静脉内注射类脂质制剂后鼠肝和脾中的萤火虫荧光素酶表达。左：与类脂质C12-(2-3-2)(C12-(2-3-2)∶DOPE∶胆固醇∶DSPE-PEG2k；3.6∶0.18∶0.76∶1重量比)一起在注射用PBS中配制的编码萤火虫荧光素酶的mRNA；右：与类脂质C12-(2-3-2)(C12-(2-3-2)∶DOPE∶胆固醇∶DSPE-PEG2k；3.6∶0.18∶0.76∶1重量比)一起在注射用水中配制的编码萤火虫荧光素酶的mRNA。仅PBS中的制剂导致在肝和脾中的表达(PBS：1.6404x10^5光子/s；水：检测不到)。
图17：静脉内注射类脂质制剂后鼠肝和脾中的萤火虫荧光素酶表达。A.体内生物发光图像：左：与类脂质C14-(2-3-2)(C14-(2-3-2)∶DOPE∶胆固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起在注射用PBS中配制的编码萤火虫荧光素酶的mRNA；中：与类脂质C16-(2-3-2)(C16-(2-3-2)∶DOPE∶胆固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起在注射用PBS中配制的编码萤火虫荧光素酶的mRNA；右：与类脂质C12-(2-3-2)(C12-(2-3-2)∶DOPE∶胆固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起在注射用PBS中配制的编码萤火虫荧光素酶的mRNA。B.体内生物发光信号定量。表达水平随烷基链长度C12-C16增加而降低。
图18：静脉内注射类脂质制剂后鼠肝和脾中的萤火虫荧光素酶表达。从图17所示治疗后的小鼠切除肝、脾、肾、胃、心脏、肺和脑，并成像荧光素酶表达。A.生物发光图像：左：与类脂质C12-(2-3-2)(C12-(2-3-2)∶DOPE∶胆固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起在注射用PBS中配制的编码萤火虫荧光素酶的mRNA；中：与类脂质C14-(2-3-2)(C14-(2-3-2)∶DOPE∶胆固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起在注射用PBS中配制的编码萤火虫荧光素酶的mRNA；右：与类脂质C16-(2-3-3)(C16-(2-3-2)∶DOPE∶胆固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起在注射用PBS中配制的编码萤火虫荧光素酶的mRNA。肝中的荧光素酶表达随类脂质烷烃链长度增加(C16＜C14＜C12)而减少，并且C16的荧光素酶表达几乎检测不到。C14的脾荧光素酶表达最高。在肺中观察到一些荧光素酶表达，但在心脏、肾、胃或脑中观察不到。B.来自A的生物发光信号的定量。
图19：不同转染剂对其递送pDNA和mRNA的能力的效率的比较。利用所示转染剂(根据相应专利WO 2011/154331的命名的结构：#46C-Stp3-C-K-OleA2；#454：C-Y3-Stp2-K(K-OleA2)-Stp2-Y3-C；#512：C-Sph3-K(Sph3-C)2)形成聚复合物。作为核酸有效负载(payload)，以所示N/P比使用编码萤火虫荧光素酶的mRNA或pDNA(pCMVLuc)。24h后，将用不同量的mRNA(500、250、125或63ng)转染的NIH3T3细胞裂解，并分析荧光素酶活性。
图20：用N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)或N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丁二胺(2-4-2)修饰的PAA8k的转染效率比较。利用N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)或N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丁二胺(2-4-2)修饰的PAA8k和编码萤火虫荧光素酶的mRNA以所示N/P比形成聚复合物。24h后，将用不同量的mRNA(500、250、125或63ng)转染的NIH3T3细胞裂解，并分析荧光素酶活性。
图21：脂质复合物的透射电镜图
如所述的形成类脂质/mRNA复合物，并通过透射电镜进行分析。上道：C10-(2-3-2)/DOPE/Chol/DPG-PEG，下道：C10-(2-3-2)/DPPC/Chol/DPG-PEG；左图概观比例(overviewscale)：100nm；右图：细化放大比例(detailed zoom scale)20nm。
图22：由1-溴癸烷合成的C10-(2-3-2)的转染效率
如在制备实施例VII下描述，利用1-溴癸烷合成C10-(2-3-2)。利用每孔500ng、250ng和125ng的剂量在NIH3T3细胞上测试转染效率。
图23：由N-十二烷基丙烯酰胺合成的C12-(2-3-2)的转染效率
如在制备实施例VIII下描述，利用N-十二烷基丙烯酰胺合成C12(2-3-2)。利用每孔500ng、250ng和125ng的剂量在NIH3T3细胞上测试转染效率。
图24：由十二烷基-丙烯酸脂合成的C12-(2-3-2)的转染效率
如在制备实施例IX下描述，利用十二烷基-丙烯酸脂合成C12-(2-3-2)。利用每孔500ng、250ng和125ng的剂量在NIH3T3细胞上测试转染效率。
图25：C12-(2-3-2)系类脂质制剂的转染效率。利用C12-(2-3-2)和DMG-PEG2k与DOPE或DSPC组合和编码萤火虫荧光素酶的mRNA以N/P 17或8生成类脂质制剂。
图26：C12修饰的低聚(烷基胺)(2-3-2)、(3-3-3)和(2-2-2)关于体内转染效率的比较。
图27：具有不同C12-烷基链饱和度和定位的C12-(2-3-2)变型的转染效率比较。A：不同C12-(2-3-2)变型的化学结构；B：用包括不同脂质的制剂转染NIH3T3细胞后的报告蛋白(萤火虫荧光素酶)表达水平。
图28：脂质复合物的冻干稳定性
如所述的形成类脂质制剂，对水透析，并与不同浓度的冻干保护剂(海藻糖(A、D)、蔗糖(B、E)和乳糖(C、F))混合。冷冻、冻干和再悬浮后，测量对NIH3T3细胞的转染效率(A-C)和水力直径(hydrodynamic diameter)(D-F)，并在相同条件下与新制脂质复合物进行比较。
图29：用包含C12-(2-3-2)的类脂质制剂转染后的离体样品中的mRNA表达。A：猪肌肉，所有样品已被处理；B：猪脂肪组织，所有样品已被处理；C：羊动脉；D：羊肌肉，上样品：已处理，下样品：非处理；E：羊肺，上样品：已处理，下样品：非处理。
图30：细胞裂解物关于ACE-2蛋白的蛋白印迹分析。左道：ACE-2mRNA处理的细胞的裂解物；右道：无mRNA(空白)的类脂质制剂处理的细胞的裂解物。上排：ACE-2染色；下排：GAPDH，加载对照。
图31：小鼠的鼠红细胞生成素表达。在静脉内给予包含mEPO mRNA的C12-(2-3-2)制剂后6h分析血液样品的mEPO。分析3种不同的RNA剂量(20μg、10μg或5μg)和对照组(PBS)。
图32：不同修饰的聚(烯丙基胺)(PALAM)的转染效率比较。利用由与PALAM-(2-3-2)、PALAM-(2-2-2)或PALAM-(3-3-3)复合的编码荧光素酶的mRNA构成的聚复合物转染NIH3T3细胞。
图33：不同修饰的聚丙烯亚胺(PPI)的转染效率比较。利用由与PPI-(2-3-2)、PPI-(2-2-2)或PPI-(3-3-3)复合的编码荧光素酶的mRNA构成的聚复合物转染NIH3T3细胞。
图34：皮下注射C12-(2-3-2)制剂后的荧光素酶表达。包含编码萤火虫荧光素酶的mRNA的C12-(2-3-2)/DOPE/胆固醇/DMG-PEG2k。
下列实施例用于示例本发明。
制备实施例I：
合成N，N’-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺修饰的聚(丙烯酸)，MW 8,000Da，PAA8k-(2-3-2)：
