KR20160040524A - Rna를 세포에 도입하기 위한 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포를 RNA로 형질감염시키는데 비히클로서 유용한 특징적인 올리고(알킬렌 아민) 부분을 포함하는 올리고머, 폴리머 및 리피도이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 핵산 및 상기의 올리고(알킬렌 아민) 부분을 가지는 올리고머 또는 폴리머 또는 리피도이드를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 사용하여 세포를 형질감염시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약학 조성물 및 용도에 관한 것이다.

Description

RNA를 세포에 도입하기 위한 조성물{Compositions for introducing RNA into cells}
본 발명은 세포를 RNA로 형질감염시키는데 비히클로서 유용한 특징적인 올리고(알킬렌 아민) 부분을 포함하는 올리고머, 폴리머 및 리피도이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 RNA 및 상기의 올리고(알킬렌 아민) 부분을 가지는 올리고머 또는 폴리머 또는 리피도이드를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 사용하여 세포를 형질감염시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약학 조성물, 용도 및 키트에 관한 것이다.
핵산 요법의 실행가능성은 궁극적으로 세포에 핵산을 전달하기 위한 효율적인 방법의 이용가능성에 의존한다.
일반적으로 핵산 전달에서는, 나(naked) 핵산의 사용이 세포를 형질감염시키기에 적합하고 몇몇 경우에는 충분하다(Wolff et al. 1990, Science, 247, 1465-1468). 그러나, 대부분의 구상중에 있는 실제 응용에서는 적어도, 전달 동안 분해로부터 핵산을 보호하고/하거나, 표적 조직으로 및 그 내에서의 분포를 촉진하고/하거나, 세포 흡수를 용이하게 하고, 적합한 세포 내 처리를 가능하게 할 수 있는 제2의 제제로 핵산을 제제화하는 것이 유리하거나, 심지어는 필요하다. 핵산 전달을 위한 이러한 제제는 과학 문헌에서 벡터로서 지칭된다. 핵산의 벡터화를 위한 매우 다양한 화합물, 소위 형질감염 시약이 이전에 기술되었다. 이들 화합물은 일반적으로 양이온성 지질 또는 리피도이드 같은 지질-유사 화합물을 포함하는 폴리양이온 또는 조성물이다(미국 특허 제8,450,298호). 핵산과 폴리양이온의 복합체는 폴리플렉스로서 칭해지며, 양이온성 지질과의 것은 리포플렉스라고 칭해진다(Felgner et al. 1997, Hum Gene Ther, 8, 511-512). 폴리양이온과 지질을 모두 포함하는 복합체도 또한 기술되었다(Li and Huang in "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Chapter 13, 295-303). 형질감염 시약은 핵산을 결합시키고 조밀화하여 나노미터 크기 범위의 일차 복합체를 만드는데 사용된다. 염-함유 매질에서 이들 복합체는 응집하는 경향이 있으며(이는 또한 염-유도 응집으로도 알려져 있다), 이는 세포 배양 시 형질감염 또는 생체 내 국소 투여에 유리할 수 있다(Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433; Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21). 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 폴리머로의 표면 차폐에 의해 응집이 피해질 수 있고, 형질감염 시약과 핵산의 복합체가 안정화될 수 있다. 차폐는 또한 형질감염 시약과의 핵산 복합체에 의한 보체 활성화 및 그의 옵소닌화를 방지하기 위해 사용된다(Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). 형질감염 시약에 의한 핵산의 조밀화는 이들을 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호할 뿐만 아니라, 엔도시토시스에 의한 세포 흡수에 적합하게 한다. 폴리(에틸렌이민), 폴리(아미도아민) 덴드리머, 폴리(2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트)(pDMAEMA) 또는 폴리(N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드)(pHPMA)의 양이온성 유도체, 폴리(베타-아미노 에스테르)(Akinc et al. 2003, Bioconj Chem 14(5):979-88), 천연 및 합성 양이온성 폴리(아미노산) 또는 펩티드, 예컨대 폴리(리신), 히스톤, HMG 단백질 또는 양이온성 탄수화물, 예컨대 키토산을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 선형 및 분지형 폴리양이온이 핵산을 결합시키고 조밀화하는데 적합하다. 상기 언급된 일차-, 이차- 및/또는 삼차 아민을 함유하는 폴리머 외에, 구아니딜 부분을 함유하는 구조가 핵산 복합체화 및 전달의 목적에 중요한 분자 부류이다. 아르기닌 기반 구조(Yamanouchi et al. 2008, Biomaterials 29(22):3269-77), 아르기닌으로 변형된 PAMAM(Son et al. 2013, Bull. Korean Chem. Soc. Vol 34 No. 3) 또는 구아니딜화된-PEI(Lee et al. 2008, Bull. Korean Chem. Soc. 2008, Vol. 29, No. 3)와 같은 구아니딜 변형 폴리머가 이러한 시스템의 효율성을 강조했다. 특히 RNA 상호작용의 경우에는, 구아니딜 부분의 분자 특성이 고유한 결합 성질을 나타낸다(Calnan et al. 19991, Science 252(5009), 1167-1171). 이러한 구조의 생성에 대한 방법에 대해서는 카트리츠키(Katritzky) 및 로고보이(Rogovoy)에 의한 (Katritzky & Rogovoy 2005, ARKIVOC (iv) 49-87)의 개요를 이용할 수 있다. 종종, 폴리플렉스는 세포 표적화 또는 세포 내 표적화 부분 및/또는 막-탈안정화 성분, 예컨대 불활성화된 바이러스(Curiel et al. 1991, ProcNatl Acad Sci USA, 88, 8850-8854), 바이러스성 캡시드 또는 바이러스성 단백질 또는 펩티드(Fender et al. 1997, Nat Biotechnol, 15, 52-56, Zhang et al. 1999, Gene Ther, 6, 171-181) 또는 막-파괴성 합성 펩티드(Wagner et al. 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 7934-7938, Plank et al. 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924)를 포함하도록 추가로 변형된다.
엔도사이토틱(endocytotic) 흡수 시, 복합체는 엔도좀 및 리소좀과 같은 세포 내 소포체로 격리되고, 여기서 세포 분해 기구에 노출된다. 따라서, 효율적인 기능성 핵산 전달을 위해서는 세포 내 소포체로부터의 이탈이 필수적인 것으로 인식되고 있으며, 이는 또한 기능성 바이러스 감염을 위한 요건이기도 하다(Wagner et al. 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 7934-7938, Plank et al. 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924). 자연이 바이러스 감염에 대해 진화하는 메카니즘은 합성 벡터에 의해 효율적인 핵산 전달을 달성하도록 모방되고 있다. 이를 위해, 예를 들면 INF, GALA 및 KALA 펩티드 또는 멜리틴 및 멜리틴 유도체와 같은 양친매성 막-탈안정화 펩티드(Boeckle et al. 2006, J Control Release, 112, 240-248)가 엔도좀 이탈 기능을 가지는 폴리양이온성 형질감염 시약을 보완하기 위해 아주 성공적으로 사용되고 있다(Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35). 리포플렉스에서, 이러한 기능은 세포막과 융합하는 그 지질 부분의 능력으로 내재된다(Xu and Szoka 1996, Biochemistry, 35, 5616-5623, Zelphati and Szoka 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 11493-11498). 부시프(Boussif) 등에 의한 중요한 발표(Boussif et al. 1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92, 7297-7301) 이래로, 폴리플렉스의 엔도좀 이탈 기능이 물리 화학적 수단에 의해 실현될 수 있음이 알려졌다. 폴리(에틸렌이민)(PEI)이 폴리플렉스를 형성하기 위한 폴리양이온으로 사용되는 경우, 그의 산성 pH에서의 완충 능력은 엔도좀 이탈을 유발하기에 충분하다. 엔도좀의 루멘은 엔도좀 막에 존재하는 프로톤 펌프에 의해 산성화되는 것으로 알려져 있다(Lafourcade et al. 2008, PLoS One, 3, e2758). 이러한 산성화는 인플루엔자 또는 아데노바이러스와 같은 일부 바이러스의 엔도좀 이탈을 촉발한다. 실험적 증거에 의해 지지되는, 소위 프로톤 스폰지 이론은 PEI의 화학적 구조의 특징을 포함하는 폴리머의 추정적인 기계적 작용을 설명한다: PEI의 아미노 그룹의 상당한 부분은 중성 (생리) pH에서 비프로톤화된다(Ziebarth and Wang 2010, Biomacromolecules, 11, 29-38). 프로톤화되고 따라서 양으로 하전된 아미노 그룹에 의해, PEI-같은 폴리머가 핵산을 결합시키고 조밀화할 수 있다. 비프로톤화된 아민은 산성 pH에서 프로톤화될 수 있고, 따라서 엔도좀 내에서 완충 능력을 가질 수 있다. 프로톤 펌프에 의한 엔도좀의 산성화는 클로라이드 이온의 축적이 따른다(Sonawane et al. 2003, J Biol Chem, 278, 44826-44831). 엔도좀 루멘 내 PEI와 같은 완충 분자의 존재 하에서 프로톤 펌프는, 그의 부재 하에와 같이 자연 산성 엔도좀의 pH에 도달할 때까지 클로라이드 축적과 함께 더 많은 프로톤을 엔도좀 루멘에 실어나를 것이다. 엔도좀 내 이온들의 불균형적인 축적은 소포체의 삼투적 탈안정화로 이어져 최종적으로는 소포체 파열 및 세포질 내 핵산 복합체의 방출을 이끌 것으로 생각된다.
프로톤 스폰지 이론에 기초하여, 많은 연구자들은 산성 pH에서 완충 능력을 가지는 아민을 포함하는 신규한 폴리머 라이브러리를 만들어 PEI의 구조적 특징을 포착하였다. 카타오카(Kataoka) 등에 의한 미국특허 제7,780,957호 및 미국특허 제7,829,657호는 카복실산 측쇄가 산성 pH에서 프로톤화가능한 아민 측쇄로 유도체화된 폴리(글루탐산) 또는 폴리(아스파르트산) 주쇄 기반 폴리머를 기술한다. 그러나, 폴리양이온 내 형질감염-향상 부분으로서 기능하는 교번 비동일 알킬렌 아민 단위를 함유하는 올리고(알킬렌 아민)의 풍부한 구조 공간에 대해서는 탐구되지 않았다. 특히, mRNA의 형질감염을 위해 이전에 조사된 것은 없다.
대조적으로, 카타오카 등의 많은 과학적 연구는 폴리{N-[N'-(2-아미노에틸)-2-아미노에틸]아스파타미드}에 초점을 맞추었다. 우치다(Uchida) 등에 의한 문헌(2011, J Am Chem Soc, 133, 15524-15532)에서 동일 그룹은 일반식 -(CH2-CH2-NH)m-H의 측쇄중에 반복 아미노에틸렌 단위를 가지는 일련의 N-치환된 폴리아스파타미드를 조사하였다. 흥미롭게도, 저자가 플라스미드 DNA의 형질감염 시 폴리머 패밀리의 효율성을 조사하였을 때, "다수의 세포주로의 엔도좀 이탈 및 형질감염 효율에 대한 폴리머 측쇄 내 반복 아미노에틸렌 단위의 특징적인 홀수-짝수 효과"가 관찰되었다. 반복 아미노에틸렌 단위를 짝수로 가지는 폴리머(PA-E)로부터의 폴리플렉스는 반복 아미노에틸렌 단위를 홀수로 가지는 폴리머(PA-O)의 것에 비해, 현저한 세포 독성없이, 수배 더 높은 형질감염 효율을 달성했다. 이러한 홀수-짝수 효과는 PA-E의 폴리플렉스의 매우 효과적인 엔도좀 이탈로 이어지는, 엔도좀의 pH에서 선택적으로 막 무결성을 파괴하는 이들 폴리머의 능력뿐만 아니라 이들 폴리머의 완충 능력과 잘 맞았다. 또한, 폴리머 측쇄에 프로톤화된 아미노 그룹 간 간격이 정확한 다가 하전 배열의 형성은 엔도좀 막을 효과적으로 파괴하여 폴리플렉스의 세포질로의 수송을 촉진하는데 필수적인 것으로 나타났다(Abstract from Uchida et al. 2011, J Am Chem Soc, 133, 15524-15532). 흥미롭게도, 동일한 연구자 그룹은 1,2-디아미노에탄 측쇄를 가지는 폴리(아스파타미드) 유도체, [PAsp(DET)]와 1,3-디아미노프로판 측쇄를 가지는 유사체, [PAsp(DPT)]를 비교하고, 비록 [PAsp(DET)]에 대해 입자 크기 및 ζ 전위의 물리화학적 차이가 무시할만 하더라도 N/P 비에 따라 세포독성이 점차적으로 증가하기 때문에, PAsp(DPT) 폴리플렉스는 높은 N/P 비에서 플라스미드 DNA의 형질감염 효율이 크게 저하한 것을 발견하였다(Miyata et al. 2008, J Am Chem Soc, 130, 16287-16294). 따라서, 홀수-짝수 규칙에 기초하여, 본 발명자들은 3개의 프로톤화가능한 아미노 그룹 및 프로필렌 스페이서 그룹을 포함하는 폴리머는 PAsp(DET) 보다 열등하고 1,3-디아미노프로판-함유 측쇄가 독성 문제와 연관되어 있다고 예상할 수 있었다. mRNA의 형질감염에 대한 이러한 폴리머의 구조-활성 관계에 대해 알려진 바가 없다.
기얼(Geall) 및 동료들은 다음 일반식을 갖는 폴리아민 부분을 가지는 콜레스테롤-폴리아민 카바메이트를 개시하였다:
Figure pct00001
상기 식에서, m은 0, 1 또는 2이고, n은 0 또는 1이다(Geall et al. 1999, FEBS Lett, 459, 337-342). 그들은 이들 물질의 pKa 값과 송아지 흉선 DNA의 응축에 있어서 그의 특성을 조사하였다. 그들은 콜레스테롤 폴리아민 카바메이트를 따른 양전하의 위치화학적 분포가 DNA 결합 친화성 및 리포펙틴 효율을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 발견했다. 이들은 조사한 콜레스테롤 폴리아민 카바메이트 중에서 폴리아민 부분, -HN-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (프로필/부틸/프로필)으로 구성된 스퍼민이 세포 배양물에서 베타 갈락토시다제-코딩 플라스미드 DNA의 형질감염 시 리포터 유전자 발현을 단연코 최고로 산출하는 반면, 예를 들어 -HN-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2 (에틸/프로필/에틸)은 3- 내지 10배 덜 효율적임을 입증하였다. 따라서, 카타오카 등의 교시 (홀수-짝수 규칙) 및 기얼 등의 결과에 비추어, 당업자는 핵산 전달의 맥락에서 후자의 구조를 고려하지 않았다.
왕(Wang) 등은 폴리(메틸 메타크릴레이트)-그래프트-올리고아민을 플라스미드 DNA를 위한 효율적이고 저 세포독성인 형질감염 시약으로서 기술하였다(Wang et al. 2010, Molecular BioSystems, 6, 256-263). 이들 폴리머는 일반식 H2N-CH2-CH2-(NH-CH2-CH2)m-NH2 (여기서 m은 1, 2, 또는 3이다)의 올리고아민으로 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 아미노분해하여 수득되었다. 저자들은 아민의 길이가 증가함에 따라 형질감염 효율이 증가하는 것을 발견하였다.
오우(Ou) 등은 N,N'-시스타민비스아크릴아미드와의 공중합에 의해 구조 Dde-NH-(CH2)a-NH-(CH2)b-NH-(CH2)a-NH-Dde를 가지는 말단 보호된 올리고 아민으로부터 유도된 폴리(디설파이드 아미도 아민)을 기술하였다(Ou et al. 2009, Biomaterials 30, 5804-5814; WO 2010/065660). 이들은 a = 2 및 b = 2, a = 2 및 b = 3, a = 3 및 b = 2, a = 3 및 b = 3, a = 3 및 b = 4 (스퍼민)의 조합을 조사하였다. Dde는 2-아세틸디메돈 보호 그룹이다. 보호 그룹의 제거 후, 합성에 따라 내부의 원래 이차 아민이 폴리머 주쇄의 일부로서 삼차 아민으로 되고 말단 아민은 펜딩 에틸렌 또는 프로필렌 아민 측쇄의 일부가 되는 폴리(디설파이드 아미도 아민)이 제공된다. 이러한 폴리머는 핵산 전달과 관련된 pH 범위에서 완충 능력을 가지며, 플라스미드 DNA를 세포로 형질감염하는데 유용하다.
최근, 시험관 내 및 생체 내에서 핵산 전달을 위한 새로운 지질류 부류이나, 비지질성인 합성 구조, 소위 리피도이드의 유용성이 밝혀졌다(US 8,450,298; Love et al. 2010, PNAS 107, 1864-1869; WO2006/138380; Akinc et al. 2008, Nat Biotechnol 26, 561-569). 리피도이드는 아민-함유 화합물을 지방족 에폭시드, 아크릴레이트, 아크릴아미드 또는 알데히드와 반응시킴으로써 얻어진다. 저자/발명자는 리피도이드 라이브러리를 획득하기 위한 합성 과정 및 시험관 내 세포로의 핵산 전달에 유용성을 가지는 유용한 화합물을 선택하기 위한 선별 과정을 제공하였다.
상기 명백한 바와 같이, 과거 많은 연구 및 개발 작업은 플라스미드 DNA, 올리고뉴클레오티드, siRNA와 같은 다른 핵산 분자 또는 핵산 유사체의 전달에 대해 행해졌다. mRNA의 전달은 깊이 조사되지 않았다. 몇몇 저자들은 DNA 또는 siRNA의 전달을 위해 잘 작용하는 화합물 및 제제가 mRNA의 전달에 대해서도 유사하게 작용할 것이라고 주장했다. 그러나, 플라스미드 DNA 또는 siRNA와 달리, mRNA는 단일가닥 분자이다. 따라서, 단지 구조만을 고려한다면, DNA 또는 siRNA 전달 대비 mRNA의 전달을 위한 화합물 및 제제는 요구조건이 서로 다를 것으로 예상된다.
위에서 인용된 문헌은 세포에 플라스미드 DNA 또는 siRNA와 같은 이중가닥 핵산의 전달을 기술하고 있지만, 기술된 방법 및 화합물이 세포 내로 mRNA와 같은 단일가닥 핵산을 전달할 수 있는지는 알려지지 않았다. 특히, 이전에는 mRNA 형질감염은 세포로의 플라스미드 DNA 형질감염과 실질적으로 다른 것으로 관찰되었다(Bettinger et al. 2001, Nucleic Acids Res, 29,3882-91, Uzguen et al, 2011, Pharm Res, 28, 2223-32).
이에 의거하여, 본 발명자들은 WO 2011/154331호에 개시된 폴리머 류에서 100개 이상의 일원을 RNA 전달, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 세포로의 전달 적합성에 대해 스크리닝하였는데, mRNA에 의해 코딩되는 유전자의 발현을 일으키는 방식으로 mRNA를 형질감염시키는데 유용한 화합물은 발견하지 못했다. 이에 반해, 이들 화합물은 모두 플라스미드 DNA 및/또는 siRNA의 전달에 효율적이다. 따라서, 세포로 이중가닥 핵산을 전달하기 위해 확립된 규칙은 단일가닥 mRNA에 대해 선험적으로 적용되지 않는다. WO 2011/154331호의 개시는 일반식 HOOC-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H (여기서 Z는 메틸렌계 또는 다양한 다른 그룹이고, R은 메틸렌 또는 카복시 잔기이고, a 및 b는 독립적으로 각각 1-7 또는 2-7의 정수이다)에 해당하는 올리고(알킬렌 아미노)산 단위를 2 내지 60개 단위 가지는 화학적으로 정의된 올리고머를 포함한다. 이러한 류의 올리고머는 소위 프로톤 스폰지 효과를 발휘할 수 있고 시험관 내 및 생체 내에서 플라스미드 DNA 및 siRNA의 형질감염에 매우 활성적인 것으로 입증된 프로톤화가능한 아미노 그룹을 포함한다. 중요하게, WO 2011/154331호 및 관련 과학 서적은 일반식 HOOC-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H에 상응하는 빌딩 블록으로부터 순서가 규정된 올리고머/폴리머 라이브러리를 확립할 수 있는 방법을 아주 자세하게 교시한다.
따라서 본 발명의 기본적인 기술적 과제는 세포 또는 조직에 높은 효율로, RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하는데 적합한 조성물을 제공하는 것이다.
이 과제는 청구항에서 특정되고 다음과 같은 일반적인 설명 및 실시예에서 보다 상세하게 예시되는 바와 같은 실시양태들의 제공으로 달성되었다. 특히, 본 발명은 본원에서 추가 정의된 바와 같은 그의 다양한 실시양태들에서 다음을 제공한다:
- 세포 내로 또는 조직으로 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하는데 유용한 교번 비동일 알킬렌 아민 단위를 함유하는 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드,
- 세포 내로 또는 조직으로 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하는데 유용한, RNA 및 특히 mRNA와 조합하여 교번 비동일 알킬렌 아민 단위를 함유하는 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드를 포함하는 조성물,
- 상기 화합물 및 조성물의 제조 방법, 및
- 세포 내로 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하기 위한 상기 화합물 및 조성물의 사용 방법뿐만 아니라, RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하기 위해 본 발명에 따른 조성물의 능력을 이용한 의학적 용도 및 치료 방법.
선형, 분지형 및 수지상의 랜덤 또는 순서가 규정된 화합물을 비롯한 올리고머 또는 폴리머 화합물, 또는 세포로 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하기에 유용한 조성물중에 포함된 리피도이드 화합물에 교번 비동일 알킬렌 아민 단위를 함유하는 올리고(알킬렌 아민)의 풍부한 구조 공간에 대해 탐구된 바가 없다. 그같은 화합물의 배열 공간에 대해서도 전혀 탐구된 적이 없다.
놀랍게도, 올리고머, 폴리머 및 리피도이드에 대해 기존에 알려지지 않은 일반적인 원리로서 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA로 세포를 형질감염시키기 위한 조성물중에 에틸렌아민 단위를 함유하고 3 이상의 단위들의 그룹에 교번 길이를 가지는 알킬렌 아민 단위의 배열이 항상 비교번 길이를 가지는 알킬렌 아민 단위의 유사 배열보다 더 효과적이었음을 발견하였다. 따라서, 화학식 (I)에 나타낸 공통 구조 실체를 공유하는 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드가 제공되고 아래에 추가로 설명될 것이다:
Figure pct00002
특히, 본 발명은 제1 양태에서, RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA와 하기 a) 내지 c)로부터 선택되는 올리고(알킬렌 아민)을 포함한 성분을 포함하는 조성물을 제공한다:
a) 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
Figure pct00003
[상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은 다수의 화학식 (II)의 그룹에서 이의 각 그룹에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고, b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m+n은 ≥2이고;
R2 내지 R5는 서로 독립적으로, 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
R6은 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 리셉터 리간드로부터 선택되고,
화학식 (II)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (II)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다];
b) 반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
Figure pct00004
[상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는 다수의 화학식 (III)의 그룹에서 이의 각 그룹에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고, b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m+n은 ≥2이고;
R2 내지 R5는 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
화학식 (III)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (III)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다]; 및
c) 화학식 (IV)의 구조를 가지는 리피도이드:
Figure pct00005
[상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고, b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m+n은 ≥2이고;
R1 내지 R6은 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 리셉터 리간드로부터 선택되되; 단 R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이고;
화학식 (IV)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (IV)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다].
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물의 제조를 위한 중간체로서 유용한 상기 정의된 바와 같은 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 및 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드뿐만 아니라 본 발명에 따른 조성물 및 약학 조성물의 제조 방법을 포함한다.
또 다른 양태는 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 표적 세포 내로 또는 조직에 전달하기 위한 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 폴리머 또는 덴드리머 또는 리피도이드의 용도, 및 본 발명에 따른 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 세포 내로 전달하는 방법에 관한 것이다.
올리고(알킬렌 아민 ) 그룹
화학식 (II), (III) 및 (IV)의 올리고(알킬렌 아민) 구조는 더 짧은(또한 표기를 위해 "S"로도 칭해짐) 에틸렌 아민 단위(즉, a 또는 b는 1이다)가 더 긴(또한 표기를 위해 "L"로도 칭해짐) 알킬렌 아민 단위(즉, a 또는 b의 다른 하나는 2 내지 4의 정수이다)와 교대로 조합된 것을 특징으로 한다. 예기치 않게, 이러한 프로톤화가능한 단위의 배열은 생성된 그룹이 세포 내로 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하기 위한 비히클을 제공하기에 적합하다는 면에서 장점을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 일 실시양태에 따른 조성물에 사용될 수 있는 올리고머 또는 폴리머는 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민)을 포함한다:
Figure pct00006
상기 식에서,
변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은 다수의 화학식 (II)의 그룹에서 이의 각 그룹에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고, b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m+n은 ≥2이고;
R2 내지 R5는 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
R6은 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C16 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C16 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 리셉터 리간드로부터 선택된다.
바람직하게는, R2 내지 R5는 수소이고, R6은 수소, 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, R2 내지 R6은 수소이다. 바람직하게는, R7은 C8-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C8-C18 알케닐, 및 더욱 바람직하게는 C8-C12 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C8-C12 알케닐 및 가장 바람직하게는 C10-C12 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C10-C12 알케닐로부터 선택된다.
화학식 (II) 또는 그의 바람직한 실시양태에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (II)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다.
다수의 화학식 (II)의 그룹이란 2 이상, 바람직하게는 3 이상의 화학식 (II)의 그룹 또는 그의 바람직한 실시양태가 본 발명에 따른 올리고머 또는 폴리머에 함유됨을 의미한다. 다수의 화학식 (II)의 그룹을 함유하는 폴리머에서는 10개 이상의 화학식 (II)의 그룹이 존재하는 것이 바람직하다. 화학식 (II)의 그룹 또는 그의 바람직한 실시양태가 폴리머 또는 올리고머 내에 동일한 구조를 가질 수 있거나, 또는 화학식 (II)의 범위 내에 2 이상의 상이한 구조를 가질 수 있음을 이해하여야 한다.
다른 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 올리고머 또는 폴리머는 반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 올리고 (알킬렌 아민) 그룹을 포함한다:
Figure pct00007
상기 식에서,
변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는 다수의 화학식 (III)의 그룹에서 이의 각 그룹에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고, b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m+n은 ≥2이고;
R2 내지 R5는 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 엔도좀 이탈 이펙터 및 리셉터 리간드로부터 선택된다. 바람직하게는, R2 내지 R5는 수소이다. 바람직하게는, R7은 C8-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C8-C18 알케닐, 및 더욱 바람직하게는 C8-C12 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C8-C12 알케닐 및 가장 바람직하게는 C10-C12 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C10-C12 알케닐로부터 선택된다.
화학식 (III) 또는 그의 바람직한 실시양태에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (III)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다.
임의로, 반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 그룹 또는 그의 바람직한 실시양태를 포함하는 올리고머 또는 폴리머는, 또한 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 하나 이상의 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹(들)을 포함할 수 있다.
반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 그룹이란 2 이상, 바람직하게는 3 이상의 화학식 (III)의 그룹 또는 그의 바람직한 실시양태가 본 발명에 따른 올리고머 또는 폴리머에 함유됨을 의미한다. 일반적으로, 2 내지 9개의 반복 단위를 포함하는 물질은 본원에서 올리고머로서 지칭되고, 10개 이상의 반복 단위를 포함하는 것은 폴리머로서 지칭된다. 따라서, 반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 그룹을 함유하는 폴리머에, 10개 이상의 화학식 (III)의 그룹이 바람직하게는 존재한다. 화학식 (III)의 그룹 또는 그의 바람직한 실시양태가 폴리머 또는 올리고머 내에 동일한 구조를 가질 수 있거나, 또는 화학식 (III)의 범위 내에 2 이상의 상이한 구조를 가질 수 있음을 이해하여야 한다. 유리하게, 및 바람직한 실시양태에 따라, 반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 그룹을 함유하는 올리고머 또는 폴리머는 상이한 화학식 (III)의 그룹으로부터 제어된 단계식 중합으로 제조되는 순서가 규정된 폴리머의 라이브러리 형태로 제공될 수 있다.
상기 화학식 (II) 및 (III)에 따라, 알킬렌 아민 단위는 교번 쇄에서 한번 반복되어 타입 -S-L-L-S- 또는 -L-S-S-L-의 올리고(알킬렌 아민) 부분이 생길 수 있고, 여기서 S는 더 짧은 에틸렌 아민 단위를 나타내고, L은 더 긴 알킬렌 아민 단위를 나타낸다. 그러나, 바람직한 화학식 (II) 및 (III)의 그룹은 반복이 일어나지 않는, 즉, p가 1이어서 더 짧은 또는 더 긴 단위가 쌍으로 나타나지 않는 것이다. 다시 말해서, 화학식 (II)의 그룹은 바람직하게는 화학식 (IIa)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹이고, 화학식 (III)의 그룹은 바람직하게는 (IIIa)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹이다:
Figure pct00008
[상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R6은 바람직한 실시양태를 포함하여 화학식 (II)에서와 같이 정의되고, 화학식 (IIa)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다]:
Figure pct00009
[상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R5는 바람직한 실시양태를 포함하여 화학식 (III)에서와 같이 정의되고, 화학식 (IIIa)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다].
