KR20190007483A - 멀티 암 중합 표적 항암 콘쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

멀티 암(multi-arm)이며, 수용성(水溶性) 폴리머로 수식(修飾)된 표적 약물 콘쥬게이트이며, 구조식(III)으로 표시되는 구조를 가지는 약물 콘쥬게이트에 관한 것이다.
Figure pct00312

(식 중, R은 유기 중심이며, POLY는 폴리머이며, L은 다가 링커이며, T는 표적 분자이며, D는 캠토테신계 약물이며, q는 3∼8이 임의의 정수이다.)
상기 약물 콘쥬게이트는, 캠토테신계 약물의 좋지 못한 수용성, 높은 독성, 및 낮은 바이오 어베일러빌리티(availability)를 개선할 수 있다.

Description

멀티 암 중합 표적 항암 콘쥬게이트
본 발명은 전체적으로, 멀티 암(multi-arm)인 수용성(水溶性) 폴리머 및 대응하는 약물 콘쥬게이트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 멀티 암 PEG로 수식(修飾)된 표적 항암 콘쥬게이트에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 본 발명은, 멀티 암 PEG를 통하여, 표적 분자와 항암 약물을 연결하여 이루어지는 콘쥬게이트에 관한 것이다.
최근, 생리 활성제의 안정성 및 송달(送達)을 개선하기 위한 다양한 방법이 제안되어 있다. 의약품용 시약의 제조 및 송달과 관련된 과제로서, 상기 의약품용 시약의 좋지 못한 수용성, 독성, 낮은 바이오 어베일러빌리티(availability), 불안정함, 및 약제의 신속한 생체내 분해성을 예로 들 수 있다. 의약품용 시약의 송달을 개선하기 위해 많은 방법이 설계되어 있지만, 결점이 없는 단일 방법은 없다. 예를 들면, 통상 사용되는 약물 송달 방법은, 리포솜, 폴리머 매트릭스, 또는 단분자 미셸 내에서의 약물 캡슐화, 폴리에틸렌글리콜과 같은 수용성 폴리머로의 공유 결합, 유전자 표적화제의 사용, 염류의 구조 등 중에서 적어도 1개 또는 복수의 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
WO2005028539, WO2010019233, WO2011063156, WO2011063158에는, 제III상 임상 시험 단계의 약물인 nktr102이 개시되어 있고, 상기 약물은 주로 전이성 유방암에 사용되며, Nektar Therapeutics에서 연구 개발된 것이다. 상기 약물은, 약물의 담지(擔持)를 높이기 위한 수용성 다분지 폴리머 약물 전구체(前驅體)이며, 그 구조는 하기와 같다.
[화학식 1]
Figure pct00001
상기 화합물은, 수용성을 높이고, 약물 담지량을 증가시키도록, 멀티 암 PEG를 통하여 이리노테칸과 연결하여 이루어지는 것이며, 항암 작용이 변함없는 전제 하에서 부작용을 저감한다. 그러나, 상기 약물은, 예를 들면, 표적 지향성이 좋지 못하여, 특정한 암 세포에 작용할 수 없으며, 암 세포를 죽임과 동시에 정상 세포의 성능에도 영향을 미침으로써, 불량 반응의 발생율은 여전히 높은 결점이 있다.
인테그린(Integrins)은, 세포 접착 수용체 분자이며, 유핵 세포 표면 전체에 넓게 발현되며, 그 중에서도, 인테그린 αγβ3는, 신경교종, 멜라노마, 난소암 등의 다양한 종양 세포 및 종양 관련 내피 세포의 표면에 많이 발현되어, 종양의 혈관 신생, 종양 전이 및 종양의 방사선 치료 내성(耐性)과 긴밀하게 관련되어 있으므로, 인테그린 αγβ3는, 종양의 표적화를 위한 특이적인 표적으로서 사용되는 경우가 많다. 연구에 의해, 아르기닌-글리신-아스파라긴산(Arg-Gly-Asp, RGD)의 트리펩티드 서열은, αγ 서브유닛(subunit)을 포함하는 인테그린 패밀리를 특이적으로 인식할 수 있고, 높은 친화성을 가지는 것으로 나타나 있다.
