ES2219346T3 - Combinaciones para la introduccion de acidos nucleicos en celulas. - Google Patents

Combinaciones para la introduccion de acidos nucleicos en celulas.

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ES2219346T3 ES00936907T ES00936907T ES2219346T3 ES 2219346 T3 ES2219346 T3 ES 2219346T3 ES 00936907 T ES00936907 T ES 00936907T ES 00936907 T ES00936907 T ES 00936907T ES 2219346 T3 ES2219346 T3 ES 2219346T3
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Franz Scherer
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Abstract

¿ Una combinación de un portador y un complejo que contiene una o más moléculas de ácido nucleico y uno o más copolímeros cargados que tienen la fórmula general I en donde R es un polímero anfifílico o un derivado homo¿ o hetero¿bifuncional del mismo, y en donde X i) es un aminoácido o derivado de aminoácido, un péptido o un derivado de péptido o un derivado de espermina o espermidina; o ii)en donde X es en donde a es H o bien, opcionalmente, alquilo C1¿C6 sustituido con halógeno o con dialquilamino; y en donde b, c y d son el mismo o diferente alquileno C1¿C6 sustituido, opcionalmente, con halógeno o con dialquil¿amino; o iii) en donde X es en donde a es H o bien, opcionalmente, alquilo C1¿C6 sustituido con halógeno o con dialquilamino, y en donde b y c son el mismo o diferente alquileno C1¿C6 sustituido, opcionalmente, con halógeno o con dialquilamino; o iv)en donde X es un compuesto aromático sustituido con tres agrupaciones funcionales W1Y1Z1, en donde W, Y y Z tienen los significados mencionados a continuación; en donde W, Y o Z tienen los mismos o diferentes grupos CO, NH, O o S o una agrupación enlazadora capaz de reaccionar con SH, OH, NH o NH2; y en donde la molécula efectora E es un péptido o derivado de péptido catiónico o aniónico o un derivado de espermina o espermidina o un glucosaminoglicano o un oligo/policatión o ¿anión no peptídico; en donde m y n son independientemente uno de otro 0, 1 ó 2; en donde p es preferiblemente 3 a 20; y en donde l es 1 a 5, preferiblemente 1.

Description

Combinaciones para la introducción de ácidos nucleicos en células.
La invención se refiere al campo de la transferencia génica, en particular a combinaciones de un portador y un complejo constituido por una molécula de ácido nucleico y un copolímero.
Un requisito previo para poner en práctica clínicamente estrategias de terapia génica es la disponibilidad de vectores génicos estables y eficientes. Sin embargo, en la aplicación sistémica que tiene como objetivo la terapia génica somática, la mayor parte de los vehículos de transferencia génica conocidos, presentan todavía problemas.
En principio, tienen que resolverse los dos problemas de transporte siguientes para conseguir una transferencia génica eficiente in vivo: 1) la transferencia del agente a transferir (v.g. DNA plasmídico, oligonucleótidos) desde el sitio de aplicación en el organismo a la célula diana (aspecto extra-celular) y 2) la transferencia del agente a transferir desde la superficie celular al citoplasma o al núcleo (aspecto celular). Una condición previa esencial para la transferencia génica mediada por receptores consiste en compactar el DNA en partículas que tengan el tamaño de un virus y liberar el DNA de las vesículas internas después de la penetración en las células por endocitosis. Esta condición previa se satisface por compactación del DNA con polímeros catiónicos específicos cuya naturaleza química garantiza la liberación de complejos de DNA desde vesículas internas (endosomas, lisosomas) después de la penetración en las células por endocitosis (Boussif et al., 1995; Ferrari et al., 1997; Haensler & Szoka, 1993; Tang et al., 1996). Un objeto de este tipo se consigue también por incorporación de péptidos destructores de la membrana dependientes del pH en complejos de DNA (Plank et al., 1994; WO 93/07283). Utilizando una composición adecuada de los complejos de DNA, puede conseguirse una penetración específica y una transferencia génica eficiente en las células por medio de interacción receptor-ligando (Kircheis et al., 1997; Zanta et al., 1997). Los complejos de DNA con péptidos catiónicos son también particularmente adecuados para la transferencia génica mediada por receptores (Gottschalk et al., 1996; Wadhwa et al., 1997; Plank et al., 1999).
Entre otros, el hecho de que el aspecto extracelular del problema de transporte se ha resuelto sólo insuficientemente hace que sea más difícil poner en práctica clínicamente los prometedores descubrimientos de investigación que pueden conseguirse en la transferencia génica con vectores no víricos. Una razón para este problema es la naturaleza fisicoquímica de los vectores de transferencia génica no víricos debido a la cual aquéllos interaccionan fuertemente con los componentes de la sangre y los tejidos durante la aplicación sistémica (v.g. por opsonización, la unión de proteína del suero) que limita particularmente la transferencia génica mediada por receptores dirigida a ciertas células diana. Se ha demostrado que la modificación de la superficie de los complejos de DNA con poli(etilenglicol) reduce considerablemente sus características de unión a las proteínas de la sangre (Plank et al., 1996; Ogris, 1998; WO 98/59064). Otra limitación del uso de vectores no víricos es la insuficiente solubilidad (o estabilidad) de los complejos de DNA in vivo. Con los métodos conocidos no ha sido posible hasta ahora complejar DNA con un policatión para aplicación intravenosa en concentraciones suficientemente grandes (v.g. en la gama de 1 mg/ml) dado que los complejos de DNA se agregan en concentraciones fisiológicas de solución salina y precipitan de la solución.
Problemas similares se presentan también durante la aplicación de compuestos químicos de peso molecular bajo. En el campo de los medicamentos "clásicos", se utilizan polímeros sintéticos biológicamente degradables para empaquetamiento de productos farmacéuticos en una forma que garantice un tiempo de retención más largo en el organismo y que conduce a la disponibilidad biológica deseada en el órgano diana ("liberación controlada"). Para este propósito, la modificación de la superficie de partículas coloidales con poli(etilenglicol) se realiza de tal manera que se suprima la opsonización no deseada. Existe una bibliografía abundante sobre la síntesis y caracterización de polímeros biológicamente degradables para uso en numerosas aplicaciones médicas (Coombes et al., 1997). Dependiendo de la sustancia y la aplicación, los enlaces químicos en la cadena principal del polímero varían. La labilidad deseada en un medio fisiológico puede alcanzarse por medio del posicionamiento adecuado de los enlaces éster, amida, péptido o uretano, por la cual la sensibilidad a la acción de las enzimas puede modificarse intencionadamente. Los principios de la síntesis combinatoria han demostrado ser eficaces para una síntesis rápida y eficiente de sustancias biológicamente efectivas (Balkenhohl et al., 1996). Variando sistemáticamente sólo un pequeño número de parámetros, puede obtenerse un gran número de compuestos que tienen la estructura básica deseada (Brocchini et al., 1997). Utilizando un sistema de selección biológica adecuado y significativo, es posible seleccionar de esta agrupación de compuestos aquéllos que tienen las características deseadas.
En la patente US No. 5.455.027 se describen polímeros que están constituidos por unidades alternantes de un poli(óxido de alquileno) y un alcano funcionalizado, en los cuales un agente farmacológicamente activo está acoplado covalentemente al grupo lateral funcional del alcano.
El documento WO 98/19710 describe la producción de vectores polielectrolíticos sintéticos y vehículos portadores de ácido nucleico por la formación de complejos. En este caso, un componente central que contiene ácido nucleico que se forma por la auto-organización de un material polímero catiónico y material de ácido nucleico, preferiblemente DNA contenido en un vector de expresión, provisto directa o indirectamente con otras moléculas funcionales o unidades moleculares diferentes, con inclusión de materiales polímeros hidrófilos que proporcionan al componente central un recubrimiento y una protección estérica. De este modo, se mejoran la estabilidad y biocompatibilidad del complejo polielectrolítico. Los vectores descritos en WO 98/19710 pueden ser útiles en terapia génica. Para unión al componente central, los materiales polímeros hidrófilos contienen grupos que tienen reactividad química importante. El documento WO 98/19710 no describe la posibilidad de utilizar interacciones físicas tales como, v.g. interacciones electrostáticas, para proporcionar al componente central, que está constituido por policatión y ácido nucleico por auto-organización, un recubrimiento hidrófilo de polímero para la protección y estabilización estérica.
En los últimos años, se han hecho evidentes los puntos esenciales siguientes en lo que respecta a la aplicación de sistemas de transferencia génica no víricos:
a)
los complejos de DNA plasmídico y polímeros catiónicos son adecuados para una transferencia génica in vitro e in vivo, en la cual complejos con polímeros que tienen grupos amino secundarios y terciarios pueden tener también una actividad endosomolítica inherente que conduce a una transferencia génica eficiente (Boussif et al., 1995, Tang et al., 1996).
b)
A partir de cierta longitud de cadena de la porción catiónica, los péptidos catiónicos ramificados son adecuados para unión eficiente a DNA y para formación de complejos de DNA particulares (Plank et al., 1999).
c)
Los complejos de DNA policatiónicos interaccionan fuertemente con los componentes de la sangre y activan el sistema del complemento (Plank et al., 1996).
d)
Las interacciones fuertes de las estructuras particuladas con los componentes de la sangre pueden reducirse o inhibirse por modificación con poli(etilenglicol) ; esto es aplicable también a los complejos de DNA policatiónicos (Plank et al., 1996; Ogris et al., 1999).
Por consiguiente, el problema técnico subyacente en la presente invención fue proporcionar un nuevo sistema de transferencia génica no vírica mejorado sobre la base de complejos policatiónicos de ácido nucleico.
Para resolver el problema técnico subyacente en la presente invención, se supuso que el ácido nucleico o complejos de ácido nucleico tienen que recubrirse con un polímero cargado que estabiliza físicamente los complejos y los protege contra la opsonización.
La presente invención se refiere en su primer aspecto a una combinación de un portador y un complejo que contiene una o más moléculas de ácido nucleico y uno o más copolímeros cargados que tienen la fórmula general I
1
en donde R es un polímero anfifílico o un derivado homo- o hetero-bifuncional del mismo, y en donde X
i)
es un aminoácido o derivado de aminoácido, un péptido o un derivado de péptido o un derivado de espermina o espermidina; o
ii)
en donde X es
d---
\melm{\delm{\para}{c}}{C}{\uelm{\para}{a}}
---b
en donde
a es H o bien, opcionalmente, alquilo C_{1}-C_{6} sustituido con halógeno o con dialquilamino;
y en donde
b, c y d son el mismo o diferente alquileno C_{1}-C_{6} sustituido, opcionalmente, con halógeno o con dialquil-amino; o
iii)
en donde X es
2
en donde
a es H o bien, opcionalmente, alquilo C_{1}-C_{6} sustituido con halógeno o con dialquilamino,
y en donde
b y c son el mismo o diferente alquileno C_{1}-C_{6} sustituido, opcionalmente, con halógeno o con dialquilamino; o
iv)
en donde X
es un compuesto aromático sustituido con tres agrupaciones funcionales W_{1}Y_{1}Z_{1}, en donde W, Y y Z tienen los significados mencionados a continuación;
en donde
W, Y o Z tienen los mismos o diferentes grupos CO, NH, O o S o una agrupación enlazadora capaz de reaccionar con SH, OH, NH o NH_{2};
y en donde la molécula efectora E
es un péptido o derivado de péptido catiónico o aniónico o un derivado de espermina o espermidina o un glucosaminoglicano o un oligo/policatión o -anión no peptídico;
en donde
m y n son independientemente uno de otro 0, 1 ó 2; en donde
p es preferiblemente 3 a 20; y en donde
l es 1 a 5, preferiblemente 1.
Si l es > 1, el resto X-Z_{m}-E_{n} puede ser el mismo o diferente.
Dentro del significado de la invención, un compuesto aromático es un grupo de hidrocarburo aromático monocíclico o bicíclico con 6 a 10 átomos de anillo que - aparte de los sustituyentes mencionados anteriormente - puede estar sustituido opcionalmente de manera independiente con uno o más sustituyentes adicionales, preferiblemente con
uno, dos o tres sustituyentes seleccionados del grupo de alquilo C_{1}-C_{6}, -O-(alquilo C_{1}-C_{6}), halógeno - preferiblemente flúor, cloro o bromo - ciano, nitro, amino, mono-(alquil C_{1}-C_{6})amino, di-(alquil C_{1}-C_{6})amino. Se prefiere el grupo fenilo.
Dentro del significado de la presente invención, un compuesto aromático puede ser también un grupo heteroarilo, es decir un grupo de hidrocarburo aromático monocíclico o bicíclico con 5 a 10 átomos de anillo que contiene, independientemente unos de otros, uno, dos o tres átomos de anillo seleccionados del grupo de N, O o S, en donde los átomos de anillo restantes son C.
A no ser que se indique otra cosa, alquilamino o dialquilamino es un grupo amino que está sustituido con uno o dos grupos alquilo C_{1} a C_{6}, en donde -en caso de dos grupos alquilo- los dos grupos alquilo pueden formar también un anillo. A no ser que se indique otra cosa, alquilo C_{1} a C_{6} representa generalmente un grupo hidrocarbonado ramificado o no ramificado con 1 a 6 átomos de carbono que puede estar sustituido opcionalmente con uno o más átomos de halógeno -preferiblemente con flúor- que pueden ser diferentes unos de otros o iguales. Ejemplos de los mismos pueden ser los grupos hidrocarbonados siguientes:
metilo, etilo, propilo, 1-metiletilo (isopropilo), n-butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo, pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 2,2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, hexilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 1,1,2-trimetilpropilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1-etil-1-metilpropilo y 1-etil-2-propilo.
A no ser que se indique otra cosa, se prefieren grupos alquilo inferiores que tienen 1 a 4 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo o 1,1-dimetiletilo.
De acuerdo con ello, alquileno significa un puente hidrocarbonado bivalente ramificado o no ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono que pueden estar sustituidos opcionalmente con uno o más átomos de halógeno -preferiblemente flúor- que pueden ser diferentes unos de otros o iguales.
Se prefiere que el polímero anfifílico R sea un poli(óxido de alquileno), polivinil-pirrolidona, poliacril-amida,
poli(alcohol vinílico) o un copolímero de estos polímeros.
Ejemplos de poli(óxidos de alquileno) adecuados son poli(etilenglicol) es (PEG), polipropilenglicoles, poliisopropilenglicoles y polibutilenglicoles.
Dentro del marco de la presente invención, se prefieren los poli(óxidos de alquileno), en particular PEG.
El poli(óxido de alquileno) puede estar presente como tal en un copolímero o como tio-, carboxi- o amino-derivado.
El polímero R tiene preferiblemente un peso molecular de 500 a 10.000; preferiblemente 1.000 a 10.000.
En el caso i) en el que X es un aminoácido, puede utilizarse un aminoácido con tres grupos funcionales para la síntesis del copolímero, en donde dos de estos grupos son susceptibles de copolimerización con el polímero y uno es susceptible de acoplamiento con la molécula efectora E; en este caso, Z no es necesario. Se prefieren los aminoácidos naturales ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, ornitina y tirosina. En principio, pueden utilizarse también aminoácidos sintéticos en lugar de aminoácidos naturales (v.g. los derivados correspondientes de espermina y espermidina).
En el caso i), puede utilizarse para la síntesis también un derivado de aminoácido, teniendo el derivado de aminoácido dos grupos funcionales para la copolimerización con el polímero, y obteniéndose por modificación de un aminoácido (ácido glutámico, ácido aspártico, lisina u ornitina) con una agrupación enlazadora para acoplamiento con la molécula efectora. Así, Z no es necesario (m = 0); ejemplos de agrupaciones enlazadoras son piridiltiomercaptoalquil-carboxilatos (véase Fig. 1) o maleimidoalcano-carboxilatos. En el caso i), X puede ser también un péptido (derivado). Si el péptido o el derivado de péptido no está cargado, E se acopla al mismo directamente o a través de Z.
Si X es un péptido o derivado de péptido cargado positiva o negativamente o un derivado de espermina o espermidina, X representa en sí mismo la molécula efectora (Z y E no son necesarios, m = n = 0). En el caso más sencillo, el péptido está constituido en este caso por una secuencia lineal de dos o más aminoácidos idénticos o diferentes naturales o sintéticos, en donde los aminoácidos se seleccionan de tal manera que el péptido está provisto globalmente de carga negativa o positiva. Como alternativa, el péptido puede estar también ramificado. En estos casos, el péptido como tal es el efector, Z y E no son necesarios (m = n = 0). Ejemplos de un tipo de péptidos catiónicos adecuados han sido descritos por Plank et al., 1999.
Derivados de péptidos aniónicos adecuados X tienen la fórmula general (péptido)_{n}-B-espaciador-(Xaa). El péptido es una secuencia de aminoácidos o derivados de aminoácidos con una carga global negativa. Preferiblemente, el péptido está constituido por 3 a 30 aminoácidos, estando constituido más preferentemente con exclusividad por residuos de ácido glutámico y/o ácido aspártico. n representa el número de ramificaciones que dependen de los grupos funcionales contenidos en B. B es una molécula de ramificación, preferiblemente lisina o una molécula del tipo X en los casos ii) a iv). El espaciador es un péptido constituido por 2 a 10 aminoácidos o un ácido orgánico amino-carboxílico que tiene 3 a 9 átomos de carbono en la cadena principal del ácido carboxílico, v.g. ácido 6-aminohexanoico. El espaciador sirve para la separación espacial de la molécula efectora cargada respecto de la cadena principal del polímero. Xaa es preferiblemente un aminoácido trifuncional, en particular ácido glutámico o ácido aspártico, y puede ser generalmente un compuesto del tipo X en los casos i) a iv).
Alternativamente, en el caso i), X puede ser un derivado de péptido, en el cual la modificación del péptido es una agrupación cargada que es diferente de un aminoácido; ejemplos de tales agrupaciones son agrupaciones de ácido sulfónico o grupos carbohidrato cargados tales como ácidos neuramínicos o glucosaminoglicanos sulfatados. La modificación del péptido puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos estándar, sea directamente en el curso de la síntesis del péptido o después de ello con el péptido acabado.
Como X en el caso i), la molécula efectora E puede ser un péptido policatiónico o polianiónico o un derivado de péptido o un derivado de espermina o espermidina. En el caso más simple, el péptido es también en este caso una secuencia lineal de dos o más aminoácidos naturales o sintéticos idénticos o diferentes, en donde los aminoácidos se seleccionan de tal manera que el péptido, globalmente, está provisto de carga positiva o negativa. Alternativamente, el péptido puede ser ramificado. Ejemplos de péptidos catiónicos ramificados adecuados han sido descritos por Plank et al., 1999. Moléculas aniónicas E adecuadas tienen la fórmula general (péptido)_{n}-B-espaciador-(Xbb), en donde Xbb es preferiblemente un aminoácido con un grupo reactivo que puede estar acoplado a X directamente o a través de Z.