또한, 일반적으로 화학식 (II) 및 (III)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹에 대해 n이 1인 것이 바람직하고, m이 1이고 n이 1인 것이 더욱 바람직하다. 따라서 화학식 (II)의 그룹이 화학식 (IIb)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹이고, 화학식 (III)의 그룹이 화학식 (IIIb)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹인 것이 특히 바람직하다:
Figure pct00010
[상기 식에서, a, b, 및 R2 내지 R6은 바람직한 실시양태를 포함하여 화학식 (II)에서와 같이 정의되고, 화학식 (IIb)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다]:
Figure pct00011
[상기 식에서, a, b, 및 R2 내지 R5는 바람직한 실시양태를 포함하여 화학식 (III)에서와 같이 정의되고, 화학식 (IIIb)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다].
화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (III), (IIIa), (IIIb)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹에서 알킬렌 아민 단위의 길이와 관련하여, 교번 단위중 하나는 에틸렌 아민 단위(즉, a 또는 b 중 하나는 1이다)일 필요가 있음이 이해될 것이다. 다른 교번 단위는 프로필렌 아민 단위, 부틸렌 아민 단위 또는 펜틸렌 아민 단위(즉, a 또는 b의 다른 하나는 2 내지 4의 정수이다)일 수 있다. 바람직하게는, a 또는 b의 다른 하나는 2 또는 3이고, 가장 바람직하게는, a는 1이고, b는 2이거나, 또는 a는 2이고 b는 1이다. 따라서, 그룹 (II)로는 화학식 (IIc)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹이 보다 더 바람직하고, 그룹 (III)으로는 화학식 (IIIc)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹이 보다 더 바람직하다:
Figure pct00012
[상기 식에서, R2 내지 R6은 화학식 (II) 및 그의 바람직한 실시양태에서와 같이 정의되고, 가장 바람직하게는 수소이며, 화학식 (IIc)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다];
Figure pct00013
[상기 식에서, R2 내지 R5는 화학식 (III) 및 그의 바람직한 실시양태에서와 같이 정의되고, 가장 바람직하게는 수소이며, 화학식 (IIIc)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다].
화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (IIc) 중 그룹 R2 내지 R6 또는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb) 및 (IIIc) 중 그룹 R2 내지 R5의 임의의 것이 예를 들어 WO2006/138380호에 기술된 바와 같은 아미노 그룹에 대한 보호 그룹이면, 그의 바람직한 실시양태는 t-부톡시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 또는 카보벤질옥시(Cbz)이다.
화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (IIc) 중 그룹 R1 내지 R6 또는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb) 및 (IIIc) 중 그룹 R2 내지 R5의 임의의 것이 리셉터 리간드이면, 유용한 예는 [Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15, CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009]에 기술된 것이다. 폐조직에 대한 바람직한 리셉터 리간드는 [Pfeifer et al. 2010, Ther. Deliv. 1(1):133-48]에 기술되었다. 바람직한 리셉터 리간드는 특정 세포 표면 구조 또는 특정 세포 타입에 대한 결합에 대해 펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 유도된 것과 같은 합성 환형 또는 선형 펩티드, 환형 또는 선형 RGD 펩티드, 합성 또는 천연 탄수화물, 예컨대 시알산, 갈락토스 또는 만노스 또는 탄수화물을 예를 들어 펩티드와 반응시켜 유도된 합성 리간드, 세포 표면 구조를 특이적으로 인식하는 항체, 엽산, 상피 성장 인자 및 그로부터 유래된 펩티드, 트랜스페린, 항-트랜스페린 리셉터 항체, 나노바디 및 항체 단편, 공지 세포 표면 분자에 결합하는 승인 약물 등을 포함한다.
화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (IIc) 중 그룹 R1 내지 R6 또는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb) 및 (IIIc) 중 그룹 R2 내지 R5의 임의의 것이 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄이면, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄의 바람직한 분자량은 100 내지 20,000 g/mol, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 10,000 g/mol 및 가장 바람직하게는 1,000 내지 5,000 g/mol이다.
그룹 (II)로서 화학식 (IId)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹이 가장 바람직하다:
Figure pct00014
여기서 화학식 (IId)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 폴리머 또는 덴드리머 구조를 제공할 수 있다.
그룹 (III)으로서 화학식 (IIId)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹이 가장 바람직하다:
Figure pct00015
여기서 화학식 (IIId)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 폴리머 또는 덴드리머 구조를 제공할 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 일 실시양태에 따른 조성물에 사용될 수 있는 리피도이드는 화학식 (IV)의 구조를 가진다:
Figure pct00016
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고, b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m+n은 ≥2이고;
R1 내지 R6은 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 리셉터 리간드로부터 선택되되; R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이다.
바람직하게는, R1 내지 R6은 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-C(OH)H-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되되; 단, R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 그룹 -CH2-C(OH)H-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이다. 더욱 바람직하게는, R1 내지 R6은 독립적으로 수소; 및 그룹 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서 R7은 C3-C16 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C16 알케닐로부터 선택됨)로부터 선택되되; 단 R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 그룹 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이다. R1 및 R6이 독립적으로 수소; 및 그룹 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)로부터 선택되고; R2 내지 R5은 모두 그룹 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)인 군이 보다 더 바람직하다. 바람직하게는, R7은 C8-C16 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C8-C18 알케닐, 및 더욱 바람직하게는 C8-C12 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C8-C12 알케닐 및 가장 바람직하게는 C10-C12 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C10-C12 알케닐로부터 선택된다.
화학식 (IV)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (IV)의 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
상기 화학식 (IV)에 따라, 알킬렌 아민 단위는 교번 쇄에서 한번 반복되어 타입 -S-L-L-S- 또는 -L-S-S-L-의 올리고(알킬렌 아민) 부분이 생길 수 있고, 여기서 S는 더 짧은 에틸렌 아민 단위를 나타내고, L은 더 긴 알킬렌 아민 단위를 나타낸다. 그러나, 바람직한 화학식 (IV)의 리피도이드는 반복이 일어나지 않는, 즉, p가 1이어서 더 짧은 또는 더 긴 단위가 쌍으로 나타나지 않는 것이다. 다시 말해서, 화학식 (IV)의 리피도이드는 바직하게는 화학식 (IVa)의 리피도이드이다:
Figure pct00017
상기 식에서, a, b, m, n, 및 R1 내지 R6은 바람직한 실시양태를 포함하여 화학식 (IV)에서와 같이 정의되고, 화학식 (IVa)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
또한, 일반적으로 화학식 (IV)의 리피도이드에 대해 n이 1인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 따라서, 화학식 (IV)의 리피도이드가 화학식 (IVb)의 리피도이드인 것이 특히 바람직하다:
Figure pct00018
상기 식에서, a, b, 및 R1 내지 R6은 바람직한 실시양태를 포함하여 화학식 (IV)에서와 같이 정의되고, 화학식 (IVb)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
화학식 (IV), (IVa) 및 (IVb)의 리피도이드에서 알킬렌 아민 단위의 길이와 관련하여, 교번 단위중 하나는 에틸렌 아민 단위(즉, a 또는 b 중 하나는 1이다)일 필요가 있음이 이해될 것이다. 다른 교번 단위는 프로필렌 아민 단위, 부틸렌 아민 단위 또는 펜틸렌 아민 단위(즉, a 또는 b의 다른 하나는 2 내지 4의 정수이다)일 수 있다. 바람직하게는, a 또는 b의 다른 하나는 2 또는 3이고, 가장 바람직하게는, a는 1이고, b는 2이거나, 또는 a는 2이고 b는 1이다. 따라서, 화학식 (IV)의 리피도이드로서 화학식 (IVc)의 리피도이드가 보다 더 바람직하다:
Figure pct00019
상기 식에서, R1 내지 R6은 화학식 (IV) 및 그의 바람직한 실시양태에서와 같이 정의되고, 화학식 (IVc) 에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
화학식 (IV), (IVa), (IVb) 및 (IVc) 중 그룹 R1 내지 R6이 예를 들어 WO2006/138380호에 기술된 바와 같은 아미노 그룹에 대한 보호 그룹이면, 그의 바람직한 실시양태는 t-부톡시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 또는 카보벤질옥시(Cbz)이다.
화학식 (IV), (IVa), (IVb) 및 (IVc) 중 그룹 R1 내지 R6이 리셉터 리간드이면, 유용한 예는 [Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15, CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009]에 기술된 것이다. 폐조직에 대한 바람직한 리셉터 리간드는 [Pfeifer et al. 2010, Ther. Deliv. 1(1):133-48]에 기술되었다. 바람직한 리셉터 리간드는 특정 세포 표면 구조 또는 특정 세포 타입에 대한 결합에 대해 펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 유도된 것과 같은 합성 환형 또는 선형 펩티드, 환형 또는 선형 RGD 펩티드, 합성 또는 천연 탄수화물, 예컨대 시알산, 갈락토스 또는 만노스 또는 탄수화물을 예를 들어 펩티드와 반응시켜 유도된 합성 리간드, 세포 표면 구조를 특이적으로 인식하는 항체, 엽산, 상피 성장 인자 및 그로부터 유래된 펩티드, 트랜스페린, 항-트랜스페린 리셉터 항체, 나노바디 및 항체 단편, 공지 세포 표면 분자에 결합하는 승인 약물 등을 포함한다.
화학식 (IV), (IVa), (IVb) 및 (IVc) 중 그룹 R1 내지 R6이 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄이면, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄의 바람직한 분자량은 100 내지 20,000 g/mol, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 10,000 g/mol 및 가장 바람직하게는 1,000 내지 5,000 g/mol이다.
전술한 바와 같이, 화학식 (I) 또는 화학식 (IIa) - (IId), (IIIa) - (IIId) 및 (IVa) - (IVc)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온 형태, 전형적으로 올리고양이온 또는 폴리양이온 형태의 올리고머 또는 폴리머 또는 리피도이드를 제공할 수 있다. 화학식 (I) 및 화학식 (IIa) - (IId), (IIIa) - (IIId) 및 (IVa) - (IVc)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 그룹중 일차 및/또는 이차 및/또는 삼차 아미노 그룹이 특히 물 및 생리액을 포함하는 수용액에서 프로톤 억셉터로서 작용할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 올리고머, 폴리머 및 리피도이드는 전형적으로 7.5 아래의 pH 수용액에서 전체적으로 양전하를 가질 것이다. 본원에서 칭해지는 수용액은 용매가 물을 50% (vol./vol.) 이상, 바람직하게는 80 또는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 100% 포함하는 용액이다. 또한, 본 발명에 따른 조성물이 예컨대 혈액 및 폐액을 포함한 7.5 아래의 pH를 가지는 생리액과 접촉되는 경우, 화학식 (I)의 그룹 및 화학식 (IIa) - (IId), (IIIa) - (IIId) 및 (IVa) - (IVc)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태는 전형적으로 하나 이상의 프로톤화된 아미노 그룹을 함유한다. 이들 화합물의 pKa 값은 자동 pKa 적정기를 사용하여 산-염기 적정으로 측정할 수 있다. 그런 다음 주어진 pH 값에서 순전하를 핸더슨-하셀바흐(Henderson-Hasselbach) 식으로부터 계산할 수 있다. 기얼(Geall) 등 (J. Geall et al. 1998, Chem Commun, 1403-1404)에 따르면, 임의 전하가 다수의 염기성 중심을 통해 공유되고, 이것이 단일점에 기인할리가 없다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 1,9-디아미노-3,7-디아자노난 (프로필/에틸/프로필)은, 예를 들어 9.3, 7.6 및 5.7의 pKa 들을 가지는데, 이는 생리 pH에서 아미노 그룹의 상당 분획이 프로톤화 및 비프로톤화 상태임을 제시한다.
그러나, 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명에 따른 올리고머, 폴리머 및 리피도이드뿐만 아니라 본 발명에 따른 조성물은 또한 양이온 형태로 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드를 함유하는 건조 염 형태로서 제공될 수도 있다.
추후 이해되는 바와 같이, 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 및 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 포함하는 본 발명에 따른 조성물중 프로톤화된 아미노 그룹의 양전하에 대한 반대 이온(음이온)은 전형적으로 RNA에 함유된 음이온 부분에 의해 제공된다. 양전하 그룹이 RNA 내 음이온 부분에 비해 과량으로 존재하는 경우, 양전하는 다른 음이온, 예컨대 전형적으로 생리액에서 마주치는 Cl- 또는 HCO3 -로 균형이 이루어질 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용하기에 적합한 올리고(알킬렌 아민)은 공지의 화학물질 제조업자로부터 상업적으로 입수할 수 있거나, 또는 당업계에 공지된 방법(예컨대 van Alphen 1936, Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 55, 835-840)에 의해 합성될 수 있다. 필요할 수 있는 임의 변형은 표준 화학 합성법으로 행해질 수 있다.
올리고머 /폴리머 구조
전술한 바와 같이, 화학식 (I)의 그룹 및 화학식 (IIa) - (IId) 및 (IIIa) - (IIId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태는 각종 올리고머 또는 폴리머 주쇄 구조에 결합할 수 있거나 또는 이를 제공할 수 있다.
일반적으로, 다수의 화학식 (II)의 그룹 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 포함하는 올리고머 또는 폴리머는 또한 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 그룹 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 가지는 폴리머 주쇄로서 지칭될 수 있다. 측쇄 또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 그룹 및 화학식 (IIa) - (IId)의 그룹을 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 가질 수 있는 폴리머 주쇄는 선형, 분지형 또는 가교형 폴리머뿐만 아니라 수지상 폴리머(덴드리머)를 포함한다. 폴리머는 합성 또는 바이오-폴리머를 포함한다. 선형 또는 분지형 폴리머 주쇄 구조가 바람직하다. 이것은 측쇄 또는 말단 그룹으로서 화학식 (II)의 그룹 및 화학식 (IIa) - (IId)의 그룹을 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 가지는 올리고머에도 또한 적용되는데, 폴리머 주쇄는 전형적으로 10개 이상의 반복 단위를 포함하는 반면, 올리고머 주쇄는 2 내지 9개, 바람직하게는 3 내지 9개의 반복 단위를 포함하는 차이가 있다. 일반적으로, 측쇄 또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 그룹 및 화학식 (IIa) - (IId)의 그룹을 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 포함하는 올리고머 및 폴리머중에서 폴리머가 바람직하다.
화학식 (II)의 측쇄 또는 말단 그룹 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태는 본 발명에 따른 폴리머를 제공하기 위해 공지된 화학 관능기 및 반응을 이용하여 적절히 폴리머 또는 올리고머 주쇄에 그래프팅될 수 있다. 숙련자들이 알 수 있는 바와 같이, 용어 "폴리머 또는 올리고머에 대한 그래프팅"은 측쇄가 중합 반응 전 모노머와 결합하는 가능성을 배제하지 않는다. 화학식 (II)에서의 자유 원자가가 나타내는 바와 같이, 측쇄 또는 말단 그룹은 공유 결합을 통해 폴리머 또는 올리고머 주쇄에 부착된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "폴리머" 및 "올리고머"가 래디칼 중합, 음이온 또는 양이온성 중합을 비롯한 각종 광범위 반응, 예컨대 중부가, 및 중축합 반응에 의해 수득가능한 폴리머 및 올리고머뿐만 아니라, 단계식 커플링 반응(예컨대 단계 성장 공정)에 의해 수득가능한 폴리머 및 올리고머를 포함할 수 있는 것이 추가로 이해될 것이다.
따라서, 측쇄 또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 그룹, 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 가지기 위해 폴리머 또는 올리고머 주쇄로서 적합한 폴리머 또는 올리고머는 폴리아미드, 폴리에스테르, 탄소쇄 주쇄를 가지는 폴리머, 및 폴리사카라이드와 같은 폴리머 또는 올리고머를 포함한다. 예시적인 폴리머 또는 올리고머 주쇄는 다수의 글루탐산 또는 아스파르트산 단위를 포함하는 폴리(아미노산), 예컨대 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산), 단백질, 폴리알킨, 폴리아민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리말레산, 폴리설포네이트, 폴리스티렌 설포네이트, 폴리포스페이트, 펜토산 폴리설페이트, 폴리(비닐 인산), 폴리(부타디엔-co-말레산), 폴리(에틸 아크릴레이트-co-아크릴산), 폴리(에틸렌-co-아크릴산), 폴리(에틸렌-co-말레산 무수물), 폴리(메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리(메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리(스티렌설폰산-co-말레산), 폴리(비닐 클로라이드-co-비닐 아세테이트-co-말레산), 탄수화물, 예컨대 일반적으로 헤파린, 헤파란 설페이트, 폴리(글루쿠론산), 폴리(갈락투론산), 히알루론산, 폴리(우론산), 또는 카복시-종결 덴드리머에 의해 제공된다. 이중에서, 다수의 글루탐산 또는 아스파르트산 단위를 포함하는 폴리(아미노산), 예컨대 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산) 및 폴리(메트)아크릴산이 바람직하다. 본 발명의 목적상 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산이 가장 바람직하다.
바람직하게는, 폴리머 주쇄는 (예컨대 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)를 통해 결정된 평균 중합 단위수 면에서) 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000의 중합도를 가진다.
본 발명에 따른 폴리머는 호모폴리머 또는 코폴리머에 의해 제공될 수 있다. 코폴리머는 폴리머 주쇄가 코폴리머가 되도록 상이한 구조를 가지는 중합 단위를 함유할 수 있다. 선택적으로, 코폴리머는 폴리머 주쇄로서, 중합 단위의 전부가 화학식 (II)의 그룹, 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 가지는 것은 아닌 호모폴리머에 기초해 수득될 수 있다. 또한 측쇄를 코폴리머 주쇄 내 특정 비율의 단위에 그래프팅함으로써 이들 두 가지 대안의 방법을 조합하는 옵션이 있음이 이해될 것이다. 코폴리머는 랜덤, 구배 또는 블록 코폴리머의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리머가 호모폴리머인 경우, 모든 중합 단위는 화학식 (II)의 그룹, 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 가진다. 본 발명에 따른 폴리머가 코폴리머인 경우, 모든 중합 단위의 5 내지 100%가 화학식 (II)의 그룹, 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 가지는 것이 바람직하고, 25 내지 100%를 가지는 것이 더욱 바람직하며, 특히 50 내지 100%를 가진다. 백분율은 모든 중합 단위에 대한 화학식 (II)의 그룹을 가지는 단위의 수로서 주어진다.
상기 코폴리머는 화학식 (II)의 그룹, 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태 외에도 측쇄 또는 말단 그룹을 가지는 다른 아민을 또한 함유할 수 있다. 그렇지만, 식 -NH-(CH2)x-(NH(CH2)2)y-NH2 (여기서 x는 1 내지 5의 정수를 나타내고 y는 1 내지 5의 정수를 나타냄)의 측쇄 또는 말단 그룹이 본 발명에 따른 폴리머에 포함되지 않는 것이 바람직하다.
화학식 (II), 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 측쇄를 가지는 바람직한 폴리아미드는 화학식 (V)의 반복 단위를 함유한다:
Figure pct00020
상기 식에서, 변수는 다음의 의미를 가진다:
R8 및 R9는 독립적으로 결합 및 C1-C6 알칸디일로부터 선택되고;
R10은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R11은 결합 및 C1-C6 알칸디일로부터 선택되고,
L1은 2가 연결 그룹이고,
A1은 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹을 나타낸다.
바람직하게는, R8 및 R9는 독립적으로 결합 및 C1-C5 알칸디일로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 결합이다. 바람직하게는, R10은 H 및 메틸로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 H이다. R11은 바람직하게는 C1-C6 알칸디일이다.
연결 그룹 L1은, 바람직한 실시양태에서, 구조 -Z1-R'-Z2-를 가지며, 여기서 Z1은 결합, -NH-(C=O)-, -NH-C(S)-NH-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-S(O)2-, -NH-CH2-C(OH)-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-, -CH=N-NH-(C=O)-, -S-S-, -티오에테르 결합-, -S-CH2-(C=O)-, -S-, -S-CH2-CH-NH2-, 및 -아릴 티오에테르 결합-으로부터 선택되고; R'는 결합, C1-C6 알칸디일 및 -(CH2-CH2-O)n-H로부터 선택되고 여기서 n은 1 내지 3이며; Z2는 결합, -(C=O)-, -NH-C(S)-, -NH-(C=O)-, -S(O)2-, -O-P(O)2-, -CH(OH)-CH2, -O-(C=O)- 및 -C(NH)-로부터 선택된다. 바람직하게는, Z1은 결합, -NH-(C=O)-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-로부터 선택되고; R'는 결합 및 C1-C6 알칸디일로부터 선택되고, Z2는 결합, -(C=O)-, -NH-(C=O)-, 및 -O-(C=O)-로부터 선택되되; 단, Z1 및 Z2의 하나는 결합이 아니다. L1에 대해 Z1 및 R'가 결합이고 Z2는 -(C=O)-이거나, 또는 Z1이 -NH-(C=O)-이고, R'는 C1-C6 알칸디일이며, Z2는 -(C=O)-인 것이 가장 바람직하다.
A1은 바람직하게는 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹에 대해 본원에서 정의된 바람직한 실시양태중 하나, 특히 화학식 (IIa) - (IId)의 그룹중 하나이다.
화학식 (V)의 반복 단위를 함유하는 바람직한 폴리아미드에서, 모든 중합 단위의 5 내지 100%가 화학식 (V)의 단위인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 25 내지 100%이고, 특히 50 내지 100%이다. 백분율은 모든 중합 단위에 대한 화학식 (V)의 단위수로 주어진다. 화학식 (V)의 변수에 대해 주어진 정의 및 바람직한 정의 내에서, 본 발명에 따른 폴리머중 화학식 (V)의 반복 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 특히 바람직한 폴리아미드 폴리머는 화학식 (Va) 및 (Vb)의 폴리머이다.
Figure pct00021
Figure pct00022
이들 화학식에서, R8, R9, R10, R11, L1 및 A1은 그의 바람직한 실시양태를 포함하여 화학식 (V)에 대해 정의된 바와 같다. R12는 OH 또는 C1-C6 알콕시, -NH2, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄, 또는 리셉터 리간드로부터 선택된다. R13은 H, 아미노 그룹에 대한 보호 그룹, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄, 또는 리셉터 리간드이고, X1은 H, -NH2, -COOH 및 -COOR"로부터 선택되고, R"는 C1-C6 알킬, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄, 또는 리셉터 리간드로부터 선택된다. 화학식 (Va)에서, s(예컨대 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 통해 결정된 평균 중합 단위수를 가리킨다)는 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000이다. 화학식 (Vb)에서, 괄호안의 단위는 특히 랜덤, 교번 또는 블록식 배열을 포함해 폴리머에서 임의의 순서로 배열될 수 있는 반복 단위이다. q+r 합(예컨대 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 통해 결정된 평균 중합 단위수를 가리킨다)은 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000이고, q/(q+r)의 비는 0.05 내지 1, 바람직하게는 0.25 내지 1, 및 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1의 범위이다.
화학식 (II)의 측쇄 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태에 의해 적절히 변형될 수 있는 예시적인 바람직한 폴리(아미노산)은 글루탐산, 아스파르트산, 오르니틴 및/또는 리신 단위를 가지는 폴리(글루탐산), 폴리(아스파르트산), 폴리리신, 폴리오르니틴 또는 폴리(아미노산)이다. 폴리(글루탐산)이 더욱 바람직하다.
화학식 (II) 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 측쇄를 가지는 탄소 쇄 주쇄를 포함한 바람직한 폴리머는 화학식 (VI)의 반복 단위를 함유한다:
Figure pct00023
상기 식에서, 변수는 다음의 의미를 가진다:
R14 및 R15는 독립적으로 결합 및 C1-C6 알칸디일로부터 선택되고;
R16은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R17은 결합 및 C1-C6 알칸디일로부터 선택되고,
L2는 2가 연결 그룹이고,
A1은 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹을 나타낸다.
바람직하게는, R14는 결합이고, R15는 결합 또는 -CH2-이다. 더욱 바람직하게는, R14는 결합이고, R15는 -CH2-이다. 바람직하게는, R16은 H 및 메틸로부터 선택된다. R17은 바람직하게는 결합 또는 -CH2-이다.
연결 그룹 L2는, 바람직한 실시양태에서, 구조 -Z3-R'-Z4-를 가지며, 여기서 Z3은 결합, -NH-(C=O)-, -NH-C(S)-NH-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-S(O)2-, -NH-CH2-C(OH)-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-, -S-S, -CH=N-NH-(C=O)-, -티오에테르 결합-, -S-CH2-(C=O)-, -S-, -S-CH2-CH-NH2-, 및 -아릴 티오에테르 결합-으로부터 선택되고; R'는 결합, C1-C6 알칸디일 및 -(CH2-CH2-O)n-H로부터 선택되고 n은 1 내지 3이며; Z4는 결합, -(C=O)-, -NH-C(S)-, -NH-(C=O)-, -S(O)2-, -O-P(O)2-, -CH(OH)-CH2, -O-(C=O)- 및 -C(NH)-로부터 선택된다. 바람직하게는, Z3은 결합, -NH-(C=O)-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-로부터 선택되고; R'는 결합 및 C1-C6 알칸디일로부터 선택되고, Z4는 결합, -(C=O)-, -NH-(C=O)-, 및 -O-(C=O)-로부터 선택되되; 단 Z3 및 Z4 중 하나는 결합이 아니다. L2에 대해 Z3 및 R'가 결합이고 Z4는 -(C=O)-인 것이 가장 바람직하다.
A1은 바람직하게는 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹에 대해 본원에서 정의된 바람직한 실시양태중 하나, 특히 화학식 (IIa) - (IId)의 그룹중 하나이다.
화학식 (VI)의 반복 단위를 함유하는 바람직한 폴리아미드에서, 모든 중합 단위의 5 내지 100%가 화학식 (VI)의 단위인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 25 내지 100%이고, 특히 50 내지 100%이다. 백분율은 모든 중합 단위에 대한 화학식 (VI)의 단위수로 주어진다. 화학식 (VI)의 변수에 대해 주어진 정의 및 바람직한 정의 내에서, 본 발명에 따른 폴리머중 화학식 (VI)의 반복 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
화학식 (II) 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 측쇄를 가지는 탄소 쇄 주쇄를 포함한 특히 바람직한 폴리머는 (VIa) 및 (VIb)의 폴리머이다.
Figure pct00024
Figure pct00025
이들 화학식에서, R14, R15, R16, R17, L2 및 A1은 그의 바람직한 실시양태를 포함하여 화학식 (VI)에 대해 정의된 바와 같다. X2는 -COOH 및 -COOR"로부터 선택되고, R"는 C1-C6 알킬, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄, 또는 리셉터 리간드이다. 화학식 (VIa)에서, s(예컨대 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 통해 결정된 평균 중합 단위의 수를 가리킨다)는 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000이다. 화학식 (VIb)에서, 괄호안의 단위는 특히 랜덤, 교번 또는 블록식 배열을 포함해 폴리머에서 임의의 순서로 배열될 수 있는 반복 단위이다. q+r 합(예컨대 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 통해 결정된 평균 중합 단위수를 가리킨다)은 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000이고, q/(q+r)의 비는 0.05 내지 1, 바람직하게는 0.25 내지 1, 및 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1의 범위이다.
화학식 (II) 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 측쇄에 의해 적절히 변형될 수 있는 탄소 쇄 주쇄를 가지는 예시적인 바람직한 폴리머는 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 또는 폴리말레산이고, 더욱 바람직하게는 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산이다.
화학식 (II) 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 측쇄를 가지는 바람직한 폴리사카라이드는 화학식 (VII)의 반복 단위를 함유한다:
Figure pct00026
상기 식에서, 변수는 다음의 의미를 가진다:
R19 및 R22는 독립적으로 결합 및 -(CH)2-로부터 선택되고;
t는 0 또는 1이고;
R18, R20 및 R21 중 하나는 -L3-A1을 나타내고, 여기서 L3은 2가 연결 그룹이고 A1은 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹을 나타내며, 다른 것들은 독립적으로 -H, -OH, 및 -(CH2)n-OH로부터 선택되고, 여기서 n은 1 또는 2이다.
바람직하게는, R19 및 R22는 결합이다. 바람직하게는, R18, R20 및 R21 중 하나는 -L3-A1을 나타내고, 여기서 L3은 2가 연결 그룹이고 A1은 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹을 나타내며, 다른 것들은 -OH이다.