종래의 종양을 치료하기 위한 약물은, 종양 조직에 대한 선택성이 부족하며, 독성 부작용이 큰 등의 결점을 가지는 것이 많다. 양호한 약물 송달 시스템을 어떻게 설계할 것인지는, 최근, 널리 연구되고 있다. 『종양 증식이 종양 혈관에 의존하는 이론』의 제창에 따라, 종양 신생 혈관 표적 수용체 약물은, 종양 치료 효과를 향상시키기 위한 신규이며서 또한 유망한 방법이 되고 있다. 인테그린 αγβ3는 종양 표적 치료의 이상적인 표적이며, 그 리간드 RGD 펩티드는, 이펙터 분자 기능을 하는 것으로서, 인테그린과 특이적으로 결합함으로써, 종양 증식 및 혈관 신생을 저해할 수 있다.
RGD 펩티드와 인테그린의 αγβ3와의 특이적인 결합에 의해, 치료 이펙터 분자를 종양 부위에 표적에 도입할 수 있고, 종양 치료 중의 정상 조직 세포로의 손해를 효과적으로 저감할 수 있다.
선형 RGD 펩티드는 생체 내에 널리 존재하지만, 상기 펩티드는 체내 순환 중의 반감기가 짧으며, αγβ3 수용체로의 친화력이 낮고, 프로테아제에 분해되기 쉽다. 한편, 환형 RGD 펩티드는, 안정성이 높고, 수용체와의 친화력이 높고, 또한 종양 침투 펩티드 특성을 나타내므로, 항암 약물의 표적 침투로의 촉진 및 약물의 정상 세포로의 독부작용의 저감에 있어서 현저하게 우위성을 나타낸다.
iRGD는, 특허문헌 WO2009126349에 개시되어 있고, 그 구체적인 구조는 하기와 같다.
[화학식 2]
Figure pct00002
WO2005028539 WO2010019233 WO2011063156 WO2011063158 WO2009126349
[발명의 개요]
본 발명은, 표적 지향성을 가지는 새로운 다분지 약물 콘쥬게이트에 관한 것이며, 상기 콘쥬게이트는, 3개 이상의 분지를 가지며, 하기 식으로 표시된다.
[화학식 3]
Figure pct00003
식 중, R은 유기 중심이며, POLY는 폴리머이며, POLY는 X와 함께 폴리머 분지를 구성한다.
상기 다분지 약물 콘쥬게이트의 각 분지는, 다른 분지와는 상호 독립하고 있다. 즉, 각 분지는 다른 POLY, X로 구성될 수도 있다. 전형적으로, 일반적인 구조는,
[화학식 4]
Figure pct00004
[화학식 5]
Figure pct00005
등에 대응하는 것이며, 나머지는 이것에 기초하여 유추할 수 있다. 각 분지는, 유기 중심인 「R」으로부터 뻗어나는 것이다. 그리고, 통상, 상기 콘쥬게이트의 각 분지는 모두 동일하다.
이하, 구조식(I) 중의 각 변수에 대하여 설명한다.
유기 중심인 「R」
구조식(I)에 있어서, 「R」은 1∼100 개의 원자를 포함하는 유기 중심기이다. 바람직하게는, R은 3∼50 개의 원자를 포함하고, 보다 바람직하게는 R은 약 3∼30 개의 원자를 포함한다. R은, 사용되는 특별한 중심 분자에 의하여, 탄소 원자로 이루어지는 중심기라도 되며, 예를 들면, O, S, N, P 등의 헤테로 원자를 1개 또는 복수 개 선택적으로 포함해도 된다. R은 직쇄, 분지 또는 환형 중 어느 것이라도 되고, 적어도 3개의 독립된 폴리머 지쇄(支鎖)로 분지된다. 구조식(I)에 있어서, 「q」는, 「R」로부터 갈라져 나온 폴리머 지쇄의 수에 대응한다.
유기 중심 「R」은, 1개의 분자로부터 유래하는 것이며, 상기 분자는, 복수의 폴리머 결합 부위를 제공하고, 그 수가, 폴리머 지쇄의 수와 거의 동일하다. 보다 바람직하게는, 다분지 폴리머 구조의 주체 중심 분자식은, 적어도 폴리머 분지로서 바람직한, 하이드록시기, 티오기, 또는 아미노기를 가지는 폴리하이드록시 화합물, 폴리술피드 화합물, 또는 폴리아민 화합물의 잔기를 3개 이상 가진다. 1개의 「폴리하이드록시 화합물」은, 복수(2개 이상)의 이용 가능한 하이드록시기를 함유하는 분자이다. 1개의 「폴리술피드 화합물」은, 복수(2개 이상)의 이용 가능한 티오기를 함유하는 분자이다. 1개의 「폴리아민 화합물」은, 복수(2개 이상)의 이용 가능한 아민기를 함유하는 분자이다. 폴리머 분지수에 의해, 폴리하이드록시 화합물, 폴리아민 화합물 또는 폴리술피드 화합물의 모체(POLY 공유 결합의 연결 전)는, 전형적으로 하이드록시기, 티오기 또는 아민기를 3∼25 개 가지고, 보다 바람직하게는 하이드록시기, 티오기 또는 아민기를 3∼10 개 가지고, 가장 바람직하게는 POLY 공유 결합과의 연결에 바람직한 하이드록시기, 티오기 또는 아민기를 3∼ 약 8개(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8) 가진다.