El acoplamiento del péptido efector E a Z o directamente a X se lleva a cabo por la vía de un grupo reactivo que o bien existe en el péptido desde el comienzo, o que se introduce posteriormente, v.g. un grupo tiol (en una cisteína o por introducción de un grupo ácido de mercaptoalcano). Alternativamente, dependiendo de Z, el acoplamiento puede tener lugar también por la vía de grupos existentes de aminoácidos o ácidos carboxílicos, o por la vía de grupos de aminoácidos o ácidos carboxílicos introducidos posteriormente.
Como X en el caso i), E puede ser alternativamente un derivado peptídico, en donde la modificación del péptido es una agrupación cargada que es diferente del aminoácido, siendo ejemplos de tales agrupaciones las agrupaciones de ácido sulfónico o grupos carbohidrato cargados tales como ácidos neuramínicos o grupos carbohidrato sulfatados. En este caso, asimismo, el acoplamiento a X tiene lugar directamente o a través de Z.
Preferiblemente, el copolímero de la fórmula general I
3
está estructurado como un copolímero de bloques fuertemente alternantes.
Opcionalmente, el copolímero está modificado con un ligando celular para la célula diana (ligando receptor L). en este caso, en la mayoría de las posiciones enlazadoras Z existe un E. Entre ellos, en lugar del efector E catiónico o aniónico, un ligando celular está acoplado a posiciones individuales del enlazador Z. Alternativamente, el ligando está acoplado a posiciones individuales de la molécula efectora E. Con preferencia, la relación de E a L es aproximadamente 10:1 a 4:1. El ligando receptor puede ser de origen biológico (v.g. transferrina, anticuerpos, grupos carbohidrato) o sintético (v.g. péptidos RGD, péptidos sintéticos, derivados de péptidos sintéticos); ejemplos de ligandos adecuados se indican en WO 93/07283. Los copolímeros de la invención pueden producirse de acuerdo con el método siguiente:
Si se trata de un péptido o análogo de péptido, el compañero de copolimerización X o X-Z_{m}-E_{n} se sintetiza de acuerdo con métodos estándar siguiendo el protocolo Fmoc (Fields et al., 1990), v.g. en la fase sólida (síntesis de péptidos en fase sólida, SPBS). Los derivados de aminoácidos se activan con TBTU/HOBt o con HBTU/HOBt (Fields et al., 1991). Para las posiciones de aminoácidos iónicos, se utilizan los derivados siguientes en su forma protegida con Fmoc en el terminal N:
(a)
cadenas laterales catiónicas: R(Pbf), K(Boc, Trt), ornitina (Boc), carboxi-espermina o -espermidina (Boc);
(b)
cadenas laterales aniónicas: D(O-terc.Bu), E(O-terc.Bu).
Para el sitio de ramificación B de la molécula (péptido)_{n}-B-espaciador(Xaa) o (péptido)_{n}-B-espaciador-(Xbb), se utiliza Fmoc-K-(Fmoc)-OH. Los péptidos están separados de la resina con TFA/DCM.
Si el compañero de polimerización X es un péptido que tiene la estructura general (péptido)_{n}-B-espaciador-(Xaa) en la copolimerización subsiguiente, se utiliza ácido glutámico o ácido aspártico que tiene un grupo protector bencilo en una posición carboxilo en la posición Xaa. Éste se elimina selectivamente por hidrogenólisis (Felix et al., 1978). Las posiciones N-terminales de los aminoácidos de la cadena peptídica tienen aminoácidos protegidos con Boc de
tal manera que los grupos protectores pueden separarse en un solo paso después de la copolimerización del péptido PEG.
Si el compañero de polimerización X es un derivado de aminoácido que contiene una agrupación enlazadora (v.g. ácido 3-mercaptopropiónico, ácido 6-aminohexanoico), se puede obtener en fase líquida de acuerdo con métodos clásicos de química de péptidos. Se hace reaccionar ácido mercaptopropiónico con 2,2'-ditiodipiridina y se purifica por cromatografía. El producto de reacción se hace reaccionar con ácido glutámico protegido en carboxilo (O-t.butilo) utilizando activación con HOBt/EDC (véase Fig. 1). El ácido 6-Fmoc-aminohexanoico se hace reaccionar análogamente. Los grupos protectores de carboxilo se eliminan en TFA/DCM, y el derivado de ácido glutámico resultante se purifica utilizando métodos cromatográficos.
La producción de los copolímeros puede efectuarse de acuerdo con los principios siguientes, y se ilustra por la vía de un copolímero PEG-péptido:
(1) Matriz poli(PEG-O-OC-) ("poliéster")
La copolimerización de los ácidos péptido-dicarboxílicos iónicos y protegidos parcialmente en la cadena lateral o derivados de ácido glutámico o ácido aspártico con macromonómeros PEG en intervalos de peso molecular definidos (PM 400-20.000 disponibles comercialmente, v.g. de Fluka) da como resultado una matriz sobre una base PEG-éster. Éste es un sistema que es lábil a la hidrólisis en un medio fisiológico (Ulbrich et al., 1985).
Los copolímeros p(PEG-péptido) se forman de acuerdo con métodos establecidos, v.g. con diciclohexilcarbodiimida/DMAP, preferiblemente en una secuencia estrictamente alternante (Zalipsky et al., 1984; Nathan, A. 1992). Al PEG-macromonómero presente junto con un péptido protegido en la cadena lateral o derivado de ácido glutámico o aspártico en solución en diclorometano, se añade DCC/DMAP. Después de separación del derivado de urea resultante, el polímero puede obtenerse por medio de precipitación con éter frío. Los grupos protectores de la cadena lateral remanentes se separan con TFA en diclorometano (en estas condiciones, el enlace PEG-éster es estable, asimismo (Zalipsky et al., 1984)). El polímero iónico se obtiene por precipitación y un paso final de cromatografía. La ingeniería de reacción permite controlar el grado de polimerización y la relación de carga por unidad de PEG en el polímero.
(2) Matriz poli(PEG-HN-OC) ("poliamida")
Como alternativa al poliéster, puede construirse una matriz de polímero amídico si se prevé que la capacidad de hidrólisis sea demasiado rápida y se prevé por consiguiente que la inestabilidad sea demasiado alta en el caso de aplicación sistémica, cuando el complejo copolímero-DNA se utiliza en una aplicación de terapia génica. En este caso, en lugar de los macromonómeros PEG, se utilizan derivados diamino-PEG que se copolimerizan con los péptidos iónicos o los derivados de ácido glutámico o aspártico análogamente a la síntesis descrita anteriormente. Durante esta síntesis, se obtiene una estructura amídica estable a la hidrólisis. Polietilen-glicoles modificados con grupos diamino están disponibles comercialmente como sustancias básicas en intervalos definidos de peso molecular comprendidos entre 500 y 20.000 (v.g. de Fluka). Los grupos protectores de la cadena lateral de los componentes peptídicos remanentes lábiles en medio ácido se separan, v.g. con TFA/DCM, y los polímeros se purifican por medio de métodos cromatográficos.
En otro paso, se hacen reaccionar copolímeros de derivados de ácido glutámico o aspártico con péptidos aniónicos o catiónicos que contienen un grupo reactivo adecuado. Por ejemplo, se hacen reaccionar copolímeros del ácido
3-(2'-tio-piridil)-mercaptopropionil-glutámico con péptidos que contienen un grupo cisteína-tiol libre. De los copolímeros resultantes del ácido 6-Fmoc-aminohexanoil-glutámico, se elimina el grupo Fmoc en condiciones alcalinas. El producto se hace reaccionar con un péptido protegido activado con carboxilo. Los grupos protectores peptídicos
(t-Boc u O-t.butilo) se separan en DCM/TFA, y el producto resultante se purifica por cromatografía. Alternativamente, el grupo amino de Ahx puede derivatizarse con enlazadores bifuncionales y hacerse reaccionar posteriormente con un péptido.
El ligando L puede acoplarse directamente por activación de grupos carboxilo en el efector E (preferiblemente en el caso de copolímeros aniónicos) o en el ligando o por inserción de enlazadores bifuncionales tales como succinimidil-piridil-ditiopropionato (SPDP; Pierce o Sigma) y compuestos similares. El producto de reacción puede purificarse por filtración en gel y cromatografía de intercambio iónico.
Esta mezcla de copolimerización puede hacerse reaccionar también de acuerdo con principios combinatorios. En este caso, principalmente el tipo y el peso molecular (grado de polimerización) del polímero R, la identidad del compañero de polimerización X-Z_{m}-E_{n} o la molécula efectora E (v.g. una serie de péptidos aniónicos con un número creciente de ácidos glutámicos) y el grado de polimerización total p son las variables de selección.
Por variación de los pesos moleculares de los macromonómeros PEG, la clase de la especie iónica utilizada así como su participación en el copolímero y el grado de polimerización de la matriz de polímero, se establece un sistema de varios parámetros que permite la construcción paralela rápida de una secuencia homóloga de copolímeros diferentes y, subsiguientemente, después de complejación con el ácido nucleico, de diversos vectores no víricos. El concepto de síntesis se pone en práctica en la escala de una placa de cultivo de células (v.g. 96 pocillos por placa). Para este propósito, la síntesis química se adapta a la microescala requerida (volúmenes de reacción en la gama de 500 \mul). Esto permite la transferencia directa de los polímeros sintetizados simultáneamente en el ensayo biológico y contribuye así a un escrutinio rápido de una pluralidad de sistemas y a la identificación de compuestos adecuados. Para la realización del método de selección biológica con relación al uso preferido de los copolímeros de la invención para la transferencia génica, los copolímeros se hacen reaccionar, por ejemplo, con complejos de DNA y se someten luego a ensayos que permiten una evaluación de las características del polímero en cuanto al uso propuesto (v.g. transferencia génica). Tales métodos de selección pueden utilizarse para nanopartículas recubiertas con copolímeros. Dichos métodos de escrutinio y selección pueden, por ejemplo, servir para ensayos de activación del complemento en un formato de placa de 96 pocillos (Plank et al., 1996), o ser medidas turbidimétricas de la agregación inducida por seroalbúmina o sal común en el mismo formato o estudios de transferencia génica in vitro en el mismo formato (Plank et al., 1999) o métodos fluorescencia-ópticos en el mismo formato.
Tales análisis muestran, por ejemplo, que copolímeros de una mezcla sintética combinatoria son adecuados para modificar la superficie de complejos de DNA de tal manera que su solubilidad es suficiente para aplicaciones de transferencia génica in vivo, reduciéndose su interacción con los componentes de la sangre y los tejidos de tal manera que su tiempo de retención y la duración de su efecto en la circulación sanguínea se incrementa suficientemente para que tenga lugar la transferencia génica medida por receptores en las células diana.
Los copolímeros se utilizan preferiblemente para el transporte de ácidos nucleicos a células eucariotas superiores.
Por consiguiente, en otro aspecto la presente invención se refiere a una combinación de un portador y complejos que contienen una o más moléculas de ácido nucleico y uno o más copolímeros cargados de la fórmula general I.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico está condensada con un policatión orgánico o un lípido catiónico.
En otro aspecto, la invención se refiere por tanto a complejos de ácido nucleico y un policatión orgánico o un lípido catiónico que están presentes en combinación con un portador y que se caracterizan porque tienen un copolímero cargado de la fórmula general I unido a su superficie por interacciones iónicas.
Los ácidos nucleicos que deben transportarse a la célula pueden ser DNAs o RNAs, no existiendo restricción alguna en cuanto a la secuencia nucleotídica y el tamaño. El ácido nucleico contenido en los complejos de la invención está definido principalmente por el efecto biológico a alcanzar en la célula, v.g. en el caso del uso dentro del alcance de la terapia génica por el gen o la sección de gen que debe expresarse o por la sustitución o reparación deseada de un gen deficiente o cualquier secuencia diana (Yoon et al., 1996; Kren et al., 1998), o por la secuencia diana de un gen a inhibir (v.g. en el caso del uso de oligorribonucleótidos antisentido o ribozimas). Preferiblemente, el ácido nucleico a transportar a la célula es DNA plasmídico que contiene una secuencia que codifica una proteína terapéuticamente eficaz. Para el uso dentro del alcance de la terapia del cáncer, la secuencia codifica, por ejemplo, una o más citoquinas tales como interleuquina-2, IFN-\alpha, IFN-\gamma, TNF-\alpha o un gen suicida que se utiliza en combinación con el sustrato. Para el uso en la denominada vacunación genética de tumores, los complejos contienen DNA codificante de uno o más antígenos tumorales o fragmentos de los mismos, opcionalmente en combinación con DNA codificante de una o más citoquinas. Ejemplos adicionales de ácidos nucleicos terapéuticamente eficaces se indican en el documento
WO 93/07283.
El copolímero de la invención tiene la característica de estabilizar estéricamente el complejo ácido nucleico-policatión y de reducir o inhibir su interacción no deseada con componentes de fluidos corporales (v.g. proteínas del suero).
Se conocen policationes orgánicos adecuados para complejar ácido nucleico para el transporte a células eucariotas; debido a su interacción con el ácido nucleico cargado negativamente, el mismo se compacta y se pone en una forma adecuada para ser absorbido por las células. Ejemplos de aquéllos son policationes que se han utilizado para la transferencia génica mediada por receptores (documentos EP 0388 758; WO 93/07283) tales como poliaminoácidos catiónicos lineales homólogos (tales como polilisina, poliarginina, poliornitina) o poliaminoácidos mixtos catiónico-neutros heterólogos lineales (constituidos por dos o más grupos amino catiónicos y neutros), péptidos catiónicos ramificados y lineales (Plank et al., 1999; Wadhwa et al., 1997), policationes no peptídicos (tales como polietilen-iminas o polipropileniminas lineales o ramificadas), dendrímeros (policationes esferoidales que pueden sintetizarse con un diámetro bien definido y un número exacto de grupos amino terminales; (Haensler y Szoka, 1993; Tang et al., 1996;
WO 95/02397), carbohidratos catiónicos, v.g. quitosano (Erbacher et al., 1998). Los policationes pueden estar modificados también con lípidos (Zhou et al., 1994; WO 97/25070).
Cationes adecuados adicionales son lípidos catiónicos (Lee et al., 1997) que están, en parte, disponibles comercialmente (v.g. Lipofectamina, Transfectam).
En lo que sigue, el término "policatión" se utiliza como un sustituto tanto para policationes como para lípidos catiónicos, a no ser que se indique otra cosa.
Dentro del significado de la presente invención, policationes preferidos son polietileniminas, polilisina y dendrímeros, v.g. dendrímeros de poliamidoaminas (dendrímeros "PAMAM").
El tamaño y/o la carga de los policationes pueden variar ampliamente; se eligen de tal modo que el complejo formado con el ácido nucleico no se disocia a una concentración fisiológica de sal común, que puede ser determinada fácilmente por medio del ensayo de desplazamiento con bromuro de etidio (Plank et al., 1999). En un paso adicional, una cantidad definida de ácido nucleico se incuba con cantidades crecientes del policatión seleccionado, se aplica el complejo formado a las células a transfectar y se mide la expresión génica (en general por medio de una construcción de gen informador, v.g. luciferasa) de acuerdo con métodos estándar.
La formación de los complejos de ácido nucleico tiene lugar por la vía de interacciones electrostáticas. En relación con el policatión, el DNA puede estar presente en una cantidad excesiva de tal manera que dichos complejos exhiben una carga superficial negativa; en el caso inverso, es decir si el policatión que condensa el ácido nucleico está presente en una cantidad excesiva, los complejos tienen una carga superficial positiva. Dentro del significado de la presente invención, el policatión está presente preferiblemente en una cantidad excesiva.
En el caso de un excedente de carga positiva, la relación de policatión y ácido nucleico se ajusta preferiblemente de tal manera que el potencial zeta es aproximadamente +20 a +50 mV, y si se utilizan policationes específicos, v.g. polilisina, puede incluso ser superior a dicho nivel.
En el caso de un excedente de carga negativa, el potencial zeta asciende a aproximadamente -50 hasta -20 mV.
La medida del potencial zeta tiene lugar de acuerdo con métodos estándar establecidos, tales como los descritos por v.g. Erbacher et al., 1998.
El policatión se conjuga opcionalmente con un ligando celular o anticuerpo; ligandos adecuados se describen en el documento WO 93/07283. Para la transferencia génica dirigida a células diana durante una terapia tumoral, se prefieren ligandos o anticuerpos para receptores asociados con células tumorales (v.g. CD87; uPA-R) que son capaces de aumentar la transferencia génica a las células tumorales.
Durante la producción de los complejos, el ácido nucleico -en general DNA plasmídico- se incuba con el policatión (opcionalmente derivatizado con un ligando receptor) presente en el excedente de carga. Durante este proceso, se forman partículas que pueden ser absorbidas por las células por endocitosis mediada por receptores. Subsiguientemente, los complejos se incuban con un copolímero cargado negativamente de acuerdo con la invención, preferiblemente un copolímero de poli(etilenglicol). Preferiblemente, el efector E en el copolímero es un péptido polianiónico. Alternativamente, el copolímero se mezcla en primer lugar con ácido nucleico y se incuba luego con policatión o, como una tercera variante, el copolímero se mezcla primeramente con policatión y se incuba luego con ácido nucleico.
Alternativamente, el ácido nucleico se incuba con un policatión presente en el déficit electrostático y se añade luego un copolímero catiónico. En este caso, asimismo, el orden de los pasos de mezcla puede modificarse como se describe anteriormente para los copolímeros aniónicos. Las porciones relativas de los componentes individuales se seleccionan de tal manera que el complejo de DNA resultante exhibe un potencial zeta débilmente positivo, neutro o débilmente negativo (+10 mV a -10 mV).
Si se utilizan copolímeros cargados positivamente, los mismos pueden emplearse como las únicas moléculas policatiónicas que se unen al ácido nucleico y lo condensan; así, la porción de un policatión o lípido catiónico no es necesaria. En este caso, asimismo, las porciones relativas de los componentes individuales se seleccionan de tal manera que el complejo de DNA resultante exhibe un potencial zeta débilmente positivo, neutro o débilmente negativo (+10 mV a -10 mV).
En los complejos, opcionalmente, los policationes y/o copolímeros se modifican con ligandos celulares idénticos o diferentes.
Los complejos de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que están estabilizados en su tamaño por el copolímero de la fórmula general I unido electrostáticamente y, como consecuencia, están protegidos contra la agregación, tienen la ventaja de que pueden almacenarse en solución por espacios de periodos de tiempo largos (semanas). Adicionalmente, aquéllos tienen la ventaja de que no interaccionan o interaccionan en pequeño grado con los componentes de los fluidos corporales (v.g. con las proteínas del suero) debido al efecto protector del copolímero unido.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene una combinación de un portador y un complejo que contiene un ácido nucleico terapéuticamente eficaz, el copolímero de acuerdo con la invención y, opcionalmente, un policatión orgánico o lípido catiónico.
La composición farmacéutica de acuerdo con la invención estará presente preferiblemente en forma liofilizada, complementada opcionalmente con azúcar tal como sacarosa o dextrosa en una cantidad que da como resultado una concentración fisiológica en la solución lista para ser utilizada. La composición puede estar presente también en la forma de un crioconcentrado.