연결 그룹 L3은, 바람직한 실시양태에서, 구조 -Z5-R'-Z6-을 가지며, 여기서 Z5는 결합, -NH-(C=O)-, -NH-C(S)-NH-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-S(O)2-, -NH-CH2-C(OH)-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-, -S-S, -CH=N-NH-(C=O)-, -티오에테르 결합-, -S-CH2-(C=O)-, -S-, -S-CH2-CH-NH2-, 및 -아릴 티오에테르 결합-으로부터 선택되고; R'는 결합, C1-C6 알칸디일 및 -(CH2-CH2-O)n-H로부터 선택되고 n은 1 내지 3이며; Z6은 결합, -(C=O)-, -NH-C(S)-, -NH-(C=O)-, -S(O)2-, -O-P(O)2-, -CH(OH)-CH2, -O-(C=O)- 및 -C(NH)-로부터 선택되되; 단 Z5 및 Z6 중 하나는 결합이 아니다. 바람직하게는, Z5는 결합, -NH-(C=O)-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-로부터 선택되고; R'는 결합 및 C1-C6 알칸디일로부터 선택되고, Z6은 결합, -(C=O)-, -NH-(C=O)-, 및 -O-(C=O)-로부터 선택되되; 단 Z5 및 Z6 중 하나는 결합이 아니다. L3에 대해 Z5 및 R'가 결합이고 Z6은 -(C=O)-인 것이 가장 바람직하다.
A1은 바람직하게는 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹에 대해 본원에서 정의된 바람직한 실시양태중 하나, 특히 화학식 (IIa) - (IId)의 그룹중 하나이다.
화학식 (VII)의 반복 단위를 함유하는 바람직한 폴리사카라이드에서, 모든 중합 단위의 5 내지 100%가 화학식 (VII)의 단위인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 25 내지 100%이고, 특히 50 내지 100%이다. 백분율은 모든 중합 단위에 대한 화학식 (VII)의 단위수로 주어진다. 화학식 (VII)의 변수에 대해 주어진 정의 및 바람직한 정의 내에서, 본 발명에 따른 폴리머중 화학식 (VII)의 반복 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
화학식 (II) 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 측쇄를 가지는 특히 바람직한 폴리사카라이드는 화학식 (VIIa)의 폴리머이다.
Figure pct00027
상기 화학식에서, R18, R19, R20, R21, R22 및 t는 그의 바람직한 실시양태를 포함하여 화학식 (VII)에 대해 정의된 바와 같다. s(예컨대 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 통해 결정된 평균 중합 단위수를 가리킨다)는 10 내지 10,000, 바람직하게는 50 내지 5,000이다.
화학식 (II) 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 측쇄에 의해 적절하게 변형될 수 있는 폴리사카라이드 주쇄를 가지는 예시적인 폴리머는 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트린, 사이클로덱스트린, 키틴, 키토산, 이눌린, 풀루란, 스클레로글루칸, 커들란, 칼로스, 라미나린, 크리솔라미나린, 자일란, 아라비노자일란, 만난, 후코이단 및 갈락토만난, 프로테오글리칸, 폴리글루쿠로난, 폴리글루쿠로난, 셀로우론산, 키토우론산, 폴리우론산, 펙틴, 글리코사미노글리칸, 헤파린, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 히알루론산 한천, 알긴산 나트륨, 알긴산, 아라비아 검, 카라기난, 푸코이단, 푸코갈락탄, 키토비오스 옥타아세테이트, 키토트리오스 운데카아세테이트, 말토올리고사카라이드이다. 키토산, 하이드록시에틸 전분, 덱스트란, 덱스트린, 사이클로덱스트린류(α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린 및 δ-사이클로덱스트린)이 바람직하다.
그의 분지형 구조에 다수의 화학식 (II)의 말단 그룹 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 함유하도록 변형될 수 있는 다양한 덴드리머 구조는 당업계에 공지이며, 예를 들면 폴리아미도아민(PAMAM)(Tomalia et al. 1990, Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 29, 138-175) 또는 파쇄 PAMAM(Tang et al, 1996, Bioconjug. Chem. 7, 703-714), 폴리아민(Hawker et al. 1990, J. Am. Chem. Soc. 112, 7638-7647), 폴리아미드 (폴리펩티드)(Sadler et al. 2002, J. Biotechnol. 90, 195-229), 폴리(아릴 에테르)(Hawker et al. 1990, J. Am. Chem. Soc. 112, 7638-7647), 폴리에스테르(Ihre et al. 1996, J. Am. Chem. Soc. 118, 6388-6395, Grinstaff et al. 2002, Chemistry 8, 2838-2846), 탄수화물(Turnbull et al. 2002, J. Biotechnol. 90, 231-255), DNA(Nilsen et al. 1997, J. Theor. Biol. 187, 273-284, Li et al., 2004, Nat. Mater. 3, 38-42), 지질(Ewert et al. 2006, Bioconjug Chem. 17, 877-88), 폴리(에테르 이민)(Thankappan et al. 2011, Bioconjug Chem. 22, 115-9.) 트리아진(Lim et al. 2012, Adv Drug Deliv Rev. 15, 826-35) 및 폴리글리세롤(Fischer et al. 2010, Bioconjug Chem. 21, 1744-52)을 들 수 있다.
말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 그룹 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 포함하는 올리고머가 또한 다수의 상기 그룹이 다수의 화학식 (II)의 그룹 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 부착을 위해 적합한 관능 그룹을 제공하는 다관능성 코어 구조에 말단 그룹으로서 공유적으로 부착된 올리고머도 포함하는 것이 이해될 것이다. 이들 다관능성 코어 구조는 특히 2가, 3가 또는 보다 고가의 카복실산 또는 폴리아민을 포함한다. 필요에 따라, 다관능성 코어 구조의 관능 그룹은 화학식 (II)의 그룹 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 그룹들의 부착을 허용하기 위해 연결 그룹으로 활성화되거나, 이와 반응할 수 있다. 다수의 이러한 그룹을 가지도록 변형될 수 있는 예시적인 분지형 코어 구조는 하기 화학식 (VIIIa-g)로 나타내어진다:
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
당업자들이 알고 있는 바와 같이, 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 그룹 (II) 또는 화학식 (IIa) - (IId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 포함하는 폴리머 또는 올리고머는 커플링 화학을 따르는 관능 그룹을 포함하거나, 포함하도록 변형되는 폴리머 주쇄에 올리고(알킬렌 아민)을 커플링하는 것을 통해 다양한 합성 경로로 용이하게 수득할 수 있다. 이같은 관능 그룹은 -COOH, -CO-, -CHO, -SO3H, -PO4H, -NH-, -NH2, -OH, 또는 -SH를 포함한다. 이해할 수 있는 바와 같이, 화학식 (II)의 측쇄 및/또는 말단 그룹을 함유하는 본 발명에 따른 폴리머 또는 올리고머를 제공하기 위해 그의 중합 전에 화학식 (II)의 그룹을 가지는 적합한 모노머를 것이 변경하는 것이 또한 가능할 수 있다. 그렇지만, 폴리머의 변경이 일반적으로 바람직하다.
예를 들어, 카복실산 그룹을 포함하는 모 폴리머(즉, 본 발명에 따른 폴리머중에 폴리머 주쇄를 제공하는 폴리머)는, 필요한 경우, 화학식 (II)의 측쇄 및/또는 말단 그룹을 제공하기 위해 예컨대 카보디이미드를 사용한 활성화 및 하기 화학식 (pre-II) (여기서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은 화학식 (II)에 대해 정의된 바와 같다)의 올리고(알킬렌 아민)과의 후속 아미드 결합 형성에 의해 직접 커플링될 수 있다.
Figure pct00031
필요하다면, 화학식 (pre-II)의 화합물은 예를 들어 WO2006/138380호에 기술된 바와 같은 아미노 그룹에 대한 통상적인 보호 그룹, 바람직하게는 t-부톡시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 또는 카보벤질옥시(Cbz)를 사용하여 그의 말단 및/또는 내부 이차 아미노 그룹중 하나 또는 모두에서 보호될 수 있다.
이러한 반응은 바람직하게는 가교-결합 반응을 원치않는 경우, 모 폴리머의 카복실산 그룹에 비해 과량의 화학식 (pre-II)의 올리고(알킬렌 아민)의 반응성 아미노 그룹의 존재하에 수행된다. 모 폴리머의 타입에 따라, 커플링 반응은 수성 또는 유기 용매중에서 수행될 수 있다. 적합한 커플링 조건은 펩티드 및 바이오컨쥬게이트 화학 업계에 주지이다(Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2nd Edition, Academic Press 2008). 위에서 언급한 바와 같이, 적합한 폴리머 주쇄는 다수의 글루탐산 또는 아스파르트산 단위를 포함하는 폴리(아미노산), 예컨대 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산), 단백질, 폴리알킨, 폴리아민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리말레산, 폴리설포네이트, 폴리스티렌 설포네이트, 폴리포스페이트, 펜토산 폴리설페이트, 폴리(비닐 인산), 폴리(부타디엔-co-말레산), 폴리(에틸 아크릴레이트-co-아크릴산), 폴리(에틸렌-co-아크릴산), 폴리(에틸렌-co-말레산 무수물), 폴리(메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리(메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리(스티렌설폰산-co-말레산), 폴리(비닐 클로라이드-co-비닐 아세테이트-co-말레산), 일반적으로 헤파린, 헤파란 설페이트, 폴리(글루쿠론산), 폴리(갈락투론산), 히알루론산, 폴리(우론산)과 같은 탄수화물, 또는 카복시-종결 덴드리머를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 실시양태의 경우, 화학식 (II)의 측쇄 및/또는 말단 그룹을 포함하는 폴리머는 모 폴리머의 환원적 아민화로 수득할 수 있다. 탄수화물 또는 당은 알데하이드로 산화되고, 이어 올리고(알킬렌 아민)과의 반응으로 이민으로 이어지며 예를 들어 소듐 시아노보로하이드라이드로의 환원으로 아민이 형성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 올리고(알킬렌 아민)은 제1 단계에서 모 폴리머중 하이드록실 및 아미노 그룹에 커플링될 수 있는, 예컨대 화학식 (pre-II')의 카복시-종결 올리고(알킬렌 아민)으로 유도체화될 수 있다:
Figure pct00032
상기 식에서, u는 1 내지 6의 정수이고, L'는 결합 또는 -(CH)2-이며, 다른 변수들은 화학식 (II)에 대해 정의된 바와 같다. 필요에 따라, 예를 들어 WO2006/138380호에 기술된 바와 같은 아미노 그룹에 대한 통상적인 보호 그룹, 바람직하게는 t-부톡시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 또는 카보벤질옥시(Cbz)를 사용하여 화학식 (pre-II) 또는 (pre-II')의 화합물중의 임의의 말단 및/또는 내부 이차 아미노 그룹(들)이 보호될 수 있다.
이 목적을 위해, 올리고(알킬렌 아민)을 디카복실산산 무수물, 디카복실산 또는 알데하이드와 반응시켜 구조 (pre-II')를 제공할 수 있다. 직교 보호 그룹을 가지는 올리고(알킬렌 아민) (pre-II)에 아민을 제공하지 않고 구조 (pre-II')를 수득할 수 있더라도, 이와 같이 하는 것이 바람직할 수 있다. 구조 (pre-II')는 예를 들면 아미드 결합 형성으로 이어지는 직접 커플링에 의해 폴리(리신), 폴리(오르니틴) 또는 폴리(비닐아민)의 변형을 허용한다. 커플링 반응이 완료되면, 임의의 보호 그룹이 통상의 방법을 통해 제거될 수 있다. 이어 생성된 폴리머는 예를 들어 투석 또는 이온 교환 또는 크기 배제 또는 역상 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
중간체 및 최종 생성물은 아민 보호 그룹이 제거된 후, 그리고 덴드리머의 경우에는 최종 커플링 단계 전에 침전, 투석 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
화학식 (III) 또는 화학식 (IIIa) - (IIId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 다수의 반복 단위를 함유하는 폴리머 또는 올리고머는 선형, 분지형, 또는 가교형 폴리머, 또는 수지상 폴리머(덴드리머)일 수 있다. 바람직하게는, 화학식 (III) 또는 화학식 (IIIa) - (IIId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 다수의 반복 단위를 함유하는 폴리머 또는 올리고머는 폴리머 또는 올리고머 내 총 반복 단위수에 대한 화학식 (III)의 단위수를 기초로 하여 이러한 반복 단위를 적어도 25%, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 함유한다. 화학식 (III) 또는 화학식 (IIIa) - (IIId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 다수의 반복 단위를 함유하는 폴리머 또는 올리고머중 모든 반복 단위의 50% 이상이 이러한 단위인 것이 특히 바람직하다. 잔여 반복 단위는 화학식 (III) 또는 화학식 (IIIa) - (IIId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 반복 단위, 특히 2가, 3가 또는 보다 고가의 카복실산으로부터 유도된 단위의 커플링을 허용하는 분자에 의해 제공된다.
화학식 (III) 또는 화학식 (IIIa) - (IIId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 다수의 반복 단위를 함유하는 폴리머 또는 올리고머는 하기 화학식 (pre-III)의 화합물을 사용하거나:
Figure pct00033
[상기 식에서, "pre"는 화학식 (pre-III)이 화학식 (III)의 전구체임을 가리키고, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는 화학식 (III)에 대해 정의된 바와 같으며, R6은 그의 바람직한 실시양태를 포함하여 화학식 (II)에 대해 정의된 바와 같다], 또는 바람직하게는 화학식 (pre-IIIa) - (pre-IIId)의 화합물 (여기서, 변수는 각각 화학식 (IIIa), (IIIb), (IIIc) 또는 (IIId)에서 정의된 바와 같다)을 사용하여 적절히 수득할 수 있다:
Figure pct00034
말단 아민 그룹을 가지는 이들 화합물을 통상적인 커플링 반응을 이용하여 연결하여 선형, 분지형, 가교형 또는 수지상 폴리머를 형성할 수 있다. 이러한 커플링 반응에서 반응물로서 사용될 수 있는 적합한 화합물은 2가, 3가 또는 보다 고가의 카복실산을 포함한다. 상업적으로 입수할 수 있고 각각 화학식 (pre-III), (pre-IIIa), (pre-IIIb), (pre-IIIc) 및 (pre-IIId)의 링커 화합물과 반응할 수 있는 예시적인 화합물은 하기 화학식 (VIIIa-g)로 나타내어진다:
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
다가 카복실산과 디아민의 직접 반응이 편의상 수행될 수 있지만, 링커 화합물이 카복실산 그룹 (또는 그의 활성화 형태)을 제공하는 것으로 한정되지 않음이 이해될 것이다. 예를 들어, 디카복실산, 예컨대 숙신산으로 화학식 (pre-III)의 화합물의 디-아미드를 형성한 후에 화학식 (VIIIg)의 화합물을 화학식 (pre-III)의 화합물과 반응시킬 수 있다.
또한, 예컨대 화학식 (pre-II')의 화합물의 제조에 대해 상술한 바와 같이, 올리고(알킬렌 아민)을 제1 단계에서 유도체화하여 화학식 (pre-III')의 카복시-종결 올리고(알킬렌 아민)을 제공할 수 있다:
Figure pct00038
상기 식에서, u는 1 내지 6의 정수이고, L"는 결합 또는 -(CH)2-이며, 다른 변수들은 화학식 (III)에 대해 정의된 바와 같고, R6은 화학식 (II)에 대해 정의된 바와 같다. 필요에 따라, 화학식 (pre-III')의 화합물중의 임의의 내부 이차 아미노 그룹(들)은 예를 들어 WO2006/138380호에 기술된 바와 같은 아미노 그룹에 대한 통상적인 보호 그룹, 바람직하게는 t-부톡시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 카보벤질옥시(Cbz)를 사용하여 보호될 수 있다. 잔여 말단 아미노 그룹 -NR5R6이 비보호된 형태/카복실산 그룹과의 아미드 형성을 허용하는 형태로 존재하는 경우, 화학식 (pre-III')의 화합물을 중합 또는 올리고머화하여 반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 올리고(알킬렌 아민) 그룹, 또는 화학식 (IIIa) - (IIId)를 비롯한 바람직한 실시양태를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 제공할 수 있다. 이러한 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있다.
예를 들어, 구조 (pre-III')는 랜덤 중합에 의해 또는 정의된 방식으로 분지형 구조를 형성하는 데에 사용될 수 있다. 공중합은 임의로 보호된 내부 아미노 그룹을 가지는 올리고(알킬렌 아민)과 폴리-카복실산 (VIIIa-VIIIg)의 혼합물로 수성 또는 유기 용매중에서 카보디이미드 활성화에 의해 동일계에서 활성화될 수 있다.
반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 그룹 또는 화학식 (IIIa) - (IIId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 함유하는 덴드리머는 또한 예컨대 다가 커플링 분자를 사용하여 제조될 수도 있다. 덴드리머는 중심 코어로부터 방사적으로 뻗어나와 나무를 연상시키는 다수의 완전 분지형 모노머로 구성된 폴리머 분자이며, 그에서 덴드리머(그리스어, dendra)라는 이름이 파생되었다. 덴드리머의 코어가 제거되면, 덴드론이라 불리는 많은 동일한 단편이 남고, 덴드론의 수는 다수 중심 코어(2, 3, 4 또는 그 이상)에 따른다. 덴드론은 3개의 상이한 영역으로 나뉠 수 있다: 코어, 내부 (또는 분지) 및 주변부 (또는 종결 또는 말단 그룹). 덴드론의 코어로부터 그의 주변부로 바깥쪽으로 이동시 발생하는 분기점의 수가 그의 세대(G-1, G-2, G-3)를 정의한다; 더 높은 차수의 덴드리머일수록 더 낮은 차수의 덴드리머 보다 그의 주변부에 더 크고 더 많은 종결 그룹을 가진다.
합성은 지수적 성장으로 이어지는 확산, 또는 덴드론이 별도로 성장하여 최종 단계에서 코어에 부착되는 수렴중 어느 하나일 수 있다. 덴드리머는 고상 폴리펩티드 및 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 사용되는 방법과 유사한 단계식으로 제조되며, 따라서 생성물은 쇄 성장이 통계적이고 다분산 생성물이 얻어지는 종래 폴리머 합성과 달리 크기가 이론상 단분산이다. 합성 재현가능성뿐만 아니라, 또한 실험적 및 치료적 변동성을 줄이기 위해 단분산 생성물이 매우 바람직하다. 실제로, 저-세대 덴드리머(G-3 이하)에 대해서는 단분산 생성물을 용이하게 수득할 수 있지만, 더 높은 세대에서는 구조적으로 매우 유사한 사소한 결함을 가지는 덴드리머로부터 완벽한 덴드리머를 정제하는 것이 불가능하기 때문에, 전형적으로 조금이긴 하지만 절대적인 단분산성으로부터 벗어나게 된다.
다수의 화학식 (III)의 올리고(알킬렌 그룹) 또는 화학식 (IIIa) - (IIId)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 포함하는 본 발명에 따른 폴리머로서 바람직한 덴드리머는 G1 내지 G10, 더욱 바람직하게는 G2 내지 G8 및 특히 G3 내지 G6 범위의 다수의 세대들을 가진다. (반응 단계에서 결합된 반응물에 기초하여 계산될 수 있는) 이들 덴드리머의 분자량은 바람직하게는 1,500 내지 1,000,000, 더욱 바람직하게는 3,000 내지 230,000, 특히 6,000 내지 60,000 및 가장 바람직하게는 15,000 내지 30,000의 범위이다.
정의된 폴리(아미도 아민) 덴드리머의 생성을 위해 (보호된) 구조 (pre-III) 및/또는 (pre-III')가 문헌(예컨대 Lee et al. 2005, Nat Biotechnol 23, 1517 - 1526)에 이미 기술된 바와 같이 분지형 코어의 단계식 생성에 사용될 수 있다. 스타터 분자로서 디-카복실산, 무수물 또는 아크릴산 또는 폴리-카복실산 (예컨대 VIIIa - VIIIg)에 의해 활성화된 올리고(알킬 아민) (예컨대 pre-III)이 사용될 수 있다. 이 코어는 구조 (pre-III)의 올리고(알킬 아민)과의 단계식 반응을 위해 사용된 후, 정제되고, 말단 아미노 그룹이 예컨대 아크릴산에 의해 활성화된다. 정제 후, 이 코어는 올리고(알킬렌 아민)의 추가 층을 첨가하는데 사용될 수 있다. 덴드리머를 수득하기 위한 반응 조건은 문헌에 상세히 기술되었다(예를 들어 Lee et al.의 인용 텍스트 및 여기에 포함된 참고문헌 참조).
추가 실시양태에 따라, 양 측에서 카복시 그룹으로 종결된 올리고(알킬렌 아민)은 한쪽이 보호될 수 있고/있거나, 내부 아민이 필요에 따라 보호될 수 있고, 말단에 아민 그룹을 가지는 디아민 또는 수지상 스타터 구조, 또는 올리고(알킬렌 아민) 자체와 공중합될 수 있다.
중간체 및 최종 생성물은 아민 보호 그룹이 제거된 후, 그리고 덴드리머의 경우에는 최종 커플링 단계 전에 침전, 투석 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, WO 2011/154331호 및 문헌(Schaffert et al. 2011, Angew Chem Int Ed Engl 50(38), 8986-9)에 기술된 것과 유사하게, 말단 카복시 그룹 (또는 그의 적절히 보호된 또는 활성화된 형태) 및 말단 아미노 그룹 (또는 그의 적절히 보호된 형태)을 가지는 올리고(알킬렌 아민), 예컨대 화학식 (pre-III')의 올리고(알킬렌 아민)이 완전히 정의된 펩티드성 선형 또는 분지형 구조의 단계식 생성을 위해 사용될 수 있다. 단계식 반응은 펩티드 화학의 원리에 따라 수행될 수 있으며, 자동 펩티드 합성기에서 행해질 수 있다. 펩티드 합성 분야의 숙련자에 주지된 바와 같이, 리신 또는 오르니틴과 같은 디-아미노산이 분지형 구조를 구축하는데 사용될 수 있다. 따라서, 각종 선형 및 분지형 호모폴리머, 또한 폴리머의 원하는 위치에 화학식 (I)의 상이한 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 헤테로폴리머가 제공될 수 있다. 또한, 표준 아미노산이 이렇게 정의된 구조 내 임의의 위치에 도입될 수 있다.
화학식 (IV)의 리피도이드, 및 화학식 (IVa), (IVb) 및 (IVc)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태의 제조를 위해, US 2010/0331234 A1호, US 8,450,298호; Love et al. 2010, PNAS 107, 1864-1869; WO2006/138380호; Akinc et al. 2008, Nat Biotechnol 26, 561-569에 기술된 것과 유사한 방법이 이용될 수 있다.
예를 들어, 화학식 (IV)의 리피도이드, 및 화학식 (IVa), (IVb) 및 (IVc)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태는 R7-에폭사이드 또는 R7-O-(C=O)-CH=CH2 또는 R7-NH-(C=O)-CH=CH2 또는 R7-(C=O)-H를 화학식 (pre-IV)의 올리고(알킬렌 아민)과 반응시켜 유도할 수 있다.
Figure pct00039
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n은 화학식 (IV)에서와 같이 정의되고, R2 내지 R6은 서로 독립적으로 수소 또는 아미노 그룹에 대한 보호 그룹이고, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다. 바람직하게는, R7은 C8-C16 알킬 또는 알케닐, 더욱 바람직하게는 C8-C12 알킬 또는 알케닐 및 가장 바람직하게는 C10-C12 알킬 또는 알케닐로부터 선택된다. 유리하게는, 한 단부가 에폭사이드, 아크릴레이트, 알데하이드의 아크릴아미드로 종결된 다수의 지방족 화합물이 상업적으로 입수가능하다.
바람직하게는, 화학식 (IV)의 리피도이드는 올리고(알킬렌 아민) (pre-IV')로부터 제조된다.
Figure pct00040
더욱 바람직하게는, 화학식 (pre-IV)의 전구체는 4개 이상의 아미노 그룹을 가진다. 가장 바람직하게는, 화학식 (IV)의 리피도이드는 올리고(알킬렌 아민) (pre-IV")로부터 제조된다.
Figure pct00041
반응은 용매의 존재 또는 부재 하에 50℃ 내지 90℃의 승온에서 수행될 수 있다. 적합한 용매는 예를 들어 CH2Cl2, CH2Cl3, 메탄올, 에탄올, THF, 헥산, 톨루엔, 벤젠 등이다.
예를 들어 WO2006/138380호에 기술된 바와 같이, 화학식 (pre-IV')의 올리고(알킬렌 아민) 내 질소에 직교 보호 그룹이 제공될 수 있음은 당업자들에게 주지이다.
Figure pct00042
이 문맥에서 보호 그룹은 화학식 (pre-IV')의 화합물에 있는 하나 또는 수개의 질소를 일시적으로 봉쇄하기에 적합하기 때문에, 반응은 동일한 분자 내의 다른 비보호된 질소에서 선택적으로 수행될 수 있다. 반응 후, 보호 그룹은 동일한 분자 내의 질소 원자에 연결된 다른 잔기들에 영향을 주지 않는 화학 반응에 의해 제거된다. 직교 보호 그룹은 주어진 분자 내 보호 그룹의 한 타입에 특정적으로 영향을 미치는 화학 반응에 의해 선택적으로 제거될 수 있는 상이한 보호 그룹이다. 예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같이, 화학식 (pre-IV')의 올리고(알킬렌 아민) 내의 일차 말단 아미노 그룹은 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 보호 그룹으로 선택적으로 보호될 수 있고, 그에 반해 내부 이차 아민은 t-부톡시카보닐(Boc) 보호 그룹으로 보호될 수 있다. Fmoc 그룹은 선택적으로 염기에 의해, Boc 보호 그룹은 산에 의해 제거될 수 있다. 보호 및 부분적으로 보호된 중간체는 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다. 따라서, 직교 보호 그룹의 정해진 위치 지정 및/또는 선택적 제거에 의해, 예를 들어, 내부 이차 아미노 그룹 모두 또는 일부 또는 두 원자가의 말단 일차 아미노 그룹의 모두 또는 일부를 선택적으로 반응시켜 한 단부가 에폭사이드 또는 아크릴레이트 또는 아크릴아미드로 종결된 지방족 쇄를 가지는 화학식 (pre-IV')의 올리고(알킬렌 아민)을 제공하는 것이 가능하다. 동일한 원리에 의해 복수 종의 R7-에폭사이드 또는 R7-O-(CO)-CH=CH2 또는 R7-NH-(CO)-CH=CH2 또는 R7-(CO)-H를 커플링하여 말단 에폭사이드, 아크릴레이트, 아크릴아미드 또는 알데하이드에 알킬 또는 알케닐 및 지방족 쇄 길이 면에서 상이한 타입의 잔기 R7로 칭해지는 "종"을 가지는 화학식 (pre-IV')의 올리고(알킬렌 아민)을 제공하는 것이 가능하다. 이러한 반응에서 화학식 (pre-IV')의 올리고(알킬렌 아민)의 유도화 정도는 선행업계에 기술된 바와 같이 반응물의 화학양론으로 제어할 수 있다. 보호 그룹의 제거 후, 질소 원자의 잔여 원자가를 구아니디늄 그룹 (-C(NH)-NH2), 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄 또는 리셉터 리간드 부착에 이용할 수 있다. 화학식 (IV)의 리피도이드는 침전, 추출 또는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 화학식 (IV)의 리피도이드가 보호 그룹을 사용하여 제어된 단계식 반응으로 제조될 수 있고 화학식 (pre-IV')의 올리고(알킬렌 아민)의 유도화 정도가 반응물의 화학양론으로 제어될 수 있다는 선택성에 기초해, 본 발명의 리피도이드는 일차, 이차, 삼차, 및/또는 사차 아민, 및 그의 염을 함유할 수 있다. 이에 의해, RNA를 결합시키고 조밀화하고 보호하는데 적합한 화학식 (IV)의 양이온성 리피도이드를 제공하기 위해 화학식 (IV)의 하나 이상의 질소 원자가 프로톤화될 수 있도록, 리피도이드의 pKa 값이 또한 합리적인 유도화 정도의 설계로 조정될 수 있다. 또, pKa 값은 화학식 (IV)의 하나 이상의 질소 원자가 산성 pH에서 완충 능력을 가질 수 있고 세포에서의 엔도사이토틱 섭취시 프로톤 스폰지 효과를 발휘할 수 있도록 조정될 수 있다. 바람직하게는, 화학식 (IV)의 리피도이드의 pKa 값은 3.0 내지 9.0이고, 더욱 바람직하게는 적어도 하나의 pKa 값은 5.0 내지 8.0이다.
