JP2019519508A - マルチアーム重合標的抗がんコンジュゲート - Google Patents
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Abstract
Description
」は、原子の結合点を示し、アスタリスク付きの酸素原子は、有機中心「R」と結合する原子である。ただし、nの数値範囲は約5〜500であり、最も好ましくは50〜200であり、好ましくは113とする。平均分子量は約1k〜60kDaである。
」は、同じように樹状に拡散していることを示す。
」におけるエステル結合は、本発明の上記分離可能なリンカーと活性剤Dとが共有結合して形成した切断可能な結合である。本発明のコンジュゲートが標的細胞に到達した後、切断可能な結合が生理学的条件下で加水分解又は酵素分解され、その後、コンジュゲートから活性剤イリノテカンが放出され、イリノテカンが標的細胞中で抗がん作用を発揮する。
」における炭素硫黄結合は、本発明の上記難分解性リンカーと標的分子Tとが形成し、生理学的条件下で加水分解に対して比較的安定な化学結合であり、そのうち、原子SはiRGDに由来するものである。標的分子の標的指向性により、本発明のコンジュゲートは特定の標的細胞に到達できながら、標的分子と母体とが分離し難い。
」はPOLYとの連結を意味する。
例えば、多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の製造方法は、下記ステップを含む。
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
DCM:ジクロロメタン
Boc−Gly−OH:
DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド
IPA:イソプロピルアルコール
TFA:トリフルオロ酢酸
TBME:tert−ブチルメチルエーテル
EA:酢酸エチル
DME:エチレングリコールジメチルエーテル
HOSU:N−スクシンイミドカーボネート
THF:テトラヒドロフラン
Boc−Lys−OH:
DEPC:シアノホスホン酸ジエチル
Pbf:
DIC:N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド
MTBE:tert−ブチルメチルエーテル
EDT:1,2−エタンジチオール
PBS:リン酸緩衝液
EDC・HCl:1−エチル(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
iRGDの作製
窒素雰囲気下で、1000mLの三ツ口フラスコに、200mLのピリジン、120gの1(1.0eq)を加え、撹拌して0℃まで降温させ、151.8gのTsCl(1.0eq)を数回に分けて添加し、1h撹拌し、次いで室温まで徐々に昇温し、3〜4h撹拌し続けた。反応終了後に、反応液を氷冷した希塩酸溶液に投入し、EAを加えて抽出し、EA層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付してBP103a01精製物を55g得た。
1000mLの三ツ口フラスコに、55gのBP103a01(1.0eq)及び160mLのDMSOを加え、均一に撹拌し、次いで、NaN323.52g(2.0eq)を加え、50℃に加熱して3時間反応させ、室温まで降温させ、反応液を水に投入し、EAで抽出し、有機層を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色の液体であるBP103a02を29.2g得た。
1Lの水素化反応器に、29gの化合物3、360mLのメタノール、5.0gのパラジウム炭素を加え、撹拌し、窒素置換し、水素ガスを導入して3〜4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、反応液をろ過し、ろ液を濃縮してBP103a03の油状物を23.5g得た。
1Lの三ツ口フラスコに、23.5gの化合物BP103a03(1.0eq)、68.6gの(Boc)2O(2.0eq)、500mlのメタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液を加え、撹拌して還流するまでに昇温し、1h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、メタノールトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解し、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合併し、1回水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、乾燥させ、固体のBP103a04を34.8g得た。
1000mLの三ツ口フラスコに、34.8gの化合物BP103a04(1.0eq)、それぞれ150mlのトルエン及びTHF、58.2gのブロモ酢酸(3eq)を加え、撹拌し、45〜50℃に加熱し、さらに33.5gの水酸化ナトリウム(6eq)を加え、一晩反応し、TLCでモニタリングし、反応終了後、反応液を留去し、水及びEAを加えて抽出し、水相をpH3に調整し、ジクロロメタンで水相を抽出し、ジクロロメタン層を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮して油状物化合物であるBP103a05を18g得た。
250mLの三ツ口フラスコに、18gの化合物BP103a05、100mlのEAを加え、撹拌して溶解した後に、0℃まで降温させ、150mlのEA/HCl(3.5M)を加え、0℃で保温し、TLCでモニタリングし、反応が終了し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して白色の固体のBP103aを10.4g得た。
100mLのフラスコに、3.0gのBP103a(1.0eq)、4.0gの化合物1(1.0eq)、40mlのDCM、4.0mlのDIEA(2.0eq)を加え、室温で撹拌し、TLCでモニタリングし、反応が終了後、有機溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィーに付して6.4gの類似油状物2を5.2g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、9.00gの化合物2(1.0eq)、3.96gのHOSU(1.53eq)、90mlのDCM、6.60gのEDC.HCl(1.53eq)を加え、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、pH=6.0の50mmol/Lのリン酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して5.9gの無色の油状物である化合物3を得た。
200mLのフラスコに、2.93gの化合物Boc−Lys−OH(1.0eq)、60mlの水、2.00gのNaHCO3(2.0eq)を加え、撹拌し、5.9gの化合物3(1.0eq)を滴下して60mlのDME(エチレングリコールジメチルエーテル)の溶液に溶解し、60mlのTHFを追加し、撹拌して一晩置いた。TLCでモニタリングし、反応が終了後、有機溶媒を留去し、酢酸でPH=4に調整し、EAで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、4.50gの無色の油状物化合物4を得た。
100mLのフラスコに、3.81gの化合物4(1.0eq)、40mlのDCM、1.07gのHOSU、1.78gのEDC.HClを加え、撹拌し、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応が終了後、DCMで希釈し、その後、50mMのリン酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、純水で1回洗浄し、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、4.1gの無色の油状物化合物5を得た。
250mLの丸底フラスコに、3.50gの化合物6(1.0eq)、52.5mlのDMFを加え、60℃に加熱して溶解し、5〜10min後にDMFを減圧留去し、300mlのn−ヘプタンを加えて減圧蒸留し、3回繰り返し、遠心脱水後、105mlのDCM、1.08gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、63mgのDMAP(0.1eq)を加え、1.59gのDCC(1.5eq)を滴下して10mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮して120mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、150mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して4.02gの淡黄色の固体である化合物7を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.02gの化合物7、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体8を4.00g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、2.95gの化合物8、80mlのDCM、2.57g(1.05eq)の化合物4、2.16mlのDIEA(3.0eq)、0.96mlのDEPC(1.5eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体9を1.48g得た。
50mLの丸底フラスコに、260mgの化合物9、10mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体10を210mg得た。
10mLの丸底フラスコに、51mgの化合物10(4.0eq)、2mlのDCM、11ulのTEA(8.0eq)、201mgの4armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体11を240mg得た。
10mLの丸底フラスコに、50mgの化合物11(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に10.6mgのiRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体12を50mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物11(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に139mgのtLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体14を1.0g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.903(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.332(s,2H)、5.484(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
Lyp−1の作製
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物11(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に182mgのLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体13を1.05g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.481(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
CPARPARの作製
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物11(1.0eq)、20lのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に154mgのCRPARPARを加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体15を1.09g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.905(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.486(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
cRGDの作製
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物11(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に96.4gのcRGDを加えて4mlのpH=7、0.01MのPBSと6mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体16を1.06g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.326(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
250mLの丸底フラスコに、5.00gの化合物20(1.0eq)、100mlのDCM、3.89gのTEA(3.0eq)を加え、3.50gのTBDPS−Cl(1.0eq)を滴下して20mlのDCMの溶液に溶解し、TLCでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、3.62gの淡黄色の固体である化合物21を得た。
250mLの丸底フラスコに、4.80gの化合物21(1.0eq)、145mlのDCM、1.64gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、95mgのDMAP(0.1eq)を加え、2.41gのDCC(1.5eq)を滴下して10mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で130mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、160mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して4.65gの淡黄色の固体である化合物22を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.65gの化合物22、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体23を2.48g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、2.3gの化合物23、45mlのDCM、3.196g(1.05eq)化合物5、1.75mlのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体24を2.20g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.0gの化合物24、60mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体25を1.75g得た。
500mLの丸底フラスコに、1.51gの化合物25(4.0eq)、140mlのDCM、390ulのTEA(8.0eq)、7.0gの4armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体26を7.9g得た。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物26(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に188mgのiRGDを加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体261を980mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.905(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
tLyp−1の作製は実施例2と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物26(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に144mgのtLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体263を1.01g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.904(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.488(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
Lyp−1の作製は実施例3と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物26(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に188mgのLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体262を1.04g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.481(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
CRPARPARの作製は実施例4と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物26(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に159mgのCRPARPARを加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体264を1.04g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.910(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
cRGDの作製は実施例5と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物26(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に99.5mgのcRGDを加えて4mlのpH=7、0.01MのPBSと6mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体265を1.03g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.915(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.337(s,2H)、5.484(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
250mLの丸底フラスコに、6.00gの化合物30(1.0eq)、120mlのDCM、5.00gのTEA(3.0eq)を加え、4.53gのTBDPS−Cl(1.0eq)を滴下して20mlのDCMの溶液に溶解し、TLCでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、4.32gの淡黄色の固体である化合物31を得た。
250mLの丸底フラスコに、5.0gの化合物31(1.0eq)、150mlのDCM、1.73gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、101mgのDMAP(0.1eq)を加え、2.55gのDCC(1.5eq)を滴下して10mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で130mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、160mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して4.52gの淡黄色の固体である化合物32を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.40gの化合物22、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体23を2.32g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、2.3gの化合物33、45mlのDCM、2.77gの(1.05eq)化合物5、1.1gのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体34を2.02g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.0gの化合物34、60mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体35を1.69g得た。
500mLの丸底フラスコに、1.50gの化合物25(4.0eq)、140mlのDCM、390ulのTEA(8.0eq)、7.0gの4armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体36を7.64g得た。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物36(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に189mgのiRGDを加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体361を1.08g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.909(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.481(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
tLyp−1の作製は実施例2と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物36(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に144mgのtLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体363を0.99g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.915(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.340(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