La composición de acuerdo con la invención puede estar presente también en una forma ultracongelada (criopreservada) o como una solución enfriada.
En un aspecto adicional, combinaciones con los copolímeros cargados positivamente o cargados negativamente de acuerdo con la invención sirven para el propósito de estabilizar estéricamente partículas coloidales ("nanopartículas") tal como se desarrollan para la aplicación de preparaciones farmacéuticas clásicas y para reducir o suprimir su interacción indeseable con componentes de fluidos corporales (v.g. con proteínas del suero). Adicionalmente, los copolímeros de acuerdo con la invención modificados con ligandos receptores pueden ser utilizados para unir ligandos receptores a la superficie de dichas nanopartículas para transferir fármacos con especificidad incrementada a células diana ("direccionamiento de fármacos").
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una combinación de un portador y un complejo que contiene una o más moléculas de ácido nucleico y uno o más copolímeros de acuerdo con la invención.
Con relación a las realizaciones preferidas de los copolímeros y las moléculas de ácido nucleico, son aplicables las explicaciones anteriores.
En este contexto, un portador es un cuerpo o una sustancia que puede estar en contacto in vivo o in vitro con células a transformar y que transporta el complejo de ácido(s) nucleico(s) y copolímero(s). Preferiblemente, el portador es un material conectado de una manera coherente, es decir una sustancia sólida, de modo particularmente preferible una sustancia sólida plástica o deformable tal como v.g. un gel, una esponja, una lámina metálica delgada, un polvo, un granulado o una faja. El portador puede estar constituido por material no reabsorbible biológicamente o reabsorbible biológicamente.
El portador puede ser también un portador producido por la reticulación de los copolímeros de acuerdo con la invención, preferiblemente en presencia de moléculas de ácido nucleico. Así, existe, por ejemplo, la posibilidad de introducción de vectores génicos conocidos (DNA desnudo, RNA desnudo, lipoplexos, poliplexos) y de oligonucleótidos y ribozimas, de modo opcional modificados químicamente, en polímeros reticulados de acuerdo con la invención. Para este propósito, la reticulación tiene lugar, v.g. in situ en presencia del vector génico, DNA, oligonucleótido, etc. por adición de un agente desencadenante de la reticulación en un disolvente acuoso u orgánico. La naturaleza del agente de reticulación depende de la estructura del copolímero. Por esta razón, v.g. la cadena principal del polímero que se muestra en Fig. 2 puede estar reticulada por adición de ditioles tales como v.g. cisteinil-cisteína o ditioles no parecidos a aminoácidos. La reticulación de copolímeros que contienen ácido carboxílico puede tener lugar por adición de cualesquiera diaminas durante la activación del ácido carboxílico (v.g. reacción del ácido carboxílico con un éster activado in situ) (Nathan et al., Macromolecules 25 (1992), 4476-4484). Una cadena principal de polímero con aminas primarias o secundarias puede tener lugar, v.g. por adición de un ácido dicarboxílico activado. Después de la reticulación, la preparación puede secarse hasta que se forma una película.
Un ejemplo de un material no reabsorbible biológicamente es el silicio (v.g. para catéteres). Sin embargo, es posible también utilizar materiales biológicamente no reabsorbibles diferentes que pueden introducirse en el cuerpo como implantes y/o han sido ya utilizados, v.g. en cirugía plástica. Ejemplos de los mismos son PTFE (v.g. para reemplazamiento de vasos), poliuretano (v.g. para catéteres), materiales metálicos (v.g. aceros de uso médico, aleación de titanio para endoprótesis; mallas metálicas para utilización como soporte de vasos (dilatadores) ("stents")).
Preferiblemente, el portador es un material biológicamente reabsorbible. Ejemplos de los mismos son colas de fibrina producidas a partir de trombina o fibrinógeno, quitina, oxicelulosa, gelatina, poli(carbonatos de etilenglicol), poliésteres alifáticos tales como v.g. poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos) y los compuestos de tipo aminoácido derivados de los mismos, tales como poliamidas y poliuretanos o poliéteres y los polímeros mixtos correspondientes. Además, cualquier otro polímero biológicamente degradable puede utilizarse como portador, particularmente los denominados adhesivos auto-curables basados en hidrogeles. En particular, son adecuados como materiales biológicamente reabsorbibles cualesquiera materiales que puedan ser degradados enzimáticamente en el cuerpo y/o por procesos hidrolíticos. Otros ejemplos de los mismos son sulfato de calcio biorreabsorbible definido químicamente, fosfato tricálcico, hidroxi-apatito, polianhídridos, portadores constituidos por proteínas purificadas o por matriz extracelular parcialmente purificada. Es particularmente preferido el portador colágeno, de modo particularmente preferible una matriz de colágeno producida a partir de colágenos de cartílago y piel, tal como es distribuida v.g. por Sigma o Collagen Corporation. Ejemplos de la producción de una matriz de colágeno se describen v.g. en las patentes US 4.394.370 y 4.975.527.
El portador será muy preferiblemente de colágeno y de modo particularmente preferible será una esponja de colágeno. En general, los polisacáridos cargados negativamente tales como glucosaminoglicanos se unen al colágeno por interacciones iónicas. La unión puede tener lugar a aminoácidos cargados positivamente en las fibrillas de colágeno (lisina, hidroxilisina y arginina) o incluso a aminoácidos cargados negativamente, por mediación de cationes bivalentes tales como calcio. Adicionalmente, las propiedades de unión iónica del colágeno pueden verse influidas intencionadamente por pretratamiento con solución ácida o alcalina y liofilización subsiguiente. Por medio de estas técnicas conocidas en la química del colágeno, es posible impregnar materiales de colágeno con suspensiones de complejos de acuerdo con la invención para producir una unión iónica entre colágeno como material portador y los complejos de DNA.
En el colágeno, los aminoácidos cargados positivamente no se concentran en secciones catiónicas cortas. Sin embargo, Tales características estructurales del portador, son necesarias para la unión eficiente de DNA. Con objeto de alcanzar una unión más fuerte al material portador, el mismo puede derivatizarse ulteriormente con sustancias catiónicas que se unen al DNA tales como péptidos (Plank et al., Human Gene Therapy 10 (1999), 319-333) o polietilenimina (PEI). Para este propósito, la esponja de colágeno se modifica v.g. con el reactivo de acoplamiento bifuncional succinimidil-piridil-ditiopropionato (SPDP). La polietilen-imina se derivatiza con iminotiolano, lo que conduce a la introducción de grupos tiol. El péptido catiónico a acoplar lleva una cisteína en el término C. los grupos tiol reaccionan con la esponja de colágeno derivatizada con SPDP por formación de puentes disulfuro. Los derivados de esponja obtenidos de este modo deberían unirse fuertemente al DNA, y se prevé que la liberación del DNA tenga lugar con una larga demora temporal.
Para la producción de una combinación de acuerdo con la invención, por ejemplo, el material de colágeno seco puede incubarse con complejos de DNA/copolímero en glucosa al 5%. Las esponjas se liofilizan posteriormente.
En general, una combinación de acuerdo con la invención puede producirse por contacto de un portador correspondiente con el complejo de ácido nucleico y copolímero, con lo que el portador absorbe el complejo o se une al mismo de tal manera que puede desprenderse de nuevo. Métodos correspondientes son conocidos por las personas expertas en la técnica (Bonadio et al. (1999), Nat. Med. 5(7): 753-759; Shea, L.D. et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17(6): 551-554). En los ejemplos, se describe ilustrativamente la producción de una combinación de esponja de colágeno como portador y un complejo ácido nucleico/copolímero.
Las combinaciones de acuerdo con la invención pueden utilizarse para la transferencia de ácidos nucleicos a células, preferiblemente a células de eucariotas superiores, preferiblemente de vertebrados, particularmente de mamíferos tanto in vitro como in vivo.
En conexión con la aplicación in vivo es posible, en particular, introducir la combinación directamente como un implante, v.g. subcutáneamente o como recubrimiento, v.g. sobre un catéter, reemplazamiento de articulación o endoprótesis (v.g. para la mejora de la integración tisular). Aplicaciones adicionales posibles son la cobertura de heridas, en general la cobertura de defectos extensos de la piel tales como v.g. quemaduras o úlceras decubitales, y como material portador para las modernas técnicas de ingeniería de tejidos (Money, D.J. y Mikos, A.G. (1999), Sci. Am. 280(4): 60-65). Adicionalmente, el procesamiento de los materiales aplicados como recubrimiento es posible en forma de polvos que se introducen intencionadamente en el organismo y se fijan al mismo por medio de sistemas de cola tisular comunes y llegan a ser eficaces en la forma de un depósito (transfección).
Además, la presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que contiene una combinación de acuerdo con la invención, opcionalmente en conexión con aditivos farmacéuticamente aceptables.
Un estuche que contiene un portador como se ha definido arriba y un copolímero de acuerdo con la invención o un complejo de un copolímero de acuerdo con la invención y una molécula de ácido nucleico es también materia objeto de la invención.
Fig. 1: Preparación de las cadenas principales del copolímero a partir de ácido 3-(2'-tiopiridil)-mercaptopropionil-glutámico y O,O'-bis(2-amino-etil)poli(etilenglicol) 6000 o O,O'-bis(2-aminoetil)poli-(etilenglicol) 3400
Fig. 2: Acoplamiento de péptidos cargados a la cadena principal del copolímero
Fig. 3: Preparación de la cadena principal del copolímero a partir del péptido protegido E4E^{PROT} y O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 6000
Fig. 4: Ensayos de desactivación del complemento
Fig. 5: Ensayo de lisis de eritrocitos
Fig. 6: Micrografías electrónicas de complejos PEI-DNA (N/P = 8) en presencia del copolímero P3YE5C
Fig. 7: Potencial zeta de complejos PEI- y DOTAP/-colesterol-DNA en dependencia de la cantidad de copolímeros P3YE5C o P6YE5C añadidos
Fig. 8: Preparación de complejos DNA/policatión/co-polímero
Fig. 9: Transferencia génica a células K562 con complejos PEI(25 kD)-DNA en presencia y en ausencia del copolímero P3YE5C
Fig. 10: Transfección de la línea de células de carcinoma de mama MDA-MB435S con complejos polilisina-DNA en presencia y en ausencia del polímero de recubrimiento P3INF7
Fig. 11: Lipofección en células NIH3T3 en presencia y en ausencia del copolímero P3YE5C
Fig. 12: Transfección de células HepG2 con DOTAP/colesterol/DNA y PEI-DNA en presencia y en ausencia de P6YE5C
Fig. 13: Transferencia génica intravenosa in vivo con complejos DNA/policatión con un recubrimiento de copolímero
Fig. 14: Liberación de DNA marcado radiactivo a partir de esponjas de colágeno cargadas con vector. Las esponjas se prepararon como se describe en el Ejemplo 17. En el caso de DNA desnudo, aproximadamente el 50% de la dosis aplicada se une activamente, mientras que la otra mitad se libera inmediatamente. La cinética de liberación subsiguiente sigue un curso aproximadamente lineal. Si se cargan vectores génicos en esponjas, una fracción de 90% se une fuertemente y se libera después de un largo periodo de tiempo con un perfil de liberación exponencial. Las esponjas derivatizadas catiónicamente ("PEI-SPDP" y "péptido-SPDP") se unen al DNA desnudo eficazmente y exhiben cinética de liberación similar a las esponjas cargadas con vector.
Fig. 15: Transferencia génica en fibroblastos de ratón NIH-3T3 por esponjas de colágeno cargadas con vector. Las esponjas de colágeno se prepararon como se describe en el Ejemplo 16 (DNA desnudo, PEI-DNA, DOTAP-colesterol-DNA preparado de acuerdo con el procedimiento variante) y se utilizaron para suministro génico como se describe en el Ejemplo 18. En el caso de las esponjas DOTAP-colesterol, las preparaciones se añadieron a una capa de células adherente (izquierda), o bien se cargaron en la esponja células recién tripsinizadas (derecha). El curso experimental subsiguiente fue idéntico para todas las disposiciones. La expresión génica informadores se ensayó a lo largo de diversos intervalos de tiempo y persiste durante periodos prolongados, particularmente en células que crecen sobre o en el interior de las esponjas.
Ejemplo 1 Preparación de copolímeros cargados de la fórmula general I
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1.1. Preparación de las cadenas principales de copolímero a partir de ácido 3-(2'-tiopiridil)-mercapto-propionil-glutámico y O,O'-bis(2-aminoetil)poli-(etilenglicol) 6000 o bien O,O'-bis(2-amino-etil)poli(etilenglicol) 3400 (diamino-PEG-3400; Fluka)
En este caso, en la fórmula general I es:
W = Y = NH;
X = ácido 3-mercaptopropionil-glutámico, es decir, un derivado de aminoácido de acuerdo con el caso i) que se obtuvo por acoplamiento del resto enlazador ácido 3-(2'-tiopiridil)mercaptopropiónico a ácido glutámico;
por consiguiente, se omite Z (m = 0).
a) Reacción de ácido 3-mercaptopropiónico con 2,2'-ditiodipiridina (1)
Se disolvió 1 g de DTDP (Fluka) en 4 ml de etanol absoluto (Merck). Después de la adición de 100 \mul de trietil-amina (Aldrich), se añadieron 87 \mul (1 mmol) de ácido 3-mercaptopropiónico. Después de 1 hora, la mezcla de reacción se purificó en partes alícuotas por HPLC en fase inversa: columna C18 preparativa (Vydac, 218TP1022), caudal 25 ml/min, ácido trifluoroacético al 0,1%, acetonitrilo 0-40% en 24 min, acetonitrilo 40-100% en 5 min, acetonitrilo 100% durante 5 min. El pico de producto se eluyó con aprox. 20% de acetonitrilo. Las fracciones de producto se agruparon y liofilizaron.
En una variante de este protocolo, el exceso de DTDP se precipita antes de la purificación por RP-HPLC por adición lenta de agua mientras se agita. El precipitado se redisuelve dos veces en etanol y se reprecipita por adición de agua. Las fases acuosas REUNIDAS se purifican por RP-HPLC como se ha descrito arriba.
b) Síntesis de ácido 3-(2'-tiopiridil)-mercapto-propionil-glutámico (2b)
El producto 1, obtenido en a) (véase Fig. 1; 0,5 mmol) se disolvió en 25 ml de diclorometano. Se añadieron 1 mmol de cada uno de di-t-butil-éster de ácido glutámico (Glu(OtBu)OtBu, Bachem), 1-hidroxibenzotriazol (Aldrich), N-etil-N'-(dimetilaminopropil)-carbo-diimida (Aldrich) y diisopropiletilamina (Aldrich) en un tubo de polipropileno de 50 ml (Peske) de manera gradual mientras se agitaba y se enfriaba en hielo. Después de 48 h de reacción, la mezcla se redujo a un residuo aceitoso por evaporación rotativa. El residuo se recogió en 20 ml de acetato de etilo. Esta solución se extrajo dos veces, cada una con ácido clorhídrico 0,5 M, solución saturada de hidrogenocarbonato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio. La fase orgánica se redujo a un residuo aceitoso por evaporación rotativa y se secó durante una noche a alto vacío (producto 2a; véase Fig. 1). Para la eliminación de los grupos protectores
t-butilo, el producto 2a se redisolvió sin purificación ulterior en 30 ml de diclorometano:ácido trifluoroacético (2:1) y se agitó durante 2 h a la temperatura ambiente. La solución se redujo a un residuo aceitoso en un evaporador rotativo, que se lavó subsiguientemente con éter enfriado en hielo. Después de secado a alto vacío, el producto se disolvió en HEPES 100 mM de pH 7,4 y se purificó en partes alícuotas por RP-HPLC (en las mismas condiciones que para el producto 1). Las fracciones del producto se agruparon. El producto 2b (véase Fig. 1) se obtuvo con un rendimiento de 270 \mumol (27% acumulado de todos los pasos). Peso molecular calculado: 344,05. Encontrado: 345,0 (MH^{+}).
c1) Copolimerización de ácido piridil-(2-ditio-propionil)-glutámico (2b) con O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 6000 (diamino-PEG-6000; Fluka)
El producto 2b se disolvió en 3 ml de dimetilformamida (Fluka) y se completó hasta 20 ml con diclorometano. Se mezclaron 5 ml de esta solución (67,5 \mumol) de manera gradual con 506 mg de diamino-PEG-6000 (84 \mumol, correspondientes a 1,25 equivalentes; Fluka), 30 mg de diciclohexilcarbodiimida (135 \mumol, 2 equivalentes, 135 \mul de una solución 1 M en DMF) y 2 mg de dimetilaminopiridina (0,25 equivalentes, solución 1 M en DMF). Después de 2 h, se separaron 10 \mul para un ensayo de ninhidrina, que produjo sólo una mancha débilmente azul. El producto bruto 3 (véase Fig. 1) se obtuvo por precipitación a partir de la mezcla de reacción con t-butil-metiléter después de enfriamiento a -20ºC con agitación. El producto se secó a vacío. Se disolvieron partes alícuotas en agua y se purificaron por filtración en gel después de separación de un residuo insoluble por filtración (Ultra-Free MC, Millipore). Para este propósito, una columna XK 16/40 (Pharmacia) se llenó con Superdex 75 (Pharmacia) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Partes alícuotas de 20 mg cada una del producto bruto 3 se purificaron a un caudal de 1 ml/min con HEPES 20 mM de pH 7,3 como eluyente. La fracción principal se eluía con un peso molecular aparente de 40.000 Da después de la separación clara de fracciones previas de pesos moleculares mayores, que se recogieron por separado.
c2) Copolimerización de ácido piridil-(2-ditio-propionil)-glutámico (2b) con O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 3400 (diamino-PEG-3400; Fluka) (producto 4; véase Fig. 1)
El producto 4 se obtuvo con la misma disposición y los mismos procedimientos de purificación que el producto 3. Se aisló un producto como la fracción principal (54% de todas las fracciones) después de filtración en gel, eluyendo con un peso molecular aparente de 22.800 Da (las fracciones secundarias eran un producto de 64 kD, 14% del total, y un producto de 46 kD, 32% del total).
El esquema de reacción para los pasos de síntesis a) a c), que produjo la cadena principal del polímero, se muestra en Fig. 1: se hace reaccionar ácido 3-mercaptopropiónico con 2,2'-ditiodi-piridina. El producto (1) se acopla a ácido glutámico protegido en carboxilo (producto 2a). Después de escisión de los grupos protectores t-butilo, se obtiene ácido 3-(2'-tiopiridil)-mercaptopropionil-glutámico (2b), que se copolimeriza, bajo activación con DCC, con
O,O'-bis(2-aminoetil)polietilen-glicol 6000 o con O,O'-bis(2-aminoetil)poli-(etilenglicol) 3400. El procedimiento da los productos 3 y 4, respectivamente.