화학식 (IV)의 리피도이드를 제공하기 위해 화학식 (pre-IV')의 올리고(알킬렌 아민)에 커플링될 수 있는 지방족 측쇄의 최대 수는 (p + 1) × m + n + 3이고, 최소 수는 1이며, 여기서 p, m 및 n은 화학식 (IV)에서 정의된 바와 같다. 바람직하게는, 잔기 R1 내지 R6 중 어떤 것도 수소 이외의 것 또는 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-C(O)-O-R7, -CH2-CH2-C(O)-NH-R7 또는 -CH2-R7이 아니라면, 지방족 측쇄의 수는 적어도 2이고, 최대 (p + 1) × m + n + 2이며, 바람직하게는 잔기 R1 내지 R6 중 하나가 아미노 그룹에 대한 보호 그룹 또는 -C(NH)-NH2 또는 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄 또는 리셉터 리간드라면, 지방족 측쇄의 수는 최대 (p + 1) × m + n + 1이다.
핵산
본 발명의 조성물은 핵산, 바람직하게는 RNA, 더욱 더 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 포함한다.
용어 "핵산"은 자연적으로 발생한 핵산 타입뿐만 아니라, 화학적으로 및/또는 효소적으로 합성된 핵산의 모든 형태를 포함하고, 또한 핵산 유사체 및 핵산 유도체, 예컨대 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 올리고뉴클레오시드 티오포스페이트 및 포스포트리에스테르, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 양이온성 올리고뉴클레오티드(US6017700 A호, WO/2007/069092호), 치환된 리보-올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트도 포함한다. 또, 용어 "핵산"은 또한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 임의의 분자를 칭하기도 한다. 본 발명의 조성물에 포함된 핵산의 서열 또는 크기에 제한은 없다. 핵산은 대개 본 발명의 조성물이 전달되는 생물학적 표적에서 달성되는 생물학적 효과에 의해 정의된다. 예컨대, 유전자 또는 핵산 요법에 적용 시, 핵산 또는 핵산 서열은 발현될 유전자 또는 유전자 단편에 의해, 또는 결함 유전자 또는 임의의 유전자 표적 서열의 목적하는 치환 또는 수리에 의해, 또는 저해, 녹다운 또는 하향 조절되는 유전자의 표적 서열에 의해 정의될 수 있다.
바람직하게는, 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. RNA와 관련하여, 원칙적으로 임의의 타입의 RNA가 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직한 일 실시양태에서 RNA는 단일가닥 RNA이다. 용어 "단일가닥 RNA"라는 것은 분리된 쇄의 하이브리드화로 인해 2개 이상의 분리된 쇄가 이중가닥 분자를 형성하는 RNA 분자에 대조적으로, 리보뉴클레오티드의 단일 연속 쇄를 의미한다. 용어 "단일가닥 RNA"는 루프와 같은 자체가 이중가닥인 구조, 이차 또는 삼차 구조의 단일가닥 분자 형태를 배제하지 않는다.
용어 "RNA"는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA뿐만 아니라 아미노산 서열을 코딩하지 않는 RNA도 포함한다. 게놈의 80% 이상이 단백질을 코딩하지 않는 기능적 DNA 요소를 포함하는 것이 제안되었다. 이들 비코딩화 서열은 조절 DNA 요소(전사 인자, 조절인자 및 공조절인자 등에 대한 결합 부위) 및 결코 단백질로 번역되지 않는 전사체를 코딩하는 서열을 포함한다. 게놈에 의해 코딩되고, RNA로 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 이들 전사체는 비코딩 RNA(ncRNA)로 불린다. 따라서, 일 실시양태에서 RNA는 비코딩 RNA이다. 바람직하게는, 비코딩 RNA는 단일가닥 분자이다. 연구에 따르면 ncRNA가 유전자 조절, 게놈 무결성의 유지, 세포 분화 및 발달에 중요한 역할을 하고 다양한 인간 질병에서 잘못 조절된다고 입증되었다. 짧은 (20 ~ 50 nt) ncRNA, 중간 (50 ~ 200 nt) ncRNA 및 긴 (> 200 nt) ncRNA와 같은 상이한 타입의 ncRNA가 있다. 짧은 ncRNA는 마이크로RNA(miRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), piwi-상호작용 RNA(piRNA) 및 전사 개시 RNA(tiRNA)를 포함한다. 중간 ncRNA의 예로는 작은 핵 RNA(snRNA), 작은 핵소체 RNA(snoRNA), 운반 RNA(tRNA), 전사 개시-부위-관련 RNA(TSSaRNA), 프로모터-관련 작은 RNA(PASR), 및 프로모터 상류 전사체(PROMPT)가 있다. 긴 비코딩 RNA(IncRNA)는 긴 유전자 간 비코딩 RNA(lincRNA), 안티센스-lncRNA, 인트론 IncRNA, 전사된 초고보존 RNA(T-UCR) 등(Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. 2014 Mar 26. doi: 10.1002/cmdc.201300534)을 포함한다. 상술된 비코딩 RNA 중 siRNA 만이 이중가닥이다. 따라서, 바람직한 실시양태예에서 비코딩 RNA는 단일가닥이기 때문에, 비코딩 RNA가 siRNA가 아닌 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서 RNA는 코딩 RNA, 즉 아미노산 서열을 코딩하는 RNA이다. 이러한 RNA 분자는 또한 mRNA(메신저 RNA)로서 지칭되고, 단일가닥 RNA 분자이다. 핵산은 당업자들에게 알려진 화학적 및 효소적 합성 방법에 의해, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 또는 이들의 조합이 수행될 수 있다. 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드는 임의로 비천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 단일 또는 이중 또는 삼중 가닥일 수 있다. "핵산"은 또한 센스 및 안티센스 올리고- 또는 폴리 뉴클레오티드, 즉, DNA 및/또는 RNA의 특이적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
바람직하게는, 용어 핵산은 mRNA, 가장 바람직하게는 변형된 mRNA를 의미한다.
메신저 RNA(mRNA)는 주로 뉴클레오시드로서 아데노신, 사이티딘, 유리딘 및 구아노신을 함유하는 뉴클레오시드 인산염 빌딩 블록으로 구성된 폴리머인데, 이는 중간 캐리어로서, 유전 정보를 세포 핵 중에 있는 DNA로부터, 단백질 번역이 일어나는 세포질로 전달한다. 따라서, 상기 메신저 RNA는 유전자 발현을 위한 대안으로서 적합하다.
본 발명과 관련하여, mRNA라는 것은 그가 세포에 도입된 경우, 단백질 또는 그의 단편을 발현하는데 적합하거나, 단백질 또는 그의 단편으로 번역될 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 "단백질"이라는 용어는 임의 타입의 아미노산 서열, 즉, 2가지 이상의 아미노산 각각이 펩티드 결합으로 연결되어 있는 쇄를 함유하며, 이는 또한 펩티드 및 융합 단백질도 포함한다.
mRNA는, 세포에서 또는 세포 주변에서 그의 작용을 필요로 하거나, 그의 작용이 유익한 단백질 또는 그의 단편, 예를 들어, 그의 부족 또는 결손 형태가 질환 또는 질병에 대한 촉발제가 되거나, 그의 제공을 통해 질환 또는 질병을 완화 또는 예방할 수 있는 단백질, 또는 세포에서 또는 세포 주변에서 신체에 유익한 과정을 촉진시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 리보뉴클레오티드 서열을 함유한다. mRNA는 완전 단백질 또는 그의 기능성 변이체에 대한 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 리보뉴클레오티드 서열은 인자, 유도제, 조절인자, 자극인자 또는 효소로서 작용하는 단백질, 또는 그의 기능성 단편을 코딩할 수 있는데, 여기서, 상기 단백질은 그의 기능이 장애, 특히, 대사 장애를 치료하는데, 또는 예를 들어, 새로운 혈관, 조직 형성 등과 같은 생체내 과정을 개시하는데 필요한 것이다. 여기서, 기능성 변이체는 세포에서 그의 기능을 필요로 하는 것이거나, 그의 부족 또는 결손 형태가 병적인 것인 단백질의 기능을 세포에서 착수할 수 있는 것인 단편을 의미하는 것으로서 이해하여야 한다. 추가로, mRNA는 또한 기능성 영역 및/또는 3' 또는 5' 비코딩 영역을 추가로 가질 수 있다. 3' 및/또는 5' 비코딩 영역은 단백질 코딩 서열의 측면에 자연적으로 위치하는 영역, 또는 RNA의 안정화에 기여하는 다른 인공 서열일 수 있다. 당업자는 각 경우에서 통상의 실험에 의해 상기 목적에 적합한 서열을 찾아낼 수 있다.
바람직한 실시양태에서, mRNA는 특히 번역을 개선시키기 위해 m7GpppG 캡, 내부 리보좀 진입 부위(IRES) 및/또는 3' 말단에 폴리A 테일을 함유한다. mRNA는 번역을 촉진시키는 추가 영역을 가질 수 있다.
바람직한 실시양태에서, mRNA는 변형 및 비변형된 뉴클레오티드의 조합을 함유하는 mRNA이다. 바람직하게는 이는 WO2011/012316호에 기술된 바와 같은 변형 및 비변형된 뉴클레오티드의 조합을 함유하는 mRNA이다. 여기에 기술된 mRNA는 안정성이 증가되고, 면역원성이 감소된 것으로 보고되었다. 바람직한 실시양태에서, 이와 같이 변형된 mRNA에서 5 내지 50%의 사이티딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%의 유리딘 뉴클레오티드가 변형된다. 아데노신- 및 구아노신-함유 뉴클레오티드는 비변형된 것일 수 있다. 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 비변형 또는 부분 변형될 수 있으며, 바람직하게는 비변형된 형태로 존재한다. 바람직하게는 10 내지 35%의 사이티딘 및 유리딘 뉴클레오티드가 변형되고, 특히 바람직하게는 변형 사이티딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25%의 범위이고, 변형된 유리딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25%의 범위이다. 실제로 상대적으로 낮은 함량, 예를 들어, 각각 단지 10%의 변형된 사이티딘 및 유리딘 뉴클레오티드가 원하는 특성을 달성할 수 있는 것으로 나타났다. 변형된 사이티딘 뉴클레오티드가 5-메틸사이티딘 잔기이고, 변형된 유리딘 뉴클레오티드가 2-티오유리딘 잔기인 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직하게는, 변형된 사이티딘 뉴클레오티드의 함량 및 변형된 유리딘 뉴클레오티드의 함량은 각각 25%이다.
다른 바람직한 실시양태에서, mRNA는 오직 관련 세포에서만 원하는 mRNA의 활성을 허용하기 위해 표적 결합 부위, 표적 서열 및/또는 마이크로-RNA 결합 부위와 결합할 수 있다. 추가의 실시양태에서, RNA는 3' 폴리A 테일 하류의 마이크로-RNA 또는 shRNA와 결합될 수 있다.
또한, 용어 "핵산(들)"은 DNA 또는 RNA 또는 그의 하이브리드 또는 당 기술 분야에 알려진 임의의 그의 변형체(예컨대, US 8278036호, WO 2013/052523호, WO 2011/012316호, US 5525711호, US 4711955호, US 5792608호 또는 EP 302175호, 예를 들면(Lorenz et al. 2004, Bioorg Med Chem Lett, 14, 4975-4977; Soutschek et al. 2004, Nature, 432, 173-178)의 변형 참조)를 지칭할 수 있다. 이러한 핵산 분자(들)은 단일- 또는 이중가닥, 선형 또는 원형, 천연 또는 합성의 것일 수 있고, 어떤 크기 제한도 없다. 예를 들어, 핵산 분자(들)은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 또는 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA, 안타고미르(antagomir) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), tRNA 또는 긴 이중가닥 RNA 또는 이러한 RNA를 코딩하는 DNA 작제물 또는 키메라플라스트(chimeraplast)(Colestrauss et al. 1996, Science, 273, 1386-1389), 또는 앱타머, 규칙적으로 공간배치된 짧은 클러스터 회문성 반복체(RNA-유도 부위-특이적 DNA 절단에 대한 "CRISPR")(Cong et al. 2013, Science, 339, 819-823), 또는 RNA 및 DNA일 수 있다. 상기 핵산 분자(들)은 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 바이러스성 DNA 또는 RNA, 박테리오파지 DNA, 코딩 및 비코딩 단일가닥(mRNA) 또는 이중가닥 RNA 및 올리고뉴클레오티드(들)(여기서, 상술된 바와 같고 3'- 또는 5'-변형된 당 주쇄 및/또는 염기에서의 임의의 당 기술분야의 변형이 포함된다)의 형태일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서 핵산은 RNA, 더욱 바람직하게는 mRNA 또는 siRNA이다.
핵산(들)은 표적 세포에서 발현될 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 당업자들에게 주지인 방법을 이용하여 제조합 핵산 분자를 작제할 수 있다; 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재된 기술 참조.
바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 치료적 또는 예방적 효과를 가질 수 있는 당업자들에게 공지되고 상술된 모든 핵산 타입 및 변형을 포함하는 치료학적 또는 약학적으로 활성인 핵산이다. 일반적으로, 치료적 또는 예방적 효과는 핵산과 세포 분자 및 세포 기관의 상호작용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 상호작용은 단독으로 예를 들어, 톨-유사 및 다른 세포 외 또는 세포 내 리셉터와 특이적으로 반응하도록 설계된 특정 CpG 올리고뉴클레오티드 및 서열에 대한 것과 같이, 선천적인 면역계를 활성화할 수 있다. 또, 세포 내 핵산의 흡수 또는 도입은 핵산에 포함된 유전자와 같은 뉴클레오티드 서열의 발현으로 이어지도록 의도될 수 있거나, 도입된 외인성 핵산의 세포 내 존재에 따른 내재성 유전자 발현의 하향조절, 침묵 또는 녹다운이 의도될 수 있거나, 또는 선택된 염기의 수리, 제거, 삽입 또는 교환 또는 내재성 핵산 서열의 전체 신축과 같은 내재성 핵산 서열의 변형이 의도될 수 있거나, 또는 도입된 외인성 핵산의 세포 내 존재 및 상호작용의 결과로 실질적으로 임의의 세포 과정의 방해가 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현은, 몇가지 예를 들자면 낭포성 섬유증, 혈우병 또는 근육 위축병과 같은 많은 대사 및 유전적 질병에서와 같이 특히 내재성 유전자가 결함이 있거나 또는 침묵하여 유전자 발현의 불충분하거나, 결함이 있거나 또는 기능이상의 산물이 초래되는 경우, 내재성 유전자 발현을 보상 또는 보완하도록 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현은 또한 유전자 발현, 신호 전달 및 다른 세포 과정의 조절과 같은 임의의 내재성 세포 과정과 상호작용하거나 이를 간섭하는 발현 산물을 가지도록 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현은 또한 형질감염 또는 형질도입된 세포가 거주하거나 또는 거주하게 되는 유기체의 맥락에서 면역 반응을 일으키도록 의도될 수 있다. 그 예는 예방접종 목적의 항원을 제시하기 위한 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포의 유전전 변형이다. 다른 예는 종양-특이적 면역 반응을 유도하기 위한 종양 내 사이토카인의 과발현이다. 또, 도입된 외인성 핵산의 과발현은 또한 재생 의약을 위한 변형된 T-세포 또는 전구체 또는 줄기 또는 다른 세포와 같이 세포 요법을 위해 생체 내 또는 생체 외에서 일시적으로 유전적으로 변형된 세포를 생성하도록 의도될 수 있다.
치료적 목적상, 내재성 유전자 발현의 하향조절, 침묵 또는 녹다운은 예를 들어, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드, tRNA, 긴 이중가닥 RNA를 이용하여 RNA 간섭(RNAi)에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 하향조절은 서열-특이적 또는 비특이적일 수 있고, 또한 긴 이중가닥 RNA가 세포로 도입되면 세포사로 이어질 수 있다. 내재성 또는 기존 유전자 발현의 하향조절, 침묵 또는 녹다운은 바이러스 감염 및 암을 비롯한 후천성, 유전성 또는 자발적 유발 질병의 치료에 유용할 수 있다. 또한, 세포 내로의 핵산 도입은 예를 들면, 바이러스 감염 또는 신생물을 예방하기 위한 예방적 조치로서 실시될 수 있음이 구상될 수 있다. 내재성 유전자 발현의 하향조절, 침묵 또는 녹다운은 전사 수준 및 번역 수준에서 발휘될 수 있다. 여러 메카니즘이 당업자들에게 공지되었으며, 예를 들어 도입된 핵산에 의한 후생적 변형, 염색질 구조 변경, 전사 인자의 선택적 결합, 삼중 나선 형성과 같은 통상적이지 않은 염기 짝짓기 메카니즘을 포함한 염기 짝짓기에 의한 게놈 DNA, mRNA 또는 기타 RNA 종에서 상보성 서열에 대한 도입된 핵산의 하이브리드화를 포함한다. 유사하게, 유전자 수리, 염기 또는 서열 변화는 게놈 수준 및 엑손 스킵을 포함한 mRNA의 수준으로 달성될 수 있다. 염기 또는 서열 변화는 예를 들어 트랜스-스플라이싱, 트랜스-스플라이싱 리보자임, 키메라플라스트, 스플리코좀-매개 RNA 트랜스-스플라이싱을 이용하거나, 그룹 II 또는 재표적 인트론을 이용하거나, 바이러스에 의해 매개된 삽입 돌연변이유발을 이용하거나, 또는 진핵, 원핵, 또는 바이러스 인테그라제 시스템을 사용한 표적화된 게놈 삽입을 이용한 잘라내기와 붙이기 메카니즘에 의해 RNA-유도 부위-특이적 DNA 절단으로 달성될 수 있다. 핵산은 생명체의 설계도 매체이고 직접 및 간접적인 방식으로 다수의 세포 과정에 참여하기 때문에, 이론상 어떠한 세포 과정도 외부에서 세포 내로의 핵산 도입에 의해 영향을 받을 수 있다. 특히, 이러한 도입은 세포 또는 기관 배양 시 생체 내 및 생체 외에서 직접 수행될 수 있고, 그 후에 수용체에 변형된 장기나 세포가 이식된다. 활성제로서 핵산을 가지는 본 발명의 복합체는 전술한 모든 목적상 유용할 수 있다.
조성물
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 핵산 및 다음으로부터 선택되는 올리고(알킬렌 아민)을 포함한 성분을 포함한다:
a) 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
Figure pct00043
[상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은 바람직한 실시양태, 및 특히 화학식 (IIa) - (IId)의 바람직한 그룹을 포함하여 상기와 같이 정의되고; 화학식 (II)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (II)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다];
b) 반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
Figure pct00044
[상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는 바람직한 실시양태, 및 특히 화학식 (IIIa) - (IIId)의 바람직한 그룹을 포함하여 상기와 같이 정의되고; 화학식 (III)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (III)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다]; 또는
c) 화학식 (IV)의 구조를 가지는 리피도이드:
Figure pct00045
[상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 바람직한 실시양태, 및 특히 화학식 (IVa) - (IVc)의 바람직한 구조를 포함하여 상기와 같이 정의되고; 화학식 (IV)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (IV)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다].
본 발명은 또한 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA, 및 그의 바람직한 실시양태를 포함하여 본원에 정의된 바와 같은 성분 a) 내지 c)로부터 선택되는 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 성분으로 구성된 조성물을 포함한다. 그러나, 조성물은 또한 추가의 성분, 예컨대 지질 제형화를 위한 성분 및/또는 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA가 세포에 또는 세포 내로 전달되는 동안 이펙터 기능을 발휘할 수 있는 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물이 일반적으로 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA와 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 및 적용 동안, 예를 들어 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 소정 경로를 통한 전달 동안 생물학적 표적 또는 생물학적 표적의 주변에 도달할 때까지 상기 성분의 상당한 부분을 조합하여 유지하기에 충분히 안정한 유한 실체로 조합된 임의적인 추가 성분의 조합체를 제공하는 것이 이해될 것이다.
본 발명에 따른 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드에 프로톤화가능한 아미노 그룹이 존재하기 때문에, 이들 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는 화학식 (II) 또는 (III)의 그룹 또는 화학식 (IV)의 구조에 양이온 전하를 포함할 수 있고, 그에 따라 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는 프로톤의 존재 하에, 예컨대 물 또는 수용액중에서, 또는 프로톤 공여 산의 존재 하에 양이온, 전형적으로 다수의 양이온성 부분을 함유하는 올리고- 또는 폴리양이온을 형성한다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA와 본 발명에 따른 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드의 복합체를 함유하거나 이로 구성된다. 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 및 음이온성 핵산이 일반적으로 이러한 복합체에서 정전기적 상호작용을 통해 조합됨이 이해될 것이다. 그러나, 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 및 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 특이적 구조에 따라, 수소 결합 및 공유 결합을 비롯해 복합체의 안정화에 다른 유인적 상호작용이 또한 연루될 수 있다.
본 발명의 조성물에서, 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 및 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA는, 예컨대, 0.25/1 내지 50/1, 바람직하게는 0.5/1 내지 30/1, 더욱 바람직하게는 1/1 내지 20/1의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 중량/핵산 중량의 비 (w/w)로 함유될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 조성물이 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA와 본 발명에 따른 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드의 복합체를 함유하는 경우, 본 발명의 조성물중의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 및 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 상대적인 비는 상호 전하 중화도를 고려하여 선택될 수 있다. 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA 복합체로 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하는데 있어서, 일반적으로 적어도 RNA 음전하의 전하 중화, 바람직하게는 RNA 음전하의 과잉 보상으로 이어지는 양의 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드가 주어진 양의 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA와 혼합된다.
양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 RNA 간의 적합한 비는 겔 지체 분석법, 형광 소광법, 예컨대 에티듐 브로마이드 변위/소광 분석, 입도 측정 및 제타 전위 측정에 의해 용이하게 측정할 수 있다. 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 RNA 간의 유용한 비는 일반적으로 아가로스 겔에서 전기이동에 적용되는 경우 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와의 복합체에 포함된 RNA의 적어도 부분 지체, 바람직하게는 완전 지체에 의해, 또는 RNA에 삽입되는 경우 에티듐 브로마이드, RiboGreen 또는 YOYO와 같은 염료의 고도의 형광 소광에 의해, 또는 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 및 RNA와 혼합 시 (나노)입자의 형성에 의해 특정된다. 화학적으로 잘-정의된 양이온에 대해, 산출된 N/P 비는 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 RNA의 상대적인 비율을 선택하고 정의하는데 적합한 인자이다. N/P 비는 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드중 화학식 (II)의 그룹 (또는 그의 바람직한 실시양태), 화학식 (III)의 그룹 (또는 그의 바람직한 실시양태) 또는 화학식 (IV)의 구조 (또는 그의 바람직한 실시양태)에서의 프로톤화가능한 질소 원자 대 본 발명의 조성물중 RNA의 포스페이트 그룹의 몰비를 가리킨다. N/P 비는 이러한 RNA와 양이온성 비히클 복합체의 특성화를 위해 확립된 파라미터이며, 당업자들이라면 예컨대 아미드 결합중의 질소 원자는 프로톤화가능한 질소 원자로서 간주되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 양이온성 올리고머 또는 폴리머의 경우, N/P 비는 편의상 예컨대 다음 식에 따라 산출될 수 있다:
Figure pct00046
상기 식에서, wp는 올리고머 또는 폴리머의 중량이고, n은 반복 단위당 프로톤화가능한 아미노 그룹의 수이고, Mwp는 반복 단위 (반대 이온 포함)의 분자량이고, wna는 RNA의 중량이고, M염기는 RNA 중 뉴클레오티드의 평균 분자량(RNA의 경우 346)이다. 본 발명에 따른 RNA 전달을 위한 이원성 폴리양이온/RNA 복합체에서, 최종 이원성 조성물의 제타 전위가 양이 되도록 N/P 비를 제공하는 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 대 RNA의 상대적인 양이 바람직하게는 사용되어야 한다. 화학식 (IV)의 리피도이드 및 RNA를 포함하는 조성물에 대한 N/P 비는 편의상 리피도이드 내 프로톤화가능한 질소 원자의 수와 조성물에 사용된 리피도이드의 몰수를 고려하여 계산될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 본 발명의 이원성 조성물에서, 1 내지 100의 N/P 비가 바람직하고, 3 내지 60의 N/P 비가 더욱 바람직하며, 4 내지 44의 N/P 비가 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 조성물은 임의로 지질 제형화를 위한 추가의 성분을 포함한다. 예를 들어, 화학식 (IV)의 리피도이드 또는 화학식 (IVa) - (IVc)를 비롯한 그의 바람직한 실시양태를 포함하는 조성물은 과학 문헌에서 헬퍼 지질로서 지칭된 콜레스테롤, DOPE, DOPC 또는 DSPC 및/또는 페길화(PEGylated) 지질 또는 리포플렉스를 제조하는 데에 유용한 임의의 기타 지질과 같은 추가의 지질을 포함한다. 본 발명과 관련하여 바람직한 헬퍼 지질은 콜레스테롤, DOPE, DOPC 및 DSPC이다. 특정 실시양태에서, 리피도이드를 함유하는 조성물은 리피도이드 약 40-60%, 콜레스테롤 약 40-60%, 및 PEG-지질 약 5-20% (조성물의 총 중량에 기초한 중량 퍼센트)이다. 특정 실시양태에서, 리피도이드를 함유하는 조성물은 리피도이드 약 50-60%, 콜레스테롤 약 40-50%, 및 PEG-지질 약 5-10%이다. 특정 실시양태에서, 리피도이드를 함유하는 조성물은 리피도이드 약 50-75%, 콜레스테롤 약 20-40%, 및 PEG-지질 약 1-10%이다. 특정 실시양태에서, 리피도이드를 함유하는 조성물은 리피도이드 약 60-70%, 콜레스테롤 약 25-35%, 및 PEG-지질 약 5-10%이다. 조성물은 (예를 들면 Akinc et al, 2007, Nat Biotech, 26, 561-569; Akinc et al, 2009, Mol Ther, 17, 872-9; Love et al, 2010, PNAS, 107, 1864-9; US 8,450,298, WO2006/138380에 기술된 바와 같이) 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 제공될 수 있다. RNA/리피도이드 복합체는 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 세포 내로 전달하는데 유용한 입자를 형성할 수 있다. 다수의 리피도이드 분자가 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA 분자와 조합될 수 있다. 예를 들어, 복합체는 1-100 리피도이드 분자, 1-1,000 리피도이드 분자, 10-1,000 리피도이드 분자, 또는 100-10,000 리피도이드 분자를 포함할 수 있다. (m)RNA 및 리피도이드의 복합체는 입자를 형성할 수 있다. 입자의 직경은 예컨대, 10-1,200 nm, 더욱 바람직하게는 10-500 nm, 및 가장 바람직하게는 20-150 nm의 범위일 수 있다.
본 발명의 조성물은 임의로 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA가 세포에 및 그 내로 전달되는 동안 이펙터 기능을 발휘하는 성분을 포함한다. 이러한 성분으로는 폴리음이온, 상술된 바와 같은 지질, 올리고머 이외의 폴리양이온, 양이온성 펩티드를 포함한 본 발명의 폴리머 또는 덴드리머, 차폐 올리고머 또는 폴리머, 폴록사머(또한, 플루로닉이라고도 함), 폴록사민, 표적 리간드, 엔도좀분해제(endosomolytic agent), 세포 투과 및 신호 펩티드, 자성 및 비자성 나노입자, RNAse 저해제, 형광 염료, 방사성 동위원소 또는 의료 영상화를 위한 조영제를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 용어 "이펙터 기능"은 생물학적 표적에서 또는 그 내에서 또는 생물학적 표적의 주변에서 조성물의 RNA, 바람직하게는 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 의도하는 생물학적 효과를 달성하도록 도와주는 임의의 기능을 포함한다. 예를 들어, 핵산 전달용 조성물은 스터퍼(stuffer) 물질로서 비코딩 핵산 또는 비-핵산 폴리음이온을 포함하도록 제형화된다(Kichler et al. 2005, J Gene Med, 7, 1459-1467). 이러한 스터퍼 물질은 의도하는 생물학적 효과를 가지는 핵산의 용량을 감소시키는 한편 이러한 스터퍼 물질의 부재 시 더 높은 핵산 용량에서 달성되는 효과의 범위 또는 정도를 유지하는데 적합하다. 비-핵산 폴리음이온은 저독성으로 생체 내 유전자 발현을 장기화하는데 사용되고 있다(Uchida et al. 2011, J Control Release, 155, 296-302). 본 발명의 조성물은 또한 리포폴리플렉스의 경우에서와 같이 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질을 포함할 수도 있다(Li and Huang in "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Chapter 13, 295-303). 리포폴리플렉스는 본 발명의 화학식 (IV)에 상응하는 리피도이드와 함께 본 발명의 화학식 (II) 및 (III)에 상응하는 폴리머로부터 유리하게 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 올리고(아미노 알킬렌)을 포함하는 본 발명의 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 이외의 올리고- 또는 폴리양이온을 포함할 수 있다. 이러한 추가의 폴리양이온은 목적하는 핵산 조밀도를 달성하는데 유용할 수 있거나, 폴리양이온성 펩티드 경우에는 이미 기술된 바와 같은 핵 편재화 신호 기능을 가질 수 있다(Ritter et al. 2003, J Mol Med, 81, 708-717). 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)과 같은 차폐 폴리머도 또한 본 발명의 조성물에 포함될 수 있고, 폴리플렉스 및 리포플렉스를 생물학적 환경에서 응집 및/또는 원치않는 상호작용(옵소닌화), 예를 들어 혈청 성분, 혈액 세포 또는 세포외 기질과의 상호작용에 대해 안정화시키기 위해 빈번히 사용된다. 차폐는 또한 핵산을 포함하는 조성물의 독성을 감소시키는 데에 적합할 수 있다(Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). PEG와 같은 차폐 폴리머는 본 발명의 폴리머 또는 리피도이드에 직접 공유적으로 결합할 수 있다. 커플링은 폴리머 주쇄에서, 바람직하게는, 가능하다면 폴리머 주쇄 또는 덴드리머의 말단 단부에서 이뤄질 수 있다. 그러나, 커플링은 또한 화학식 (II), (III) 및 (IV)의 아미노 그룹에 대해 행해질 수도 있다.