将10mg聚(丙烯酸)钠盐(MW：8,000Da，Sigma Aldrich)稀释在包含50mM MES，pH6.0的2mL反应缓冲液中。将1.69g N，N’-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(100eq./羧基基团，Sigma Aldrich)稀释在2mL相同缓冲液中。由于低聚(亚烷基胺)是作为游离碱购入的，通过滴加32％HCl将pH重新调节至pH 6.0。混合聚(丙烯酸)和低聚(亚烷基胺)溶液。为开始反应，添加每份羧基10倍摩尔数过量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，SigmaAldrich，稀释在2mL反应缓冲液中)。将最终体积调节至10mL。将混合物在高架振荡器上在RT下温育3h。通过透析纯化产物。为此，将反应混合物装入slide-a-lyzer透析盒(3-12mL，MWCO：3,500Da，Thermo Fisher)，并对水透析72h。每日换水两次。透析后，将纯化的聚合物冻干。
在相同条件下合成和测试下表1列举的聚合物：
Figure BPA0000218995900000531
制备实施例II：
通过固相支持肽合成来合成用于生成刷状聚合物的低聚(亚烷基胺)构建段：
I.合成三(Boc)保护的N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(EPE(Boc)3)。
将5gN，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(31.2mmol)溶解在100mL二氯甲烷(DCM)中，并冷却至0℃。将4.43g三氟乙酸乙酯(31.2mmol，leq./分子)稀释在100mL DCM中，并在4h时间内滴加至搅拌的溶液。添加后将溶液在RT下搅拌过夜。第二天，将19.46mL三乙基胺(14.2g，0.1404mol，1.5eq./游离胺)添加至反应混合物。30.64g二碳酸二叔丁酯(0.1404mol，1.5eq./胺)溶解在100mL DCM中，滴加至搅拌的溶液，并在恒定搅拌下在RT温育24h。反应后，将有机相浓缩至约100mL，并用5％NaHCO3洗涤3次和用水洗涤3次。将有机相在无水Na2SO4上干燥，过滤，并蒸发溶剂。将产物稀释在100mL甲醇和200mL 3M NaOH(20eq./分子)中，并在RT搅拌过夜。蒸发甲醇，并将水溶液用DCM洗涤3次。将有机相收集，在无水Na2SO4上干燥，过滤并蒸发。通过H1-NMR分析所得分子(EPE(Boc)3)。
II.合成Fmoc-谷氨酸修饰的boc化的N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(Fmoc-Glu(EPE(Boc)3-OH)。
将3.5gN-(9-芴基甲氧基羰基)-L-谷氨酸(Fmoc-Glu-OH，9.47mmol)与100mL乙酸酐混合，在回流和恒定搅拌下在油浴中加热至100℃，直到溶液澄清。使溶液在冰中冷却下来，并通过60℃的真空蒸发去除溶剂。将产物溶解在100mL四氢呋喃中。将5.24g EPE(Boc)3(11.37mmol，1.2eq./分子)稀释在100mL四氢呋喃中，与3.3mL N，N-二异丙基乙基胺(18.94mmol，2eq./分子)混合，并添加至含谷氨酸的溶液。将反应混合物在RT搅拌2h。在通过蒸发浓缩溶液后，将其稀释在DCM中，并用柠檬酸钠缓冲液(0.1M，pH 5.5)洗涤3次。在无水Na2SO4上干燥有机相后，通过快速干燥柱层析在二氧化硅柱上利用庚烷/乙酸乙酯(50/50至0/100)和乙酸乙酯/甲醇(100/0至80/20)的阶梯梯度纯化样品。合并在二氧化硅TLC上包含UV信号的部分，蒸发溶剂，并通过H1-NMR分析产物。
制备实施例III：
通过固相支持肽合成来合成用于生成线性和分支聚合物的低聚(亚烷基胺)构建段：
I.合成二(Boc)保护的N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(EPE(Boc)2)。
将5gN，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(31.2mmol)溶解在100mL二氯甲烷(DCM)中，并冷却至0℃。将8.86g三氟乙酸乙酯(62.4mmol，2eq./分子)稀释在100mL DCM中，并在4h时间内滴加至搅拌的溶液。添加后将溶液在RT下搅拌过夜。第二天，将13mL三乙基胺(9.47g，0.0936mol，1.5eq./游离胺)添加至反应混合物。将20.43g二碳酸二叔丁酯(0.0936mol，1.5eq./胺)溶解在100mL DCM中，滴加至搅拌的溶液，并在恒定搅拌下在RT温育24h。反应后，将有机相浓缩至约100mL，并用5％NaHCO3洗涤3次和用水洗涤3次。将有机相在无水Na2SO4上干燥，过滤，并蒸发溶剂。将产物稀释在100mL甲醇和200mL 3M NaOH(20eq./分子)中，并在RT搅拌过夜。蒸发甲醇，并将水溶液用DCM洗涤3次。将有机相收集，在无水Na2SO4上干燥，过滤并蒸发。通过H1-NMR分析所得分子(EPE(Boc)2)。
II.合成琥珀酰化的、fmoc-保护的、boc化的N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(Fmoc-EPE(Boc)2-OH)。
将3.0g(EPE(Boc)2)(8.3mmol)溶解在50mL四氢呋喃中，并冷却至0℃。将0.996g琥珀酸酐(10mmol，1.2eq./分子)溶解在200mL四氢呋喃中，并滴加至搅拌的溶液。添加后，使反应在RT再搅拌1小时。添加4.34mL N，N-二异丙基乙基胺(33.2mmol，4eq./分子)。然后将溶解在乙腈/四氢呋喃中的4.2g Fmoc N-羟基琥珀酰亚胺酯(12.45mmol，1.5eq./分子)滴加至反应混合物。将溶液搅拌过夜。将反应混合物浓缩至约100ml，与100ml二氯甲烷混合，并用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 5.2)洗涤5次。将有机相干燥，浓缩，并通过快速干燥柱层析在二氧化硅柱上利用从正庚烷与乙酸乙酯(100/0-0/100)和进一步至乙酸乙酯与甲醇(100/0-80/20)的阶梯梯度纯化所得产物。合并在二氧化硅TLC上包含UV信号的部分，蒸发溶剂，并通过H1-NMR分析产物。
制备实施例IV：
基于N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺的类脂质的合成
将100mg N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623mmol)与575.07mg 1，2-环氧十二烷(3.12mmol，(N-1)eq.，其中N是每份低聚(亚烷基胺)的伯胺的2倍量+仲胺的1倍量)混合，并在恒定振荡下在80℃混合96h。反应后，将所得类脂质以100μg/mL的浓度稀释在25mM乙酸钠缓冲液(ph 5)中，用于转染。
在相同条件下合成表2列举的类脂质：
Figure BPA0000218995900000561
制备实施例V：
合成N，N’-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺修饰的聚(烯丙基胺)；(PALAM-(2-3-2))
将500mg聚(烯丙基胺)-溶液(Sigma-Aldrich，20％w/w，分子量：17,000Da)稀释在包含50mM MES，pH 6.0的2mL反应缓冲液中。将10.33g琥珀酸(50eq./胺，Sigma-Aldrich)稀释在5mL相同反应缓冲液中。合并溶液，并将pH重新调节至6.0。为开始反应，添加稀释在5mL反应缓冲液中的3.36g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，10eq./胺，SigmaAldrich)。将混合物在高架振荡器上在RT下温育3h。通过透析纯化产物。为此，将反应混合物装入slide-a-lyzer透析盒(3-12mL，MWCO：10,000Da，Thermo Fisher)，并对水透析72h。每日换水两次。透析后，将纯化的聚合物冻干。