1.2. Síntesis de péptidos
Los péptidos se sintetizaron de acuerdo con el protocolo FastMoc™ utilizando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A.
i)
Se sintetizó el péptido YE5C (secuencia [Ac-YEEEEE]_{2}-ahx-C) utilizando 330 mg de resina de clorotritilo cargada con cisteína (0,5 mmol/g; Bachem) utilizando los grupos protectores tritil-(Cys), di-Fmoc-(Lys) y O-t-butil-(Glu). Se utilizaron 1 mmol de cada uno de los aminoácidos protegidos. Después del punto de ramificación (Lys), se llevaron a cabo en todos los casos acoplamientos dobles. La acetilación de los términos N se realizó sobre el péptido acoplado a la resina utilizando 2 mmol de anhídrido acético en 2 ml de N-metilpirrolidona en presencia de 2 mmol de diisopropiletilamina. El péptido se obtuvo como producto bruto después de escisión de la resina (500 \mul de agua, 500 \mul de tioanisol, 250 \mul de etanodiol en 10 ml de ácido trifluoroacético) y precipitación con dietiléter. El producto bruto se disolvió en HEPES 100 mM de pH 7,9 y se purificó por cromatografía de perfusión (Poros 20 HQ, Boehringer Mannheim, cargado en una columna PEEK de 4 x 100 mm; NaCl 0-0,5 M en 8 min, caudal 10 ml/min). El coeficiente de extinción del péptido en tampón de fosfato de sodio 50 mM en hidrocloruro de guanidinio 6 M a 280 nm es 2560 M^{1}cm^{-1} (Gill y von Hippel, 1989).
ii)
Se sintetizó el péptido INF7 (secuencia GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC) de acuerdo con el mismo procedimiento sobre 599 mg de resina de clorotritilo (0,5 mmol/g), se escindió de la resina como se ha descrito para YE5C y se precipitó con dietil-éter. El producto bruto se secó a vacío. Se disolvieron partes alícuotas de 20 mg cada una en 500 \mul de tampón de hidrogenocarbonato de trietilamonio 1 M, pH 8 y se purificaron por filtración en gel (Sephadex G-10 de Pharmacia cargado en una columna HR 10/30 de Pharmacia. Caudal, 1 ml/min. Eluyente: HEPES 20 mM, pH 7,3/NaCl 150 mM o TEAB 100 mM o hidrogenocarbonato de amonio 100 mM). Coeficientes de extinción: 278 nm 12.600; 279 nm 12.665; 280 nm 12.660 M^{-1}cm^{-1}.
iii)
Se sintetizó el péptido SFO29-ahx (Secuencia K_{2}K-ahx-C) de manera análoga (500 mg de resina Fmoc-Cys(Trt)-clorotritilo, Bachem; 0,5 mmol/g) y se purificó de acuerdo con procedimientos estándar (Sephadex G10 con TFA al 0,1% como eluyente; HPLC en fase inversa, gradiente de TFA al 0,1%-acetonitrilo). La lisina en el punto de ramificación era alfa,épsilon-di-Fmoc-L-lisina, y las lisinas subsiguientes eran alfa-Fmoc-épsilon-Boc-L-lisina.
iv)
Se sintetizó el péptido E4E (secuencia [EEEE]_{2}KGGE) de manera análoga. Escala de síntesis: 0,25 mmol Fmoc-Glu(OBzl)-resina de clorotritilo. La carga de la resina se realizó por suspensión de las cantidades correspondientes de resina de cloruro de O-clorotritilo (Alexis) en diclorometano absoluto y mezcla con 2 eq. de cada una de Fmoc-Glu(OBzl)OH y diisopropiletilamina. Después de agitación mediante sacudidas durante varias horas, la resina se filtró y se lavó varias veces con dimetilformamida, metanol, isopropanol, diclorometano y dietiléter. Se utiliza un protocolo Fmoc modificado. El aminoácido N-terminal lleva un grupo protector Boc para producir un derivado peptídico totalmente protegido y estable en medio básico a partir de la síntesis en fase sólida con la secuencia (E(Boc)[E(tBu)]_{3})_{2}-KGGE(OBzl)OH(E4E^{PROT}).
La escisión de la resina se llevó a cabo con diclorometano/ácido acético/trifluoroetanol 8:1:1 a la temperatura ambiente. El grupo protector benciléster del ácido glutámico C-terminal se separó selectivamente con H_{2}/paladio sobre carbón vegetal activado de acuerdo con procedimientos estándar.
\newpage
Las masas de los péptidos se determinaron por espectroscopia de masas con pulverización electrónica, que confirmó la identidad de los péptidos.
1.3. Acoplamiento de los péptidos a las cadenas principales del copolímero (4) o (5)
Las soluciones en HEPES 20 mM, pH 7,4 de 1,2 equivalentes (con respecto a los grupos tiopiridilo en el polímero) del péptido que contiene cisteína C-terminal y la cadena principal del copolímero, obtenidas en 1.1, se mezclan y se someten a sacudidas o se agitan durante 15 h a la temperatura ambiente.
Para la determinación de los equivalentes a utilizar, los sitios de acoplamiento de tiopiridilo disponibles se determinan por reacción de una solución diluida de polímero con 2-mercaptoetanol y medida subsiguiente de la absorbancia de la 2- tiopiridona liberada a una longitud de onda de 342 nm. La concentración de las funciones tiol libres del péptido que contiene cisteína se determina con el reactivo de Ellman a una longitud de onda de 412 nm de acuerdo con Lambert-Beer.
Una vez completada la reacción, lo que se determinó por la absorbancia de la tiopiridona liberada a 342 nm, el volumen de la mezcla de reacción se redujo y el producto se fraccionó por filtración en gel (Superdex 45, Pharmacia).
1.3.1 Preparación del copolímero P3YE5C
Se utilizó el péptido ramificado YE5C, secuencia (YEEEEE)_{2}K(ahx)C, que está acoplado por un puente disulfuro del tiol de la cisteína al grupo del ácido 3-mercaptopropionil-glutámico.
a)
Se preparó el copolímero P3YE5C a partir de la fracción 3 (22.800 Da) del producto (4) y péptido purificado. Como producto, se obtuvo un compuesto con un peso molecular aparente de 35.000 Da. Con respecto al peso molecular del péptido y la cadena principal del copolímero utilizada, esto significa un grado de polimerización de p = 6 (6 unidades que se repiten).
b)
Se preparó el copolímero P6YE5C a partir de la fracción 3 (40.200 Da) de producto (3) y péptido purificado. Como producto, se obtuvo un compuesto con un peso molecular aparente de 55.800 Da. El grado de polimerización es aproximadamente 7.
1.3.2 Preparación del copolímero P3INF7
Se utilizó el péptido endosomolítico INF7, que está acoplado por un puente disulfuro del tiol de la cisteína al grupo del ácido 3-mercaptopropionil-glutámico.
a)
Se preparó el copolímero P3INF7 a partir de la fracción 3 (22.800 Da) del producto (4) y péptido de la gripe purificado.
b)
Se preparó el copolímero P6INF7 a partir de la fracción 3 (40.200 Da) de producto (3) y péptido de la gripe INF7 purificado.
1.3.3 Preparación de un copolímero modificado con ligando receptor ("lactosilado")
Se utilizaron 1 parte de péptido lactosilado SFO29-ahx y 9 partes del péptido ramificado YE5C, que se acoplaron por un puente disulfuro de los tioles de cisteína a los grupos de ácido 3-mercaptopropionilglutámico. Se incubaron 3,32 \mumol de cada uno (con respecto a los grupos tiopiridilo inherentes) de copolímero (4) y (5), respectivamente, disueltos en 1 ml de HEPES 20 mM de pH 7,4, con una mezcla de 500 nmol de SFO29-ahx lactosilado y 4,48 \mumol de péptido YE5C 1,1 ml de tampón HEPES. Esto corresponde a un exceso de 1,5 veces de grupos tiol libres de los péptidos sobre los grupos tiopiridilo disponibles. La fracción de péptido lactosilado referida al péptido total es 10%. La reacción transcurrió completamente durante una noche. Los productos se purificaron por filtración en gel (Superdex 75) como se ha descrito.
El esquema de reacción para acoplamiento de los péptidos cargados a la cadena principal del copolímero de acuerdo con 1.3 se muestra en Fig. 2. Los péptidos con grupos tiol libres se acoplan al producto (3) o (4), por ejemplo el péptido INF7 (izquierda) o el péptido YE5C. Esto da los productos P3INF7 (preparado a partir de O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 3400), P6INF7 (preparado a partir de O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 6000) y de manera análoga P3YE5C y P6YE5C.
Ejemplo 2 Preparación de la cadena principal del copolímero ácido Fmoc-6-aminohexanoilglutámico y O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 6000 (diamino-PEG-6000; Fluka) o bien O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 3400 (diamino-PEG-3400; Fluka)
En este caso, en la fórmula general I:
W = Y = NH; X = ácido Fmoc-6-aminohexanoil-glutámico.
Esto significa que X, de acuerdo con i), es un derivado de aminoácido que se obtiene por acoplamiento de ácido Fmoc-6-aminohexanoico a ácido glutámico. Para el acoplamiento de la molécula efectora E, Z puede omitirse o puede ser un enlazador bifuncional tal como SPDP o EMCS.
Un efector E adecuado para acoplamiento a la cadena principal del polímero puede ser un péptido del tipo E4E^{PROT} (se omite Z) o del tipo YE5C. En el último caso, el péptido reacciona por la vía de su tiol de cisteína con una molécula enlazadora Z (tal como SPDP o EMCS).
a) Síntesis del dipéptido ácido Fmoc-6-aminohexanoico-GluOH (6)
Se disuelven 1 g de ácido 6-aminohexanoico protegido con Fmoc (2,82 mmol, 1,2 eq. de Glu(OtBu)OtBu y 1,2 eq. de 1-hidroxibenzotriazol en 200 ml de diclorometano. Después de enfriamiento a 0ºC, se añadieron a la mezcla 1,2 eq. de N-etil-N'-(dimetilaminopropil)-carbodiimida y 1,7 ml de diisopropiletilamina (pH = 8). Después de una hora a 0ºC, la mezcla se agitó durante 18 h a la temperatura ambiente. El disolvente se eliminó completamente por destilación, se recogió el residuo en acetato de etilo y se extrajo con ácido clorhídrico 0,5 M, solución saturada de hidrogenocarbamato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio. Después de evaporación del disolvente, se produjo ácido Fmoc-6-aminohexanoico-Glu(OtBu)OtBu (5) por liofilización.
El derivado protegido con di-t-butilo (5) se disolvió en 30 ml de diclorometano/ácido trifluoroacético 2:1 y se agitó durante una hora a la temperatura ambiente. Una vez completada la reacción (control de la reacción por HPLC en fase inversa), el disolvente se redujo a aproximadamente 5% del volumen inicial. El producto (6) se obtuvo por precipitación en dietil-éter. La purificación final se realizó por RP-HPLC con un gradiente de acetonitrilo/agua/TFA al 0,1%.
b) Copolimerización de ácido Fmoc-6-aminohexanoico-GluOH (6) con O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 3400' (diamino-PEG-3400, Fluka), producto (7)
10 mg de (6) 1,5 eq. de O,O'-bis(2-aminoetil)poli-(etilenglicol) 3400', 2 eq. de diciclohexilcarbodiimida y 0,25 eq. de 4-(dimetilamino)-piridina se disuelven en 5 ml de diclorometano. Después de agitar durante 30 min a la temperatura ambiente y reducir su volumen, se filtró la solución, seguido por eliminación completa del disolvente por destilación. El residuo se suspendió en 500 \mul de agua y se liofilizó.
Después de la separación del grupo protector Fmoc (20% piperidina en dimetilformamida o diclorometano) del polímero, el copolímero puede conjugarse por química estándar de acoplamiento de péptidos con cualquier péptido que presente un término C libre.
Ejemplo 3 Preparación de la cadena principal del polímero a partir del péptido protegido E4E^{PROT} y O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 6000 (diamino-PEG-6000; Fluka) o bien O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 3400 (diamino-PEG-3400; Fluka)
En este caso, en la fórmula general I:
W = Y = NH; X = el péptido ramificado E4E^{PROT}.
En este ejemplo, un péptido polianiónico X de acuerdo con i) representa en sí mismo el efector. Por tanto, se omiten Z y E (m = n = 0).
Copolimerización de E4E^{PROT} con O,O'-bis(2-aminoetil)-poli-(etilenglicol) 6000' (diamino-PEG-6000, Fluka) (8).
50 \mumol de E4E^{PROT}, 5 eq. de O,O'-bis(2-aminoetil)-poli(etilenglicol) 6000', 2 eq. de diciclohexilcarbodiimida y 0,25 eq. de 4-(dimetilamino)piridina se disolvieron en 10 ml de diclorometano. Después de agitar a 4ºC durante cuatro horas y después de reducir su volumen, se filtró la solución, seguido por eliminación completa del disolvente por destilación. El residuo se suspendió en 500 \mul de agua y se liofilizó.
Para la escisión de los grupos protectores de la cadena lateral remanentes lábiles en medio ácido, se añadió ácido trifluoroacético que contenía hasta 5% de agente de barrido (preferiblemente etano-ditiol, trietilsilano, tioanisol) de acuerdo con procedimientos descritos en la bibliografía, seguido por agitación durante 2 horas. El producto bruto se aisló por precipitación en dietil-éter. La purificación final se llevó a cabo por filtración en gel (Superdex 75, Pharmacia) como se ha descrito arriba.
La Fig. 3 muestra el esquema de reacción: el grupo protector bencilo en el carboxilato 1 del ácido glutámico C-terminal del péptido totalmente protegido E4E^{PROT} se escinde selectivamente por medio de H_{2}/paladio sobre carbón vegetal activado. El producto se copolimeriza, después de activación con DCC, con O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 6000 o con O,O'-bis(2-aminoetil)poli(etilenglicol) 3400. En el paso final, los grupos protectores de los ácidos glutámicos posicionados en el terminal N se escinden con TFA en DCM.
Ejemplo 4 Estudios de activación del complemento
El ensayo se llevó a cabo esencialmente como se describe en Plank et al., 1996.
a) Complejos polilisina-DNA con o sin copolímero P6INF7
Se preparó polilisina (longitud media de cadena 170; Sigma)-DNA como una solución stock por adición de 64 \mug de pCMVLuc en 800 \mul de HBS a 256 \mug de pL en 800 \mul de HBS y mezcla por pipeteado. Esto corresponde a una relación de carga calculada de 6,3. Como control positivo, se añadieron 50 \mul cada vez de esta suspensión de poliplejos a la columna 1 A-F de una placa de 96 pocillos y se mezclaron con 100 \mul de tampón GVB^{2+}. Todos los restantes pocillos contenían 50 \mul de tampón GVB^{2+}. Se transfirieron 100 \mul de la columna 1 a la columna 2, se mezclaron, etc. como se describe en Plank et al., 1996.
Ulteriormente, se mezclaron 300 \mul cada vez de la solución stock polilisina-DNA con 35, 70 y 105 nmol (con referencia al resto INF7) del polímero P6INF7 y se diluyeron a 1050 \mul con tampón GVB^{2+} después de 15 min de incubación. Se distribuyeron 150 \mul cada vez de la suspensión resultante a la columna 1, filas A-F, de una placa de 96 pocillos. Una serie de diluciones de 1,5 veces en tampón GVB^{2+} y el resto del ensayo de activación del complemento se realizaron como se describe anteriormente y en Plank et al., 1996.
Las concentraciones finales de los componentes en la columna 1 son 2/3 \mug para DNA, 8/3 \mug para pL y 0, 5, 10, 15 nmol (con referencia a INF7) para el polímero por 200 \mul de volumen total.
b) Activación del complemento por complejos PEI-DNA con y sin recubrimiento de copolímero
El ensayo se llevó a cabo como se describe:
Se prepararon complejos PEI (25 kD, Aldrich)-DNA por combinación de volúmenes iguales de una solución de DNA (80 \mug/ml en HEPES 20 mM de pH 7,4) y una solución de PEI (83,4 \mug/ml en HEPES 20 mM de pH 7,4). Para la eliminación del exceso de PEI sin combinar, los complejos de DNA se centrifugaron tres veces durante 15 min a 350 x g en tubos de filtración Centricon-100 (Millipore). Entre las centrifugaciones, los tubos se rellenaron hasta el volumen original con HEPES 20 mM de pH 7,4. Después del paso de centrifugación final se obtuvo una solución stock de complejo de DNA correspondiente a una concentración de DNA de 300 \mug/ml. Una parte alícuota de 182 \mul de esta solución se diluyó a 2520 \mul con HEPES 20 mM de pH 7,4. Partes alícuotas de 610 \mul cada una (correspondientes a 13,2 \mug de DNA cada una) se añadieron por pipeteado a soluciones de P6YE5C en 277,6 \mul de HEPES 20 mM de pH 7,4. Las soluciones resultantes se ajustaron a una concentración de sal de 150 mM con NaCl 5 M. Se transfirieron
150 \mul de cada una de las soluciones resultantes a la columna 1, A-F, de una placa de 96 pocillos. La serie de dilución en tampón GVB^{2+} se llevó a cabo como se ha descrito (Plank et al., 1996).
De la misma manera, se incubaron 610 \mul cada vez de un complejo PEI-DNA de concentración mayor (86 ng de DNA por \mul) con 277,6 \mul cada vez de soluciones del polímero P3YE5C. Las soluciones contenían 0, 1, 2, 3 equivalentes de carga del péptido YE5C con relación a la cantidad de DNA utilizada. Después de 15 min, se añadieron 27,45 \mul cada vez de NaCl 5 M (dando como resultado un volumen total de 915 \mul). Se transfirieron 150 \mul cada vez de la solución resultante a la columna 1, filas A a F, de una placa de 96 pocillos (lo que corresponde a 8,6 \mug de DNA y 9 \mug de PEI cada vez). La serie de dilución en GVB^{2+} y el procedimiento de ensayo restante se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente para pL-DNA.
El resultado del ensayo de activación del complemento se muestra en Fig. 4:
A)
Activación del complemento por complejos polilisina-DNA en presencia y en ausencia del copolímero P6INF7. El valor CH50 se refiere a la dilución particular de suero que da lugar a la lisis del 50% de los glóbulos rojos de la sangre de oveja en la disposición del ensayo. El valor CH50_{max} hace referencia al valor CH50 particular que se obtiene con suero humano sin tratar. En la disposición experimental descrita en esta memoria, se incubó suero humano con vectores génicos. Los valores CH50 obtenidos con suero tratado de esta manera son menores que CH50_{max} si los vectores génicos activan la cascada del complemento. Los datos se presentan como porcentaje de CH50_{max}. La fuerte activación del complemento observada con los complejos polilisina-DNA puede ser inhibida totalmente por el polímero de recubrimiento P6INF7.
B)
El péptido INF7 en sí mismo, en forma libre o combinada con polímero, es un activador débil del complemento. Si se incorpora en un complejo polilisina-DNA, esta activación del complemento desaparece.