Lyp−1の作製は実施例3と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物36(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に189mgのLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体362を1.06g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.908(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.484(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
CRPARPARの作製は実施例4と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物36(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に160mgのCRPARPARを加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体364を1.01g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.910(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.336(s,2H)、5.485(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
cRGDの作製は実施例5と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物36(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に100mgのcRGDを加えて4mlのpH=7、0.01MのPBSと6mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体365を1.05g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.914(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.340(s,2H)、5.489(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
250mLの丸底フラスコに、5.0gの化合物40(1.0eq)、150mlのDCM、2.67gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、155mgのDMAP(0.1eq)を加え、3.93gのDCC(1.5eq)を滴下して15mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で130mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、160mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して6.85gの淡黄色の固体である化合物41を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.00gの化合物41、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体42を3.54g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、3.00gの化合物42、45mlのDCM、3.46g(1.05eq)化合物5、1.38gのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体43を2.68g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.0gの化合物43、60mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体44を1.61g得た。
500mLの丸底フラスコに、1.50gの化合物44(4.0eq)、140mlのDCM、391ulのTEA(8.0eq)、7.0gの4armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体45を7.61g得た。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物45(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に188mgのiRGDを10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体451を1.09g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.909(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.482(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
tLyp−1の作製は実施例2と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物45(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に144mgのtLyP−1を10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体453を1.02g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.912(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.336(s,2H)、5.485(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
Lyp−1の作製は実施例3と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物45(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に188mgのLyP−1を10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体452を1.06g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.917(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.340(s,2H)、5.491(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
CRPARPARの作製は実施例4と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物45(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に159mgのCRPARPARを10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体454を1.07g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.911(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.332(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
cRGDの作製は実施例5と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物45(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に99.5mgのcRGDを加えて4mlのpH=7、0.01MのPBSと6mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体455を1.03g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.909(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.331(s,2H)、5.478(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
10mLの丸底フラスコに、52mgの化合物10(3.0eq)、2mlのDCM、11ulのTEA(6.0eq)、273mgの3armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体50を310mg得た。
10mLの丸底フラスコに、50mgの化合物50(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に7.2mgのiRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体51を49mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
L部分の作製は実施例1と同じである。
10mLの丸底フラスコに、55mgの化合物50(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に、4.2mgのcRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSと1.5mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体52を50mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、476mgの化合物10(8.0eq)、15mlのDCM、105ulのTEA(16.0eq)、1.0gの8armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体60を1.37g得た。
10mLの丸底フラスコに、50mgの化合物60(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に14.5mgのiRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体61を54mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
Lyp−1の作製は実施例3と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
10mLの丸底フラスコに、60mgの化合物60(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に17.4mgのLyP−1を加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体62を68mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.329(s,2H)、5.481(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、45mgの化合物60(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に10.0mgのtLyP−1を加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体63を45mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.330(s,2H)、5.482(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、55mgの化合物60(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に13.5mgのCRPARPARを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体64を62mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.331(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、50mgの化合物60(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に7.7mgのcRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSと1.5mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体65を50mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.481(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
250mLの丸底フラスコに、5.00gの化合物20(1.0eq)、100mlのDCM、3.87gのTEA(3.0eq)を加え、3.49gのTBDPS−Cl(1.0eq)を滴下して20mlのDCMの溶液に溶解し、TLCでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、3.52gの淡黄色の固体である化合物21を得た。
250mLの丸底フラスコに、4.50gの化合物21(1.0eq)、135mlのDCM、1.5gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、87mgのDMAP(0.1eq)を加え、2.21gのDCC(1.5eq)を滴下して10mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で120mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、150mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して4.95gの淡黄色の固体である化合物22を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.95gの化合物22、55mlのDCMを加え、攪拌溶解後に13.7mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体23を2.5g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、2.3gの化合物23、45mlのDCM、3.9g(1.05eq)化合物5、2.14mlのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体24を2.45g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.2gの化合物24、65mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体25を1.7g得た。
100mLの丸底フラスコに、1.21gの化合物25(8.0eq)、60mlのDCM、314ulのTEA(16.0eq)、3.0gの4armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体70を3.9g得た。
10mLの丸底フラスコに、50mgの化合物70(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に15.3mgのiRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体71を55mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、60mgの化合物70(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に18.3mgのLyP−1を加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体72を68mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.486(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、55mgの化合物70(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に12.8mgのtLyP−1を加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体73を55mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.488(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、55mgの化合物70(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に14.2mgのCRPARPARを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体74を60mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.332(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、60mgの化合物70(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に9.7mgのcRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSと1.5mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体75を62mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.900(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
250mLの丸底フラスコに、6.00gの化合物30(1.0eq)、120mlのDCM、5.00gのTEA(3.0eq)を加え、4.53gのTBDPS−Cl(1.0eq)を滴下して20mlのDCMの溶液に溶解し、TLCでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、4.32gの淡黄色の固体である化合物31を得た。
250mLの丸底フラスコに、5.0gの化合物31(1.0eq)、150mlのDCM、1.73gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、101mgのDMAP(0.1eq)を加え、2.55gのDCC(1.5eq)を滴下して10mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で130mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、160mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して4.52gの淡黄色の固体である化合物32を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.40gの化合物22、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体23を2.32g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、2.3gの化合物33、45mlのDCM、2.77gの(1.05eq)化合物5、1.1gのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体34を2.02g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.0gの化合物34、60mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体35を1.69g得た。
500mLの丸底フラスコに、2.75gの化合物35(8.0eq)、140mlのDCM、730ulのTEA(16.0eq)、7.0gの8armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体80を8.64g得た。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物80(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に307mgのiRGDを加えて15mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体81を1.18g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.903(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.334(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物80(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に235mgのtLyP−1を加えて15mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体83を1.05g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.904(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.334(s,2H)、5.489(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物80(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に163mgのcRGDを加えて6mlのpH=7、0.01MのPBSと10mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体85を1.00g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.903(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.334(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