PVP 및 폴록사머와 같은 폴리비닐 유도체는 근육 내 주사 시에 형질감염을 향상시키는데 유용한 것으로 입증되었고(Mumper et al. 1996, Pharm Res, 13, 701-709, Lemieux et al. 2000, Gene Ther, 7, 986-991), 따라서 본 발명의 조성물에 포함되는 경우 유용할 수 있다.
핵산 전달용 조성물에 포함된 항체를 포함하는 표적 리간드는 표적 세포의 우선적이고 개선된 형질감염을 위해 유용하다(Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009). 표적 리간드는 본 발명의 조성물에 직접 또는 간접 방식으로 표적 인식 및/또는 표적 결합 기능을 부여하는 임의의 화합물일 수 있다. 가장 일반적인 용어로, 표적이라 함은 표적 리간드가 분자 상호작용을 통해 특이적으로 결합할 수 있는 상이한 생물학적 구조로서, 이러한 결합은 궁극적으로 표적 조직 내 및/또는 표적 세포에서 또는 그 내에서 조성물에 포함된 핵산의 우선적인 축적으로 이어질 것이다. PEG 쇄와 마찬가지로, 표적 리간드는 폴리머 주쇄 또는 덴드리머의 말단에 결합될 수 있다. 그러나, 커플링은 또한 화학식 (II), (III) 및 (IV)의 그룹에 대해 달성될 수도 있다.
또한, 엔도좀분해제, 예컨대 엔도좀 분해성 펩티드(Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35) 또는 세포내이입(endocytosed) 핵산의 엔도좀 유리를 증강하는데 적합한 다른 화합물들이 본 발명의 조성물의 유용한 성분이다. 세포 투과 펩티드 (다른 내용에서는 단백질 형질도입 도메인으로도 알려짐)(Lindgren et al. 2000, Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103) 또한 핵산의 세포내 전달을 매개하기 위한 본 발명의 조성물의 유용한 성분일 수 있다. 이른바 TAT 펩티드는 이 분류에 포함되며 핵 국재화 작용도 갖는다(Rudolph et al. 2003, J Biol Chem, 278, 11411-11418).
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 자기 나노입자는 자기력에 의한 전달의 물리적 표적화와 자기주입법(Magnetofection)으로도 알려진 메카니즘인 핵산 전달의 급격한 효율 증강에 유용하다(EP1297169; Plank et al. 2011, Adv Drug Deliv Rev, 63, 1300-1331). 유사하게, 또한, 본 발명의 조성물은 초음파와 임의의 자기장 적용에 의한 핵산 전달의 물리적 증강과 표적화에 사용된 비자기성 또는 자기성 마이크로버블일 수도 있다(Holzbach et al. 2010, J Cell Mol Med, 14, 587-599, Vlaskou et al. 2010, Adv Funct Mater, 20, 3881-3894). 양자점(Quantum dots)(Zintchenko et al. 2009, Mol Ther, 17, 1849-1856), 방사성 추적자 및 의료 영상용 조영제는 핵산 전달을 추적하고 핵산 전달용 조성물의 생체 내 분포를 측정하는데 유리하게 사용할 수 있다. 요약하면, 핵산 전달을 위한 다양한 이펙터가 기술되고 있으며 이것은 본 발명에 따른 핵산과 올리고머 또는 폴리머 또는 덴드리머를 포함하는 조성물에서 유용한 성분이 될 수 있다.
당업자들이라면 본 발명에 따른 조성물에 포함된 각 성분 물질의 양과 관련하여 상당한 융통성이 존재하는 것을 알고 있다. 예를 들어, 이른바 단일분자 이성분(binary) 폴리플렉스는 조성물이 폴리양이온의 혼합 시 형성된 나노입자로 구성되는 플라스미드 DNA와 단일 플라스미드 DNA 분자를 정확히 포함하는 플라스미드 DNA에 대해, 그리고 전하 중화 또는 전하 과잉보상(음전하를 초과하는 양전하)에 필요한 많은 폴리양이온 분자로서 기술되었다(DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10):4548-54). 형질감염에서 자주 사용된 N/P 비의 PEI-DNA 복합체에 있어서, 형광 상관 분광학에 의해 이들이 평균적으로 3.5 (+/- 1) DNA 플라스미드 분자 및 30 PEI 분자를 함유하는 반면, 복합체를 제조하는데 사용된 약 86%의 PEI 분자가 자유 형태로 있는 것이 확인되었다(Clamme et al. 2003, Biophys J 84,1960-1968). 다른 극단으로, 추정상 다수(10 내지 100)의 성분 분자를 포함하는, PEI와 플라스미드 DNA의 응집 복합체가 형질감염에서 작은 별개 PEI-DNA 나노입자보다 더 나은 것을 확인하였다(Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433; Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21). 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 소수의 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA 분자를 포함하는 (나노)입자일 수 있지만, 또한 거시적 대상, 예컨대 엄청난 수의 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA 분자를 포함하는 침전물 또는 건조 분말일 수 있다. 요약하면, 본 발명의 조성물은 자가조립 전 그 성분들의 투입비를 특징으로 한다. RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA 성분들에 대한 개별 성분들의 전형적인 투입 w/w 비는 1 내지 50이다. N/P 비는 올리고머 또는 폴리머/덴드리머 또는 리피도이드가 화학적으로 잘 정의되었을 때 이성분 폴리머/덴드리머 또는 리피도이드 조성물에 대한 투입비의 적합한 기준이 된다. 본 발명의 조성물이 추가 성분을 포함하는 경우, N/P 비의 결정은 모호해질 수 있다. 이 경우, 적합한 투입비는, 예를 들어 비제한적으로 겔 지체 분석, 형광 소광 분석, 예컨대 브롬화 에티듐 변위/소광 분석 등의 실험, 입자 분립화(sizing) 및 제타 전위 측정 및 기능성 어세이, 예컨대 본원에 기술된 형질감염 어세이에 의해 측정된다. 추가의 폴리음이온 또는 차폐 폴리머를 포함하는 3성분 복합체에 있어서, 순전하 비율(음전하를 초과하는 양전하)은 1 미만이고 제타 전위는 중성이거나 음성일 수 있다.
본 발명의 조성물은 하기한 바와 같이 제조할 수 있다. 자가조립 공정 후에 본 발명의 조성물은 혼입되지 않은 성분들과 분리되고, 동일 단계에서 현탁액 배지를 원심분리 또는 한외여과 또는 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석 또는 임의의 관련 방법으로 대체할 수 있다. 정제 또는 미정제된 본 발명의 조성물 성분들의 화학양론은 다양한 분석 방법, 예를 들어 분광분석 방법, 예컨대 UV/VIS 분광광도법 또는 형광 상관 분광학(DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10):4548-54), 개별 성분들의 수직 형광 또는 방사성 동위원소 표지, NMR 및 IR 분광학 또는 크로마토그래피 분석 및 조성물 분해(Disassembly)시 정량으로 측정할 수 있다. 분해는, 예를 들어 과량의 폴리음이온, 예컨대 본원에 기술된 헤파린 또는 콘드로이틴 설페이트의 첨가 또는 소듐 도데실설페이트의 첨가에 의해 가능하다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는 본원에 기술된 바와 같이 제조 및 정제할 수 있다. 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는 수용액 또는 건조 분말로 보관할 수 있으며, 이 경우 조성물을 제조하기 전에 수성 매질, 바람직하게 물에 재용해된다. 용액의 pH는 필요하다면 산, 바람직하게 염산 또는 시트르산으로 중성 또는 약산성으로 조절된다(pH 4.5 이하). 조성물에 포함되는 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 경우에, pH는 약 4.5 내지 5.5, 바람직하게 약 4.9 내지 5.1, 더욱 바람직하게 약 5.0까지로 조절하는 것이 바람직하다. 핵산은 당업자에게 공지된 현재의 기술에 따라 생산 및 정제한다. 핵산은 수성 매질, 바람직하게 물 중의 용액으로 제공된다. 임의로, 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 또는 핵산 또는 양자(both)는 이펙터 분자, 예컨대 표적 리간드, 시그널 펩티드, 세포 투과 펩티드, 엔도좀 분해성 물질 또는 차폐 폴리머와 화학적으로 결합한다. 그러나, 이펙터 분자의 화학적 성질에 따라 이들은 화학적 결합으로 결합하는 것이 아니라 본 발명의 조성물 내에서 비공유 결합, 즉 정전기, 소수성 또는 조성물 중의 다른 성분들과의 반데르발스 작용에 기초한 자가조립에 의해 혼입될 수 있다. 이를 위하여 개별 성분 용액의 이온강도, 반대이온의 타입, pH 또는 유기 용매 함량을 조절하는 것이 유리할 수 있다.
유기 용매가 화학식 (IV)의 리피도이드 원액을 제조하기 위해 사용될 수 있으며, 수 난용성 또는 수 불용성 성분, 예컨대 지질 또는 소수성 올리고머 또는 폴리머의 동시조립에 필요할 수 있다. 적합한 유기 용매는, 예를 들어 수혼화성 용매, 예컨대 에탄올과 기타 알콜, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 또는 글리코퓨롤 및 WO2013/045455호에 기술된 다른 용매이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 리피도이드를 포함하는 조성물은 리피도이드 및 추가 성분, 예컨대 다른 용매, 바람직하게 에탄올에 용해된 헬퍼 지질, 및 바람직하게 산성 pH로 완충된 수성 매질에 용해된 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA로부터 제조한다. 제1 단계에서는 유기상에 용해된 성분들을 목적하는 화학양론적 비로 혼합하고 선택된 유기 용매를 사용하여 목적하는 최종 부피로 희석한다. 리피도이드와 관련하여 목적하는 최종 비에 해당하는 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 양을 수성 매질로 희석한다. 바람직하게, 수성 매질의 부피는 적어도 유기 용매 중의 조합된 성분 용액의 부피와 같다. 바람직하게, RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 포함하는 수성상의 부피는 유기 용매 중의 조합된 성분 용액의 부피를 초과하며, 가장 바람직하게 수성상과 유기상의 v/v 비는 4:1이다. 제2 단계에서, 리피도이드를 포함하는 유기 혼합물은 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 수용액에 바람직하게 보텍싱(vortexing)하면서 신속하게 주입된다. 경우에 따라, RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA와 리피도이드를 포함하는 성분의 용액은 이 단계 전후에 70℃로 가열한다. 필요하거나 바람직하다면, 여기에서 유기 용매는 증발, 투석, 한외여과, 투석여과(diafiltration) 또는 크기 배제 크로마토그래피로 제거할 수 있으며, 동일 단계에서 분산 매질은 최종 목적 완충액 조성물, 예컨대 PBS로 교환할 수 있다. 경우에 따라, 조성물은 단일분산 제제의 멸균 및/또는 제조를 위해 원하는 기공 크기의 막 필터에 통과될 수 있다.
상기한 혼합 방법의 대안으로, RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA, 및 리피도이드 성분은, 예를 들어 문헌 [Hirota et al.(Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290)] 또는 [Kasper et al. (Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185)]에 기술된 것과 같은 마이크로 혼합용 자동화 장치 또는, 예컨대 문헌[Xuan et al. (Xuan et al. 2010, Microfluidics 및 Nanofluidics, 9, 1-16)]에 요약한 것과 같은 미세유체 포커싱에 의해 혼합할 수 있다.
본 발명에 따른 리피도이드를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 대안은 리포좀 또는 미셀을 중간체로 경유하는 것이다. 리포플렉스(Lipoplex)는 대개 수성 현탁액 중에서 미셀 또는 리포좀인 상업적으로 입수할 수 있는 형질감염 시약으로부터 제조된다. 본 발명의 리피도이드는 미셀 또는 리포좀을 제조하는데 사용할 수 있다. 미셀과 리포좀을 제조하는 다양한 방법들이 당업계에 알려져 있으며, 본 발명의 리피도이드로 임의의 방법을 사용하여 미셀과 리포좀을 제조할 수 있다. 또한 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 포함하는 임의의 제제, 소분자, 단백질, 펩티드, 금속, 유기금속성 화합물 등이 미셀 또는 리포좀 내에 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 리포좀(지질 또는 리피도이드 소포체)은 자발적 조립을 통해 형성된다. 다른 실시양태에서, 리포좀은 얇은 지질 필름 또는 지질 케이크가 수화하여 지질 결정질 이중층의 적층이 유동 및 팽윤될 때 형성된다. 수화된 지질 시트는 교반 및 자기-폐쇄에서 분리되어 거대한 다중층 소포체(LMV)를 형성한다. 이것은 말단에서 이중층의 탄화수소 코어와 물의 상호작용을 방해한다. 일단 리포좀이 형성되면 입자 크기를 줄이는 것은 초음파 에너지(초음파 처리) 또는 기계적 에너지(압출)를 투입하여 변형할 수 있다(Szoka et al, 1980, Ann Rev Biophys Bioeng, 9, 467-508). 리포좀의 제조는 수화를 위한 리피도이드 제조, 교반에 의한 리피도이드 수화, 및 리포좀의 균일 분산을 얻기 위한 소포체 사이징(sizing)을 포함한다. 이를 위하여, 본 발명의 조성물에 포함될 지질성 성분들은 원액으로서 유기 용매, 예컨대 클로로포름에 용해된다. 이후, 성분들은 목적하는 화학양론적 비로 혼합되고 유기 용매를 적합한 용기, 예컨대 둥근바닥 플라스크에서 회전식 증발에 의해 제거하여 용기 벽에 얇은 지질 필름을 생성한다. 바람직하게, 이 필름을 고진공으로 건조한다. 리피도이드 필름/케이크는 수성 매질을 건조 리피도이드 컨테이너에 첨가하고 혼합물을 교반하여 수화된다. 초음파 에너지를 사용한 LMV 현탁액의 분해는 전형적으로 15-50 nm 범위의 직경을 갖는 작은 단일층상 소포체(SUV)를 생성한다. 지질 압출이란 액체 현탁액을 규정된 기공 크기를 갖는 폴리카보네이트 필터에 통과시켜서 사용된 필터의 기공 크기와 비슷한 직경을 갖는 입자를 얻는 방법이다. 100 nm 기공을 갖는 필터를 통과시키는 압출은 전형적으로 평균 직경이 120-140 nm인 거대 단일층상 소포체(LUV)를 제공한다. 특정한 리피도이드는 특정 분자, 예컨대 핵산(예를 들어, DNA 및 mRNA) 주위에서 자발적으로 자가조립하여 리포좀을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이것은 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 전달에 적용된다. 이러한 리피도이드를 사용하여 추가 단계 또는 장치, 예컨대 압출기의 필요 없이 리포좀의 간단한 조립이 가능하다.
RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 이후 성분들의 용액을 혼합하여 자가조립에 의해 제조할 수 있다. 자가조립은 피펫팅과 교반/보텍싱을 사용한 수동 혼합 또는, 예를 들어 문헌[Hirota et al.(Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290)] 또는 [Kasper et al. (Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185)]에 기술된 것과 같은 마이크로 혼합용 자동화 장치 또는, 예컨대 문헌[Xuan et al. (Xuan et al. 2010, Microfluidics 및 Nanofluidics, 9, 1-16)]에 요약된 것과 같은 미세유체 포커싱을 사용하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물이 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA, 및 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 이외의 추가 성분을 포함하는 경우, 순차적 혼합이 필요할 수 있다. 이 경우, 임의의 추가 성분은 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드 및 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 자가조립 후에 첨가되거나, 혼합 전에 이들 중 어느 하나에 첨가할 수 있다. 혼합 단계의 가장 적합한 순서는 추가 성분들의 화학적 성질에 따르게 된다. 예를 들어 추가 성분이 음으로 하전된 경우, 추가 성분을 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 혼합하기 전에 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA 성분 또는, 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA의 사전형성된 복합체에 첨가하는 것이 가장 적합할 수 있고, 여기서 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는 (m)RNA와 음이온성 추가 성분의 음전하 합에 대한 양전하 비율 측면에서 초과량으로 존재한다. 역으로, 추가 성분이 양이온성이면, (m)RNA와 혼합하기 전에 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드에 첨가하는 것이 가장 적합하다. 또는 추가 성분은 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 혼합하기 전에 (m)RNA의 음전하를 부분적으로 중화하는 화학양론으로 사용할 수 있다. 자기주입법을 위한 (m)RNA를 포함하는 복합체의 경우, 염 유도성 콜로이드 응집이 (m)RNA, 폴리양이온 또는 양이온성 지질 및 자기입자를 포함하는 조성물을 제조하는 적합한 수단인 것으로 나타났다(EP1297169호). (m)RNA 성분이 양이온성 올리고뉴클레오티드인 특별한 경우에, 폴리음이온이 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 (m)RNA를 자가조립하는데 사용될 수 있다. 이 경우, 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는 양이온성 올리고뉴클레오티드와 혼합된 다음, 폴리음이온과 혼합된다. 다양한 제제화 방법이 본 발명의 조성물을 얻는데 사용될 수 있다는 것은 당업자들에게 공지되어 있다. 개별 성분들의 농도는 본 발명의 조성물의 의도하는 용도에 따라 선택된다. 관련 파라미터는 (m)RNA 성분의 최종 농도와 상기한 성분들의 비율이다. 세포 배양에서 (m)RNA 전달을 위해 1 내지 100 μg/ml의 최종 (m)RNA 농도가 일반적으로 바람직하다. 생체 내 적용에서, 유용한 최종 (m)RNA 농도는 최대 5 mg/ml일 수 있다.
본 발명의 조성물은 수성 현탁액으로 보관할 수 있거나 건조할 수 있다. 따라서, 바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 건조된 형태, 임의로 냉동건조(동결건조)된 형태로 보관된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 건조 또는 동결건조된 복합체 또는 조성물은 또한 동결건조보호제를 포함한다. 동결건조보호제는 (냉동)건조된 물질을 보호하는 분자이다. 이러한 분자는 전형적으로 폴리하이드록시 화합물, 예컨대 당(모노사카라이드, 디사카라이드 및 폴리사카라이드), 폴리알콜 및 이들의 유도체이다. 트레할로스와 수크로스가 건조 과정의 자연 보호제로 알려져 있다. 트레할로스는 다양한 식물, 균류 및 가뭄기 동안 가사상태(탈수가사로도 알려짐)로 있는 무척추 동물에 의해 생산된다. 본 발명의 범위에 특히 적합한 동결건조보호제는 당, 예컨대 트레할로스, 락토스, 라피노스, 수크로스, 만노스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트린, 우레아, 말토덱스트린, 푸럭탄(fructan), 말토올리고사카라이드, 만노-올리고사카라이드, 사이클로이눌로헥사오스, 하이드록시에틸 전분, 덱스트란, 이눌린, 폴리비닐피롤리돈 또는 아미노산, 예컨대 트립토판, 글리신 및 페닐알라닌이다. 가장 바람직하게 트레할로스가 본 발명에 사용된다.
약학적 측면
다른 측면에서, 본 발명은 조직 또는 표적 세포에 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하기 위한 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드의 용도에 관한 것이다. "세포에 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하는"이란 용어는 바람직하게 세포 내로 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전이하는 것을 의미한다. 상기 용도는 생체 내 또는 시험관 내일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 표적 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포 또는 조직에 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 전달하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행할 수 있다. 접촉을 일으키는 것은 당업자들에게 알려진 수단 및 방법으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 이 방법을 시험관 내에서 수행할 경우, 세포를 조성물의 존재 하에 배양 배지 중에서 배양하거나 조성물을 세포에 첨가하여 접촉이 일어나게 할 수 있다. 이 방법을 생체 내에서 수행할 경우, 세포 또는 조직과의 접촉은, 예를 들어 조성물을 개체에 당업자들에게 알려진 투여 경로, 특히 유전자 요법 분야에서 통상적으로 적용되는 투여 경로로 투여하여 일어날 수 있다. 조성물의 제제화 및 이를 개체에 투여하는 가능한 방법을 이하에 상세히 기술하였다.
용어 "생체 내"란 살아있는 유기체의 몸에 영향을 주는 임의의 적용을 지칭하며, 여기서 상기 유기체는 바람직하게 다세포, 더욱 바람직하게 포유동물, 가장 바람직하게 인간이다. 용어 "시험관 내"란 단리된 살아있는 유기체의 몸체 일부 및 상기 유기체 외부에서, 예를 들어 세포, 조직 및 기관에 대해 일어나는 임의의 적용을 지칭하며, 여기서 상기 유기체는 바람직하게 다세포, 더욱 바람직하게 포유동물, 가장 바람직하게 인간이다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물 또는 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드와 임의로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 용어 "약학 조성물"이란 대상에 투여할 수 있는 본 발명의 조성물의 약학적으로 허용가능한 형태를 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 형태"란 약학 조성물로서 제제화된 조성물을 의미하며, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 추가로 포함한다. 적합한 약학 담체의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 수중유 에멀젼, 다양한 타입의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 공지된 통상의 방법으로 제제화될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 대상에 적합한 용량으로 투여할 수 있다. 복용 요법은 주치의와 임상적 인자에 의해 결정된다. 의료분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 대상에 대한 복용량은 다양한 인자, 예를 들어 대상의 사이즈, 체표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간과 경로, 일반적 건강 및 동시 투여되는 다른 약물 등에 따라 달라진다. 활성 물질의 전형적인 용량은, 예를 들어 1 ng 내지 수 그램의 범위 내일 수 있다. (m)RNA 요법에 적용하면, 발현 또는 발현 저해를 위한 (m)RNA의 복용량은 이 범위에 해당해야 하지만; 이 예시적인 범위 미만 또는 초과의 용량이, 특히 상기한 인자들을 고려하여 구상된다. 일반적으로, 약학 조성물의 정상적 투여로서의 요법은 1일 체중 1 kg 당 0.1 μg 내지 10 mg 단위의 범위 내여야 한다. 요법이 연속 주입일 경우에는 또한 각각 체중 1 kg 당 1 μg 내지 10 mg 단위의 범위 내여야 한다. 진행은 주기적인 평가에 의해 모니터링할 수 있다. 복용량은 변경될 수 있지만, 본 발명의 조성물의 구성성분으로서 (m)RNA의 정맥내 투여를 위한 바람직한 용량은 약 106 내지 1019 카피의 (m)RNA 분자이다.
용어 "투여되는"이란 대상의 몸체에 조성물을 주입하는 적합한 모든 방법을 포함한다. 적합한 조성물 투여는 다양한 방법, 예를 들어 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 피하, 경피, 척추 강내, 근육 내, 국소, 피내, 비강 내, 흡입에 의한 폐 또는 기관지 내 또는 경구 또는 직장 투여로 가능하다. 본 발명의 조성물은 특히 문헌[Shea et al. (Shea et al. 1999, Nat Biotechnol, 17, 551-554)] 및 EP1198489호에 기술된 바와 같은 유전자 활성 매트릭스로 투여할 수 있다.
원칙적으로, 본 발명의 약학 조성물은 국소적 또는 전신적으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구적으로, 예를 들어 정맥 내로 투여할 수 있지만, 다른 투여 방법도 본 발명의 범위 내에 있다. 표적 부위로의 직접 투여, 예를 들어 혈관 내 부위로의 카테터 또한 가능하다. 예를 들어, 표적 부위, 예컨대 종양에 직접 주사하여 투여할 수도 있다. 또한, 에어로졸화 또는 분무화 또는 경구 투여에 의한 투여도 본 발명의 범위 내에 있다. 비경구 투여를 위한 조제물은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 플루오로카본, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주입가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어 염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스와 염화나트륨, 락테이트화 링거액, 또는 비휘발성유를 포함한다. 정맥 내 비히클은 유동 및 영양 보충제(replenisher), 전해질 보충제(예컨대 링거 덱스트로스를 포함하는 것들) 등을 포함한다. 보존제와 기타 첨가제, 예컨대 항미생물제, 산화방지제, 킬레이트화제 및 불활성 기체 등도 존재할 수 있다. 또한, 약학 조성물은 추가 제제, 예컨대 약학 조성물의 목적하는 용도에 따라 인터류킨 또는 인터페론을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물에 포함된 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA가 예방 또는 치료 효과를 유발하도록 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료방법에 관한 것이다. 특히, 용어 "환자"는 동물 및 사람을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물을 투여하여 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 용어 "질환"이란 본 발명의 실시양태를 적용함으로써 치료, 예방 또는 백신처리되는(vaccined) 가능한 병리학적 상태를 지칭한다. 상기 방법의 바람직한 실시양태에서, 질환은 유전적, 후천적, 감염성 또는 비감염성, 연령관련, 심혈관성, 대사성, 장내, 신생물성(특히 암) 또는 유전자적인 것일 수 있다. 질환은 결과적으로, 예를 들어 유기체의 유전자 장비, 행동적, 사회적 또는 환경적 인자, 예컨대 화학물질 또는 방사능에 대한 노출에 기반할 수 있는 유기체 내에서의, 예를 들어 생리학적 과정, 분자적 과정, 생화학적 반응의 불규칙성에 기초할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 국제특허출원 공개 WO2010EP04681호에 기술된 치료에 사용된다.
상기 치료 방법에 부합하여, 본 발명은 또 다른 실시양태에 있어서 본 발명의 조성물 중에 함유된 RNA, 바람직하게 단일가닥 RNA, 예컨대 mRNA를 질환이 있는 환자의 체내 조직 또는 기관에 제공하여 치료될 수 있는 질환의 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가 설명을 위하여, 본 발명의 바람직한 측면을 다음의 항목들로 요약하였으며, 이 항목들은 앞선 일반적 설명의 일부를 형성하고 거기에 기술된 바람직한 실시양태 또한 적용된다.
1. 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
Figure pct00047
상기 화학식 (II)에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6는 다수의 화학식 (II)의 그룹에서 이의 각 그룹에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이며 m+n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5는 서로 독립적으로, 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되며;
R6는 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 리셉터 리간드로부터 선택되고,
화학식 (II)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (II)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다.
2. 화학식 (II)에서 p가 1인 1항의 올리고머 또는 폴리머.
3. 화학식 (II)에서 n이 1인 1항 또는 2항의 올리고머 또는 폴리머.
4. 화학식 (II)에서 m이 1이고 n이 1인 1항 또는 2항의 올리고머 또는 폴리머.
5. 화학식 (II)에서 a가 1이고 b가 2이거나, 또는 a가 2이고 b가 1인 1항 내지 4항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 폴리머.
6. 화학식 (II)에서 R2 내지 R5가 수소인 1항 내지 5항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 폴리머.
7. 화학식 (II)에서 R6가 수소인 1항 내지 6항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 폴리머.
8. 폴리머인 1항 내지 5항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 폴리머.
9. 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 그룹을 갖는 폴리머 주쇄가 다수의 글루탐산 또는 아스파르트산 단위를 포함하는 폴리(아미노산), 예컨대, 일반적으로 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파르트산), 단백질, 폴리알킨, 폴리아민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리말레산, 폴리설포네이트, 폴리스티렌 설포네이트, 폴리포스페이트, 펜토산 폴리설페이트, 폴리(비닐 인산), 폴리(부타디엔-co-말레산), 폴리(에틸 아크릴레이트-co-아크릴산), 폴리(에틸렌-co-아크릴산), 폴리(에틸렌-co-말레산 무수물), 폴리(메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리(메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리(스티렌설폰산-co-말레산), 폴리(비닐 클로라이드-co-비닐 아세테이트-co-말레산), 탄수화물, 예컨대 헤파린, 헤파란 설페이트, 폴리(글루쿠론산), 폴리(갈락투론산), 히알루론산, 일반적으로 폴리(우론산), 또는 카복시-말단 덴드리머로부터 선택된 8항의 폴리머.
10. 다수의 글루탐산 또는 아스파르트산 단위를 포함하는 폴리(아미노산), 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산으로부터 선택된 9항의 폴리머
11. 반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
Figure pct00048
상기 화학식 (III)에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는 다수의 화학식 (III)의 그룹에서 이의 각 그룹에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이며 m+n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5는 서로 독립적으로, 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, 또는 -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되며;
화학식 (III)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (III)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다.