C)
Activación del complemento por complejos PEI-DNA (N/P = 8) en presencia del copolímero P3YE5C. El complejo de DNA sin proteger es un activador fuerte del sistema del complemento. El copolímero P3YE5C reduce la activación del complemento dependiendo de la cantidad añadida de copolímero, pero no conduce a protección completa en el campo examinado.
D)
En contraste, el copolímero P6YE5C protege completamente contra la activación del complemento aun cuando se añade en pequeñas cantidades.
Ejemplo 5 Ensayo de lisis de los eritrocitos
El ensayo sirve para el examen de la capacidad de los péptidos para lisar membranas naturales de una manera dependiente del pH.
Los eritrocitos utilizados en este ensayo se obtuvieron como sigue: se tomaron 10 ml de sangre reciente de individuos voluntarios y se diluyeron inmediatamente en 10 ml de solución de Alsever (Whaley 1985; Plank et al., 1996). Partes alícuotas de 3 ml cada una se lavaron tres veces con el tampón correspondiente (40 ml cada vez de citrato o HBS; después de adición del tampón, agitación con sacudidas, centrifugación a 2500 x g y descarte del sobrenadante). La concentración de los eritrocitos se determinó con un "coeficiente de extinción" de 2,394 x 10^{-8} ml/células a 541 nm. Para la deducción del coeficiente de extinción, se determinó el recuente de células en una parte alícuota utilizando una cámara de Neubauer seguido por medida de la absorbancia de esta solución a 541 nm después de adición de 1 \mul de Triton X-100 al 1%.
Partes alícuotas de INF7 e INF7 acoplado a copolímero (P3INF7), respectivamente, se proporcionaron en la columna 1 de una placa de 96 pocillos en 150 \mul de citrato de sodio 10 mM de pH 5/NaCl 150 mM o en tampón HBS (usualmente 45 \mumol de péptido). Se añadieron a todos los pocillos restantes 50 \mul de tampón en cada caso (citrato y HBS, respectivamente). Se transfirieron 100 \mul de la columna 1 a la columna 2 utilizando un pipeteador multicanal y se mezclaron por pipeteado. Se transfirieron 100 \mul de la columna 2 a la columna 3, y así sucesivamente. Los 100 \mul excedentes de la columna 11 se desecharon, y la columna 12 contenía solamente tampón. La serie de dilución de 1,5 veces resultante se diluyó a 100 \mul con 50 \mul de tampón cada vez (citrato o HBS). Subsiguientemente, se añadieron cada vez 3 x 10^{6} eritrocitos humanos, se sellaron las placas con Parafilm y se agitaron mediante sacudidas a 400 rpm en una incubadora con agitación (Series 25 Inncubator Shaker; New Brunswic Scientific Co.; NJ, EE.UU.) a 37ºC durante 1 h. A continuación, se centrifugaron las placas a 2500 x g, se transfirieron 150 \mul cada vez del sobrenadante a una placa de 96 pocillos con fondo plano y se determinó la hemoglobina liberada a 410 nm utilizando un lector de placas ELISA. Se determinó el 100% de lisis por adición de 1 \mul de Triton X-100 al 1% a pocillos individuales en la columna 12 (antes de transferir a la placa de fondo plano). El 0% de lisis se determinó a partir de las muestras sin tratar en la columna 12.
El resultado del ensayo de lisis de los eritrocitos se muestra en Fig. 5: El péptido INF7 exhibe una actividad fuerte dependiente del pH. A partir de la síntesis del copolímero P3INF7, se aislaron cuatro fracciones (peso molecular decreciente de 1 a 4) por separación cromatográfica (Superdex 75, Pharmacia). Entre éstas, las fracciones 2 y 3 exhibían una actividad de lisis mayor que el péptido INF7 libre. En todos los casos, la actividad de lisis era estrictamente dependiente del pH, es decir, no se producía lisis alguna a pH neutro (no representado).
Ejemplo 6 Determinación de tamaño de los complejos de DNA por difusión dinámica de la luz y microscopía electrónica
Preparación de los poliplejos PEI-DNA y aplicación del recubrimiento de polímero: 40 \mug de DNA (pCMVLuc) en cada caso en 333 \mul de HEPES 20 mM de pH 7,4 se pipetearon en 41,7 \mug de PEI (25 kD, Aldrich) en 333 \mul de HEPES de pH 7,4 y se mezclaron. Después de 10-15 min de incubación, se añadieron 0, 0,5, 1, 1,5, 2 ó 3 equivalentes de carga (con relación a la carga del DNA aplicado) de los polímeros P3YE5C y P6YE5C, respectivamente, en
333 \mul de HEPES cada vez (o 0, 1, 2, 3 y 5 equivalentes en un segundo experimento). Con referencia al péptido YE5C, esto corresponde a una cantidad de 0, 152, 303, 455, 606 ó 909 pmol de polímero por \mug de DNA. Se prepararon complejos DOTAP/colesterol-DNA a partir de liposomas DOTAP/colesterol (1:1 mol/mol) en 330 \mul de HEPES 20 mM de pH 7,4 y DNA en un volumen igual a una relación de carga de 5. Los lipoplejos se incubaron con 0, 1, 2, 3 y 5 equivalentes del copolímero P3YE5C en 330 \mul de tampón. La concentración final de DNA del complejo era
10 \mug/ml.
El tamaño de los complejos de DNA se determinó por una parte por dispersión dinámica de la luz (Zetamaster 3000, Malvern Instruments) inmediatamente después de la adición del polímero y subsiguientemente en diversos momentos a lo largo de varias horas. Por otra parte, los tamaños se determinaron por microscopía electrónica como se describe en Erbacher et al., 1998, y Erbacher et al., 1999.
La Fig. 6 muestra las micrografías electrónicas de complejos PEI-DNA (N/P = 8) en presencia del copolímero P3YE5C.
A)
En presencia de un equivalente de carga (con respecto a las cargas del DNA utilizado) del copolímero. El tamaño de partícula es 20 a 30 nm.
B)
En presencia de dos equivalentes de carga del copolímero. La mayoría de las partículas presentan tamaños aproximados de 20 nm. Éstos son complejos de DNA monomoleculares, es decir, una molécula de plásmido empaquetada en una partícula.
C)
En presencia de 1,5 equivalentes de carga del copolímero después de adición de BSA a una concentración final de 1 mg/ml e incubación durante una noche. Los complejos de DNA protegidos con copolímero se mantienen estables y no se agregan, en contraste a los complejos PEI-DNA no protegidos, que precipitan inmediatamente en las mismas condiciones (no representado).
Ejemplo 7 Determinación de los potenciales zeta de complejos de DNA
Las mismas muestras que en el Ejemplo 6 se sometieron a determinaciones del potencial zeta utilizando el instrumento Malvern. Los parámetros de índice de refracción, viscosidad y constante dieléctrica se ajustaron a los valores del agua desionizada, lo cual es válido únicamente como aproximación.
La Fig. 7 muestra el potencial zeta de complejos PEI- y DOTAP/colesterol-DNA en dependencia de la cantidad de copolímero P3YE5 añadida. El potencial zeta, una medida de la carga superficial de los complejos, disminuye desde valores altamente positivos pasando por un punto neutro hasta ligeramente negativos con las cantidades crecientes de copolímero añadidas. Esto demuestra que el copolímero se une a los complejos de DNA y neutraliza o apantalla sus cargas electrostáticas.
Ejemplo 8 Preparación de complejos de DNA y transfecciones
Para los ejemplos siguientes de cultivo de células y experimentos de transfección, se utilizaron los materiales y métodos siguientes, a no ser que se indique otra cosa:
a) Transferencia génica en cultivo de células en una placa de 96 pocillos
Se siembran células adherentes en placas de fondo plano a una densidad de 20.000 a 30.000 células por pocillo el día antes de la transfección (dependiendo de la tasa de división celular. Las células deberían ser 70-80% confluentes durante la transfección).
Antes de la transfección, se retira el medio por aspiración. Para la transfección, se añaden 150 \mul de medio a las células, seguido por adición de 50 \mul de complejos de DNA.
b) Composición de los complejos de DNA
Preferiblemente, concentración final 1 \mug de DNA/pocillo. El cálculo se realiza para 1,2 veces la cantidad necesaria. Se utiliza un volumen de 20 \mul por componente (DNA, PEI, polímero). Finalmente, se utilizan para la transfección 50 \mul de complejo de DNA. Tampón: HEPES 20 mM de pH 7,4/NaCl 150 mM = HBS. Los volúmenes de tampón utilizados se mantienen constantes.
En el caso en que se requieren complejos de DNA para 96 experimentos individuales, el cálculo se efectúa convenientemente como si se realizaran 100 experimentos individuales, por ejemplo:
DNA: 1 \mug x 100 x 1,2: 120 \mug en 20 x 100 \mul HBS = 2 ml volumen total.
Polietilenimina (PEI): Con objeto de obtener una relación N/P de 8, el cálculo de acuerdo con la fórmula
N/P = \frac{(\mu g \ PEI)}{43} \ x \ \frac{330}{(\mu g \ DNA)}
8 = \frac{(\mu g \ PEI)}{43} \ x \ \frac{330}{(120)},
muestra que se requieren 125,09 \mug de PEI, es decir en un volumen total de 20 x 100 \mul = 2 ml HBS.
Polímero de recubrimiento: Si, por ejemplo, debe utilizarse polímero de recubrimiento para la cantidad de DNA y PEI arriba indicada en una cantidad de 2 equivalentes de carga (con respecto a DNA) el volumen requerido de polímero de recubrimiento a una concentración c de 11,1 \mumol/ml, de acuerdo con la fórmula
\mu l \ (\text{polímero de recubrimiento}) = 1000 \ x \ \frac{(\mu g \ DNA)}{330} \ x \ \frac{\text{equiv. de Carga}}{c \ (\text{polímero de recubrimiento} \ [\mu mol/ml])}
\mu l \ (\text{polímero de recubrimiento}) \ = \ 1000 \ x \ \frac{120}{330} \ x \ \frac{2}{11,1} \ = \ 65,5 \ \mu l
que se diluyen también a 2 ml con HBS.
Esto es un ejemplo de 100 experimentos con 1 \mug de DNA cada uno. Por lo general, se realizan aproximadamente 5 experimentos y se examinan, por ejemplo, relaciones N/P de 4, 5, 6, 7, 8 con 0, 1, 2, 3 equivalentes de carga cada vez de polímero de recubrimiento, respectivamente.
c) Mezcla de los complejos de DNA
Después de la preparación de las diluciones requeridas, se añade DNA bajo agitación turbulenta a PEI. Después de 15 min, se añade el polímero de recubrimiento al complejo PEI-DNA preformado, nuevamente con agitación turbulenta. Después de 30 min adicionales, se añaden 50 \mul de complejo de DNA cada vez a las células que están presentes en 150 \mul de medio.
El tipo de recipiente utilizado depende del volumen total calculado. En el ejemplo anterior, se proporciona PEI convenientemente en un tubo de polipropileno de 14 ml (por ejemplo Falcon 2059), y los otros dos componentes se proporcionan en tubos de 6 ml (por ejemplo, Falcon 2063). Para experimentos individuales en una placa de 96 pocillos, los componentes pueden mezclarse también en una placa de 96 pocillos. Si el volumen total final es 1-1,5 ml, son adecuados tubos Eppendorf. En lugar de agitación turbulenta puede realizarse pipeteado hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta para la mezcladura.
Conversión a cápsulas de 3 cm (placa de 6 pocillos)
Para cápsulas de 3 cm (placa de 6 pocillos), se utilizan convenientemente cantidades de DNA de 2 a 5 \mug, con un volumen por componente, por ejemplo, de 100 \mul cada vez. El cálculo se realiza de manera análoga a la indicada anteriormente. En una placa de 12 pocillos, se utilizan convenientemente cantidades de aprox. 1 \mug de DNA por ensayo.
La Fig. 8 muestra la formulación de complejos de DNA de manera esquemática: Preferiblemente, se incuba en primer lugar un policatión con DNA plasmídico, dando como resultado un complejo de DNA cargado positivamente (por ejemplo, PEI, N/P = 8). A continuación, se añade copolímero con carga negativa, que se une electrostáticamente al complejo preformado. El copolímero puede modificarse con ligandos receptores, como se simboliza por asteriscos (a la derecha).
d) Tampón sustrato de luciferina
Como tampón sustrato de luciferina, se utilizó una mezcla de ditiotreitol 60 mM, sulfato de magnesio 10 mM, ATP 1 mM, D(-)-luciferina 30 \muM en tampón 25 mM de glicil-glicina de pH 7,8.
e) Determinación de proteína en lisados de células
El contenido de proteínas de los lisados se determinó utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad): A
10 \mul (o 5 \mul) de lisado, se añadieron 150 \mul (o 155 \mul) de agua destilada y 40 \mul de concentrado de tinte Bio-Rad para Ensayo de Proteínas por pocillo de una placa transparente de 96 pocillos (tipo "fondo plano", Nunc, Dinamarca). Se determinó la absorbancia a 630 nm utilizando el lector de absorbancia "Biolumin 690" y el programa de ordenador "Xperiment" (ambos de Molecular Dynamics, EE.UU.). Como curva de calibración, se midieron las concentraciones de 50, 33,3, 22,3, 15, 9,9, 6,6, 4,4, 2,9, 2,0, 1,3, 0,9 y 0 ng BSA/\mul. La seroalbúmina bovina (BSA) se adquirió como el Standard II para Ensayo de Proteínas Bio-Rad. De esta manera, los resultados pudieron expresarse finalmente como pg de luciferasa por mg de proteína.
Ejemplo 9 Transferencia génica en células K562 con complejos PEI(25kD)-DNA en presencia y en ausencia del copolímero P3YE5C
Se cultivaron células K562 (ATCC CCL 243) a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2} en medio RPMI-1640 complementado con 10% FCS, 100 unidades/ml penicilina, 100 \mug/ml estreptomicina y glutamina 2 mM. La tarde anterior a la transfección, se añadió desferoxamina a las células para dar una concentración final de 10 \muM. Se cambió el medio inmediatamente antes de la transfección. Se extendieron 50.000 células en cada caso en 160 \mul de medio cada vez en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Se preparó transferrina- PEI (hTf-PEI 25 kD) por aminación reductora esencialmente como ha sido descrito por Kircheis et al., 1997. Se obtuvo un producto que tenía acopladas por término medio 1,7 moléculas de transferrina por molécula de PEI.
En un experimento piloto, se determinó una composición de poliplejos hTf-PEI que da lugar a transfección alta y que demuestra claramente una influencia del ligando receptor.
Se combinaron 32,4 \mug de hTf-PEI (la cantidad se refiere a hTf) en 600 \mul de HBS con 36 \mug de PEI (25 kD) en 600 \mul de HBS. Se pipetearon en esta mezcla 40 \mug de DNA (pCMVLuc) en 600 \mul de HBS y se mezcló el todo. Después de 15 min, se añadieron 270 \mul de la solución resultante cada vez a 90 \mug en cada caso de soluciones del polímero P3YE5C en HBS o a HBS solamente. Estas soluciones contenían cantidades de polímero que contenían 0/0,5/1/1,5/2/3 equivalentes de carga con respecto a la carga del DNA aplicado. De manera análoga, se cargaron complejos de DNA sin hTf con la cantidad equivalente de PEI (40 \mug de DNA + 42 \mug PEI + polímero de recubrimiento). Se proporcionaron 60 \mul cada vez de las mezclas resultantes (correspondientes a una cantidad de 1 \mug de DNA/pocillo) en 5 pocillos cada vez de una placa de 96 pocillos con fondo redondo y se añadieron 50.000 células K562 en 160 \mul de medio RPMI cada vez. Después de 24 h, las células se sedimentaron por centrifugación. El sobrenadante se separó por aspiración, y se añadieron 100 \mul de tampón de lisis (Tris 250 mM de pH 7,8; Triton X-100 al 0,1%). Después de 15 min de incubación y mezcla por pipeteado, se transfirieron 10 \mul de muestra cada vez a una placa opaca (Costar) para el ensayo de luciferasa en formato de placa de 96 pocillos. Las muestras se proveyeron con 100 \mul de tampón sustrato de luciferina. La medida de la emisión de luz se llevó a cabo con un contador de centelleo y luminiscencia de microplacas "Top Count" (Canberra-Packard, Dreieich). El tiempo de recuento fue 12 segundos, el retardo del recuento fue 10 min, y los recuentos de fondo se sustrajeron automáticamente. Como estándar, se midieron 100, 50, 25, 12,6, 6,25, 3,13, 1,57, 0,78, 0,39, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,013, 0,007 y 0 ng de luciferasa cada vez (Boehringer Mannheim) en 10 \mul de tampón de lisis cada vez (= serie de dilución al doble) en las mismas condiciones. A partir de estas medidas se obtuvo una curva de calibración.
La Fig. 9 muestra los resultados en los experimentos de transferencia génica con complejos PEI-DNA (N/P = 8) en células K562 en presencia y en ausencia de transferrina como ligando receptor con adición del copolímero P3YE5C. El copolímero no interfiere con la transferencia génica e incluso la mejora si está presente un ligando receptor en el complejo de DNA. Se muestra la expresión del gen informador de luciferasa normalizada para el contenido total de proteína en el extracto de células (valores medios y desviaciones estándar de muestras triplicadas).
Ejemplo 10 Transfección de la línea de células de carcinoma de mama MDA-MB435S con complejos polilisina-DNA en presencia y en ausencia del polímero de recubrimiento P3INF7
Se cultivaron células MDA-MB435S (línea de células de carcinoma de mama humano) a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2} en medio DMEM complementado con 10% FCS, 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM. La tarde antes de la transfección, las células se extendieron a una densidad de 20.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos con fondo plano.
Los complejos de DNA se prepararon como sigue:
Cálculo para 1 pocillo: La cantidad de DNA a obtener es 1 \mug por pocillo, la cantidad de pL170 es 4 \mug en un volumen total de 60 \mul de HBS. Las cantidades se multiplicaron por 1,2. Los complejos de DNA se mezclaron como se especifica en la tabla siguiente, en la cual se añadió primeramente DNA a polilisina y esta mezcla se añadió después de 15 min al polímero P3INF7 o tampón. Los experimentos se realizaron por triplicado. Se añadieron cada vez 60 \mul de complejos de DNA a las células, las cuales se cubrieron con 150 \mul de medio. Después de 4 h, se cambió el medio. Después de 24 h, se llevaron a cabo los ensayos de luciferasa y proteína como se describe en el Ejemplo 9 después de lavado con PBS y adición de 100 \mul de tampón de lisis.
Nr. P3INF7 HBS \mul pL170 \mul = \mug HBS 7,2 \mug DNA en HBS (\mul)
1 144,6 (5 nmol) 71,4 28,8 79,2 108
2 289,2 (10 nmol) - 28,8 42,6 71,4
3 - - 28,8 187,2 216
La Fig. 10 muestra los resultados de los experimentos de transferencia génica en la línea de células de carcinoma de mama humano MDA-MB435S con complejos polilisina-DNA en presencia y en ausencia del copolímero P3INF7. En ausencia del copolímero, no tiene lugar expresión alguna medible del gen informador. La actividad destructora de la membrana y por consiguiente endosomolítica dependiente del pH del copolímero da lugar a una transferencia génica eficiente. 5 nmol o 10 nmol de P3INF7 se refieren a la cantidad de péptido INF7 unido al copolímero aplicada.