250mLの丸底フラスコに、5.0gの化合物40(1.0eq)、150mlのDCM、2.67gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、155mgのDMAP(0.1eq)を加え、3.93gのDCC(1.5eq)を滴下して15mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で130mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、160mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、6.85gの乾燥して淡黄色の固体である化合物41を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.00gの化合物41、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体42を3.54g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、3.00gの化合物42、45mlのDCM、3.46g(1.05eq)化合物5、1.38gのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体43を2.68g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.0gの化合物43、60mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体44を1.61g得た。
250mLの丸底フラスコに、1.61gの化合物44(8.0eq)、80mlのDCM、418ulのTEA(16.0eq)、4.0gの8armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体90を5.15g得た。
50mLの丸底フラスコに、0.5gの化合物90(1.0eq)、10mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に152mgのiRGDを5mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体91を0.53g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.488(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
0.5gの化合物90(1.0eq)、10mlのpH=7、0.01MのPBSを50mLの丸底フラスコに加え、溶解して透明になった後に153mgのLyP−1を5mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体92を0.57g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.900(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.332(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
50mLの丸底フラスコに、0.5gの化合物90(1.0eq)、10mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に129mgのCRPARPARを5mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体94を0.55g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.331(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
50mLの丸底フラスコに、0.5gの化合物90(1.0eq)、10mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に80.8mgのcRGDを加えて4mlのpH=7、0.01MのPBSと6mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体95を0.50g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.903(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.330(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
化合物1〜42の、ヒト結腸癌HT−29のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用を測定する。
2.1 試料
イリノテカン(原薬)、nktr−102(原薬)は購入品であり、化合物1〜42はすべてブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
McCoy’s5A培養液、ウシ胎児血清(FBS)、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン二重特異性抗体、注射用水、乳酸、ソルビトール。
雌性BALB/cヌードマウス(匹数:300匹;週齢:5〜7週)をBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から購入し、温度20〜25℃、相対湿度40%〜70%、12時間明、12時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取するSPF動物飼育室で飼育した。飼育して約1週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク(CAS、本実験室では液体窒素中に凍結保存)から入手したヒト結腸癌細胞HT−29。
3.1 HT−29細胞培養
5%CO2、37℃の培養条件下で、HT−29細胞を、10%ウシ胎児血清含有McCoy’s5A培養液中で通常の細胞培養を行い、0.25%トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に2〜3回行い、継代比率を1:3〜1:8とした。
対数増殖期のHT−29細胞を採取し、細胞数計測後に無血清McCoy’s5A培地に再懸濁し、細胞濃度を6×107細胞/mLに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に50mLの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を1mLのシリンジで採取し、ヌードマウスの右前腋窩皮下に注射し、各動物に100μL(6×106細胞/匹)接種し、HT−29のヌードマウス移植腫瘍モデルを構築した。接種後に定期的に動物の状態及び腫瘍の増殖状態を観察し、電子ノギスを用いて腫瘍径を測定し、データを直接的にExcel表に入力し、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が100〜300mm3になった後に、健康状態が良好で、腫瘍体積が近い動物を225匹選択し、乱塊法により45組に分けた(n=5)。実験開始後に腫瘍径を週に2回測定し、腫瘍体積を計算し、且つ動物体重を秤量して記録した。
腫瘍体積(TV)の計算公式は下記のとおりである。
TV(mm3)=l×w2/2
式中、lは腫瘍長径(mm)を表し、wは腫瘍短径(mm)を表す。
0.5gのソルビトールを秤量して50mLの遠心管に入れ、遠心管に50mLの注射用水を加え、固形物が完全に溶解するまで旋回振動し、濃度1%のソルビトール水溶液(w/v)を調製し、4℃の冷蔵庫に保存しておいた。
3.4.1 イリノテカン投与製剤の調製
12.0mgのイリノテカンを秤量し、0.15mlの1%乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに2.85mlの1%ソルビトール水溶液をそれぞれ加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の1%乳酸、1%ソルビトール水溶液の比率を約5:95(v/v)とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、88.55mgのnktr−102を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.85mgの化合物1を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.80mgの化合物2を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.88mgの化合物3を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、111.24mgの化合物4を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.78mgの化合物5を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物6を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物7を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物8を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物9を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物10を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、112.98mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、108.94mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.01mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.37mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、104.91mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
動物の群分け及び投与態様は表1のとおりである。
実験の最終日に、体重を秤量し、腫瘍径を測定した後に動物を安楽死させた(CO2)。腫瘍組織を取り出し、秤量して撮影し(撮影時に以下の組み合わせでそれぞれ撮影)、腫瘍重量抑制率を計算した。動物に対して肉眼解剖を行い、内臓器官に異常があるかを肉眼で観察した。
相対腫瘍体積(RTV)の計算公式は下記のとおりである。
RTV=TVt/TVinitial
式中、TVinitialは群分けして投与した時に測定した腫瘍体積であり、TVtは投与期間中各測定時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率(%T/C)の計算公式下記のとおりである。
%T/C=100%´(RTVT/RTVC)
式中、RTVTは治療群のRTVを示し、RTVCは溶媒対照群のRTVを示す。
腫瘍増殖抑制率TGI(%)の計算公式は下記のとおりである。
TGI=100%×[1−(TVt(T)−TVinitial(T))/(TVt(C)−TVinitial(C))]
式中、TVt(T)は治療群の各測定時の腫瘍体積を示し、TVinitial(T)は群分けして投与した時の治療群の腫瘍体積を示し、TVt(C)は溶媒対照群の各測定時の腫瘍体積を示し、TVinitial(C)は群分けして投与した時の溶媒対照群の腫瘍体積を示す。
動物の体重低減率の計算公式は下記のとおりである。
動物の体重低減率=100%×(BWinitial−BWt)/BWinitial
式中、BWtは投与期間中各測定時の動物体重を示し、BWinitialは群分けして投与した時の動物体重を示す。
腫瘍重量抑制率IR(%)の計算公式は下記のとおりである。
IR(%)=100%×(WC−WT)/WC
式中、WCは対照群の腫瘍重量を示し、WTは治療群の腫瘍重量を示す。
Microsoft Office Excel 2007ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差(Mean±SE)として表し、2群の比較はt検定で行った。
実験中、実験者及び獣医師は実験動物の徴候及び健康状態を観察し続けなければならない。疼痛、うつ病、活動低下等動物のいかなる異常症状を実験ノートに記録する必要がある。実験動物の異常状況がIACUC関連動物福祉法規の規定に一致しない場合、獣医師は実験停止の要否を判断し、且つ実験責任者に通知することができる。
ヒトがん異種移植腫瘍モデルについて、実験評価指標として相対腫瘍増殖率T/C(%)を推奨する。増殖率が低いほど、腫瘍抑制効果が良いことは表2に示されている。
1.実験目的
本研究は、ヒト乳がんMDA−MB−231のヌードマウス移植腫瘍モデルを用いて、化合物1〜42の生体内における抗腫瘍活性を評価する。
2.1 動物種類
マウス。
BALB/cヌードマウス。
雌性。
320匹接種し、実験で225匹を使用した。
6〜8週。
20〜22g±20% 体重平均値。
上海西普−必凱実験動物有限公司(BK)、許可証番号SCXK(滬)2008−0016。
すべての実験動物をSPFレベルの実験室で飼育した。実験者は日常のケア及び実験研究を担当した。
各ケージに実験番号、実験群別、実験者名前、マウス品種及び性別等の情報が記載されている身分カードが付いており、マウスはイヤリングがによりマーキングした。
腫瘍体積が150〜200mm3になった後に、各群にマウス5匹、各群内の腫瘍体積及びマウス体重が均一であるように、乱塊法により群分けした。各群の腫瘍体積の平均値の、すべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差が±10%以下であった。
すべての実験動物の操作及び管理は、動物使用及び管理ガイドラインに厳しく従う。
居住条件:IVCシステム、各ケージに5匹
温度:20℃〜26℃
湿度:40%±70%
光照射:12時間の昼夜交替
北京科澳協力飼料有限公司から購入した照射ラット・マウス飼料。自由に摂食させた。
都市水道水。ろ過して高圧滅菌して飲水させた。
上海茂生誘導体科技有限公司から購入したコーンコブ。高圧滅菌して使用した。週に2回敷料を交換した。
実験前にマウスに少なくとも1週間の環境適応期間を与えた。
3.1 実験対象医薬品
イリノテカン(原薬)、nktr−102(原薬)は購入品であり、化合物1〜42はすべてブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
3.2.1 生理食塩水
上海華源長富薬業(集団)有限公司から購入した生理食塩水。
上海康徳莱企業発展集団股フン有限公司(上海、中国)から購入した1mlの無菌シリンジ。
上海中国科学院細胞生物研究所から購入したヒト乳がんMDA−MB−231。
MDA−MB−231を、10%ウシ胎児血清FBS(GIBCO、USA)を含むDMEM培地(GIBCO、USA)で培養し、5%CO2を含む37℃のインキュベーターで培養した。
米国BD社から購入したマトリゲルMatrigel。
ESCOから購入した生物学的安全キャビネット(型番:AC2−6E1)、
Thermo Scientific Formaから購入したCO2水密性インキュベーター(型番:3111)、
Olympusから購入した倒立顕微鏡(型番:CKX41SF)、
上海医療器械工業(集団)有限公司から購入した電気吸引装置(型番:YX930D)、
METTLER TOLEDOから購入した天びん(METTLER TOLEDO AB135−S)、
北京雷勃爾遠心機有限公司から購入した低速遠心機(型番:LD5−2A)、
桂林広陸数字測控股フン有限公司から購入した電子デジタルノギス(型番:SF2000)。
ヒト乳がんMDA−MB−231のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、各匹に対して1×106個の細胞を接種した。
今回の実験は以下(表)の投与量及び投与態様を設計した(表3)。
調製方法はブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
単回投与に必要な容量:
20g(body weight)x10(animals)x10mL/kg/1000x1.5=3mL
12.0mgのイリノテカンを秤量し、0.15mlの1%乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに2.85mlの1%ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の1%乳酸、1%ソルビトール水溶液の比率を約5:95(v/v)とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、88.55mgのnktr−102を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.85mgの化合物1を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.80mgの化合物2を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.88mgの化合物3を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、111.24mgの化合物4を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.78mgの化合物5を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物6を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物7を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物8を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物9を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物10を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、112.98mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、108.94mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.01mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.37mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、104.91mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
MDA−MB−231細胞を、10%ウシ胎児血清FBS(GIBCO、USA)を含むDMEM培地で培養した。細胞を5%CO2を含む37℃のインキュベーターで培養した。
細胞接種法による腫瘍ヌードマウス皮下移植モデルの構築:対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、細胞数計測後に1×PBSに再懸濁し、細胞濃度をに1×107/ml調整し。1mLのシリンジ(針No.4)でヌードマウス右背部皮下に腫瘍細胞を、1×106/0.1ml/マウスで接種した。
腫瘍体積が100〜200mm3になった時点で、各群の腫瘍の差が平均値の10%未満となるように、各群にマウス5匹で乱塊法により動物をランダムに群分けした。群分けの日をDay 0とし、群分けの日に投与した。
実験期間を3週間とし、実験期間中、動物体重及び腫瘍サイズを週に2回測定した。毎日に臨床症状を観察して記録した。実験の最終日に、動物を殺し、体重を秤量し、腫瘍を取り出し、秤量して撮影して記録した。
すべての動物実験操作は、動物使用及び管理規則に厳しく従う。腫瘍関連パラメータの計算は、中国CFDAによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』を参照する。
腫瘍体積(Tumor volume、TV)の計算公式はTV=a×b2/2である。式中、a、bはそれぞれ測定された腫瘍の長さ及び幅を示す。相対腫瘍体積(relative Tumor volume、RTV)の計算公式はRTV=Vt/V0である。式中、V0は群分けして投与した時の腫瘍体積を示し、Vtは測定時の腫瘍体積を示す。抗腫瘍活性の評価指標として相対腫瘍増殖率T/C(%)及び腫瘍抑制率(%)を用い、計算公式はそれぞれT/C(%)=(TRTV/CRTV)×100%である。TRTVは治療群のRTVを示し、CRTVは陰性対照群のRTVを示す。腫瘍抑制率(%)=(陰性対照群の平均腫瘍重量−投与群の平均腫瘍重量)/陰性対照群の平均腫瘍重量×100%。
腫瘍担持動物の体重変化(%)の計算は下記のとおりである。(測定時の体重−群分け時の体重)/群分け時の体重×100。
Microsoft Office Excel 2007ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差(Mean±SE)として表し、2群の比較はt検定で行った。
中国CFDAによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』(2006年11月)に基づき、T/C(%)≦40%、且つ統計学分析によりp<0.05のものが有効であることは、表4に示されている。
1.実験目的
本研究は、ヒト膵臓がんMIA Paca−2のヌードマウス移植腫瘍モデルを用い、化合物1〜42の生体内における抗腫瘍活性を評価する。
2.1 動物種類
マウス。
BALB/c−nu/nuヌードマウス。
雌性。
300。
6〜8週。
20−22g±20% 体重平均値。
上海西普‐必凱実験動物有限公司(BK)、許可証番号SCXK(滬)2008−0016。
すべての実験動物をSPFレベルの実験室で飼育した。
各ケージに実験番号、実験群別、実験者名前、マウス品種及び性別等の情報が記載されている身分カードが付いており、マウスはイヤリングがによりマーキングした。
腫瘍体積が150〜200mm3になった後に、各群にマウス5匹、各群内の腫瘍体積及びマウス体重が均一であるように、乱塊法により群分けした。各群の腫瘍体積の平均値の、すべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差が±10%以下であった。
すべての実験動物の操作及び管理は、実験動物使用及び管理ガイドラインに厳しく従う。
居住条件:IVCシステム、各ケージに5匹
温度:25℃±1℃
湿度:65%±10%
光照射:12時間の昼夜交替
北京科澳協力飼料有限公司から購入した照射ラット・マウス飼料。自由に摂食させた。
都市水道水。ろ過して高圧滅菌して飲水させた。
上海茂生誘導体科技有限公司から購入したコーンコブ。高圧滅菌して使用した。週に2回敷料を交換した。
実験前にマウスに少なくとも1週間の環境適応期間を与えた。
3.1 実験対象医薬品
イリノテカン(原薬)、nktr−102(原薬)は購入品であり、化合物1〜42はすべてブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
3.2.1 生理食塩水
上海華源長富薬業(集団)有限公司から購入した生理食塩水(上海、中国)。
上海康徳莱企業発展集団股フン有限公司(上海、中国)から購入した1mlの無菌シリンジ。
ヒト膵臓がんMIA Paca−2は上海中国科学院細胞生物研究所から購入した。
MIA Paca−2を、10%ウシ胎児血清FBS(GIBCO、USA)及び2.5%HSを含むDMEM培地(GIBCO、USA)で培養し、5%CO2を含む37℃のインキュベーターで培養した。
米国BD社から購入したマトリゲルMatrigel。
ESCOから購入した生物学的安全キャビネット(型番:AC2−6E1)、
Thermo Scientific Formaから購入したCO2水密性インキュベーター(型番:3111)、
Olympusから購入した倒立顕微鏡(型番:CKX41SF)、
上海医療器械工業(集団)有限公司から購入した電気吸引装置(型番:YX930D)、