12. 화학식 (III)에서 p가 1인 11항의 올리고머 또는 폴리머.
13. 화학식 (III)에서 n이 1인 11항 또는 12항의 올리고머 또는 폴리머.
14. 화학식 (III)에서 m이 1이고 n이 1인 11항 또는 12항의 올리고머 또는 폴리머.
15. 화학식 (III)에서 a는 1이고 b가 2이거나, 또는 a는 2이고 b는 1인 11항 내지 14항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 폴리머.
16. 화학식 (III)에서 R2 내지 R5가 수소인 11항 내지 15항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 폴리머.
17. 폴리머인 11항 내지 16항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 폴리머.
18. 덴드리머인 17항의 폴리머.
19. 다음 화학식 (IV)의 구조를 갖는 리피도이드:
Figure pct00049
상기 화학식 (IV)에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6는 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이며 m+n은 ≥ 2이고;
R1 내지 R6는, 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C16 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C6 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 리셉터 리간드로부터 선택되되; 단 R1 내지 R6 중에서 적어도 2개의 잔기는 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이고;
화학식 (IV)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (IV)의 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
20. 화학식 (IV)에서, p가 1인 19항의 리피도이드.
21. 화학식 (IV)에서, n이 1인 19항 또는 20항의 리피도이드.
22. 화학식 (IV)에서, m이 1이고 n이 1인 19항 또는 20항의 리피도이드.
23. 화학식 (IV)에서, a가 1이고 b가 2이거나, 또는 a가 2이고 b가 1인 19항 내지 22항 중 어느 한 항의 리피도이드.
24. 화학식 (IV)에서, R1 내지 R6가 서로 독립적으로 수소 및 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, 또는 -CH(R7)-CH2-OH로부터 선택되고, 여기서 R7은 C8-C16 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C8-C16 알케닐로부터 선택되되; 단 R1 내지 R6 중에서 적어도 2개의 잔기는 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, 또는 -CH(R7)-CH2-OH이고, 여기서 R7은 C8-C16 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C8-C16 알케닐로부터 선택되는 19항 내지 22항 중 어느 한 항의 리피도이드.
25. mRNA와 1항 내지 18항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 폴리머를 포함하는 조성물.
26. 올리고머 또는 폴리머가 양이온성 올리고머 또는 폴리머인 25항의 조성물.
27. mRNA와 양이온성 올리고머 또는 폴리머의 복합체를 포함하는 25항의 조성물.
28. mRNA와 19항 내지 24항 중 어느 한 항의 리피도이드를 포함하는 조성물.
29. 리피도이드가 양이온성 리피도이드인 28항의 조성물.
30. mRNA와 양이온성 리피도이드의 복합체를 포함하는 29항의 조성물.
31. 동결건조 형태인 25항 내지 30항 중 어느 한 항의 조성물.
32. 동결건조보호제를 추가로 포함하는 31항의 조성물.
33. 동결건조보호제가 트레할로스인 32항의 조성물.
34. 25항 내지 33항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학 조성물.
35. 세포에 mRNA를 전달하기 위한, 25항 내지 33항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
36. 세포에 mRNA를 전달하기 위한, 1항 내지 18항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 폴리머 또는 19항 내지 24항 중 어느 한 항의 리피도이드의 용도.
37. 25항 내지 33항 중 어느 한 항의 조성물을 표적 세포 또는 조직과 접촉하는 단계를 포함하는, 표적 세포 또는 조직에 mRNA를 전달하는 방법.
도 1: mRNA를 사용한 다른 세포 타입의 형질감염 효율에 대한 폴리(아크릴산) 의 올리고(알킬렌 아민 ) 측쇄 변형 타입의 효과. 폴리플렉스를 측쇄 변형 (2-3-2) 및 (3-2-3) 또는 대조 그룹 (3-3-3), (2-2-2), (2-2) 또는 (3-4-3)을 갖는 폴리(아크릴산) (MW: 8,000Da)과 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 4 내지 44의 N/P 비로 표시된 세포 타입에 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 RNA(500, 250, 125 또는 62.5ng)로 형질감염된 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 2: (2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 PAA8k의 복합체 형성능을 측정하기 위한 겔 이동 어세이 . 폴리플렉스를 기술된 바와 같이 표시된 N/P 비로 형성하였다. 폴리머와 mRNA의 상호작용을 아가로스 겔에서의 이동으로 분석하였다. 상호작용이 좋을 수록 mRNA의 완전하게 방해된 이동을 위한 폴리머의 필요량은 더 적어진다.
도 3: (2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 PAA8k의 복합체 형성능의 결정을 위한 리보그 린(RiboGreen) 어세이 . 폴리플렉스를 기술된 바와 같이 표시된 N/P 비로 형성하였다. 폴리머와 mRNA의 상호작용을 리보그린을 첨가하여 분석하였다. 이 분자는 핵산과 상호작용하여 다량의 mRNA에서 형광 시그널을 증가한다. 핵산과 폴리머의 상호작용이 양호할수록, 형광 시그널의 검출은 더 적어진다. 시그널은 동일한 양의 자유 mRNA를 함유하는 대조군과 비교한 상대적 형광으로 표시된다.
도 4: 상이한 N,N ' - 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 (2-3-2) 변형 폴리 머의 형질감염 효능. 폴리플렉스를 표시된 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 변형 폴리머 (PAA8k: 폴리(아크릴산), MW 8,000Da; Glu9.8k: 폴리(글루탐산), MW 9,800Da; PMA9.5k: 폴리(메타크릴레이트), MW 9,500 Da; Glu64k: 폴리(글루탐산), MW 64,000 Da; GluLys: 폴리(글루탐산)-폴리(리신)-co-폴리머) (20,000-50,000 Da) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 4 내지 20의 N/P 비로 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 mRNA (500, 250, 125 또는 62.5ng)로 형질감염된 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 5: 상이한 분자량의 N,N ' - 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 (2-3-2) 변형 폴리(아크릴산)의 형질감염 효능. 폴리플렉스를 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2)로 변형된 표시된 분자량의 폴리(아크릴산)과 반딧불이 루시퍼라제를 4 내지 20의 N/P 비로 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 mRNA (500, 250, 125 또는 62.5ng)로 형질감염된 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 6: mRNA 폴리머 제제의 세포독성. 표시된 올리고(알킬렌 아민)으로 변형된 폴리(아크릴산)(MW 8,000Da, 20,000Da 및 70,000Da) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 포함하는 복합체를 4 내지 44의 N/P 비 및 상이한 양의 mRNA 형질감염에 사용하였다. 24시간 후에 세포 생존률을 상기한 바와 같이 측정하였다. 데이터를 형질감염되지 않은 세포와 비교한 생존률(%)로 나타내었다.
도 7: 마우스 폐에서 리포터 단백질 발현 수준. PAA20k-(2-3-2)와 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA의 폴리플렉스를 표시된 N/P 비로 혼합하고 에어로졸에 의해 마우스에 적용하였다.
도 8: N,N ' - 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 (2-3-2) 변형 폴리(아크릴 산)의 물리화학적 특성. 폴리플렉스를 생체 내 조건 하에 N/P 10으로 형성하였다. 사용 폴리머: 폴리(아크릴산), MW 20,000Da.
도 9: PAA20k -(2-3- 2)와 mRNA의 투과전자현미경 사진. 폴리플렉스를 N/P 10으로 혼합하여 투과전자현미경으로 분석하였다. 스케일 바(bar): 100nm. 사용 폴리머: 폴리(아크릴산), MW 20,000Da.
도 10: 폴리플렉스 제제의 에어로졸 적용 후 포사인 폐 조직에서 반딧불이 루시퍼라제의 발현. 좌측 사진 brPEI N/P 10. 우측 사진 PAA20k-(2-3-2) N/P 10. 사용 폴리머: 폴리(아크릴산), MW 20,000Da.
도 11: PAA20k -(2-3-2) 복합제를 동결건조하는 능력에 대한 트레할로스 효과. 복합체를 상기한 바와 같이 형성하여 1% 트레할로스의 존재 또는 부재 하에 동결건조하였다. 보이는 바와 같이, 트레할로스는 동결건조 및 재수화한 후 이러한 복합체의 mRNA 형질감염 효능을 보존할 수 있다.
도 12: DNA 형질감염 효능에 대한 (2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 폴리머의 효과. 폴리플렉스를 표시된 측쇄 변형을 갖는 폴리(아크릴산) (MW: 8,000Da)과 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 pDNA (pCMVLuc)를 4 내지 20의 N/P 비로 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 DNA (500, 250, 125 또는 62.5ng)로 형질감염된 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 대조용으로 분지된 PEI (brPEI) 25 kDa를 형질감염 시약으로 사용하였다.
도 13: GL3-Luc- siRNA와 N,N ' - 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 (2-3-2) 변형 폴리(아크릴산)의 복합체를 사용한 RNAi 유도 유전자 침묵(silencing). 반딧불이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 반딧불이 루시퍼라제 siRNA(siLuc) 또는 대조용 siRNA(siGFP)에 대한 siRNA와 PAA20k-(2-3-2)의 복합체를 표시된 N/P 비와 상이한 siRNA 양으로 사용하여 형질감염하였다. 루시퍼라제 발현을 24시간 후에 분석하고 미처리 세포와 비교한 상대적 발현으로 나타냈다.
도 14: NIH3T3 세포를 상이한 리피도이드 / mRNA 복합체로 형질감염한 후의 반딧불이 루시퍼라제 활성. 복합체를 mRNA와 (2-3-2) 또는 대조용 올리고(알킬렌 아민) (2-2-2) 및 (3-3-3)에 기초한 리피도이드 사이에서 16의 w/w-비(리피도이드 중량/mRNA 중량)로 형성하였다.
도 15: DNA 형질감염 효능에 대한 폴리(아크릴산)의 올리고(알킬렌 아민 ) 측 쇄 변형의 효과. 폴리플렉스를 표시된 측쇄 변형을 갖는 폴리(아크릴산) (MW: 8,000Da) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 pDNA(pCMVLuc)를 표시된 N/P 비로 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 DNA (500, 250, 125 또는 62.5ng)로 형질감염된 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다. mRNA 형질감염(도 1 참조)에 대하여 올리고(알킬렌 아민) 측쇄 변형은 형질감염 효능에 현저하게 영향을 주지 않았다.
도 16: 리피도이드 제제를 정맥내 주사한 후 뮤린의 간 및 비장에서 반딧불이 루시퍼라제의 발현. 왼쪽: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C12-(2-3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 3.6:0.18:0.76:1 중량비)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA; 오른쪽: 주사용수 중의 리피도이드 C12-(2-3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 3.6:0.18:0.76:1 중량비)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA. PBS 중의 제제만 간과 비장에서 발현이 일어났다(PBS: 1.6404x10^5 광자/s; 물: 검출할 수 없음).
도 17: 리피도이드 제제를 정맥내 주사한 후 뮤린의 간 및 비장에서 반딧불이 루시퍼라제의 발현. A. 생체 내 생체발광 영상: 왼쪽: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C14-(2-3-2) (C14-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA; 중앙: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C16-(2-3-2) (C16-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA; 오른쪽: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C12-(2-3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA. B. 생체 내 생체발광 시그널의 정량. 알킬쇄 길이를 C12-C16으로 증가하면서 발현 수준은 감소하였다.
도 18: 리피도이드 제제를 정맥내 주사한 후 뮤린의 간 및 비장에서 반딧불이 루시퍼라제의 발현. 도 17에 나타낸 처리 마우스로부터 간, 비장, 신장, 위, 심장, 폐 및 뇌를 절제하여 루시퍼라제 발현에 대해 영상화하였다. A. 생체발광 영상: 왼쪽: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C12-(2-3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA; 중앙: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C14-(2-3-2) (C14-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA; 오른쪽: 주사용 PBS 중의 리피도이드 C16-(2-3-3) (C16-(2-3-2):DOPE:콜레스테롤:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1)로 제제화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA. 루시퍼라제 발현은 간에서 리피도이드의 알칸쇄 길이가 증가하면서 감소하였고(C16<C14<C12), C16은 거의 검출할 수 없었다. 비장에서의 루시퍼라제 발현은 C14가 가장 높았다. 폐에서 일부 루시퍼라제 발현이 관찰되었으나, 심장, 신장, 위 또는 뇌에서는 관찰되지 않았다. B. A에서의 생체발광 시그널의 정량.
도 19: 상이한 형질감염 시약의 pDNA와 mRNA를 전달하는 능력에 대한 효능 비교. 폴리플렉스를 표시된 형질감염 시약(대응 특허 WO 2011/154331의 명명법에 따른 구조: #46 C-Stp3-C-K-OleA2; #454: C-Y3-Stp2-K(K-OleA2)-Stp2-Y3-C; #512: C-Sph3-K(Sph3-C)2)를 사용하여 형성하였다. 핵산 페이로드(payload)로서 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA 또는 pDNA (pCMVLuc)가 표시된 N/P 비로 사용되었다. 24시간 후에 상이한 양의 mRNA (500, 250, 125 또는 63ng)로 형질감염된 NIH3T3 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 20: N,N ' - 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 (2-3-2) 또는 N,N ' - 비 스(2-아미노에틸)-1,3-부탄디아민 (2-4- 2)으로 변형된 PAA8k의 형질감염 효능의 비교. 폴리플렉스를 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 또는 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-부탄디아민 (2-4-2)으로 변형된 PAA8k 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 표시된 N/P 비로 사용하여 형성하였다. 24시간 후에 상이한 양의 mRNA (500, 250, 125 또는 63ng)로 형질감염된 NIH3T3 세포를 용균하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 21: 리포플렉스의 투과전자현미경 사진
리피도이드/mRNA 복합체를 기술된 바와 같이 형성하여 투과전자현미경으로 분석하였다. 상위 레인: C10-(2-3-2)/DOPE/Chol/DPG-PEG, 하위 레인: C10-(2-3-2)/DPPC/Chol/DPG-PEG; 왼쪽 사진 오버뷰 스케일: 100 nm; 오른쪽 사진: 상세한 줌(zoom) 스케일 20 nm.
도 22: 1 - 브로모데칸으로부터 합성된 C10-(2-3- 2)의 형질감염 효능
C10-(2-3-2)는 1-브로모데칸을 사용하여 제조예 VII에 기술된 바와 같이 합성하였다. 형질감염 효능을 NIH3T3 세포에서 웰 당 500ng, 250ng 및 125ng의 용량으로 시험하였다.
도 23: N- 도데실 아크릴아미드로부터 합성된 C12-(2-3- 2)의 형질감염 효능
C12-(2-3-2)는 N-도데실 아크릴아미드를 사용하여 제조예 VIII에 기술된 바와 같이 합성하였다. 형질감염 효능을 NIH3T3 세포에서 웰 당 500ng, 250ng 및 125ng의 용량으로 시험하였다.
도 24: 도데실 - 아크릴레이트로부터 합성된 C12-(2-3- 2)의 형질감염 효능
C12-(2-3-2)는 도데실-아크릴레이트를 사용하여 제조예 IX에 기술된 바와 같이 합성하였다. 형질감염 효능을 NIH3T3 세포에서 웰 당 500ng, 250ng 및 125ng의 용량으로 시험하였다.
도 25: 리피도이드 제제를 포함하는 C12-(2-3- 2)의 형질감염 효능
리피도이드 제제는 N/P 17 또는 8로 DOPE 또는 DSPC와 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA와 함께 C12-(2-3-2) 및 DMG-PEG2k를 사용하여 생성하였다.
도 26: 생체 내 형질감염 효능에 있어서 C12 변형 올리고( 알킬 아민 ) (2-3-2), (3-3-3) 및 (2-2-2)의 비교
도 27: 변경된 C12- 알킬쇄 포화도 및 포지셔닝(positioning)을 갖는 C12-(2-3-2) 버젼의 형질감염 효율의 비교. a: 상이한 C12-(2-3-2) 버젼의 화학적 구조; b: 상이한 지질을 포함하는 제제로 NIH3T3 세포를 형질감염한 후의 리포터 단백질(반딧불이 루시퍼라제) 발현 수준
도 28: 리포플렉스의 동결건조 안정성
리피도이드 제제를 기술된 바와 같이 형성하고 물에 대해 투석하여 상이한 농도의 동결건조보호제(트레할로스 (A, D), 수크로스 (B, E) 및 락토스(C, F))와 혼합하였다. 냉동하고, 동결건조 및 재현탁한 후, NIH3T3 세포에서의 형질감염 효능 (A-C)과 수력학적 직경(D-F)을 측정하여 동일 조건하에서 새로 제조된 리포플렉스와 비교하였다.
도 29: C12-(2-3-2) 함유 리피도이드 제제로 형질감염한 후 생체 외 샘플에서 mRNA 발현. A: 돼지 근육, 모든 샘플 처리; B: 돼지 지방 조직, 모든 샘플 처리; C: 양의 동맥; D: 양 근육, 상위 샘플: 처리군, 하위 샘플: 미처리군; E: 양의 폐, 상위 샘플: 처리군, 하위 샘플: 미처리군
도 30: ACE-2 단백질에서 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석
왼쪽 레인: ACE-2 mRNA 처리 세포의 용해물; 오른쪽 레인: mRNA가 없는 리피도이드 제제로 처리된 세포의 용해물(비어있음). 윗줄: ACE-2의 염색; 아랫줄: GAPDH, 대조군 로딩.
도 31: 마우스에서 뮤린 에리트로포이에틴 발현. 혈액 샘플을 mEPO mRNA를 함유하는 C12-(2-3-2) 제제를 정맥 내 투여한 6시간 후에 mEPO에 대해 분석하였다. 상이한 3개 RNA 용량(20μg, 10μg 또는 5μg) 및 대조 그룹(PBS)을 분석하였다.
도 32: 상이하게 변형된 폴리(알릴아민)(PALAM)의 형질감염 효능 비교. NIH3T3 세포를 PALAM-(2-3-2), PALAM-(2-2-2) 또는 PALAM-(3-3-3)과 복합된 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA로 구성된 폴리플렉스를 사용하여 형질감염하였다.
도 33: 상이하게 변형된 폴리프로필렌이민(PPI)의 형질감염 효능 비교. NIH3T3 세포를 PPI-(2-3-2), PPI-(2-2-2) 또는 PPI-(3-3-3)과 복합된 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA로 구성된 폴리플렉스를 사용하여 형질감염하였다.
도 34: C12-(2-3-2) 제제를 피하 주사한 후 루시퍼라제의 발현. 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 함유하는 C12-(2-3-2)/DOPE/콜레스테롤/DMG-PEG2k.
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이다.
제조예 I:
N,N '- 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 변형 폴리 (아크릴산), MW 8,000 Da, PAA8k-(2-3-2)의 합성:
10mg 폴리(아크릴산) 소듐염(MW: 8,000 Da, Sigma Aldrich)을 50mM MES(pH 6.0)를 함유하는 2mL의 반응 완충액으로 희석하였다. 1.69g N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (100 eq./카복시 그룹, Sigma Aldrich)을 2mL의 동일 완충액으로 희석하였다. 올리고(알킬렌 아민)을 자유 염기로 구입하면, 32% HCl을 적가하여 pH를 pH 6.0으로 조절하였다. 폴리(아크릴산) 및 올리고(알킬렌 아민) 용액을 혼합하였다. 반응을 개시하기 위하여 카복실 그룹당 10배 몰 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC, Sigma Aldrich, 2mL 반응 완충액으로 희석)를 첨가하였다. 최종 부피를 10mL로 조절하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온으로 오버헤드 진탕기에서 인큐베이션하였다. 생성물을 투석에 의해 정제하였다. 이를 위하여 반응 혼합물을 slide-a-lyzer 투석 카세트(3-12mL, MWCO: 3,500 Da, Thermo Fisher)에 충전하고 물에 대해 72시간 동안 투석하였다. 물은 1일 2회 교환하였다. 투석한 후, 정제된 폴리머를 동결건조하였다. 동일 조건 하에서 다음 표 1에 나열된 폴리머를 합성 및 시험하였다.
Figure pct00050
제조예 II:
고체상 지원 펩티드 합성에 의한 브러쉬형 폴리머의 생성을 위한 올리고(알킬렌 아민) 구성요소의 합성:
I. 트리(Boc) 보호된 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민(EPE(Boc)3)의 합성
5g N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (31.2mmol)을 100mL 디클로로메탄 (DCM)에 용해하여 0℃로 냉각하였다. 4.43g의 에틸 트리플루오로아세테이트 (31.2mmol, 1eq./분자)를 100mL DCM으로 희석하고 교반된 용액에 4시간 동안 적가하였다. 첨가 후 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날, 19.46mL 트리에틸아민 (14.2g, 0.1404mol, 1.5eq./자유 아민)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 30.64g의 디-tert-부틸디카보네이트 (0.1404mol, 1.5 eq./아민)를 100mL DCM에 용해하고, 교반된 용액에 적가하여 실온에서 24시간 동안 일정한 교반 하에 인큐베이션하였다. 반응 후 유기상을 약 100mL로 농축하고 5%　NaHCO3로 3회 및 물로 3회 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4로 건조하고 여과하여 용매를 증발시켰다. 생성물을 100mL 메탄올과 200mL 3M NaOH (20　eq./분자)로 희석하고 밤새 실온에서 교반하였다. 메탄올을 증발시키고 수성 용액을 DCM으로 3회 세척하였다. 유기상을 모아서 무수 Na2SO4로 건조하고 여과 및 증발시켰다. 얻어진 분자 (EPE(Boc)3)를 H1-NMR로 분석하였다.
II. Fmoc-글루탐산 변형 보실화(bocylated) N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (Fmoc-Glu(EPE(Boc)3-OH)의 합성
3.5g N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-L-글루탐산 (Fmoc-Glu-OH, 9.47mmol)을 100mL의 아세트산 무수물과 혼합하고 유탕조에서 환류 및 일정한 교반 하에 용액이 투명해질 때까지 100℃로 가열하였다. 용액을 얼음으로 냉각하고 용매를 진공 증발에 의해 60℃에서 제거하였다. 생성물을 100mL 테트라하이드로푸란에 용해하였다. 5.24g EPE(Boc)3 (11.37mmol, 1.2eq./분자)를 100mL 테트라하이드로푸란으로 희석하여 3.3mL N,N-디이소프로필에틸아민 (18.94mmol, 2eq./분자)과 혼합하고 글루탐산을 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 증발시켜서 농축한 후, DCM으로 희석하고 트리소듐-시트레이트 완충액(0.1M, pH 5.5)으로 3회 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4로 건조한 다음, 샘플을 실리카 컬럼의 건식 컬럼 플래쉬 크로마토그래피로 헵탄/에틸 아세테이트 (50/50 내지 0/100) 및 에틸 아세테이트/메탄올 (100/0 내지 80/20)의 계단식 구배를 사용하여 정제하였다. 실리카 TLC 상에서 UV 시그널을 함유하는 분획을 모으고 용매를 증발시켜서 생성물을 H1-NMR로 분석하였다.
제조예 III:
고체상 지원 펩티드 합성에 의한 선형 및 분지형 폴리머의 생성을 위한 올리고(알킬렌 아민) 구성요소의 합성:
I. 디(Boc) 보호된 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민(EPE(Boc)2)의 합성
5g N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (31.2mmol)을 100mL 디클로로메탄 (DCM)에 용해하여 0℃로 냉각하였다. 8.86g의 에틸 트리플루오로아세테이트 (62.4mmol, 2eq./분자)를 100mL DCM으로 희석하고 교반된 용액에 4시간 동안 적가하였다. 첨가 후 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날, 13mL 트리에틸아민 (9.47g, 0.0936mol, 1.5eq./자유 아민)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 20.43g의 디-tert-부틸디카보네이트 (0.0936mol, 1.5 eq./아민)를 100mL DCM에 용해하고, 교반된 용액에 적가하여 실온에서 24시간 동안 일정한 교반 하에 인큐베이션하였다. 반응 후 유기상을 약 100mL로 농축하고 5%　NaHCO3로 3회 및 물로 3회 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4로 건조하고 여과하여 용매를 증발시켰다. 생성물을 100mL 메탄올과 200mL 3M NaOH (20　eq./분자)로 희석하고 밤새 실온에서 교반하였다. 메탄올을 증발시키고 수성 용액을 DCM으로 3회 세척하였다. 유기상을 모아서 무수 Na2SO4로 건조하고 여과 및 증발시켰다. 얻어진 분자 (EPE(Boc)2)를 H1-NMR로 분석하였다.
II. 숙시닐화, fmoc-보호된, 보실화(bocylated) N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (Fmoc-EPE(Boc)2-OH)의 합성
3.0g (EPE(Boc)2) (8.3mmol)를 50mL 테트라하이드로푸란에 재용해하고 0℃로 냉각하였다. 0.996g 숙신산 무수물(10mmol, 1.2 eq./분자)을 200mL 테트라하이드로푸란에 용해하여 교반된 용액에 적가하였다. 첨가 후, 반응물을 실온에서 1시간 동안 더 교반하였다. 4.34mL N,N-디이소프로필에틸아민 (33.2mmol, 4eq./분자)을 첨가하였다. 이후, 아세토니트릴/테트라하이드로푸란에 용해된 4.2g의 Fmoc N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (12.45mmol, 1.5 eq./분자)를 반응 혼합물에 적가하였다. 용액을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 약 100 ml로 농축하고, 100 ml의 디클로로메탄과 혼합하여 0.1M 시트르산나트륨 완충액(pH 5.2)으로 5회 세척하였다. 유기상을 건조하고 농축한 다음, 얻어진 생성물을 실리카 컬럼의 건식 컬럼 플래쉬 크로마토그래피로 n-헵탄에서 에틸 아세테이트 (100/0 - 0/100) 및 추가로 에틸 아세테이트/메탄올 (100/0 - 80/20)의 계단식 구배를 사용하여 정제하였다. 실리카 TLC 상에서 UV 시그널을 함유하는 분획을 모으고 용매를 증발시켜서 생성물을 H1-NMR로 분석하였다.
제조예 IV:
N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민에 기초한 리피도이드의 합성
100mg의 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623mmol)을 575.07mg의 1,2-에폭시도데칸 (3.12mmol, (N-1) eq. 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2배량의 1차 아민 + 1배량의 이차 아민이다)과 혼합하고 96시간 동안 80℃에서 일정한 교반 하에 혼합하였다. 반응 후에 얻어진 리피도이드를 25mM 소듐아세테이트 완충액(ph 5)으로 100 μg/mL의 농도로 희석하여 형질감염에 사용하였다.
동일한 조건하에서, 표 2에 기재된 리피도이드를 합성하였다:
Figure pct00051
제조예 V:
N,N '- 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 변형 폴리(알릴아민)의 합성; (PALAM-(2-3-2))
500mg의 폴리(알릴아민)-용액 (Sigma-Aldrich, 20% w/w, 분자량: 17,000Da)을 2mL의, 50mM MES를 함유하는 반응 완충액(pH 6.0)으로 희석하였다. 10.33g의 숙신산 (아민 당 50 eq., Sigma-Aldrich)을 5mL의 동일 반응 완충액으로 희석하였다. 용액을 모으고 pH를 6.0으로 다시 조정하였다. 반응을 개시하기 위하여, 5mL의 반응 완충액으로 희석된, 3.36g 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (아민 당 EDC, 10eq. Sigma Aldrich)를 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온으로 오버헤드 진탕기에서 인큐베이션하였다. 생성물을 투석에 의해 정제하였다. 이를 위하여, 반응 혼합물을 slide-a-lyzer 투석 카세트(3-12mL, MWCO: 10,000 Da, Thermo Fisher)에 충전하여 물에 대해 72시간 동안 투석하였다. 물은 1일 2회 교환하였다. 투석 후, 정제된 폴리머를 동결건조하였다.
5mg의 동결건조된, 숙신산 변형 폴리(알릴아민)을 50mM MES를 함유하는, 2mL의 반응 완충액(pH 6.0)에 희석하였다. 510.38mg의 N,N '- 비스 (2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (100eq./카복실 그룹, Sigma Aldrich)을 2mL의 동일 완충액으로 희석하였다. 올리고(알킬렌 아민)을 자유 염기로 구입하면, 32% HCl을 적가하여 pH를 pH 6.0으로 다시 조정하였다. 폴리(알릴아민) 및 올리고(알킬렌 아민) 용액을 혼합하였다. 반응을 개시하기 위하여, 카복실 그룹 당 10배 몰 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC, Sigma Aldrich, 4mL 반응 완충액으로 희석)를 첨가하였다. 최종 부피를 10mL로 조정하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온으로 오버헤드 진탕기에서 인큐베이션하였다. 생성물을 투석에 의해 정제하였다. 이를 위하여, 반응 혼합물을 slide-a-lyzer 투석 카세트(3-12mL, MWCO: 3,500 Da, Thermo Fisher)에 충전하여 물에 대해 72시간 동안 투석하였다. 물은 1일 2회 교환하였다. 투석 후, 정제된 폴리머를 동결건조하였다.
