BR112015032225B1 - Composição, composição farmacêutica, uso de uma composição, e, método in vitro para dispensação de rna de fita simples a uma célula alvo ou tecido - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÃO, OLIGÔMERO, POLÍMERO OU LIPOIDE, USO DE UMA COMPOSIÇÃO, E, MÉTODO PARA DISPENSAÇÃO DE RNA A UMA CÉLULA ALVO OUTECIDO A presente invenção se refere a oligômeros, polímeros e lipoides compreendendo porções de oligo(alquileno a mina) característico que são úteis como veículos para transfectar uma célula com RNA. A presente invenção se refere adicionalmente a uma composição compreendendo pelo menos um ácido nucleico e um oligômero ou polímero ou um lipoide compreendendo ais porções de oligo(alquileno amina ) característico e a um método para transfecção de uma célula usando dita c omposição. Além disso, a presente invenção se refere a composições farmacê uticas e usos.

Description

[001] A presente invenção refere-se aos oligômeros, polímeros e lipoides compreendendo porções de oligo(alquileno amina) características que são úteis como veículos para transfectar uma célula com um RNA. A presente invenção também se refere a uma composição compreendendo pelo menos um RNA e um oligômero ou polímero ou um lipoide compreendendo tais porções de oligo(alquileno amina) e a um método de transfectar uma célula usando a dita composição. Além disso, a presente invenção refere-se às composições farmacêuticas, seus usos e a um kit.
[002] A praticabilidade das terapias com ácido nucleico é, basicamente, dependente da disponibilidade de métodos eficientes para liberar os ácidos nucleicos nas células.
[003] Na liberação de ácidos nucleicos, em geral, o uso de ácidos nucleicos nus é adequado e suficiente em alguns exemplos de células transfectadas (Wolff et al. 1990, Science, 247, 1465-1468). Contudo, na maioria das aplicações técnicas consideradas, é vantajoso ou mesmo necessário formular o ácido nucleico com pelo menos um segundo agente que protege o ácido nucleico da degradação durante a liberação e/ou facilita a distribuição a e em um tecido alvo e/ou facilita a captação celular e permite o processamento intracelular adequado. Tais formulações para a liberação de ácido nucleico são indicadas como vetores na literatura científica. Uma enorme variedade de compostos para a vetorização de ácidos nucleicos, então chamados reagentes de transfecção, foram previamente descritos. Estes compostos são geralmente policátions ou composições compreendendo os lipídeos catiônicos ou compostos semelhantes aos lipídeos tais como lipoides (US 8.450.298). Os complexos de ácidos nucleicos com policátions são indicados como poliplexos, aqueles com lipídeos catiônicos são indicados como lipoplexos (Felgner et al. 1997, Hum Gene Ther, 8, 511-512). Os complexos compreendendo tanto um policátion e lipídeos também foram descritos (Li and Huang in “Nonviral Vetores for Gene Therapy”, Academic Press 1999, Capítulo 13, 295-303). Os reagentes de transfecção são usados para ligar e compactar os ácidos nucleicos para resultar em complexos primários na faixa de tamanho nanométrica. Nos meios contendo um sal, estes complexos tendem a agregar, também conhecida como agregação induzida por sal, a qual pode ser vantajosa para a transfecção na cultura celular ou na administração localizada in vivo (Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433; Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21). A agregação pode ser evitada e os complexos de ácidos nucleicos com reagentes de transfecção podem ser estabilizados através da proteção de superfície com polímeros tais como poli(etileno glicol). A proteção também é usada para evitar a opsonização e a ativação de complemento através de complexos de ácidos nucleicos com reagentes de transfecção (Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). A compactação dos ácidos nucleicos por reagentes de transfecção não somente os protege contra a degradação pelas nucleases, mas também os torna adequado para a captação celular através da endocitose. Vários policátions lineares e ramificados são adequados para ligar e compactar os ácidos nucleicos incluindo, mas não limitando a poli(etilenoimina), poli(amidoamina) dendrímeros, metacrilato de poli(2-(dimetilamino)etila) (pDMAEMA) ou derivados catiônicos de poli(N-(2- hidroxipropil)metacrilamida) (pHPMA), éster(es) poli(beta-amino) (Akinc et al. 2003, Bioconj Chem 14(5):979-88), poli(aminoácidos) catiônicos naturais e sintéticos ou peptídeos tais como poli(lisinas), histonas, proteínas HMG ou carboidratos catiônicos tais como quitosanos. Além dos polímeros contendo aminas primárias, secundárias e/ou ternárias mencionados acima, estruturas contendo porções de guanidila são uma classe importante de moléculas para os propósitos de complexação e liberação de ácido nucleico. Os polímeros modificados com guanidila como as estruturas com base em arginina (Yamanouchi et al. 2008, Biomaterials 29(22):3269-77), PAMAM modificado com arginina (Son et al. 2013, Bull. Korean Chem. Soc. Vol 34 No. 3) ou PEI guanidilado (Lee et al. 2008, Bull. Korean Chem. Soc. 2008, Vol. 29, No. 3) destacaram a eficiência de tais sistemas. Especialmente no caso da interação com RNA, as características moleculares da porção de guanidila apresentam propriedades de ligação únicas (Calnan et al. 19991, Science 252(5009), 1167-1171). Para a geração de tais estruturas, os métodos como revistos por Katritzky e Rogovoy (Katritzky & Rogovoy 2005, ARKIVOC (iv) 49-87) podem ser usados. Frequentemente, os poliplexos também são modificados para conter um alvejamento celular ou uma porção de alvejamento celular e/ou um componente que desestabiliza a membrana tal como um vírus inativado (Curiel et al. 1991, ProcNatl Acad Sci EUA, 88, 8850-8854), um capsídeo viral ou uma proteína viral ou peptídeo (Fender et al. 1997, Nat Biotechnol, 15, 52-56, Zhang et al. 1999, Gene Ther, 6, 171181) ou um peptídeo sintético rompedor de membrana (Wagner et al. 1992, Proc Natl Acad Sci EUA, 89, 7934-7938, Plank et al. 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924).
[004] Na absorção endocítica, os complexos são isolados em vesículas intracelulares tais como endossomos e lisossomos onde são expostos à maquinaria de degradação celular. Deste modo, foi reconhecido que a evasão das vesículas intracelulares é essencial para a liberação funcional eficiente de ácido nucleico, um requerimento que também se aplica para a infecção viral funcional (Wagner et al. 1992, Proc Natl Acad Sci EUA, 89, 7934-7938, Plank et al. 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924). Os mecanismos que a natureza desenvolveu para a infectividade viral foram imitados para a liberação eficaz de ácido nucleico através de vetores sintéticos. Para esta finalidade, peptídeos anfifílicos que desestabilizam a membrana tais como os peptídeos INF, GALA e KALA ou melitina e derivados de melitina (Boeckle et al. 2006, J Control Release, 112, 240-248) foram usados com grande sucesso para complementar os reagentes de transfecção policatiônicos com funcionalidade de escape endossômico (Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35). Nos lipoplexos, tal funcionalidade é inerente pela capacidade de suas porções de lipídeo de se fundir com as membranas celulares (Xu and Szoka 1996, Biochemistry, 35, 5616-5623, Zelphati and Szoka 1996, Proc Natl Acad Sci EUA, 93, 1149311498). Desde que o papel central por Boussif et al. (Boussif et al. 1995, Proc Natl Acad Sci EUA, 92, 7297-7301), é conhecido que a funcionalidade de escape endossômico dos poliplexos pode ser realizada por meios físico- químicos. Quando a poli(etilenoimina) (PEI) é usada como um policátion para formar poliplexos, sua capacidade de tamponamento em um pH ácido é suficiente para provocar o escape endossômico. É conhecido que o lúmen dos endossomos é acidificado por uma bomba de próton que reside nas membranas endossômicas (Lafourcade et al. 2008, PLoS One, 3, e2758). Esta acidificação é a deflagração para o escape endossômico de alguns vírus tais como influenza ou adenovírus. A então chamada teoria de esponja de prótons, sustentada por evidências experimentais, descreve a ação mecânica putativa dos polímeros compreendendo características de estrutura química de PEI: Uma fração substancial dos grupos amino de PEI são não protonadas em um pH neutro (fisiológico) (Ziebarth and Wang 2010, Biomacromolecules, 11, 29-38). Em virtude dos grupos amino protonados e deste modo positivamente carregados, os polímeros semelhantes a PEI podem ligar e compactar os ácidos nucleicos. As aminas não protonadas podem se tornar protonadas no pH ácido, e deste modo possuem capacidade de tamponamento dentro dos endossomos. A acidificação endossômica pela bomba de prótons vem com o acúmulo de íons de cloro (Sonawane et al. 2003, J Biol Chem, 278, 4482644831). Na presença de uma molécula de tamponamento, tal como PEI no lúmen endossômico, a bomba de prótons lançará mais prótons no lúmen endossômico, junto com o acúmulo de cloro, como seria na sua ausência até o pH natural endossômico ácido ser atingido. O acúmulo desproporcional de íons dentro dos endossomos é pensado levar a uma desestabilização osmótica das vesículas, levando, enfim, à ruptura da vesícula e à liberação do complexo de ácido nucleico no citoplasma.
[005] Com base na teoria de esponja de prótons, vários pesquisadores escolheram as características estruturais da PEI em criar novas bibliotecas poliméricas que compreendem as aminas com capacidade de tamponamento no pH ácido. A US 7.780.957 e US 7.829.657 Kataoka et al. Descrevem os polímeros com base em uma estrutura de poli(ácido glutâmico) ou poli(ácido aspártico) onde as cadeias laterais de ácido carboxílico são derivatizadas com cadeias laterais de amina protonáveis em um pH ácido. Contudo, o espaço estrutural rico de oligo(alquileno aminas) contendo unidades de alquileno amina não idênticas alternadas para servir como porções que aumentam a transfecção em policátions não foi explorado. Em particular, este não foi previamente investigado quanto a transfecção de mRNA.
[006] Ao contrário, muitos dos trabalhos científicos de Kataoka et al. tem focado em poli{N-[N‘-(2-aminoetil)-2-aminoetil]aspartamida}. Em uma publicação por Uchida et al. (2011, J Am Chem Soc, 133, 15524-15532) o mesmo grupo examinou uma série de poliaspartamidas N-substituídas que possuem unidades de aminoetileno repetidas nas cadeias laterais da fórmula geral -(CH2—CH2-NH)m—H. De maneira interessante, quando os autores examinaram a eficiência da família de polímeros na transfecção do DNA plasmídico, “um efeito ímpar-par distinto das unidades de aminoetileno repetidas na cadeia lateral do polímero nas eficácias da evasão endossômica e a transfecção para várias linhas celulares foram observados. Os poliplexos dos polímeros com um número equilibrado de unidades de repetição de aminoetileno (PA-Es) obtiveram uma ordem de eficácia de transfecção de magnitude maior, sem citotoxidade notável, do que aqueles dos polímeros com um número ímpar de unidades de repetição de aminoetileno (PA-Os). Este efeito ímpar-par combinou bem com a capacidade de tamponamento destes polímeros, bem como com a sua capacidade de romper a integridade da membrana seletivamente no pH endossômico, levando a evasão endossômica altamente eficaz dos poliplexos de PA-E. Além disso, a formação de um arranjo polivalente carregado com espaçamento preciso entre os grupos amino protonados na cadeia lateral do polímero foi mostrada ser essencial para o rompimento eficaz da membrana endossômica, facilitando deste modo o transporte do poliplexo no citoplasma” (Resumo de Uchida et al. 2011, J Am Chem Soc, 133, 15524-15532). De maneira interessante, quando o mesmo grupo de pesquisadores compararam os derivados de poli(aspartamida) que carregam cadeias laterais de 1,2-diaminoetano, [PAsp(DET)] contra os análogos que carregam cadeias laterais de 1,3-diaminopropano, [PAsp(DPT)], eles observaram que os poliplexos de PAsp(DPT) apresentaram uma queda significante na eficácia de transfecção do DNA plasmídeo em altas razões de N/P devido à citotoxidade progressivamente aumentada com razão N/P, mesmo se as diferenças físico-químicas a [PAsp(DET)] no tamanho de partícula e Z-potencial foram negligenciáveis (Miyata et al. 2008, J Am Chem Soc, 130, 16287-16294). Consequentemente, com base na regra ímpar-par, seria esperado que os polímeros que compreendem 3 grupos amino protonáveis e grupos espaçadores de propileno seriam inferiores a PAsp(DET) e que as cadeias laterais que compreendem 1,3-diaminopropano são associadas com problemas de toxicidade. Nada é conhecido com relação às relações de estrutura-atividade de tais polímeros para a transfecção de mRNA.
[007] Geall e seus colaboradores descreveram carbamatos de colesterol-poliamina com a porção de poliamina tendo a fórmula geral: -NH-CH2-(CH2)n-CH2-NH-CH2-(CH2)m-CH2-NH-CH2-( CH2)n-NH2, onde m = 0, 1 ou 2 e onde n = 0 ou 1 (Geall et al. 1999, FEBS Lett, 459, 337-342). Eles examinaram os valores de pKa destas substâncias e suas características na condensação de DNA do timo do bezerro. Eles descobriram que a distribuição regioquímica de cargas positivas ao longo dos carbamatos de colesterol poliamina desempenha papéis significantes na modulação de afinidade de ligação de DNA e eficiência de lipofecção. Eles descobriram que os carbamatos de colesterol-poliamina examinados, a espermina que constitui a porção de poliamina, -HN-CH2-CH2-CH2-NH- CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (propila/butila/propila) produziram, de longe, a expressão de gene repórter mais alta na transfecção do beta DNA plasmídeo que codifica a galactosidase em cultura celular, enquanto, por exemplo, -HN-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2- CH2-NH2 (etila/propila/etila) foi de três a dez vezes menos eficiente. Consequentemente, em vista dos ensinamentos de Kataoka et al. (regra ímpar- par) e as descobertas de Geall et al., aquele versado na técnica rejeitaria a última estrutura no contexto da liberação de ácido nucleico.
[008] Wang et al. descreveram poli(metil metacrilato)-enxerto- oligoaminas como reagentes de transfecção eficientes e de baixa toxicidade para o DNA plasmídeo (Wang et al. 2010, Molecular BioSystems, 6, 256263). Estes polímeros foram obtidos através da aminólise de poli(metacrilato de metila) com oligoaminas da fórmula geral H2N-CH2-CH2-(NH-CH2-CH2)m-NH2, onde m = 1, 2, ou 3. Os autores descobriram que a eficácia de transfecção aumentou com uma extensão crescente de aminas.
[009] Ou et al. descreveu as poli(dissulfeto amido aminas) que são derivadas de oligo aminas termicamente protegidas tendo a estrutura Dde- NH-(CH2)a-NH-(CH2)b-NH-(CH2)a-NH-Dde através da copolimerização com N,N’-cistaminabisacrilamida (Ou et al. 2009, Biomaterials 30, 5804-5814; WO 2010/065660). Eles examinaram as combinações a = 2 e b = 2, a = 2 e b = 3, a = 3 e b = 2, a = 3 e b = 3, a = 3 e b = 4 (espermina). Dde é o grupo de proteção de 2-acetildimedona. Depois da remoção do grupo de proteção, os rendimentos da síntese de poli(dissulfeto amido aminas) onde as aminas internas, originalmente secundárias se tornam aminas ternárias como parte da cadeia polimérica principal e as aminas terminais se tornam parte das cadeias laterais de etileno ou propileno amina pendentes. Tais polímeros possuem a capacidade de tamponamento na faixa de pH relevante para a liberação de ácido nucleico e são úteis para transfectar o DNA plasmídico nas células.
[0010] Recentemente, a utilidade de uma nova classe de estruturas sintéticas semelhantes aos lipídeos, mas não lipídicas, os então chamados lipoides, para a liberação de ácido nucleico in vitro e in vivo foi descoberta (US 8.450.298; Love et al. 2010, PNAS 107, 1864-1869; WO2006/138380; Akinc et al. 2008, Nat Biotechnol 26, 561-569). Os lipoides são obtidos reagindo-se os compostos contendo amina com epóxidos alifáticos, acrilatos, acrilamidas ou aldeídos. Os autores/inventores forneceram procedimentos sintéticos para obter bibliotecas de lipoide e procedimentos de triagem para selecionar compostos úteis com utilidade na liberação de ácido nucleico às células in vitro.
[0011] Como é evidente acima, muita pesquisa e trabalho de desenvolvimento foi feita no passado na liberação de outras moléculas de ácido nucleico tais como DNA plasmídico, oligonucleotídeos, siRNA ou análogos do ácido nucleico. A liberação de mRNA não foi investigada em muita profundidade. Alguns autores alegaram que os compostos e formulações que funcionam bem para a liberação de DNA ou siRNA funcionariam de maneira semelhante para a liberação de mRNA. Contudo, ao contrário do DNA plasmídico ou siRNA, o mRNA é uma molécula de filamento único. Consequentemente, com base somente nas considerações estruturais, seria esperado diferentes requerimentos para os compostos e formulações quanto a liberação de mRNA versus a liberação de DNA ou siRNA.
[0012] A literatura anterior citada acima descreve a liberação dos ácidos nucleicos de duplo-filamento tais como DNA plasmídico ou siRNA em células, mas não é conhecido se os métodos e compostos descritos são capazes de liberar os ácidos nucleicos de filamento único tal como o mRNA nas células. Notavelmente, foi anteriormente observado que a transfecção de mRNA difere substancialmente da transfecção do DNA plasmídico nas células (Bettinger et al. 2001, Nucleic Acids Res, 29,3882-91, Uzgün et al, 2011, Pharm Res, 28, 2223-32).
[0013] De acordo com isto, os presentes inventores descobriram que quando triando mais do que 100 membros de uma família de polímeros descrita na WO 2011/154331 quanto sua adequabilidade na liberação de RNA, preferivelmente na liberação de RNA de filamento único tal como mRNA, às células, nenhum dos compostos foi útil em transfectar o mRNA em uma maneira que dá origem à expressão de um gene codificado pelo mRNA. Ao contrário, todos estes compostos são eficientes na liberação do DNA plasmídico e/ou siRNA. Consequentemente, as regras estabelecidas quanto à liberação dos ácidos nucleicos de duplo-filamento nas células não se aplicam a priori para o mRNA de filamento único. A descrição da WO 2011/154331 compreende oligômeros quimicamente definidos sendo de 2 a 60 unidades de unidades de ácido oligo(alquileno amino) que correspondem à fórmula geral H00C-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H, onde Z é uma série de metileno ou uma variedade de outros agrupamentos, R é um metileno ou resíduo de carbóxi e a e b são independentemente números inteiros de 1 a 7 ou 2 a 7, respectivamente. Os oligômeros desta família compreendem grupos amino protonáveis capazes de exercer um então chamado efeito de esponja de prótons e foram mostrados ser altamente ativos na transfecção do DNA plasmídico e siRNA in vitro e in vivo. De maneira importante, a WO 2011/154331 e publicações científicas associadas ensinam em muitos detalhes como as bibliotecas de oligômero/polímero definidas por sequência podem ser estabelecidas a partir de blocos de formação correspondentes à fórmula geral H00C-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H.
[0014] A tarefa técnica subjacente à presente invenção, foi deste modo fornecer uma composição que é adequada para a liberação de RNA, preferivelmente, RNA de filamento único, tal como mRNA, com uma alta eficiência em uma célula ou a um tecido.
[0015] Esta tarefa foi efetuada através do fornecimento das formas de realização como caracterizado nas reivindicações e ilustrado em maiores detalhes na seguinte descrição geral e nos exemplos. Em particular, a invenção fornece, em suas várias formas de realização como ainda definido: - oligômeros, polímeros ou lipoides compreendendo oligo(alquileno aminas) contendo unidades de alquileno amina não idênticas alternadas que são úteis para a liberação de um RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA, em uma célula ou a um tecido, - composições compreendendo estes oligômeros, polímeros ou lipoides compreendendo oligo(alquileno aminas) contendo unidades de alquileno amina não idênticas alternadas em combinação com um RNA e, em particular, um mRNA que são úteis para a liberação do RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA, em uma célula ou a um tecido, - métodos para preparar os ditos compostos e composições, bem como - métodos para usar os ditos compostos e composições para liberar um RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA, em uma célula, bem como os usos médicos e métodos terapêuticos que exploram a capacidade das composições de acordo com a invenção para liberar um RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA.
[0016] O espaço estrutural rico de oligo(alquileno aminas) contendo unidades de alquileno amina não idênticas alternadas nos compostos oligoméricos ou poliméricos, incluindo compostos lineares, ramificados e dendríticos, aleatórios ou de sequência definida, ou em compostos de lipoide compreendidos em uma composição útil para a liberação de um RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA, a uma célula não foi explorado. Nenhum dos dois tem o espaço de sequência de tais compostos como tal foi explorado.
[0017] Foi surpreendentemente descoberto como um princípio geral anteriormente desconhecido para oligômeros, polímeros e lipídeos que um arranjo de unidades de alquileno amina de comprimento alternado nos grupos de três ou mais unidades e contendo uma unidade de etilenoamina nas composições para transfectar uma célula com um RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA, foi consistentemente mais eficaz do que arranjos análogos de unidades de alquileno amina de comprimento não alternado. Assim, oligômeros, polímeros ou lipídeos foram fornecidos que compartilham uma entidade estrutural comum que é ilustrada na fórmula (I):
Figure img0001
e que será explicada mais abaixo.
[0018] Em particular, a invenção fornece, em um primeiro aspecto, uma composição compreendendo um RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA e um componente compreendendo um oligo(alquileno amina), componente este que é selecionado de: a) um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (II) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal:
Figure img0002
em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R6 são definidas como segue, independentemente para cada grupo da fórmula (II) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; e uma cadeia de poli(etileno glicol); R6 é selecionado de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, - CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2- R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)- NH2; uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante de receptor, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (II) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (II); b) um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição:
Figure img0003
em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R5 são definidas como seguem, independentemente para cada grupo da fórmula (III) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2; e uma cadeia de poli(etileno glicol); e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (III) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (III); e c) um lipídeo tendo a estrutura da fórmula (IV)):
Figure img0004
em que as variáveis a, b, p, m, n e R1 a R6 são definidas como seguem: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R1 a R6 são independentemente um do outro selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2; uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante de receptor; contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 são um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, - CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IV) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (IV).
[0019] Em outros aspectos, a invenção refere-se a oligômeros, polímeros ou lipídeos como definidos acima como intermediários úteis para a preparação das composições de acordo com a invenção e às composições farmacêuticas compreendendo as composições de acordo com a invenção. A invenção também abrange métodos para a preparação dos oligômeros, polímeros ou lipídeos de acordo com a invenção assim como as composições e composições farmacêuticas de acordo com a invenção.
[0020] Ainda outros aspectos estão direcionados ao uso de uma composição de acordo com a invenção ou um polímero ou dendrímero ou lipídeo de acordo com a invenção para liberar RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA, dentro de uma célula alvo ou ao tecido e a um método para liberar RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, dentro de uma célula compreendendo a etapa de levar uma composição de acordo com a invenção em contato com a célula.
Grupos de Oligo(alquileno amina)
[0021] As estruturas de oligo(alquileno amina) das fórmulas (II), (III) e (IV) são caracterizadas em que elas combinam unidades de etileno amina mais curtas (também aludidas para ilustração como “S”) (isto é, a ou b é 1) com unidades de alquileno amina mais longas (também aludidas para ilustração como “L”) (isto é, o outro de a ou b é um número inteiro de 2 a 4) em uma maneira análoga. Inesperadamente, este argumento das unidades protonáveis foi descoberto fornecer vantagens em termos da adequabilidade do grupo resultante para fornecer um veículo e para liberar RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, dentro de uma célula.
[0022] Como indicado acima, oligômeros ou polímeros que podem ser usados nas composições de acordo com uma modalidade preferida da invenção compreendendo uma pluralidade de grupos de oligo(alquileno amina) da fórmula (II) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal: -NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a- NR5]n-R6 (II), em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R6 são definidas como seguem, independentemente para cada grupo da fórmula (II) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2; e uma cadeia de poli(etileno glicol); R6 é selecionado de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, - CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2- R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C16 ou alquenila C3-C16 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)- NH2; uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante de receptor.
[0023] Preferivelmente, R2 a R5 são hidrogênio e R6 é selecionado de hidrogênio, um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2 e uma cadeia de poli(etileno glicol). Mais preferivelmente, R2 a R6 são hidrogênio. Preferivelmente, R7 é selecionado de alquila C8-C18 ou alquenila C8-C18 tendo uma ligação dupla C-C e mais preferivelmente de alquila C8-C12 ou alquenila C8-C12 tendo uma ligação dupla C-C e mais preferivelmente de alquila C10-C12 ou alquenila C10-C12 tendo uma ligação dupla C-C.
[0024] Um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (II) ou suas modalidades preferidas podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (II).
[0025] Uma pluralidade de grupos da fórmula (II) significa que dois ou mais dos grupos da fórmula (II) ou suas modalidades preferidas estão contidos nos oligômeros ou polímeros de acordo com a invenção, preferivelmente três ou mais. Nos polímeros contendo uma pluralidade de grupos da fórmula (II), é preferido que 10 ou mais grupos da fórmula (II) estejam presentes. Será entendido que os grupos da fórmula (II) ou suas modalidades preferidas podem ter a mesma estrutura dentro de um polímero ou oligômero, ou podem ter duas ou mais estruturas diferentes dentro do escopo da fórmula (II).
[0026] De acordo com uma outra modalidade preferida, os oligômeros ou polímeros que podem ser usados nas composições de acordo com a invenção compreendendo uma pluralidade de grupos de oligo (alquileno amina) da fórmula (III) como unidades de repetição: -NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a- NR5]n- (III), em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R5 são definidas como seguem, independentemente para cada grupo da fórmula (III) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2; uma cadeia de poli(etileno glicol); um efetor de escape endossômico e um ligante de receptor. Preferivelmente, R2 a R5 são hidrogênio. Preferivelmente, R7 é selecionado de alquila C8-C18 ou alquenila C8-C18 tendo uma ligação dupla C-C e mais preferivelmente de alquila C8-C12 ou alquenila C8-C12 tendo uma ligação dupla C-C e mais preferivelmente de alquila C10-C12 ou alquenila C10-C12 tendo uma ligação dupla C-C.
[0027] Um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (III) ou suas modalidades preferidas podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (III).
[0028] Opcionalmente, os oligômeros ou polímeros que compreendem uma pluralidade de grupos da fórmula (III) ou suas modalidades preferidas como unidades de repetição podem compreender, além disso, um ou mais grupos de oligo(alquileno amina) da fórmula (II) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal.
[0029] Uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidade de repetição significa que dois ou mais dos grupos da fórmula (III) ou suas modalidades preferidas estão contidos nos oligômeros ou polímeros de acordo com a invenção, preferivelmente três ou mais. Geralmente, substâncias compreendendo de 2 a 9 unidades de repetição são aqui aludidas como oligômeros, estes compreendendo 10 e mais unidades de repetição como polímeros. Assim, nos polímeros contendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição, 10 ou mais grupos da fórmula (III) estão preferivelmente presentes. Será entendido que os grupos da fórmula (III) ou suas modalidades preferidas podem ter a mesma estrutura dentro de um polímero ou oligômero, ou podem ter duas ou mais estruturas diferentes dentro do escopo da fórmula (III). Vantajosamente e de acordo com uma modalidade preferida, os oligômeros ou polímeros contendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição podem ser fornecidos na forma de uma biblioteca de polímeros de sequência definida que são preparados a partir de grupos diferentes da fórmula (III) em uma polimerização controlada, escalonada.
[0030] De acordo com as fórmulas (II) e (III) acima, uma unidade de alquileno amina pode ser repetida uma vez em uma cadeia alternada tal que as porções de oligo(alquileno amina) do tipo -S-L-L-S- ou -L-S-S-L- podem resultar, em que S representa uma unidade de etileno amina mais curta e L representa uma unidade de alquileno amina mais longa. Entretanto, os grupos preferidos das fórmulas (II) e (III) são aqueles em que nenhuma repetição ocorre, isto é, em que p é 1, tal que as unidades mais curtas ou mais longas não aparecem em pares. Em outras palavras, o grupo da fórmula (II) é preferivelmente um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (IIa) e o grupo da fórmula (III) é preferivelmente um grupo de oligo(alquileno amina) de (IIIa): -NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a- NR5]n-R6(IIa), em que a, b, m, n e R2 a R6 são definidos como na fórmula (II), incluindo as modalidades preferidas e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIa) podem ser protonados para fornecer uma estrutura de polímero ou oligômero catiônico; -NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a- NR5]n- (IIIa), em que a, b, m, n e R2 a R5 são definidos como na fórmula (III), incluindo as modalidades preferidas e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIIa) podem ser protonados para fornecer uma estrutura de polímero ou oligômero catiônico.
[0031] Além disso, é geralmente preferido para o grupo de oligo(alquileno amina) das fórmulas (II) e (III) que n seja 1 e mais preferido que m seja 1 e n seja 1. Assim, é particularmente preferido que o grupo da fórmula (II) seja um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (IIb) e que o grupo da fórmula (III) seja um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (IIIb): -NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-(NR5)- R6 (IIb), em que a, b e R2 a R6 são definidos como na fórmula (II), incluindo as modalidades preferidas e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIb) podem ser protonados para fornecer uma estrutura de polímero ou oligômero catiônico; -NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5- (IIIb), em que a, b e R2 a R5 são definidos como na fórmula (III), incluindo as modalidades preferidas e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIIb) podem ser protonados para fornecer uma estrutura de polímero ou oligômero catiônico.