将5mg冻干的、琥珀酸修饰的聚(烯丙基胺)稀释在包含50mM MES，pH 6.0的2mL反应缓冲液中。将510.38mg N，N’-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(100eq./羧基1基团，SigmaAldrich)稀释在2mL相同缓冲液中。由于低聚(亚烷基胺)是作为游离碱购入的，通过滴加32％HCl将pH重新调节至pH 6.0。混合聚(烯丙基胺)和低聚(亚烷基胺)溶液。为开始反应，添加每份羧基10倍摩尔数过量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，SigmaAldrich，稀释在4mL反应缓冲液中)。将最终体积调节至10mL。将混合物在高架振荡器上在RT下温育3h。通过透析纯化产物。为此，将反应混合物装入slide-a-lyzer透析盒(3-12mL，MWCO：3,500Da，Thermo Fisher)，并对水透析72h。每日换水两次。透析后，将纯化的聚合物冻干。
在相同条件下合成和测试下表3列举的聚合物：
Figure BPA0000218995900000581
制备实施例VI：
合成N，N’-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺修饰的聚亚丙基亚胺(PPI-(2-3-2))
将100mg聚亚丙基亚胺十六烷胺树枝状聚合物(PPI，3.0代，Sigma Aldrich)溶解在包含50mM MES，pH 6.0的1.5mL反应缓冲液中。将11.2g琥珀酸(100eq./伯胺，Sigma-Aldrich)溶解在30mL相同反应缓冲液中。合并溶液，并将pH重新调节至6.0。为开始反应，添加稀释在2mL反应缓冲液中的1.81g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，10eq./伯胺，Sigma Aldrich)。将混合物在高架振荡器上在RT温育过夜。通过透析纯化产物。为此，将反应混合物装入slide-a-lyzer透析盒(3-12mL，MWCO：2,000Da，Thermo Fisher)，并对水透析72h。每日换水两次。透析后，将纯化的聚合物冻干。
将10mg冻干的、琥珀酸修饰的PPI稀释在包含50mM MES，pH 6.0的2mL反应缓冲液中。将0.776g N，N’-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(100eq./羧基1基团，Sigma Aldrich)稀释在2mL相同缓冲液中。由于低聚(亚烷基胺)是作为游离碱购入的，通过滴加32％HCI将pH重新调节至pH 6.0。混合聚亚丙基亚胺和低聚(亚烷基胺)溶液。为开始反应，添加每份羧基10倍摩尔数过量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，Sigma Aldrich，稀释在4mL反应缓冲液中)。将最终体积调节至10mL。将混合物在高架振荡器上在RT培育5h。通过透析纯化产物。为此，将反应混合物装入slide-a-lyzer透析盒(3-12mL，MWCO：3,500Da，Thermo Fisher)，并对水透析72h。每日换水两次。透析后，将纯化的聚合物冻干。
在相同条件下合成和测试下表4列举的聚合物：
Figure BPA0000218995900000601
制备实施例VII：
合成基于N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺和1-溴癸烷的类脂质
将100mg N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623μmol)与10mL四氢呋喃(THF)、815.2μL N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)和690.1mg 1-溴癸烷(3.12μmol，(N-1)eq.，其中N是每份低聚(亚烷基胺)的伯胺的2倍量+仲胺的1倍量)混合，并在恒定振荡下在室温混合22h。使产物在冷正己烷中析出两次，并溶解于DCM中。通过60℃蒸发去除溶剂。将所得类脂质以50mg/mL的浓度稀释在乙醇中，并在4℃下储存。
制备实施例VIII：
合成基于N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺和N-十二烷基丙烯酰胺的类脂质
将100mg N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623μmol)与746.9mg N-十二烷基丙烯酰胺(3.12μmol，(N-1)eq.，其中N是每份低聚(亚烷基胺)的伯胺的2倍量+仲胺的1倍量)混合，并在恒定振荡下在90℃混合192h。将所得类脂质以50mg/mL的浓度稀释在乙醇中，并在4℃下储存。
制备实施例IX-
合成基于N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺和十二烷基丙烯酸脂的类脂质
将100mg N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623μmol)与750mg十二烷基丙烯酸脂(3.12μmol，(N-1)eq.，其中N是每份低聚(亚烷基胺)的伯胺的2倍量+仲胺的1倍量)混合，并在恒定振荡下在90℃混合22h。将所得类脂质以50mg/mL的浓度稀释在乙醇中，并在4℃下储存。
制备实施例X：
合成基于N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺和1，2-环氧十二烷的类脂质
将100mg N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623mmol)与575.07mg 1，2-环氧十二烷(3.12mmol，(N-1)eq.，其中N是每份低聚(亚烷基胺)的伯胺的2倍量+仲胺的1倍量)混合，并在恒定振荡下在80℃混合96h。将所得类脂质以50mg/mL的浓度稀释在乙醇中，并在4℃下储存。
实施例1
测试阳离子聚合物其运输mRNA到不同细胞系中的能力。
材料和方法
聚复合物形成：
关于体外转染，在44μL体积中形成聚复合物。将包含1100ng编码萤火虫荧光素酶的mRNA(分别包括25％的5-甲基胞苷和2-硫代尿苷的化学修饰mRNA)的22μL注射用水与包含期望量的聚合物的22μL注射用水混合。聚合物与RNA的比被限定为每个核酸磷酸基的聚合物氮(N/P)，并且利用恒定量的核酸进行测试。混合核酸与聚合物后，将样品在RT温育30min，用于转染。
聚复合物的体外转染：
已在2种不同的细胞系(NIH3T3和A549)上测试聚合物的转染效率。在处理前24h，将100μL介质中的5,000个细胞(NIH3T3)或7,000个细胞(A549)接种到96孔板的孔中。在转染当天，如所述的形成聚复合物。为测试不同的mRNA量，进行连续稀释，混合50％的聚复合物溶液与等量介质(不含FCS)，取该溶液以再进行相似的稀释步骤等，直到达到62.5ng/20μL的最终浓度。将每个稀释步骤的20μL添加至细胞，其中无介质更换。在转染后24h去除介质。通过添加100μl裂解缓冲液(25mM Tris HCl，0.1％曲拉通X 100，pH 7.8)和在RT温育20min来裂解细胞。将80μL裂解物装入白色96孔板的孔中，并在Wallac Victor2(PerkinElmer)中用于荧光素酶活性测量。为此，添加100μL荧光素酶试验试剂(0.5mM D-荧光素、0.3mM辅酶A、33mM DTT、0.5mM ATP、1mM碳酸镁、2.7mM硫酸镁、0.1mM EDTA、20mMN-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine))，并确定化学发光。实验进行三次。
结果
如图1所示，不同修饰的聚合物之间荧光素酶的表达水平极端变化。对所有细胞类型最有效的转染水平可利用PAA8k-(2-3-2)或PAA8k-(3-2-3)实现，相比之下，包含低聚(亚烷基胺)侧链——烷基链中的一个被替换(2-2-2)和(3-3-3))或去除(2-2)——的修饰聚合物的效率急剧下降10-1000倍。低聚(亚烷基胺)(3-4-3)中所有烷基链的延长也使效率降低100倍。
实施例2
(2-3-2)和(3-2-3)修饰的PAA8k的复合物形成和mRNA结合能力。