METTLER TOLEDOから購入した天びん(METTLER TOLEDO AB135−S)、
北京雷勃爾遠心機有限公司から購入した低速遠心機(型番:LD5−2A)、
桂林広陸数字測控股フン有限公司から購入した電子デジタルノギス(型番:SF2000)。
ヒト膵臓がんMIA Paca−2のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、各匹に対して3×106個細胞を接種した。
今回の実験は以下(表6)の投与量及び投与態様を設計した。
調製方法はブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
単回投与に必要な容量:
20g(body weight)x10(animals)x10mL/kg/1000x1.5=3mL
12.0mgのイリノテカンを秤量し、0.15mlの1%乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに2.85mlの1%ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の1%乳酸、1%ソルビトール水溶液の比率を約5:95(v/v)とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、88.55mgのnktr−102を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.85mgの化合物1を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.80mgの化合物2を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.88mgの化合物3を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、111.24mgの化合物4を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.78mgの化合物5を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物6を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物7を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物8を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物9を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物10を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、112.98mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、108.94mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.01mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.37mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、104.91mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
MIA Paca−2細胞を、10%ウシ胎児血清FBS(GIBCO、USA)及び2.5%HSを含むDMEM培地で培養した。細胞を5%CO2を含む37℃のインキュベーターで培養した。
細胞接種法による腫瘍ヌードマウス皮下移植モデルの構築:対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、細胞数計測後に1×PBSに再懸濁し、細胞濃度を3×107/mlに調整した。1mLのシリンジ(針No.4)でヌードマウス右背部皮下に腫瘍細胞を、3×106/0.1ml/マウスで接種した。
腫瘍体積が100〜200mm3になった時点で、各群の腫瘍の差が平均値の10%未満となるように、各群にマウス5匹で乱塊法により動物をランダムに群分けした。群分けの日をDay1とし、群分けの日に投与した。
実験期間を3週間とし、実験期間中、動物体重及び腫瘍サイズを週に2回測定した。毎日に臨床症状を観察して記録した。実験の最終日に、動物を殺し、体重を秤量し、腫瘍を取り出し、秤量して撮影して記録した。
すべての動物実験操作は、動物使用及び管理規則に厳しく従う。腫瘍関連パラメータの計算は、中国SFDAによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』を参照する。
腫瘍体積(Tumor volume、TV)の計算公式はTV=a×b2/2である。式中、a、bはそれぞれ測定された腫瘍の長さ及び幅を示す。相対腫瘍体積(relative Tumor volume、RTV)の計算公式はRTV=Vt/V0である。式中、V0は群分けして投与した時の腫瘍体積を示し、Vtは測定時の腫瘍体積を示す。抗腫瘍活性の評価指標として相対腫瘍増殖率T/C(%)及び腫瘍抑制率(%)を用い、計算公式はそれぞれT/C(%)=(TRTV/CRTV)×100%である。TRTVは治療群のRTVを示し、CRTVは陰性対照群のRTVを示す。腫瘍抑制率(%)=(陰性対照群の平均腫瘍重量−投与群の平均腫瘍重量)/陰性対照群の平均腫瘍重量×100%。
腫瘍担持動物の体重変化(%)の計算は下記のとおりである。(測定時の体重−群分け時の体重)/群分け時の体重×100。
中国SFDAによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』(2006年11月)に基づき、T/C(%)≦40%、且つ統計学分析によりP<0.05のものが有効である。
Microsoft Office Excel 2007ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差(Mean±SE)として表し、群同士の比較はt−検定で行い、P<0.05の場合に有意差ありと認められる。
中国CFDAによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』(2006年11月)に基づき、T/C(%)≦40%、且つ統計学分析によりP<0.05のものが有効であることは、表6に示されている。
1.実験目的
供試薬物である化合物1〜42の、ヒト胃がんNCI−N87細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用を評価する。
2.1 試料
イリノテカン(原薬)、SN−38、10−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカン、nktr−102は購入品であり、化合物1〜42はすべてブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
RPMI−1640培養液、ウシ胎児血清(FBS)、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン、生理食塩水。
雌性BALB/cヌードマウス(匹数:150匹;週齢:6〜8週)をBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から購入し、温度20〜25℃、相対湿度40%〜70%、12時間明、12時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取する蘇州聖蘇新薬開発有限公司のSPF動物飼育室で飼育した。飼育して約1週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク(CAS、本実験室では液体窒素中に凍結保存)から入手したヒト胃がん細胞NCI−N87。
3.1 NCI−N87細胞培養
5%CO2、37℃の培養条件下で、NCI−N87細胞を、10%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培養液中で通常の細胞培養を行い、0.25%トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に1〜2回行い、継代比率を1:2〜1:6とした。
対数増殖期のNCI−N87細胞を採取し、細胞数計測後に無血清RPMI−1640培地に再懸濁し、細胞濃度を5×107細胞/mLに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に50mLの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を1mLのシリンジで採取し、ヌードマウスの右前腋窩皮下に注射し、各動物に100μL(5×106細胞/匹)接種し、NCI−N87のヌードマウス移植腫瘍モデルを構築した。接種後に定期的に動物の状態及び腫瘍の増殖状態を観察し、電子ノギスを用いて腫瘍径を測定し、データを直接的にExcel表に入力し、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が100〜300mm3になった後に、健康状態が良好で、腫瘍体積が近い動物を225匹選択し、乱塊法により45組に分けた(n=5)。実験開始後に腫瘍径を週に2回測定し、腫瘍体積を計算し、且つ動物体重を秤量して記録した。
腫瘍体積(TV)の計算公式は下記のとおりである。
TV(mm3)=l×w2/2
式中、lは腫瘍長径(mm)を表し、wは腫瘍短径(mm)を表す。
0.5gのソルビトールを秤量して50mLの遠心管に入れ、遠心管に50mLの注射用水を加え、固形物が完全に溶解するまで旋回振動し、濃度1%のソルビトール水溶液(w/v)を調製し、4℃の冷蔵庫に保存しておいた。
3.4.1 イリノテカン投与製剤の調製
12.0mgのイリノテカンを秤量し、0.15mlの1%乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに2.85mlの1%ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の1%乳酸、1%ソルビトール水溶液の比率を約5:95(v/v)とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、88.55mgのnktr−102を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.85mgの化合物1を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.80mgの化合物2を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.88mgの化合物3を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、111.24mgの化合物4を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.78mgの化合物5を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物6を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物7を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物8を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物9を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物10を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、112.98mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、108.94mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.01mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.37mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、104.91mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
動物の群分け及び投与態様は表7のとおりである。
実験終了後、体重を秤量し、腫瘍径を測定した後に動物を安楽死させた(CO2)。腫瘍組織を取り出して秤量し、腫瘍重量抑制率を計算した。腫瘍組織秤量後に、今後の分析のために、−70℃未満の冷蔵庫に移して保存した。
相対腫瘍体積(RTV)の計算公式は下記のとおりである。
RTV=TVt/TVinitial
式中、TVinitiaLは群分けして投与した時に測定した腫瘍体積であり、TVtは投与期間中各測定時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率(%T/C)の計算公式下記のとおりである。
%T/C=100%´(RTVT/RTVC)
式中、RTVTは治療群のRTVを示し、RTVCは溶媒対照群のRTVを示す。
腫瘍増殖抑制率TGI(%)の計算公式は下記のとおりである。
TGI=100%×[1−(TVt(T)−TVinitial(T))/(TVt(C)−TVinitial(C))]
式中、TVt(T)は治療群の各測定時の腫瘍体積を示し、TVinitial(T)は群分けして投与した時の治療群の腫瘍体積を示し、TVt(C)は溶媒対照群の各測定時の腫瘍体積を示し、TVinitial(C)は群分けして投与した時の溶媒対照群の腫瘍体積を示す。
動物の体重低減率の計算公式は下記のとおりである。
動物の体重低減率=100%×(BWinitial−BWt)/BWinitial
式中、BWtは投与期間中各測定時の動物体重を示し、BWinitialは群分けして投与した時の動物体重を示す。
腫瘍重量抑制率IR(%)の計算公式は下記のとおりである。
IR(%)=100%×(WC−WT)/WC
式中、WCは対照群の腫瘍重量を示し、WTは治療群の腫瘍重量を示す。
Microsoft Office Excel 2007ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差(Mean±SE)として表し、2群の比較はt−検定で行った。
実験中、実験者及び獣医師は実験動物の徴候及び健康状態を観察し続けなければならない。疼痛、うつ病、活動低下等動物のいかなる異常症状を実験ノートに記録する必要がある。実験動物の異常状況がIACUC関連動物福祉法規の規定に一致しない場合、獣医師は実験停止の要否を判断し、且つ実験責任者に通知することができる。
ヒトがん異種移植腫瘍モデルについて、実験評価指標として相対腫瘍増殖率T/C(%)を推奨する。増殖率が低いほど、腫瘍抑制効果が良いことは表8に示されている。
1.実験目的
供試薬物である化合物1〜42の、同所性U87MGヌードマウス脳グリオーマモデル生存率への影響を評価する。
2.1 試料
イリノテカン(原薬)、nktr−102(原薬)は購入品であり、化合物1〜42はすべてブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
RPMI−1640培養液、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン、生理食塩水。
雌性BALB/cヌードマウス(匹数:300匹;週齢:6〜8週)をBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から購入し、温度20〜25℃、相対湿度40%〜70%、12時間明、12時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取するSPF動物飼育室で飼育した。飼育して約1週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク(CAS、本実験室では液体窒素中に凍結保存)から入手したグリオーマ細胞U87MG。
NCI−N87細胞培養
5%CO2、37℃の培養条件下で、NCI−N87細胞をRPMI−1640培養液中で通常の細胞培養を行い、0.25%トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に1〜2回行い、継代比率を1:2〜1:6とした。
対数増殖期のNCI−N87細胞を採取し、細胞数計測後に無血清RPMI−1640培地に再懸濁し、細胞濃度を1×108細胞/mLに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に50mLの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を1mLのシリンジで採取し、動物脳定位固定装置の補助により、マイクロインジェクション法でヒトグリオーマ細胞U87MG細胞1μL(1×105細胞/匹)を生体外で培養し、同所性U87MG脳グリオーマモデルを構築し、接種後に定期的に動物の状態観察した。接種後12日目に、動物を225匹選択し、乱塊法により45組に分けた(n=5)。
3.2.1 イリノテカン投与製剤の調製
12.0mgのイリノテカンを秤量し、0.15mlの1%乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに2.85mlの1%ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の1%乳酸、1%ソルビトール水溶液の比率を約5:95(v/v)とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、88.55mgのnktr−102を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.85mgの化合物1を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.80mgの化合物2を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.88mgの化合物3を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、111.24mgの化合物4を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.78mgの化合物5を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物6を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物7を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物8を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物9を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物10を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、112.98mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、108.94mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.01mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.37mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、104.91mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
動物の群分け及び投与態様は表9のとおりである。
動物の生存時間を記録した。
Microsoft Office Excel 2007ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。2群の比較はt検定で行った。
表10に示している。
」は、原子の結合点を示し、アスタリスク付きの酸素原子は、有機中心「R」と結合する原子である。ただし、nの数値範囲は約5〜500であり、最も好ましくは50〜200であり、好ましくは113とする。平均分子量は約1k〜60kDaである。
」は、同じように樹状に拡散していることを示す。
」におけるエステル結合は、本発明の上記分離可能なリンカーと活性剤Dとが共有結合して形成した切断可能な結合である。本発明のコンジュゲートが標的細胞に到達した後、切断可能な結合が生理学的条件下で加水分解又は酵素分解され、その後、コンジュゲートから活性剤イリノテカンが放出され、イリノテカンが標的細胞中で抗がん作用を発揮する。
」における炭素硫黄結合は、本発明の上記難分解性リンカーと標的分子Tとが形成し、生理学的条件下で加水分解に対して比較的安定な化学結合であり、そのうち、原子SはiRGDに由来するものである。標的分子の標的指向性により、本発明のコンジュゲートは特定の標的細胞に到達できながら、標的分子と母体とが分離し難い。
」はPOLYとの連結を意味する。
例えば、多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の製造方法は、下記ステップを含む。
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
DCM:ジクロロメタン
Boc−Gly−OH:
DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド
IPA:イソプロピルアルコール
TFA:トリフルオロ酢酸
TBME:tert−ブチルメチルエーテル
EA:酢酸エチル
DME:エチレングリコールジメチルエーテル
HOSU:N−スクシンイミドカーボネート
THF:テトラヒドロフラン
Boc−Lys−OH:
DEPC:シアノホスホン酸ジエチル
Pbf:
DIC:N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド
MTBE:tert−ブチルメチルエーテル
EDT:1,2−エタンジチオール
PBS:リン酸緩衝液
EDC・HCl:1−エチル(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
iRGDの作製
窒素雰囲気下で、1000mLの三ツ口フラスコに、200mLのピリジン、120gの1(1.0eq)を加え、撹拌して0℃まで降温させ、151.8gのTsCl(1.0eq)を数回に分けて添加し、1h撹拌し、次いで室温まで徐々に昇温し、3〜4h撹拌し続けた。反応終了後に、反応液を氷冷した希塩酸溶液に投入し、EAを加えて抽出し、EA層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付してBP103a01精製物を55g得た。
1000mLの三ツ口フラスコに、55gのBP103a01(1.0eq)及び160mLのDMSOを加え、均一に撹拌し、次いで、NaN323.52g(2.0eq)を加え、50℃に加熱して3時間反応させ、室温まで降温させ、反応液を水に投入し、EAで抽出し、有機層を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色の液体であるBP103a02を29.2g得た。
1Lの水素化反応器に、29gの化合物3、360mLのメタノール、5.0gのパラジウム炭素を加え、撹拌し、窒素置換し、水素ガスを導入して3〜4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、反応液をろ過し、ろ液を濃縮してBP103a03の油状物を23.5g得た。