Ejemplo 11 Lipofección en presencia de polímeros de recubrimiento (Fig. 11)
Se cultivaron células NIH3T3 (ATCC CRL 1658) a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2} en medio DMEM complementado con 10% FCS, 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM.
La tarde anterior a la transfección, las células se extendieron a una densidad de 500.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos.
Preparación de los complejos de DNA
A 16 \mug de DNA en 240 \mul de HEPES 20 mM de pH 7,4, se añadió una solución de 242 nmol de liposomas DOTAP/colesterol en 240 \mul del mismo tampón. Esto da como resultado una relación de carga (+/-) de 5. De la solución resultante, se pipetearon 210 \mul a 105 \mul de una solución que contenía 6,36 nmol del polímero P3YE5C (con respecto al resto del péptido YE5C; esto corresponde a 3 equivalentes de carga de DNA). Para el experimento de control, se pipetearon 210 \mul de DOTAP/colesterol-DNA en 105 \mul de HEPES 20 mM de pH 7,4. Se añadieron cada vez 90 \mul de los complejos de DNA resultantes a las células que se mantuvieron en 800 \mul de medio reciente. Esto corresponde a 2 \mug de DNA por pocillo. Los experimentos se realizaron por triplicado.
De la misma manera, el experimento se llevó a cabo con Lipofectamina™ en lugar de DOTAP/colesterol. En este caso, se utilizó una cantidad de Lipofectamina (DOSPA) que da lugar a una relación de carga de 7 (+/-).
30 min después de la adición de los complejos de DNA, se añadió a las células 1 ml de medio reciente cada vez, y después de 3 horas se añadieron 2 ml adicionales. El medio no se cambió. 22 h después de la adición del complejo, las células se lavaron con PBS y se lisaron en 500 \mul de tampón de lisis. Se utilizaron partes alícuotas del lisado de células para el ensayo de luciferasa y para la detección del contenido de proteína.
La Fig. 11 muestra el resultado de la lipofección de las células NIH3T3 en presencia y en ausencia del copolímero P3YE5C. Ni la transfección con DOTAP/colesterol-DNA ni la realizada con lipofectamina se reducen significativamente (3 equivalentes de carga del copolímero. DOTAP/colesterol-DNA exhibe un potencial zeta neutro con esta composición; véase Fig. 7).
Ejemplo 12 Transfección de células HepG2 con DOTAP/-colesterol-DNA y PEI-DNA en presencia y en ausencia de P6YE5C
Se cultivaron células HepG2 (ATCC HB 8065) a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2} en medio DMEM complementado con 10% FCS, 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM.
Dos días antes de la transfección, las células se extendieron en placas de 6 pocillos a una densidad de 500.000 células por pocillo. La transfección con DOTAP/colesterol se realizó exactamente como se ha descrito arriba para las células NIH3T3, excepto que esta vez se utilizó el polímero P6YE5C. Ulteriormente, se pipetearon 7 \mug de DNA en 105 \mul de tampón HEPES a 7,3 \mug de PEI de 25 kD disuelta en el mismo volumen. Después de 15 min de incubación, se pipeteó esta solución en 105 \mul de una solución del polímero P6YE5C que contenía 3 equivalentes de carga de DNA de YE5C. Se añadieron cada vez 90 \mul de esta solución a las células. Los experimentos se realizaron por triplicado.
La Fig. 12 muestra la transferencia génica en células HepG2 en presencia y en ausencia del copolímero P6YE5C. La transfección por DOTAP/colesterol-DNA no se inhibe significativamente. La transfección por complejos PEI-DNA se reduce (3 equivalentes de carga del copolímero).
Ejemplo 13 Transferencia génica intravenosa in vivo a) Control (PEI-DNA, N/P = 8)
Se pipetearon 150 \mug de DNA (pCLuc) en 337,5 \mul de HEPES 20 mM de pH 7,4 en 156,4 \mul de PEI (25 kD, Aldrich) en el mismo volumen de tampón HEPES. Después de 15 min, se añadieron 75 \mul de glucosa al 50%. De esta solución, se inyectaron cada vez 100 \mul en la vena de la cola de ratones (correspondiente a una dosis de 20 \mug de DNA por animal).
b) Control (DOTAP/colesterol-DNA; relación de carga +/- = 5)
Se prepararon liposomas DOTAP-colesterol de acuerdo con un protocolo estándar (Barron et al., 1998). En este caso, se prepararon liposomas con una relación molar de DOTAP a colesterol de 1:1 y una concentración final de DOTAP 5 mM en glucosa al 5%. Se añadieron 130 \mug de DNA en 91,1 \mul de HEPES 20 mM de pH 7,4 a 393,5 \mul de suspensión de liposomas. Después de 15 min, se añadieron 65 \mul de glucosa al 50%. Se inyectaron cada vez 100 \mul de esta solución en la vena de la cola de ratones (correspondiente a una dosis de 20 \mug de DNA por animal).
c) PEI-DNA (N/P = 8) con recubrimiento de copolímero
Se añadieron 150 \mug de DNA en 2475 \mul a 156,4 \mug de PEI (25 kD) en el mismo volumen con agitación turbulenta. Después de 15 min, se añadieron 3 equivalentes de carga (con respecto a las cargas de la cantidad de DNA aplicada) de polímero P3YE5C en 2475 \mul de tampón HEPES con agitación turbulenta. Después de 30 min más, los complejos de DNA se concentraron por centrifugación en tubos Centricon 30 a una concentración de DNA de 454 \mug/ml. Esta solución se ajustó subsiguientemente a una concentración final de 200 \mug de DNA por ml y 5% de glucosa por adición de glucosa al 50% y HEPES 20 mM de pH 7,4. De esta solución, se inyectaron cada vez 100 \mul en la vena de la cola de ratones (correspondiente a una dosis de 20 \mug de DNA por animal).
d) DOTAP/colesterol-DNA (5:1) con recubrimiento de copolímero
Se pipetearon directamente 393,9 \mul de suspensión de liposomas en una solución de 130 \mug de DNA en 65,3 \mul de agua. Después de 15 min, se añadieron 3 equivalentes de carga de P3YE5C en 216,9 \mul de tampón HEPES y, después de 30 min más, 75 \mul de glucosa al 5%. De esta solución, se inyectaron cada vez 115,5 \mul en la vena de la cola de ratones (correspondiente a una dosis de 20 \mug de DNA por animal).
La Fig. 13 muestra el resultado de los experimentos de transferencia génica in vivo: Se inyectaron complejos
PEI-DNA y DOTAP/colesterol-DNA con o sin copolímero P3YE5C unido (3 equivalentes de carga) en la vena de la cola de ratones (n = 6). Los animales se sacrificaron 24 h después de la inyección y se determinó la expresión del gen informador en los órganos. Cada vez, la actividad máxima se midió en los sitios de inyección. Con el copolímero PEI-DNA, se encontró una expresión significativa del gen informador en el pulmón y en el corazón, mientras que la transferencia génica al pulmón por DOTAP/colesterol-DNA se inhibía por la aplicación del copolímero.
Ejemplo 14 Estabilización estérica de los complejos PEI-DNA
Se prepararon complejos PEI-DNA exactamente como se describe en el Ejemplo 6 (PEI-DNA, N/P = 8, 0/1,5/3 equivalentes de carga de copolímero P3YE5C o P6YE5C). El tamaño de los complejos se determinó por dispersión dinámica de la luz, encontrándose que era 20 a 30 nm. Subsiguientemente, se añadió NaCl 5 M a una concentración final de 150 mM. PEI-DNA sin copolímero se agregaba inmediatamente (después de 5 min, era medible una población de partículas de > 500 nm, y después de 15 min la mayoría de las partículas eran > 1000 nm; los complejos precipitaron de la solución durante la noche). En presencia de P3YE5C o P6YE5C (1,5 ó 3 equivalentes de carga) el tamaño de partícula se mantenía estable al menos durante 3 días.
Análogamente, la adición de BSA a una concentración final de 1 mg/ml conducía a una precipitación inmediata de PEI-DNA. En presencia de P3YE5C o P6YE5C (1,5 equivalentes de carga y más), el tamaño de partícula se mantenía constante al menos durante 24 horas (véase también Fig. 6c).
Ejemplo 15 Preparación de esponjas de colágeno cargadas con COPROGs (vectores génicos protegidos con copolímero)
Se añadieron cada vez 500 \mul de una solución de DNA plasmídico (que codificaba luciferasa bajo el control del promotor CMV; concentración de 0,5 mg/ml en agua) a 500 \mul cada vez de una solución de polietilenimina (25 kD; Aldrich; 521 \mug/ml en agua) utilizando una micropipeta y se mezclaron instantáneamente por pipeteado. La suspensión de vector resultante se añadió a 500 \mul de una solución acuosa del PROCOP ("copolímero protector") P6YE5C y se mezcló por pipeteado instantáneo. La solución de PROCOP contenía 2 equivalentes de carga de P6YE5C cada vez. Los equivalentes de carga se refieren al cociente de la carga (negativa) en el PROCOP y la carga negativa del DNA. La cantidad en nanomoles de PROCOP a utilizar se calcula de acuerdo con la fórmula
PROCOP \ (nmol) \ = \ \frac{DNA \ (\mu g)}{330} \ x \ CE
La cantidad de PROCOP a utilizar en microlitros se calcula de acuerdo con
PROCOP \ (\mu l) \ = \ \frac{DNA \ (\mu g)}{330} \ x \ \frac{CE}{C_{PROCOP} \ (mM)}
en donde CE son los equivalentes de carga de PROCOP y C_{PROCOP} es la concentración del copolímero. La concentra-
ción del polímero se da en términos de las cargas (negativas) del péptido (aniónico) en el polímero que, a su vez,
se hallan por determinación fotométrica de la concentración de péptido basada en la extinción de la tirosina en el péptido.
Se agruparon las suspensiones acuosas de vector resultantes. Se aplicaron cada vez 3 ml de suspensión de vector a una esponja Tachotop de 4,5 x 5 cm utilizando un micropipeteador (con anterioridad, la esponja disponible comercialmente se cortó en trozos de este tamaño, bajo el banco estéril, se pesó y se dispuso en cápsulas Petri de vidrio estériles). Después de 2 a 3 horas de incubación a la temperatura ambiente, las cápsulas Petri se sometieron brevemente a vacío en un liofilizador (Hetosicc CD4, Heto), seguido por retorno brusco de la cámara de vacío a la presión normal ("carga a vacío"). Esto hace que las burbujas de aire en la esponja desaparezcan y la esponja se empape completamente con líquido. Después de 4 horas de incubación en total, las esponjas se secaron durante una noche en las cápsulas Petri sin previa congelación en el liofilizador. Las esponjas se mantuvieron subsiguientemente en cápsulas Petri selladas con Parafilm a 4ºC hasta la implantación en los animales de ensayo.
Ejemplo 16 Preparación de esponjas de colágeno cargadas con vectores génicos convencionales (a) Carga con DNA plasmídico desnudo
En condiciones estériles, se aplicaron 500 \mug de DNA plasmídico (pCMVLuc) disuelto en 5 ml de glucosa al 5% a una esponja Tachotop de 4,5 x 5 cm con una pipeta. Esto corresponde a aprox. 20 \mug de DNA por cm^{2}. Después de 24 h de incubación a 4ºC, la esponja se liofilizó (liofilizador Hetosicc CD4, Heto, vacío < 10 \mubar) y se cortó en piezas de aprox. 1,5 x 1,5 cm en condiciones estériles. Una pieza de esponja de este tamaño corresponde por consiguiente a una carga de aprox. 45 \mug de DNA.
Dichas preparaciones se utilizaron para transferencia génica in vitro como se describe en el Ejemplo 19.
La Fig. 15 muestra una expresión baja del gen informador desde el comienzo, que llega a ser indetectable después de un breve período de tiempo.
(b) Esponjas de polietilenimina/DNA Pre-tratamiento de PEI y preparación de los complejos de DNA
Se disolvió PEI (peso molecular 25 kD) en agua destilada estéril o en tampón HBS y se neutralizó por adición de 80 \mul de ácido clorhídrico concentrado por 100 mg de PEI. Esta solución se separó de los componentes de peso molecular bajo con concentradores Centricon 30 (Amicon-Millipore) o por diálisis (peso molecular de corte 12-14 kD). La concentración de la solución se determinó por un ensayo de ninhidrina que cuantifica las aminas primarias.
Para la formación de complejos de DNA, se combinaron volúmenes iguales de soluciones de pDNA y PEI. El DNA se añadió bajo agitación con sacudidas a la solución de PEI. La cantidad de PEI se eligió de modo que diera como resultado una relación de nitrógeno a fosfato (relación N/P) de 8:1 ó 10:1. Esta relación es la relación molar de átomos de nitrógeno en la PEI a los fosfatos (= cargas negativas) de los nucleótidos del DNA.
Cálculo
N/P \ = \ \frac{(\mu g \ PEI)}{43} \ x \ \frac{330}{(\mu g \ DNA)}
(330 = peso molecular medio de un nucleótido; 43 = PM de la unidad base de PEI que se repite teniendo en cuenta las aminas primarias).
Carga de las esponjas con complejos PEI-DNA
Se aplicaron con una pipeta 5 ml de soluciones de complejo PEI-DNA que contenían 250 \mug, 375 \mug o 500 \mug de DNA y relaciones N/P de 8 ó 10 a esponjas Tachotop o Resorba de 4,5 x 5 cm de tamaño. 250 \mug de DNA por 4,5 x 5 cm corresponden a 10 \mug de DNA por cm^{2}, 375 \mug de DNA en 4,5 x 5 cm corresponden a 15 \mug de DNA por cm^{2}, y 500 \mug de DNA en 4,5 x 5 cm corresponden a 20 \mug de DNA por cm^{2}. Después de 24 h de incubación a 4ºC, las preparaciones se liofilizaron y se cortaron en piezas de aprox. 1,5 x 1,5 cm en condiciones estériles (correspondientes a 22,5 \mug, 34 \mug o 45 \mug de DNA).
Dichas preparaciones se utilizaron para transferencia génica in vitro tal como se describe en el Ejemplo 19.
La Fig. 15 muestra una expresión génica alta. La expresión génica se ensayó durante varias semanas. Se observó un aumento de la expresión en las esponjas (no representado).
(c) Esponjas liposoma/DNA Preparación de liposomas catiónicos a partir de polvo de DOTAP
En un tubo de vidrio silanizado con tapón roscado, se preparó una solución 5 mM de DOTAP en cloroformo. El cloroformo se eliminó por evaporación rotativa (Rotavapor-R, Büchi, Suiza) con lo que se formó una película uniforme de lípido en la pared interior del tubo. El evaporador rotativo se ventiló con argón gaseoso a fin de excluir el oxígeno. El tubo se sometió al vacío del liofilizador durante una noche. La película lipídica se rehidrató subsiguientemente con 15 ml de una solución de glucosa al 5%, en primer lugar bajo agitación tumultuosa durante 30 segundos, y luego bajo tratamiento con ultrasonidos (Sonicator: Sonorex RK 510 H; Bandelin) durante 30 min, lo que dio como resultado la formación de una suspensión estable de liposomas.
Preparación de los lipoplejos DOTAP
Para una esponja de 4,5 x 5 cm, se requieren 222 \mug de DNA a fin de obtener 20 \mug de DNA por 1,5 x 1,5 cm. La relación de carga (+/-) debería ser 5:1, donde las cargas positivas proceden de DOTAP y las cargas negativas del DNA. 222 \mug de DNA corresponden a 0,67 \mumol de cargas negativas. En un tubo de poliestireno, se cargaron 3,35 \mumol de liposomas DOTAP hasta un volumen de 2,5 ml con solución de glucosa al 5%. Se añadieron a esto 222 \mug de DNA, asimismo en 2,5 ml de solución de glucosa al 5%, bajo ligera agitación.
Aplicación de los lipoplejos DOTAP a la esponja
Se distribuyeron uniformemente 5 ml de la solución liposoma/DNA preparada anteriormente en una esponja Tachotop de 4,5 x 5 cm en condiciones estériles utilizando una pipeta. Después de 24 h de incubación a 4ºC, la esponja se liofilizó y se cortó subsiguientemente en piezas de 1,5 x 1,5 cm.
(d) Esponjas DNA/DOTAP
500 \mug de DNA (pCMVLuc) en 5 ml de solución de glucosa al 5% se pipetearon en una esponja Tachotop de 4,5 x 5 cm en condiciones estériles, se incubaron a 4ºC durante 24 h y se liofilizaron subsiguientemente. Esto corresponde a 20 \mug de DNA por 1 x 1 cm o 45 \mug de DNA por 1,5 x 1,5 cm.
En un experimento piloto, se demostró por carga de una solución de violeta de metilo al 0,01%-cloroformo en una esponja de colágeno que la estructura entera de la esponja era mojada uniformemente por la solución. A partir de ello se llegó a la conclusión de que esto debería ser posible asimismo para una solución de lípido en cloroformo. La relación de carga deseada debería ser 5. Para 500 \mug de DNA esto requiere una cantidad de 7,6 \mumol de DOTAP. De acuerdo con ello, se cargaron en la esponja 5 ml de una solución de 1 mg/ml de DOTAP en cloroformo. Subsiguientemente, la esponja se incubó a -20ºC y luego durante una noche a la temperatura ambiente (con objeto de dejar que se evaporara el cloroformo). La esponja se cortó en piezas de aprox. 1,5 x 1,5 cm en condiciones estériles.
(e) Esponjas DOTAP/DNA
La relación de carga deseada era nuevamente 5:1. Se aplicaron 5 ml de una solución de 1 mg/ml de DOTAP en cloroformo a esponja Tachotop, Tissu Vlies o Resorba de 4,5 x 5 cm utilizando una pipeta y se incubaron durante aprox. 1 hora a -20ºC. El cloroformo se evaporó durante una noche a la temperatura ambiente. Se aplicaron 500 \mug de DNA (pCMVLuc) en 5 ml de solución de glucosa al 5% por esponja de 4,5 x 5 cm con una pipeta, se incubaron durante 24 h a 4ºC y se liofilizaron posteriormente. Esto corresponde a 20 \mug de DNA por cm^{2}.