材料和方法
凝胶迁移试验：
如实施例1所述，以N/P 1、2、4、8和12形成聚复合物。温育后，将5μL样品与5μL2×RNA加载染料(Fermentas)混合，在70℃温育10min，并加载到包含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上。使凝胶迁移在150V下在TBE-缓冲液中进行30min。通过260nm下的UV吸收，可视化迁移的核酸。
RiboGreen试验：
如实施例1所述，以N/P 1、2、4、8和12形成聚复合物。温育后，将2μL样品与148μL水和50μL RiboGreen溶液(1∶200，QuantiT RiboGreen RNA试验试剂盒，Invitrogen)在白色96孔板中混合。将样品在避光下在RT温育5min，并利用Wallac Victor2(Perkin Elmer，1s，Ex.：485nm，Em.：535nm)测量荧光。
结果
聚合物与核酸相互作用以形成稳定复合物的能力是有效运输系统的关键特征。通过凝胶迁移(图2)和RiboGreen试验(图3)分析修饰聚合物与mRNA的相互作用。当聚合物能够与核酸相互作用形成稳定的复合物时，这造成纳米尺寸颗粒和电荷反转(chargeinversion)。两效果均导致琼脂糖凝胶电泳过程中迁移能力受阻。如图2所示，与无聚合物(N/P 0)的对照相比，(2-3-2)或(3-2-3)修饰的PAA8k导致游离mRNA不存在/显著减少，表明强烈相互作用。这种结合同使用黄金标准分支PEI(brPEI)一样有效。
这些数据可利用RiboGreen试验证实。在此试验中，结合效率增加导致荧光信号减少。如图3所示，PAA8k-(2-3-2)和-(3-2-3)的荧光信号减少如brPEI。因此，生成了稳定性相似的复合物。
实施例3
转染效率与聚合物骨架无关。
材料和方法
按照实施例1进行聚复合物形成。
聚复合物的体外转染
关于聚复合物的体外转染和效率测试，使用NIH3T3细胞。在处理前24h，将包含10％FCS的100μL介质中的5,000个细胞接种于96孔板的孔中。在转染当天，将介质与100μL无FCS的介质交换。如所述形成聚复合物。为测试不同的mRNA量，将20μL(500ng)、10μL(250ng)、5μL(125ng)和2.5μL(62.5ng)添加至介质。在37℃和5％CO2下温育4h后，将介质更换成包含10％FCS的新制介质。在转染后24h，去除介质。将细胞裂解，并如实施例1所述进行分析。
结果
为确认利用(2-3-2)修饰的聚合物运输核酸到细胞中的能力与骨架结构无关，在所述条件(表1)下用(2-3-2)修饰不同类型的聚合物(除实施例1的聚(丙烯酸)，8,000Da外)。结果显示，在用低聚(亚烷基胺)(2-3-2)修饰时，不同类型的骨架聚合物(图4)以及不同的链长度(图5)导致显著报告基因表达。
实施例4
验证不同类型的低聚(亚烷基胺)修饰的聚合物的细胞毒性。
材料和方法
按照实施例3进行转染。活细胞的确定利用TACS MTT细胞增殖试验(Trevigen)进行。在转染后24小时，将介质与100μl新制介质交换。添加10μl MTT试剂后，将细胞在37℃和5％CO2下温育4h。添加100μl洗涤剂，然后进行RT温育步骤过夜。利用Wallac Victor2(Perkin Elmer)通过570nm的吸收测量进行读取。结果表示为，与未处理对照相比的活细胞％。
结果
如图6所示，不同修饰的聚合物在细胞毒性方面不同。虽然用包含(2-3-2)和(3-2-3)修饰的聚(丙烯酸)(PAA8k-(2-3-2)、PAA8k-(3-2-3)、PAA20k-(2-3-2)、PAA70k-(2-3-2))的复合物处理细胞显示约100％左右的活力，但侧链类型的其他选择造成与毒性标准(brPEI)相当的强毒性(PAA8k-(3-4-3)、PAA8k-(3-3-3))。
实施例5
小鼠中的信使RNA运输效率
材料和方法
动物：
由Janvier，Route Des
Figure BPA0000218995900000641
SecsBP5，F-53940Le Genest St.Isle，法国获得6至8周龄的雌性BALB/c小鼠，并将其供养在特定无病原条件下。小鼠在实验前适应动物设备环境至少7天。所有动物程序均被地方伦理委员会批准和控制，并且按照德国动物生命保护法的指导实施。
聚复合物形成：
聚复合物配制如下：将mRNA和PAA20k-(2-3-2)稀释在4.0ml双蒸水中，产生浓度500μg/ml的mRNA和相应于N/P 10、20、30或40的浓度的PAA20k-(2-3-2)。将mRNA溶液移液至聚合物溶液，通过上下吸液混合，产生最终mRNA浓度250μg/ml。使用前将复合物在环境温度下温育20min。
气溶胶装置设计：
关于整体装置中的喷雾程序，将小鼠置于9.8×13.2×21.5cm塑料箱中，该塑料箱可用盖密封。在箱子的一个窄侧布置4个小孔作为气溶胶流出口。通过处于对面窄侧的孔，将箱子经由2.1cm直径连接件连接至15.4cm宽×41.5cm长的塑料圆筒。圆筒底部均匀地覆盖有150g二氧化硅凝胶(1-3mm，#85330；Fluka，瑞士)，用于干燥连接至圆筒另一端的喷射雾化器(PARI
Figure BPA0000218995900000651
LC plus，PARI GmbH)产生的气溶胶。(细节被述及于Rudolph等，JGene Med。2005，7：59-66)。
利用体内生物发光成像测量小鼠肺中的Luc活性：
在给药后24小时，通过颈脱位法对小鼠实施安乐死。在通过正中切口打开腹膜后，将肺从动物解剖，并用PBS灌注。将肺在液氮中快速冷冻，并在冷冻状态下均质化。添加400ul裂解缓冲液(250mM Tris pH 7.8，0.1％曲拉通X-100，Roche全蛋白酶抑制剂混合片剂)和冰上温育20min后，利用Lumat LB9507管发光计(EG&G Berthold，Munich，德国)测量上清液中的荧光素酶活性。
结果
实验显示，mRNA与PAA20k-(2-3-2)组合在肺部气溶胶递送后在小鼠肺细胞中有效表达，表明聚合物能够在体内有效运输mRNA到肺细胞中(cf.图7)。
实施例6
猪中的信使RNA运输效率
材料和方法
聚复合物形成：
关于体内转染，在28mL体积中形成聚复合物。制备包含5.83mg编码萤火虫荧光素酶的mRNA和1.17mg编码β-半乳糖苷酶的mRNA的14mL注射用水和包含期望量的聚合物的14mL注射用水，并将其通过双通道注射泵(KDS-210-CE；KD Scientifc)混合。通过装置的吸取功能充填2个20mL注射器。经由T型件(Discofix C 3SC，B.Braun)连接注射器和利用混合装置的输注功能，进行混合。聚合物与mRNA的比限定为每个核酸磷酸基团的聚合物氮(N/P)，并以N/P 10测试。在混合核酸与聚合物后，将样品在RT温育30min，并将24mL用于喷雾。剩余体积用于物理化学分析。利用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)确定纯样品的颗粒尺寸和ζ电位。
对猪施用气溶胶的实验程序：
通过预先用药阿扎哌隆(azaperone)2mg/kg体重、克他命(ketamine)15mg/kg体重、阿托品(atropine)0.1mg/kg体重启动猪的睡眠，然后将静脉内管线插至侧耳廓静脉。通过按需静脉内注射丙泊酚(propofol)3-5mg/kg体重，将猪麻醉。通过按需持续静脉内输注1％丙泊酚维持麻醉。使通风参数匹配呼气末的二氧化碳，并且如需对其进行调节。利用脉搏血氧测定法(pulse oximetry)、二氧化碳描记术(capnography)、直肠温度探针和映像状态(reflex status)连续监测麻醉、呼吸和心血管参数。猪接受10ml/kg/h输注平衡电解质溶液。麻醉持续时间为约80-120min。在气溶胶施用完成(Aeroneb网孔式雾化器)后的睡眠后，通过经由侧耳静脉弹丸注射戊巴比妥(pentobarbital)100mg/kg体重，将猪处死。将肺切除，并收集来自不同肺区域的切片后的约1em厚组织样本，然后在培养箱中37℃和5％CO2下的细胞培养基中温育24h。关于荧光素酶活性的测量，将组织样本在包括PBS中的D-荧光素底物(100μg/ml)的介质浴中在37℃下温育30min，并进行离体荧光素酶生物发光成像(IVIS 100，Xenogen，Alameda，USA)。