동일한 조건하에서, 이하의 표 3에 기재된 폴리머를 합성 및 시험하였다:
Figure pct00052
제조예 VI:
N,N '- 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 변형 폴리프로필렌이민 ( PPI -(2-3-2))의 합성
100mg의 폴리프로필렌이민 헥사데카아민 덴드리머 (PPI, generation 3.0, Sigma Aldrich)를 50mM MES를 함유하는 1.5mL의 반응 완충액(pH 6.0)에 용해하였다. 11.2g의 숙신산 (100 eq. 1차 아민 당, Sigma-Aldrich)을 30mL의 동일한 반응 완충액에 용해하였다. 용액을 모아서 pH를 6.0으로 다시 조정하였다. 반응을 개시하기 위하여 2mL의 반응 완충액에 희석된 1.81g의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC, 10eq. 1차 아민 당, Sigma Aldrich)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 오버헤드 진탕기에서 밤새 인큐베이션하였다. 생성물을 투석에 의해 정제하였다. 이를 위하여, 반응 혼합물을 slide-a-lyzer 투석 카세트(3-12mL, MWCO: 2,000 Da, Thermo Fisher)에 충전하여 물에 대해 72시간 동안 투석하였다. 물은 1일 2회 교환하였다. 투석 후, 정제된 폴리머를 동결건조하였다.
10mg의 동결건조된, 숙신산 변형 PPI를 50mM MES를 함유하는, 2mL의 반응 완충액(pH 6.0)에 희석하였다. 0.776g N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (100eq./카복실 그룹, Sigma Aldrich)을 2mL의 동일한 완충액으로 희석하였다. 올리고(알킬렌 아민)을 자유 염기로 구입하면, 32% HCl을 적가하여 pH를 pH 6.0으로 다시 조정하였다. 폴리프로필렌이민 및 올리고(알킬렌 아민) 용액을 혼합하였다. 반응을 개시하기 위하여, 카복실 그룹 당 10배 몰 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC, Sigma Aldrich, 4mL 반응 완충액으로 희석)를 첨가하였다. 최종 부피를 10 mL로 조정하였다. 혼합물을 5시간 동안 실온으로 오버헤드 진탕기에서 인큐베이션하였다. 생성물을 투석에 의해 정제하였다. 이를 위하여, 반응 혼합물을 slide-a-lyzer 투석 카세트(3-12mL, MWCO: 3,500 Da, Thermo Fisher)에 충전하여 물에 대해 72시간 동안 투석하였다. 물은 1일 2회 교환하였다. 투석 후, 정제된 폴리머를 동결건조하였다.
동일한 조건하에서, 이하의 표 4에 기재된 폴리머를 합성 및 시험하였다:
Figure pct00053
제조예 VII:
N,N '- 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 및 1- 브로모데칸에 기초한 리피도이드의 합성
100mg의 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민(0.623 μmol)을 10mL의 테트라하이드로푸란(THF)과 혼합하였다. 815.2μL의 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA)과 690.1mg의 1-브로모데칸 (3.12μmol, (N-1) eq. 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2배량의 1차 아민 + 1배량의 이차 아민이다)과 혼합하고 22시간 동안 실온에서 일정한 교반 하에 혼합하였다. 생성물을 차가운 n-헥산에서 2회 침전하고 DCM에 용해하였다. 용매를 증발에 의해 60℃에서 제거하였다. 얻어진 리피도이드를 에탄올로 50mg/mL의 농도로 희석하여 4℃에서 보관하였다.
제조예 VIII:
N,N '- 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 및 N- 도데실 아크릴아미드에 기초한 리피도이드의 합성
100mg의 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623μmol)을 746.9mg의 N-도데실 아크릴아미드(3.12μmol, (N-1) eq. 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2배량의 1차 아민 + 1배량의 이차 아민이다)와 혼합하고 192시간 동안 90℃에서 일정한 교반 하에 혼합하였다. 얻어진 리피도이드를 에탄올로 50mg/mL의 농도로 희석하여 4℃에서 보관하였다.
제조예 IX:
N,N '- 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 및 도데실 아크릴레이트에 기초한 리피도이드의 합성
100mg의 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623μmol)을 750mg 도데실 아크릴레이트 (3.12μmol, (N-1) eq. 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2배량의 1차 아민 + 1배량의 이차 아민이다)와 혼합하고 22시간 동안 90℃에서 일정한 교반 하에 혼합하였다. 얻어진 리피도이드를 에탄올로 50mg/mL의 농도로 희석하여 4℃에서 보관하였다.
제조예 X:
N,N '- 비스 (2- 아미노에틸 )-1,3- 프로판디아민 및 1,2- 에폭시도데칸에 기초한 리피도이드의 합성
100mg N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623mmol)을 575.07mg의 1,2-에폭시도데칸 (3.12mmol, (N-1) eq. 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2배량의 1차 아민 + 1배량의 이차 아민이다)과 혼합하고 96시간 동안 80℃에서 일정한 교반 하에 혼합하였다. 얻어진 리피도이드를 에탄올로 50mg/mL의 농도로 희석하여 4℃에서 보관하였다.
실시예 1
mRNA를 상이한 세포주에 운반하는 양이온성 폴리머의 능력에 대한 시험
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
시험관 내 형질감염에 있어서, 폴리플렉스는 44μL의 부피로 형성하였다. 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는, 1100ng의 mRNA (25%의 5-메틸시티딘 및 2-티오유리딘 각각을 포함하는 화학적으로 변형된 mRNA)를 함유하는 주사용수 22μL를 목적하는 양의 폴리머를 함유하는 22μL의 주사용수와 혼합하였다. 폴리머 대 RNA 비를 핵산 포스페이트 그룹에 대한 폴리머 질소(N/P)로서 정의하였고 일정한 양의 핵산을 사용하여 시험하였다. 핵산과 폴리머를 혼합한 후, 샘플을 30분 동안 실온에서 인큐베이션하여 형질감염에 사용하였다.
폴리플렉스의 시험관 내 형질감염:
폴리머를 2개의 상이한 세포주(NIH3T3 및 A549)에서 형질감염 효능에 대해 시험하였다. 처리하기 24시간 전에, 100μL 배지 중의 5,000 세포 (NIH3T3) 또는 7,000 세포 (A549)를 96-웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 형질감염 당일에 폴리플렉스를 기술된 바와 같이 형성하였다. 상이한 mRNA 양을 시험하기 위해 연속 희석을 50%의 폴리플렉스 용액과 동량의 (FCS가 없는) 배지와 혼합하여 수행하고, 이 용액을 취하여 유사한 추가 희석 단계 등을 최종 농도가 62.5ng/20μL에 이를 때까지 수행하였다. 20μL의 매 희석단계를 배지 교환없이 세포에 첨가하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 제거하였다. 세포를 100μL의 용균 완충액(25mM Tris HCl, 0.1% TritonX 100, pH 7.8)을 첨가하고 20분 동안 실온에서 인큐베이션하여 용균하였다. 80μL의 용해물을 화이트 96-웰 플레이트의 웰에 충전하고 Wallac Victor2 (Perkin Elmer)에서의 루시퍼라제 활성 측정에 사용하였다. 이를 위하여 100μL의 루시퍼라제 어세이 시약(0.5mM D-루시페린, 0.3mM 코엔자임 A, 33mM DTT, 0.5mM ATP, 1mM 탄산마그네슘, 2.7mM 황산마그네슘, 0.1mM EDTA, 20mM 트리신)을 첨가하고 화학발광을 측정하였다. 실험은 3회 반복 수행하였다.
결과
도 1에서 보이는 바와 같이, 루시퍼라제의 발현 수준은 상이한 변형 폴리머 간에 극도로 달랐다. 모든 세포 타입에 대해 가장 효율적인 형질감염 수준은 PAA8k-(2-3-2) 또는 PAA8k-(3-2-3)을 사용하여 얻어질 수 있는 반면, 알킬쇄 중 하나가 대체((2-2-2) 및 (3-3-3))되거나, 제거(2-2)된 올리고(알킬렌 아민) 측쇄를 함유하는 변형 폴리머는 효능이 10-1000배까지 급격하게 감소하였다. 올리고(알킬렌 아민)에서 모든 알킬쇄의 연장(3-4-3)은 또한 효능을 100배까지 저하시켰다.
실시예 2
(2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 PAA8k의 복합체 형성 및 mRNA 결합능.
재료 및 방법
겔 이동 어세이:
폴리플렉스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 N/P 1, 2, 4, 8 및 12로 형성하였다. 인큐베이션한 후, 5μL의 샘플을 10분 동안 70℃에서 인큐베이션한 5μL의 2x RNA 로딩 염료(Fermentas)와 혼합하여 에티듐 브로마이드를 함유하는 1% 아가로스 겔에 적재하였다. TBE-완충액에서 150V로 30분 동안 겔 이동을 수행하였다. 이동된 핵산을 UV 흡수로 260 nm에서 가시화하였다.
리보그린(RiboGreen) 어세이:
폴리플렉스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 N/P 1, 2, 4, 8 및 12로 형성하였다. 인큐베이션한 후, 2μL의 샘플을 148μL의 물 및 50μL 리보그린 용액(1:200, QuantiT Ribogreen RNA Assay Kit, Invitrogen)과 화이트 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 샘플을 5분 동안 실온에서 빛을 차단한 상태에서 인큐베이션하고 형광을 Wallac Victor2 (Perkin Elmer, 1s, Ex.: 485nm, Em.: 535nm)을 사용하여 측정하였다.
결과
핵산과 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 폴리머의 능력은 효율적인 운반 시스템의 중요한 특징이다. 변형 폴리머와 mRNA의 상호작용을 겔 이동(도 2)과 리보그린 어세이(도 3)로 분석하였다. 폴리머가 핵산과 상호작용하여 안정한 복합체를 형성할 수 있는 경우, 이것은 나노크기 입자와 전하 역전을 유발한다. 두 효과로 인해 아가로스 겔 전기영동에서 이동능이 방해된다. 도 2에서 보이는 바와 같이, (2-3-2) 또는 (3-2-3)으로 변형된 PAA8k는 폴리머가 없는 대조군(N/P 0)과 비교하여 자유 mRNA의 부재/강력한 감소를 유발하였으며, 이것은 강력한 상호작용을 시사한다. 이 결합은 판단기준 분지형 PEI (brPEI)를 사용한 것만큼 효율적이었다.
이러한 데이터는 리보그린 어세이를 사용하여 확인할 수 있다. 이 어세이에서, 증가된 결합 효능은 형광 시그널을 감소한다. 도 3에서 보이는 바와 같이, 형광 시그널의 감소는 PAA8k-(2-3-2) 및 -(3-2-3)에 대해 brPEI만큼 강력하였다. 따라서, 유사한 안정성을 갖는 복합체가 형성되었다.
실시예 3
폴리머 주쇄와 독립적인 형질감염 효능
재료 및 방법
폴리플렉스 형성을 실시예 1에 따라 수행하였다.
폴리플렉스의 시험관 내 형질감염
폴리플렉스의 시험관 내 형질감염과 효능 시험을 위해 NIH3T3 세포를 사용하였다. 처리하기 24시간 전에 10% FCS를 함유하는 100μL 배지 중의 5000 세포를 96-웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 형질감염 당일에 배지를 FCS가 없는 100μL 배지로 교환하였다. 폴리플렉스를 상기한 바와 같이 형성하였다. 상이한 mRNA를 시험하기 위해 20μL (500ng), 10μL (250ng), 5μL (125ng) 및 2.5μL (62.5ng)를 배지에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 10% FCS를 함유하는 새로운 배지로 대체하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 제거하였다. 세포를 용균하여 실시예 1에서와 같이 분석하였다.
결과
핵산을 세포에 (2-3-2) 변형 폴리머를 사용하여 운반하는 능력이 주쇄 구조와는 독립적이라는 것을 확인하기 위해 다양한 타입의 폴리머(폴리(아크릴산) 외, 8,000Da 실시예 1)가 기술된 조건(표 1) 하에서 (2-3-2)로 변형되었다. 그 결과, 올리고(알킬렌 아민) (2-3-2)로 변형된 경우, 상이한 타입의 주쇄-폴리머(도 4) 뿐만 아니라 사슬 길이(도 5)가 상당한 리포터 유전자 발현을 유발하는 것으로 나타났다.
실시예 4
상이한 타입의 올리고(알킬렌 아민)으로 변형된 폴리머의 세포 독성 확인
재료 및 방법
형질감염을 실시예 3에 따라 수행하였다. 살아있는 세포에 대한 측정을 TACS MTT 세포 증식 어세이 (Trevigen)를 사용하여 수행하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 100μL의 새로운 배지로 교환하였다. 10μL MTT 시약을 첨가한 후, 세포를 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 100μL의 계면활성제를 첨가한 다음, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 570nm에서 Wallac Victor2 (Perkin Elmer)를 사용하여 흡광 측정에 의해 판독하였다. 결과를 미처리된 대조군과 비교하여 살아있는 세포(%)로 나타내었다.
결과
도 6에서 보이는 바와 같이 상이한 변형 폴리머는 세포 독성 측면에서 달랐다. (2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 폴리(아크릴산)을 함유하는 복합체로 처리된 세포가 약 100%의 생존률을 나타낸 반면(PAA8k-(2-3-2), PAA8k-(3-2-3), PAA20k-(2-3-2), PAA70k-(2-3-2)), 측쇄 형태에서 다른 변경(PAA8k-(3-4-3), PAA8k-(3-3-3))은 독성 표준(brPEI)과 비교하여 강력한 독성을 나타내었다.
실시예 5
마우스에서 메신저 RNA 운반 효능
재료 및 방법
동물:
6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Janvier(Route Des Chenes SecsBP5, F-53940 Le Genest St. Isle, France)로부터 입수하였고, 특정 무균 조건 하에서 유지하였다. 마우스를 적어도 실험 7일 전에 동물 시설 환경에 적응시켰다. 모든 동물 과정은 지역윤리위원회가 승인 및 관리하였으며 동물 생태 보호에 대한 독일법의 가이드라인을 준수하였다.
폴리플렉스 형성:
폴리플렉스는 다음과 같이 제제화하였다: mRNA 및 PAA20k-(2-3-2)를 4.0 ml의 2차 증류수에 희석하여 500 μg/ml mRNA 및 PAA20k-(2-3-2)의 농도를 N/P 10, 20, 30 또는 40에 해당하는 농도로 얻었다. mRNA 용액을 폴리머 용액에 피펫팅하고 위아래 피펫팅으로 혼합하여 250 μg/ml의 최종 mRNA 농도를 얻었다. 복합체를 사용하기 전에 주위온도에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
에어로졸 장치의 디자인:
전신 장치의 분무방법을 위해, 마우스를 뚜껑으로 밀폐할 수 있는 9.8×13.2×21.5 cm 플라스틱 박스에 넣었다. 박스의 좁은 한 측면에 4 개의 작은 구멍을 에어로졸 유출구로 배치하였다. 반대쪽 좁은 측면 전체에 걸쳐서 박스를 2.1 cm 직경 연결조각에 의해 폭 15.4 cm×길이 41.5 cm 플라스틱 실린더에 연결하였다. 실린더 바닥은 실린더의 다른 말단에 연결된 제트 네뷸라이저(PARI BOY® LC plus, PARI GmbH)로 제조된 에어로졸을 건조하는 150 g의 실리카겔(1-3 mm, #85330; Fluka, Switzerland)로 고르게 덮었다. (Rudolph et al., J Gene Med. 2005, 7: 59-66에 상세하게 기술).
마우스 폐에서 생체 내 생체발광 영상화를 사용한 Luc 활성의 측정:
투여한 24시간 후에 마우스를 경추탈골에 의해 안락사시켰다. 중앙부위 절개로 개복한 후, 동물에서 폐를 절제하여 PBS에 관류하였다. 폐를 액체 질소에 급속 결빙하여 결빙된 상태에서 균질화하였다. 400μL의 용균 완충액(250 mM 트리스 pH 7.8, 0.1 % 트리톤 X-100, Roche 완전 프로테아제 저해제 칵테일 정제)을 첨가하여 20분 동안 빙냉에서 인큐베이션한 후, 상청액 중의 루시퍼라제 활성을 Lumat LB9507 튜브 루미노미터(EG&G Berthold, Munich, Germany)를 사용하여 측정하였다.
결과
본 실험은 mRNA가 PAA20k-(2-3-2)와의 조합으로서 폐 에어로졸 전달시 마우스의 폐 세포에서 효과적으로 발현되는 것을 나타내는 것으로, 폴리머가 생체 내 폐 세포에 mRNA를 효율적으로 운반할 수 있는 것을 시사한다(도 7 참조).
실시예 6
돼지에서 메신저 RNA 운반 효율
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
생체 내 형질감염을 위해 폴리플렉스를 28mL의 부피로 형성하였다. 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 5.83mg의 mRNA와 β-갈락토시다제를 코딩하는 1.17mg의 mRNA를 함유하는 주사용수 14mL 및 목적하는 양의 폴리머를 함유하는 주사용수 14mL를 준비하여 2채널 시린지 펌프(KDS-210-CE; KD Scientifc)로 혼합하였다. 2개의 20mL 시린지를 장치의 회수(withdrawal) 기능을 사용하여 충전하였다. T-피스(piece) (Discofix C 3SC, B.Braun)에 의해 시린지를 연결하고 혼합 장치의 주입 기능을 사용하여 혼합하였다. 폴리머 대 mRNA 비는 핵산 포스페이트 그룹 당 폴리머 질소로 정의되며(N/P), N/P 10으로 시험하였다. 핵산과 폴리머를 혼합한 후, 샘플을 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고 24mL를 분무에 사용하였다. 남은 부피는 물리화학적 분석에 사용하였다. 순수 샘플의 입자 크기와 제타 전위는 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments)를 사용하여 측정하였다.
에어로졸을 돼지에 적용하는 실험적 방법:
돼지의 진정을 체중 1kg 당 2mg의 아자페론, 체중 1kg 당 15mg의 케타민, 체중 1kg 당 0.1mg의 아트로핀으로 사전투약하여 개시한 다음, 측면 귀 정맥에 정맥 내 선을 삽입하였다. 돼지는, 필요하다면 체중 1kg 당 3-5mg의 프로포폴을 정맥 내 주사하여 마취시켰다. 마취는, 필요하다면 1% 프로포폴의 정맥 내 연속주입으로 유지하였다. 환기 파라미터는 종말호기(endexpiratory) 이산화탄소와 일치하였고, 필요하다면 조절하였다. 마취, 호흡 및 심장혈관 파라미터는 맥박 산소측정법, 카프노그래피(capnography), 직장 온도 프로브 및 반사 상태를 사용하여 지속적으로 관찰하였다. 돼지에게는 10 ml/kg/h의 균형 전해질 용액을 주입하였다. 마취 기간은 대략 80-120 분이었다. 돼지는 에어로졸 적용(Aeroneb 메쉬 네뷸라이저)을 완료한 후 진정시키고, 측부 귀 정맥을 통해 체중 1kg 당 펜토바비탈 100mg을 볼루스 주사하여 치사하였다. 폐를 절제하고 약 1cm 두께의 슬라이스 조직편을 다양한 폐 영역에서 수집하여 인큐베이터에서 24시간 동안 37℃, 5% CO2로 세포 배양배지 내에서 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성의 측정을 위해 조직편을 PBS(100μg/ml) 중의 D-루시페린 기질을 포함하는 배양배지 중에서 37℃로 30분 동안 인큐베이션하고 생체 외 루시퍼라제 생체발광 영상화를 수행하였다(IVIS 100, Xenogen, Alameda, USA).
폴리플렉스의 투과전자현미경:
투과전자현미경(TEM)에서는, 에어로졸 적용을 위해 제조된 혼합물 1 액적을 사용하였다. 액적을 격자판(Plano GmbH, Wetzlar)에 올렸다. 5분 동안 인큐베이션한 후, 여과지를 사용하여 액적을 제거하였다. 샘플은 우라닐 아세테이트 용액으로 염색하고 투과전자현미경으로 분석하였다(Jem 1011, Jeol).
결과
도 8에서 보이는 바와 같이, N/P-비 10의 PAA20k-(2-3-2) 및 mRNA는 100nm 미만의 수력학적 복합체 직경과 40mV의 표면 전하(제타 전위)를 갖는 복합체를 생성하였다. 두 파라미터는 생체 내에서 핵산을 세포 내로 효과적으로 운반하는 것으로 이미 입증된 brPEI 기반 복합체와 동일한 크기의 범위이다. TEM으로 분석했을 때 입자들은 둥근 모양과 균일한 크기를 나타냈다(도 9). 도 10에서 보이는 바와 같이, 이 입자들은 표적 단백질의 발현을 유발하는 에어로졸 적용 후에 폐 조직에 mRNA(반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는)를 효율적으로 전달할 수 있다. 발현 수준은 판단기준 brPEI로 형성된 폴리플렉스의 분무화에 필적하였다.
실시예 7
복합체의 동결건조 안정성
재료 및 방법
샘플 제조
PAA20k-(2-3-2)/mRNA (메트리디아(metridia) 루시퍼라제를 코딩하는) 복합체를 실시예 1에 기술된 바와 같이 4개의 상이한 바이알에서 N/P 20으로 1mL의 부피로 형성하였다. 하나의 바이알은 형질감염의 추가 처리없이 사용하였으며, 2번째 바이알에는 100μL의 11% 트레할로스를 1% 트레할로스의 최종 부피가 되도록 첨가하였고, 3번째 바이알은 동결건조하고 1mL 물로 재수화하였다. 4번째 바이알은 동결건조 및 1mL 물로 재수화하기 전에 100μL의 11% 트레할로스로 처리하였다.
형질감염:
형질감염 24시간 전에 100μL 배지 중의 5,000 NIH3T3 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 형질감염 당일에 배지를 FCS를 함유하지 않는 100μL의 새로운 배지로 교환하였다. 20, 10, 5 및 2.5μL의 모든 복합체 용액을 세포에 3회 반복 첨가하여 500, 250, 125 및 62.5ng으로 형질감염을 유발하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 제거하고 수집하여 새로운 배지로 대체하였다. 48시간 및 72시간 후에 이를 반복하였다. 모아진 배지를 메트리디아 루시퍼라제 활성에 대해 분석하였다. 이를 위하여 50μL 배지를 화이트 96-웰 플레이트에 충전하고 20μL 코엘렌테라진(coelenterazine) 용액(50μM 코엘렌테라진 / 50mM 소듐 포스페이트-완충액)과 혼합하여 Wallac Victor2 (Perkin Elmer)를 사용하여 화학발광 시그널을 측정하였다.
결과
도 11에서 보이는 바와 같이, 새로운 복합체는 24시간 후에 메트리디아 루시퍼라제 발현을 유도하였다. 발현은 추가 24시간 동안 계속 안정하였고, 이후 서서히 감소하였다. 이 효과는 트레할로스의 첨가에 의해 부정적으로 영향받지 않고 발현 수준을 약간 증가하였다. 동결건조 후에 미처리 복합체는 세포를 형질감염할 수 없어서 리포터 단백질 발현의 부재를 유발하였다. 이에 반해 트레할로스 첨가는 복합체 및 발생한 형질감염 효능을 보존하였다.
실시예 8
플라스미드 DNA의 운반 시스템으로서 PAA8k-(2-3-2) 및 PAA8k-(3-2-3)의 용도
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
폴리플렉스는 mRNA 대신에 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 플라스미드 DNA (pCMVLuc, Plasmid Factory)를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 형성하였다.
폴리플렉스를 사용한 시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과
이 실험에서, DNA 운반과 얻어진 단백질 발현에서 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 변형 폴리머 (폴리(아크릴산)의 효능은 판단기준 분지형 PEI (brPEI, 도 12)와 비교하여 분석하였다. 그 결과, pDNA 및 올리고(알킬렌 아민) (2-3-2) 및 (3-2-3) 변형 폴리머로 구성된 복합체를 사용한 NIH3T3 세포의 형질감염은 리포터 단백질 발현에서 상당한 증가를 유발하는 것이 분명하였다. 발현 수준은 판단 기준보다 더 높았다.
실시예 9
RNA 간섭을 유발하는 siRNA의 운반 시스템으로서 PAA20k-(2-3-2)의 용도
재료 및 방법
복합체를 실시예 1에 기술된 바와 같이 GL3-Luc siRNA (Qiagen)를 사용하여 형성하였다. siRNA 양을 적정하기 위해 복합체를 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후에 단계적으로 희석하였다. 이를 위하여 22μL의 복합체 용액을 FCS가 없는 22μL의 배지와 혼합하였다. 22μL의 희석액을 다시 FCS가 없는 22μL의 배지와 혼합하였다. 이 연속 희석을 20μL당 7.8ng의 siRNA 농도가 얻어질 때까지 반복하였다. 20μL의 매 단계 희석물을 반딧불이 루시퍼라제를 안정하게 발현하는 HeLa 세포 (HeLa-Luc)를 사용하여 실시예 1에서 기술된 바와 같이 형질감염에 사용하였다. 루시퍼라제 발현의 하향 조절에 기초한 RNA 간섭 특이성에 대한 대조군으로서 세포 발현에 영향을 미치지 않는 대조용 siRNA(GFP22-siRNA; Qiagen)를 동일 조건 하의 형질감염에 사용하였다. 결과는 미처리 대조용 세포와 비교한 상대적 루시퍼라제 발현으로 나타냈다.
결과
도 13에서 보이는 바와 같이 GL3-Luc-siRNA (siLuc)와 PAA20k-(2-3-2)의 복합체는 루시퍼라제 발현의 하향 조절을 유도하였다. 이 효과는 용량 의존적(적은 양의 siRNA에서 효과 감소) 및 특이적(비특이적 siRNA (siGFP)에 대해 효과 없음)이었다. 높은 N/P 비에서 추가적인 비특이적 효과는 siGFP 처리 세포의 감소된 시그널이 표시될 때 관찰할 수 있다.
실시예 10
올리고(알킬렌 아민) (2-3-2)에 기초한 리피도이드 구조의 유리한 mRNA 운반 효능
재료 및 방법
리피도이드/mRNA 복합체 형성
리피도이드를 제조예 IV에 기술된 바와 같이 합성하여 희석하였다. 형질감염을 위하여 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 250ng의 mRNA를 50μL의 물에서 최적 조건 하에 50μL 물 중의 4,000 ng 리피도이드와 혼합하여 16의 w/w 비(리피도이드 중량/mRNA 중량)을 얻었다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 샘플을 형질감염에 사용하였다.
리피도이드/mRNA 복합체를 사용한 시험관 내 형질감염
처리하기 24시간 전에 100μL 배지 중의 5,000 NIH3T3 세포를 96-웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 형질감염 당일에 폴리플렉스를 기술된 바와 같이 형성하였다. 상이한 mRNA 양을 시험하기 위하여 연속 희석을 50%의 복합체 용액과 동량의 (FCS가 없는) 배지와 혼합하고, 이 용액을 취하여 15.6ng/50μL의 최종 농도를 달성할 때까지 유사한 추가 희석 단계 등을 수행하였다. 형질감염 전에 배지를 세포에서 제거하고 FCS가 없는 100μL 배지로 교환하였다. 50μL의 매 희석 단계물을 세포에 첨가하고 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 배지를 10% FCS를 함유하는 새로운 배지로 다시 대체하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 제거하였다. 세포를 용균하여 용해물을 실시예 1에서와 같이 리포터 단백질 활성에 대해 분석하였다.
결과
도 14에서 보이는 바와 같이 구조 (2-3-2)에 기초한 리피도이드는 (2-2-2) 또는 (3-3-3)에 기초한 유사한 구조보다 더 높은 반딧불이 루시퍼라제 발현 수준을 유발하였다. 이 효과는 결합된 알킬쇄(C12 또는 C14)에 대해 독립적으로 입증될 수 있다. 반딧불이 루시퍼라제의 활성은 세포 내 그의 발현 수준, 그에 따른 세포 내로의 mRNA 운반 효능과 연관되어 있으므로, 이러한 결과는 (2-3-2) 기반 리피도이드가 mRNA를 시험관 내에서 세포 내로 더 효율적으로 운반하는 것을 나타낸다.
실시예 11
정맥 내 투여후 마우스에서 리피도이드 제제의 메신저 RNA 운반 효능
재료 및 방법
동물:
6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Janvier(Route Des Chenes SecsBP5, F-53940 Le Genest St. Isle, France)로부터 입수하였고, 특정 무균 조건 하에서 유지하였다. 마우스를 적어도 실험 7일 전에 동물 시설 환경에 적응시켰다. 모든 동물 과정은 지역윤리위원회가 승인 및 관리하였으며 동물 생태 보호에 대한 독일법의 가이드라인을 준수하였다.