(f) Esponjas DOTAP-colesterol/DNA
La relación de carga deseada (+/-) era de nuevo 5:1, y la carga de DNA deseada era 20 \mug por cm^{2}. Por consiguiente, se disolvieron 5 mg de DOTAP y 2,95 mg de colesterol (esto es, 305 nmol de cada uno) en 2,5 ml de cloroformo cada vez y se combinaron subsiguientemente. Se aplicó esta solución a una esponja Tachotop de 4,5 x 5 cm con una pipeta, y se incubó durante 1 h a - 20ºC, seguido por evaporación del cloroformo a la temperatura ambiente. Se aplicaron
500 \mug de DNA (pCMVLuc) en 5 ml de solución de glucosa al 5% a la esponja de 4,5 x 5 cm con una pipeta, se incubó durante 24 h a 4ºC y se liofilizó. Subsiguientemente, la esponja se cortó en piezas de 1,5 x 1,5 cm.
Variante
Se prepararon 180 ml de una solución DOTAP:colesterol = 1:0,9 a una concentración total de lípidos de 2 mM en cloroformo. Las esponjas Tachotop (Nycomed) se cortaron por la mitad (= 4,5 x 5 cm) y se sumergieron en 30 ml cada vez de esta solución en tubos de polipropileno de 50 ml con tapón roscado, seguido por una incubación total de 2 horas en una incubadora de sacudidas. Intermitentemente, los tubos se llevaron ligeramente a vacío durante un breve período de tiempo con el tapón abierto ("carga a vacío") en el liofilizador, de tal modo que las esponjas llegaron a empaparse completamente con la solución de cloroformo. Las esponjas se transfirieron finalmente desde el baño de cloroformo a cápsulas Petri de vidrio y se secaron a vacío durante una noche. 500 \mug de DNA (pCMVLuc) en 5 ml de solución de glucosa al 5% se dejaron gotear sobre 4,5 x 5 cm de esponja cada vez, se incubaron durante 4 h a la temperatura ambiente y se liofilizaron. La esponja se cortó subsiguientemente en piezas de 1,5 x 1,5 cm. estas preparaciones se utilizaron para transferencia génica in vitro como se describe en el Ejemplo 19.
Inicialmente, se observa en las células de la cápsula de cultivo una expresión alta que disminuye rápidamente.
En contraste, la expresión en la esponja se mantiene constante y persiste durante un largo período de tiempo.
Fig. 15.
(g) Esponjas DNA/PEI-SH-SPDP (i) Acoplamiento covalente de PEI a las esponjas
Se añadieron 0,5 ml de una solución 15,5 mM de SPDP en etanol absoluto a 2 ml de HEPES 0,1 M de pH 7,9, se mezclaron, se aplicaron a esponjas Tachotop de 4,5 x 5 cm con una pipeta y se incubaron durante una noche a 37ºC. Los grupos amino de las lisinas en el colágeno reaccionan en una reacción de sustitución nucleófila con el grupo carboxilo del éster activado en SPDP.
El SPDP sin unir se separó cuantitativamente por lavado con agua destilada (en tubos Falcon de 14 ml; Becton Dickinson, EE.UU.) hasta que no pudo determinarse fotométricamente ya más absorción entre 200 y 400 nm en los sobrenadantes. Subsiguientemente, las esponjas se liofilizaron y se cortaron en piezas de aprox. 1,5 x 1,5 cm. Las piezas de esponja se pesaron (con una balanza MC 1 de Sartorius, Göttingen). Para la determinación de la cantidad de SPDP acoplada, se incubó una pieza de esponja con 2 ml de HBS y 3 \mul de \beta-mercaptoetanol. La tiopiridona liberada durante este procedimiento se determinó fotométricamente a 342 nm (\varepsilon = 8080 l/mol). La sustitución se calcula de acuerdo con:
Sustitución (nmol/mg) = \frac{E_{342} \ x \ Vol_{(ml)} \ x \ 10^{6}}{\varepsilon \ (l/mol) \ x \ Peso_{(mg)}}
Por término medio, la sustitución era aproximadamente 20 nmol de SPDP/mg de colágeno. No obstante, se prepararon también esponjas con 0,45 nmol SPDP/mg de colágeno.
(ii) Derivatización de PEI con iminotiolano (reactivo de Traut)
Con objeto de acoplar PEI covalentemente al SPDP y con éste a la esponja por la vía de un enlace disulfuro, tiene que introducirse un grupo tiol en PEI. Esto se llevó a cabo por acoplamiento de 2-iminotiolano a PEI.
Se mezcló PEI con un exceso molar doble de iminotiolano mientras se enjuagaba con argón. Se añadió un volumen 1/15 de HEPES 1 M de pH = 7,9. Subsiguientemente, la reacción se continuó a la temperatura ambiente durante aprox. 20 min. Se eliminó el exceso de reactivo por centrifugación repetida en tubos Centricon 30. Los grupos tiol libres en la PEI se determinaron con reactivo de Elman.
(iii) Acoplamiento del derivado PEI-iminotiolano a esponjas de SPDP-colágeno
Se añadió un exceso de 5 a 10 veces de PEI (con respecto a la relación de grupos tiol libres en la PEI a grupos tiopiridilo en la esponja) a las piezas de esponja de SPDP. Después de 7 días a la temperatura ambiente, se había completado la reacción. Esto se determinó por determinación fotométrica de la absorbancia a 342 nm. Había reaccionado el 100% de la SPDP en la esponja con PEI-SH.
La cantidad de polietilenimina acoplada se calcula de acuerdo con:
Sustitución (nmol/mg) = \frac{E_{342} \ Vol_{(ml)} \ x \ 10^{6}}{\varepsilon \ _{(l/mol)} \ x \ Peso_{(mg)}}
Las esponjas se enjuagaron con agua hasta que ya no pudo detectarse más absorbancia a 342 nm en el sobrenadante. A continuación, se liofilizaron las esponjas.
(iv) Aplicación de DNA a esponjas PEI-SH-SPDP
Se cargaron 20 \mug de DNA (pCMVLuc) en 500 \mul de solución de glucosa al 5% con una pipeta por pieza de esponja de 1,5 x 1,5 cm, se incubaron durante 24 h a 4ºC y se liofilizaron.
(v) Esponjas DNA/péptido-SPDP
Las esponjas se cargaron con SPDP como se ha descrito. Se obtuvo una sustitución media de 20 nmol SPDP/mg de colágeno. No obstante se prepararon también esponjas con 12,8 nmol de SPDP/mg de colágeno. Se aplicó el péptido SFO7-SH de la secuencia (KKKK)_{2}KGGC a la esponja en un exceso molar doble sobre los grupos SPDP en 300 \mul de HEPES 0,1 M de pH = 7,9. La reacción se llevó a cabo en un tubo Falcon de 14 ml en el cual el espacio de aire del tubo se enjuagó brevemente con argón. Después de 2 días a la temperatura ambiente, la reacción se había completado en un 60%. Esto se determinó por la absorción del sobrenadante a 342 nm (determinación de la tiopiridona liberada). El cálculo de la cantidad de péptido acoplado se realizó como se describe para PEI.
Las esponjas péptido-SPDP se lavaron con agua destilada hasta que ya no podía medirse más absorbancia a 280 nm en el sobrenadante. Subsiguientemente, se liofilizaron las esponjas.
(vi) Aplicación de DNA a esponjas péptido-SPDP
Se cargaron 20 \mul de DNA (pCMVLuc) en 500 \mul de solución de glucosa al 5% por pieza de esponja de 1,5 x 1,5 cm con una pipeta, se incubaron durante 24 h a 4ºC y se liofilizaron.
Ejemplo 17 Implantación subcutánea en ratas Wistar y determinación de la expresión del gen informador (a) Animales de ensayo
Se utilizaron como animales de ensayo siete ratas Wistar macho de dos meses (Charles River Deutschland GmbH, Sulzfeld) con un peso corporal de 300-400 g. Las ratas se mantuvieron en grupos en jaulas Makrolon tipo 4 con una ocupación máxima de 5 animales. Como nutrición exclusiva, los animales tienen a su disposición pelets de Altromin 1324, Dieta Para Ratas y Ratones (Altromin, Lage/Lippe, Alemania) y agua a discreción. Los animales se mantienen sobre gránulos de madera de coníferas esterilizados, exentos de polvo (Altromin) que se cambian dos veces por semana. De acuerdo con las regulaciones de mantenimiento de los animales de ensayo, los animales se alojan en ambientes especializados de una instalación animal para mantenimiento convencional de animales a una temperatura ambiente de 20-25ºC con ventilación constante del aire. La humedad relativa es 60%-70%. Iluminación: fases de 12 horas, cada una de un ciclo luz-oscuridad. La intensidad de luz es 50-100 lux. Los animales se mantienen durante al menos dos semanas antes de la experimentación en la instalación animal del instituto y no se vacían antes de la cirugía.
(b) Implantación de las esponjas (i) Materiales
Aparato de anestesia (aparato de anestesia MDS Matrx) con Isofluran (Abbot GmbH, Wiesbaden, Alemania):
Éste es un sistema cíclico con un ventilador que expulsa el aire maloliente y proporciona aire fresco. Las ventajas son inhalación constante para tolerancia quirúrgica sin necesidad de inyectar narcóticos y oportunidad de ajuste fino de la intensidad de la anestesia.
No se requiere medicación previa alguna y el animal recupera la consciencia dentro de unos cuantos minutos después de la anestesia.
Cámara de cuerpo entero de vidrio acrílico transparente con tapa
Cámara de cabeza
Almohadilla de calentamiento (ajustada al nivel 2, \sim 38ºC)
Tela de cubierta verde para la mesa quirúrgica o la rata
Maquinilla de esquilar
Desinfectante de la piel (Cutasept® F, Bode Chemie, Hamburgo, Alemania)
Ungüento para los ojos Bepanthen® Roche (Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen, Alemania)
Pluma permanente resistente al agua para marcación de las ratas
Guantes estériles desechables
Equipo de instrumentos quirúrgicos estériles constituido por:
1 fórceps anatómico
1 fórceps quirúrgico
1 Tijeras Lexer con cuchilla puntiaguda sobre cuchilla roma
1 Tijeras Metzenbaum convexas (puntiaguda/-puntiaguda)
1 torunda de gasa para soporte de agujas
Sutura quirúrgica: sutura monohilo, azul, 45 cm de longitud, 4/0 Prolene® con aguja puntiaguda sellada
Bisturí estéril desechable No. 15
14 esponjas numeradas y pesadas por grupo experimental (7 animales)
(ii) Cirugía
Los animales se llevan a la sala de cirugía aprox. 15 minutos antes de la cirugía con objeto de dejar que se adapten al entorno. La cámara de cuerpo entero que está conectada con el dispositivo de anestesia se inunda con oxígeno/4% de Isofluran (350 cm^{3}/min) aprox. 2 min antes de inicializar la anestesia. Esto se hace para conseguir la concentración correspondiente del narcótico que garantice la inicialización más rápida y con ello más suave posible de la anestesia (etapa de excitación breve). La rata se introduce en la cámara de cuerpo entero y la concentración inicial de los gases de inhalación se mantiene constante hasta que -después de 1 a 2 minutos- se pierde el reflejo de enderezamiento (la rata descansa sobre su lomo) y se alcanza la etapa de anestesia III.1-2. La rata se retira de la cámara, se coloca en posición ventral y se provee de la cámara de cabeza. Una vez que el animal ha alcanzado la etapa de anestesia III.2, la etapa de tolerancia quirúrgica (el reflejo de retirada pedal debe ser negativo), se reduce el suministro de Isofluran a 1,5%. Se aplica un ungüento de engrasado oftálmico a ambos ojos con objeto de prevenir el secado excesivo de la córnea debido a la pérdida del reflejo palpebral. En la región lumbar (en el área dorsal entre la última costilla y la extremidad posterior), se afeita un área de aprox. 7 x 2 cm utilizando la maquinilla de esquilar, seguido por limpieza y desinfección de las áreas de la piel con una torunda de gasa rociada con Cutasept. Se sujeta la piel en el lado derecho aprox. A 2 cm de la mediana con fórceps quirúrgicos y se practica una incisión de 1 cm con un bisturí en dirección dorso-ventral. Utilizando las tijeras Metzenbaum, la incisión de la piel se extiende de manera roma y el tejido subcutáneo se socava cuidadosamente aprox. 3 cm en dirección craneal. La periferia craneal de la herida se mantiene abierta con fórceps quirúrgicos y la esponja preparada se introduce tan lejos como sea posible en dirección craneal en el tejido socavado. La incisión se cierra con una pinza en forma de U. se repite el mismo procedimiento en el lado izquierdo (véase 5.-7.). Se interrumpe el suministro de Isofluran mientras se continúa la perfusión de O_{2}. Después de la reaparición del reflejo de deglución, se aplican oralmente aprox. 0,1 ml de Novalgin® (sustancia activa: Metamizol-Sodio; Hoechst AG, Frankfurt, Alemania) al animal como analgésico no esteroidal. El animal se pone en una jaula de ocupación individual hasta la recuperación plena de la consciencia y se devuelve a su jaula después de aprox. 1 hora.
(c) Recuperación de la esponja (i) Materiales
Aparato de anestesia (aparato de anestesia MDS Matrx) con Isofluran (Abbot GmbH, Wiesbaden, Alemania)
Cámara de cuerpo entero de vidrio acrílico transparente con tapa
Cámara de cabeza
Guantes estériles desechables
Equipo de instrumentos quirúrgicos estériles (véase arriba)
1.000 ml de solución de infusión isotónica de cloruro de sodio (Delta-Pharma GmbH, Pfullingen, Alemania), provista de 50.000 U.I. de heparina (2 x 5 ml de solución de inyección Heparina-Sodio de 25.000 U.I. cada una de Ratiopharm® GmbH, Ulm/Donautal, Alemania)
Tubo de infusión
Cánula de mariposa 19 G
Los animales se someten a perfusión antes de la recuperación de la esponja con objeto de obtener un tejido tan drenado de sangre como sea posible. Esto tiene por objeto reducir el número de factores que interfieran potencialmente con el ensayo de la luciferasa subsiguiente (por ejemplo hemoglobina) a un mínimo. Tubos de homogeneización de 2 ml con tapón roscado (tubo de tapón roscado de 2,0 ml desechable/cónico provisto de tapón, VWR Scientific Products, West Chester, EE.UU.) se llenan hasta la marca de 0,3 ml con bolitas de homogeneización grandes (Zirconia Beads, de 2,5 mm de diámetro, Biospec Products, Inc., Bartlesville, EE.UU.) y con 750 \mul cada uno de tampón de lisis para experimentos con animales (10 ml de Tampón de Lisis Informador 5x; Promega Corporation, Madison, EE.UU.; + 40 ml de agua bidestilada + 1 tableta de Protease-Inhibitor Complete™; Boehringer Mannheim GmbH, Alemania). Estos tubos recibirán las esponjas recuperadas.
(ii) Procedimiento
La rata se somete a pretratamiento y se anestesia como se describe bajo Implantación de la Esponja 1.-2. El animal se coloca en posición dorsal. Se abre la cavidad abdominal con tijeras en una incisión mediana que se extiende desde la zona pre-umbilical al manubrio del esternón. Se practican incisiones de alivio a la derecha y a la izquierda de la última costilla. Se deja al descubierto la vena cava caudal y se inserta una cánula de mariposa en posición caudal en la unión con las venas renales. Se conecta la solución de infusión. Después de infusión de aprox. 5 ml, se abre la vena cava caudal con un bisturí en posición caudal del punto de inserción. El animal se somete a perfusión con 100-150 ml de solución de infusión o se desangra hasta que es evidente una decoloración clara del hígado. La rata se coloca en posición ventral. Incisión de la piel en la región mediana utilizando un bisturí, que se extiende desde la región lumbar hasta aprox. 7 cm en dirección craneal; incisiones de alivio a la izquierda y a la derecha de la zona caudal respecto a las heridas de implantación. Las esponjas se liberan en gran parte por disección con tijeras o bisturí y se retiran junto con el tejido circundante (tejido conectivo y una porción de aprox. 1 cm del músculo dorsal largo). Cada esponja recuperada (con tejido circundante) se lava con tampón 1 x PBS; la esponja y el tejido se separan a continuación y se transfieren a los tubos de homogeneización marcados preparados previamente. Los tubos llenos se ponen luego en hielo y se procesan inmediatamente, si es posible.
(iii) Procesamiento de las muestras
Las muestras, que deben mantenerse continuamente en hielo, se homogeneízan utilizando un Mini Bead Beater® (Biospec Products, Inc., Bartlesville, EE.UU.) durante 3 x 20 segundos, seguido por centrifugación a 14.000 rpm durante 10 min a 4ºC.
Ensayo de luciferasa
Se retiran 20 \mul del sobrenadante por tubo y se transfieren a los pocillos de una placa Costar® de 96 pocillos (placa opaca - 96 pocillos negros compactos, Corning Costar Corporation, Cambridge, EE.UU.). Se añaden 100 \mul de tampón de luciferasa por pocillo (Promega Luciferase Assay System, Promega Corporation, Madison, EE.UU.) y se miden durante 12 s con un retardo de recuento de 1 min.
Los resultados de los experimentos in vivo arriba descritos se presentan en la Tabla siguiente.
5
La tabla muestra transferencia génica in vivo después de implantación subcutánea de las preparaciones de esponja. Las esponjas se prepararon como se describe en los Ejemplos 15 ó 16 y se implantaron subcutáneamente en ratas Wistar como se describe en el Ejemplo 16. La expresión génica se determinó por vez primera después de 3 días. Únicamente las esponjas de colágeno cargadas con complejos PEI-DNA recubiertas con un copolímero de la invención dan lugar a una expresión detectable de gen informador en esta disposición experimental (los números son fg de luciferasa/mg de proteína).
Ejemplo 17 Liberación de DNA marcado radiactivo a partir de diversas preparaciones de esponja de colágeno-vector (a) Marcación radiactiva de DNA plasmídico por traslación de la mella
Se utilizó el estuche de traslación de mella de Amersham (# N5500). Se utilizó 1 \mug de DNA (pCMV\betaGal) por reacción de marcación. Se cambió el protocolo del fabricante de tal manera que el tiempo de reacción fue 15 min a 15ºC en lugar de las 2 h a 15ºC sugeridas para DNA lineal. Como el nucleósido-trifosfato se utilizó [\alpha-^{32}P] dATP con una actividad específica de 3000 Ci/mmol (Amersham, Freiburg). La separación de [\alpha-^{32}P] dATP no incorporado se llevó a cabo de acuerdo con el principio de filtración en gel y el protocolo del fabricante con "Columnas de Purificación de Muestras Nuc Trap" y el aparato de unión apantallado con vidrio acrílico "Dispositivo de Apantallado Beta Push Column" (ambos de Stratagene, Heidelberg). El plásmido resultante se examinó por electroforesis en gel de agarosa (gel de agarosa al 1%, 100 V, 35 min, tinción con bromuro de etidio). Se cargó el mismo mezclado con plásmido sin marcar y se visualizó bajo luz UV y por autorradiografía después de electroforesis y secado del gel. Esto permite la evaluación del tamaño y la fracción relativa de los fragmentos de plásmido formados durante la marcación de la mella. Para purificar de enzimas el DNA marcado radiactivo, se utilizó el "Sistema de Purificación de DNA Promega Wizard™ PCR Preps" (Promega, EE.UU.) con una modificación menor del protocolo del fabricante concerniente al equipo.