[0032] Como respeito ao comprimento das unidades de alquileno amina nos grupos de oligo(alquileno amina) das fórmulas (II), (IIa), (IIb) e (III), (IIIa), (IIIb), será entendido que uma das unidades alternadas necessita ser uma unidade de etileno amina (isto é, a ou b deve ser 1). A outra unidade alternada pode ser uma unidade de propileno amina, uma unidade de butileno amina ou uma unidade de pentileno amina (isto é, o outro de a ou b é um número inteiro de 2 a 4. Preferivelmente, o outro de a ou b é 2 ou 3 e mais preferivelmente, a é 1 e b é 2, ou um é 2 e b é 1. Consequentemente, ainda mais preferido como grupo (II) é um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (IIc) e ainda mais preferido como um grupo (III) é um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (IIIc): -NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-R6 (IIc), em que R2 a R6 são como definidos na fórmula (II) e as suas modalidades preferidas e são mais preferivelmente hidrogênio e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIc) podem ser protonados para fornecer uma estrutura de polímero ou oligômero catiônico; -NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5- (IIIc), em que R2 a R5 são como definidos na fórmula (III) e as suas modalidades preferidas e são mais preferivelmente hidrogênio e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIIc) podem ser protonados para fornecer uma estrutura de polímero ou oligômero catiônico.
[0033] Na medida em que qualquer um dos grupos R2 a R6 nas fórmulas (II), (IIa), (IIb) e (IIc) ou os grupos R2 a R5 nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb) e (IIIc) são um grupo de proteção para um grupo amino tal como descrito por exemplo na WO 2006/138380, as suas modalidades preferidas são t-butoxicarbonila (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), ou carbobenzilóxi (Cbz).
[0034] Na medida em que qualquer um dos grupos R1 a R6 nas fórmulas (II), (IIa), (IIb) e (IIc) ou os grupos R2 a R5 nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb) e (IIIc) são um ligante de receptor, os exemplos úteis são dados em Philipp e Wagner em “Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy”, 3a Edição, Capítulo 15, CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009. Os ligantes de receptor preferidos para tecido pulmonar são descritos em Pfeifer et al. 2010, Ther. Deliv. 1(1):133-48. Os ligantes de receptor preferidos incluem peptídeos sintéticos cíclicos ou lineares tais como derivados da triagem de bibliotecas de peptídeo para ligar a uma estrutura de superfície celular particular ou tipo de célula particular, peptídeos RGD cíclicos ou lineares, carboidratos sintéticos ou naturais tais como ácido siálico, ligantes de galactose ou manose ou sintéticos derivados da reação de um carboidrato por exemplo com um peptídeo, anticorpos que especificamente reconhecem as estruturas da superfície celular, ácido fólico, fatores de crescimento epidérmico e seus derivados peptídicos, transferrina, anticorpos do receptor de anti-transferrina, nanocorpos e fragmentos de anticorpo, drogas aprovadas que se ligam às moléculas da superfície celular conhecidas etc.
[0035] Na medida em que qualquer um dos grupos R1 a R6 nas fórmulas (II), (IIa), (IIb) e (IIc) ou os grupos R2 a R5 nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb) e (IIIc) são uma cadeia de poli(etileno glicol), o peso molecular preferido da cadeia de poli(etileno glicol) é de 100 - 20.000 g/mol, mais preferivelmente 1.000 - 10,000 g/mol e mais preferido é 1.000 - 5.000 g/mol.
[0036] Mais preferido como grupo (II) é um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (IId): -NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H (IId), em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IId) podem ser protonados para fornecer um polímero catiônico ou estrutura dendrimérica.
[0037] Mais preferido como grupo (III) é um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (IIId): -NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH- (IIId), em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIId) podem ser protonados para fornecer um polímero catiônico ou estrutura dendrimérica.
[0038] Como indicado acima, lipídeos que podem ser usados nas composições de acordo com uma modalidade preferida da invenção tendo a estrutura da fórmula (IV): R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a- NR5]n-R6 (IV), em que as variáveis a, b, p, m, n e R1 a R6 são definidas como seguem: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R1 a R6 são independentemente um do outro selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2; uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante de receptor; contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 são um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, - CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C.
[0039] Preferivelmente, R1 a R6 são independentemente selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-C(OH)H-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH, em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; e uma cadeia de poli(etileno glicol); contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 são um grupo -CH2-C(OH)H-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH, em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C. Mais preferivelmente, R1 a R6 são independentemente selecionado de hidrogênio; e um grupo -CH2-CH(OH)-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH em que R7 é selecionado de alquila C3-C16 ou alquenila C3-C16 tendo uma ligação dupla C-C; contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 são um grupo -CH2-CH(OH)-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH, em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C. Ainda mais preferida é a situação em que R1 e R6 são independentemente selecionados de hidrogênio; e um grupo -CH2-CH(OH)-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; e R2 a R5 são todos um grupo -CH2-CH(OH)-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C. Preferivelmente, R7 é selecionado de alquila C8-C16 ou alquenila C8C18 tendo uma ligação dupla C-C e mais preferivelmente de alquila C8-C12 ou alquenila C8-C12 tendo uma ligação dupla C-C e mais preferivelmente de alquila C10-C12 ou alquenila C10-C12 tendo uma ligação dupla C-C.
[0040] Um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IV) podem ser protonados para fornecer um lipídeo catiônico da fórmula (IV).
[0041] De acordo com a fórmula (IV) acima, uma unidade de alquileno amina pode ser repetida uma vez em uma cadeia alternada tal que as porções de oligo(alquileno amina) do tipo -S-L-L-S- ou -L-S-S-L- podem resultar, em que S representa uma unidade de etileno amina mais curta e L representa uma unidade de alquileno amina mais longa. Entretanto, um lipídeo preferido da fórmula (IV) é um em que nenhuma repetição ocorre, isto é, em que p é 1, tal que as unidades mais curtas ou mais longas não aparecem em pares. Em outras palavras, o lipídeo da fórmula (IV) é preferivelmente um lipídeo da (IVa): R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a- NR5]n-R6 (IVa), em que a, b, m, n e R1 a R6 são definidos como na fórmula (IV), incluindo as modalidades preferidas e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IVa) podem ser protonados para fornecer um lipídeo catiônico; além disso, é geralmente preferido para o lipídeo da fórmula (IV) que n seja 1 e mais preferido que m seja 1 e n seja 1. Assim, é particularmente preferido que o lipídeo da fórmula (IV) seja um lipídeo da fórmula (IVb): R1-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5- R6 (IVb), em que a, b e R1 a R6 são definidos como na fórmula (IV), incluindo as modalidades preferidas e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IVb) podem ser protonados para fornecer um lipídeo catiônico.
[0042] Como respeito ao comprimento das unidades de alquileno amina no lipídeo das fórmulas (IV), (IVa) e (IVb), será entendido que uma das unidades alternadas necessita ser uma unidade de etileno amina (isto é, a ou b deve ser 1). A outra unidade alternada pode ser uma unidade de propileno amina, uma unidade de butileno amina ou uma unidade de pentileno amina (isto é, o outro de a ou b é um número inteiro de 2 a 4. Preferivelmente, o outro de a ou b é 2 ou 3 e mais preferivelmente, a é 1 e b é 2, ou um é 2 e b é 1. Consequentemente, ainda mais preferido como lipídeo da fórmula (IV) é um lipídeo da fórmula (IVc): R1-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-R6 (IVc), em que R1 a R6 são como definidos na fórmula (IV) e as suas modalidades preferidas e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IVc) podem ser protonados para fornecer um lipídeo catiônico;
[0043] Na medida em que os grupos R1 a R6 nas fórmulas (IV), (IVa), (IVb) e (IVc) são um grupo de proteção para um grupo amino tal como descrito por exemplo na WO 2006/138380, as suas modalidades preferidas são t-butoxicarbonila (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), ou carbobenzilóxi (Cbz).
[0044] Na medida em que os grupos R1 a R6 nas fórmulas (IV), (IVa), (IVb) e (IVc) são um ligante de receptor, os exemplos úteis são dados em Philipp e Wagner em “Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms e Strategy”, 3a Edição, Capítulo 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009. Os ligantes de receptor preferidos para tecido pulmonar são descritos em Pfeifer et al. 2010, Ther Deliv. 1(1):133-48. Os ligantes de receptor preferidos incluem peptídeos sintéticos cíclicos ou lineares tais como derivados da triagem de bibliotecas de peptídeo para ligar a uma estrutura de superfície celular particular ou tipo de célula particular, peptídeos RGD cíclicos ou lineares, carboidratos sintéticos ou naturais tais como ácido siálico, ligantes de galactose ou manose ou sintéticos derivados da reação de um carboidrato por exemplo com um peptídeo, anticorpos que especificamente reconhecem as estruturas da superfície celular, ácido fólico, fatores de crescimento epidérmico e seus derivados peptídicos, transferrina, anticorpos do receptor de anti-transferrina, nanocorpos e fragmentos de anticorpo, drogas aprovadas que se ligam às moléculas da superfície celular conhecidas etc.
[0045] Na medida em que os grupos R1 a R6 nas fórmulas (IV), (IVa), (IVb) e (IVc) são uma cadeia de poli(etileno glicol), o peso molecular preferido da cadeia de poli(etileno glicol) é de 100 - 20.000 g/mol, mais preferivelmente 1.000 - 10.000 g/mol e mais preferido é 1.000 - 5.000 g/mol.
[0046] Como indicado acima, um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados nas fórmulas (I) e as suas modalidades preferidas incluindo fórmulas (IIa) - (IId), (IIIa) - (IIId) e (IVa) - (IVc) podem ser protonados para resultar em um oligômero ou polímero ou lipídeo em uma forma catiônica, tipicamente uma forma oligocatiônica ou policatiônica. Será entendido que grupos amino primários e/ou secundários e/ou terciários nos grupos da fórmula (I) e as suas modalidades preferidas incluindo fórmulas (IIa) - (IId), (IIIa) - (IIId) e (IVa) - (IVc) podem atuar como aceitadores de próton, especialmente em água e soluções aquosas, incluindo fluídos fisiológicos. Assim, os oligômeros, polímeros e os lipídeos da presente invenção tipicamente têm um uma carga positiva global em uma solução aquosa em um pH abaixo de 7,5. Uma solução aquosa, como aqui aludido, é uma solução em que o solvente compreende 50% (vol./vol.) ou mais, preferivelmente 80 ou 90% ou mais e mais preferivelmente 100% de água. Também, se as composições de acordo com a invenção estão em contato com um fluído fisiológico tendo um pH abaixo de 7,5, incluindo por exemplo, sangue e fluído pulmonar, os grupos das fórmulas (I) e as suas modalidades preferidas incluindo as fórmulas (IIa) - (IId), (IIIa) - (IIId) e (IVa) - (IVc) tipicamente contendo um ou mais grupos amino protonados. Os valores de pKa destes compostos podem ser determinados pela titulação com ácido-base usando um titulador de pKa automatizado. A carga líquida em um dado valor de pH pode ser depois calculada a partir da equação de Henderson-Hasselbach. De acordo com Geall et al. (J. Geall et al. 1998, Chem Commun, 1403-1404), é importante reconhecer que qualquer carga é compartilhada através de vários dos centros básicos e que a mesma não pode ser atribuída a um único ponto. 1,9-diamino-3,7-diazanonano (propil/etil/propil)), por exemplo, tem pKas de 9,3, 7,6 e 5,7, significando que nas frações substanciais no pH fisiológico dos grupos amino estão nos estados protonados e não protonados.
[0047] Entretanto, como será entendido pelo leitor versado, os oligômeros, polímeros e lipídeos de acordo com a invenção assim como as composições de acordo com a invenção também podem ser fornecidos como uma forma de sal seco que contém o oligômero, polímero ou lipídeo em uma forma catiônica.
[0048] Como será entendido ainda, os contraíons (ânions) para as cargas positivas de grupos amino protonados nas composições de acordo com a invenção compreendendo um oligômero, polímero ou lipídeo e RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, são tipicamente fornecidos pelas porções aniônicas contidas no RNA. Se os grupos positivamente carregados estão presentes em excesso comparados com as porções aniônicas no RNA, as cargas positivas podem ser balanceadas por outros ânions, tais como Cl- ou HCO3- tipicamente encontrados nos fluídos fisiológicos.
[0049] Os oligo(alquileno amina)s adequados para o uso no contexto da presente invenção podem ser comercialmente obtidos a partir de fornecedores químicos conhecidos, ou podem ser sintetizados pelos métodos conhecidos na técnica (por exemplo, van Alphen 1936, Recueila des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 55, 835-840). Qualquer modificação que possa ser necessária pode ser obtida pelos métodos padrão de síntese química.
Estrutura de polímeros/oligômeros
[0050] Como indicado acima, os grupos das fórmulas (I) e as suas modalidades preferidas incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) e (IIIa) - (IIId) podem estar ligados a, ou podem fornecer uma variedade de oligômeros ou estruturas de estrutura polimérica.
[0051] Geralmente, o oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) também podem ser aludidas como uma estrutura polimérica carregando uma pluralidade de grupos da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId), como uma cadeia lateral e/ou um grupo terminal. As cadeias principais poliméricas que podem carregar uma pluralidade de grupos da fórmula (II) e as suas modalidades preferidas, incluindo os grupos das fórmulas (IIa) a (IId), como uma cadeia lateral ou um grupo terminal incluem polímeros lineares, ramificados ou reticulados assim como polímeros dendríticos (dendrímeros). Os polímeros incluem polímeros sintéticos ou biopolímeros. As estruturas de estrutura polimérica preferidas são lineares ou ramificadas. Isto também se aplica para os oligômeros que carregam os grupos da fórmula (II) e as suas modalidades preferidas incluindo os grupos das fórmulas (IIa) a (IId) como uma cadeia lateral ou um grupo terminal, a diferença sendo que uma estrutura polimérica tipicamente compreende 10 ou mais unidades de repetição, ao passo que uma estrutura de oligômero compreende de 2 a 9, preferivelmente 3 a 9 unidades de repetição. Geralmente, entre os oligômeros e polímeros compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (II) e as suas modalidades preferidas, incluindo os grupos das fórmulas (IIa) a (IId), como uma cadeia lateral ou um grupo terminal, os polímeros são preferidos.
[0052] As cadeias laterais ou grupos terminais da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) podem ser convenientemente enxertadas a uma cadeia principal polimérica ou oligomérica usando funcionalidades e reações químicas conhecidas de modo a fornecer os polímeros de acordo com a invenção. Como será entendido pelo leitor versado, o termo “enxertar a um polímero ou oligômero” não exclui a opção de que as cadeias laterais são ligadas aos monômeros antes da reação de polimerização. Como indicado pela valência livre na fórmula (II), as cadeias laterais ou grupos terminais são ligados à estrutura polimérica ou oligomérica por intermédio de uma ligação covalente.
[0053] Será entendido ainda que os termos “polímero” e “oligômero” como aqui usados abrangem polímeros e oligômeros obteníveis por uma ampla variedade de reações, tais como reações de poliadição e policondensação, incluindo polimerização de radical, polimerização aniônica ou catiônica, assim como polímeros e oligômeros obteníveis pelas reações de ligação escalonadas (por exemplo, processos de crescimento escalonados).
[0054] Assim, os polímeros ou oligômeros adequados como cadeias principais poliméricas ou oligoméricas para carregar uma pluralidade de grupos da fórmula (II), ou suas modalidades preferidas incluindo as fórmulas (IIa) - (IId), como uma cadeia lateral ou um grupo terminal incluem polímeros ou oligômeros tais como poliamidas, poliésteres, polímeros com uma estrutura de cadeia carbônica e polissacarídeos. As cadeias principais poliméricas ou oligoméricas exemplares são fornecidas pelos poli(aminoácidos) compreendendo uma pluralidade de unidades do ácido glutâmico ou aspártico, tais como poli(ácido glutâmico) e poli(ácido aspártico), proteínas, polialcinos, poliaminas, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, ácido polimaleico, polissulfonato, poliestireno sulfonato, polifosfato, pentosan polissulfato, poli(ácido vinil fosfórico), poli(butadieno- co-ácido maleico), poli(acrilato de etila-co-ácido acrílico), poli(etileno-co- ácido acrílico), poli(etileno-co-anidrido maleico), poli(metacrilato de metila- co-ácido metacrílico), poli(metacrilato de metila-co-ácido metacrílico), poli(ácido estirenossulfônico-co-ácido maleico), poli(cloreto de vinila-co- acetato de vinila-co-ácido maleico) carboidratos tais como heparina, sulfato de heparana, poli(ácido glicurônico), poli(ácido galacturônico), ácido hialurônico, poli(ácidos urônicos) no geral, ou dendrímeros terminados em carbóxi. Entre eles, poli(aminoácidos) compreendendo uma pluralidade de unidades de ácido glutâmico ou aspártico, tais como poli(ácido glutâmico) e poli(ácido aspártico) e ácido poli(met)acrílico são preferidos. Mais preferido para o propósito da presente invenção são o ácido poliacrílico e ácido polimetacrílico.
[0055] Preferivelmente, as cadeias principais poliméricas têm um grau de polimerização (em termos do número médio de unidades polimerizadas, determinadas por exemplo, por intermédio da cromatografia de permeação em gel (GPC)) de 10 a 10.000, preferivelmente de 50 a 5.000.
[0056] Os polímeros de acordo com a invenção podem ser fornecidos pelos homopolímeros ou copolímeros. Os copolímeros podem conter unidades polimerizadas com estruturas diferentes, tal que a estrutura polimérica seja um copolímero. Alternativamente, copolímeros podem ser obtidos com base em um homopolímero como uma estrutura polimérica, em que nem todas das unidades polimerizadas carregam um grupo da fórmula (II), ou suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId). Será entendido que também existe a opção de combinar estas duas alternativas enxertando-se cadeias laterais a uma certa porcentagem das unidades em uma estrutura copolimérica. Os copolímeros podem estar na forma de copolímeros aleatórios, de gradiente ou bloco.
[0057] Se os polímeros de acordo com a invenção são homopolímeros, todas as unidades polimerizadas carregam um grupo da fórmula (II), ou suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId). Se os polímeros de acordo com a invenção são copolímeros, é preferido que 5 a 100% de todas as unidades polimerizadas carregam um grupo da fórmula (II), ou suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId), mais preferivelmente de 25 a 100% e em particular de 50 a 100%. As porcentagens são dadas em termos do número de unidades que carregam um grupo da fórmula (II), em relação à todas as unidades polimerizadas.
[0058] Os copolímeros acima podem conter, além do grupo da fórmula (II), ou suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) também outras cadeias laterais ou grupos terminais contendo amina. Entretanto, é preferido que nenhuma das cadeias laterais ou grupos terminais da fórmula -NH-(CH2)x-(NH(CH2)2)y-NH2, em que x indica um número inteiro de 1 a 5 e y indica um número inteiro de 1 a 5, estejam contidos nos polímeros de acordo com a invenção.
[0059] As poliamidas preferidas que carregam uma cadeia lateral da fórmula (II), ou suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId), contêm unidades de repetição da fórmula (V):
Figure img0005
em que as variáveis têm os seguintes significados: R8 e R9 são independentemente selecionados de uma ligação e alcanodiila C1-C6; R10 é selecionado de H e alquila C1-C6; R11 é selecionado de uma ligação e alcanodiila C1-C6, L1 é um grupo de ligação bivalente, e A1 representa um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (II).
[0060] Preferivelmente, R8 e R9 são independentemente selecionados de uma ligação e alcanodiila C1-C5 e são mais preferivelmente uma ligação. Preferivelmente, R10 é selecionado de H e metila e é mais preferivelmente H. R11 é preferivelmente alcanodiila C1-C6.
[0061] O grupo de ligação L1 tem, em uma modalidade preferida, a estrutura -Z1-R’-Z2-, em que Z1 é selecionado de uma ligação, -NH-(C=O)-, - NH-C(S)-NH-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-S(O)2-, -NH-CH2-C(OH)-, -NH- (C=O)-O-, -NH-C(NH)-, -CH=N-NH-(C=O)-, -S-S-, -ligação de tioéter-, -S- CH2-(C=O)-, -S-, -S-CH2-CH-NH2- e -ligação de aril tioéter-; R’ é selecionado de uma ligação, alcanodiila C1-C6 e -(CH2-CH2-O)n-H com n = 1 a 3; e Z2 é selecionado de um ligação, -(C=O)-, -NH-C(S)-, -NH-(C=O)-, - S(O)2-, -O-P(O)2-, -CH(OH)-CH2, -O-(C=O)- e -C(NH)-. Preferivelmente, Z1 é selecionado de uma ligação, -NH-(C=O)-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-O- , -NH-C(NH)-; R’ é selecionado de uma ligação e alcanodiila C1-C6 e Z2 é selecionado de uma ligação, -(C=O)-, -NH-(C=O)- e -O-(C=O)-; com a condição de que um de Z1 e Z2 é outro que não uma ligação. É mais preferido para L1 que Z1 e R’ sejam uma ligação e Z2 é -(C=O)-, ou que Z1 é -NH- (C=O)-, R’ seja alcanodiila C1-C6 e Z2 é -(C=O)-.
[0062] A1 é preferivelmente uma das modalidades preferidas aqui definidas para o grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (II). Em particular um dos grupos das fórmulas (IIa) - (IId).
[0063] Nas poliamidas preferidas contendo a unidade de repetição da fórmula (V), é preferido que 5 a 100% de todas as unidades polimerizadas sejam unidades da fórmula (V), mais preferivelmente de 25 a 100% e em particular de 50 a 100%. As porcentagens são dadas em termos do número de unidades da fórmula (V), em relação a todas as unidades polimerizadas. Dentro das definições e definições preferidas dadas para as variáveis da fórmula (V), as unidades de repetição da fórmula (V) podem ser as mesmas ou diferentes no polímero preferido de acordo com a invenção.
[0064] Particularmente preferidos como polímeros de poliamida para o uso na presente invenção são os polímeros das fórmulas (Va) e (Vb).
Figure img0006
[0065] Nestas fórmulas, R8, R9, R10, R11, L1 e A1 são definidos como para a fórmula (V), incluindo as modalidades preferidas da mesma. R12 é selecionado de OH ou alcóxi C1-C6, -NH2, uma cadeia de poli(etileno glicol), ou um ligante de receptor. R13 é H, um grupo de proteção para um grupo amino, uma cadeia de poli(etileno glicol), ou um ligante de receptor X1 é selecionado de H, -NH2, -COOH e -COOR”, com R” sendo alquila C1-C6, uma cadeia de poli(etileno glicol), ou um ligante de receptor. Na fórmula (Va), s (indicando o número médio de unidades polimerizadas, determinado por exemplo, por intermédio da cromatografia de permeação em gel (GPC)) é de 10 a 10.000, preferivelmente de 50 a 5.000. Na fórmula (Vb), as unidades em colchetes são unidades de repetição que podem estar dispostas no polímero em qualquer ordem, incluindo em particular um arranjo aleatório, alternado ou de bloco. A soma de q+r (indicando o número médio de unidades polimerizadas, determinado por exemplo, por intermédio da cromatografia de permeação em gel (GPC)) é de 10 a 10.000, preferivelmente de 50 a 5.000 e a razão de q/(q+r) varia de 0,05 a 1, preferivelmente de 0,25 a 1 e mais preferivelmente de 0,5 a 1.
[0066] Os poli(aminoácidos) exemplares preferidos, que podem ser convenientemente modificados pelas cadeias laterais da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) são poli(ácido glutâmico), poli(ácido aspártico), polilisina, poliornitina ou poli(aminoácidos) contendo unidades de ácido glutâmico, ácido aspártico, ornitina e/ou lisina. Mais preferido é o poli(ácido glutâmico).
[0067] Os polímeros preferidos com uma estrutura de cadeia carbônica carregando uma cadeia lateral da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) contêm unidades de repetição da fórmula (VI):
Figure img0007
em que as variáveis têm os seguintes significados: R14 e R15 são independentemente selecionados de uma ligação e alcanodiila C1-C6; R16 é selecionado de H e alquila C1-C6; R17 é selecionado de uma ligação e alcanodiila C1-C6, L2 é um grupo de ligação bivalente, e A1 representa um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (11) .
[0068] Preferivelmente, R14 é uma ligação e R15 é uma ligação ou - CH2-. Mais preferivelmente, R14 é uma ligação e R15 é -CH2-. Preferivelmente, R16 é selecionado de H e metila. R17 é preferivelmente uma ligação ou -CH2-.
[0069] O grupo de ligação L2 tem, em uma modalidade preferida, a estrutura -Z3-R’-Z4-, em que Z3 é selecionado de uma ligação, -NH-(C=O)-, - NH-C(S)-NH-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-S(O)2-, -NH-CH2-C(OH)-, -NH- (C=O)-O-, -NH-C(NH)-, -S-S, -CH=N-NH-(C=O)-, -ligação de tioéter-, -S-CH2-(C=O)-, -S-, -S-CH2-CH-NH2- e -ligação de aril tioéter-; R’ é selecionado de uma ligação, alcanodiila C1-C6 e -(CH2-CH2- O)n-H com n = 1 a 3; e Z4 é selecionado de uma ligação, -(C=O)-, -NH-C(S)-, -NH-(C=O)-, -S(O)2-, -O-P(O)2-, -CH(OH)-CH2, -O-(C=O)- e -C(NH)-. Preferivelmente, Z3 é selecionado de uma ligação, -NH-(C=O)-, -NH-(C=O)- NH-, -NH-(C=O)-O-, -NH-C(NH)-; R’ é selecionado de uma ligação e alcanodiila C1-C6 e Z4 é selecionado de uma ligação, -(C=O)-, -NH-(C=O)- e -O-(C=O)-; com a condição de que um de Z3 e Z4 é outro que não uma ligação. É mais preferido para L2 que Z3 e R’ sejam uma ligação e Z4 seja - (C=O)-.
[0070] A1 é preferivelmente uma das modalidades preferidas aqui definidas para o grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (II), Em particular um dos grupos das fórmulas (IIa) - (IId).
[0071] Nas poliamidas preferidas contendo a unidade de repetição da fórmula (VI), é preferido que de 5 a 100% de todas as unidades polimerizadas sejam unidades da fórmula (VI), mais preferivelmente de 25 a 100% e em particular de 50 a 100%. As porcentagens são dadas em termos do número de unidades da fórmula (VI), em relação a todas as unidades polimerizadas. Dentro das definições e definições preferidas dadas para as variáveis da fórmula (VI), as unidades de repetição da fórmula (VI) podem ser as mesmas ou diferentes no polímero preferido de acordo com a invenção.
[0072] Particularmente preferidos como polímeros com uma estrutura de cadeia carbônica que carregam as cadeias laterais da fórmula (II), ou suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId), são os polímeros da fórmula (VIa) e (VIb).
Figure img0008
[0073] Nestas fórmulas, R14, R15, R16, R17, L2 e A1 são definidos como para a fórmula (VI), incluindo as suas modalidades preferidas. X2 é selecionado de -COOH e -COOR”, com R” sendo alquila C1-C6, uma cadeia de poli(etileno glicol), ou um ligante de receptor. Na fórmula (VIa), s (indicando o número médio de unidades polimerizadas, determinadas por exemplo, por intermédio da cromatografia de permeação em gel (GPC)) é de 10 a 10.000, preferivelmente de 50 a 5.000. Na fórmula (VIb), as unidades em colchetes são unidades de repetição que podem estar dispostas no polímero em qualquer ordem, incluindo em particular um arranjo aleatório, alternado ou de bloco. A soma de q+r (indicando o número médio de unidades polimerizadas, determinada por exemplo, por intermédio da cromatografia de permeação em gel (GPC)) é de 10 a 10.000, preferivelmente de 50 a 5.000 e a razão de q/(q+r) varia de 0,05 a 1, preferivelmente de 0,25 a 1 e mais preferivelmente de 0,5 a 1.
[0074] Os polímeros exemplares preferidos com uma estrutura de cadeia carbônica, que podem ser convenientemente modificados pelas cadeias laterais da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) são ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico ou ácido polimaleico e mais preferidos são o ácido poliacrílico e o ácido polimetacrílico.
[0075] Os polissacarídeos preferidos que carregam uma cadeia lateral da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId), contêm unidades de repetição da fórmula (VII):
Figure img0009
em que as variáveis têm os seguintes significados: R19 e R22 são independentemente selecionados de uma ligação e -(CH)2-; t é 0 ou 1; e um de R18, R20 e R21 representa -L3-A1, em que L3 é um grupo de ligação bivalente e A1 representa um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (II) e os outros são independentemente selecionados de -H, -OH e -(CH2)n-OH, em que n = 1 ou 2.
[0076] Preferivelmente, R19 e R22 são uma ligação. Preferivelmente, um de R18, R20 e R21 representa -L3-A1, em que L3 é um grupo de ligação bivalente e A1 representa um grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (II) e os outros são -OH.
[0077] O grupo de ligação L3 tem, em uma modalidade preferida, a estrutura -Z5-R’-Z6-, em que Z5 é selecionado de uma ligação, -NH-(C=O)-, - NH-C(S)-NH-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-S(O)2-, -NH-CH2-C(OH)-, -NH- (C=O)-O-, -NH-C(NH)-, -S-S, -CH=N-NH-(C=O)-, -ligação de tioéter-, -S- CH2-(C=O)-, -S-, -S-CH2-CH-NH2- e -ligação de aril tioéter-; R’ é selecionado de uma ligação, alcanodiila C1-C6 e -(CH2-CH2-O)n-H com n = 1 a 3; e Z6 é selecionado de uma ligação, -(C=O)-, -NH-C(S)-, -NH-(C=O)-, - S(O)2-, -O-P(O)2-, -CH(OH)-CH2, -O-(C=O)- e -C(NH)-; com a condição de que um de Z5 e Z6 é outro que não uma ligação. Preferivelmente, Z5 é selecionado de uma ligação, -NH-(C=O)-, -NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-O-, - NH-C(NH)-; R’ é selecionado de uma ligação e alcanodiila C1-C6 e Z6 é selecionado de uma ligação, -(C=O)-, -NH-(C=O)- e -O-(C=O)-; com a condição de que um de Z5 e Z6 é outro que não uma ligação. É mais preferido para L3 que Z5 e R’ sejam uma ligação e Z6 é -(C=O)-.
[0078] A1 é preferivelmente uma das modalidades preferidas aqui definidas para o grupo de oligo(alquileno amina) da fórmula (II), em particular um grupo da fórmula (IIa) - (IId).