聚复合物的透射电镜：
关于透射电镜(TEM)，使用一滴制备用于气溶胶施用的混合物。将液滴置于栅格(Plano GmbH，Wetzlar)上。温育5min后，利用滤纸去除液滴。将样品用乙酸铀酰(uranylacetate)溶液染色，并通过透射电镜进行分析(Jem 1011，Jeol)。
结果
如图8所示，N/P比为10的PAA20k-(2-3-2)和mRNA产生复合物，其复合物水力直径在100nm以下并且表面电荷(ζ电位)为40mV。两参数范围与已显示在体内有效运输核酸到细胞中的brPEI系复合物大小相同。在通过TEM分析时，颗粒显示圆形和均匀尺寸(图9)。如图10所示，在气溶胶施用后，这些颗粒能够有效递送mRNA(编码萤火虫荧光素酶)到肺组织中，造成目标蛋白质表达。表达水平与黄金标准brPEI形成的聚复合物的喷雾相当。
实施例7
复合物的冻干稳定性
材料和方法
制备样品
在4个不同的小瓶中以N/P 20在1mL体积中，如实施例1所述，形成PAA20k-(2-3-2)/mRNA(编码metridia荧光素酶)复合物。一个小瓶不经进一步处理用于转染，第二个小瓶中添加100μL 11％海藻糖溶液，造成1％海藻糖的最终体积。第三个小瓶冻干，并在1mL水中再水合。第四个小瓶用100μl 11％海藻糖处理，然后冻干并也在1mL水中再水合。
转染：
在转染前24h，将100μL介质中的5,000个NIH3T3细胞接种于96孔板，并在37℃和5％CO2下温育。在转染当天，将介质换成100μL无FCS的新制介质。将20、10、5和2.5μL的每种复合物溶液添加至细胞，一式三份，导致500、250、125和62.5ng的转染。在转染后24h将介质去除，收集，并换成新制介质。在48h和72h后重复此操作。分析收集的介质的metridia荧光素酶活性。为此，将50μL介质装入白色96孔板，与20μL腔肠素(coelenterazine)溶液(50m磷酸钠缓冲液中50μM腔肠素)混合，并利用Wallac Victor2(Perkin Elmer)测量化学发光信号。
结果
如图11所示，新制复合物在24h后导致methridia荧光素酶表达。表达另外保持稳定24h，然后缓慢减少。此效果不因海藻糖的添加受到消极影响，但导致表达水平略微增加。在冻干后，未处理的复合物不能转染细胞，导致报告蛋白表达不存在。相比之下，海藻糖的添加保持复合物和产生的转染效率。
实施例8
PAA8k-(2-3-2)和PAA8k-(3-2-3)用作质粒DNA的运输系统。
材料和方法
聚复合物形成：
利用编码萤火虫荧光素酶的质粒DNA(pCMVLuc，质粒工厂)代替mRNA，如实施例1所述，形成聚复合物。
利用聚复合物的体外转染：
转染实验如实施例3所述进行。
结果
在此实验中，与黄金标准分支PEI(brPEI，图12)比较，分析N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修饰的聚合物(聚(丙烯酸))在DNA运输和导致的蛋白质表达方面的效率。结果清楚显示，由pDNA和低聚(亚烷基胺)(2-3-2)和(3-2-3)修饰的聚合物构成的复合物转染NIH3T3细胞导致报告蛋白表达显著增加。表达水平甚至同黄金标准一样较高。
实施例9
PAA20k-(2-3-2)用作siRNA运输系统以诱导RNA干扰。
材料和方法
利用GL3-Luc siRNA(Qiagen)，如实施例1所述，形成复合物。关于siRNA量的滴定，在RT下30min温育后阶梯稀释复合物。为此，将22μL复合物溶液与22μl无FCS介质混合。将22μL此稀释液再与22μL无FCS介质混合。重复此连续稀释，直到实现每20μL7.Sng的siRNA浓度。利用稳定表达萤火虫荧光素酶的HeLa细胞(HeLa-Luc)，将每个稀释步骤的20μL如实施例1描述用于转染。作为基于RNA干扰的荧光素酶表达下调的特异性的对照，将不影响细胞表达的对照siRNA(GFP22-siRNA；Qiagen)在相同条件下用于转染。结果显示为与未处理对照细胞相比的相对荧光素酶表达。
结果
如图13所示，GL3-Luc-siRNA(siLuc)和PAA20k-(2-3-2)的复合物导致荧光素酶表达下调。这个效果与剂量相关(在较低siRNA量下效果降低)，并且有特异性(对非指定siRNA(siGFP)无效)。在较高N/P比下，可观察到另外的非特异性效果，如siGFP处理的细胞的信号减少所示。
实施例10
基于低聚(亚烷基胺)(2-3-2)的类脂质结构的有益mRNA运输效率
材料和方法
类脂质/mRNA复合物形成
如制备实施例IV所述，合成并稀释类脂质。关于转染，将50μL水中250ng编码萤火虫荧光素酶的mRNA在优化条件下与50μL水中的4,000ng类脂质混合，导致w/w比(类脂质重量/mRNA重量)为16。在RT下温育30min后，将样品用于转染。
利用类脂质/mRNA复合物的体外转染
在处理前24h，将100μL介质中的5,000个NIH3T3细胞接种于96孔板的孔中。在转染当天，如所述的形成聚复合物。为测试不同的mRNA量，进行连续稀释，混合50％的复合物溶液与等量介质(无FCS)，取该溶液以实施相似的稀释步骤，等等，直到达到最终浓度15.6ng/50μL。在转染前，将介质从细胞去除，并更换成100μL无FCS介质。将每个稀释步骤的50μL添加至细胞，并在37℃和5％CO2下温育4h。然后，将介质再次更换为包含10％FCS的新制介质。在转染后24h去除介质。将细胞裂解，并如实施例1所述分析裂解物的报告蛋白活性。
结果
如图14所示，基于结构(2-3-2)的类脂质导致萤火虫荧光素酶的表达水平高于基于(2-2-2)或(3-3-3)的相似结构。此效果可被证实与附接的烷基链(C12或C14)无关。由于萤火虫荧光素酶的活性与其在细胞中的表达水平相关，因而与mRNA运输到细胞中的效率相关，这些结果证明，基于(2-3-2)的类脂质在体外更有效地运输mRNA到细胞中。
实施例11
静脉内给予后在小鼠中类脂质制剂的信使RNA运输效率
材料和方法
动物：
由Janvier，Route Des
Figure BPA0000218995900000691
SecsBP5，F-53940Le Genest St.Isle，法国获得6至8周龄的雌性BALB/c小鼠，并将其供养在特定无病原条件下。小鼠在实验前适应动物设备环境至少7天。所有动物程序均被地方伦理委员会批准和控制，并且按照德国动物生命保护法的指导实施。
类脂质制剂：
类脂质与mRNA一起配制如下：将C12-(2-3-2)、DOPE、Chol和DSPE-PEG2k(3.6∶0.18∶0.76∶1重量比)溶解在乙醇中，并以10.5的脂质/mRNA重量比快速注入包括化学修饰的编码萤火虫荧光素酶的mRNA的柠檬酸盐缓冲溶液(10mM柠檬酸，150mM NaCl，pH＝4.5)，产生20％的最终乙醇浓度，并对水透析。所得类脂质/mRNA复合物产生带正电的纳米颗粒(92.6±0.7nm；21.0±0.2mV)，并将其静脉内注入被控制的小鼠的尾静脉。在第二实验中，在静脉内注射前将类脂质/mRNA复合物调节至PBS，产生几乎不带电的纳米颗粒(91.5±0.6nm；-0.7±0.2mV)。
利用体内生物发光成像测量小鼠内的Luc活性：
在给药后24小时，通过腹膜内注射美托咪定(medetomidine)(11.5μg/kg BW)、咪唑安定(midazolame)(115μg/kg BW)和芬太尼(fentanyl)(1.15μg/kg BW)麻醉小鼠。通过腹膜内注射施加D-荧光素底物(3mg/100μl PBS per mouse)。10分钟后测量生物发光——利用IVIS 100成像系统(Xenogen，Alameda，USA)和摄像机设置：Bin(HS)，视场10，f1光圈数(f-stop)，高分辨率面元划分(binning)和5min曝光时间。利用直播图像软件版本(LivingImage Software version)2.50(Xenogen，Alameda，USA)定量和分析信号。
结果
实验显示，mRNA在小鼠腹部区域中有效表达——仅在类脂质/mRNA复合物在携带几乎中性电荷的PBS中配制时，但非在水中配制时(cf.图16)。
实施例12
静脉内给予后小鼠中类脂质制剂的信使RNA至不同器官的运输效率
材料和方法
动物：
由Janvier，Route Des