(b) Preparación de esponjas modificadas químicamente con DNA marcado radiactivo (i) Esponjas DOTAP/DNA-Tachotop
Se cortaron esponjas Tachotop en piezas de aprox. 1,5 x 1,5 cm y se pesaron. El peso medio era 5 mg. A continuación, se aplicaron 450 \mul de una solución de 1 mg/ml de DOTAP en cloroformo con una pipeta a la esponja, se incubaron durante 1 h a -20ºC, seguido por evaporación del cloroformo a la temperatura ambiente y pesada de las esponjas. Estas esponjas DOTAP se pusieron en los pocillos de una placa de 6 pocillos. Una mezcla de 20 \mug (en un caso también 40 \mug) de plásmido sin marcar y 10 \mul y 30 \mul, respectivamente, del producto de la marcación radiactiva por 5 mg de esponja en un volumen total de 200 \mul de solución de glucosa al 5% se aplicó a la esponja utilizando una pipeta, se incubó a 4ºC durante 2-24 h y se liofilizó.
(ii) Esponjas DNA-Tachotop
Método 1
Las esponjas Tachotop se cortaron en piezas de aprox. 1,2 x 1,5 cm y se pesaron. Las esponjas se pusieron en los pocillos de una placa de 6 pocillos. Se cargaron con una pipeta 20 \mug de DNA plasmídico sin marcar por 5 mg de esponja y 10 ó 30 \mul de DNA marcado radiactivo (en un volumen total de 200 \mul de solución de glucosa al 5%), se incubó a 4ºC durante 2-24 h y se liofilizó.
Método 2
Sobre una esponja Tachotop de 4,5 x 5 cm, se cargaron con una pipeta 500 \mug de DNA plasmídico sin marcar y 122,1 \mul de DNA marcado radiactivo (en un total de 2 ml de solución de glucosa al 5%), se incubó durante 12 h a 4ºC y se liofilizó. La esponja se cortó en piezas de 1,5 x 1,5 cm y se pesó cada pieza. Para determinar la fracción del DNA aplicada que se mantenía en la cápsula de cultivo de células después de la liofilización durante la preparación de la esponja, se enjuagaron la tapa y el fondo de la placa con 2 ml de 10 x SDS, midiéndose todas y cada una de las partes alícuotas de 40 \mul.
(iii) Esponjas DOTAP/colesterol/DNA-Tachotop
La relación de carga deseada (+/-) era nuevamente 5:1, y la sustitución deseada con DNA era 20 \mug por cm^{2}. Por ello, se disolvieron 5 \mug de DOTAP y 2,25 mg de colesterol (que son 305 nmol de cada uno) en 2,5 ml de cloroformo cada vez y se combinaron subsiguientemente. Esta solución se aplicó a una esponja Tachotop de 4,5 x 5 cm con una pipeta, y se incubó durante 1 h a -20ºC seguido por evaporación del cloroformo a la temperatura ambiente. Se cargaron 500 \mug de DNA plasmídico sin marcar y 122,1 \mul de DNA marcado radiactivo (en un volumen total de 2 ml de solución de glucosa al 5%) en la esponja de 4,5 x 5 cm con una pipeta, se incubó durante 24 h a 4ºC y se liofilizó. La esponja se cortó en piezas de 1,5 x 1,5 cm y se pesó cada pieza. Para determinar la fracción del DNA aplicada que se mantenía en la cápsula de cultivo de células después de la liofilización durante la preparación de la esponja, se enjuagaron la tapa y el fondo de la placa con 2 ml de 10 x SDS, midiéndose todas y cada una de las partes alícuotas de 40 \mul.
(iv) Esponjas polietilenimina/DNA-Tachotop
Sobre una esponja Tachotop de 4,5 x 5 cm, se cargaron con una pipeta 2 ml de soluciones de complejo PEI/DNA (con 500 \mug de DNA plasmídico sin marcar y 122,1 \mul de DNA marcado radiactivo para una relación N/P de 6). Los 500 \mug de DNA por 4,5 x 5 cm corresponden a 20 \mug de DNA x cm^{2}. Después de 24 h de incubación a 4ºC, las preparaciones se liofilizaron, se cortaron a piezas de aprox. 1,5 x 1,5 cm y se pesó cada pieza. Para determinar la fracción del DNA aplicada que se mantenía en la cápsula de cultivo de células después de la liofilización durante la preparación de la esponja, se enjuagaron la tapa y el fondo de la placa con 2 ml de 10 x SDS, midiéndose todas y cada una de las partes alícuotas de 40 \mul.
(v) Se prepararon esponjas DNA-péptido-SPDP como se describe en el Ejemplo 16 con la única excepción de que el componente DNA contenía DNA marcado radiactivo como se ha descrito arriba. (vi) Esponjas polietilenimina/DNA-Tachotop protegidas con copolímero
Estas esponjas se prepararon como se describe en el ejemplo 15, con la única excepción de que la solución de DNA plasmídico contiene adicionalmente DNA marcado radiactivo.
(c) Determinación de la liberación dependiente del tiempo de DNA marcado radiactivo a partir de las esponjas
Las diversas preparaciones de esponja se proveyeron de 1 ml de PBS cada una en tubos de vidrio silanizados (tubos de cultivo de 16 x 100 mm con tapones roscados fabricados de vidrio AR, Brand, Alemania). Los tubos se agitaron brevemente a 3.000 rpm (centrífuga: Megafuge 2.0 R, Heraeus, Munich) y se agitaron luego a 37ºC en un aparato de sacudidas en baño de agua a 80 ó 120 rpm. Después de 1 h, 1 día, 3 días y subsiguientemente cada 3 días, se determinó la cantidad de DNA radiactivo en el sobrenadante. Para este propósito, los tubos se centrifugaron a 3.000 rpm y se agitaron brevemente. Se retiraron 40 \mul del sobrenadante y se reemplazaron con 40 \mul de PBS. Las muestras se mezclaron con 160 \mul de cóctel LSC de alta eficiencia Microscint 20 (Packard, EE.UU.) en los pocillos de una placa blanca opaca de 96 pocillos (tipo "fondo plano, sin tratar", Costar, EE.UU.) y se sometieron a recuento utilizando un instrumento Top Count (Canberra-Packard, EE.UU.) bajo corrección automática para la semi-vida. El tiempo de recuento fue 5 min, el retardo de recuento fue 10 min y se formó el promedio de 3 medidas. Como referencia, se midieron 2 \mul del DNA plasmídico marcado. La concentración medida de DNA (cpm/ml) se corrigió para las muestras ya tomadas anteriormente (las cantidades retiradas con anterioridad se sumaron y se añadieron al valor medido). Con objeto de determinar la cantidad del DNA aplicada que se mantenía en las cápsulas de cultivo de células después de la liofilización durante la preparación de la esponja, se enjuagaron las cápsulas con 500 \mul de PBS, de la cual se midieron partes alícuotas de 40 \mul. Al final de una serie de medidas (por ejemplo después de 30 días de incubación), se trataron las esponjas con una solución de SDS al 1% con objeto de determinar si podría recuperarse 100% de la dosis aplicada. Para este propósito, se transfirieron las esponjas a tubos Falcon nuevos, se añadió 1 ml de SDS al 1% y se incubaron las muestras durante 1 día con agitación enérgica repetida. A continuación, se retiraron 40 ml de los sobrenadantes, se mezclaron con 160 \mul de Microscint 20 en los pocillos de una placa blanca opaca de 96 pocillos, y se sometió a recuento la radiactividad (cpm) utilizando el instrumento Top Count.
Los resultados se muestran en la Fig. 14.
Las esponjas cargadas con DNA desnudo liberan aprox. 50% de la dosis aplicada en el transcurso de una hora, seguido por una liberación prolongada aproximadamente lineal. En contraste, las esponjas cargadas con vector exhiben poca liberación inicial, no mayor que 5%, seguido por una liberación menor a largo plazo por unidad de tiempo. Esto indica una unión eficiente de los vectores examinados a la matriz de colágeno.
(d) Electroforesis en gel de agarosa para la caracterización del DNA liberado
Después de 5 ó 30 días de agitación mediante sacudidas de las esponjas DOTAP/DNA en 1 ml de PBS, se sometieron 20 \mul cada vez del sobrenadante a electroforesis durante 35 min a 100 V en un pequeño gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. Como control, se cargaron en el gel 1 \mug de DNA plasmídico sin marcar y complejos liposoma-DNA (relación de carga 5:1). El gel se fotografió bajo luz UV, y subsiguientemente se secó y se expuso en una película de rayos X.
Ejemplo 19 Transfección de las células NIH 3T3 por/sobre las esponjas de colágeno marcadas con vector in vitro
En placas de cultivo de células (placas de 6 pocillos de la compañía TPP), se siembran aprox. 50.000 a 400.000 fibroblastos de ratón NIH 3T3 tripsinizados (adherentes) por pocillo en 4 ml de medio DMEM (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco) complementado con antibióticos (500 unidades de penicilina, 50 mg de estreptomicina/500 ml) y 10% de suero de ternero fetal así como 1,028 g/l de N-acetil-L-alanil-L-glutamina. Las células se incuban durante uno a dos días en una atmósfera (aire) con 5% de dióxido de carbono a 37ºC. Se pone una esponja de colágeno (1,5 x 1,5 cm) preparada de acuerdo con los Ejemplos 15 ó 16 en cada uno de un número apropiado de pocillos uno a dos días después de la siembra de las células y se incuba durante aprox. tres días a 37ºC en una atmósfera con 5% de dióxido de carbono. La primera medida de la expresión de luciferasa se realiza en un período de uno a tres días. Para este propósito, los pocillos con las células adherentes se lavan tres veces con solución tampón de fosfato (PBS) después de la eliminación de las esponjas de colágeno, y se tratan subsiguientemente con 500 \mul de tampón de lisis (0,1% Triton en Tris 250 mM, pH = 7,8). Subsiguientemente, se determina la actividad de luciferasa como se describe a continuación.
Con objeto de demostrar el efecto prolongado, las esponjas de colágeno retiradas se colocan nuevamente en pocillos recientes con células sembradas y se incuban durante aprox. 3 días a 37ºC en una atmósfera con 5 litros de dióxido de carbono. Después de ello, las esponjas de colágeno se retiran de los pocillos, se lavan las células adherentes y se tratan con tampón de lisis como se ha descrito arriba, seguido por la determinación de la actividad de luciferasa como se describe más adelante. Este procedimiento se repite a discreción dependiendo de cuántas disposiciones individuales se eligieron al comienzo. De este modo, se puede determinar a lo largo de un período de al menos 6 semanas en qué grado las esponjas de colágeno preparadas de acuerdo con A) son susceptibles de transfección, es decir de conducir a la expresión de actividad de luciferasa en las células.
Ensayo de luciferasa
Las esponjas de colágeno colonizadas se retiraron de las cápsulas de cultivo de tejidos y se lavaron con PBS. Del mismo modo, las células en las cápsulas de cultivo de tejidos se lavaron con PBS. Las células que se desprendían posiblemente de las esponjas durante el lavado se redujeron a un sedimento a partir de la solución de lavado por centrifugación y se examinaron por separado respecto a la expresión de luciferasa. Los valores obtenidos de este modo se añadieron a la expresión de luciferasa la esponja. Las células contenidas en las esponjas se lisaron por adición de 1 ml de tampón de lisis. Las células en los pocillos se lisaron por adición de 500 \mul de tampón de lisis. Se mezclaron 10 a 50 \mul de cada uno de los lisados de células con 100 \mul en cada caso de tampón de sustrato luciferina en una placa negra de 96 pocillos. La medida de la emisión de luz resultante se efectuó utilizando un contador de Centelleo de Microplacas y Luminiscencia "Top Count" (Canberra-Packard, Dreieich). El tiempo de recuento fue 12 segundos, el retardo de recuento fue 10 min y los valores de fondo se sustrajeron automáticamente. Como estándar, se midieron 100, 50, 25, 12,6, 6,25, 3,13, 1,57, 0,78, 0,39, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,013, 0,007 y 0 ng de luciferasa en 50 \mul de tampón de lisis cada vez (= serie de dilución al doble) en las mismas condiciones, y a partir de esto se obtuvo una curva de calibración.
Tampones (a) Tampón de lisis
Triton X-100 al 0,1% en Tris 250 mM de pH 7,8
Tampón sustrato de luciferina
Ditiotreitol 60 mM, sulfato de magnesio 10 mM, ATP 1 mM, D-luciferina 30 \muM, en tampón de glicil-glicina 25 mM de pH 7,8.
(b) Solución salina tamponada con HEPES (HBS)
HEPES 20 mM, pH 7,3; cloruro de sodio 150 mM.
Determinación del contenido de proteína en los lisados de células
Se determinó el contenido de proteína de los lisados utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Munich): Se añadieron a 10 \mul (o 5 \mul) del lisado 150 \mul (o 155 \mul) de agua destilada y 40 \mul de concentrado de tinte Bio-Rad para Ensayo de Proteínas en un pocillo de una placa transparente de 96 pocillos (tipo "fondo plano", Nunc, Dinamarca). Se midió la absorción a 630 nm utilizando el lector de absorbancia "Biolumin 690" y el programa de ordenador "Xperiment" (ambos de Molecular Dynamics, EE.UU.). Para una curva de calibración, se midieron concentraciones de 50, 33,3, 22,3, 15, 9,9, 6,6, 4,4, 2,9, 2,0, 1,3, 0,9 y 0 ng BSA/\mul. La seroalbúmina bovina (BSA) se adquirió como Standard II para Ensayo de Proteínas Bio-Rad. De esta manera, los resultados pueden darse como pg de luciferasa/mg de proteína.
Los resultados de los experimentos in vitro se muestran en la Fig. 15.
Los resultados de una continuación de los experimentos se muestran en la Figura 16 A para PEI-DNA y en la Figura 16 C para DNA desnudo. Un experimento análogo para esponjas cargadas con un vector protegido con copolímero se muestra en la Figura 16 B. La Figura 16 D muestra los resultados de un experimento de control. Para este propósito, se sembraron fibroblastos NIH 3T3 a una densidad de 450.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos el día antes de la transfección (v.g. el día 1). Poco antes de la transfección, se reemplazó el medio con 1,5 ml de medio reciente. Se añadieron los complejos de DNA en un volumen total de 500 \mul (día 2), seguido por 4 horas de incubación y un cambio de medio. El día 3, se añadió a cada pocillo una pieza de esponja de colágeno de tamaño 1,5 x 1,5 cm sin tratar. El día 6, se sembraron células recientes en placas recientes de 6 pocillos (450.000 células por pocillo). El día 7, todas las esponjas excepto 3 se mudaron a estos pocillos. Tres esponjas y los pocillos de los cuales se tomaron todas las esponjas se sometieron al ensayo de luciferasa. El día 10, todas las esponjas excepto 3 se mudaron a pocillos vacíos y se incubaron ulteriormente en 2 ml de medio. Tres esponjas y todos los pocillos de los cuales se mudaron las esponjas se sometieron al ensayo de luciferasa. En los momentos subsiguientes indicados en la Figura 16 D, tres esponjas en cada caso y las células que se habían sedimentado en el fondo de los pocillos se analizaron en cuanto a expresión de luciferasa.
La Figura 16 D muestra que la expresión de luciferasa es inicialmente alta pero desciende luego rápidamente o ya no puede medirse en absoluto. Esto significa que en los otros casos (Fig. 15 y 16 A-C) la expresión significativamente alta de luciferasa debe atribuirse a la transfección continua de novo de las células por vectores inmovilizados. Por tanto, no se trata de una selección indiferente de células transfectadas inicialmente. Si fuera éste el caso, la expresión de luciferasa en el experimento de control tendría que mantenerse en niveles análogamente altos a los de los otros experimentos.
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Claims (15)

1. Una combinación de un portador y un complejo que contiene una o más moléculas de ácido nucleico y uno o más copolímeros cargados que tienen la fórmula general I
6
en donde R es un polímero anfifílico o un derivado homo- o hetero-bifuncional del mismo,
y en donde X
i)
es un aminoácido o derivado de aminoácido, un péptido o un derivado de péptidoo un derivado de espermina o espermidina; o
ii)
en donde X es
d---
\melm{\delm{\para}{c}}{C}{\uelm{\para}{a}}
---b
en donde
a es H o bien, opcionalmente, alquilo C_{1}-C_{6} sustituido con halógeno o con dialquilamino;
y en donde
b, c y d son el mismo o diferente alquileno C_{1}-C_{6} sustituido, opcionalmente, con halógeno o con dialquil-amino; o
iii)
en donde X es
7
en donde
a es H o bien, opcionalmente, alquilo C_{1}-C_{6} sustituido con halógeno o con dialquilamino,
y en donde
b y c son el mismo o diferente alquileno C_{1}-C_{6} sustituido, opcionalmente, con halógeno o con dialquilamino; o
iv)
en donde X
es un compuesto aromático sustituido con tres agrupaciones funcionales W_{1}Y_{1}Z_{1}, en donde W, Y y Z tienen los significados mencionados a continuación;
en donde
W, Y o Z tienen los mismos o diferentes grupos CO, NH, O o S o una agrupación enlazadora capaz de reaccionar con SH, OH, NH o NH_{2};
y en donde la molécula efectora E
es un péptido o derivado de péptido catiónico o aniónico o un derivado de espermina o espermidina o un glucosaminoglicano o un oligo/policatión o -anión no peptídico; en donde
m y n son independientemente uno de otro 0, 1 ó 2; en donde
p es preferiblemente 3 a 20; y en donde
l es 1 a 5, preferiblemente 1.
2. La combinación de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual el polímero anfifílico del copolímero es un poli(óxido de alquileno).
3. La combinación de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual el polímero anfifílico del copolímero es un polialquilenglicol.
4. La combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la cual X o E en el copolímero es un péptido o derivado de péptido cargado.
5. La combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la cual un ligando para una células eucariota superior está acoplado al copolímero.
6. La combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la cual la o las moléculas de ácido nucleico está (están) condensada(s) con moléculas de policatión o lípido catiónico orgánico y el complejo formado de este modo tiene uno o más copolímeros cargados de la fórmula general I unidos a su superficie por interacción iónica.
7. La combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que contiene una molécula de ácido nucleico terapéuticamente eficaz.
8. La combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la cual el portador está constituido por un material biológicamente no reabsorbible.
9. La combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la cual el portador está constituido por un material biológicamente reabsorbible.
10. La combinación de acuerdo con la reivindicación 9, en la cual el material biológicamente reabsorbible es colágeno.
11. La combinación de acuerdo con la reivindicación 10, en la cual el portador es una esponja de colágeno.
12. La combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la cual el portador es un portador que puede obtenerse por reticulación de un copolímero como se define en la reivindicación 1.
13. Uso de una combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la transferencia de un ácido nucleico en células.
14. Composición farmacéutica que contiene una combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
15. Un estuche que contiene un portador y un copolímero o un complejo como se define en la reivindicación 1.
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