[0079] Nos polissacarídeos preferidos contendo a unidade de repetição da fórmula (VII), é preferido que de 5 a 100% de todas as unidades polimerizadas são unidades da fórmula (VII), mais preferivelmente de 25 a 100% e em particular de 50 a 100%. As porcentagens são dadas em termos do número de unidades da fórmula (VII), em relação a todas as unidades polimerizadas. Dentro das definições e definições preferidas dadas para as variáveis da fórmula (VII), as unidades de repetição da fórmula (VII) podem ser as mesmas ou diferentes no polímero preferido de acordo com a invenção.
[0080] Particularmente preferidos como polissacarídeos que carregam uma cadeia lateral da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) são os polímeros da fórmula (VIIa).
Figure img0010
[0081] Nesta fórmula, R18, R19, R20, R21, R22 e t são definidos como para a fórmula (VII), incluindo as suas modalidades preferidas. s (indicando o número médio de unidades polimerizadas, determinadas por exemplo, por intermédio da cromatografia de permeação em gel (GPC)) é de 10 a 10.000, preferivelmente de 50 a 5.000.
[0082] Os polímeros exemplares com uma estrutura de polissacarídeo, que pode ser convenientemente modificada pelas cadeias laterais da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) são amido, amilose, amilopectina, glicogênio, celulose, dextrano, dextrina, ciclodextrina, quitina, quitosano, inulina, Pululano, Escleroglicano, curdlan, calose, laminarina, crisolaminarina, xilano, arabinoxilano, manana, fucoidan e galactomanana, proteoglicanos, poliglicuronan, poliglicuronan, ácido celourônico, ácido quitourônico, ácidos poliurônicos, pectinas, glicosaminoglicanos, heparina, sulfato de heparina, sulfatos de condroitina, sulfato de dermatana, ácido hialurônico ágar, alginato de sódio, ácido algínico, Goma Arábica, carragenina, fucoidan, fucogalactana, octa-acetato de quitobiose, undeca-acetato de quitotriose, malto-oligossacarídeos. Preferidos são quitosanos, hidroxietil amido, dextranos, dextrina, ciclodextrinas (α- ciclodextrina, β-ciclodextrina, Y—ciclodextrina e δ-ciclodextrina).
[0083] Várias estruturas dendriméricas que podem ser modificadas para conter uma pluralidade de grupos terminais da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) nas suas estruturas ramificadas são conhecidas na técnica e são descritas por exemplo, poliamidoaminas (PAMAM) (Tomalia et al. 1990, Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 29, 138-175) ou PAMAM fraturado (Tang et al, 1996, Bioconjug. Chem. 7, 703-714), poliaminas (Hawker et al. 1990, J. Am. Chem. Soc. 112, 7638-7647), poliamidas (polipeptídeos) (Sadler et al. 2002, J. Biotechnol. 90, 195-229), poli(éteres arílico) (Hawker et al. 1990, J. Am. Chem. Soc. 112, 7638-7647), poliésteres (Ihre et al. 1996, J. Am. Chem. Soc. 118, 6388-6395, Grinstaff et al. 2002, Chemistry 8, 2838-2846), carboidratos (Turnbull et al. 2002, J. Biotechnol. 90, 231-255), DNA (Nilsen et al. 1997, J. Theor. Biol. 187, 273-284, Li et al., 2004, Nat. Mater. 3, 38-42), lipídeos (Ewert et al. 2006, Bioconjug Chem. 17, 877-88), poli(éter imina) (Thankappan et al. 2011, Bioconjug Chem. 22, 115-9), triazina (Lim et al. 2012, Adv Drug Deliv Rev. 15, 826-35) e poligliceróis (Fischer et al. 2010, Bioconjug Chem. 21, 1744-52).
[0084] Será entendido que os oligômeros compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) como grupos terminais também abrangem oligômeros em que uma pluralidade de tais grupos são covalentemente ligados como grupos terminais a uma estrutura de núcleo polifuncional que fornece grupos funcionais adequados para a ligação de uma pluralidade de grupos da fórmula (II) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId). Estas estruturas de núcleo polifuncional incluem em particular ácidos carboxílicos ou poliaminas divalentes, trivalentes ou valência superior. Se necessário, os grupos funcionais das estruturas de núcleo polifuncionais podem ser ativadas ou reagidas com um grupo de ligação de modo a permitir a ligação de grupos de um grupo da fórmula (II) ou uma modalidade preferida do mesmo, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId). As estruturas de núcleo ramificadas exemplares que podem ser modificadas para carregar uma pluralidade de tais grupos são ilustradas pelas fórmulas (VIIIa- g) abaixo:
Figure img0011
Figure img0012
[0085] Como será conhecido por uma pessoa versada na técnica, os polímeros ou oligômeros compreendendo o grupo (II) ou suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIa) - (IId) como uma cadeia lateral e/ou um grupo terminal podem ser facilmente obtidos por uma variedade de vias sintéticas por intermédio da ligação de oligo(alquileno aminas) às estruturas poliméricas que compreendem ou foram modificadas para compreender grupos funcionais passíveis de ligação química. Tais grupos funcionais incluem -COOH, -CO-, -CHO, -SO3H, -PO4H, -NH-, -NH2, -OH, ou -SH. Como será entendido, também pode ser possível modificar monômeros adequados com os grupos da fórmula (II) antes da sua polimerização para fornecer os polímeros ou oligômeros de acordo com a invenção que contêm uma cadeia lateral e/ou grupo terminal da fórmula (II). Entretanto, a modificação de um polímero é geralmente preferida.
[0086] Por exemplo, polímeros precursores (isto é, os polímeros que fornecem a estrutura polimérica nos polímeros de acordo com a invenção) compreendendo grupos do ácido carboxílico são passíveis de ligação direta, onde necessário pela ativação por exemplo, usando carbodiimida e subsequente formação da ligação de amida com uma oligo(alquileno amina) da fórmula (pré-II) abaixo, em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R6 são definidas como para a fórmula (II) para fornecer as cadeias laterais e/ou grupos terminais da fórmula (II). H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a- NR5]n-R6 (pré-II),
[0087] Se necessário, o composto da fórmula (pré-II) pode ser protegido em um ou todos dos seus grupos amino secundários terminais e/ou internos usando um grupo de proteção convencional para um grupo amino tal como descrito por exemplo na WO2006/138380, preferivelmente t- butoxicarbonila (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), ou carbobenzilóxi (Cbz).
[0088] Tais reações são preferivelmente conduzidas na presença de um excesso de grupos amino reativos da oligo(alquileno amina) da fórmula (pré-II) em relação aos grupos do ácido carboxílico do polímero precursor se as reações de reticulação não são desejadas. Dependente da natureza do polímero precursor, a reação de ligação pode ser conduzida em solventes aquosos ou orgânicos. As condições de ligação adequadas são bem conhecidas na técnica de peptídeo e química de bioconjugado (Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2a Edição, Academic Press 2008). Como mencionado acima, as estruturas poliméricas adequadas incluem, mas não são limitadas aos poli(aminoácidos) compreendendo uma pluralidade de unidades de ácido glutâmico ou aspártico, tais como poli(ácido glutâmico) e poli(ácido aspártico), proteínas, polialcinos, poliaminas, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, ácido polimaleico, polissulfonato, poliestireno sulfonato, polifosfato, polissulfato de pentosano, poli(ácido vinil fosfórico), poli(butadieno-co-ácido maleico), poli(acrilato de etila-co-ácido acrílico), poli(etileno-co-ácido acrílico), poli(etileno-co-anidrido maleico), poli(metacrilato de metila-co-ácido metacrílico), poli(metacrilato de metila- co-ácido metacrílico), poli(ácido estirenossulfônico-co-ácido maleico), poli(cloreto de vinila-co-acetato de vinila-co-ácido maleico) carboidratos tais como heparina, sulfato de heparana, poli(ácido glicurônico), poli(ácido galacturônico), ácido hialurônico, poli(ácidos urônicos) no geral, ou dendrímeros terminados em carbóxi.
[0089] Para outras modalidades da presente invenção, o polímero compreendendo cadeias laterais e/ou grupos terminais da fórmula (II) pode ser obtido pela aminação redutiva de um polímero precursor. Carboidratos ou açúcares podem ser oxidados para aldeídos, seguido pela reação com um oligo(alquileno amina) levando a uma imina que pode ser reduzida por exemplo com ciano boroidreto de sódio para resultar em uma amina.
[0090] Ainda para uma outra modalidade da presente invenção, uma oligo(alquileno amina) pode ser derivatizada em uma primeira etapa para resultar em uma oligo(alquileno amina) terminada em carbóxi por exemplo, da fórmula (pré-II’) que é passível de ligação à hidroxila e grupos amino em um polímero precursor: HOOC-(CH2)u-L’-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b- NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (pré-II’), em que u é um número inteiro de 1 a 6, L’ é uma ligação ou - (CH)2- e as outras variáveis são definidas como para a fórmula (II). Se necessário, qualquer(quaisquer) grupo(s) amino secundário terminal(is) e/ou interno(s) no composto da fórmula (pré-II) ou (pré-II’) pode(m) ser protegido(s) usando um grupo de proteção convencional para um grupo amino tal como descrito por exemplo na WO2006/138380, preferivelmente t- butoxicarbonila (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), ou carbobenzilóxi (Cbz).
[0091] Para este propósito, a oligo(alquileno amina) pode ser reagida com um anidrido do ácido dicarboxílico, um ácido dicarboxílico ou um aldeído resultando na estrutura (pré-II’). Embora a estrutura (pré-II’) possa ser obtida sem fornecer as aminas na oligo(alquileno amina) (pré-II) com grupos de proteção ortogonais, pode ser preferível assim fazê-los. A estrutura (pré- II’) permite a modificação de por exemplo, poli(lisina), poli(ornitina) ou poli(vinilamina) pela ligação direta, resultando na formação da ligação de amida. Na conclusão da reação de ligação, qualquer um dos grupos de proteção pode ser removido por intermédio de métodos convencionais. O polímero resultante pode ser depois purificado por exemplo, pela diálise ou cromatografia de troca iônica ou exclusão de tamanho ou fase reversa ou interação hidrofóbica.
[0092] Os produtos intermediário e final podem ser purificados pela precipitação, diálise ou cromatografia de exclusão de tamanho depois dos grupos de proteção de amina terem sido removidos e antes da etapa de ligação final no caso de dendrímeros.
[0093] Polímeros ou oligômeros contendo uma pluralidade de unidades de repetição da fórmula (III) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIIa) - (IIId) podem ser polímeros lineares, ramificados, ou reticulados, ou polímeros dendríticos (dendrímeros). Preferivelmente, os polímeros ou oligômeros contendo uma pluralidade de unidades de repetição da fórmula (III) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIIa) - (IIId) contêm pelo menos 25%, mais preferivelmente pelo menos 40% de tais unidades de repetição, em termos do número de unidades da fórmula (III) em relação ao número total de unidades de repetição no polímero ou oligômero. É especialmente preferido que 50% ou mais de todas as unidades de repetição nos polímeros ou oligômeros contendo uma pluralidade de unidades de repetição da fórmula (III) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIIa) - (IIId), são tais unidades. As unidades de repetição remanescentes sendo fornecidas pelas moléculas que possibilita a ligação das unidades de repetição da fórmula (III) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIIa) - (IIId). Em unidades particulares derivadas de ácidos carboxílicos bivalentes, trivalentes ou valência superior.
[0094] Polímeros ou oligômeros contendo uma pluralidade de unidades de repetição da fórmula (III) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIIa) - (IIId) podem ser convenientemente obtidos usando um composto da fórmula (pré-III): H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a- NR5]n-R6 (pré-III), onde “pré” indica a fórmula (pré-III) sendo um precursor da fórmula (III) e em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R5 são definidas como para a fórmula (III) e R6 é definido como para a fórmula (II), incluindo as suas modalidades preferidas, ou preferivelmente usando um composto das fórmulas (pré-IIIa) - (pré-IIId), em que as variáveis são definidos como na fórmula (IIIa), (IIIb) (IIIc) ou (IIId), respectivamente: H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a- NR5]n-R6 (pré-IIIa), H-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5- R6 (pré-IIIb), H-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-R6 (pré-IIIc), H-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H (pré-IIId),
[0095] Estes compostos que carregam grupos amina terminais podem ser ligados para formar polímeros lineares, ramificados, reticulados ou dendríticos usando reações de ligação convencionais. Os compostos adequados que podem ser usados como reagentes em tais reações de ligação incluem ácidos carboxílicos bivalentes, trivalentes ou de valência superior. Os compostos exemplares que são comercialmente disponíveis e que podem ser reagidos com os compostos ligadores da fórmula (pré-III), (pré-IIIa), (pré- IIIb), (pré-IIIc) e (pré-IIId), respectivamente, são ilustradas pelas fórmulas (VIIIa-g) abaixo:
Figure img0013
Figure img0014
[0096] Embora a reação direta de ácidos carboxílicos polivalentes com diaminas possa ser convenientemente realizada, será entendido que os compostos ligadores não são limitados a aqueles que fornecem grupos do ácido carboxílico (ou suas formas ativadas). Por exemplo, o composto da fórmula (VIIIg) pode ser reagido com um composto da fórmula (pré-III) depois que uma diamida do composto da fórmula (pré-III) foi formada com um ácido dicarboxílico, tal como ácido succínico.
[0097] Também, uma oligo(alquileno amina) pode ser derivatizada em uma primeira etapa para resultar em uma oligo(alquileno amina) terminada em carbóxi da fórmula (pré-III’), por exemplo, como descrito acima para a preparação de compostos da fórmula (pré-II’): HOOC-(CH2)u-L”-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b- NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n- R6 (pré-III’), em que u é um número inteiro de 1 a 6, L” é uma ligação ou - (CH)2- e as outras variáveis são definidas como para a fórmula (III) e R6 é definido como para a fórmula (II). Se necessário, qualquer(quaisquer) grupo(s) amino secundário interno(s) no composto da fórmula (pré-III’) pode(m) ser protegido(s) usando um grupo de proteção convencional para um grupo amino tal como descrito por exemplo na WO2006/138380, preferivelmente t-butoxicarbonila (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), ou carbobenzilóxi (Cbz). Se o grupo amino terminal remanescente -NR5R6 está presente em uma forma não protegida/em uma forma que permite a formação da amida com um grupo do ácido carboxílico, compostos da fórmula (pré-III’) podem ser polimerizados ou oligomerizados para fornecer um oligômero ou polímero que compreende uma pluralidade de grupos de oligo(alquileno amina) da fórmula (III), ou modalidades preferidas incluindo fórmulas (IIIa) - (IIId) como unidades de repetição. Tais polímeros podem ser lineares ou ramificados.
[0098] Por exemplo, a estrutura (pré-III’) pode ser usada para formar estruturas ramificadas pela polimerização aleatória ou em uma maneira definida. A copolimerização pode ser ativada in situ em uma mistura de oligo(alquileno amina), opcionalmente com grupos amino internos protegidos e ácido policarboxílico (VIIIa-VIIIg) em solvente aquoso ou orgânico pela ativação da carbodiimida.
[0099] Dendrímeros contendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) ou suas modalidades preferidas, incluindo fórmulas (IIIa) - (IIId) como unidades de repetição também podem ser preparadas, por exemplo, usando moléculas de ligação polivalente. Um dendrímero é uma molécula polimérica composta de monômeros múltiplos perfeitamente ramificados que emanam radialmente de um núcleo central, reminiscente de uma árvore, donde os dendrímeros derivam seu nome (Grego, dendra). Quando o núcleo de um dendrímero é removido, vários fragmentos idênticos chamados dendrons permanecem, o número de dendrons dependendo da multiplicidade do núcleo central (2, 3, 4 ou mais). Um dendron pode ser dividido em três regiões diferentes: o núcleo, o interior (ou ramificações) e a periferia (ou grupos finais ou terminais). O número de pontos de ramificação encontrados na movimentação para fora do núcleo do dendron para a sua periferia define a sua geração (G-1, G-2, G-3); dendrímeros de gerações superiores são maiores, mais ramificados e têm mais grupos finais na sua periferia do que os dendrímeros de gerações inferiores.
[00100] A síntese pode ser divergente, que resulta em um crescimento do tipo exponencial, ou convergente, caso em que os dendrons são desenvolvidos separadamente e ligados ao núcleo na etapa final. Os dendrímeros são preparados em uma maneira escalonada, similar aos métodos usados para a síntese de polipeptídeo e oligonucleotídeo de fase sólida e, portanto, para os produtos são teoricamente monodispersos no tamanho, como oposto às sínteses de polímero tradicionais onde o crescimento de cadeia é estatístico e produtos polidispersos são obtidos. Um produto monodisperso é extremamente desejável não apenas para a reprodutibilidade sintética, mas também para reduzir a variabilidade experimental e terapêutica. Na prática, um produto monodisperso pode ser facilmente obtido para dendrímeros de baixa geração (até G-3), mas algumas vezes em gerações superiores a incapacidade para purificar dendrímeros perfeitos dos dendrímeros com defeitos menores que são estruturalmente muito similares resulta em um desvio de monodispersividade absoluta, embora tipicamente um leve.
[00101] Os dendrímeros preferidos como polímeros de acordo com a presente invenção que compreende uma pluralidade de oligo(grupos alquileno) da fórmula (III) ou as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IIIa) - (IIId), têm várias gerações variando de G1 a G10, mais preferivelmente de G2 a G8 e em particular de G3 a G6. O peso molecular destes dendrímeros (como pode ser calculado com base nos reagentes combinados nas etapas de reação) preferivelmente varia de 1.500 a 1.000.000, mais preferivelmente de 3.000 a 230.000, Em particular de 6.000 a 60.000 e mais preferivelmente de 15.000 a 30.000.
[00102] Para a produção de estruturas definidas de dendrímeros de poli(amido amina) (protegida) (pré-III) e/ou (pré-III’) pode ser usada para a geração escalonada de um núcleo ramificado como já descrito na literatura (por exemplo, Lee et al. 2005, Nat Biotechnol 23, 1517 - 1526). Como moléculas iniciadoras uma oligo(alquil amina) (por exemplo, pré-III) ativada por um ácido dicarboxílico, anidrido ou ácido acrílico ou um ácido policarboxílico (por exemplo, VIIIa - VIIIg) podem ser usados. Este núcleo é usado para reagir escalonadamente o mesmo com uma oligo(alquil amina) de estrutura (pré-III) seguido pela purificação e ativação dos grupos de terminal amino por exemplo, pelo ácido acrílico. Depois da purificação este núcleo pode ser usado para adicionar uma camada adicional de oligo(alquileno amina)s. As condições de reação para a obtenção de dendrímeros foram descritas em detalhes na literatura (ver por exemplo Lee et al., loc. cit. e as referências aí compreendidas).
[00103] De acordo com outras modalidades, as oligo(alquileno amina)s terminadas em ambos os lados com um grupo carbóxi podem ser protegidas em um lado, e/ou as aminas internas podem ser protegidas, se necessário e podem ser copolimerizadas com uma diamina ou estrutura dendrítica iniciadora tendo grupos amina nos terminais, ou com a própria oligo(alquileno amina).
[00104] Os produtos intermediários e finais podem ser purificados pela precipitação, diálise ou cromatografia de exclusão de tamanho depois os grupos de proteção de amina foram removidos e antes da etapa de ligação final no caso de dendrímeros.
[00105] Já uma outra modalidade, oligo(alquileno amina)s tendo um grupo terminal carbóxi (ou uma forma do mesmo adequadamente protegida ou ativada) e um grupo de terminal amino (ou uma forma adequadamente protegida do mesmo), por exemplo, oligo(alquileno aminas) da fórmula (pré- III’) podem ser usados para a geração escalonada de uma estrutura peptídica linear ou ramificada totalmente definida, similarmente como descrito na WO 2011/154331 e em (Schaffert et al. 2011, Angew Chem Int Ed Engl 50(38), 8986-9). Uma reação escalonada pode ser realizada de acordo com os princípios da química de peptídeo e pode ser conduzida em um sintetizador de peptídeo automatizado. Como conhecido por uma pessoa versada na técnica da síntese de peptídeo, di-aminoácidos tais como lisina ou ornitina, podem ser usados para formar estruturas ramificadas. Consequentemente, uma grande variedade de homopolímeros lineares e ramificados, mas também de heteropolímeros compreendendo oligo(alquileno amina)s diferentes da fórmula (I) nas posições desejadas do polímero, pode ser fornecida. Além disso, aminoácidos canônicos podem ser incorporados em tais estruturas definidas em qualquer posição.
[00106] Para a preparação dos lipídeos da fórmula (IV) e as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IVa), (IVb) e (IVc), métodos podem ser utilizados que são análogos a aqueles descritos na US 2010/0331234 A1, US 8.450.298; Love et al. 2010, PNAS 107, 1864-1869; WO2006/138380; Akinc et al. 2008, Nat Biotechnol 26, 561-569.
[00107] Por exemplo, lipídeos da fórmula (IV) e as suas modalidades preferidas, incluindo as fórmulas (IVa), (IVb) e (IVc) podem ser derivadas reagindo-se R7-epóxido ou R7-O-(C=O)-CH=CH2 ou R7-NH-(C=O)-CH=CH2 ou R7-(C=O)-H, com um oligo(alquileno amina) da fórmula (pré-IV) H-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a- NR5]n-R6 (pré-IV), em que as variáveis a, b, p, m, n são definidas como na fórmula (IV) e R2 a R6 são independentemente um do outro hidrogênio ou um grupo de proteção para um grupo amino e R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C. Preferivelmente, R7 é alquila ou alquenila C8-C16, mais preferivelmente alquila ou alquenila C8C12 e mais preferido alquila ou alquenila C10-C12. Vantajosamente, numerosos compostos alifáticos terminados em uma extremidade com um epóxido, um acrilato, uma acrilamida de um aldeído são comercialmente disponíveis.
[00108] Preferivelmente, o lipídeo da fórmula (IV) é preparado do oligo(alquileno amina) (pré-IV’) H-NH-{CH2-(CH2)a-NH-[CH2-(CH2)b-NH]p}m-[CH2-(CH2)a- NH]n-H (pré-IV’);
[00109] Mais preferivelmente, os precursores da fórmula (pré-IV) têm quatro ou mais grupos amino. O mais preferivelmente, o lipídeo da fórmula (IV) é preparado a partir do oligo(alquileno amina) (pré-IV”) H-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H (pré-IV”).
[00110] A reação pode ser realizada com ou sem solvente em temperatura elevada entre 50°C e 90°C. Os solventes adequados são por exemplo CH2Cl2, CH2Cl3, metanol, etanol, THF, hexanos, tolueno, benzeno etc.
[00111] É conhecido por uma pessoa versada na técnica que nitrogênios em um oligo(alquileno amina) da fórmula (pré-IV’) H-NH-{CH2-(CH2)a-NH-[CH2-(CH2)b-NH]p}m-[CH2-(CH2)a- NH]n-H (pré-IV’), podem ser fornecidos com grupos de proteção ortogonais tal como descrito por exemplo na WO2006/138380. Um grupo de proteção neste contexto é adequado para bloquear temporariamente um ou vários nitrogênios em um composto da fórmula (pré-IV’) tal que uma reação possa ser realizada seletivamente em outros nitrogênios não protegidos dentro da mesma molécula. Depois da reação, o grupo de proteção é removido por uma reação química que não afeta outros resíduos ligados aos átomos de nitrogênio dentro da mesma molécula. Os grupos de proteção ortogonais são grupos de proteção diferentes que podem ser removidos seletivamente pelas reações químicas que afetam especificamente um tipo de grupo de proteção dentro de uma dada molécula. Por exemplo, como descrito nos Exemplos, os grupos de amino terminal primários em um oligo(alquileno amina) da fórmula (pré-IV’) pode ser seletivamente protegido com o grupo de proteção de 9- fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc) enquanto que as aminas secundárias internas podem ser protegidas com o grupo de proteção de t-butoxicarbonila (Boc). O grupo Fmoc pode ser removido seletivamente por uma base, o grupo de proteção Boc por um ácido. Os intermediários protegidos e parcialmente protegidos podem ser separados pela cromatografia. Assim, em virtude de uma remoção posicional e/ou seletiva definida de grupos de proteção ortogonais é possível, por exemplo, reagir seletivamente todo ou partes dos grupos amino secundários internos ou todo ou partes das duas valências dos grupos amino primários terminais de um oligo(alquileno amina) da fórmula (pré-IV’) com cadeias alifáticas terminadas em uma extremidade com um epóxido ou um acrilato ou uma acrilamida. Em virtude do mesmo princípio é possível ligar mais do que uma única espécie de R7-epóxido ou R7-O-(CO)- CH=CH2 ou R7-NH-(CO)-CH=CH2 ou R7-(CO)-H a uma dada oligo(alquileno amina) da fórmula (pré-IV’) com “espécies” referindo-se a tipos diferentes de resíduos R7 em termos de alquila ou alquenila e em termos de comprimento de cadeia alifática e ao epóxido, acrilato, acrilamida ou aldeído terminais. O grau de derivatização da oligo(alquileno amina) da fórmula (pré-IV’) em tais reações pode ser controlado pela estequiometria dos reagentes tais como descrito no estado anterior da técnica. Depois da remoção dos grupos de proteção, as valências remanescentes de átomos de nitrogênio podem ser usados para ligar um grupo guanidínio (-C(NH)-NH2), uma cadeia de poli(etileno glicol) ou um ligante de receptor. Lipídeos da fórmula (IV) podem ser purificados pela precipitação, extração ou cromatografia. Com base na opção que os lipídeos da fórmula (IV) podem ser preparados pelas reações escalonadas controladas com a ajuda de grupos de proteção e que o grau de derivatização da oligo(alquileno amina) da fórmula (pré-IV’) pode ser controlado pela estequiometria dos reagentes, o lipídeo da presente invenção pode conter aminas primárias, secundárias, terciárias e/ou quaternárias e sais das mesmas. Em consequência, também os valores pKa dos lipídeos podem ser modulados pelo planejamento racional do grau de derivatização tal que um ou mais dos átomos de nitrogênio na fórmula (IV) possam ser protonados para fornecer um lipídeo catiônico da fórmula (IV) adequado para ligar e compactar e proteger o RNA. Além disso, os valores de pKa podem ser modulados tal que um ou mais dos átomos de nitrogênio na fórmula (IV) podem ter capacidade de tamponamento no pH ácido e assim pode exercer um efeito de esponja de próton na captação endocitótica dentro das células. Preferivelmente, os valores de pKa dos lipídeos da fórmula (IV) estão entre 3,0 e 9,0, mais preferivelmente pelo menos um valor de pKa está entre 5,0 e 8,0.
[00112] O número máximo de cadeias laterais alifáticas que podem ser ligadas a uma oligo(alquileno amina) da fórmula (pré-IV’) de modo a se obter um lipídeo da fórmula (IV) é (p + 1) x m + n + 3, o número mínimo é 1, onde p, m e n são definidos como na fórmula (IV). Preferivelmente, o número de cadeias laterais alifáticas é pelo menos 2 e no máximo (p + 1) x m + n + 2 se nenhum dos resíduos R1 a R6 for outro que não hidrogênio ou -CH2-CH(OH)- R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-C(O)-O-R7, -CH2-CH2-C(O)-NH-R7 ou - CH2-R7 e preferivelmente o número de cadeias laterais alifáticas é no máximo (p + 1) x m + n + 1 se um dos resíduos R1 a R6 é um grupo de proteção para um grupo amino ou -C(NH)-NH2 ou uma cadeia de poli(etileno glicol) ou um ligante de receptor.
Ácido Nucleico
[00113] A composição da presente invenção compreende um ácido nucleico, preferivelmente RNA, ainda mais preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA.
[00114] O termo “ácido nucleico” abrange todas as formas de tipos que ocorrem naturalmente de ácidos nucleicos assim como ácidos nucleicos química e/ou enzimaticamente sintetizados e também abrange análogos de ácido nucleico e derivados de ácido nucleico tais como por exemplo, ácidos nucleicos trancados (LNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), oligonucleosídeo tiofosfatos e fosfotriésteres, morfolina oligonucleotídeos, oligonucleotídeo catiônicos (US6017700 A, WO/2007/069092), ribo- oligonucleotídeos ou fosforotioatos substituídos. Além disso, o termo “ácido nucleico” também se refere a qualquer molécula que compreende nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo. Não há limitações com respeito à sequência ou tamanho de um ácido nucleico compreendido na composição da presente invenção. O ácido nucleico é predominantemente definido pelo efeito biológico que deva ser obtido no alvo biológico ao qual a composição da presente invenção é liberada. Por exemplo, no caso de uma aplicação na terapia de gene ou ácido nucleico, o ácido nucleico ou sequência de ácido nucleico pode ser definida pelo gene ou fragmento de gene que deva ser expressado ou pela substituição ou reparo pretendidos de um gene defeituoso ou qualquer sequência alvo de gene ou pela sequência alvo de um gene a ser inibido, silenciado ou infrarregulado.
[00115] Preferivelmente, o termo “ácido nucleico” se refere a oligonucleotídeos ou polinucleotídeos, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Como respeito ao RNA, em princípio qualquer tipo de RNA pode ser utilizado no contexto da presente invenção. Em uma modalidade preferida o RNA é um RNA de filamento único. O termo “RNA de filamento único” significa uma cadeia única consecutiva de ribonucleotídeos em contraste com as moléculas de RNA em que duas ou mais cadeias separadas formam uma molécula de filamento duplo devido à hibridização das cadeias separadas. O termo “RNA de filamento único” não exclui que a molécula de filamento único se forma nas estruturas de filamento duplo por si só tais como alças, estruturas secundárias ou terciárias.