1Lの三ツ口フラスコに、23.5gの化合物BP103a03(1.0eq)、68.6gの(Boc)2O(2.0eq)、500mlのメタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液を加え、撹拌して還流するまでに昇温し、1h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、メタノールトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解し、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合併し、1回水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、乾燥させ、固体のBP103a04を34.8g得た。
1000mLの三ツ口フラスコに、34.8gの化合物BP103a04(1.0eq)、それぞれ150mlのトルエン及びTHF、58.2gのブロモ酢酸(3eq)を加え、撹拌し、45〜50℃に加熱し、さらに33.5gの水酸化ナトリウム(6eq)を加え、一晩反応し、TLCでモニタリングし、反応終了後、反応液を留去し、水及びEAを加えて抽出し、水相をpH3に調整し、ジクロロメタンで水相を抽出し、ジクロロメタン層を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮して油状物化合物であるBP103a05を18g得た。
250mLの三ツ口フラスコに、18gの化合物BP103a05、100mlのEAを加え、撹拌して溶解した後に、0℃まで降温させ、150mlのEA/HCl(3.5M)を加え、0℃で保温し、TLCでモニタリングし、反応が終了し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して白色の固体のBP103aを10.4g得た。
100mLのフラスコに、3.0gのBP103a(1.0eq)、4.0gの化合物M1(1.0eq)、40mlのDCM、4.0mlのDIEA(2.0eq)を加え、室温で撹拌し、TLCでモニタリングし、反応が終了後、有機溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィーに付して類似油状物M2を5.2g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、9.00gの化合物M2(1.0eq)、3.96gのHOSU(1.53eq)、90mlのDCM、6.60gのEDC.HCl(1.53eq)を加え、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、pH=6.0の50mmol/Lのリン酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して5.9gの無色の油状物である化合物M3を得た。
200mLのフラスコに、2.93gの化合物Boc−Lys−OH(1.0eq)、60mlの水、2.00gのNaHCO3(2.0eq)を加え、撹拌し、5.9gの化合物M3(1.0eq)を滴下して60mlのDME(エチレングリコールジメチルエーテル)の溶液に溶解し、60mlのTHFを追加し、撹拌して一晩置いた。TLCでモニタリングし、反応が終了後、有機溶媒を留去し、酢酸でPH=4に調整し、EAで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、4.50gの無色の油状物化合物M4を得た。
100mLのフラスコに、3.81gの化合物M4(1.0eq)、40mlのDCM、1.07gのHOSU、1.78gのEDC.HClを加え、撹拌し、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応が終了後、DCMで希釈し、その後、50mMのリン酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、純水で1回洗浄し、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、4.1gの無色の油状物化合物M5を得た。
250mLの丸底フラスコに、3.50gの化合物M6(1.0eq)、52.5mlのDMFを加え、60℃に加熱して溶解し、5〜10min後にDMFを減圧留去し、300mlのn−ヘプタンを加えて減圧蒸留し、3回繰り返し、遠心脱水後、105mlのDCM、1.08gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、63mgのDMAP(0.1eq)を加え、1.59gのDCC(1.5eq)を滴下して10mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮して120mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、150mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して4.02gの淡黄色の固体である化合物M7を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.02gの化合物M7、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体M8を4.00g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、2.95gの化合物M8、80mlのDCM、2.57g(1.05eq)の化合物4、2.16mlのDIEA(3.0eq)、0.96mlのDEPC(1.5eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体M9を1.48g得た。
50mLの丸底フラスコに、260mgの化合物M9、10mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体M10を210mg得た。
10mLの丸底フラスコに、51mgの化合物M10(4.0eq)、2mlのDCM、11ulのTEA(8.0eq)、201mgの4armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体M11を240mg得た。
10mLの丸底フラスコに、50mgの化合物M11(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に10.6mgのiRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H1(化合物1の塩酸塩)を50mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物11(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に139mgのtLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H2(化合物2の塩酸塩)を1.0g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.903(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.332(s,2H)、5.484(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
Lyp−1の作製
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M11(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に182mgのLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H3(化合物3の塩酸塩)を1.05g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.481(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
CPARPARの作製
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M11(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に154mgのCRPARPARを加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H4(化合物4の塩酸塩)を1.09g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.905(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.486(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
cRGDの作製
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M11(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に96.4gのcRGDを加えて4mlのpH=7、0.01MのPBSと6mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H5(化合物5の塩酸塩)を1.06g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.326(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
250mLの丸底フラスコに、5.00gの化合物M20(1.0eq)、100mlのDCM、3.89gのTEA(3.0eq)を加え、3.50gのTBDPS−Cl(1.0eq)を滴下して20mlのDCMの溶液に溶解し、TLCでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、3.62gの淡黄色の固体である化合物M21を得た。
250mLの丸底フラスコに、4.80gの化合物M21(1.0eq)、145mlのDCM、1.64gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、95mgのDMAP(0.1eq)を加え、2.41gのDCC(1.5eq)を滴下して10mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で130mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、160mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して4.65gの淡黄色の固体である化合物M22を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.65gの化合物M22、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体M23を2.48g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、2.3gの化合物M23、45mlのDCM、3.196g(1.05eq)化合物M5、1.75mlのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体M24を2.20g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.0gの化合物M24、60mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体M25を1.75g得た。
500mLの丸底フラスコに、1.51gの化合物M25(4.0eq)、140mlのDCM、390ulのTEA(8.0eq)、7.0gの4armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体M26を7.9g得た。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M26(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に188mgのiRGDを加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H6(化合物6の塩酸塩)を980mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.905(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
tLyp−1の作製は実施例2と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M26(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に144mgのtLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H7(化合物7の塩酸塩)を1.01g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.904(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.488(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
Lyp−1の作製は実施例3と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M26(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に188mgのLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H8(化合物8の塩酸塩)を1.04g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.481(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
CRPARPARの作製は実施例4と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M26(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に159mgのCRPARPARを加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H9(化合物9の塩酸塩)を1.04g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.910(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
cRGDの作製は実施例5と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M26(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に99.5mgのcRGDを加えて4mlのpH=7、0.01MのPBSと6mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H10(化合物10の塩酸塩)を1.03g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.915(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.337(s,2H)、5.484(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
250mLの丸底フラスコに、6.00gの化合物M30(1.0eq)、120mlのDCM、5.00gのTEA(3.0eq)を加え、4.53gのTBDPS−Cl(1.0eq)を滴下して20mlのDCMの溶液に溶解し、TLCでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、4.32gの淡黄色の固体である化合物M31を得た。
250mLの丸底フラスコに、5.0gの化合物M31(1.0eq)、150mlのDCM、1.73gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、101mgのDMAP(0.1eq)を加え、2.55gのDCC(1.5eq)を滴下して10mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で130mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、160mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して4.52gの淡黄色の固体である化合物M32を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.40gの化合物M32、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体M33を2.32g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、2.3gの化合物M33、45mlのDCM、2.77gの(1.05eq)化合物5、1.1gのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体M34を2.02g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.0gの化合物M34、60mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体M35を1.69g得た。
500mLの丸底フラスコに、1.50gの化合物M35(4.0eq)、140mlのDCM、390ulのTEA(8.0eq)、7.0gの4armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体M36を7.64g得た。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M36(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に189mgのiRGDを加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H11(化合物11の塩酸塩)を1.08g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.909(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.481(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
tLyp−1の作製は実施例2と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M36(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に144mgのtLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H12(化合物12の塩酸塩)を0.99g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.915(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.340(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
Lyp−1の作製は実施例3と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M36(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に189mgのLyP−1を加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H13(化合物13の塩酸塩)を1.06g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.908(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.484(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
CRPARPARの作製は実施例4と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M36(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に160mgのCRPARPARを加えて10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H14(化合物14の塩酸塩)を1.01g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.910(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.336(s,2H)、5.485(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
cRGDの作製は実施例5と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M36(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に100mgのcRGDを加えて4mlのpH=7、0.01MのPBSと6mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H15(化合物15の塩酸塩)を1.05g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.914(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.340(s,2H)、5.489(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
250mLの丸底フラスコに、5.0gの化合物M40(1.0eq)、150mlのDCM、2.67gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、155mgのDMAP(0.1eq)を加え、3.93gのDCC(1.5eq)を滴下して15mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で130mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、160mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して6.85gの淡黄色の固体である化合物M41を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.00gの化合物M41、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体M42を3.54g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、3.00gの化合物M42、45mlのDCM、3.46g(1.05eq)化合物M5、1.38gのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体M43を2.68g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.0gの化合物M43、60mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体M44を1.61g得た。