Figure BPA0000218995900000702
SecsBP5，F-53940Le Genest St.Isle，法国获得6至8周龄的雌性BALB/c小鼠，并将其供养在特定无病原条件下。小鼠在实验前适应动物设备环境至少7天。所有动物程序均被地方伦理委员会批准和控制，并且按照德国动物生命保护法的指导实施。
类脂质制剂：
类脂质与mRNA一起配制如下：将类脂质、DOPE、Chol和DMPE-PEG2k(8∶6∶5∶1摩尔比)溶解在乙醇中，并以15的N/P比快速注入包括化学修饰的编码萤火虫荧光素酶的mRNA的柠檬酸盐缓冲(10mM柠檬酸，150mM NaCl，pH＝4.5)溶液中，产生20％的最终乙醇浓度，并对水透析。所得类脂质/mRNA复合物产生带正电的纳米颗粒。在静脉内注射前将类脂质/mRNA复合物调节至PBS，产生几乎不带电的纳米颗粒(参见表5)。
表5
Figure BPA0000218995900000701
利用体内生物发光成像测量小鼠内的Luc活性：
在给药后24小时，通过腹膜内注射美托咪定(11.5μg/kg BW)、咪唑安定(115μg/kgBW)和芬太尼(1.15μg/kg BW)麻醉小鼠。通过腹膜内注射施加D-荧光素底物(每只小鼠3mg/100μl PBS)。10分钟后测量生物发光——利用IVIS 100成像系统(Xenogen，Alameda，USA)和摄像机设置：Bin(HR)，视场10，f1光圈数，高分辨率面元划分和30s曝光时间。利用直播图像软件版本2.50(Xenogen，Alameda，USA)定量和分析信号。随后，将器官解剖并再次单独成像。
结果
实验显示，mRNA在小鼠腹部区域中有效表达，并且随烷烃链长度减少而增加(cf.图17A，B)。此外，实验显示，mRNA的肝递送随类脂质的烷烃链长度增加而减少(C16＜C14＜C12)，并且C16的mRNA肝递送几乎检测不到。C14的脾荧光素酶表达最高。在肺中观察到一些荧光素酶表达，但在心脏、肾、胃或脑中观察不到(cf.图18A、B)。
实施例13
不同转染剂对其递送pDNA和mRNA的能力的效果的比较。
材料和方法
聚复合物形成：
利用编码萤火虫荧光素酶的质粒DNA(pCMVLuc，质粒工厂)或编码萤火虫荧光素酶的mRNA，如实施例1所述，形成聚复合物。
利用聚复合物的体外转染：
转染实验如实施例3所述进行。
结果
进行实验以证明转染效率仅与转染介质(聚合物/类脂质)有关还是也与核酸类型有关。结果(图19)清楚显示，有效运输pDNA的转染剂不一定是mRNA运输的有效载体。因此，高pDNA转染效率的载体系统不允许效率预测mRNA(efficiency prediction mRNA)。
实施例14：
N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)或N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丁二胺(2-4-2)修饰的PAA8k的转染效率比较。
材料和方法
聚复合物形成：
如实施例1所述形成聚复合物。
利用聚复合物的体外转染：
如实施例3所述进行转染实验。
结果
为进一步考察(2-3-2)修饰的聚合物的效率与结构(2-3-2)强烈相关还是显示与任何其他结构2-X-2(其中X＞2)相似的效率，用N，N′-双(2-氨基乙基)-1，3-丁二胺(2-4-2)修饰PAA8k。PAA8k-(2-3-2)与PAA8k-(2-4-2)的比较(图20)显示，在编码萤火虫荧光素酶的mRNA转染后，两种聚合物产生几乎相同的高荧光素酶表达水平。这证明结构(2-X-2)(其中X＞2)修饰的聚合物总体上产生与其他低聚(烷基胺)修饰相比mRNA运输效率提高的转染剂。
实施例15：
类脂质制剂的透射电镜术
材料和方法
类脂质制剂：
类脂质与一起mRNA配制如下：将C10-(2-3-2)、1，2-二油酰基-sn-甘油并-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或1，2-二棕榈酰基-sn-甘油并-3-磷酸胆碱(DPPC)、胆固醇和1，2-二硬脂酰基-sn-甘油并-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2k)或1，2-二棕榈酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG2k)(9∶6∶5∶1摩尔比)溶解于乙醇，并以17的脂质-氮/mRNA-磷酸根摩尔比快速注入包括化学修饰的编码萤火虫荧光素酶的mRNA的柠檬酸盐缓冲溶液(10mM柠檬酸，150mM NaCl，pH 4.5)，产生20％的最终乙醇浓度，并对水透析24h。
透射电镜：
关于尺寸分析，使用10,000和60,000放大率的TEM(透射电镜)。作为第一步骤，将铜基板(Plano GmbH；S162-3)清除等离子体。在此处理后，使8μl类脂质制剂接触铜板3min。去除类脂质制剂液滴后，通过使负载类脂质的铜板接触一滴8μl乙酸铀酰溶液两次30s，将样品染色。在每步后通过吸水纸吸取去除液体。最后，将载体板在室温下再干燥30min，并通过Jem1011(Jeol)进行分析。
结果
TEM图(图21)显示，形成的类脂质制剂是尺寸分布均匀(概观)的球形颗粒。在放大图中，可估测这些颗粒的尺寸为60-80nm。
实施例16
通过卤代脂环(alcylhalide)合成的C10-(2-3-2)的mRNA运输效率。
材料和方法
合成：
如制备实施例VII所述进行C10-(2-3-2)的合成。
类脂质制剂：
利用9∶6∶5∶1摩尔比的C10-(2-3-2)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油并-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG2k)和编码萤火虫荧光素酶的mRNA，以N/P 17，如实施例15所述，形成类脂质/mRNA复合物。
体外转染：
在处理前24h，将100μL介质中的5,000个NIH3T3细胞接种于96孔板的孔中。在转染当天，如所述的形成类脂质制剂，并用10×PBS溶液将其调节至1×PBS。将类脂质制剂稀释导致50μL中500ng、250ng或125ng，添加至细胞，并在37℃和5％CO2下温育24h。在转染后24h去除介质。将细胞裂解，并分析裂解物的报告蛋白活性，如实施例1所述。
结果
如图22所示，通过卤代脂环合成的C10-(2-3-2)能够运输mRNA到细胞中，导致报告蛋白荧光素酶表达。
实施例17
通过N-十二烷基丙烯酰胺合成的C12-(2-3-2)的mRNA运输效率。
材料和方法
合成：
如制备实施例VIII所述进行C12-(2-3-2)的合成。
类脂质制剂：
利用9∶6∶5∶1摩尔比的C12-(2-3-2)、1，2-2硬脂酰基-sn-甘油并-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG2k)和编码萤火虫荧光素酶的mRNA，以N/P 17，如实施例15所述，形成类脂质/mRNA复合物。
体外转染：
利用500、250或125ng每孔的mRNA剂量，如实施例16所述，进行转染实验。
结果
如图23所示，通过N-十二烷基丙烯酰胺合成的C12-(2-3-2)能够运输mRNA到细胞中，导致荧光素酶的报告基因表达。
实施例18
通过十二烷基-丙烯酸脂合成的C12-(2-3-2)的mRNA运输效率。
材料和方法：
如制备实施例IX所述进行C12-(2-3-2)的合成。
类脂质制剂：
利用9∶6∶5∶1摩尔比的C12-(2-3-2)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油并-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG2k)和编码萤火虫荧光素酶的mRNA，以N/P 17，如实施例15所述，形成类脂质/mRNA复合物。
体外转染：
利用500、250或125ng每孔的mRNA剂量，如实施例16所述，进行转染实验。
结果
如图24所示，通过十二烷基丙烯酸脂合成的C12-(2-3-2)能够运输mRNA到细胞中，导致报告蛋白荧光素酶表达。
实施例19
利用不同辅助脂质和不同类脂质与mRNA(N/P)的比配制的C12-(2-3-2)的mRNA运输效率。