[00116] O termo “RNA” abrange RNA que codifica uma sequência de aminoácido assim como RNA que não codifica uma sequência de aminoácido. Foi sugerido que mais do que 80% do genoma contém elementos de DNA funcionais que não codificam proteínas. Estas sequências não codificadoras incluem elementos de DNA reguladores (sítios de ligação para fatores de transcrição, reguladores e correguladores etc.) e sequências que codificam transcritos que nunca são traduzidos em proteínas. Estes transcritos, que são codificados pelo genoma e transcrito no RNA, mas não se tornam traduzidos em proteínas, são chamados de RNAs não codificadores (ncRNAs). Assim, em uma modalidade o RNA é um RNA não codificador. Preferivelmente, o RNA não codificador é uma molécula de filamento único. Os estudos demonstram que ncRNAs são desempenhadores críticos na regulagem de gene, manutenção da integridade genômica, diferenciação e desenvolvimento celulares e eles estão desregulados em várias doenças humanas. Existem tipos diferentes de ncRNAs: ncRNAs curtos (20 a 50 nt), médios (50 a 200 nt) e longos (>200 nt). O ncRNA curto inclui microRNA (miRNA), RNA interferente pequeno (siRNA), RNA que interage com piwi (piRNA) e RNA iniciador de transcrição (tiRNA). Os exemplos de ncRNAs médios são RNAs nucleares pequenos (snRNAs), RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs), RNAs de transferência (tRNAs), RNAs associados com o sítio de início de transcrição (TSSaRNAs), RNAs pequenos associados com promotor (PASRs) e transcritos a montante do promotor (PROMPTs). RNAs não codificadores grandes (lncRNA) incluem RNA não codificador intergênico longo (lincRNA), lncRNA de antissentido, lncRNA intrônico, RNAs transcritos ultraconservados (T-UCRs) e outros (Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. 26 de março de 2014. doi: 10,1002/cmdc,201300534). Dos RNAs não codificadores mencionados acima apenas o siRNA é de filamento duplo. Assim, visto que em uma modalidade preferida o RNA não codificador é de filamento único, é preferido que o RNA não codificador não seja siRNA. Em uma outra modalidade o RNA é um RNA codificador, isto é, um RNA que codifica uma sequência de aminoácido. Tais moléculas de RNA também são aludidas como mRNA (RNA mensageiro) e são moléculas de RNA de filamento único. Os ácidos nucleicos podem ser fabricados pela metodologia química e enzimática sintética conhecida por uma pessoa de habilidade comum na técnica, ou pelo uso da tecnologia recombinante, ou pode ser isolado de fontes naturais, ou por uma combinação das mesmas. O oligo- ou polinucleotídeos podem opcionalmente compreender nucleotídeos não naturais e podem ser de filamento único ou duplo ou triplo. “Ácido nucleico” também se refere aos oligo- ou polinucleotídeos de sentido e de antissentido, isto é, uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotídeo específica em um DNA e/ou RNA.
[00117] Preferivelmente, o termo ácido nucleico se refere ao mRNA e mais preferivelmente ao mRNA modificado.
[00118] Os RNAs mensageiros (mRNA) são polímeros que são formados de blocos de construção de nucleosídeo fosfato principalmente com adenosina, citidina, uridina e guanosina como nucleosídeos, que como carregadores intermediários levam a informação genética do DNA para o núcleo da célula dentro do citoplasma, onde a mesma é traduzida em proteínas. Eles são assim adequados como alternativas para a expressão de gene.
[00119] No contexto da presente invenção, mRNA deve ser entendido significar qualquer molécula de polirribonucleotídeo que, se a mesma entra na célula, é adequada para a expressão de uma proteína ou fragmento da mesma ou é traduzível para uma proteína ou fragmento da mesma. O termo “proteína” aqui abrange qualquer tipo de sequência de aminoácido, isto é, cadeias de dois ou mais aminoácidos que são cada um ligados por intermédio de ligações de peptídeo e também inclui peptídeos e proteínas de fusão.
[00120] O mRNA contém uma sequência de ribonucleotídeo que codifica uma proteína ou fragmento da mesma cuja função na célula ou na vicinidade da célula é necessária ou benéfica, por exemplo, uma proteína a falta ou forma defeituosa da qual é um deflagrador para uma doença ou uma enfermidade, o fornecimento da qual pode moderar ou prevenir uma doença ou uma enfermidade, ou uma proteína que pode promover um processo que seja benéfico para o corpo, em uma célula ou sua vicinidade. O mRNA pode conter a sequência para a proteína completa ou uma variante funcional da mesma. Além disso, a sequência de ribonucleotídeo pode codificar uma proteína que atua como um fator, indutor, regulador, estimulador ou enzima, ou um fragmento funcional do mesmo, onde esta proteína é uma cuja função é necessária de modo a remediar um distúrbio. Em particular um distúrbio metabólico ou de modo a iniciar processos in vivo tais como a formação de novos vasos sanguíneos, tecidos, etc. Aqui, variante funcional é entendido significar um fragmento que na célula pode empreender a função da proteína cuja função na célula é necessária ou a falta ou forma defeituosa da qual é patogênica. Além disso, o mRNA também pode ter outras regiões funcionais e/ou regiões não codificadoras 3’ ou 5’. As regiões não codificadoras 3’ e/ou 5’ podem ser as regiões que flanqueiam naturalmente a sequência que codifica a proteína ou sequências artificiais que contribuem para a estabilização do RNA. Aqueles versados na técnica podem determinar as sequências adequadas para isto em cada caso pelos experimentos de rotina.
[00121] Em uma modalidade preferida, o mRNA contém um capuz m7GpppG, um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) e/ou uma cauda poliA na extremidade 3’. Em particular de modo a melhorar a tradução. O mRNA pode ter regiões adicionais promotoras da tradução.
[00122] Em uma modalidade preferida o mRNA é um mRNA que contém uma combinação de nucleotídeos modificados e não modificados. Preferivelmente, o mesmo é um mRNA contendo uma combinação de nucleotídeos modificados e não modificados como descrito na WO2011/012316. O mRNA descrito neste ponto é relatado mostrar uma estabilidade aumentada e imunogenicidade diminuída. Em uma modalidade preferida, em um tal mRNA modificado de 5 a 50% dos nucleotídeos de citidina e de 5 a 50% dos nucleotídeos de uridina são modificados. Os nucleotídeos contendo adenosina e guanosina podem ser não modificados. Os nucleotídeos de adenosina e guanosina podem ser não modificados ou parcialmente modificados e eles estão preferivelmente presentes na forma não modificada. Preferivelmente de 10 a 35% dos nucleotídeos de citidina e uridina são modificados e de modo particularmente preferível o teor dos nucleotídeos de citidina modificados reside em uma faixa de 7,5 a 25% e o teor dos nucleotídeos de uridina modificados em uma faixa de 7,5 a 25%. Foi descoberto que de fato um teor relativamente baixo, por exemplo, de apenas 10% de cada um, de nucleotídeos de citidina e uridina modificados podem alcançar as propriedades desejadas. É particularmente preferido que os nucleotídeos de citidina modificados sejam resíduos de 5-metilcitidina e os nucleotídeos de uridina modificados são resíduos de 2-tiouridina. Mais preferivelmente, o teor de nucleotídeos de citidina modificados e o teor dos nucleotídeos de uridina modificados é de 25%, respectivamente.
[00123] Em uma outra modalidade preferida, o mRNA pode ser combinado com sítios de ligação alvos, sequências de alvejamento e/ou com sítios de ligação de micro-RNA, de modo a permitir a atividade do mRNA desejado apenas nas células relevante. Em uma outra modalidade preferida, o RNA pode ser combinado com micro-RNAs ou shRNAs a jusante da cauda 3’ poliA.
[00124] Além disso, o termo “ácido(s) nucleico(s)” pode se referir ao DNA ou RNA ou seus híbridos ou qualquer modificação dos mesmos que seja conhecida no estado da técnica (ver, por exemplo, a US 8278036, WO 2013/052523, WO 2011/012316, US 5525711, US 4711955, US 5792608 ou EP 302175, (Lorenz et al. 2004, Bioorg Med Chem Lett, 14, 4975-4977; Soutschek et al. 2004, Nature, 432, 173-178) para exemplos de modificações). Tal(is) molécula(s) de ácido nucleico é/são de filamento único ou duplo, linear(es) ou circular(es), natural(is) ou sintética(s) e sem qualquer limitação de tamanho. Por exemplo, a(s) molécula(s) de ácido nucleico pode(m) ser DNA genômico, cDNA, mRNA, RNA de antissentido, ribozima, ou RNAs interferentes pequenos (siRNAs), micro RNAs, antagomirs, ou RNAs de grampo de cabelo pequenos (shRNAs), tRNAs ou RNAs de filamento duplo longos ou uma construção de DNA que codifica tais RNAs ou quimeraplastos (Colestrauss et al. 1996, Science, 273, 1386-1389), ou aptâmeros, repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente espaçadas (“CRISPR” para a clivagem de DNA específica de sítio guiada pelo RNA) (Cong et al. 2013, Science, 339, 819-823), ou RNA e DNA. A(s) dita(s) molécula(s) de ácido nucleico pode(m) estar na forma de plasmídeos, cosmídeos, cromossomas artificiais, DNA ou RNA virais, DNA bacteriófago, RNA codificador e não codificador de filamento único (mRNA) ou de filamento duplo e oligonucleotídeo(s), em que qualquer uma das modificações do estado da técnica na cadeia principal de açúcar e/ou nas bases como descrito acima e modificações em 3’ ou 5’ são incluídas. Em uma modalidade particularmente preferida o ácido nucleico é RNA, mais preferivelmente mRNA ou siRNA.
[00125] O(s) ácido(s) nucleico(s) pode(m) conter uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que deva ser expressado em uma célula alvo. Os métodos que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para construir moléculas de ácido nucleico recombinante; ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1989).
[00126] Em uma modalidade preferida, o dito ácido nucleico é um ácido nucleico terapêutica ou farmaceuticamente ativo incluindo todos os tipos e modificações de ácido nucleico listados acima e aqueles conhecidos por uma pessoa versada na técnica que podem ter um efeito terapêutico ou preventivo. No geral, os efeitos terapêuticos ou preventivos podem ser obtidos pela interação do ácido nucleico com moléculas e organelas celulares. Tal interação sozinha por exemplo pode ativar o sistema imune inato, como é o caso para certos oligonucleotídeos CpG e sequências planejadas para interagir especificamente com receptores semelhantes a toll e outros extra- ou intracelulares. Além disso, a absorção ou introdução de ácidos nucleicos nas células podem ser pretendidas para levar à expressão de sequências de nucleotídeo tais como genes compreendidos no ácido nucleico, podem ser planejadas para a infrarregulagem, silenciamento ou inativação da expressão de gene endógena como uma consequência da presença intracelular de um ácido nucleico exógeno introduzido, ou podem ser intencionadas para a modificação de sequências de ácido nucleico endógeno tal como reparo, excisão, inserção ou troca de bases selecionadas ou de trechos inteiros de sequências de ácido nucleico endógeno, ou podem ser intencionadas para a interferência com virtualmente qualquer processo celular como uma consequência da presença e interação intracelular de um ácido nucleico exógeno introduzido. A sobre-expressão de ácidos nucleicos exógenos introduzidos pode ser intencionada para compensar ou complementar a expressão de gene endógena, Em particular, em casos onde um gene endógeno é defeituoso ou silencioso, levando a nenhum produto, produto insuficiente ou um defeituoso ou um disfuncional de expressão de gene tal como é o caso com muitas doenças metabólicas e hereditárias como fibrose cística, hemofilia ou distrofia muscular para mencionar umas poucas. A sobre-expressão de ácidos nucleicos exógenos introduzida também pode ser intencionada a ter o produto da expressão interagindo ou interferindo com qualquer processo celular endógeno tal como a regulagem da expressão de gene, transdução de sinal e outros processos celulares. A superexpressão de ácidos nucleicos exógenos introduzidos também pode ser intencionada a dar origem a uma resposta imune no contexto do organismo no qual uma célula transfectada ou transduzida reside ou é feita residir. Os exemplos são a modificação genética de células que apresentam antígeno tais como células dendríticas de modo a ter as mesmas presentes em um antígeno para os propósitos de vacinação. Outros exemplos são a superexpressão de citocinas em tumores de modo a evocar uma resposta imune específica de tumor. Além disso, a superexpressão de ácidos nucleicos exógenos introduzidos também pode ser intencionada para gerar células de modo transitório geneticamente modificada in vivo ou ex vivo para as terapias celulares tais como células T modificadas ou precursoras ou células tronco ou outras para a medicina regenerativa.
[00127] A infrarregulagem, silenciamento ou inativação da expressão de gene endógena para propósitos terapêuticos por exemplo podem ser obtidos pela interferência de RNA (RNAi), com ribozimas, oligonucleotídeos de antissentido, tRNAs, RNA de filamento duplo longo onde tal infrarregulagem pode ser específica ou não específica de sequência e também pode levar à morte celular como é o caso quando RNAs de filamento duplo longos são introduzidos dentro das células. A infrarregulagem, silenciamento ou inativação da expressão de gene endógena ou pré-existente podem ser úteis no tratamento de doenças adquiridas, hereditárias ou espontaneamente incurrentes incluindo infecções virais e câncer. Também pode ser considerado que a introdução de ácidos nucleicos dentro das células pode ser praticada como uma medida preventiva de modo a prevenir, por exemplo, a infecção viral ou neoplasias. A infrarregulagem, silenciamento ou inativação da expressão de gene endógeno podem ser exercidas ao nível transcricional e ao nível traducional. Mecanismos múltiplos são conhecidos pela pessoa versada na técnica e incluem por exemplo modificações epigenéticas, mudanças na estrutura da cromatina, ligação seletiva de fatores de transcrição pelo ácido nucleico introduzido, hibridização do ácido nucleico introduzido nas sequências complementares no DNA genômico, mRNA ou outras espécies de RNA pelo emparelhamento de base incluindo mecanismos de emparelhamento de base não convencionais tais como a formação de hélice tripla. Similarmente, o reparo de gene, mudanças de base ou sequência podem ser obtidos ao nível genômico e ao nível de mRNA incluindo salto de éxon. As mudanças de base ou sequência por exemplo podem ser obtidas pela clivagem de DNA específica de sítio guiada por RNA, pelos mecanismos de corte e pasta explorando a transjunção, ribozimas de transjunção, quimeraplastos, transjunção de RNA mediada por espliceossoma, ou pela exploração do grupo II ou íntrons realvejados, ou pela exploração da mutagênese insercional mediada pelos vírus ou explorando a inserção genômica alvejada usando sistemas de integrase procariótica, eucariótica ou viral. Visto que os ácidos nucleicos são os transportadores dos planos de construção de sistemas vivos e visto que eles participam em muitos processos celulares em uma maneira direta e indireta, na teoria qualquer processo celular pode ser influenciado pela introdução de ácidos nucleicos dentro das células a partir do exterior. Notavelmente, esta introdução pode ser realizada diretamente in vivo e ex vivo na cultura de célula ou órgão seguido pelo transplante de órgãos ou células assim modificados em um recipiente. Os complexos da presente invenção com ácidos nucleicos como agentes ativos podem ser úteis para todos os propósitos descritos acima.
Composição
[00128] Como descrito acima, a composição de acordo com a invenção compreende o ácido nucleico e o componente compreendendo um oligo(alquileno amina) cujo componente é selecionado de: a) um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (II) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal:
Figure img0015
em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R6 são definidas como acima, incluindo as formas de realização preferidas, e, em particular, os grupos de fórmulas preferidos (IIa) - (IId); e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (II) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (II); b) um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição:
Figure img0016
em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R5 são definidas como acima, incluindo as formas de realização preferidas, e, em particular, os grupos de fórmulas preferidos de (IIIa) a (IIId); e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (III) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (III); ou c) um lipoide tendo a estrutura da fórmula (IV):
Figure img0017
em que as variáveis a, b, p, m, n e R1 a R6 são definidas como acima, incluindo as formas de realização preferidas, e, em particular, as estruturas preferidas de fórmulas de (IVa) a (IVc); e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IV) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (IV).
[00129] A invenção também abrange uma composição que consiste do RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, e o componente compreendendo um oligo(alquileno amina) selecionado dos componentes de a) a c) como aqui definido, incluindo as formas de realização preferidas destes. Contudo, a composição também pode compreender outros componentes, por exemplo, componentes para a formulação lipídica e/ou componentes que exercem uma função efetora durante o RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, liberado à e em uma célula.
[00130] Será entendido que as composições de acordo com a invenção geralmente fornecem uma associação de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, com um oligômero, polímero ou lipoide e outros componentes opcionais que são associados em uma entidade finita, estável o suficiente para manter a associação de uma proporção significante dos ditos componentes até atingir um alvo biológico ou as adjacências de um alvo biológico durante uma aplicação, por exemplo, durante uma via desejada de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como liberação de mRNA.
[00131] Devido à presença dos grupos amino protonáveis nos oligômeros, polímeros ou lipoides de acordo com a invenção, estes oligômeros, polímeros ou lipoides podem compreender cargas catiônicas nos grupos da fórmula (II) ou (III) ou na estrutura da fórmula (IV), tal que os oligômeros, polímeros ou lipoides formem cátions, tipicamente oligo- ou policátions contendo uma pluralidade de porções catiônicas, na presença de prótons, por exemplo, em soluções de água ou aquosas, ou na presença de um ácido doador de prótons. Deste modo, preferivelmente, a composição de acordo com a invenção contém ou consiste de um complexo de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, e um oligômero, polímero ou lipoide catiônico de acordo com a invenção. Será entendido que um oligômero, polímero ou lipoide catiônico e um ácido nucleico aniônico são geralmente associados por intermédio da interação eletroestática em tal complexo. Contudo, dependendo da estrutura específica do oligômero, polímero ou lipoide e do RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, outras interações atrativas também podem participar na estabilização do complexo, incluindo ligações de hidrogênio e ligações covalentes.
[00132] Nas composições da presente invenção, o oligômero, polímero ou lipoide e RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, podem estar contidos, por exemplo, em uma razão de oligômero, polímero ou lipoide em peso/ácido nucleico em peso (p/p) de 0,25/1 a 50/1, preferivelmente de 0,5/1 a 30/1, mais more preferivelmente de 1/1 a 20/1.
[00133] Mais preferivelmente, nos casos em que a composição contém um complexo do RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, e um oligômero, polímero ou lipoide catiônico de acordo com a invenção, as razões relativas do oligômero, polímero ou lipoide e RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, nas composições da invenção podem ser selecionadas considerando o grau de neutralização de carga mútua. No RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, a liberação com complexos do RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, com um oligômero, polímero ou lipoide catiônico, em geral, quantidades do oligômero, polímero ou lipoide catiônico são misturadas com uma dada quantidade de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, que leva a pelo menos uma neutralização de carga das cargas negativas de RNA, preferivelmente a uma supercompensação das cargas negativas do RNA.
[00134] As razões adequadas entre oligômero, polímero ou lipoide catiônico e os RNAs podem ser facilmente determinadas através de ensaios de retardação em gel, métodos de extinção por fluorescência tal como o ensaio de deslocamento/extinção de brometo de etídio, através de medições de tamanho de partícula e potencial zeta. As razões úteis entre oligômero, polímero ou lipoide e o RNA são geralmente caracterizadas pela retardação pelo menos parcial, preferivelmente completa do RNA compreendido no complexo com o oligômero, polímero ou lipoide catiônico quando submetidos à eletroforese em um gel de agarose, em um alto grau de extinção da fluorescência dos corantes tais como brometo de etídio, RiboGreen ou YOYO quando intercalados nos RNAs ou através da formação de (nano)partículas na mistura de oligômero, polímero ou lipoide e RNA. Para os cátions quimicamente bem definidos, a razão calculada de N/P é um fator adequado para escolher e definir as razões relativas do oligômero, polímero ou lipoide e o RNA. A razão de N/P indica a razão molar dos átomos de nitrogênio protonáveis nos grupos da fórmula (II) (ou formas de realização preferidas destes), nos grupos da fórmula (III) (ou formas de realização preferidas destes) ou na estrutura da fórmula (IV) (ou formas de realização preferidas destes) do oligômero, polímero ou lipoide da presente invenção sobre os grupos de fosfato do RNA na composição da presente invenção. A razão de N/P é um parâmetro estabelecido para a caracterização de tais complexos de RNAs com veículos catiônicos, e será entendido pelo leitor versado que, por exemplo, os átomos de nitrogênio em ligações de amida não contam como átomos de nitrogênio protonáveis. No caso de um oligômero ou polímero catiônico, a razão de N/P pode ser convenientemente calculada, por exemplo, de acordo com a formula
Figure img0018
onde wp é o peso do oligômero ou polímero, n é o número de grupos amino protonáveis por unidade de repetição, Mwp é o peso molecular da unidade de repetição (incluindo contraíons), wna é o peso do RNA e Mbase é o peso molecular médio de um nucleotídeo no RNA que é de 346 no caso do RNA. Nos complexos binários de policátion/RNA para a liberação de RNA de acordo com a invenção, as quantidades relativas do oligômero, polímero ou lipoide ao RNA devem ser preferivelmente usadas, as quais fornecem uma razão de N/P resultante em um potencial zeta positivo da composição binária. Para uma composição compreendendo um lipoide da fórmula (IV) e um RNA, a razão de N/P pode ser convenientemente calculada levando em consideração o número de átomos de nitrogênio protonáveis no lipoide e o número de moles do lipoide usado na composição. No contexto da presente invenção, para as composições binárias da presente invenção, as razões de N/P de 1 a 100 são preferidas, são mais preferidas as razões de N/P de 3 a 60, e são mais preferidas as razões de N/P de 4 a 44.
[00135] A composição de acordo com a invenção opcionalmente compreende outros componentes para a formulação lipídica. Por exemplo, a composição compreendendo um lipoide da fórmula (IV) ou as formas de realização preferidas desta, incluindo as fórmulas de (IVa) a (IVc) compreendem outros lipídeos tais como colesterol, DOPE, DOPC ou DSPC que são indicados como lipídeos auxiliares na literatura científica e/ou lipídeos PEGuilados ou qualquer outro lipídeo útil para preparar os lipoplexos. Os lipídeos auxiliares preferidos no contexto da presente invenção são colesterol, DOPE, DOPC e DSPC. Em algumas formas de realização a composição contendo um lipoide é de cerca de 40 a 60% de lipoide, cerca de 40 a 60% de colesterol, e cerca de 5 a 20% de PEG-lipídeo (em por cento em peso, com base no peso total da composição). Em algumas formas de realização, a composição contendo um lipoide é de cerca de 50 a 60% de lipoide, cerca de 40 a 50% de colesterol, e cerca de 5 a 10% PEG-lipídeo. Em algumas formas de realização, a composição contendo um lipoide é de cerca de 50 a 75% de lipoide, cerca de 20 a 40% de colesterol, e cerca de 1 a 10% de PEG-lipídeo. Em algumas formas de realização, a composição contendo um lipoide é de cerca de 60 a 70% de lipoide, cerca de 25 a 35% de colesterol, e de cerca de 5 a 10% de PEG-lipídeo. A composição pode ser fornecida através de qualquer meio conhecido na técnica (por exemplo, como descrito em Akinc et al, 2007, Nat Biotech, 26, 561-569; Akinc et al, 2009, Mol Ther, 17, 872-9; Love et al, 2010, PNAS, 107, 1864-9; US 8.450.298, WO2006/138380). Os complexos de RNA/lipoide podem formar partículas que são úteis na liberação de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tais como mRNAs, nas células. As moléculas de lipoide múltiplas podem ser associadas com um RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como uma molécula de mRNA. Por exemplo, um complexo pode incluir de 1 a 100 moléculas de lipoide, 1 a 1.000 moléculas de lipoide, 10 a 1.000 moléculas de lipoide, ou de 100 a 10.000 moléculas de lipoide. O complexo de (m)RNA e lipoide pode formar uma partícula. O diâmetro das partículas pode variar, por exemplo, de 10 a 1.200 nm, mais preferivelmente, o diâmetro das faixas de partículas variam de 10 a 500 nm, e mais preferivelmente de 20 a 150 nm.
[00136] A composição da invenção opcionalmente compreende os componentes que exercem uma função efetora durante o RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, liberado à e em uma célula. Tais componentes podem ser, mas não são limitados a poliânions, lipídeos como descritos acima, policátions outros que não os oligômeros, polímeros ou dendrímeros do presente, incluindo peptídeos catiônicos, oligômero ou polímeros de proteção, poloxâmeros (também conhecidos como pluronics), poloxaminas, ligantes de alvejamento, agentes endossomolíticos, que penetram a célula e peptídeos de sinal, nanopartículas magnéticas e não magnéticas, inibidores de RNAs, corantes fluorescentes, radioisótopos ou agentes de contraste para formação de imagem médica. O termo “função efetora” abrange qualquer função que ajuda a obter um efeito biológico intencionado de um RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, da composição a ou em um alvo biológico ou nas adjacências de um alvo biológico. Por exemplo, as composições para a liberação de ácido nucleico foram formuladas para compreender ácidos nucleicos não codificadores ou poliânions de ácido que não nucleico como materiais de enchimento (Kichler et al. 2005, J Gene Med, 7, 1459-1467). Tais materiais de enchimento são adequados para reduzir a dose de um ácido nucleico tendo um efeito biológico intencionado enquanto mantendo a escala ou grau deste efeito obtido em uma dose maior de ácido nucleico na ausência de tal material de enchimento. Os poliânions do ácido que não nucleico também foram usados para obter uma expressão genética in vivo prolongada em uma toxicidade reduzida (Uchida et al. 2011, J Control Release, 155, 296-302). As composições da presente invenção também podem compreender lipídeos catiônicos, aniônicos ou neutros tal como é o caso nos lipopoliplexos (Li e Huang em “Nonviral Vectors for Gene Therapy”, Academic Press 1999, Capítulo 13, 295-303). Os lipopoliplexos podem ser vantajosamente preparados a partir dos polímeros correspondentes às fórmulas (II) e (III) da presente invenção com lipoides correspondentes à fórmula (IV) da presente invenção. Além disso, as composições da presente invenção podem compreender oligo- ou policátions outros que não os oligômeros, polímeros ou lipoides catiônicos que compreendem oligo(amino alquileno), da presente invenção. Tais policátions adicionais podem ser úteis para obter um grau desejado de compactação de um ácido nucleico ou no caso de peptídeos policatiônicos pode haver uma função de sinal para localização nuclear tal como previamente descrito (Ritter et al. 2003, J Mol Med, 81, 708-717). Os polímeros de proteção tais como poli(etileno glicol) (PEG) também podem estar compreendidos nas composições da presente invenção e são frequentemente usados para estabilizar os poliplexos e lipoplexos contra a agregação e/ou interações indesejadas em um ambiente biológico (opsonização), por exemplo, interações com componentes de soro, células sanguíneas ou matriz extracelular. A proteção também pode ser adequada para reduzir a toxicidade das composições que compreendem ácido nucleico (Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). Os polímeros de proteção tais como PEG podem ser covalentemente ligados diretamente aos polímeros ou lipoides da presente invenção. A ligação pode ser obtida na estrutura do polímero, preferivelmente, se possível, nas extremidades terminais de uma estrutura polimérica ou de um dendrímero. Contudo, a ligação também pode ser obtida aos grupos amino das fórmulas (II), (III) e (IV).
[00137] Os derivados de polivinila, tais como PVP e poloxâmeros podem ser descobertos úteis para melhorar a transfecção na injeção intramuscular (Mumper et al. 1996, Pharm Res, 13, 701-709, Lemieux et al. 2000, Gene Ther, 7, 986-991) e consequentemente podem ser úteis a ser compreendidos nas composições da presente invenção.
[00138] Os ligantes de alvejamento incluindo os anticorpos compreendidos nas composições para liberação de ácido nucleico são úteis para a transfecção preferencial e melhorada das células alvo (Philipp e Wagner em “Gene and cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy”, 3a Edição, Capítulo 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009). Um ligante de alvejamento pode ser qualquer composto que confere às composições da presente invenção uma função de reconhecimento do alvo e/ou de ligação ao alvo de uma maneira direta ou indireta. Em termos mais ferais, um alvo é uma estrutura biológica diferente à qual um ligante de alvejamento pode ligar especificamente por intermédio da interação molecular e onde tal ligação levará, enfim, ao acúmulo preferencial do ácido nucleico compreendido na composição em um tecido alvo e/ou em uma célula alvo. Similarmente às cadeias de PEG, os ligantes de alvejamento podem ser ligados às extremidades terminais de uma estrutura polimérica ou um dendrímero. Contudo, a ligação também pode ser obtida para os grupos das fórmulas (II), (III) e (IV).
[00139] Além disso, os agentes endossomolíticos tais como os peptídeos endossomolíticos (Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 2135) ou qualquer outro composto que seja adequado para melhorar a liberação endossômica de um ácido nucleico ingerido por endocitose são componentes úteis das composições da presente invenção. Similarmente, os peptídeos que penetram a célula (em outro contexto também conhecidos como domínios de transdução de proteína) (Lindgren et al. 2000, Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103) podem ser componentes úteis da composição da presente invenção de modo a mediar a liberação intracelular de um ácido nucleico. O então chamado peptídeo TAT cai dentro desta classe e também tem uma função de localização nuclear (Rudolph et al. 2003, J Biol Chem, 278, 11411-11418).
[00140] As nanopartículas magnéticas que podem ser compreendidas nas composições da presente invenção são úteis para o alvejamento físico de liberação pela força magnética e para uma melhora drástica na eficiência da transferência do ácido nucleico, um mecanismo também conhecido como magnetofecção (EP1297169; Plank et al. 2011, Adv Drug Deliv Rev, 63, 1300-1331). Similarmente, uma composição da presente invenção também pode ser uma microbolha não magnética ou magnética usada para o realce físico e alvejamento da liberação de ácido nucleico por intermédio de ultrassom e opcionalmente aplicação do campo magnético (Holzbach et al. 2010, J cell Mol Med, 14, 587-599, Vlaskou et al. 2010, Adv Funct Mater, 20, 3881-3894). Pontos de quantum (Zintchenko et al. 2009, Mol Ther, 17, 18491856), traçadores radioativos e agentes de contraste para formação de imagem médica podem ser vantajosamente usados para rastrear a liberação de ácido nucleico e para determinar a biodistribuição das composições para liberação de ácido nucleico. Resumindo, vários efetores para liberação de ácido nucleico foram descritos e podem ser componentes úteis nas composições que compreendem um ácido nucleico e um oligômero, polímero ou dendrímero de acordo com a invenção.