리피도이드 제제:
리피도이드는 mRNA를 사용하여 다음과 같이 제제화하였다: C12-(2-3-2), DOPE, Chol 및 DSPE-PEG2k (3.6:0.18:0.76:1 중량비)를 에탄올에 용해하고 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 화학적으로 변형된 mRNA를 지질/mRNA 중량비 10.5로 포함하는 시트르산염 완충 용액(10 mM 시트르산, 150 mM NaCl, pH=4.5)에 재빨리 주사하여 20%의 에탄올 최종 농도를 얻어서 물에 투석하였다. 얻어진 리피도이드/mRNA 복합체가 양으로 하전된 나노입자(92.6 ± 0.7nm; 21.0 ± 0.2mV)를 생성하였고 진정된 마우스의 꼬리 정맥에 정맥 내 주입하였다. 2차 실험에서 리피도이드/mRNA 복합체를 정맥 내 주입 전에 PBS로 조절하여 거의 하전되지 않은 나노입자(91.5 ± 0.6nm; -0.7 ± 0.2mV)를 얻었다.
생체 내 생체발광 영상화를 사용한 마우스 내 Luc 활성의 측정:
투약 24시간 후에 마우스를 메데토미딘(11.5 μg/kg BW), 미다졸람 (115 μg/kg BW) 및 펜타닐 (1.15 μg/kg BW)의 복강 내 주입으로 마취시켰다. D-루시페린 기질(마우스당 3 mg/100 μL PBS)을 복강내 주입으로 적용하였다. 생체발광을 10분 후에 IVIS 100 영상화 시스템(Xenogen, Alameda, USA) 및 카메라 세팅(Bin(HS), 관측시야 10, f1 f-stop, 고해상 비닝(binning) 및 노출시간 5 분)을 사용하여 측정하였다. 시그널을 정량하고 Living Image 소프트웨어 버젼 2.50 (Xenogen, Alameda, USA)을 사용하여 분석하였다.
결과
실험 결과, 리피도이드/mRNA 복합체가 물이 아니라 거의 중성전하를 갖는 PBS로 제제화된 경우에만 mRNA가 마우스의 복부 영역에서 효과적으로 발현되는 것으로 나타났다(도 16 참조).
실시예 12
리피도이드 제제의 마우스에서 상이한 기관에 대한 정맥 내 투여 후 메신저 RNA 운반 효능
재료 및 방법
동물:
6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Janvier(Route Des Chenes SecsBP5, F-53940 Le Genest St. Isle, France)로부터 입수하였고, 특정 무균 조건 하에서 유지하였다. 마우스를 적어도 실험 7일 전에 동물 시설 환경에 적응시켰다. 모든 동물 과정은 지역윤리위원회가 승인 및 관리하였으며 동물 생태 보호에 대한 독일법의 가이드라인을 준수하였다.
리피도이드 제제:
리피도이드는 mRNA를 사용하여 다음과 같이 제제화하였다: 리피도이드, DOPE, Chol 및 DMPE-PEG2k (8:6:5:1 몰비)를 에탄올에 용해하고 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 화학적으로 변형된 mRNA를 N/P 비 15로 포함하는 시트르산염 완충 용액(10 mM 시트르산, 150 mM NaCl, pH=4.5)에 재빨리 주입하여 20%의 에탄올 최종 농도를 얻어서 물에 투석하였다. 얻어진 리피도이드/mRNA 복합체는 양으로 하전된 나노입자를 생성하였다. 리피도이드/mRNA 복합체는 정맥내 주입 전에 PBS로 조절되어 거의 하전되지 않은 나노입자를 생성하였다(표 5 참조).
Figure pct00054
생체 내 생체발광 영상화를 사용한 마우스에서 Luc 활성의 측정:
투약 24시간 후에 마우스를 메데토미딘(11.5 μg/kg BW), 미다졸람 (115 μg/kg BW) 및 펜타닐 (1.15 μg/kg BW)의 복강 내 주입으로 마취시켰다. D-루시페린 기질(마우스당 3 mg/100 μl PBS)을 복강내 주입으로 적용하였다. 생체발광을 10분 후에 IVIS 100 영상화 시스템(Xenogen, Alameda, USA) 및 카메라 세팅(Bin(HS), 관측시야 10, f1 f-stop, 고해상 비닝(binning) 및 노출시간 30초)을 사용하여 측정하였다. 시그널을 정량하고 Living Image 소프트웨어 버젼 2.50 (Xenogen, Alameda, USA)을 사용하여 분석하였다. 이후, 장기를 절제하여 별도로 다시 영상화하였다.
결과
실험 결과, mRNA는 마우스의 복부 영역에서 효과적으로 발현되고 알킬쇄 길이가 감소함에 따라 증가하는 것으로 나타났다(도 17 A, B 참조). 또한, 실험에서는 mRNA의 간 전달은 리피도이드의 알칸쇄 길이가 증가하면 감소하여(C16<C14<C12) C16은 거의 검출할 수 없는 것으로 나타났다. 비장에서 루시퍼라제 발현은 C14가 가장 높았다. 일부 루시퍼라제 발현은 폐에서 관찰되었지만, 심장, 신장, 위 또는 뇌에서는 관찰되지 않았다(도 18 A, B 참조).
실시예 13
pDNA 및 mRNA를 전달하는 능력에 있어서 상이한 형질감염 시약들의 효능 비교
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
폴리플렉스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 플라스미드 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 DNA (pCMVLuc, Plasmid Factory) 또는 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 사용하여 형성하였다.
폴리플렉스를 사용한 시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과
본 실험은 형질감염 효능이 형질감염 배지(폴리머/리피도이드) 또는 또한 핵산의 타입에 독점적으로 연관되는지를 입증하기 위해 수행하였다. 결과(도 19)는 pDNA를 효율적으로 운반하는 형질감염 시약이 필수적으로 mRNA 운반의 효율적인 비히클이 되지 않는 것을 분명히 보여주고 있다. 따라서, pDNA에 대해 형질감염 효능이 높은 담체 시스템이 효율 예측 mRNA를 허용하지 않는다.
실시예 14
N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (2-3-2) 또는 N,N '-비스(2-아미노에틸)-1,3-부탄디아민 (2-4-2)으로 변형된, PAA8k의 형질감염 효능 비교
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
폴리플렉스를 실시예 1에 기술된 바와 같이 형성하였다.
폴리플렉스를 사용한 시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과
(2-3-2)로 변형된 폴리머의 효능이 구조 (2-3-2)와 강력하게 연관되어 있거나 X>2인 다른 구조 2-X-2에 대해 비슷한 효율을 보이는지를 추가로 조사하기 위해 PAA8k를 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-부탄디아민으로 변형하였다(2-4-2). PAA8k-(2-3-2)와 PAA8k-(2-4-2)와의 비교(도 20)에서, 두 폴리머는 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA의 형질감염 후에 거의 동일한 높은 루시퍼라제 발현 수준을 유발하는 것으로 나타났다. 이것은 X>2인 구조 (2-X-2)로 변형된 폴리머는 일반적으로 다른 올리고(알킬 아민)으로의 변형과 비교하여 향상된 mRNA 운반 효율을 갖는 형질감염 시약을 얻는 것을 보여준다.
실시예 15
리피도이드 제제의 투과전자현미경
재료 및 방법
리피도이드 제제:
리피도이드를 mRNA로 다음과 같이 제제화하였다: C10-(2-3-2), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DSPE-PEG2k) 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DPG-PEG2k) (9:6:5:1 몰비)을 에탄올에 용해하고 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 화학적으로 변형된 mRNA를 지질-질소/mRNA-포스페이트 몰비 17로 포함하는 시트르산염 완충 용액(10 mM 시트르산, 150 mM NaCl, pH=4.5)에 재빨리 주입하여 20%의 에탄올 최종 농도를 얻어서 물에 24시간 투석하였다.
투과전자현미경:
크기 분석을 위해, TEM (투과전자현미경)을 10,000 및 60,000의 배율로 사용하였다. 제1 단계로, 구리 함유 플레이트(Plano GmbH; S162-3)를 플라스마 세척하였다. 이렇게 처리한 후, 8μL의 리피도이드 제제를 구리 플레이트와 3분 동안 접촉하였다. 리피도이드 제제 액적을 제거한 후, 리피도이드가 적재된 구리 플레이트를 8μL 우라닐 아세테이트 용액 1방울과 2번 30초 동안 접촉시켜서 샘플을 염색하였다. 매 단계 후에 액체를 압지로 흡수하여 제거하였다. 최종적으로 담체 플레이트를 실온에서 30분 동안 건조하여 Jem1011 (Jeol)로 분석하였다.
결과
TEM 사진(도 21)은 형성된 리피도이드 제제가 균일한 크기 분포를 갖는 구형 입자인 것을 나타내고 있다(개략도). 확대 사진에서 입자들의 크기는 60-80nm로 추정할 수 있다.
실시예 16
알실할라이드(alcylhalide)에 의해 합성된 C10-(2-3-2)의 mRNA 운반 효능
재료 및 방법
합성:
C10-(2-3-2)의 합성은 제조예 VII에 기술된 바와 같이 수행하였다.
리피도이드 제제:
리피도이드/mRNA 복합체는 실시에 15에 기술된 바와 같이 C10-(2-3-2), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DPG-PEG2k)(9:6:5:1 몰비) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 17로 사용하여 형성하였다.
시험관 내 형질감염:
처리하기 24시간 전에 100μL 배지 중의 5,000 NIH3T3 세포를 96-웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 형질감염 당일에 리피도이드 제제를 상기한 바와 같이 형성하고 10x PBS 용액으로 1x PBS로 조절하였다. 리피도이드 제제를 희석하여 50μL 중의 500ng, 250ng 또는 125ng을 얻고, 세포에 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 형질감염 24시간 후에 배지를 제거하였다. 세포를 용균하고 용해물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 리포터 단백질 활성에 대해 분석하였다.
결과
도 22에 보이는 바와 같이, 알실할라이드로 합성된 C10-(2-3-2)는 mRNA를 세포에 운반하여 리포터 단백질 루시퍼라제의 발현을 유발할 수 있다.
실시예 17
N-도데실아크릴아미드로 합성된 C12-(2-3-2)의 mRNA 운반 효능
재료 및 방법
합성:
C12-(2-3-2)의 합성은 제조예 VIII에 기술된 바와 같이 수행하였다.
리피도이드 제제:
리피도이드/mRNA 복합체는 실시에 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DPG-PEG2k) (9:6:5:1 몰비) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 17로 사용하여 형성하였다.
시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 16에 기술된 바와 같이 웰당 500, 250 또는 125ng의 mRNA 용량을 사용하여 수행하였다.
결과
도 23에서 보이는 바와 같이 N-도데실 아크릴아미드로부터 합성된 C12-(2-3-2)는 mRNA를 세포 내로 운반하여 루시퍼라제의 리포터 유전자 발현을 유발할 수 있다.
실시예 18
도데실-아크릴레이트로 합성된 C12-(2-3-2)의 mRNA 운반 효능
재료 및 방법:
C12-(2-3-2)의 합성은 제조예 IX에 기술된 바와 같이 수행하였다.
리피도이드 제제:
리피도이드/mRNA 복합체는 실시에 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DPG-PEG2k) (9:6:5:1 몰비) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 17로 사용하여 형성하였다.
시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 16에 기술된 바와 같이 웰당 500, 250 또는 125ng의 mRNA 용량을 사용하여 수행하였다.
결과
도 24에서 보이는 바와 같이 도데실 아크릴레이트로부터 합성된 C12-(2-3-2)는 mRNA를 세포 내로 운반하여 리포터 단백질 루시퍼라제의 발현을 유발할 수 있다.
실시예 19
상이한 헬퍼 지질 및 상이한 리피도이드 대 mRNA (N/P) 비를 사용하여 제제화된 C12-(2-3-2)의 mRNA 운반 효율
재료 및 방법
리피도이드 제제:
리피도이드/mRNA 복합체를 실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2)를, PEG-지질로서 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤-메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG2k), 헬퍼 지질로서 DOPE 또는 DSPC와 조합하고 N/P 비 17 또는 8을 사용하여 형성하였다.
시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 16에 기술된 바와 같이 웰당 250 ng의 mRNA 용량을 사용하여 수행하였다.
결과
도 25에서 보이는 바와 같이 C12-(2-3-2)는 mRNA를 세포 내로 운반하여 상이한 헬퍼 지질(DOPE, DSPC)과 상이한 N/P 비(17 또는 8)로 조합하여 루시퍼라제의 리포터 유전자 발현을 유발할 수 있다. 따라서, C12-(2-3-2)는 헬퍼 지질 및 N/P 비에 대해 독립적으로 세포 내에 RNA를 효율적으로 운반한다.
실시예 20
마우스 내에서 C12-(2-2-2) 및 C12-(3-3-3)과 비교하여 C12-(2-3-2)를 갖는 리피도이드 제제의 정맥 내 투여 후 개선된 mRNA 운반 효능
재료 및 방법
동물: 실시예 11에 기술
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DMG-PEG2k) 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 17로 사용
생체 내 생체발광 영상화를 사용한 마우스에서 Luc 활성의 측정:
실시예 11에 기술된 바와 같이, 투여 6시간 후 동물을 마취.
결과
도 26에서 보이는 바와 같이, C12-(2-3-2)가 포함된 리피도이드 제제는 C12-(3-3-3) 및 C12-(2-2-2)와 비교하여 마우스에서 상당히 증가된 리포터 유전자 발현을 유발하였다. 이것은 C12-(2-3-2)의 유리한 mRNA 운반능을 증명하는 것이다.
실시예 21
상이한 양의 알킬쇄 C12로 포화된 올리고(알킬렌 아민) (2-3-2)의 mRNA 운반 효능 비교
재료 및 방법:
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 투석 없이 상이한 변형 정도 및 위치를 갖는 올리고(알킬 아민) (2-3-2) 사용(도 27 A 참조, SynCom).
시험관 내 형질감염:
형질감염 실험을 실시예 16에 기술된 바와 같이 웰당 250 ng의 mRNA 용량을 사용하여 수행하였다.
결과
도 27 A에서 보이는 바와 같이, 상이한 3개 버젼의 C12-(2-3-2)를 합성하여 mRNA 운반능에서 올리고(알킬렌 아민)에 대한 알킬쇄의 양과 위치의 영향을 평가하였다. 형질감염 효능(도 27 B)은 리포터 단백질 발현에서 차이를 보이지 않았으므로, mRNA 운반 효능의 차이를 관찰할 수 없음을 증명하였다. 그러므로, 상이한 타입의 C12-(2-3-2) 리피도이드 제제는 동일한 효능으로 mRNA를 운반한다.
실시예 22
리피도이드 제제의 동결건조
재료 및 방법
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같다.
동결건조 방법:
트레할로스, 수크로스 및 락토스의 보호제 용액을 물(c: 20% w/v)로 제조하였다. 2배수로 연속 희석물을 제조하여 보호제 용액 20%에서 0.625% (w/v)까지 형성하였다. 이 용액에 동일한 부피의 리피도이드 제제를 첨가하고 피펫팅으로 혼합하였다. 용액을 액체 질소로 냉동하고 시그마 알파 1-4 (Martin Christ)를 사용하여 동결건조하였다. 동결건조 후에 입자들을 동일 부피의 물로 재현탁하여 분석에 사용하였다. 대조용으로서 리포플렉스를 보호제 용액과 같은 농도로 냉동 및 동결건조 없이 혼합하였다.
시험관 내 형질감염:
실시예 15에 기술된 바와 같이 웰당 233ng의 mRNA 사용
크기 측정:
입자의 수력학적 직경을 ZetaSier Nano ZS (Malvern)를 사용하여 측정하였다.
결과
도 28에서 보이는 바와 같이, 시험된 당은 모두 상이한 농도에서 입자 크기와 형질감염 효능을 유지할 수 있었다. 비교에 있어서 보호제가 없는(0%) 입자는 효율이 떨어지고 응집 과정으로 인하여 크기가 크게 증가하였다.
실시예 23
생체 외에서 포유동물 조직 내로 RNA의 운반
재료 및 방법
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), DOPE, 콜레스테롤, DPG-PEG2k 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 비 17로 투석 없이 사용.
조직 샘플의 처리:
약 1cm3의 조직편(근육, 지방, 동맥 또는 폐; 표 참조)을 바로 희생된 동물(돼지 또는 양; 표 참조)로부터 취하여 PBS로 세척하였다. 모든 조직편 내에 10μg의 RNA를 함유하는 100μL의 리피도이드 제제 또는 20μg RNA를 함유하는 200μL 리피도이드 제제를 주입하였다(표 참조). 양(sheep)의 동맥을 처리하는 경우에 있어서, 리피도이드 제제는 실로 양쪽 말단을 폐색시킨 혈관 내강에 주입하였다. 조직을 24시간 동안 10% FCS를 함유하는 세포 배양배지(DMEM)에서 배양하였다.
루시퍼라제 발현의 분석:
24시간 후에 샘플을 루시페린 (100μg/mL)을 함유하는 PBS 중에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성을 생체 내 영상화 시스템(IVIS, Perkin Elmer)을 사용하여 측정하였다.
결과
도 29에서 보이는 바와 같이, C12-(2-3-2)는 상이한 종의 다양한 상이한 조직의 세포에 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA 운반이 가능하여 루시퍼라제를 발현하였다. 이에 비하여 미처리 시료(D, E, 하위 조직편)는 영상 시그널을 나타내지 않았다.
실시예 24
시험관 내에서 안지오텐신(Angiotensin) I 전환 효소 2 (ACE-2)의 발현
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), DOPE, 콜레스테롤, DPG-PEG2k를 사용하여 mRNA 첨가없이, 공(empty) 리포플렉스를 얻었다. 리피도이드 mRNA 복합체 형성을 포스트 로딩(post loading)에 의해 수행하였다. 이를 위하여 ACE-2를 코딩하는 1μL의 mRNA(1mg/ml)를 4μL의 리포플렉스 함유 용액과 혼합하여 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
세포의 시험관 내 형질감염:
시험관 내 형질감염을 위하여 300,000 HepG2 세포를 10% FCS를 함유하는 2mL 배지에서 6 웰 플레이트의 웰에 처리하기 24시간 전에 접종하였다. 형질감염 당일에 배지를 2mL 새로운 배지로 교환하였다. 리피도이드 제제를 기술된 바와 같이 제조하고 500ng mRNA를 함유하는 2.5μL를 각 웰에 첨가하였다. 대조용 웰에 동량의 리피도이드 제제를 mRNA 첨가 없이 형성 과정에 주입하였다.
웨스턴 블롯에 의한 ACE-2 발현의 검출:
형질감염 24시간 후에 배지를 제거하고 세포를 1mL PBS로 세척하였다. 세포를 10분 동안 빙냉 하에 250μl 용균 완충액(25mM Tris-HCl, 0.1% TritonX, pH 7.4)을 사용하여 용균하였다. 용해물을 스크래핑(scraping)한 후 찌꺼기를 14,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 제거하였다.
단백질 측정(BCA-Assay, Thermo-Fisher scientific) 후에 레인당 10μg을 10% SDS-PAGE 겔(Thermo-Fisher scientific)에 로딩하였다. 100 V로 1.5시간 동안 전기영동한 다음, 겔을 PVDF 막(TransBlot Turbo, Biorad)에 블롯팅하였다.
블롯팅한 후, 막을 TBS-T (20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 7.5, 0.1% Tween20) 중의 5% 밀크 분말을 사용하여 30분 동안 블로킹하였다. 블로킹한 후, 막을 1:10,000 희석의 항-ACE2 항체 (R&D systems)로 4℃에서 밤새 탐침하였다. 3회의 세척 단계(각각 10분, TBS-T) 후에 막을 1:10,000 희석의 항-염소-HRP 항체(SCBT)로 1시간 동안 실온에서 탐침하고 3회 세척(각각 10분, TBS-T)하였다. 시그널을 발광성 HRP-기질 (GE healthcare)을 사용하여 현상하고 카메라(ChemiDoc XRS+, Bio-Rad)를 사용하여 분석하였다. ACE2 시그널을 검출하고, 동등한 로딩을 1:1,000 희석의 항-GAPDH 항체(NEB)를 사용하여 4시간 동안 실온에서 분석하였다.
결과
도 30에 형질감염의 웨스턴 블롯 결과를 나타냈다. 좌측 2개 레인은 처리된 세포의 용해물을 나타내고, 우측 레인은 미처리된 세포의 용해물이다. 분명하게 나타난 바와 같이, ACE-2 발현은 유일하게 ACE-2를 코딩하는 RNA가 로딩된 후 리피도이드 제제로 처리된 샘플에서 관찰할 수 있었다. 이 실험은 ACE-2 mRNA 또한 C12-(2-3-2) 함유 리피도이드 제제를 통해 운반될 수 있음을 보여준다. 또한, 공 리포플렉스의 로딩후(post loading) 방법도 세포 내로의 효율적인 mRNA 운반을 유발하는 것이 입증되었다.
실시예 25
Balb/c 마우스에서 뮤린 에리트로포이에틴(mEPO)의 발현
재료 및 방법
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), DOPE, 콜레스테롤, DMPE-PEG2k 및 뮤린 에리트로포이에틴(mEPO)을 코딩하는 mRNA (N/P 비 15) 사용
동물:
실시예 11에 기술
동물 처리:
리피도이드 제제를 1x PBS로 조절하고 희석하여 각각 130μL 중의 5, 10 및 20μg mRNA를 얻었다. 투여 당 3마리의 마우스를 정맥 내 주사로 처리하였다. 대조군의 마우스는 PBS로 처리하였다. 처리 6시간 후에 채혈하고 뮤린 EPO 농도를 분석하였다.
뮤린 EPO 정량:
뮤린 에리트로포이에틴의 정량은 제조업체의 설명에 따라 마우스 EPO ELISA (Quantikine ELISA, R&D Systems Inc.)에 의해 수행하였다.
결과
이 실험에서는 뮤린 EPO mRNA로 처리한 후 마우스에서 뮤린 에리트로포이에틴의 발현이 C12-(2-3-2) 함유 리피도이드 제제로 형성되었다. 도 31에서 보이는 바와 같이 뮤린 EPO는 PBS 처리된 대조군보다 훨씬 더 높은 농도로 모든 그룹에서 6시간 후에 검출할 수 있었다. 따라서, 뮤린 EPO mRNA가 세포 내에 효율적으로 운반되어 단백질 발현을 유도하였다.
실시예 26
올리고(알킬렌 아민) (2-3-2) 변형 선형 폴리머 폴리(알릴아민)의 메신저 RNA 운반 효능
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
실시예 1에 기술된 바와 같이 올리고(알킬렌 아민) (2-3-2), (2-2-2) 또는 (3-3-3)으로 변형된 폴리(알릴아민) (PALAM) 사용. 합성은 제조예 V 참조.
폴리플렉스의 시험관 내 형질감염:
실시예 1에 기술된 바와 같이, NIH3T3세포 형질감염, 500ng의 mRNA 및 N/P 12 사용
결과
도 32에서 보이는 바와 같이 mRNA와 PALAM-(2-3-2)의 폴리플렉스로 형질감염한 후 세포는 PALAM-(2-2-2)/mRNA 또는 PALAM-(3-3-3)/mRNA 복합체로 형질감염한 후보다 훨씬 더 높은 루시퍼라제 발현을 나타냈다. 따라서, 이 결과는 알킬쇄를 변경한 올리고(알킬렌 아민)을 사용한 선형 아민 말단 폴리머의 변형이 선형 카복실 말단 폴리머 주쇄에서와 같은 유리한 효과를 유도하는 것을 입증한다.
실시예 27
올리고(알킬렌 아민) (2-3-2) 변형 수지상 폴리머 폴리프로필렌이민의 메신저 RNA 운반 효능
재료 및 방법
폴리플렉스 형성:
실시예 1에 기술된 바와 같이 올리고(알킬렌 아민) (2-3-2), (2-2-2) 또는 (3-3-3)으로 변형된 폴리프로필렌이민 (PPI) 사용. 합성은 제조예 VI 참조.
폴리플렉스의 시험관 내 형질감염:
실시예 1에 기술된 바와 같이, NIH3T3세포 형질감염, 500ng의 mRNA 및 N/P 32 사용
결과
도 33에서 보이는 바와 같이 mRNA와 PPI-(2-3-2)의 폴리플렉스로 형질감염한 후 세포는 PPI-(2-2-2)/mRNA 또는 PPI-(3-3-3)/mRNA 복합체로 형질감염한 후보다 훨씬 더 높은 루시퍼라제 발현을 나타냈다. 따라서, 이 결과는 알킬쇄를 변경한 올리고(알킬렌 아민)을 사용한 수지상 폴리머의 변형이 선형 폴리머 주쇄에서와 같은 유리한 효과를 유도하는 것을 입증한다.
실시예 28
래트에 피하 주사한 후 C12-(2-3-2) 제제의 세포 내 RNA 운반 효율
재료 및 방법
리피도이드 제제:
실시예 15에 기술된 바와 같이 C12-(2-3-2), DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2k 및 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 N/P 비 17로 사용
동물 처리:
리피도이드 제제를 1x PBS로 조절하였다. 63μg의 RNA를 함유하는 500μL의 제제를 암컷 Buffalo 래트에 피하 주사하였다. 투약 6시간 후에 래트를 메데토미딘(11.5 μg/kg BW), 미다졸람 (115 μg/kg BW) 및 펜타닐 (1.15 μg/kg BW)의 복강 내 주입으로 마취시켰다. D-루시페린 기질(마우스당 30 mg/PBS)을 복강내 주입으로 적용하였다. 생체발광을 10분 후에 IVIS 100 영상화 시스템(Xenogen, Alameda, USA)을 사용하여 측정하였다.
결과
도 34에서 보이는 바와 같이 래트는 밝은 발광 시그널을 주입면에 나타내었으며, 이는 주위 조직 내로의 RNA 운반이 매우 효율적임을 입증하는 것이다. 또한 코딩 단백질을 생산할 수 있는 RNA의 기능은 온전히 남아있음을 보여준다.

Claims (16)

  1. RNA 및, 하기 a) 내지 c)로부터 선택되는 올리고(알킬렌 아민)을 포함한 성분을 포함하는 조성물:
    a) 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (II)의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
    Figure pct00055

    [상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은 다수의 화학식 (II)의 그룹에서 이의 각 그룹에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다
    a는 1이고, b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고, b는 1이고,
    p는 1 또는 2이고,
    m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m+n은 ≥2이고;
    R2 내지 R5는 서로 독립적으로, 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
    R6은 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 리셉터 리간드로부터 선택되고,
    화학식 (II)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (II)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다];
    b) 반복 단위로서 다수의 화학식 (III)의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 폴리머:
    Figure pct00056

    [상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는 다수의 화학식 (III)의 그룹에서 이의 각 그룹에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
    a는 1이고, b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고, b는 1이고,
    p는 1 또는 2이고,
    m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m+n은 ≥2이고;
    R2 내지 R5는 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7 또는 -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
    화학식 (III)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (III)의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다]; 및
    c) 화학식 (IV)의 구조를 가지는 리피도이드:
    Figure pct00057

    [상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 다음과 같이 정의된다:
    a는 1이고, b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고, b는 1이고,
    p는 1 또는 2이고,
    m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m+n은 ≥2이고;
    R1 내지 R6은 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노 그룹에 대한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 리셉터 리간드로부터 선택되되; 단, R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이고;
    화학식 (IV)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 화학식 (IV)의 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다].
  2. 제1항에 있어서, RNA 및, 성분 a) 및 b)로부터 선택되는 올리고(알킬렌 아민)을 포함한 성분을 포함하고, 여기에서
    성분 a)는 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 다수의 화학식 (IIa)의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 폴리머이고:
    Figure pct00058

    [상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R6은 제1항에 정의된 바와 같고, 화학식 (IIa)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다];
    성분 b)는 반복 단위로서 다수의 화학식 (IIIa)의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 폴리머인 조성물:
    Figure pct00059

    [상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R5는 제1항에 정의된 바와 같고, 화학식 (IIIa)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 올리고머 또는 폴리머 구조를 제공할 수 있다].
  3. 제1항에 있어서, RNA 및 화학식 (IVa)의 구조를 가지는 리피도이드를 포함하는 조성물:
    Figure pct00060

    상기 식에서,
    a, b, m, n, 및 R1 내지 R6은 제1항에 정의된 바와 같고,
    화학식 (IVa)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 프로톤화하여 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) 또는 (IVa)에서 n이 1인 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) 또는 (IVa)에서 m이 1이고 n은 1인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) 또는 (IVa)에서 a는 1이고 b는 2이거나, 또는 a는 2이고 b는 1인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드가 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드이고, 양이온성 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드는 RNA와 복합체를 형성하는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 형태인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 동결건조보호제를 더 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 동결건조보호제가 트레할로스인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, RNA가 단일가닥 RNA인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, RNA가 mRNA인 조성물.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학 조성물.
  15. RNA를 세포 내로 전달하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제13항의 올리고머, 폴리머 또는 리피도이드의 용도.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 표적 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, RNA를 표적 세포 또는 조직에 전달하는 방법.
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