材料和方法
类脂质制剂：
利用C12-(2-3-2)组合1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG2k)作为PEG-脂质，DOPE或DSPC作为辅助脂质，和17或8的N/P比，如实施例15所述，形成类脂质/mRNA复合物。
体外转染：
利用250ng每孔的mRNA剂量，如实施例16所述，进行转染实验。
结果
如图25所示，C12-(2-3-2)能够运输mRNA到细胞中，导致与不同辅助脂质(DOPE，DSPC)和不同N/P比(17或8)组合的荧光素酶的报告基因表达。因此，C12-(2-3-2)有效运输RNA到细胞中，而与辅助脂质和N/P比无关。
实施例20
与C12-(2-2-2)和C12-(3-3-3)相比，静脉内给予C12-(2-3-2)的类脂质制剂后，小鼠内的mRNA运输效率提高。
材料和方法
动物：
如实施例11所述。
类脂质制剂：
如实施例15所述，利用C12-(2-3-2)，1，2-二油酰基-sn-甘油并-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG2k)和编码萤火虫荧光素酶的mRNA，N/P为17。
利用体内生物发光成像测量小鼠内的Luc活性：
如实施例11所述，给药后麻醉动物6h。
结果
如图26所示，与C12-(3-3-3)和C12-(2-2-2)相比，包括C12-(2-3-2)的类脂质制剂导致小鼠内报告基因表达显著增加。这证明C12-(2-3-2)的有益mRNA运输能力。
实施例21
以不同量的烷基链C12饱和的低聚(亚烷基胺)(2-3-2)的mRNA运输效率比较。
材料和方法：
类脂质制剂：
如实施例15所述，无透析，利用具有不同修饰程度和位置的低聚(烷基胺)(2-3-2)(参见图27A，SynCom)。
体外转染：
利用250ng每孔的mRNA剂量，如实施例16所述，进行转染实验。
结果
如图27A所示，合成C12-(2-3-2)的3种不同变型，以评价每种低聚(亚烷基胺)的烷基链数量和位置对mRNA运输能力的影响。在报告蛋白表达中，转染效率(图27B)未显示差异，证明观察不到mRNA运输效率的差异。因此，不同类型的C12-(2-3-2)类脂质制剂以相同效率运输mRNA。
实施例22
冻干类脂质制剂。
材料和方法
类脂质制剂：
如实施例15所述。
冻干过程：
在水中制备海藻糖、蔗糖和乳糖的保护剂溶液(c：20％w/v)。制备以2为系数的连续稀释液，生成20％至0.625％(w/v)的保护剂溶液。向这些溶液添加相同体积的类脂质制剂，并通过吸液混合。将溶液在液氮中冷冻，并利用sigma alpha 1-4(Martin Christ)冻干。在冻干后，将颗粒重新悬浮于相同体积的水中，用于分析。作为对照，将脂质复合物与相同浓度的保护剂溶液混合，不经冷冻和冻干。
体外转染：
如实施例15所述，利用每孔233ng的mRNA。
尺寸测量：
利用ZetaSier Nano ZS(Malvern)测量颗粒的水力直径。
结果
如图28所示，所有测试糖都能够在不同浓度下保持颗粒尺寸和转染效率。相比之下，无保护剂(0％)的颗粒效率较低，并且尺寸因聚集过程而急剧增加。
实施例23
RNA到哺乳动物组织中的离体运输
材料和方法
类脂质制剂：
如实施例15所述，利用C12-(2-3-2)、DOPE、胆固醇、DPG-PEG2k和编码萤火虫荧光素酶的mRNA，N/P比为17，无透析。
组织样品处理：
从刚处死的动物(猪或羊；见表)获取约1cm3的组织片(肌肉、脂肪、动脉或肺；见表)，并在PBS中洗涤。在每个组织片中注入包含10μg RNA的100μL类脂质制剂或包含20μgRNA的200μL类脂质制剂(见表)。在处理羊动脉的情况下，将类脂质制剂注入两端通过纱线封闭的血管腔。将组织在包含10％FCS的细胞培养基(DMEM)中培养24h。
荧光素酶表达分析：
24h后，将样品在包含荧光素(100μg/mL)的PBS中温育30min。利用体内成像系统(IVIS，Perkin Elmer)测量荧光素酶活性。
结果
如图29所示，C12-(2-3-2)能够运输编码萤火虫荧光素酶的mRNA到不同物种的多种不同组织的细胞中，导致荧光素酶表达。相比之下，未处理样品(D，E，下方组织片)不显示成像信号。
实施例24
体外表达血管紧张素I转化酶2(ACE-2)
类脂质制剂：
如实施例15所述，利用C12-(2-3-2)、DOPE、胆固醇、DPG-PEG2k，不添加mRNA，产生空白脂质复合物。在加载后进行类脂质mRNA复合物的配制。为此，将1μL编码ACE-2的mRNA(1mg/ml)与4μL包含脂质复合物的溶液混合，并在室温下温育10min。
体外细胞转染：
关于体外转染，在2mL包含10％FCS的介质中处理前24h，将300,000个HepG2细胞接种于6孔板的孔中。在转染当天，将介质与2mL新制介质交换。如所述的制备类脂质制剂，并将包含500ng mRNA的2.5μL添加至各孔。在对照孔中，注入等量的类脂质制剂，制剂中不添加mRNA。
通过蛋白质印迹检测ACE-2表达：
在转染后24h，去除介质，并用1mL PBS洗涤细胞。利用250μl裂解缓冲液(25mMTris-HCl，0.1％曲拉通X，pH 7.4)，将细胞在冰上裂解10min。在刮掉裂解物后，通过在14,000rpm下离心10min去除碎片。
在蛋白质估测(BCA-试验，Thermo-Fisher scientific)后，每泳道10μg加载到10％SDS-PAGE凝胶(Thermo-Fisher scientific)上。在100V下电泳1.5h后，将凝胶印迹到PVDF膜(TransBlot Turbo，Biorad)上。
印迹后，利用TBS-T(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.5，0.1％吐温20)中的5％乳粉将膜阻断30min。阻断后，将膜用1∶10,000稀释度的抗ACE2抗体(R&D systems)在4℃下探测过夜。3个洗涤步骤(每个10min，TBS-T)后，将膜用1∶10,000稀释度的抗山羊-HRP抗体(SCBT)在室温下探测1h，然后进行3个洗涤步骤(每个10min，TBS-T)。利用发光HRP-底物(GEhealthcare)产生信号，并利用摄像机(ChemiDoc XRS+，Bio-Rad)分析信号。在检测到ACE2信号后，同等加载量利用1∶1,000稀释度的抗GAPDH抗体(NEB)在室温下分析4h。
结果
在图30中显示转染的蛋白质印迹结果。左侧两泳道显示已处理细胞的裂解物，右侧两泳道显示未处理细胞的裂解物。清楚表明，ACE-2表达可仅在后负载(post loaded)有编码ACE-2的RNA的类脂质制剂处理的样品中被观察到。此实验证明，通过包含C12-(2-3-2)的类脂质制剂也可运输ACE-2mRNA。还证明，后负载空白脂质复合物的方法也导致mRNA有效运输到细胞中。
实施例25
鼠红细胞生成素(mEPO)在Balb/c小鼠内的表达
材料和方法
类脂质制剂：
如实施例15所述，利用C12-(2-3-2)、DOPE、胆固醇、DMPE-PEG2k和编码鼠红细胞生成素的mRNA(mEPO)，N/P比为15。
动物：
如实施例11所述。
动物处理：
将类脂质制剂调节至1×PBS，并稀释各自产生130μL中的5、10和20μg mRNA。每种剂量通过静脉内注射处理3只小鼠。作为对照，用PBS处理小鼠。在处理后6h，采集血液，并分析鼠EPO水平。
鼠EPO的定量：
通过鼠EPO ELISA(Quantikine ELISA、R&D Systems Inc.)，按照制造商的方案，进行鼠红细胞生成素的定量。
结果
在此实验中，在用配制在包含C12-(2-3-2)的类脂质制剂中的鼠EPO mRNA处理后，小鼠内鼠红细胞生成素表达。如图31证实，在所有小组中6h后可检测到鼠EPO，浓度显著高于PBS处理的对照组。因此，鼠EPO mRNA被有效运输到细胞中，导致蛋白质表达。
实施例26
低聚(亚烷基胺)(2-3-2)修饰的线性聚合物聚(烯丙基胺)的信使RNA运输效率
材料和方法。
聚复合物形成：
如实施例1所述，利用低聚(亚烷基胺)(2-3-2)、(2-2-2)或(3-3-3)修饰的聚(烯丙基胺)(PALAM)。合成参见制备实施例V。
聚复合物的体外转染：
利用500ng mRNA和N/P 12，如实施例1所述，转染NIH3T3细胞。