[00141] É bem conhecido para aquele versado na técnica que existe um grande grau de flexibilidade com relação à quantidade de substância de cada componente compreendido na composição de acordo com a presente invenção. Por exemplo, os então chamados poliplexos binários monomoleculares foram descritos para o DNA plasmídico onda composição consiste de nanopartículas formadas na mistura do policátion e do DNA plasmídico que compreende exatamente uma molécula única de DNA plasmídico e como muitas moléculas de policátion que são necessárias para a neutralização de carga ou supercompensação de carga (positiva sobre negativa) (DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10):4548-54). Para os complexos de PEI-DNA em razões de N/P que são frequentemente usados nas transfecções, foi descoberto por espectroscopia de correlação de fluorescência que estes contêm uma média de 3,5 (+/- 1) de moléculas plasmídicas no DNA e 30 moléculas de PEI enquanto cerca de 86% das moléculas de PEI usadas para preparar os complexos estavam em uma forma livre (Clamme et al. 2003, Biophys J 84,1960-1968). No outro extremo, foi descoberto que os complexos agregados de PEI e DNA plasmídico, compreendendo putativamente um grande número (dezenas de centenas) das moléculas de componente tiveram um melhor desempenho na transfecção do0 que as nanopartículas de PEI- DNA pequenas discretas (Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433; Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21). Consequentemente, a composição de acordo com a presente invenção pode ser uma (nano)partícula compreendendo um pouco de moléculas de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, mas também pode ser um objeto macroscópico tal como um precipitado ou um pó seco compreendendo um enorme número de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como moléculas de mRNA,. Em resumo, as composições da presente invenção são caracterizadas pelas razões de entrada de seus componentes antes da automontagem. As razões típicas de entrada em p/p de componentes individuais com relação ao RNA, preferivelmente componente de RNA de filamento único tal como mRNA, são entre 1 e 50. A razão N/P é uma medida adequada da razão de entrada para o polímero/dendrímero binário ou composições de lipoide quando o oligômero ou polímero/dendrímero ou lipoide são quimicamente bem definidos. Se a composição da presente invenção compreende outros componentes, uma designação de uma razão N/P pode ser ambígua. Neste caso, as razões de entrada adequadas são determinadas pelo experimento incluindo, mas não limitando aos ensaios de retardação em gel, ensaios de extinção de fluorescência tais como o ensaio de deslocamento/extinção de brometo de etídio, através das medições de tamanho de partícula e potencial zeta e através de ensaios funcionais tais como ensaios de transfecção como aqui descritos. Nos complexos ternários compreendendo um poliânion adicional ou polímeros de proteção, a razão de carga bruta (positivo sobre negativo) pode ser menor do que 1 e o potencial zeta pode ser neutro ou negativo.
[00142] A composição da invenção pode ser produzida como descrito abaixo. Depois do processo de automontagem, a composição da presente invenção pode ser separada de quaisquer componentes não incorporados e na mesma etapa, o meio de suspensão pode ser substituído por centrifugação ou por ultrafiltração ou cromatografia de exclusão de tamanho ou diálise ou qualquer método relacionado. A estequiometria dos componentes da composição da presente invenção, purificados ou não purificados, pode ser determinada através de uma variedade de métodos analíticos, incluindo métodos espectroscópicos tais como espectrometria de UV/VIS ou espectroscopia de correlação de fluorescência (DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10):4548-54), pela fluorescência ortogonal ou rotulação de radioisótopo dos componentes individuais, através da espectrometria de RMN e IR ou análise cromatográfica e quantificação na separação da composição. A separação pode ser obtida, por exemplo, pela adição de poliânion em excesso tal como heparina como aqui descrito ou sulfato de condoitina ou através da adição de dodecilsulfato de sódio.
[00143] A presente invenção também se refere a um método para produzir a composição da invenção. Os oligômeros, polímeros ou lipoides da presente invenção podem ser produzidos e purificados como aqui descrito. Os oligômeros, polímeros ou lipoides podem ser armazenados em solução aquosa ou como pó seco, caso estes sejam novamente dissolvidos em um meio aquoso, preferivelmente água, antes de produzir a composição. O pH da solução é ajustado para neutro ou levemente ácido (abaixo de pH 4,5) com um ácido, preferivelmente com ácido clorídrico ou cítrico, se necessário. No caso de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, sendo o ácido nucleico compreendido na composição, é preferido que o pH fosse ajustado para cerca de 4,5 a 5,5, preferivelmente a cerca de 4,9 a 5,1, mais preferivelmente a cerca de 5,0. Os ácidos nucleicos são produzidos e purificados de acordo com o estado da técnica bem conhecida àqueles versados na técnica. O ácido nucleico é fornecido como solução em um meio aquoso, preferivelmente água. Opcionalmente, o oligômero, polímero ou lipoide ou o ácido nucleico ou ambos são quimicamente ligados com moléculas efetoras tais como os ligantes de alvejamento, peptídeos de sinal, peptídeos que penetram a célula, substâncias endossomolíticas ou polímeros de proteção. Contudo, dependendo da natureza química das moléculas efetoras, estas podem não precisar estar ligadas pela ligação química, mas podem ser incorporadas na composição da presente invenção por automontagem com base na ligação não covalente, isto é, eletroestática, hidrofóbica ou interação de Van-der-Waals com qualquer um dos outros componentes da composição. Para este propósito, pode ser vantajoso ajustar a força iônica, tipo de contra-íon, pH ou teor de solvente orgânico das soluções de componente individuais.
[00144] Os solventes orgânicos podem ser usados para preparar soluções de estoque dos lipoides da fórmula (IV) e podem ser necessários para a co-montagem de outros componentes pouco ou não solúveis em água, tais como lipídeos ou oligômeros ou polímeros hidrofóbicos. Os solventes orgânicos adequados são, por exemplo, solventes miscíveis em água tais como etanol e outros álcoois, sulfóxido de dimetila, dimetilformamida, N- metilpirrolidona, ou glicofurol e outros solventes descritos na WO2013/045455. Em uma forma de realização, as composições que compreendem lipoide da presente invenção são preparadas a partir de lipoides e outros componentes tais como lipídeos auxiliares dissolvidos em qualquer um destes solventes, preferivelmente etanol, e um RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, dissolvido em um meio aquoso, preferivelmente tamponado ao pH ácido. Em uma primeira etapa, os componentes dissolvidos na fase orgânica são misturados razão estequiométrica desejada e diluídos a um volume final desejado com o solvente orgânico de escolha. Uma quantidade do RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, correspondente à razão final com relação ao lipoide é diluída no meio aquoso. Preferivelmente, o volume do meio aquoso é pelo menos igual ao volume das soluções de componente combinadas em solvente orgânico. Preferivelmente, o volume da fase compreendendo o RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, excede o volume das soluções de componente combinadas em solvente orgânico, mais preferivelmente, a razão em v/v da fase aquosa e orgânica é de 4:1. Na segunda etapa, a mistura orgânica que compreende lipoide é rapidamente injetada na solução aquosa do RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, preferivelmente sob turbilhonamento. Opcionalmente, as soluções de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, e componentes compreendendo lipoide são aquecidas antes ou depois desta etapa para até 70°C. Se requerido ou necessário, o solvente orgânico pode ser agora removido por evaporação, diálise, ultrafiltração, diafiltração ou cromatografia de exclusão de tamanho enquanto na mesma etapa, o meio de dispersão pode ser trocado para uma composição de tampão final desejada tal como PBS. Opcionalmente, a composição pode ser submetida à extrusão através de filtros de membrana de tamanho de poro desejado para a esterilização e/ou para obter uma formulação monodispersada.
[00145] Como uma alternativa ao procedimento de mistura descrito acima, o RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, e o componente lipoide podem ser misturados com um dispositivo automatizado para micromistura tal como descrito, por exemplo, por Hirota et al. (Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290) ou Kasper et al. (Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185) ou pela focalização microfluídica tal como revisto por Xuan et al. (Xuan et al. 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16).
[00146] Uma alternativa para obter as composições que compreendem lipoide de acordo com a presente invenção é por intermédio dos lipossomos ou micelas como um intermediário. Os lipoplexos são frequentemente preparados a partir de reagentes de transfecção comercialmente disponíveis que são micelas ou lipossomos em uma suspensão aquosa. Os lipoides da presente invenção podem ser usados para preparar as micelas ou lipossomos. Muitas técnicas para preparar as micelas e lipossomos são conhecidas na técnica, e qualquer método pode ser usado com os lipoides inventivos para produzir as micelas e lipossomos. Além disso, qualquer agente incluindo RNA, preferivelmente RNA de filamento único tais como mRNAs, moléculas pequenas, proteínas, peptídeos, metais, compostos organometálicos, etc. pode ser incluído em uma micela ou lipossomo. Em algumas formas de realização, os lipossomos (vesículas lipídicas ou lipoide) são formados através da montagem espontânea. Em outras formas de realização, os lipossomos são formados quando as películas finas de lipídeos ou tortas lipídicas são hidratadas e as pilhas de bicamadas cristalinas lipídicas se tornam fluidicas e incham. As lâminas de lipídeo hidratadas se desprendem durante a agitação e auto-fecham para formar vesículas grandes multilamelares (LMV). Isto previne a interação da água com o núcleo de hidrocarboneto das bicamadas nas extremidades. Uma vez que estes lipossomos se formaram, a redução do tamanho da partícula pode ser modificada através da entrada de energia sônica (sonicação) ou energia mecânica (extrusão) (Szoka et al, 1980, Ann Rev Biophys Bioeng, 9, 467-508). A preparação dos lipossomos envolve a preparação dos lipoides para hidratação, hidratando os lipoides com agitação, e classificando as vesículas por tamanho para obter uma distribuição homogênea dos lipossomos. Para este propósito, os componentes lipídicos a ser compreendidos em uma composição da presente invenção são dissolvidos como soluções de estoque em solvente orgânico tal como clorofórmio. Os componentes são depois misturados na razão estequiométrica desejada e o solvente orgânico é removido por evaporação rotatória em um recipiente adequado tal como um frasco de fundo redondo, levando a uma película fina de lipídeos na parede do recipiente. Preferivelmente, a película é secada em alto vácuo. A hidratação da película/torta de lipoide é efetuada adicionando-se um meio aquoso ao recipiente de lipoide seco e agitando a mistura. A quebra das suspensões de LMV usando energia sônica tipicamente produz vesículas unilamelares pequenas (SUV) com diâmetros na faixa de 15 a 50 nm. A extrusão lipídica é uma técnica em que uma suspensão lipídica é forçada através de um filtro de policarbonato com um tamanho de poro definido para produzir as partículas tendo um diâmetro próximo ao tamanho de poro do filtro usado. A Extrusão através dos filtros com poros de 100 nm tipicamente produz vesículas lamelares grandes (LUV) com um diâmetro médio de 120 a 140 nm. Alguns lipoides podem espontaneamente se auto-montar em torno de algumas moléculas, tais como ácidos nucleicos (por exemplo, DNA e mRNA), para formar os lipossomos. Em algumas formas de realização, a aplicação é a liberação de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tais como mRNAs. O uso destes lipoides permite a montagem simples dos lipossomos sem a necessidade de etapas adicionais ou dispositivos tal como uma extrusora.
[00147] A composição da presente invenção que compreende um RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA, pode ser então preparada por automontagem na mistura das soluções dos componentes. A automontagem pode ser efetuada através da mistura manual usando pipetagem e agitação/turbilhonamento ou usando um dispositivo automatizado para micro-mistura tal como descrito, por exemplo, por Hirota et al. (Hirota et al. 1999, Biotechnics, 27, 286-290) ou Kasper et al. (Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185) ou pela focalização microfluídica tal como revisto por Xuan et al. (Xuan et al. 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16). Se a composição da presente invenção compreende outros componentes além do RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, e o oligômero, polímero ou lipoide da presente invenção, uma mistura sequêncial pode ser necessária. Neste caso, qualquer outro componente pode ser adicionado depois da automontagem do oligômero, polímero ou lipoide e o RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, ou pode ser adicionado a algum destes antes da mistura. A sequência mais adequada das etapas de mistura será dependente da natureza química dos componentes adicionais. Por exemplo, se o componente adicional é negativamente carregado, pode ser mais adequado adicioná-lo ao componente de RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, antes da mistura com o oligômero, polímero ou lipoide ou a um complexo pré-formado do oligômero, polímero ou lipoide e o RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, onde o oligômero, polímero ou lipoide está presente em excesso em termos da razão de cargas positivas sobre a soma das cargas negativas do (m)RNA e o componente aniônico adicional. Reciprocamente, se o componente adicional é catiônico, este pode ser mais adequado para adicionar ao oligômero, polímero ou lipoide antes de misturar com o (m)RNA. Ou este pode ser usado em uma estequiometria para neutralizar parcialmente as cargas negativas do (m)RNA seguido pela mistura com a solução de oligômero, polímero ou lipoide da presente invenção. No caso do (m)RNA compreendendo complexos para magnetofecção, foi mostrado que a agregação coloide induzida por sal é um meio adequado para preparar as composições compreendendo um (m)RNA, um policátion ou um lipídeo catiônico e as partículas magnéticas (EP1297169). No caso especial do componente de (m)RNA sendo um oligonucleotídeo catiônico, um poliânion pode ser usado para auto-montar o oligômero, polímero ou lipoide da presente invenção com o (m)RNA. Neste caso, o oligômero, polímero ou lipoide da presente invenção são misturados com o oligonucleotídeo catiônico seguido pela mistura com o poliânion. É bem conhecido por aquele versado na técnica que várias opções de formulação estão disponíveis para obter a composição da presente invenção. As concentrações dos componentes individuais são escolhidas de acordo com o uso intencionado da composição da presente invenção. Os parâmetros relevantes são a concentração final do componente de (m)RNA e a razão dos componentes como descrito acima. Para a liberação de (m)RNA na cultura celular, as concentrações finais de (m)RNA entre 1 e 100 μg/ml são geralmente preferidas. Para as aplicações in vivo, as concentrações de (m)RNA finais úteis podem ser de até 5 mg/ml.
[00148] A composição da presente invenção pode ser armazenada em suspensão aquosa ou pode ser secada. Consequentemente, em uma forma de realização preferida, a composição da presente invenção é armazenada na forma seca, opcionalmente na forma secada por congelamento (liofilizada). Em uma forma de realização mais preferida, o complexo ou composição seco ou liofilizado também compreendem um lioprotetor. Os lioprotetores são moléculas que protegem o material seco (por congelamento). Tais moléculas são tipicamente compostos de poliidróxi tais como açúcares (mono-, di- e polissacarídeos), polialcoóis e seus derivados. Trealose e sacarose são conhecidas ser protetores naturais para os processos de secagem. A trealose é produzida por uma variedade de plantas, fungos e animais invertebrados que permanecem em um estado de animação suspensa durante períodos de seca (também conhecidos como anidrobiose). Os açúcares tais como trealose, lactose, rafinose, sacarose, manose, sorbitol, manitol, xilitol, polietileno glicol, dextrinas, ureia, maltodextrinas, frutanos, malto-oligossacarídeos, mano-oligossacarídeos, cicloinuloexaose, amido de hidroxietila, dextranos, inulina, polivinilpirrolidona ou aminoácidos tais como triptofano, glicina e fenilalanina são particularmente lioprotetores adequados no escopo da presente invenção. Mais preferivelmente, a trealose é usada neste contexto. Aspectos Farmacêuticos
[00149] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso da composição da presente invenção ou do oligômero, polímero ou lipoide da presente invenção para liberar um RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA, ao tecido ou em uma célula alvo. O termo “liberar um RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA, a uma célula” preferivelmente significa a transferência do RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, na célula. O dito uso pode ser in vivo ou in vitro.
[00150] A presente invenção também se refere a um método para liberar um RNA, preferivelmente um RNA de filamento único tal como mRNA, a uma célula alvejada ou tecido compreendendo a etapa de trazer uma composição de acordo com a invenção em contato com a célula ou tecido alvo. Tal método pode ser realizado in vitro ou in vivo. O ato de trazer em contato pode ser obtido por intermédio de métodos conhecidos àquele versado na técnica. Por exemplo, se o método é realizado in vitro, o ato de levar em contato pode ser obtido cultivando-se as células na presença da composição no meio de cultura ou adicionando-se a composição às células. Se o método é realizado in vivo, o ato de trazer em contato com as células ou tecidos pode, por exemplo, ser obtido através da administração da composição a um indivíduo pelas cias de administração conhecidas àquele versado na técnica, em particular, através de qualquer via de administração que é geralmente utilizada no campo da terapia genética. As vias possíveis de formular a composição e de administrá-la a um indivíduo também são descritas mais abaixo.
[00151] O termo “in vivo” se refere a qualquer aplicação que é efetuada ao corpo de organismo vivo em que o dito organismo é preferivelmente multicelular, mais preferivelmente, um mamífero e ainda mais preferivelmente um ser humano. O termo “in vitro” se refere a qualquer aplicação que é efetuada às partes do corpo de um organismo vivo isolado e fora do dito organismo, por exemplo, células, tecidos e órgãos, em que o dito organismo é preferivelmente multicelular, mais preferivelmente um mamífero e ainda mais preferivelmente um ser humano.
[00152] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo a composição ou o oligômero, polímero ou lipoide da invenção e opcionalmente um carregador e/ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. O termo “composição farmacêutica” se refere a uma forma farmaceuticamente aceitável da composição da presente invenção que pode ser administrada a uma pessoa.
[00153] O termo “forma farmaceuticamente aceitável” significa que a composição é formulada como uma composição farmacêutica, em que a dita composição farmacêutica também pode compreender um carregador e/ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. Os exemplos de carregadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salinas tamponadas de fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes de umectação, soluções estéreis etc. As composições compreendendo tais carregadores podem ser formuladas através de métodos convencionais bem conhecidos. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao paciente em uma dose adequada. O regime de dosagem será determinado pelo médico atendente e fatores clínicos. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho, área de superfície corporal e idade do paciente, o composto particular a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outros medicamentos sendo administrados concomitantemente. Uma dose típica de substâncias ativas pode ser, por exemplo, na faixa de 1 ng a vários gramas. A terapia aplicada de (m)RNA, a dosagem de um (m)RNA para a expressão ou para a inibição da expressão devem corresponder a esta faixa; contudo, doses abaixo ou acima desta faixa exemplar são previstas, especialmente considerando os fatores acima mencionados. Geralmente, o regime como uma administração regular da composição farmacêutica deve ser na faixa de 0,1 μg a 10 mg unidades por quilograma de peso corporal por dia. Se o regime é uma infusão contínua, este também deve ser na faixa de 1 μg a 10 mg unidades por quilograma de peso corporal, respectivamente. O progresso pode ser monitorado através de avaliações periódicas. As doses variarão, mas uma dosagem preferida para a administração intravenosa de (m)RNAs como constituintes da composição da presente invenção é de aproximadamente 106 a 1019 cópias da molécula de (m)RNA.
[00154] O termo “administrado” abrange qualquer método adequado para introduzir a composição no corpo de um paciente. A administração das composições adequadas pode ser efetuada de diferentes maneiras, por exemplo, pela administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica, intratecal, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal, pulmonar por inalação ou intrabrônquica, oral ou retal. As composições da presente invenção podem, em particular, ser administradas como uma matriz ativada por gene tal como descrito por Shea et al. (Shea et al. 1999, Nat Biotechnol, 17, 551-554) e na EP1198489.
[00155] A princípio, as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas local ou sistematicamente. A administração preferivelmente será parenteral, por exemplo, de maneira intravenosa, embora outras vias de administração estejam dentro do escopo da invenção. A administração diretamente ao local alvo, por exemplo, por um catéter a um local em uma veia sanguínea, também é concebível. A administração também pode, por exemplo, ocorrer através da injeção direta em um local alvo tal como um tumor. Também está dentro do escopo da invenção, a administração por aerossolização ou nebulização ou administração oral. As preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões estéreis aquosas ou não aquosas. Os exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, fluorocarbonetos, óleos vegetais, tais como óleo de oliveira, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Os carregadores aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado, ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (tais como aqueles com base em dextrose de Ringer), e outros. Os conservantes e outros aditivos também podem estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e outros. Além disso, a composição farmacêutica pode compreender outros agentes tais como interleucinas ou interferonas dependendo do uso intencionado da composição farmacêutica.
[00156] Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método de tratamento compreendendo administrar a composição farmacêutica da presente invenção a um paciente de modo a ter o RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, contido na dita composição para causar um efeito preventivo ou terapêutico. Notavelmente, o termo “paciente” compreende animais e seres humanos.
[00157] Através da administração da composição farmacêutica da presente invenção, as doenças podem ser tratadas ou prevenidas. O termo “doença” se refere a qualquer condição patológica concebível que pode ser tratada, prevenida ou vacinada utilizando-se uma forma de realização da presente invenção. Em uma forma de realização preferida do dito método, as ditas doenças podem ser hereditárias, adquiridas, infecciosas ou não infecciosas, relacionadas com a idade, cardiovascular, metabólica, intestinal, neoplástica (em particular câncer) ou genética. Uma doença pode ter base, por exemplo, nas irregularidades de processos fisiológicos, processos moleculares, reações bioquímicas dentro de um organismo que por sua vez pode ter base, por exemplo, no equipamento genético de um organismo, em fatores comportamentais, sociais ou ambientais tal como a exposição a produtos químicos ou radiação. Em uma forma de realização particularmente preferida, a composição farmacêutica da presente invenção é usada para tratamentos como descritos no pedido de patente WO2010EP04681.
[00158] De acordo com os métodos de tratamento acima descritos, a presente invenção se refere, em outra forma de realização ao uso da composição da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença que pode ser tratada através do fornecimento do dito RNA, preferivelmente RNA de filamento único tal como mRNA, contido na dita composição a um tecido ou órgão dentro do corpo de um paciente afetado por uma doença.
[00159] Para mais ilustração, os aspectos preferidos da invenção são resumidos nos seguintes itens, que formam parte da descrição geral precedente e as formas de realização preferidas aqui descritas também se aplicam. 1. Um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (II) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal:
Figure img0019
em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R6 definidas como segue, independentemente para cada grupo da fórmula (II) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla de C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; e um cadeia de poli(etileno glicol); R6 é selecionado de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, - CH(R7)-CH-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2- R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla de C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; - C(NH)-NH2; uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante receptor, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (II) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (II). 2. O oligômero ou polímero do item 1, em que, na fórmula (II), p é 1. 3. O oligômero ou polímero dos itens 1 ou 2, em que, na fórmula (II), n é 1. 4. O oligômero ou polímero dos itens 1 ou 2, em que, na fórmula (II), m é 1 e n é 1. 5. O oligômero ou polímero de qualquer um dos itens de 1 a 4, em que, na fórmula (II), um é 1 e b é 2 ou um é 2 e b é 1. 6. O oligômero ou polímero de qualquer um dos itens de 1 a 5, em que, na fórmula (II), R2 a R5 são hidrogênio. 7. O oligômero ou polímero de qualquer um dos itens de 1 a 6, em que, na fórmula (II), R6 é hidrogênio. 8. O oligômero ou polímero de qualquer um dos itens de 1 a 5, que é um polímero. 9. O polímero do item 8, em que a estrutura polimérica que carrega uma pluralidade de grupos da fórmula (II) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal é selecionada de um poli(aminoácido) compreendendo uma pluralidade de unidades de ácido glutâmico ou aspártico, tal como poli(ácido glutâmico) e poli(ácido aspártico), uma proteína, uma polialcina, uma poliamina, ácido poliacrílico, polimetacrílico, ácido polimaleico, polissulfonato, sulfonato de poliestireno, polifosfato, polissulfato de pentosano, poli(ácido vinil fosfórico), poli(ácido butadieno-co-maleico), poli(ácido acrilato de etila-co-acrílico), poli(ácido etileno-co-acrílico), poli(anidrido etileno-co-maleico), poli(ácido metil metacrilato-co- metacrílico), poli(ácido metil metacrilato-co-metacrílico), poli(ácido estirenossulfônico-co-ácido maleico), poli(cloreto de vinila-co-acetato de vinila-co-ácido maleico), um carboidrato tal como heparina, sulfato de heparano, poli(ácido glicurônico), poli(ácido galacturônico), ácido hialurônico, poli(ácidos urônicos) em geral, ou um dendrímero terminado em carbóxi. 10. O polímero do item 9, que é selecionado de um poli(aminoácido) compreendendo uma pluralidade de unidades de ácido glutâmico ou aspártico, ácido poliacrílico e polimetacrílico. 11. Um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição:
Figure img0020
em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R5 são definidas como segue, independentemente para cada grupo da fórmula (III) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7 ou -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla de C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2; e uma cadeia de poli(etileno glicol); e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (III) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (III). 12. O oligômero ou polímero do item 11, em que, na fórmula (III), p é 1. 13. O oligômero ou polímero dos itens 11 ou 12, em que, na fórmula (III), n é 1. 14. O oligômero ou polímero dos itens 11 ou 12, em que, na fórmula (III), m é 1 e n é 1. 15. O oligômero ou polímero de qualquer um dos itens de 11 a 14, em que, na fórmula (III), um é 1 e b é 2 ou a é 2 e b é 1. 16. O oligômero ou polímero de qualquer um dos itens de 11 a 15, em que, na fórmula (III), R2 a R5 são hidrogênio. 17. O oligômero ou polímero de qualquer um dos itens de 11 a 16, que é um polímero. 18. O polímero do item 17, que é um dendrímero. 19. Um lipoide tendo a estrutura da fórmula (IV):
Figure img0021
em que as variáveis a, b, p, m, n e R1 a R6 são definidas como segue: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R1 a R6 são independentemente um do outro selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C16 ou alquenila C3-C6 tendo uma ligação dupla de C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2; uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante receptor; contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 sejam um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH-OH, - CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla de C-C; e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IV) podem ser protonados para fornecer um lipoide catiônico da fórmula (IV). 20. O lipoide do item 19, em que, na fórmula (IV), p é 1. 21. O lipoide dos itens 19 ou 20, em que, na fórmula (IV), n é 1. 22. O lipoide dos itens 19 ou 20, em que, na fórmula (IV), m é 1 e n é 1. 23. O lipoide de qualquer um dos itens de 19 a 22, em que, na fórmula (IV), a é 1 e b é 2 ou a é 2 e b é 1. 24. O lipoide de qualquer um dos itens de 19 a 22, em que, na fórmula (IV), R1 a R6 são independentemente um do outro selecionados de hidrogênio e um grupo -CH2-CH(OH)-R7, ou -CH(R7)-CH2-OH, em que R7 é selecionado de alquila C8-C16 ou alquenila C8-C16 tendo uma ligação dupla de C-C; contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 sejam um grupo -CH2-CH(OH)-R7, ou -CH(R7)-CH2-OH, em que R7 é selecionado de alquila C8-C16 ou alquenila C8-C16 tendo uma ligação dupla de C-C. 25. Uma composição compreendendo um mRNA e um oligômero ou polímero de qualquer um dos itens de 1 a 18. 26. A composição do item 25, em que o oligômero ou polímero é um oligômero ou polímero catiônico. 27. A composição do item 25, compreendendo um complexo do mRNA e o oligômero ou polímero catiônico. 28. Uma composição compreendendo um mRNA e um lipoide de qualquer um dos itens de 19 a 24. 29. A composição do item 28, em que o lipoide é um lipoide catiônico. 30. A composição do item 29, compreendendo um complexo do mRNA e o lipoide catiônico. 31. A composição de qualquer um dos itens de 25 a 30, que está na forma liofilizada. 32. A composição do item 31, que também compreende um lioprotetor. 33. A composição do item 32, em que o lioprotetor é trealose. 34. Uma composição farmacêutica compreendendo uma composição de qualquer um dos itens de 25 a 33. 35. Uso de uma composição de qualquer um dos itens de 25 a 33 for liberando um mRNA em uma célula. 36. Uso de um oligômero ou polímero de qualquer um dos itens de 1 a 18 ou um lipoide de qualquer uma das reivindicações de 19 a 24 para liberar um mRNA em uma célula. 37. Um método para liberar um mRNA a uma célula ou tecido alvo compreendendo a etapa de trazer uma composição de qualquer um dos itens de 25 a 33 em contato com a célula ou tecido alvo.
Descrição das Figuras:
[00160] Figura 1: Efeito do tipo de modificação de cadeia lateral de oligo(alquileno amina) de poli(ácido acrílico) na eficiência de transfecção de diferentes tipos de célula com mRNA. Os poliplexos foram formados usando poli(ácido acrílico) (MW: 8,000 Da) com modificações de cadeia lateral (2-3-2) e (3-2-3) ou os grupos de controle (3-3-3), (2-2-2), (2-2) ou (34-3) e mRNA codificando quanto a luciferase de um vaga-lume em razões de N/P entre 4 e 44 nos tipos de células indicados. Depois de 24 horas, as células transfectadas com diferentes quantidades de RNA (500, 250, 125 ou 62,5 ng) foram lisadas e analisadas quanto a atividade de luciferase.
[00161] Figura 2: Ensaio de migração em gel para a determinação da capacidade de formação do complexo de PAA8k modificado em (2-32) e (3-2-3). Os poliplexos foram formados como descrito nas razões de N/P. A interação de polímero e mRNA foi analisada por intermédio da migração em um gel de agarose. Quanto melhor a interação, menor a quantidade necessária de polímero para uma migração completamente impedida de mRNA.
[00162] Figura 3: Ensaio de RiboGreen para a determinação da capacidade de formação de complexo de PAA8k modificado em (2-3-2) e (3-2-3). Os poliplexos foram formados como descrito nas razões de N/P indicadas. A interação do polímero e mRNA foi analisada por intermédio da adição de RiboGreen. Esta molécula interage com os ácidos nucleicos, resultando em um sinalo de fluorescência aumentado em grandes quantidades de mRNA. Quanto melhor a interação do ácido nucleico com o polímero, menor o sinal de fluorescência detectado. Os sinais são apresentados como fluorescência relativa se comparado a um controle contendo a mesma quantidade de mRNA livre.
[00163] Figura 4: Eficiência de transfecção de diferentes polímeros N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (2-3-2) modificados. Os poliplexos foram formados usando os polímeros modificados em N,N’-Bis(2- aminoetil)-1,3-propanodiamina (PAA8k: poli(ácido acrílico), MW 8.000 Da; Glu9.8k: poli(ácido glutâmico), MW 9.800 Da; PMA9,5k: poli(metacrilato), MW 9.500 Da; Glu64k: poli(ácido glutâmico), MW 64.000 Da; GluLys: poli(ácido glutâmico)-poli(lisina)-co-polímero) (20.000 a 50.000 Da) e mRNA que codifica a luciferase de vagalume em razões de N/P entre 4 e 20. Depois de 24 horas, as células transfectadas com diferentes quantidades de mRNA (500, 250, 125 ou 62,5ng) foram lisadas e analisadas quanto a atividade de luciferase.