500mLの丸底フラスコに、1.50gの化合物M44(4.0eq)、140mlのDCM、391ulのTEA(8.0eq)、7.0gの4armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体M45を7.61g得た。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M45(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に188mgのiRGDを10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H16(化合物16の塩酸塩)を1.09g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.909(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.482(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
tLyp−1の作製は実施例2と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M45(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に144mgのtLyP−1を10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H17(化合物17の塩酸塩)を1.02g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.912(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.336(s,2H)、5.485(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
Lyp−1の作製は実施例3と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M45(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に188mgのLyP−1を10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H18(化合物18の塩酸塩)を1.06g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.917(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.340(s,2H)、5.491(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
CRPARPARの作製は実施例4と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M45(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に159mgのCRPARPARを10mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H19(化合物19の塩酸塩)を1.07g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.911(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.332(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
cRGDの作製は実施例5と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物M45(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に99.5mgのcRGDを加えて4mlのpH=7、0.01MのPBSと6mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体H20(化合物20の塩酸塩)を1.03g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.909(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.331(s,2H)、5.478(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
10mLの丸底フラスコに、52mgの化合物M10(3.0eq)、2mlのDCM、11ulのTEA(6.0eq)、273mgの3armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体50を310mg得た。
10mLの丸底フラスコに、50mgの化合物50(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に7.2mgのiRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体21を49mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
L部分の作製は実施例1と同じである。
10mLの丸底フラスコに、55mgの化合物50(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に、4.2mgのcRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSと1.5mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体22を50mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
100mLの丸底フラスコに、476mgの化合物M10(8.0eq)、15mlのDCM、105ulのTEA(16.0eq)、1.0gの8armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体60を1.37g得た。
10mLの丸底フラスコに、50mgの化合物60(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に14.5mgのiRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体23を54mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
Lyp−1の作製は実施例3と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
10mLの丸底フラスコに、60mgの化合物60(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に17.4mgのLyP−1を加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体24を68mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.329(s,2H)、5.481(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、45mgの化合物60(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に10.0mgのtLyP−1を加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体25を45mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.330(s,2H)、5.482(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、55mgの化合物60(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に13.5mgのCRPARPARを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体26を62mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.331(s,2H)、5.480(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、50mgの化合物60(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に7.7mgのcRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSと1.5mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体27を50mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.328(s,2H)、5.481(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
iRGDの作製は実施例1と同じである。
L部分の作製は実施例1と同じである。
250mLの丸底フラスコに、5.00gの化合物M20(1.0eq)、100mlのDCM、3.87gのTEA(3.0eq)を加え、3.49gのTBDPS−Cl(1.0eq)を滴下して20mlのDCMの溶液に溶解し、TLCでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、3.52gの淡黄色の固体である化合物M21を得た。
250mLの丸底フラスコに、4.50gの化合物M21(1.0eq)、135mlのDCM、1.5gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、87mgのDMAP(0.1eq)を加え、2.21gのDCC(1.5eq)を滴下して10mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で120mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、150mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して4.95gの淡黄色の固体である化合物M22を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.95gの化合物M22、55mlのDCMを加え、攪拌溶解後に13.7mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体M23を2.5g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、2.3gの化合物M23、45mlのDCM、3.9g(1.05eq)化合物5、2.14mlのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体M24を2.45g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.2gの化合物M24、65mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体M25を1.7g得た。
100mLの丸底フラスコに、1.21gの化合物M25(8.0eq)、60mlのDCM、314ulのTEA(16.0eq)、3.0gの4armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体70を3.9g得た。
10mLの丸底フラスコに、50mgの化合物70(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に15.3mgのiRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体28を55mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、60mgの化合物70(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に18.3mgのLyP−1を加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体29を68mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.486(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、55mgの化合物70(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に12.8mgのtLyP−1を加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体30を55mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.335(s,2H)、5.488(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、55mgの化合物70(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に14.2mgのCRPARPARを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体31を60mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.332(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
10mLの丸底フラスコに、60mgの化合物70(1.0eq)、1.5mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に9.7mgのcRGDを加えて1mlのpH=7、0.01MのPBSと1.5mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体32を62mg得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.900(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
250mLの丸底フラスコに、6.00gの化合物M30(1.0eq)、120mlのDCM、5.00gのTEA(3.0eq)を加え、4.53gのTBDPS−Cl(1.0eq)を滴下して20mlのDCMの溶液に溶解し、TLCでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、4.32gの淡黄色の固体である化合物M31を得た。
250mLの丸底フラスコに、5.0gの化合物M31(1.0eq)、150mlのDCM、1.73gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、101mgのDMAP(0.1eq)を加え、2.55gのDCC(1.5eq)を滴下して10mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で130mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、160mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、乾燥して4.52gの淡黄色の固体である化合物M32を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.40gの化合物M32、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体M33を2.32g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、2.3gの化合物M33、45mlのDCM、2.77gの(1.05eq)化合物M5、1.1gのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体M34を2.02g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.0gの化合物M34、60mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体M35を1.69g得た。
500mLの丸底フラスコに、2.75gの化合物M35(8.0eq)、140mlのDCM、730ulのTEA(16.0eq)、7.0gの8armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体80を8.64g得た。
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物80(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に307mgのiRGDを加えて15mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体33を1.18g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.903(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.334(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物80(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に235mgのtLyP−1を加えて15mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体35を1.05g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.904(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.334(s,2H)、5.489(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
100mLの丸底フラスコに、1.0gの化合物80(1.0eq)、20mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に163mgのcRGDを加えて6mlのpH=7、0.01MのPBSと10mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体37を1.00g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.903(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.334(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
250mLの丸底フラスコに、5.0gの化合物M40(1.0eq)、150mlのDCM、2.67gのBoc−Gly−OH(1.2eq)、155mgのDMAP(0.1eq)を加え、3.93gのDCC(1.5eq)を滴下して15mlのDCMの溶液に溶解し、20℃で4時間反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが25%体積になるまで濃縮した時点で130mlのIPAを加え、75%の溶媒を留去し、160mlのn−ヘプタンを加え、室温で1時間撹拌し、ろ過し、n−ヘプタンで2回洗浄し、6.85gを乾燥して淡黄色の固体である化合物M41を得た。
100mLの三ツ口フラスコに、4.00gの化合物M41、50mlのDCMを加え、攪拌溶解後に11.6mlのTFAを滴下し、室温で2h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、150mlのアセトニトリルを加え、120mlの溶媒を減圧蒸留した後に320mlのTBME溶液に投入し、30min撹拌し、ろ過し、ケーキをTBMEで洗浄して淡黄色の固体M42を3.54g得た。
200mLの三ツ口フラスコに、3.00gの化合物M42、45mlのDCM、3.46g(1.05eq)化合物5、1.38gのTEA(3.0eq)を加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、DCMで希釈し、次いで、2回水洗し、飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、HPLC精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体M43を2.68g得た。
200mLの丸底フラスコに、2.0gの化合物M43、60mlの20%TFA/DCMを加え、室温で4h反応させ、TLCでモニタリングし、反応終了後、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体M44を1.61g得た。
250mLの丸底フラスコに、1.61gの化合物M44(8.0eq)、80mlのDCM、418ulのTEA(16.0eq)、4.0gの8armPEG20K−SCM(1.0eq)を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体90を5.15g得た。
50mLの丸底フラスコに、0.5gの化合物90(1.0eq)、10mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に152mgのiRGDを5mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体38を0.53g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.902(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.333(s,2H)、5.488(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
0.5gの化合物90(1.0eq)、10mlのpH=7、0.01MのPBSを50mLの丸底フラスコに加え、溶解して透明になった後に153mgのLyP−1を5mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体39を0.57g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.900(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.332(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