结果
如图32所示，在用mRNA和PALAM-(2-3-2)的聚复合物转染后，细胞显示荧光素酶表达显著高于用PALAM-(2-2-2)/mRNA或PALAM-(3-3-3)/mRNA复合物转染后的荧光素酶表达。因此这些结果证实，用具有交替烷基链的低聚(亚烷基胺)修饰线性的、胺末端的聚合物，对线性的、羧基末端的聚合物骨架造成相同的有益效果。
实施例27
低聚(亚烷基胺)(2-3-2)修饰的树枝状聚合物聚亚丙基亚胺的信使RNA运输效率
材料和方法
聚复合物形成：
如实施例1所述，利用低聚(亚烷基胺)(2-3-2)、(2-2-2)或(3-3-3)修饰的聚亚丙基亚胺(PPI)。合成参见制备实施例VI。
聚复合物的体外转染：
利用500ng mRNA和N/P 32，如实施例1所述，转染NIH3T3细胞。
结果
如图33所示，在用mRNA和PPI-(2-3-2)聚复合物转染后，细胞显示荧光素酶表达显著高于用PPI-(2-2-2)/mRNA或PPI-(3-3-3)/mRNA复合物转染后的荧光素酶表达。因此，这些结果证实，用具有交替烷基链的低聚(亚烷基胺)修饰树枝状聚合物，对线性聚合物骨架导致相同的有益效果。
实施例28
大鼠皮下注射后C12-(2-3-2)制剂的胞内RNA运输效率
材料和方法
类脂质制剂：
如实施例15所述，利用C12-(2-3-2)、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2k和编码萤火虫荧光素酶的mRNA，N/P比为17。
动物处理：
将类脂质制剂调节至1×PBS。将500μL包含63μg RNA的制剂皮下注入雌性Buffalo大鼠，在给药后6h，通过腹膜内注射美托咪定(11.5μg/kg BW)、咪唑安定(115μg/kg BW)和芬太尼(1.15μg/kg BW)将大鼠麻醉。通过腹膜内注射施加D-荧光素底物(每只鼠30mg，在PBS中)。10分钟后利用IVIS 100成像系统(Xenogen，Alameda，USA)测量生物发光。
结果
如图34证实，注射侧大鼠显示明亮发光信号，证明RNA到周围组织的运输非常有效。其还显示，由于编码蛋白质可被生成，RNA的功能保持完整。

Claims (14)

1.组合物，包括单链RNA和包括低聚(亚烷基胺)的组分，所述组分选自：
a)包括多个式(II)基团作为侧链和/或作为末端基团的低聚物或聚合物：
Figure FDA0002312331030000011
其中在多个这样的基团中，每个式(II)基团中的变量a、b、p、m、n和R2至R6独立地限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；和聚(乙二醇)链；
R6选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；–C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体，
并且其中式(II)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(II)的阳离子基团；
b)包括多个式(III)基团作为重复单元的低聚物或聚合物：
Figure FDA0002312331030000012
其中在多个这样的基团中，每个式(III)基团的变量a、b、p、m、n和R2至R5独立地限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R2至R5彼此独立地选自氢；基团–CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；–C(NH)-NH2；和聚(乙二醇)链；
并且其中式(III)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(III)的阳离子基团；和
c)具有式(IV)结构的类脂质：
Figure FDA0002312331030000021
其中变量a、b、p、m、n和R1至R6限定如下：
a为1，并且b为2至4的整数；或a为2至4的整数，并且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，并且m+n≥2；和
R1至R6彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基保护基团；–C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体；条件是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
并且其中式(IV)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供式(IV)的阳离子类脂质。
2.根据权利要求1所述的组合物，包括所述单链RNA和所述包括低聚(亚烷基胺)的组分，所述组分选自组分a)和b)，其中
组分a)是包括多个式(IIa)基团作为侧链和/或作为末端基团的低聚物或聚合物：
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IIa)，
其中a、b、m、n、和R2至R6限定如权利要求1，并且其中式(IIa)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构；和
组分b)是包括多个式(IIIa)基团作为重复单元的低聚物或聚合物：
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n- (IIIa)，
其中a、b、m、n、和R2至R5限定如权利要求1，并且其中式(IIIa)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构。
3.根据权利要求1所述的组合物，包括所述单链RNA和具有式(IVa)结构的类脂质：
R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IVa)，
其中a、b、m、n、和R1至R6限定如权利要求1，并且其中式(IVa)中显示的氮原子中的一个或多个可被质子化以提供阳离子类脂质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，在式(II)、(IIa)、(III)、(IIIa)、(IV)或(IVa)中，n为1。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，在式(II)、(IIa)、(III)、(IIIa)、(IV)或(IVa)中，m为1并且n为1。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，在式(II)、(IIa)、(III)、(IIIa)、(IV)或(IVa)中，a为1并且b为2，或a为2并且b为1。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述低聚物、聚合物或类脂质是阳离子低聚物、聚合物或类脂质，并且其中所述阳离子低聚物、聚合物或类脂质与所述单链RNA一起形成复合物。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其是冻干形式。
9.根据权利要求8所述的组合物，其进一步包括冻干保护剂.。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述冻干保护剂是海藻糖。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述单链RNA是mRNA。
12.药物组合物，包括根据权利要求1至11中任一项所述的组合物。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物在体外用于递送单链RNA到细胞中的应用。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物在制备用于递送单链RNA至目标细胞或组织的试剂中的应用。
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