[00164] Figura 5: Eficiência de transfecção de diferentes pesos moleculares de poli(ácido acrílico) modificado por N,N’-Bis(2-aminoetil)- 1,3-propanodiamina (2-3-2). Os poliplexos foram formados usando os pesos moleculares indicados de poli(ácido acrílico) modificado por com N,N‘-Bis(2- aminoetil)-1,3-propanodiamina (2-3-2) e mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume em razões de N/P entre 4 e 20. Depois de 24 horas as células transfectadas com diferentes quantidades de mRNA (500, 250, 125 ou 62,5ng) foram lisadas e analisadas quanto a atividade de luciferase.
[00165] Figura 6: Citotoxidade das formulações poliméricas de mRNA. Os complexos compreendidos de poli(ácido acrílico) (MW 8.000 Da, 20.000 Da e 70.000 Da) modificados com as oligo(alquileno amina)s indicadas e mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume foram usados para transfecção em razões de N/P entre 4 e 44 e diferentes quantidades de mRNA. Depois de 24 horas, a viabilidade das células foi determinada como descrito. Os dados são mostrados como sobrevivência em % se comparado às células não transfectadas.
[00166] Figura 7: Níveis de expressão da proteína repórter de pulmões de camundongos. Os poliplexos de PAA20k-(2-3-2) e mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume foram misturados nas razões de N/P indicadas e aplicados ao camundongo por intermédio de aerossol.
[00167] Figura 8: Propriedades físico-químicas de Poli(ácido acrílico) modificado por N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (2-32). Os poliplexos foram formados sob condições in vivo em uma N/P de 10. Polímero Usado: poli(ácido acrílico), MW 20.000 Da.
[00168] Figura 9: Foto microscópica do elétron de transmissão de PAA20k-(2-3-2) e mRNA. Os poliplexos foram misturados em N/P de 10 e analisados por intermédio de um microscópio eletrônico de transmissão. Escala em bar: 100 nm. Polímero Usado: poli(ácido acrílico), MW 20.000 Da.
[00169] Figura 10: A expressão de luciferase de vaga-lume em tecido de pulmão de porcino depois da aplicação de aerossol de formulações de poliplexo. Imagens à esquerda brPEI N/P 10. Imagens à direita PAA20k-(2-3-2) N/P 10. Polímero usado: poli(ácido acrílico), MW 20.000 Da.
[00170] Figura 11: Efeito de trealose na capacidade de liofilizar complexos de PAA20k-(2-3-2). Os complexos foram formados como descrito e liofilizados na presença ou ausência de 1% de trealose. Como demonstrado, a trealose é capaz de conservar a eficiência de transfecção de mRNA destes complexos depois da liofilização e reidratação.
[00171] Figura 12: Efeitos de polímeros modificados em (2-3-2) e (3-2-3) modificados na eficiência de transfecção de DNA. Os poliplexos foram formados usando poli(ácido acrílico) (MW: 8.000 Da) com modificações de cadeia lateral indicadas e pDNA que codifica a luciferase de vaga-lume (pCMVLuc) em razões de N/P entre 4 e 20. Depois de 24 horas, as células transfectadas com diferentes quantidades de DNA (500, 250, 125 ou 62,5 ng) foram lisadas e analisadas quanto a atividade de luciferase. Como PEI de controle ramificado (brPEI) 25 kDa foi usado como reagente de transfecção.
[00172] Figura 13: Silenciamento de gene induzido por RNAi usando complexos de GL3-Luc-siRNA e p(ácido acrílico) modificado por N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (2-3-2). AS células de HeLa que expressão luciferase de vaga-lume de maneira estável foram transfectadas usando complexos de siRNA contra luciferase de vaga-lume siRNA (siLuc) ou siRNA de controle (siGFP) e PAA20k-(2-3-2) em razões de N/P indicadas e diferentes quantidades de siRNA. A expressão de luciferase foi analisada depois de 24 horas e é mostrada como expressão relativa se comparado às células não tratadas.
[00173] Figura 14: Atividade da luciferase de vaga-lume depois transfecção das células de NIH3T3 com diferentes complexos de lipoide/mRNA. Os complexos foram formados entre mRNA e lipoides com base em (2-3-2) ou nas oligo(alquileno amina)s (2-2-2) e (3-3-3) de controle em razões em p/p (lipoide em peso/mRNA em peso) de 16.
[00174] Figura 15: Efeito da modificação de cadeia lateral de oligo(alquileno amina) do poli(ácido acrílico) na eficiência de transfecção de DNA. Os poliplexos foram formados usando poli(ácido acrílico) (MW: 8.000 Da) com modificações de cadeia lateral indicadas e pDNA que codifica a luciferase de vaga-lume (pCMVLuc) em razões de N/P indicadas. Depois de 24 horas, as células transfectadas com diferentes quantidades de DNA (500, 250, 125 ou 62,5 ng) foram lisadas e analisadas quanto a atividade de luciferase. Ao contrário da transfecção de mRNA (ver a Figura 1) a modificação da cadeia lateral de oligo(alquileno amina) não afeta notavelmente a eficiência de transfecção.
[00175] Figura 16: Expressão de luciferase de vaga-lume em fígado e baço de murinos depois da injeção intravenosa de formulações de lipoide. Esquerda: luciferase que codifica mRNA de vaga-lume formulada com lipoide C12-(2-3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:Colesterol:DSPE-PEG2k; razão em peso 3,6:0,18:0,76:1) em PBS para injeção; Direita: luciferase que codifica mRNA de vaga-lume formulada com lipoide C12-(2-3-2) (C12-(2-3- 2):DOPE:Colesterol:DSPE-PEG2k; razão em peso 3,6:0,18:0,76:1) em água para injeção. Somente as formulações em PBS levam à expressão no fígado e baço (PBS: 1,6404x10A5 fótons/s; água: não detectável).
[00176] Figura 17: Expressão da luciferase de vaga-lume em fígado e baço de murino depois da injeção intravenosa de formulações de lipoide. A. imagem de bioluminescência in vivo: Esquerda: luciferase que codifica mRNA de vaga-lume formulada com lipoide C14-(2-3-2) (C14-(2-3- 2):DOPE:Colesterol:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1) em PBS para injeção; Meio: luciferase que codifica mRNA de vaga-lume formulada com lipoide C16-(2- 3-2) (C16-(2-3-2):DOPE:Colesterol:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1) em PBS para injeção; Direita: luciferase que codifica mRNA de vaga-lume formulada com lipoide C12-(2-3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:Colesterol:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1) em PBS para injeção. B. Quantificação de sinal de bioluminescência in vivo. Os níveis de expressão diminuem com o comprimento de cadeia crescente de alquila C12-C16.
[00177] Figura 18: A expressão de luciferase de vaga-lume em fígado e baço de murino depois da injeção intravenosa das formulações de lipoide. Fígado, baço, rim, estômago, coração, pulmões e cérebro foram extirpados do camundongo tratado mostrado na Figura 17 e visualizados quanto a expressão de luciferase. A. Imagem de bioluminescência: Esquerda: luciferase que codifica mRNA de vaga-lume formulada com lipoide C12-(2- 3-2) (C12-(2-3-2):DOPE:Colesterol:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1) em PBS para injeção; Meio: luciferase que codifica mRNA de vaga-lume formulada com lipoide C14-(2-3-2) (C14-(2-3-2):DOPE:Colesterol:DSPE-PEG2k; 8:6:5:1) em PBS para injeção; Direita: luciferase que codifica mRNA de vaga-lume formulada com lipoide C16-(2-3-3) (C16-(2-3-2):DOPE:Colesterol:DSPE- PEG2k; 8:6:5:1) em PBS para injeção. A expressão de luciferase no fígado diminuiu com o comprimento de cadeia de alcano crescente dos lipoides (C16<C14<C12) e foi dificilmente detectável para C16. A expressão de luciferase no baço foi maior para C14. Um pouco da expressão de luciferase foi observada nos pulmões, mas nenhuma foi observada no coração, rim, estômago ou cérebro. B. Quantificação do sinal de bioluminescência de A.
[00178] Figura 19: Comparação da eficiência dos diferentes reagentes de transfecção quanto sua capacidade de liberar pDNA e mRNA. Os poliplexos foram formados usando reagentes de transfecção indicados (Estruturas de acordo com a nomenclatura da patente correspondente WO 2011/154331: #46 C-Stp3-C-K-OleA2; #454: C-Y3- Stp2-K(K-OleA2)-Stp2-Y3-C; #512: C-Sph3-K(Sph3-C)2). Como carga útil de ácido nucleico, mRNA ou pDNA (pCMVLuc) que codificam a luciferase de vaga-lume foram usados nas razões de N/P indicadas. Depois de 24 horas, as células de NIH3T3 transfectadas com diferentes quantidades de mRNA (500, 250, 125 ou 63ng) foram lisadas e analisadas quanto a atividade de luciferase.
[00179] Figura 20: Comparação da eficiência de transfecção de PAA8k, modificado com N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (2-32) ou N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-butanediamina (2-4-2). Os poliplexos foram formados usando PAA8k modificados com N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3- propanodiamina (2-3-2) ou N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-butanodiamina (2-4-2) e mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume nas razões de N/P indicadas. Depois de 24 horas as células de NIH3T3 transfectadas com diferentes quantidades de mRNA (500, 250, 125 ou 63ng) foram lisadas e analisadas quanto a atividade de luciferase.
[00180] Figura 21: Fotos de microscópio eletrônico de transmissão dos lipoplexos. Os complexos de Lipoide/mRNA foram formados como descrito e analisado por intermédio do microscópio eletrônico de transmissão. Linha superior: C10-(2-3-2)/DOPE/Chol/DPG-PEG, Linha inferior: C10-(2- 3-2)/DPPC/Chol/DPG-PEG; Escala da visão geral das fotos da esquerda: 100 nm; fotos da direita: escala em zoom detalhado de 20 nm.
[00181] Figura 22: Eficiência de transfecção de C10-(2-3-2) sintetizado a partir de 1-bromodecano C10-(2-3-2) foi sintetizado como descrito sob o exemplo de produção VII usando 1-bromodecano. A eficiência de transfecção foi testada em células NIH3T3 usando doses de 500 ng, 250 ng e 125 ng por poço.
[00182] Figura 23: Eficiência de transfecção de C12-(2-3-2) sintetizado a partir de N-dodecil acrilamida C12(2-3-2) foi sintetizado como descrito sob o exemplo de produção VIII usando N-dodecil acrilamida. A eficiência de transfecção foi testada em células de NIH3T3 usando doses de 500 ng, 250 ng e 125 ng por poço.
[00183] Figura 24: Eficiência de transfecção de C12-(2-3-2) sintetizado a partir de dodecil-acrilato C12-(2-3-2) foi sintetizado como descrito sob o exemplo de produção IX usando dodecil-acrilato. A eficiência de transfecção foi testada em células de NIH3T3 usando doses de 500 ng, 250 ng e 125 ng por poço.
[00184] Figura 25: Eficiência de transfecção de formulação de lipoide com base em C12-(2-3-2). As formulações de lipoide foram geradas usando C12-(2-3-2) e DMG-PEG2k em combinação com DOPE ou DSPC com mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume em N/P de 17 ou 8
[00185] Figura 26: Comparação de oligo(alquil amina)s (2-3-2), (33-3) e (2-2-2) C12 modificadas na eficiência de transfecção IN VIVO.
[00186] Figura 27: Comparação da eficiência de transfecção de C12-(2-3-2) versão com uma saturação e posicionamento de cadeia de alquila C12 alterados. A: estrutura química de versões de C12-(2-3-2) diferentes; B: Nível de expressão da proteína repórter (luciferase de vaga- lume) depois da transfecção das células de NIH3T3 com formulações compreendendo os lipídeos diferentes.
[00187] Figura 28: Estabilidade de Liofilização dos Lipoplexos. As formulações de lipoide foram formadas como descrito, dialisadas contra água e misturadas com diferentes concentrações de lioprotetores (trealose (A, D), sacarose (B, E) e lactose (C, F)). Depois de congelar, liofilizar e recolocar em suspensão, a eficiência de transfecção em células de NIH3T3 (A-C) e o diâmetro hidrodinâmico (D-F) foram medidos e comparados aos lipoplexos recentemente preparados sob as mesmas condições.
[00188] Figura 29: Expressão de mRNA em amostras EX VIVO depois da transfecção com C12-(2-3-2) contendo formulações lipoide. A: músculo de porco, todas as amostras tratadas; B: tecido gorduroso de porco, todas as amostras tratadas; C: artéria de ovelha; D: músculo de ovelha, amostra superior: tratada, amostra inferior: não tratada; E: pulmão de ovelha, amostra superior: tratada, amostra inferior: não tratada
[00189] Figura 30: Análise de Western blot dos lisados celulares em proteína ACE-2. Linhas à esquerda: Lisado de células tratadas com ACE-2 mRNA; Linhas à direita: Lisado das células tratadas com formulações lipoide sem mRNA (vazio). Linha superior: Coloração de ACE-2; linha inferior: GAPDH, controle de carga.
[00190] Figura 31 Expressão de eritropoietina de murinos em camundongos. As amostras sanguíneas foram analisadas quanto mEPO 6 horas depois da administração intravenosa de uma formulação de C12-(2-3-2) contendo mRNA de mEPO. Três diferentes doses de RNA (20 μg, 10 μg ou 5 μg) e um grupo de controle (PBS) foram analisadas.
[00191] Figura 32: Comparação da eficiência de transfecção de poli(alilamina) modificadas de maneira diferente (PALAM). As células de NIH3T3 foram transfectadas usando poliplexos compostos de mRNA que codificam a luciferase complexada com PALAM-(2-3-2), PALAM-(2-2-2) ou PALAM-(3-3-3).
[00192] Figura 33: Comparação da eficiência de transfecção de polipropilenimina diferentemente modificada (PPI). As células NIH3T3 foram transfectadas usando poliplexos compostos de mRNA que codificam a luciferase complexada com PPI-(2-3-2), PPI-(2-2-2) ou PPI-(3-3-3).
[00193] Figura 34: Expressão da luciferase depois da injeção subcutânea de uma formulação de C12-(2-3-2). C12-(2-3- 2)/DOPE/Colesterol/DMG-PEG2k contendo mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume
[00194] Os seguintes Exemplos servem para ilustrar a invenção.
Exemplo de produção I: Síntese de poli(ácido acrílico) modificado por N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3- propanodiamina, MW 8.000 Da, PAA8k-(2-3-2):
[00195] 10 mg de sal sódico de poli(ácido acrílico) (MW: 8.000 Da, Sigma Aldrich) foram diluídos em 2 ml de tampão de reação contendo 50 mM de MES, pH 6,0. 1,69 g de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (100 eq./grupo carbóxi, Sigma Aldrich) foi diluído em 2 ml do mesmo tampão. Conforme o oligo(alquileno amina) foi adquirido como base livre, o pH foi reajustado ao pH 6,0 através da adição às gotas de HCl a 32%. A solução de poli(ácido acrílico) e oligo(alquileno amina) foram misturados. Para iniciar a reação, um excesso molar de 10 vezes de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, Sigma Aldrich, diluído em tampão de reação de 2 ml) por grupo carboxila foi adicionado. O volume final foi ajustado a 10 ml. A mistura foi incubada por 3 horas na temperatura ambiente em um agitador de topo. O produto foi purificado por diálise. Para este propósito, a mistura de reação foi enchida em um cassete de diálise slide-a- lyzer (3 a 12 ml, MWCO: 3,500 Da, Thermo Fisher) e dialisado contra água por 72 horas. A água foi trocada duas vezes por dia. Depois da diálise, o polímero purificado foi liofilizado.
[00196] Sob as mesmas condições, os polímeros listados na seguinte tabela 1 foram sintetizados e testados: Tabela 1: Lista de polímeros modificados por coligo(alquileno amina) sintetizado.
Figure img0022
Exemplo de produção II: Síntese de um bloco de construção de oligo(alquileno amina) para a geração de polímeros semelhantes à escova através da síntese de peptídeo suportado em fase sólida: I. Síntese de N,N‘-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (EPE(Boc)3) protegido por tri(Boc).
[00197] 5g de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (31,2 mmol) foram solubilizados em 100 ml de diclorometano (DCM) e resfriados até 0°C. 4,43 g de trifluoroacetato de etila (31,2 mmol, 1 eq./molécula) foram diluídos em 100 ml de DCM e adicionados às gotas à solução agitada durante um período de 4 horas. Depois da adição, a solução é agitada na temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, 19,46 ml de trietilamina (14,2 g, 0,1404 mol, 1,5eq./amina livre) são adicionados à mistura de reação. 30,64 g de dicarbonato de di-terc-butila (0,1404 mol, 1,5 eq./amina) são solubilizados em 100 ml de DCM, adicionados às gotas à solução agitada e incubados na temperatura ambiente por 24 horas sob agitação constante. Depois da reação, a fase orgânica é concentrada até aproximadamente 100 ml e lavada 3 vezes com 5% de NaHCO3 e 3 vezes com água. A fase orgânica é secada em Na2SO4 anidro, filtrada e o solvente é evaporado. O produto é diluído em 100 ml de metanol e 200 ml de 3M de NaOH (20 eq./molécula) e agitado durante a noite na temperatura ambiente. O metanol é evaporado e a solução aquosa é lavada 3 vezes com DCM. A fase orgânica é coletada, secada em Na2SO4 anidro, filtrada e evaporada. A molécula de (EPE(Boc)3) resultante é analisada por H1-RMN.
II. Síntese de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina bocilado modificado por Fmoc-ácido glutâmico (Fmoc-Glu(EPE(Boc)3-OH)
[00198] 3,5 g de ácido N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-L-glutâmico (Fmoc-Glu-OH, 9,47 mmol) são misturados com 100 ml de anidrido acético, aquecidos até 100°C em um banho de óleo sob refluxo e agitação constante até a solução se tornar clara. A solução é resfriada em gelo e os solventes removidos por intermédio de evaporação no vácuo a 60°C. O produto é solubilizado em 100 ml de tetra-hidrofurano. 5,24 g de EPE(Boc)3 (11,37 mmol, 1,2eq./molécula) são diluídos em 100 ml de tetra-hidrofurano, misturados com 3,3 ml de N,N-Diisopropiletilamina (18,94 mmol, 2eq./molécula) e adicionados à solução contendo ácido glutâmico. A mistura de reação é agitada por 2 horas na temperatura ambiente. Depois da concentração da solução por evaporação, esta é diluída em DCM e lavada 3 vezes com tampão de citrato trissódico (0,1M, pH 5,5). Depois de secar a fase orgânica em Na2SO4 anidro, a amostra é purificada por cromatografia cintilante de coluna seca em uma coluna de sílica usando um gradiente escalonado do heptano/acetato de etila (50/50 a 0/100) e acetato de etila/metanol (100/0 a 80/20). As frações contendo um sinal de UV em sílica TLC são reunidas, o solvente é evaporado e o produto é analisado por H1- RMN.
Exemplo de produção III: Síntese do bloco de construção de uma oligo(alquileno amina) para a geração de polímeros lineares e ramificados através da síntese de peptídeos suportada em fase sólida: I. Síntese de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina protegida por di(Boc) (EPE(Boc)2).
[00199] 5 g de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (31,2 mmol) são solubilizados em 100 ml diclorometano (DCM) e resfriados até 0°C. 8,86 g de trifluoroacetato de etila (62,4 mmol, 2eq./molécula) são diluídos em 100 ml de DCM e adicionados às gotas à solução agitada durante um período de 4 horas. Depois da adição, a solução é agitada na temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, 13 ml de trietilamina (9,47g, 0,0936 mol, 1,5eq./amina livre) são adicionados à mistura de reação. 20,43 g de dicarbonato de di-terc-butila (0,0936 mol, 1,5 eq./amina) são solubilizados em 100 ml de DCM, adicionados às gotas à solução agitada e incubados na temperatura ambiente por 24 horas sob agitação constante. Depois da reação, a fase orgânica é concentrada até aproximadamente 100 ml e lavada 3 vezes com NaHCO3 5% e 3 vezes com água. A fase orgânica é secada em Na2SO4 anidro, filtrada e o solvente é evaporado. O produto é diluído em 100 ml de metanol e 200 ml de 3M de NaOH (20 eq./molécula) e agitado durante a noite na temperatura ambiente. O metanol é evaporado e a solução aquosa é lavada 3 vezes com DCM. A fase orgânica é coletada, secada em Na2SO4 anidro, filtrada e evaporada. A molécula de (EPE(Boc)2) resultante é analisada por H1-RMN.
II. Síntese de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina bocilado protegido por fmoc (Fmoc-EPE(Boc)2-OH), succinilado.
[00200] 3,0 g de (EPE(Boc)2) (8,3mmol) são resolvidos em 50 ml de tetra-hidrofurano e resfriados até 0°C. 0,996 g de anidrido succínico (10 mmol, 1,2 eq./molécula) é dissolvido em 200 ml de tetra-hidrofurano e adicionado às gotas à solução agitada. Depois da, adição a reação é agitada por uma hora adicional na temperatura ambiente. 4,34 ml de N,N- diisopropiletilamina (33,2 mmol, 4eq./molécula) são adicionados. Depois 4,2 g de éster de N-hidroxissuccinimida Fmoc (12,45 mmol, 1,5 eq./molécula) dissolvidos em acetonitrila/tetra-hidrofurano são adicionados às gotas à mistura de reação. A solução é agitada durante a noite. A mistura de reação é concentrada até aproximadamente 100 ml, misturada com 100 ml de diclorometano e lavada 5 vezes com 0,1 M de tampão de citrato de sódio (pH 5,2). A fase orgânica é secada, concentrada e o produto resultante é purificado por cromatografia cintilante de coluna seca em uma coluna de sílica usando um gradiente escalonado de n-heptano para acetato de etila (100/0 a 0/100) e também ao acetato de etila em metanol (100/0 a 80/20). As frações contendo um sinal de UV na TLC em sílica TLC são reunidas, o solvente é evaporado e o produto analisado por H1-RMN.
Exemplo de produção IV: Síntese de lipoides com base em N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina
[00201] 100 mg N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (0,623 mmol) foram misturados com 575,07 mg de 1,2-epoxidodecano (3,12 mmol, (N-1) eq. onde N é 2 x a quantidade de amina primária mais 1 x a quantidade de amina secundária por oligo(alquileno amina)) e misturados por 96 horas a 80°C sob agitação constante. Depois da reação, o lipoide resultante foi diluído em 25 mM de tampão de acetato de sódio (ph 5) em uma concentração de 100 μg/ ml e usado para a transfecção.
[00202] Sob as mesmas condições os lipoides, listados na tabela 2 foram sintetizados: Tabela 2: Lista de lipoides sintetizados
Figure img0023
Exemplo de produção V: Síntese de poli(alilamina) modificada com N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3- propanodiamina; (PALAM-(2-3-2))
[00203] 500 mg de solução de poli(alilamina) (Sigma-Aldrich, 20% p/p, peso molecular: 17.000 Da) foram diluídos em 2 ml de tampão de reação contendo 50 mM de MES, pH 6,0. 10,33 g de ácido succínico (50 eq. por amina, Sigma-Aldrich) foi diluído em 5 ml do mesmo tampão de reação. As soluções foram reunidas e o pH reajustado a 6,0. Para iniciar a reação, 3,36 g de 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 10 eq. por amina, Sigma Aldrich) diluídos em 5 de ml tampão de reação foram adicionados. A mistura foi incubada por 3 horas na temperatura ambiente em um agitador de topo. O produto foi purificado por diálise. Para este propósito a mistura de reação foi enchida em um cassete de diálise slide-a-lyzer (3 a 12 ml, MWCO: 10.000 Da, Thermo Fisher) e dialisada contra água por 72 horas. A água foi trocada duas vezes por dia. Depois da diálise, o polímero purificado foi liofilizado.
[00204] 5 mg do poli(alilamina) liofilizado modificado com ácido succínico foi diluído em 2 ml de tampão de reação contendo 50mM de MES, pH 6,0. 510,38 mg de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (100 eq./grupo carboxila, Sigma Aldrich) foram diluídos em 2 ml do mesmo tampão. Considerando que o oligo(alquileno amina) foi adquirido como uma base livre, o pH foi reajustado ao pH 6,0 através da adição às gotas de HCl a 32%. A poli(alilamina) e a solução de oligo(alquileno amina) solução foram misturados. Para iniciar a reação, um excesso molar de 10 vezes de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, Sigma Aldrich, diluído em 4 ml tampão de reação) por grupo carboxila foi adicionado. O volume final foi ajustado a 10 ml. A mistura foi incubada por 3 horas na temperatura ambiente em um agitador de topo. O produto foi purificado por diálise. Para este propósito a mistura de reação foi enchida em um cassete de diálise slide-a- lyzer (3 a 12 ml, MWCO: 3.500 Da, Thermo Fisher) e dialisado contra água por 72 horas. A água foi trocada duas vezes por dia. Depois da diálise, o polímero purificado foi liofilizado.
[00205] Sob as mesmas condições os polímeros listados na seguinte tabela 3 foram sintetizados e testados: Tabela 3: Lista de polímeros modificados com oligo(alquileno amina) sintetizados com base em poli(alilamina).
Figure img0024
Exemplo de produção VI: Síntese de polipropilenimina modificada com N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3- propanodiamina (PPI-(2-3-2))
[00206] 100 mg de dendrímero de polipropilenimino hexadecamina (PPI, geração 3,0, Sigma Aldrich) foram dissolvidos em 1,5 ml de tampão de reação contendo 50 mM de MES, pH 6,0. 11,2 g de ácido succínico (100 eq. por amina primária, Sigma-Aldrich) foram dissolvidos em 30 ml do mesmo tampão de reação. As soluções foram reunidas e o pH reajustado a 6,0. Para iniciar a reação 1,81 g de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 10eq. por amina primária, Sigma Aldrich) diluído em 2 ml de tampão de reação foi adicionado. A mistura foi incubada durante a noite na temperatura ambiente em um agitador de topo. O produto foi purificado por diálise. Para este propósito a mistura de reação foi enchida em um cassete de diálise slide- a-lyzer (3 a 12 ml, MWCO: 2.000 Da, Thermo Fisher) e dialisada contra água por 72 horas. A água foi trocada duas vezes por dia. Depois da diálise, o polímero purificado foi liofilizado.
[00207] 10 mg do PPI modificado com ácido succínico, liofilizado, foram diluídos em 2 ml de tampão de reação contendo 50 mM de MES, pH 6,0. 0,776 g de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (100eq./grupo carboxila, Sigma Aldrich) foram diluídos em 2 ml do mesmo tampão. Considerando que o oligo(alquileno amina) foi adquirido como base livre, o pH foi reajustado a pH 6,0 através da adição às gotas de HCl a 32%. A polipropilenimina e a solução de oligo(alquileno amina) solução foram misturadas. Para iniciar a reação, um excesso molar de 10 vezes de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, Sigma Aldrich, diluído em 4 ml de tampão de reação) por grupo carboxila foi adicionado. O volume final foi ajustado a 10 ml. A mistura foi incubada por 5 horas na temperatura ambiente em um agitador de topo. O produto foi purificado por diálise. Para este propósito a mistura de reação foi enchida em um cassete de diálise slide-a- lyzer (3 a 12 ml, MWCO: 3.500 Da, Thermo Fisher) e dialisada contra água por 72 horas. a água foi trocada duas vezes por dia. Depois da diálise, o polímero purificado foi liofilizado.
[00208] Sob as mesmas condições, os polímeros listados na seguinte tabela 4 foram sintetizados e testados: Tabela 4: Lista de polímeros modificados com oligo(alquileno amina), sintetizados com base em poli(alilamina).
Figure img0025
Exemplo de produção VII: Síntese de lipoides com base em N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina e 1-bromodecano
[00209] 100 mg de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (0,623 μmol) foram misturados com 10 ml de tetra-hidrofurano (THF). 815,2 μl N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) e 690,1 mg de 1-bromodecano (3,12 μmol, de (N-1) eq. onde N é 2 x a quantidade de aminas primárias mais 1 x a quantidade de aminas secundárias por oligo(alquileno amina)) e misturados por 22 horas na temperatura ambiente sob agitação constante. O produto foi precipitado duas vezes em n-hexano gelado e dissolvido em DCM. Os solventes foram removidos por evaporação a 60°C. O lipoide resultante foi diluído em etanol em uma concentração de 50 mg/ml e armazenado a 4°C.
Exemplo de produção VIII: Síntese de lipoides com base em N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina e N-dodecil acrilamida
[00210] 100 mg de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (0,623 μmol) foram misturados com 746,9 mg de N-dodecil acrilamida (3,12 μmol, (N-1) eq. onde N é 2 x a quantidade de amina primária mais 1 x a quantidade de amina secundária por oligo(alquileno amina)) e misturados por 192 horas a 90°C sob agitação constante. O lipoide resultante foi diluído em etanol em uma concentração de 50 mg/ml e armazenado a 4°C.
Exemplo de produção IX: Síntese de lipoides com base em N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina e acrilato de dodecila
[00211] 100 mg de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (0,623 μmol) foram misturados com 750 mg de acrilato de dodecila (3,12 μmol, (N- 1) eq. onde N é 2 x a quantidade de amina primária mais 1x a quantidade de amina secundária por oligo(alquileno amina)) e misturados por 22 horas a 90°C sob agitação constante. O lipoide resultante foi diluído em etanol em uma concentração de 50 mg/ ml e armazenado a 4°C.
Exemplo de produção X: Síntese de lipoides com base em N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina e 1,2-epoxidodecano
[00212] 100 mg de N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (0,623 mmol) foram misturados com 575,07 mg de 1,2-epoxidodecano (3,12 mmol, (N-1) eq. onde N é 2 x a quantidade de amina primária mais 1 x a quantidade de amina secundária por oligo(alquileno amina)) e misturados por 96 horas a 80°C sob agitação constante. O lipoide resultante foi diluído em etanol em uma concentração de 50 mg/ ml e armazenado a 4°C.