50mLの丸底フラスコに、0.5gの化合物90(1.0eq)、10mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に129mgのCRPARPARを5mlのpH=7、0.01MのPBSの溶液に加え、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体41を0.55g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.901(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.331(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
50mLの丸底フラスコに、0.5gの化合物90(1.0eq)、10mlのpH=7、0.01MのPBSを加え、溶解して透明になった後に80.8mgのcRGDを加えて4mlのpH=7、0.01MのPBSと6mlのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で4時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、HCl/EA溶液を加え、濃縮し、TBMEに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体42を0.50g得た。
1HNMR(DMSO+D2O):δ0.903(t,CH2CH 3)、3.5(brmPEG)、5.330(s,2H)、5.487(s,2H)、7.0−8.5(mNH)
化合物1〜42の、ヒト結腸癌HT−29のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用を測定する。
2.1 試料
イリノテカン(原薬)、nktr−102(原薬)は購入品であり、化合物1〜42はすべてブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
McCoy’s5A培養液、ウシ胎児血清(FBS)、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン二重特異性抗体、注射用水、乳酸、ソルビトール。
雌性BALB/cヌードマウス(匹数:300匹;週齢:5〜7週)をBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から購入し、温度20〜25℃、相対湿度40%〜70%、12時間明、12時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取するSPF動物飼育室で飼育した。飼育して約1週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク(CAS、本実験室では液体窒素中に凍結保存)から入手したヒト結腸癌細胞HT−29。
3.1 HT−29細胞培養
5%CO2、37℃の培養条件下で、HT−29細胞を、10%ウシ胎児血清含有McCoy’s5A培養液中で通常の細胞培養を行い、0.25%トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に2〜3回行い、継代比率を1:3〜1:8とした。
対数増殖期のHT−29細胞を採取し、細胞数計測後に無血清McCoy’s5A培地に再懸濁し、細胞濃度を6×107細胞/mLに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に50mLの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を1mLのシリンジで採取し、ヌードマウスの右前腋窩皮下に注射し、各動物に100μL(6×106細胞/匹)接種し、HT−29のヌードマウス移植腫瘍モデルを構築した。接種後に定期的に動物の状態及び腫瘍の増殖状態を観察し、電子ノギスを用いて腫瘍径を測定し、データを直接的にExcel表に入力し、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が100〜300mm3になった後に、健康状態が良好で、腫瘍体積が近い動物を225匹選択し、乱塊法により45組に分けた(n=5)。実験開始後に腫瘍径を週に2回測定し、腫瘍体積を計算し、且つ動物体重を秤量して記録した。
腫瘍体積(TV)の計算公式は下記のとおりである。
TV(mm3)=l×w2/2
式中、lは腫瘍長径(mm)を表し、wは腫瘍短径(mm)を表す。
0.5gのソルビトールを秤量して50mLの遠心管に入れ、遠心管に50mLの注射用水を加え、固形物が完全に溶解するまで旋回振動し、濃度1%のソルビトール水溶液(w/v)を調製し、4℃の冷蔵庫に保存しておいた。
3.4.1 イリノテカン投与製剤の調製
12.0mgのイリノテカンを秤量し、0.15mlの1%乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに2.85mlの1%ソルビトール水溶液をそれぞれ加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の1%乳酸、1%ソルビトール水溶液の比率を約5:95(v/v)とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、88.55mgのnktr−102を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.85mgの化合物1を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.80mgの化合物2を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.88mgの化合物3を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、111.24mgの化合物4を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.78mgの化合物5を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物6を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物7を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物8を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物9を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物10を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、112.98mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、108.94mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.01mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.37mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、104.91mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
動物の群分け及び投与態様は表1のとおりである。
実験の最終日に、体重を秤量し、腫瘍径を測定した後に動物を安楽死させた(CO2)。腫瘍組織を取り出し、秤量して撮影し(撮影時に以下の組み合わせでそれぞれ撮影)、腫瘍重量抑制率を計算した。動物に対して肉眼解剖を行い、内臓器官に異常があるかを肉眼で観察した。
相対腫瘍体積(RTV)の計算公式は下記のとおりである。
RTV=TVt/TVinitial
式中、TVinitialは群分けして投与した時に測定した腫瘍体積であり、TVtは投与期間中各測定時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率(%T/C)の計算公式下記のとおりである。
%T/C=100%´(RTVT/RTVC)
式中、RTVTは治療群のRTVを示し、RTVCは溶媒対照群のRTVを示す。
腫瘍増殖抑制率TGI(%)の計算公式は下記のとおりである。
TGI=100%×[1−(TVt(T)−TVinitial(T))/(TVt(C)−TVinitial(C))]
式中、TVt(T)は治療群の各測定時の腫瘍体積を示し、TVinitial(T)は群分けして投与した時の治療群の腫瘍体積を示し、TVt(C)は溶媒対照群の各測定時の腫瘍体積を示し、TVinitial(C)は群分けして投与した時の溶媒対照群の腫瘍体積を示す。
動物の体重低減率の計算公式は下記のとおりである。
動物の体重低減率=100%×(BWinitial−BWt)/BWinitial
式中、BWtは投与期間中各測定時の動物体重を示し、BWinitialは群分けして投与した時の動物体重を示す。
腫瘍重量抑制率IR(%)の計算公式は下記のとおりである。
IR(%)=100%×(WC−WT)/WC
式中、WCは対照群の腫瘍重量を示し、WTは治療群の腫瘍重量を示す。
Microsoft Office Excel 2007ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差(Mean±SE)として表し、2群の比較はt検定で行った。
実験中、実験者及び獣医師は実験動物の徴候及び健康状態を観察し続けなければならない。疼痛、うつ病、活動低下等動物のいかなる異常症状を実験ノートに記録する必要がある。実験動物の異常状況がIACUC関連動物福祉法規の規定に一致しない場合、獣医師は実験停止の要否を判断し、且つ実験責任者に通知することができる。
ヒトがん異種移植腫瘍モデルについて、実験評価指標として相対腫瘍増殖率T/C(%)を推奨する。増殖率が低いほど、腫瘍抑制効果が良いことは表2に示されている。
1.実験目的
本研究は、ヒト乳がんMDA−MB−231のヌードマウス移植腫瘍モデルを用いて、化合物1〜42の生体内における抗腫瘍活性を評価する。
2.1 動物種類
マウス。
BALB/cヌードマウス。
雌性。
320匹接種し、実験で225匹を使用した。
6〜8週。
20〜22g±20% 体重平均値。
上海西普−必凱実験動物有限公司(BK)、許可証番号SCXK(滬)2008−0016。
すべての実験動物をSPFレベルの実験室で飼育した。実験者は日常のケア及び実験研究を担当した。
各ケージに実験番号、実験群別、実験者名前、マウス品種及び性別等の情報が記載されている身分カードが付いており、マウスはイヤリングがによりマーキングした。
腫瘍体積が150〜200mm3になった後に、各群にマウス5匹、各群内の腫瘍体積及びマウス体重が均一であるように、乱塊法により群分けした。各群の腫瘍体積の平均値の、すべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差が±10%以下であった。
すべての実験動物の操作及び管理は、動物使用及び管理ガイドラインに厳しく従う。
居住条件:IVCシステム、各ケージに5匹
温度:20℃〜26℃
湿度:40%〜70%
光照射:12時間の昼夜交替
北京科澳協力飼料有限公司から購入した照射ラット・マウス飼料。自由に摂食させた。
都市水道水。ろ過して高圧滅菌して飲水させた。
上海茂生誘導体科技有限公司から購入したコーンコブ。高圧滅菌して使用した。週に2回敷料を交換した。
実験前にマウスに少なくとも1週間の環境適応期間を与えた。
3.1 実験対象医薬品
イリノテカン(原薬)、nktr−102(原薬)は購入品であり、化合物1〜42はすべてブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
3.2.1 生理食塩水
上海華源長富薬業(集団)有限公司から購入した生理食塩水。
上海康徳莱企業発展集団股フン有限公司(上海、中国)から購入した1mlの無菌シリンジ。
上海中国科学院細胞生物研究所から購入したヒト乳がんMDA−MB−231。
MDA−MB−231を、10%ウシ胎児血清FBS(GIBCO、USA)を含むDMEM培地(GIBCO、USA)で培養し、5%CO2を含む37℃のインキュベーターで培養した。
米国BD社から購入したマトリゲルMatrigel。
ESCOから購入した生物学的安全キャビネット(型番:AC2−6E1)、
Thermo Scientific Formaから購入したCO2水密性インキュベーター(型番:3111)、
Olympusから購入した倒立顕微鏡(型番:CKX41SF)、
上海医療器械工業(集団)有限公司から購入した電気吸引装置(型番:YX930D)、
METTLER TOLEDOから購入した天びん(METTLER TOLEDO AB135−S)、
北京雷勃爾遠心機有限公司から購入した低速遠心機(型番:LD5−2A)、
桂林広陸数字測控股フン有限公司から購入した電子デジタルノギス(型番:SF2000)。
ヒト乳がんMDA−MB−231のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、各匹に対して1×106個の細胞を接種した。
今回の実験は以下(表)の投与量及び投与態様を設計した(表3)。
調製方法はブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
単回投与に必要な容量:
20g(body weight)x10(animals)x10mL/kg/1000x1.5=3mL
12.0mgのイリノテカンを秤量し、0.15mlの1%乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに2.85mlの1%ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の1%乳酸、1%ソルビトール水溶液の比率を約5:95(v/v)とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、88.55mgのnktr−102を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.85mgの化合物1を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.80mgの化合物2を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.88mgの化合物3を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、111.24mgの化合物4を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.78mgの化合物5を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物6を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物7を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物8を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物9を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物10を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、112.98mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、108.94mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.01mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.37mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、104.91mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
MDA−MB−231細胞を、10%ウシ胎児血清FBS(GIBCO、USA)を含むDMEM培地で培養した。細胞を5%CO2を含む37℃のインキュベーターで培養した。
細胞接種法による腫瘍ヌードマウス皮下移植モデルの構築:対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、細胞数計測後に1×PBSに再懸濁し、細胞濃度をに1×107/ml調整し。1mLのシリンジ(針No.4)でヌードマウス右背部皮下に腫瘍細胞を、1×106/0.1ml/マウスで接種した。
腫瘍体積が100〜200mm3になった時点で、各群の腫瘍の差が平均値の10%未満となるように、各群にマウス5匹で乱塊法により動物をランダムに群分けした。群分けの日をDay 0とし、群分けの日に投与した。
実験期間を3週間とし、実験期間中、動物体重及び腫瘍サイズを週に2回測定した。毎日に臨床症状を観察して記録した。実験の最終日に、動物を殺し、体重を秤量し、腫瘍を取り出し、秤量して撮影して記録した。
すべての動物実験操作は、動物使用及び管理規則に厳しく従う。腫瘍関連パラメータの計算は、中国CFDAによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』を参照する。
腫瘍体積(Tumor volume、TV)の計算公式はTV=a×b2/2である。式中、a、bはそれぞれ測定された腫瘍の長さ及び幅を示す。相対腫瘍体積(relative Tumor volume、RTV)の計算公式はRTV=Vt/V0である。式中、V0は群分けして投与した時の腫瘍体積を示し、Vtは測定時の腫瘍体積を示す。抗腫瘍活性の評価指標として相対腫瘍増殖率T/C(%)及び腫瘍抑制率(%)を用い、計算公式はそれぞれT/C(%)=(TRTV/CRTV)×100%である。TRTVは治療群のRTVを示し、CRTVは陰性対照群のRTVを示す。腫瘍抑制率(%)=(陰性対照群の平均腫瘍重量−投与群の平均腫瘍重量)/陰性対照群の平均腫瘍重量×100%。
腫瘍担持動物の体重変化(%)の計算は下記のとおりである。(測定時の体重−群分け時の体重)/群分け時の体重×100。
Microsoft Office Excel 2007ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差(Mean±SE)として表し、2群の比較はt検定で行った。
中国CFDAによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』(2006年11月)に基づき、T/C(%)≦40%、且つ統計学分析によりp<0.05のものが有効であることは、表4に示されている。
1.実験目的
本研究は、ヒト膵臓がんMIA Paca−2のヌードマウス移植腫瘍モデルを用い、化合物1〜42の生体内における抗腫瘍活性を評価する。
2.1 動物種類
マウス。
BALB/c−nu/nuヌードマウス。
雌性。
300。
6〜8週。
20−22g±20% 体重平均値。
上海西普‐必凱実験動物有限公司(BK)、許可証番号SCXK(滬)2008−0016。
すべての実験動物をSPFレベルの実験室で飼育した。
各ケージに実験番号、実験群別、実験者名前、マウス品種及び性別等の情報が記載されている身分カードが付いており、マウスはイヤリングがによりマーキングした。
腫瘍体積が150〜200mm3になった後に、各群にマウス5匹、各群内の腫瘍体積及びマウス体重が均一であるように、乱塊法により群分けした。各群の腫瘍体積の平均値の、すべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差が±10%以下であった。
すべての実験動物の操作及び管理は、実験動物使用及び管理ガイドラインに厳しく従う。
居住条件:IVCシステム、各ケージに5匹
温度:25℃±1℃
湿度:65%±10%
光照射:12時間の昼夜交替
北京科澳協力飼料有限公司から購入した照射ラット・マウス飼料。自由に摂食させた。
都市水道水。ろ過して高圧滅菌して飲水させた。
上海茂生誘導体科技有限公司から購入したコーンコブ。高圧滅菌して使用した。週に2回敷料を交換した。
実験前にマウスに少なくとも1週間の環境適応期間を与えた。
3.1 実験対象医薬品
イリノテカン(原薬)、nktr−102(原薬)は購入品であり、化合物1〜42はすべてブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
3.2.1 生理食塩水
上海華源長富薬業(集団)有限公司から購入した生理食塩水(上海、中国)。
上海康徳莱企業発展集団股フン有限公司(上海、中国)から購入した1mlの無菌シリンジ。
ヒト膵臓がんMIA Paca−2は上海中国科学院細胞生物研究所から購入した。
MIA Paca−2を、10%ウシ胎児血清FBS(GIBCO、USA)及び2.5%HSを含むDMEM培地(GIBCO、USA)で培養し、5%CO2を含む37℃のインキュベーターで培養した。
米国BD社から購入したマトリゲルMatrigel。
ESCOから購入した生物学的安全キャビネット(型番:AC2−6E1)、
Thermo Scientific Formaから購入したCO2水密性インキュベーター(型番:3111)、
Olympusから購入した倒立顕微鏡(型番:CKX41SF)、
上海医療器械工業(集団)有限公司から購入した電気吸引装置(型番:YX930D)、
METTLER TOLEDOから購入した天びん(METTLER TOLEDO AB135−S)、
北京雷勃爾遠心機有限公司から購入した低速遠心機(型番:LD5−2A)、
桂林広陸数字測控股フン有限公司から購入した電子デジタルノギス(型番:SF2000)。
ヒト膵臓がんMIA Paca−2のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、各匹に対して3×106個細胞を接種した。
今回の実験は以下(表5)の投与量及び投与態様を設計した。
調製方法はブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
単回投与に必要な容量:
20g(body weight)x10(animals)x10mL/kg/1000x1.5=3mL
12.0mgのイリノテカンを秤量し、0.15mlの1%乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに2.85mlの1%ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の1%乳酸、1%ソルビトール水溶液の比率を約5:95(v/v)とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、88.55mgのnktr−102を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.85mgの化合物1を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.80mgの化合物2を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.88mgの化合物3を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、111.24mgの化合物4を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.78mgの化合物5を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物6を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物7を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物8を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物9を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物10を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、112.98mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、108.94mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.01mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.37mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、104.91mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