Exemplo 1
[00213] Teste dos polímeros catiônicos na sua capacidade de transportar mRNA em diferentes linhas celulares.
Materiais e Métodos Formação de Poliplexo:
[00214] Parta a transfecção in vitro, poliplexos foram formados em um volume de 44 μl. 22 μl de água para injeção contendo 1100 ng de mRNA (mRNA quimicamente modificado compreendendo 25% de 5-metilcitidina e 2-tiouridina, respectivamente) que codifica a luciferase de vaga-lume foram misturados com 22 μl de água para injeção contendo a quantidade desejada de polímero. A razão de polímero para RNA foi definida como nitrogênio polimérico por grupo fosfato de ácido nucleico (N/P) e foi testada usando quantidades constantes de ácido nucleico. Depois de misturar o ácido nucleico com o polímero, as amostras foram incubadas por 30 min na temperatura ambiente e usadas para transfecção.
Transfecção in vitro do poliplexos:
[00215] Os polímeros foram testados quanto a eficiência de transfecção em 2 linhas celulares diferentes (NIH3T3 e A549). 24 horas antes do tratamento, 5.000 células (NIH3T3) ou 7.000 células (A549) em 100 μl de meio foram semeadas em um poço de uma placa de 96 poços. No dia da transfecção, os poliplexos foram formados como descrito. Para testar diferentes quantidades de mRNA, uma série de diluição foi realizada misturando 50% da solução de poliplexo com a mesma quantidade de meio (sem FCS), fazendo com esta solução realize uma etapa de diluição adicional similar, etc. Até uma concentração final de 62,5 ng/20 μl ser atingida. 20 μl de cada etapa de diluição foram adicionados às células sem troca de meio. 24 horas depois da transfecção, o meio foi removido. As células foram lisadas pela adição de 100 μl de tampão de lise (25 mM de Tris HCl, 0,1% de TritonX 100, pH 7,8) e incubadas por 20 minutos na temperatura ambiente. 80 μl do lisado foram enchidos em um recipiente de uma placa branca de 96 poços e usados quanto a medição da atividade de luciferase em um Wallac Victor2 (Perkin Elmer). Para este propósito 100 μl do reagente do ensaio de luciferase (0,5 mM D-luciferina, 0,3 mM de Coenzima A, 33 mM DTT, 0,5 mM de ATP, 1 mM de carbonato de magnésio, 2,7 mM de sulfato de magnésio, 0,1 mM de EDTA, 20 mM de tricina) foram adicionados e a quimioluminescência foi determinada. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Resultados
[00216] Como mostrado na figura 1, os níveis de expressão de luciferase variam extremamente entre os polímeros modificados diferentes. Os níveis de transfecção mais eficientes nos tipos de célula podem ser obtidos usando PAA8k-(2-3-2) ou PAA8k-(3-2-3), ao contrário, os polímeros modificados contendo cadeias laterais de oligo(alquileno amina) onde uma das cadeias de alquila é substituída ((2-2-2) e (3-3-3)) ou removida (2-2), a eficiência é drasticamente reduzida em um fator de 10 a 1000. O alongamento de todas as cadeias alquila no oligo(alquileno amina) (3-4-3) também reduz a eficiência em um fator de 100.
Exemplo 2
[00217] Formação de complexo e capacidade de ligação de mRNA de PAA8k modificado com (2-3-2) e (3-2-3).
Materiais e Métodos Ensaio de migração e em gel:
[00218] Os poliplexos foram formados como descrito no exemplo 1 a N/P 1, 2, 4, 8 e 12. Depois da incubação, 5 μl da amostra foram misturados com 5 μl de 2 x de corante de carga de RNA (Fermentas) incubados por 10 minutos a 70°C e carregados em um gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio. A migração em gel foi realizada em um tampão de TBE a 150V por 30 minutos. Os ácidos nucleicos migrados foram visualizados pela absorção UV a 260 nm.
Ensaio de RiboGreen:
[00219] Os poliplexos foram formados como descrito no exemplo 1 a N/P 1, 2, 4, 8 e 12. Depois da incubação, 2 μl de amostra foram misturados com 148 μl de água e 50 μl de solução de RiboGreen (1:200, Kit de Ensaio de RNA QuantiT Ribogreen, Invitrogen) em uma placa branca de 96 poços. As amostras foram incubadas por 5 minutos na temperatura ambiente sob exclusão de luz e a fluorescência foi medida usando um Wallac Victor2 (Perkin Elmer, 1s, Ex.: 485nm, Em.: 535nm).
Resultados
[00220] A capacidade dos polímeros de interagir com ácidos nucleicos para complexos estáveis é uma característica crítica para um sistema de transporte eficiente. A interação dos polímeros modificados com mRNA foi analisada por intermédio da migração de gel (figura 2) e ensaio de RiboGreen (figura 3). Quando o polímero é capaz de interagir com o ácido nucleico, formando complexos estáveis, isto leva às partículas de tamanho nano e à inversão de carga. Ambos efeitos resultam em uma capacidade de migração impedida durante a eletroforese em gel de agarose. Como mostrado na figura 2, PAA8k modificado com (2-3-2) ou (3-2-3) leva a uma ausência/forte redução do mRNA livre, se comparado ao controle sem polímero (N/P 0), indicando uma interação forte. Esta ligação é tão eficiente quanto com o PEI ramificado padrão ouro (brPEI).
[00221] Estes dados podem ser confirmados usando o ensaio de RiboGreen. Neste ensaio, uma eficácia de ligação aumentada resulta em um sinal de fluorescência reduzido. Como mostrado na figura 3, a redução do sinal de fluorescência é para PAA8k-(2-3-2) e -(3-2-3) tão forte quanto para brPEI. Deste modo, os complexos com uma estabilidade similar são gerados.
Exemplo 3 Eficiência de transfecção é independente da estrutura polimérica Materiais e Métodos
[00222] A formação do poliplexo foi realizada de acordo com o exemplo 1.
Transfecção in vitro dos poliplexos
[00223] Para a transfecção in vitro e o teste de eficiência dos poliplexos NIH3T3, células foram usadas. 24 horas antes do tratamento 5.000 células em 100 μl de meio contendo 10% de FCS foram semeadas em um de poço de uma placa de 96 poços. No dia da transfecção, o meio foi trocado contra 100 μl de meio sem FCS. Os poliplexos foram formados como descrito. Para testar diferentes quantidades de mRNA, 20 μl (500 ng), 10 μl (250 ng), 5 μl (125 ng) e 2,5 μl (62,5 ng) foram adicionados ao meio. Depois de 4 horas de incubação a 37°C e 5% de CO2, o meio foi substituído por um meio fresco contendo 10% de FCS. 24 horas depois da transfecção, o meio foi removido. As células foram lisadas e analisadas como descrito no exemplo 1.
Resultados
[00224] Para confirmar que a capacidade de transportar ácidos nucleicos nas células usando polímeros modificados com (2-3-2) é independente da estrutura, diferentes tipos de polímeros (além do poli(ácido acrílico), 8.000 Da exemplo 1) fora modificados com (2-3-2) sob as condições descritas (tabela 1). Os resultados mostram que diferentes tipos de polímeros estruturais (figura 4) bem como diferentes extensões de cadeia (figura 5) levam à expressão de gene repórter significante, quando modificados com o oligo(alquileno amina) (2-3-2).
Exemplo 4
[00225] Validação da toxicidade celular dos polímeros modificados com diferentes tipos de oligo(alquileno amina)s.
Materiais e Métodos
[00226] As transfecções foram realizadas de acordo com o exemplo 3. A determinação das células vivas foi realizada usando Ensaio de Proliferação de células TACS MTT (Trevigen). Vinte e quatro horas depois da transfecção, o meio foi trocado contra 100 μl de meio fresco. Depois da adição de 10 μl de células reagentes MTT foram incubadas por 4 horas a 37°C e com CO2 a 5%. 100 μl de reagente detergente foram adicionados seguido por uma etapa de incubação na temperatura ambiente durante a noite. A leitura foi realizada pela medição de absorção a 570 nm usando um Wallac Victor2 (Perkin Elmer). Os resultados são apresentados como células vivas em % comparado a um controle não tratado.
Resultados
[00227] Como mostrado na figura 6, os polímeros modificados diferentes variam em termos de toxicidade celular. Enquanto as células tratadas com complexos contendo poli(ácido acrílico) modificado com (2-3-2) e (3-2-3) apresentam viabilidade em torno de 100%, (PAA8k-(2-3-2), PAA8k-(3-2-3), PAA20k-(2-3-2), PAA70k-(2-3-2)), outras alterações na cadeia tipo lateral levam a uma forte toxicidade (PAA8k-(3-4-3), PAA8k-(3- 3-3)) comparável ao padrão tóxico (brPEI).
Exemplo 5
[00228] Eficiência do transporte de RNA mensageiro em camundongos.
Materiais e métodos Animais:
[00229] Camundongos fêmeas BALB/c de seis a oito semanas de idade foram obtidos da Janvier, Route Des Chênes SecsBP5, F-53940 Le Genest St. Isle, França, e mantidos sob condições específicas isentas de patógenos. Os camundongos foram aclimatizados ao ambiente da instalação para animais por pelo menos setes dias antes das experiências. Todos os procedimentos animais foram aprovados e controlados pelo comitê ético local e realizados de acordo com as diretrizes da lei alemã de proteção à vida animal.
Formação do poliplexo:
[00230] Os poliplexos foram formulados como segue: mRNA e PAA20k-(2-3-2) foram diluídos em 4,0 ml de água duplamente destilada resultando em concentrações de 500 μg/ml de mRNA e PAA20k-(2-3-2) em concentrações correspondentes a uma N/P de 10, 20, 30 ou 40. A solução de mRNA foi pipetada à solução polimérica, misturada pela pipetagem para cima e para baixo, para produzir uma concentração de mRNA final de 250 μg/ ml. Os complexos foram incubados por 20 minutos na temperatura ambiente antes do uso.
Projeto do dispositivo de aerossol:
[00231] Para o procedimento de nebulização em um dispositivo de corpo inteiro, os camundongos foram colocados em uma caixa plástica de 9,8 x 13,2 x 21,5 cm que pode ser lacrada com uma tampa. Em um lado estreito da caixa, quatro pequenos furos são posicionados como fluxos de aerossol. Através de todo lado estreito oposto, a caixa é conectada por intermédio de uma parte conectora de 2,1 cm de diâmetro a um cilindro de plástico 15,4 cm amplo x 41,5 cm de comprimento. O fundo do cilindro é uniformemente coberto com 150 g de gel de sílica (1 a 3 mm, #85330; Fluka, Suíça) para secar o aerossol que é produzido por um nebulizador de jato (PARI BOY® LC plus, PARI GmbH) conectado à outra terminação do cilindro. (Detalhes descritos em Rudolph et al., J Gene Med. 2005, 7: 59-66).
Medições da atividade de Luc nos pulmões do camundongo usando formação de imagem bioluminescente in vivo:
[00232] Vinte e quatro horas após a administração, os camundongos foram submetidos à eutanásia pelo deslocamento cervical. Depois de abrir o peritôneo por incisões na linha mediana, os pulmões foram dissecados dos animais e borrifados com PBS. Os pulmões foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e homogeneizados no estado congelado. Depois da adição de 400 μl de tampão de lise (250 mM de Tris no pH 7,8, Triton X-100 a 0,1%, Tabletes de Coquetel Inibidor da Protease Completo da Roche) e incubação por 20 min em gelo, a atividade de luciferase no sobrenadante foi medida usando um luminômetro de tubo Lumat LB9507 (EG&G Berthold, Munique, Alemanha).
Resultados
[00233] A experiência mostra que o mRNA é eficientemente expressado nas células pulmonares dos camundongos na liberação de aerossol pulmonar como uma combinação com PAA20k-(2-3-2), indicando que o polímero é capaz de transportar de maneira eficaz o mRNA nas células pulmonares in vivo (conforme a figura 7).
Exemplo 6 Eficiência do transporte de RNA mensageiro e porcos Materiais e Métodos Formação do poliplexo:
[00234] Para a transfecção in vivo, os poliplexos foram formados em um volume de 28 ml. 14 ml de água para injeção contendo 5,83 mg de mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume e 1,17 mg de mRNA que codifica β-galactosidase e 14 ml de água para injeção contendo a quantidade desejada de polímero foram preparados e misturados por intermédio de uma bomba de seringa de dois canais (KDS-210-CE; KD Scientifc). Duas seringas de 20 ml foram enchidas usando a função de retirada do dispositivo. A mistura foi realizada conectando as seringas por intermédio de uma peça em T (Discofix C 3SC, B.Braun) e da função de infusão do dispositivo de mistura. A razão de polímero para mRNA foi definida como nitrogênio polimérico por grupo de fosfato do ácido nucleico grupo (N/P) e testada em N/P 10. Depois de misturar o ácido nucleico com o polímero, as amostras foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente e 24 ml foram usados para a nebulização. O volume restante foi usado para a análise físico-química. O tamanho de partícula o zeta potencial zeta da amostra pura foram determinados usando um Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments).
Procedimento experimental da aplicação de aerossol em porcos:
[00235] A sedação do porco foi iniciada pela pré-medicação com 2 mg/kg de peso corporal de azaperona, 15 mg/kg de peso corporal de cetamina, 0,1 mg/kg de peso corporal de atropina e seguida por uma inserção de uma linha intravenosa à veia auricular lateral. O porco foi anestesiado por injeção intravenosa de 3 a 5 mg/kg de peso corporal de propofol como necessário. A anestesia foi mantida com a infusão intravenosa contínua de 1% de propofol como necessário. Os parâmetros de ventilação foram igualados com dióxido de carbono expiratório final e ajustados se necessário. Os parâmetros da anestesia, respiratórios e cardiovasculares foram continuamente monitorados usando oximetria de pulso, capnografia, sonda de temperatura retal e condições de reflexo. O porco recebeu uma infusão de solução de eletrólitos balanceada a 10 ml/kg/hora. A duração da anestesia foi de aproximadamente 80 a 120 min. O porco foi morto com injeção de bolo de 100 mg/kg de peso corporal de pentobarbital por intermédio da veia da orelha lateral após da sedação depois da aplicação de aerossol estar completa (Nebulizador de malha Aeroneb). Os pulmões foram extirpados e fatiados em aproximadamente 1 cm de espessura, as amostras de tecido foram coletadas de várias regiões do pulmão seguido pela incubação em um meio de cultura celular por 24 horas a 37°C e CO2 a 5% em uma incubadora. Para a medição da atividade de luciferase, amostras de tecido foram incubadas em um banho de meio compreendendo um substrato de D-Luciferina em PBS (100 μg/ ml) a 37°C por 30 minutos e submetidas à formação de imagem bioluminescente de luciferase ex vivo (IVIS 100, Xenogen, Alameda, EUA).
Microscopia eletrônica de transmissão dos poliplexos:
[00236] Para a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) uma gotícula da mistura produzida pela aplicação de aerossol foi usada. A gotícula foi colocada em uma grade (Plano GmbH, Wetzlar). Depois de incubar por 5 minutos, a gotícula foi removida com usando um filtro de papel. A amostra foi tingida com uma solução de acetato de uranila e analisada por intermédio de um microscópio de transmissão de elétrons (Jem 1011, Jeol).
Resultados
[00237] Como mostrado na figura 8 PAA20k-(2-3-2) e mRNA em uma razão de N/P de 10 resultados em complexos com um diâmetro de complexo hidrodinâmico abaixo de 100 nm e uma carga de superfície (potencial zeta) de 40 mV. Ambos os parâmetros variam no mesmo tamanho que os complexos com base em brPEI que já mostraram transportar de maneira eficiente os ácidos nucleicos nas células in vivo. As partículas apresentam uma forma redonda e um tamanho uniforme, quando analisadas por intermédio de TEM (figura 9). Como mostrado na figura 10, estas partículas são capazes de liberar de maneira eficaz o mRNA (que codifica a luciferase de vaga-lume) no tecido pulmonar após a aplicação de aerossol resultando na expressão da proteína alvo. Os níveis de expressão foram comparáveis à nebulização dos poliplexos formados com o brPEI padrão ouro.
Exemplo 7 Estabilidade de liofilização dos complexos Materiais e Métodos Preparação das amostras
[00238] O complexos de PAA20k-(2-3-2)/mRNA (que codificam luciferase de metridia) foram formados como descrito no exemplo 1 em 4 frascos diferentes em N/P 20 em um volume de 1 ml. Um frasco foi usado sem tratamento adicional para transfecção, ao segundo frasco 100 μl de uma solução de trealose a 11% foi adicionada para resultar em um volume final de trealose a 1%. O terceiro frasco foi liofilizado e reidratado em 1 ml de água. O quarto frasco foi tratado com 100 μl de trealose a 11% antes da liofilização e também reidratado em 1 ml de água.
Transfecção:
[00239] 24 horas antes da transfecção, 5.000 células NIH3T3 em 100 μl de meio foram semeadas em uma placa de 96 poços e incubadas a 37°C e CO2 a 5%. No dia da transfecção, o meio foi novamente substituído por 100 μl de meio fresco sem FCS. 20, 10, 5 e 2,5 μl de cada solução de complexo foram adicionados às células em triplicata resultando na transfecção com 500, 250, 125 e 62,5 ng. 24 horas depois da transfecção, o meio foi removido, coletado e substituído por meio fresco. Isto foi repetido depois de 48 horas e 72 horas. O meio coletado foi analisado quanto a atividade de luciferase de metridia. Para este propósito, 50 μl de meio foi enchido em uma placa branca de 96 poços, misturados com 20 μl de solução de coelenterazina (50 μM de coelenterazina em 50 mM de tampão de fosfato de sódio) e o sinal de quimioluminescência foi medido usando um Wallac Victor2 (Perkin Elmer).
Resultados
[00240] Como mostrado na figura 11, os complexos frescos levaram à expressão de luciferase de metridia depois de 24 horas. A expressão permaneceu estável por mais 24 horas e depois diminuiu lentamente. Este efeito não é negativamente influenciado pela adição da trealose, mas resultou em níveis de expressão levemente aumentados. Depois da liofilização, os complexos não tratados não são capazes de transfectar as células, resultando na ausência de expressão de proteína repórter. Ao contrário, a adição de trealose conserva o complexo e a eficiência de transfecção resultante.
Exemplo 8
[00241] Uso de PAA8k-(2-3-2) e PAA8k-(3-2-3) como sistema de transporte para DNA plasmídico.
Materiais e Métodos Formação do poliplexo:
[00242] Os poliplexos foram formados como descrito no exemplo 1 usando DNA plasmídico (pCMVLuc, Plasmid Factory) que codifica a luciferase de vaga-lume ao invés do mRNA.
Transfecção in vitro usando os poliplexos:
[00243] Os experimentos de transfecção foram realizados como descrito no exemplo 3.
Resultados
[00244] Neste experimento, a eficácia dos polímeros de (poli(ácido acrílico) modificados por N,N-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (2-3-2) no transporte de DNA e expressão de proteína resultante, foi analisada em comparação ao PEI ramificado padrão ouro (brPEI, figura 12). Os resultados mostram claramente que a transfecção de células NIH3T3 com complexos compostos de pDNA e polímeros modificados por oligo(alquileno amina) (23-2) e (3-2-3) levam a um aumento significante na expressão da proteína repórter. O nível de expressão é ainda maior como do padrão de ouro.
Exemplo 9
[00245] Uso de PAA20k-(2-3-2) como sistema de transporte para siRNA para induzir a interferência de RNA.
Materiais e Métodos
[00246] Os complexos foram formados como descrito no exemplo 1 usando GL3-Luc siRNA (Qiagen). Para a titulação da quantidade de siRNA, os complexos foram diluídos às etapas depois de incubação de 30 min na temperatura ambiente. Para este propósito, 22 μl de solução de complexo foram misturadas com 22 μl de meio sem FCS. 22 μl desta diluição foram novamente misturadas com 22 μl de meio sem FCS. Esta série de diluição foi repetida até uma concentração de siRNA de 7,8 ng por 20 μl ser obtida. 20 μl de cada etapa de diluição foram usados para a transfecção como descrito sob o exemplo 1 usando células HeLa que expressam estavelmente luciferase de vaga-lume (HeLa-Luc). Como controle para a especificidade de uma interferência de RNA com base na infra regulação da expressão de luciferase, um siRNA de controle, que não influencia a expressão celular (GFP22- siRNA; Qiagen) foi usado para a transfecção sob as mesmas condições. Os resultados são mostrados como expressão de luciferase relativa se comparado às células de controle não tratadas.
Resultados
[00247] Como mostrado na figura 13, o complexo de GL3-Luc-siRNA (siLuc) e PAA20k-(2-3-2) leva à infra regulação da expressão de luciferase. Este efeito é dependente da dose (efeito reduzido em quantidades de siRNA menores) e específico (nenhum efeito no siRNA não específico (siGFP)). Nas razões de N/P maiores, um efeito não especificado adicional pode ser observado como indicado pelo sinal diminuído doas células tratadas com siGFP.
Exemplo 10 Eficiência de transporte de mRNA benéfica das estruturas de lipoide com base em oligo(alquileno amina) (2-3-2) Material e Métodos Formação do complexo de Lipoide/mRNA
[00248] Os lipoides foram sintetizados e diluídos como descrito no exemplo de produção IV. Para a transfecção, 250 ng de mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume em 50 μl de água foram misturados sob condições otimizadas com 4.000 ng de lipoide em 50 μl de água resultando em uma razão de p/p (lipoide em peso/mRNA em peso) de 16. Depois de 30 minutos de incubação na temperatura ambiente, as amostras foram usadas para a transfecção.
Transfecção in vitro usando complexos de lipoide/mRNA
[00249] 24 horas antes do tratamento 5.000 células NIH3T3 em 100 μl de meio foram semeadas em um recipiente de uma placa de 96 poços. No dia, os poliplexos de transfecção foram formados como descrito. Para testar diferentes quantidades de mRNA, uma série de diluição foi realizada misturando 50% da solução de complexo com a mesma quantidade de meio (sem FCS), levando esta solução a realizar uma etapa de diluição adicional similar, etc. até uma concentração final de 15,6ng/50 μl ser atingida. Antes da transfecção, o meio foi removido a partir das células e substituído por 100 μl de meio sem FCS. 50 μl de cada etapa de diluição foram adicionados às células e incubadas por 4 horas a 37°C e 5% de CO2. Depois disto, o meio é novamente substituído por um meio fresco contendo 10% de FCS. 24 horas depois da transfecção, o meio foi removido, as células foram lisadas e os lisados foram analisados quanto a atividade da proteína repórter como descrito no exemplo 1.
Resultados
[00250] Como mostrado na figura 14, os lipoides com base na estrutura (2-3-2) levam a um maior nível de expressão da luciferase de vaga-lume do que as estruturas similares com base em (2-2-2) ou (3-3-3). Este efeito pôde ser demonstrado independentemente da cadeia de alquila (C12 ou C14) ligada. Conforme a atividade da luciferase de vaga-lume se correlaciona com seu nível de expressão na célula, e por esta razão, à eficiência do transporte de mRNA na célula, estes resultados mostram que os lipoides com base em (2-3-2) transportam o mRNA mais eficiente nas células in vitro.
Exemplo 11 Eficiência do transporte de RNA mensageiro das formulações de lipoide em camundongos depois da administração intravenosa Materiais e métodos Animais:
[00251] Comundongos fêmeas BALB/c de seis a oito semanas de idade foram obtidos da Janvier, Route Des Chênes SecsBP5, F-53940 Le Genest St. Isle, França, e mantidos sob condições específicas isentas de patógenos. Os camundongos foram aclimatizados ao ambiente da instalação animal por pelo menos sete dias antes das experiências. Todos os procedimentos animais foram provados e controlados pelo comitê e ética local e realizados de acordo com as diretrizes da lei alemã de proteção da vida animal.
Formulações lipoides:
[00252] Os lipoides foram formulados com mRNA como segue: C12- (2-3-2), DOPE, Chol e DSPE-PEG2k (razão em peso de 3,6:0,18:0,76:1) foram dissolvidos em etanol e rapidamente injetados em uma solução tamponada de citrato (10 mM de ácido cítrico, 150 mM de NaCl, pH = 4,5) compreendendo luciferase quimicamente modificada que codifica mRNA de vaga-lume em uma razão em peso de lipídeo/mRNA de 10,5 para produzir uma concentração de etanol final de 20% e dialisada contra água. Os complexos de lipoide/mRNA resultantes resultaram em nanopartículas positivamente carregadas (92,6 ± 0,7 nm; 21,0 ± 0,2 mV) e foram injetados intravenosamente na veia da cauda dos camundongos restringidos. Em uma segunda experiência, os complexos de lipoide/mRNA foram ajustados ao PBS antes da injeção intravenosa que resultou em nanopartículas quase descarregadas (91,5 ± 0,6 nm; -0,7 ± 0,2mV).
Medição da atividade de Luc em camundongos usando formação de imagem bioluminescente in vivo:
[00253] Vinte e quatro horas após a administração, os camundongos foram anestesiados através da injeção intraperitoneal de medetomidina (11,5 μg/kg de BW), midazolama (115 μg/kg de BW) e fentanila (1,15 μg/kg de BW). Substrato de D-luciferina (3 mg/100 μl de PBS por camundongo) foi aplicado por intermédio da injeção intraperitoneal. A bioluminescência foi medida 10 minutos depois, usando um Sistema de Formação de imagem IVIS 100 (Xenogen, Alameda, EUA) e os ajustes de câmera: Bin(HS), campo de visão 10, f1 f-stop, binning de alta resolução e tempo de exposição de 5 minutos. O sinal foi quantificado e analisado usando o Suporte Lógico Living Image versão 2.50 (Xenogen, Alameda, EUA).
Resultados
[00254] A experiência mostra que o mRNA é eficazmente expressado na região abdominal dos camundongos somente quando os complexos de lipoide/mRNA foram formulados em PBS carregando uma carga quase neutra, mas não quando formulada em água (conforme a figura 16).
Exemplo 12 Eficiência do transporte de RNA mensageiro das formulações de lipoide em camundongos aos diferentes órgãos depois da administração intravenosa Materiais e métodos Animais:
[00255] Comundongos fêmeas BALB/c de seis a oito semanas de idade foram obtidos de Janvier, Route Des Chênes SecsBP5, F-53940 Le Genest St. Isle, França, e mantidos sob condições específicas isentas de patógenos. Os camundongos foram aclimatizados ao ambiente da instalação animal por pelo menos sete dias antes das experiências. Todos os procedimentos animais foram aprovados e controlados pelo comitê de ética local e realizados de acordo com as diretrizes da lei alemã de proteção da vida animal.
Formulações lipoides:
[00256] Os lipoides foram formulados com mRNA como segue: Lipoide, DOPE, Chol e DMPE-PEG2k (razão molar de 8:6:5:1) foram dissolvidos em etanol e rapidamente injetados em uma solução de ácido cítrico tamponada com citrato (10 mM de ácido cítrico, 150 mM de NaCl, pH = 4,5) compreendendo luciferase quimicamente modificada que codifica mRNA de vaga-lume em uma razão de N/P de 15 para produzir uma concentração de etanol final de 20% e dialisados contra água. Os complexos de lipoide/mRNA resultantes, resultaram em nanopartículas positivamente carregadas. Os complexos de lipoide/mRNA foram ajustados a PBS antes da injeção intravenosa que resultou em nanopartículas quase descarregadas (ver a Tabela 5). TABELA 5
Figure img0026
Medição da atividade de Luc em camundongos usando formação de imagem bioluminescente in vivo:
[00257] Vinte e quatro horas após a administração, os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de medetomidina (11,5 μg/kg de BW), midazolama (115 μg/kg de BW) e fentanila (1,15 μg/kg de BW). O substrato de D-luciferina (3 mg/100 μl de PBS por camundongo) foi aplicado por intermédio da injeção intraperitoneal. A bioluminescência foi medida 10 minutos depois, usando um Sistema de Formação de imagem IVIS 100 (Xenogen, Alameda, EUA) e os ajustes de câmera: Bin(HR), campo de visão 10, f1 f-stop, binning de alta resolução e tempo de exposição de 30 segundos. O sinal foi quantificado e analisado usando o Suporte Lógico Living Image versão 2,50 (Xenogen, Alameda, EUA). Subsequentemente, os órgãos foram dissecados e, de novo, separadamente visualizados.
Resultados
[00258] A experiência mostra que o mRNA é eficazmente expressado na região abdominal dos camundongos e aumentando com extensão decrescente da cadeia de alcano (conforme a figura 17 A, B). Além disso, a experiência mostrou que o mRNA liberalmente ao fígado diminuiu com a extensão crescente da cadeia de alcano dos lipoides (C16<C14<C12) e foi dificilmente detectável para C16. A expressão de luciferase no baço foi a mais alta para C14. Algumas expressões de luciferase foram observadas nos pulmões, mas nenhuma foi observada no coração, rim, estômago ou cérebro (conforme a figura 18 A, B).
Exemplo 13
[00259] Comparação da eficiência de diferentes reagentes de transfecção na sua capacidade de liberar pDNA e mRNA.
Materiais e Métodos Formação do poliplexo:
[00260] Os poliplexos foram formados como descrito no exemplo 1 usando DNA plasmídico (pCMVLuc, Plasmid Factory) que codifica a luciferase de vaga-lume ou mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume. Transfecção in vitro usando poliplexos:
[00261] Os experimentos de transfecção foram realizados como descrito no exemplo 3
Resultados
[00262] O experimento foi realizado para demonstrar, se a eficiência de transfecção é exclusivamente relacionada ao meio de transfecção (polímero/lipoide) ou também ao tipo de ácido nucleico. Os resultados (figura 19) mostram claramente que os reagentes de transfecção que transportam o pDNA de maneira eficaz, não são necessariamente veículos eficientes para o transporte de mRNA. Deste modo, um sistema carregador com uma alta eficiência de transfecção para o pDNA não permite um prognóstico eficiente de mRNA.
Exemplo 14:
[00263] Comparação da eficiência de transfecção de PAA8k, modificado com N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (2-3-2) ou N,N‘- Bis(2-aminoetil)-1,3-butanodiamina (2-4-2).
Materiais e Métodos Formação do poliplexo:
[00264] Os poliplexos foram formados como descrito no Exemplo 1.
Transfecção in vitro usando poliplexos:
[00265] Os experimentos de transfecção foram realizados como descrito no Exemplo 3
Resultados
[00266] Para investigar mais se a eficiência dos polímeros modificados com (2-3-2) é muito relacionada à estrutura (2-3-2) ou mostra eficiência similar para qualquer outra estrutura 2-X-2 com X>2, PAA8k foi modificado com N,N’-Bis(2-aminoetil)-1,3-butanodiamina (2-4-2). A comparação com PAA8k-(2-3-2) com PAA8k-(2-4-2) (figura 20) mostra que ambos os polímeros resultam em altos níveis de expressão de luciferase quase idênticos depois da transfecção do mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume. Isto demonstra que um polímero modificado com a estrutura (2-X-2) com X>2 em geral resultada em um reagente de transfecção com uma eficiência de transporte de mRNA melhorada se comparado à modificação com outras oligo(alquila amina)s.
Exemplo 15 Microscópio eletrônico de transmissão das formulações de lipoide Materiais e métodos Formulação de lipoide:
[00267] Os lipoides foram formulados com mRNA como segue: C10- (2-3-2), 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ou 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), colesterol e 1,2-distearoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietileno glicol)-2000] (DSPE- PEG2k) ou 1,2-dipalmitoil-sn-glicerol, metoxipolietileno Glicol (DPG- PEG2k) (razão molar de 9:6:5:1) foram dissolvidos em etanol e rapidamente injetados em uma solução tamponada com citrato (10 mM de ácido cítrico, 150 mM de NaCl, pH 4,5) compreendendo luciferase quimicamente modificada que codifica mRNA de vaga-lume em uma razão molar de lipídeo-nitrogênio/mRNA-fosfato de 17 para produzir uma concentração de etanol final de 20% e dialisados contra água por 24 horas.
Microscópio eletrônico de transmissão:
[00268] Para a análise de tamanho, TEM (Microscopia de elétron de transmissão) foi usada com ampliações de 10.000 e 60.000. Como uma primeira etapa, as placas com base em cobre (Plano GmbH; S162-3) foram limpas com plasma. Depois deste tratamento, 8 μl da formulação de lipoide foram trazidos em contato com uma placa de cobre por 3 minutos. Depois de remover a gotícula da formulação de lipoide, a amostra foi tingida trazendo a placa de cobre carregada com o lipoide em contato com uma gota de 8 μl de solução de acetato de uranila duas vezes por 30 segundos. Depois de cada etapa, os líquidos foram removidos retirando-se com um mata borrão. Finalmente as placas carregadoras são secadas na temperatura ambiente por outros 30 minutos e analisadas por intermédio de um Jem1011 (Jeol).
Resultados
[00269] As fotos TEM (Figura 21) mostram que as formulações de lipoide formadas são partículas esféricas com uma distribuição de tamanho homogênea (visão geral). Na foto ampliada, o tamanho destas partículas pode ser estimado de 60 a 80 nm.
Exemplo 16
[00270] Eficácia do transporte de mRNA de C10-(2-3-2) sintetizado por intermédio de um haleto de acila.
Materiais e métodos Síntese:
[00271] A síntese de C10-(2-3-2) foi realizada como descrito sob o exemplo de produção VII.
Formulação de lipoide:
[00272] Os complexos de lipoide/mRNA foram formados como descrito no exemplo 15 usando C10-(2-3-2), 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC), colesterol, 1,2-Dipalmitoil-sn-glicerol-metoxipolietileno Glicol (DPG-PEG2k) em uma razão molar de 9:6:5:1 e mRNA que codificam a luciferase de vaga-lume em N/P de 17.
Transfecção in vitro:
[00273] 24 horas antes do tratamento 5.000 células NIH3T3 em 100 μl de meio foram semeadas em um poço de uma placa de 96 poços. No dia da transfecção, as formulações de lipoide foram formadas como descrito e ajustadas a 1 x PBS com uma solução de 10 x de PBS. As formulações de lipoide foram diluídas para resultar em 500 ng, 250 ng ou 125 ng em 50 μl, adicionadas às células e incubadas por 24 horas a 37°C e 5% de CO2. 24 horas depois da transfecção, o meio foi removido. As células foram lisadas e os lisados foram analisados quanto a atividade de proteína repórter como descrito no exemplo 1.
Resultados
[00274] Como mostrado na figura 22, C10-(2-3-2) sintetizado por intermédio de um haleto de acila é capaz de transportar o mRNA em uma célula levando à expressão da proteína de luciferase repórter.
Exemplo 17
[00275] Eficiência do transporte de mRNA de C12-(2-3-2) sintetizado por intermédio de N-dodecilacrilamida.
Materiais e métodos Síntese:
[00276] A Síntese de C12-(2-3-2) foi realizada como descrito sob o exemplo de produção VIII.
Formulação de lipoide:
[00277] Os complexos de lipoide/mRNA foram formados como descrito no exemplo 15 usando C12-(2-3-2), 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC), colesterol, 1,2-dipalmitoil-sn-glicerol-metoxipolietileno Glicol (DPG-PEG2k) em uma razão molar de 9:6:5:1 e mRNA que codificam a luciferase de vaga-lume em N/P de 17.
Transfecção in vitro:
[00278] Os experimentos de transfecção foram realizados como descrito no exemplo 16 usando uma dose de mRNA de 500, 250 ou 125 ng por poço.
Resultados
[00279] Como mostrado na figura 23, C12-(2-3-2) sintetizado por intermédio de N-dodecil acrilamida é capaz de transportar o mRNA em uma célula levando à expressão do gene repórter de luciferase.
Exemplo 18
[00280] Eficiência do transporte de mRNA de C12-(2-3-2) sintetizado por intermédio de dodecil-acrilato.
Materiais e métodos:
[00281] A Síntese de C12-(2-3-2) foi realizada como descrito sob o exemplo de produção IX.
Formulação de lipoide:
[00282] Os complexos de lipoide/mRNA foram formados como descrito no exemplo 15 usando C12-(2-3-2), 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC), colesterol, 1,2-dipalmitoil-sn-glicerol-metoxipolietileno glicol (DPG-PEG2k) em uma razão molar de 9:6:5:1 e mRNA que codificam a luciferase de vaga-lume em N/P de 17.
Transfecção in vitro:
[00283] Os experimentos de transfecção foram realizados como descrito no exemplo 16 usando uma dose de mRNA de 500, 250 ou 125 ng por poço.
Resultados
[00284] Como mostrado na figura 24, C12-(2-3-2) sintetizado por intermédio de acrilato de dodecila é capaz de transportar o mRNA em uma célula levando à expressão da proteína repórter de luciferase.
Exemplo 19 Eficiência do transporte de mRNA de C12-(2-3-2) formulado usando diferentes lipídeos auxiliares e diferentes razões de lipoides para mRNA (N/P) Materiais e métodos Formulação de lipoide:
[00285] Os complexos de lipoide/mRNA foram formados como descrito no exemplo 15 usando C12-(2-3-2) em combinação com 1,2- dimiristoil-sn-glicerol-metoxipolietileno glicol (D MG-PEG2k) como PEG- lipídeo, DOPE ou DSPC como lipídeos auxiliares e razão de N/P de 17 ou 8.
Transfecção in vitro:
[00286] Os experimentos de transfecção foram realizados como descrito no exemplo 16 usando uma dose de mRNA de 250 ng por poço.
Resultados
[00287] Como mostrado na figura 25, C12-(2-3-2) é capaz de transportar mRNA em uma célula levando à expressão do gene repórter da luciferase em combinação com diferentes lipídeos auxiliares (DOPE, DSPC) e em diferentes razões de N/P (17 ou 8). Deste modo, C12-(2-3-2) eficientemente transporta o RNA em células independentes do lipídeo auxiliar e da razão de N/P.
Exemplo 20 Eficiência melhorada do transporte de mRNA em camundongos depois da administração intravenosa da formulação de lipoide com C12-(2-3-2) comparado a C12-(2-2-2) e C12-(3-3-3) Materiais e métodos Animais:
[00288] Como descrito no exemplo 11
Formulações de lipoide:
[00289] Como descrito no exemplo 15, usando C12-(2-3-2), 1,2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol, 1,2-dimiristoil-sn- glicerol-metoxipolietileno glicol (D MG-PEG2k) e mRNA que codificam a luciferase de vaga-lume em N/P de 17. Medição da atividade de Luc em camundongos usando formação de imagem bioluminescente in
vivo:
[00290] Como descrito no exemplo 11, anestesiar os animais 6 horas depois da administração.
Resultados
[00291] Como mostrado na figura 26, a formulação de lipoide onde C12-(2-3-2) é incluído leva à expressão do gene repórter aumentada em camundongos se comparado a C12-(3-3-3) e C12-(2-2-2). Isto demonstra a capacidade benéfica do mRNA de C12-(2-3-2).
Exemplo 21
[00292] Comparação da eficiência do transporte de mRNA de oligo(alquileno amina) (2-3-2) saturado com diferentes quantidades de cadeia de alquila C12.
Materiais e métodos: Formulação de lipoide:
[00293] Como descrito no exemplo 15, sem a diálise usando oligo(alquila amina) (2-3-2) com diferentes graus e posições de modificação (ver figura 27 A, SynCom).
Transfecção in vitro:
[00294] Os experimentos de transfecção foram realizados como descrito no exemplo 16 usando uma dose de mRNA de 250 ng por poço.
Resultados
[00295] Como mostrado na figura 27 A, três diferentes versões de C12- (2-3-2) foram sintetizadas para avaliar a influência da quantidade e posição das cadeias de alquila por oligo(alquileno amina) na capacidade de transporte de mRNA. A eficiência de transfecção (figura 27 B) não mostra diferenças na expressão da proteína repórter provando que nenhuma diferença na eficiência do transporte de mRNA pode ser observada. Deste modo, diferentes tipos de formulações de lipoide C12-(2-3-2) transportam mRNA com a mesma eficiência.
Exemplo 22 Liofilização das formulações de lipoide. Materiais e métodos Formulação de lipoide:
[00296] Como descrito no exemplo 15.
Processo de liofilização:
[00297] As soluções protetoras de trealose, sacarose e lactose foram preparadas em água (c: 20% p/v). As diluições em série com um fator de 2 foram preparadas resultando em soluções protetivas de 20% até 0,625% (p/v). A estas soluções, o mesmo volume de formulação de lipoide foi adicionado e misturado através da pipetação. As soluções foram congeladas em nitrogênio líquido e liofilizadas usando um sigma alfa 1-4 (Martin Christ). Depois da liofilização, as partículas foram recolocadas em suspensão no mesmo volume de água e usadas para análise. Como controle, os lipoplexos foram misturados com as soluções protetivas nas mesmas concentrações sem congelamento e liofilização.
Transfecção in vitro:
[00298] Como descrito no exemplo 15, usando 233 ng de mRNA por poço.
Medição de tamanho:
[00299] O diâmetro hidrodinâmico das partículas foi medido usando um ZetaSier Nano ZS (Malvern).
Resultados
[00300] Como mostrado na figura 28, todos os açúcares testados foram capazes de manter o tamanho de partícula e a eficiência de transfecção em diferentes concentrações. Em comparação, as partículas sem protetor (0%) se tornam menos eficientes e aumentam muito em tamanho devido aos processos de agregação.
Exemplo 23 Transporte de RNA em tecido mamífero ex vivo Material e métodos Formulação de lipoide:
[00301] Como descrito no exemplo 15, usando C12-(2-3-2), DOPE, Colesterol, DPG-PEG2k e mRNA que codificam a luciferase de vaga-lume em uma razão de N/P de 17 sem diálise.
Tratamento das amostras de tecido:
[00302] As partes de tecido (músculo, gordura, artéria ou pulmões; ver a tabela) de aproximadamente 1cm3 foram retiradas de um animal recentemente abatido (porco ou ovelha; ver a tabela) e lavadas em PBS. Em cada parte de tecido, 100 μl da formulação de lipoide contendo 10μg de RNA ou 200 μl de formulação de lipoide contendo 20μg de RNA foram injetados (ver a tabela). No caso do tratamento da artéria de ovelha, as formulações de lipoide foram injetadas no lúmen do vaso que foi fechado em ambas as extremidades por intermédio de um fio. O tecido foi cultivado por 24 horas em um meio de cultura celular (DMEM) contendo 10% de FCS.
Análise da expressão de luciferase:
[00303] Depois de 24 horas, as amostras foram incubadas em PBS contendo luciferina (100μg/ml) por 30 minutos. A atividade de luciferase foi medida usando um sistema de visualização in vivo (IVIS, Perkin Elmer).
Resultados
[00304] Como mostrado na figura 29, C12-(2-3-2) permitiu o transporte de mRNA que codifica a luciferase de vaga-lume nas células de uma variedade de diferentes tecidos de diferentes espécies, resultando na expressão da luciferase. Ao contrário, as amostras não tratadas (D, E, parte inferior do tecido) não mostram um sinal de imagem.
Exemplo 24 Expressão da Enzima 2 (ACE-2) que converte Angiotensina I in vitro Formulação de lipoide:
[00305] Como descrito no exemplo 15 usando C12-(2-3-2), DOPE, colesterol, DPG-PEG2k sem a adição de mRNA, que resultou em lipoplexos vazios. A formulação de complexos de mRNA de lipoide foi realizada por intermédio da pós-carga. Para este propósito, 1 μl de mRNA que codifica ACE-2 (1 mg/ ml) foi misturado com 4 μl da solução contendo lipoplexo e incubado por 10 minutos na temperatura ambiente.
Transfecção in vitro das células:
[00306] Para a transfecção in vitro, 300.000 células HepG2 foram semeadas em um poço de uma placa de 6 poços 24 horas antes do tratamento em 2 ml de meio contendo 10% de FCS. No dia da transfecção, o meio foi trocado contra 2 ml de meio fresco. As formulações de lipoide foram preparadas como descrito e 2,5 μl contendo 500 ng de mRNA foram adicionados a cada poço. Nos poços de controle, a mesma quantidade de formulação de lipoide foi injetada sem a adição de mRNA durante a formulação.
Detecção da expressão de ACE-2 por western blot:
[00307] 24h depois do meio de transfecção ser removido e as células lavadas com 1 ml de PBS, as células foram lisadas por 10 minutos em gelo usando 250 μl de tampão de lise (25 mM de Tris-HCl, 0,1% de TritonX, pH 7,4). Depois da raspagem dos lisados, os fragmentos foram removidos por centrifugação por 10min a 14.000 rpm.
[00308] Depois da estimativa da proteína (ensaio de BCA, ThermoFisher scientific) 10 μg por linha foram carregados em um gel de SDS-PAGE a 10% (Thermo-Fisher scientific). Depois da eletroforese a 100 V por 1,5 hora o gel foi manchado em uma membrana de PVDF (TransBlot Turbo, Biorad).
[00309] Depois de manchar a membrana foi bloqueada usando 5% de leite em pó em TBS-T (20 mM de Tris-HCl, 500 mM de NaCl, pH 7,5, 0,1% de Tween 20) por 30 minutos. Depois do bloqueio, a membrana foi sondada com um anticorpo anti-ACE2 (R&D systems) em uma diluição de 1:10,000 a 4°C durante a noite. Depois de três etapas de lavagem (10 min, TBS-T cada) a membrana foi sondada usando um anticorpo HRP anticabra (SCBT) em uma diluição de 1:10.000 por 1 hora na temperatura ambiente, seguido por três etapas de lavagem (10 min, TBS-T cada). Os sinais foram desenvolvidos usando um substrato de HRP luminescente (GE healthcare) e os sinais foram analisados usando uma câmera (ChemiDoc XRS+, Bio-Rad). Depois da detecção dos sinais de ACE2, as cargas iguais foram analisadas usando um anticorpo anti-GAPDH (NEB) em uma diluição de 1:1.000 por 4 horas na temperatura ambiente.
Resultados
[00310] Na figura 30, os resultados de western blot da transfecção são mostrados. As duas linhas à esquerda mostram os lisados das células tratado, à esquerda das linhas o lisado das células não tratadas. Como demonstrado claramente, a expressão de ACE-2 somente pode ser observada em amostras que foram tratadas com as formulações de lipoide pós-carregadas com RNA que codifica ACE-2. A experiência mostra que o mRNA de ACE-2 também pode ser transportado por intermédio de C12-(2-3-2) contendo a formulação de lipoide. Isto também demonstra que o método de pós carregamento dos lipoplexos vazios também resultada no transporte de mRNA eficiente na célula.
Exemplo 25 Expressão de eritropoietina de murino (mEPO) em camundongos Balb/c Materiais e métodos Formulação de lipoide:
[00311] Como descrito no exemplo 15 usando C12-(2-3-2), DOPE, Colesterol, DMPE-PEG2k e mRNA codificando eritropoietina de murino (mEPO) em uma razão N/P de 15.
Animais:
[00312] Como descrito no exemplo 11
Tratamento de animais:
[00313] A formulação de lipoide foi ajustada a 1 x PBS e diluída para resultar em 5, 10 e 20 μg de mRNA em 130 μl cada. Por dose, três camundongos foram tratados através da injeção intravenosa. Como controle, camundongos foram tratados com PBS. 6 horas após o tratamento, o sangue foi retirado e analisado quanto os níveis de EPO de murinos.
Quantificação de EPO de murinos:
[00314] A quantificação em eritropoietina de murino foi realizada por intermédio de um ELISA de EPO de camundongo (Quantikine ELISA, R&D Systems Inc.) de acordo com o protocolo do fabricante.
Resultados
[00315] Neste experimento, a expressão de eritropoietina de murino em camundongos depois do tratamento com mRNA EPO de murino foi formulada em uma formulação de lipoide contendo C12-(2-3-2). Como demonstrado na figura 31, o EPO de murino pode ser detectado depois de 6 horas em todos os grupos em concentrações significantemente maiores do que o grupo de controle tratado com PBS. Deste modo, o mRNA de EPO de murino foi eficientemente transportado nas células levando à expressão da proteína.
Exemplo 26 Eficiência do transporte de RNA mensageiro de polímero de poli(alilamina) linear modificada com oligo(alquileno amina) (2-3-2) Materiais e métodos. Formação do poliplexo:
[00316] Como descrito no exemplo 1, usando poli(alilamina) (PALAM) modificada com oligo(alquileno amina) (2-3-2), (2-2-2) ou (3-3-3). Síntese de produção do exemplo V.
Transfecção in vitro dos poliplexos:
[00317] Como descrito no exemplo 1, transfectar as células NIH3T3, usando 500 ng de mRNA e N/P de 12.
Resultados
[00318] Como mostrado na figura 32 depois da transfecção com poliplexos de mRNA e PALAM-(2-3-2), as células mostram uma expressão significantemente maior de luciferase do que depois da transfecção com complexos de PALAM-(2-2-2)/mRNA ou PALAM-(3-3-3)/mRNA. Deste modo, estes resultados demonstram que a modificação de um polímero linear, terminado em amina com um oligo(alquileno amina) com cadeias de alquila alternadas leva ao mesmo efeito benéfico como em uma estrutura polimérica linear terminada em carboxila.
Exemplo 27 Eficiência do transporte de RNA mensageiro do polímero de polipropilenimina dendrítico modificado com oligo(alquileno amina) (2-3-2) Materiais e métodos Formação do poliplexo:
[00319] Como descrito no exemplo 1 usando polipropilenimina (PPI) modificado com oligo(alquileno amina) (2-3-2), (2-2-2) ou (3-3-3). Síntese de produção do exemplo VI.
Transfecção in vitro dos poliplexos:
[00320] Como descrito no exemplo 1, transfectar as células NIH3T3, usando 500 ng de mRNA e N/P de 32.
Resultados
[00321] Como mostrado na figura 33 depois da transfecção com os poliplexos de mRNA e PPI-(2-3-2), as células mostram uma expressão de luciferase significantemente maior do que após a transfecção com complexos de PPI-(2-2-2)/mRNA ou PPI-(3-3-3)/mRNA. Deste modo, estes resultados demonstram que a modificação de um polímero dendrítico com um oligo(alquileno amina) com cadeias de alquila alternadas levam ao mesmo efeito benéfico como em uma estrutura polimérica linear.
Exemplo 28 Eficiência do transporte de RNA intracelular da formulação de C12-(2-3-2) depois da injeção subcutânea em ratos Materiais e métodos Formulação de lipoide:
[00322] Como descrito no exemplo 15, usando C12-(2-3-2), DOPE, Colesterol, D MG-PEG2k e mRNA que codificam a luciferase de vaga-lume em uma razão de N/P de 17.
Tratamento de animais:
[00323] A formulação de lipoide foi ajustada a 1 x PBS. 500 μl da formulação contendo 63 μg de RNA foram injetados de maneira subcutânea em ratos Buffalo fêmeas e 6 horas depois da administração, os ratos foram anestesiados pela injeção intraperitoneal de medetomidina (11,5 μg/kg de BW), midazolama (115 μg/kg de BW) e fentanila (1,15 μg/kg de BW). Substrato de D-luciferina (30 mg em PBS por camundongo) foi aplicado por intermédio de injeção intraperitoneal. A bioluminescência foi medida 10 minutos depois, usando um Sistema de Visualização IVIS 100 (Xenogen, Alameda, EUA).
Resultados
[00324] Como demonstrado na figura 34, os ratos mostram um sinal luminescente brilhante no lado da injeção, demonstrando que o transporte do RNA no tecido adjacente foi muito eficiente. Isto também mostra que a funcionalidade do RNA permanece intacta considerando que a proteína codificadora pode ser produzida.

Claims (14)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende RNA de fita simples e um componente compreendendo um oligo(alquileno amina), em que o componente é selecionado de: a) um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (II) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal:
Figure img0027
em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R6 são definidas como segue, independentemente para cada grupo da fórmula (II) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m+n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)- R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)- NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de C3-C18 alquila ou C3-C18 alquenila tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amina; e uma cadeia poli(etileno glicol); R6 é selecionado a partir de hidrogênio; um grupo -CH2- CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)- NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amina; -C(NH)-NH2; uma cadeia poli(etileno glicol); e um ligante receptor, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (II) podem ser protonados para prover um grupo catiônico da fórmula (II); b) um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição:
Figure img0028
em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R5 são definidas como se segue, independentemente para cada grupo da fórmula (III) em uma pluralidade dos tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m+n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados a partir de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7ou -CH2- R7 em que R7 é selecionado a partir de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amina; - C(NH)-NH2; e uma cadeia poli(etileno glicol); e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (III) podem ser protonados para prover um grupo catiônico da fórmula (III); e c) um lipoide tendo a estrutura da fórmula (IV):
Figure img0029
em que as variáveis a, b, p, m, n e R1 a R6 são definidas como se segue: a é 1 e b é um númer o inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m+n é > 2; e R1 a R6 são, independentemente um do outro, selecionados a partir de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2- CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado a partir de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)- NH2; uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante receptor; desde que pelo menos dois resíduos dentre R1 a R6 sejam um grupo -CH2-CH(OH)-R7, - CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2- R7 em que R7 é selecionado a partir de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IV) podem ser protonados para prover um lipoide catiônico da fórmula (IV).
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende o RNA de fita simples e o componente compreende um oligo(alquileno amina) selecionado a partir dos componentes a) e b), em que componente a) é um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (IIa) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal: -NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IIa), em que a, b, m, n, e R2 a R6 são como definidos na reivindicação 1, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIa) podem ser protonados para prover um estrutura de polímero ou oligômero catiônico; e componente b) é um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (IIIa) como unidades de repetição: -NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n- (IIIa), em que a, b, m, n, e R2 a R5 são como definidos na reivindicação 1, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIIa) podem ser protonados para prover um estrutura de polímero ou oligômero catiônico.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende o RNA de fita simples e um lipoide tendo a estrutura da fórmula (IVa): R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IVa), em que a, b, m, n, e R1 a R6 são como definidos na reivindicação 1, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IVa) podem ser protonados para prover um lipoide catiônico.
4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que, na fórmula (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) ou (IVa) n é 1.
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que, na fórmula (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) ou (IVa) m é 1 e n é 1.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que, na fórmula (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) ou (IVa) a é 1 e b é 2 ou a é 2 e b é 1.
7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o oligômero, polímero ou lipoide é um oligômero catiônico, polímero ou lipoide, e em que o oligômero catiônico, polímero ou lipoide forma um complexo com o RNA de fita simples.
8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que está na forma liofilizada e que compreende adicionalmente um liprotector.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o liprotector é trealose.
10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o RNA de fita simples é mRNA.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
12. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é para dispensar RNA de fita simples em uma célula IN VITRO.
13. Método IN VITRO para dispensação de RNA de fita simples a uma célula alvo ou tecido, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa para trazer uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 em contato com a célula alvo ou tecido.
14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que é para uso em terapia genética.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012170889A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cleavable lipids
CN106414749A (zh) * 2014-02-26 2017-02-15 埃泽瑞斯公司 用于胃肠给予rna的组合物
MX2016014881A (es) 2014-05-14 2017-05-01 Alex Levitzki Man And Holdings Ltd Vectores mejorados de polietilenimina polietilenglicol.
US20180214572A1 (en) * 2014-11-10 2018-08-02 Ethris Gmbh Induction of osteogenesis by delivering bmp encoding rna
GB2560250A (en) * 2015-06-30 2018-09-05 Ethris Gmbh ATP-Binding cassette family coding polyribonucleotides and formulations thereof
PE20240371A1 (es) * 2015-12-01 2024-03-05 Spark Therapeutics Inc Metodos escalables para producir un vector viral adenoasociado (aav) recombinante en un sistema de cultivo celular en suspension sin suero adecuado para uso clinico
BR112018075479A2 (pt) * 2016-06-09 2019-03-19 Curevac Ag portadores híbridos para carga de ácido nucleico
EP4035659A1 (en) 2016-11-29 2022-08-03 PureTech LYT, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
US11104887B2 (en) 2017-01-03 2021-08-31 Ethris Gmbh Ornithine transcarbamylase coding polyribonucleotides and formulations thereof
WO2019204451A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Carnegie Mellon University Enhanced lipid nanoparticle drug delivery using a negatively charged polymer
US20210137846A1 (en) 2018-04-25 2021-05-13 Ethris Gmbh Cryoprotective agents for particulate formulations
CA3129912A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ethris Gmbh Treatment of ciliopathies
CN111249476B (zh) * 2020-02-19 2023-09-26 深圳厚存纳米药业有限公司 泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合中性复合物纳米粒
IL302689A (en) 2020-11-04 2023-07-01 Ethris Gmbh Use of IFN-Lambda mRNA to treat viral infections
JP2024507394A (ja) 2021-02-26 2024-02-19 エスリス ゲーエムベーハー エアロゾル形成用の製剤および核酸を送達するためのエアロゾル
EP4333810A1 (en) * 2021-05-07 2024-03-13 Carnegie Mellon University Lipid nanoparticle-mediated mrna delivery to the pancreas
CN113876639B (zh) * 2021-11-12 2023-08-22 湖北省麦诗特生物科技有限公司 一种含有提高皮肤弹性脂质体的面霜组合物及其制备方法
EP4327829A1 (en) 2022-08-26 2024-02-28 Ethris GmbH Stabilization of lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
WO2024042236A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Ethris Gmbh Stable lipid or lipidoid nanoparticle suspensions

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
CA1223831A (en) 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US6017700A (en) 1995-08-04 2000-01-25 Bayer Corporation Cationic oligonucleotides, and related methods of synthesis and use
JP4538150B2 (ja) * 1998-08-14 2010-09-08 ヴァレンティス，インコーポレイテッド 核酸分子の保護された単一バイアル調製物、インライン混合によってそれを形成する方法、及び関連する生成物及び方法
EP1129064B1 (en) * 1998-11-12 2008-01-09 Invitrogen Corporation Transfection reagents
ES2219346T3 (es) 1999-06-25 2004-12-01 Christian Plank Combinaciones para la introduccion de acidos nucleicos en celulas.
WO2002000870A2 (en) 2000-06-26 2002-01-03 Christian Plank Method for transfecting cells using a magnetic field
JP4535229B2 (ja) 2003-05-08 2010-09-01 国立大学法人 東京大学 ポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体
JP4739352B2 (ja) * 2004-12-17 2011-08-03 日東電工株式会社 真核細胞をトランスフェクトするための固定化分解性カチオンポリマーを持つ固体表面
JP5061349B2 (ja) 2005-02-10 2012-10-31 国立大学法人 東京大学 ポリカチオン荷電性ポリマー及び核酸のキャリヤーとしての使用
US20060235459A1 (en) 2005-04-19 2006-10-19 Das Gladwin S Balloon catheters and methods for manufacture
WO2006138380A2 (en) 2005-06-15 2006-12-28 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
US9090648B2 (en) 2005-12-15 2015-07-28 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Cationic oligonucleotides, automated methods for preparing same and their uses
MX353900B (es) * 2008-11-07 2018-02-01 Massachusetts Inst Technology Lipidoides de aminoalcohol y usos de los mismos.
US20110263025A1 (en) * 2008-12-02 2011-10-27 University Of Utah Research Foundation Biodegradable polydisulfide amines for gene delivery
CN105255881A (zh) 2009-07-31 2016-01-20 埃泽瑞斯公司 用于蛋白质表达的具有未修饰和修饰核苷酸的组合的rna
WO2011154331A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Polymers for delivery of nucleic acids
US9168230B2 (en) * 2011-05-26 2015-10-27 University Of South Carolina Tetrary gene delivery system for gene therapy and methods of its use
DE102011114986A1 (de) 2011-09-28 2013-03-28 Ethris Gmbh Sprühsystem
HUE057725T2 (hu) 2011-10-03 2022-06-28 Modernatx Inc Módosított nukleozidok, nukleotidok és nukleinsavak és ezek felhasználása
WO2014066811A1 (en) * 2012-10-25 2014-05-01 The Johns Hopkins University Bioreducible poly (b-amino ester)s for sirna delivery
WO2014028487A1 (en) * 2012-08-13 2014-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof

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