MIA Paca−2細胞を、10%ウシ胎児血清FBS(GIBCO、USA)及び2.5%HSを含むDMEM培地で培養した。細胞を5%CO2を含む37℃のインキュベーターで培養した。
細胞接種法による腫瘍ヌードマウス皮下移植モデルの構築:対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、細胞数計測後に1×PBSに再懸濁し、細胞濃度を3×107/mlに調整した。1mLのシリンジ(針No.4)でヌードマウス右背部皮下に腫瘍細胞を、3×106/0.1ml/マウスで接種した。
腫瘍体積が100〜200mm3になった時点で、各群の腫瘍の差が平均値の10%未満となるように、各群にマウス5匹で乱塊法により動物をランダムに群分けした。群分けの日をDay0とし、群分けの日に投与した。
実験期間を3週間とし、実験期間中、動物体重及び腫瘍サイズを週に2回測定した。毎日に臨床症状を観察して記録した。実験の最終日に、動物を殺し、体重を秤量し、腫瘍を取り出し、秤量して撮影して記録した。
すべての動物実験操作は、動物使用及び管理規則に厳しく従う。腫瘍関連パラメータの計算は、中国SFDAによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』を参照する。
腫瘍体積(Tumor volume、TV)の計算公式はTV=a×b2/2である。式中、a、bはそれぞれ測定された腫瘍の長さ及び幅を示す。相対腫瘍体積(relative Tumor volume、RTV)の計算公式はRTV=Vt/V0である。式中、V0は群分けして投与した時の腫瘍体積を示し、Vtは測定時の腫瘍体積を示す。抗腫瘍活性の評価指標として相対腫瘍増殖率T/C(%)及び腫瘍抑制率(%)を用い、計算公式はそれぞれT/C(%)=(TRTV/CRTV)×100%である。TRTVは治療群のRTVを示し、CRTVは陰性対照群のRTVを示す。腫瘍抑制率(%)=(陰性対照群の平均腫瘍重量−投与群の平均腫瘍重量)/陰性対照群の平均腫瘍重量×100%。
腫瘍担持動物の体重変化(%)の計算は下記のとおりである。(測定時の体重−群分け時の体重)/群分け時の体重×100。
中国SFDAによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』(2006年11月)に基づき、T/C(%)≦40%、且つ統計学分析によりP<0.05のものが有効である。
Microsoft Office Excel 2007ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差(Mean±SE)として表し、群同士の比較はt−検定で行い、P<0.05の場合に有意差ありと認められる。
中国CFDAによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』(2006年11月)に基づき、T/C(%)≦40%、且つ統計学分析によりP<0.05のものが有効であることは、表6に示されている。
1.実験目的
供試薬物である化合物1〜42の、ヒト胃がんNCI−N87細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用を評価する。
2.1 試料
イリノテカン(原薬)、SN−38、10−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカン、nktr−102は購入品であり、化合物1〜42はすべてブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
RPMI−1640培養液、ウシ胎児血清(FBS)、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン、生理食塩水。
雌性BALB/cヌードマウス(匹数:150匹;週齢:6〜8週)をBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から購入し、温度20〜25℃、相対湿度40%〜70%、12時間明、12時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取する蘇州聖蘇新薬開発有限公司のSPF動物飼育室で飼育した。飼育して約1週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク(CAS、本実験室では液体窒素中に凍結保存)から入手したヒト胃がん細胞NCI−N87。
3.1 NCI−N87細胞培養
5%CO2、37℃の培養条件下で、NCI−N87細胞を、10%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培養液中で通常の細胞培養を行い、0.25%トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に1〜2回行い、継代比率を1:2〜1:6とした。
対数増殖期のNCI−N87細胞を採取し、細胞数計測後に無血清RPMI−1640培地に再懸濁し、細胞濃度を5×107細胞/mLに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に50mLの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を1mLのシリンジで採取し、ヌードマウスの右前腋窩皮下に注射し、各動物に100μL(5×106細胞/匹)接種し、NCI−N87のヌードマウス移植腫瘍モデルを構築した。接種後に定期的に動物の状態及び腫瘍の増殖状態を観察し、電子ノギスを用いて腫瘍径を測定し、データを直接的にExcel表に入力し、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が100〜300mm3になった後に、健康状態が良好で、腫瘍体積が近い動物を225匹選択し、乱塊法により45組に分けた(n=5)。実験開始後に腫瘍径を週に2回測定し、腫瘍体積を計算し、且つ動物体重を秤量して記録した。
腫瘍体積(TV)の計算公式は下記のとおりである。
TV(mm3)=l×w2/2
式中、lは腫瘍長径(mm)を表し、wは腫瘍短径(mm)を表す。
0.5gのソルビトールを秤量して50mLの遠心管に入れ、遠心管に50mLの注射用水を加え、固形物が完全に溶解するまで旋回振動し、濃度1%のソルビトール水溶液(w/v)を調製し、4℃の冷蔵庫に保存しておいた。
3.4.1 イリノテカン投与製剤の調製
12.0mgのイリノテカンを秤量し、0.15mlの1%乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに2.85mlの1%ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の1%乳酸、1%ソルビトール水溶液の比率を約5:95(v/v)とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、88.55mgのnktr−102を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.85mgの化合物1を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.80mgの化合物2を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.88mgの化合物3を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、111.24mgの化合物4を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.78mgの化合物5を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物6を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物7を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物8を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物9を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物10を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、112.98mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、108.94mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.01mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.37mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、104.91mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
動物の群分け及び投与態様は表7のとおりである。
実験終了後、体重を秤量し、腫瘍径を測定した後に動物を安楽死させた(CO2)。腫瘍組織を取り出して秤量し、腫瘍重量抑制率を計算した。腫瘍組織秤量後に、今後の分析のために、−70℃未満の冷蔵庫に移して保存した。
相対腫瘍体積(RTV)の計算公式は下記のとおりである。
RTV=TVt/TVinitial
式中、TVinitiaLは群分けして投与した時に測定した腫瘍体積であり、TVtは投与期間中各測定時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率(%T/C)の計算公式下記のとおりである。
%T/C=100%×(RTVT/RTVC)
式中、RTVTは治療群のRTVを示し、RTVCは溶媒対照群のRTVを示す。
腫瘍増殖抑制率TGI(%)の計算公式は下記のとおりである。
TGI=100%×[1−(TVt(T)−TVinitial(T))/(TVt(C)−TVinitial(C))]
式中、TVt(T)は治療群の各測定時の腫瘍体積を示し、TVinitial(T)は群分けして投与した時の治療群の腫瘍体積を示し、TVt(C)は溶媒対照群の各測定時の腫瘍体積を示し、TVinitial(C)は群分けして投与した時の溶媒対照群の腫瘍体積を示す。
動物の体重低減率の計算公式は下記のとおりである。
動物の体重低減率=100%×(BWinitial−BWt)/BWinitial
式中、BWtは投与期間中各測定時の動物体重を示し、BWinitialは群分けして投与した時の動物体重を示す。
腫瘍重量抑制率IR(%)の計算公式は下記のとおりである。
IR(%)=100%×(WC−WT)/WC
式中、WCは対照群の腫瘍重量を示し、WTは治療群の腫瘍重量を示す。
Microsoft Office Excel 2007ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差(Mean±SE)として表し、2群の比較はt−検定で行った。
実験中、実験者及び獣医師は実験動物の徴候及び健康状態を観察し続けなければならない。疼痛、うつ病、活動低下等動物のいかなる異常症状を実験ノートに記録する必要がある。実験動物の異常状況がIACUC関連動物福祉法規の規定に一致しない場合、獣医師は実験停止の要否を判断し、且つ実験責任者に通知することができる。
ヒトがん異種移植腫瘍モデルについて、実験評価指標として相対腫瘍増殖率T/C(%)を推奨する。増殖率が低いほど、腫瘍抑制効果が良いことは表8に示されている。
1.実験目的
供試薬物である化合物1〜42の、同所性U87MGヌードマウス脳グリオーマモデル生存率への影響を評価する。
2.1 試料
イリノテカン(原薬)、nktr−102(原薬)は購入品であり、化合物1〜42はすべてブライトジーン バイオ−メディカル テクノロジー カンパニー リミテッドにより提供されるものである。
RPMI−1640培養液、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン、生理食塩水。
雌性BALB/cヌードマウス(匹数:300匹;週齢:6〜8週)をBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から購入し、温度20〜25℃、相対湿度40%〜70%、12時間明、12時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取するSPF動物飼育室で飼育した。飼育して約1週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク(CAS、本実験室では液体窒素中に凍結保存)から入手したグリオーマ細胞U87MG。
U87MG細胞培養
5%CO2、37℃の培養条件下で、U87MG細胞をRPMI−1640培養液中で通常の細胞培養を行い、0.25%トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に1〜2回行い、継代比率を1:2〜1:6とした。
対数増殖期のU87MG細胞を採取し、細胞数計測後に無血清RPMI−1640培地に再懸濁し、細胞濃度を1×108細胞/mLに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に50mLの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を1mLのシリンジで採取し、動物脳定位固定装置の補助により、マイクロインジェクション法でヒトグリオーマ細胞U87MG細胞1μL(1×105細胞/匹)を生体外で培養し、同所性U87MG脳グリオーマモデルを構築し、接種後に定期的に動物の状態を観察した。接種後12日目に、動物を225匹選択し、乱塊法により45組に分けた(n=5)。
3.2.1 イリノテカン投与製剤の調製
12.0mgのイリノテカンを秤量し、0.15mlの1%乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに2.85mlの1%ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の1%乳酸、1%ソルビトール水溶液の比率を約5:95(v/v)とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、88.55mgのnktr−102を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.85mgの化合物1を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.80mgの化合物2を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.88mgの化合物3を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、111.24mgの化合物4を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.78mgの化合物5を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物6を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物7を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物8を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物9を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物10を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のSN−38の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、112.98mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、108.94mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.01mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.37mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、104.91mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の10−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.09mgの化合物11を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、109.05mgの化合物12を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、113.12mgの化合物13を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、110.48mgの化合物14を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
毎回の投与に先立って、105.02mgの化合物15を正確に秤量し、2.3mlの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を4.0mg・mL-1とした。
動物の群分け及び投与態様は表9のとおりである。
動物の生存時間を記録した。
Microsoft Office Excel 2007ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。2群の比較はt検定で行った。
表10に示している。
Claims (14)
- 下記の構造式(III)を有する、多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
(式中、Rは有機中心であり、POLYはポリマーであり、Lは多価リンカーであり、Tは標的分子であり、Dは活性剤であり、qは3〜8の任意の整数である。
ただし、Dは下記式で示されるカンプトテシン系薬物である。
- Dは、イリノテカン、SN−38、10−ヒドロキシカンプトテシン、又はルビテカンである、請求項1に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
- POLYは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリル酸アミン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、ポリサッカライド、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリアクリル酸、ポリ酢酸ビニル、ポリフォスファジン、ポリオキサゾリン、又はポリ(N−アクリロイルモルホリン)である、請求項1又は2に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
- POLYは、
- 多価リンカーLは、下記式で示されるものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
(式中、記号「*」は、多価リンカーLと標的分子Tとの結合点を示し、「#」は、多価リンカーLと活性剤Dとの結合点を示し、「%」は、多価リンカーLとPOLYとの結合点を示す。m、m’はそれぞれ1〜20の任意の整数であり、l、kはそれぞれ1〜10の任意の整数である。) - 多価リンカーLは、下記式で示されるものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
- Tは、「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」配列を含むRGDペプチド、tLyp−1、Lyp−1、RPARPAR、Angiopep2、GE11、又は葉酸である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
- Tは、iRGD又はcRGDである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
- 前記多分岐薬物コンジュゲートは、構造式(IV)、(V)、又は(VI)で示される構造を有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
(式中、nは5〜500であり、好ましくは5〜200であり、最も好ましくは113である。) - 下記の構造を有する多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
化合物1:
化合物24:
化合物25:
化合物26:
化合物27:
化合物28:
化合物29:
化合物30:
化合物31:
化合物32:
化合物33:
化合物34:
化合物35:
化合物36:
化合物37:
化合物38:
化合物39:
化合物40:
化合物41:
化合物42:
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬物組成物。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の、結腸癌、肺がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、グリオーマ、及び、乳房、卵巣、結腸、腎臓、胆管、肺及び脳の悪性肉腫、がん及びリンパ腫を治療するための薬物の製造のための使用。
- 下記式で示される多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の製造方法であって、
(1)活性剤Dと多価リンカーLとを連結し、D−L部分を得るスデップ、
(2)D−L部分とマルチアームポリマーである
(3)上記スデップで得られた
- Dは、イリノテカン、SN−38、10−ヒドロキシカンプトテシン、又はルビテカンであり、
マルチアームポリマーである
Lは、
Tは、iRGD、cRGD、tLyp−1、Lyp−1、RPARPAR、Angiopep2、GE11、又は葉酸である、請求項13に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の製造方法。
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