폴리하이드록시 화합물 또는 폴리아민 화합물 중심의 모체는, 폴리머와 작용하기 전에, 전형적으로는, 구조식 R-(OH)p 또는 R-(NH2)p를 1개 가진다. 구조식(I) 중, p값은 q값에 대응하는 것이다. 그 이유는, 모체 유기 분자 중의 각 기능성 기, 전형적으로는 -OH 및 -NH2는, 위치가 영향을 받기 쉬우며, 또는 반응이 발생하기 쉬운 경우, 폴리머 분지의 POLY 공유결 합에 연결되기 때문이다. 구조식(I) 중, POLY에 연결한 후, R 모체의 폴리하이드록시 화합물의 하이드록시기는 모두 1개의 폴리머 분지로 변화하며, 상기 R은 연결 후의 잔기이다. 예를 들면, 유기 중심 분자가 펜타에리트리톨로부터 유도된 경우, 폴리하이드록시 화합물의 모체는, 구조식 C(CH2OH)4를 가지고, 유기 중심기 R은 하기로 표시된다.
[화학식 6]
Figure pct00006
폴리머의 중심으로서 바람직한 예시적인 폴리하이드록시 화합물은, 예를 들면, 에틸렌글리콜, 알칸디올, 하이드로카르빌글리콜, 알킬렌하이드로카르빌글리콜, 하이드로카르빌시클로알킬글리콜, 1,5-나프틸렌글리콜, 4,8-비스(하이드록시메틸)트리시클로데칸, 시클로알킬렌글리콜, 디하이드록시알칸, 트리하이드록시알칸, 테트라하이드록시알칸 등의 1∼10 개의 탄소 원자 및 1∼10 개의 하이드록시기를 가지는 지방족 폴리하이드록시 화합물이 있다. 지환식 폴리하이드록시 화합물은, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 크실리톨, 류코시드, 트레이톨, 아라비톨, 에리트리톨, 헥사헥산올, 리보오스, 아라비노오스, 크실로오스, 릭소오스, 람노오스, 갈락토오스, 글루코오스, 프룩토오스, 소르보오스, 만노오스, 피라노오스, 알트로오스, 탈로오스, 타가토오스, 피라노시드, 수크로오스, 락토오스, 말토오스 등의 직쇄형 또는 폐환식의 당류 및 당 알코올이 있다. 또한, 카테콜, 하이드로카르빌카테콜, 피로갈롤, 플로로글루신페놀, 1,2,4-벤젠트리올, 레조르신, 하이드로카르빌레조르신, 디하이드로카르빌레조르신, 오르시놀 일수화물, 올리브 페놀, 하이드로퀴논, 하이드로카르빌하이드로퀴논, 페닐하이드로퀴논 등의 방향족 폴리하이드록시 화합물을 사용할 수도 있다. 그 외에 사용할 수 있는 폴리하이드록실 화합물 중심은, 크라운 에테르, 시클로덱스트린, 덱스트린, 또는 다른 탄수화물을 포함할 수 있다.
구조식(I) 중, q는, 대응하는 「R」에 연결되어 있는 폴리머 분지의 개수를 나타내고, 구체적으로 3∼20이라도 된다. 전형적으로, 「q」의 구체적인 수치가 3, 4, 5, 6, 7, 8이다. 구체적으로, 「R」을 중심으로 하여 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의 폴리머 지쇄로 분지된다.
일부 실시형태에 있어서, 「R」은 3개의 폴리머 분지를 가지고, 「R」은 바람직하게는,
[화학식 7]
Figure pct00007
이다.
일부 실시형태에 있어서, 「R」은 4개의 폴리머 분지를 가지고, 「R」은 바람직하게는,
[화학식 8]
Figure pct00008
이다.
일부 실시형태에 있어서, 「R」은 6개의 폴리머 분지를 가지고, 「R」은 바람직하게는,
[화학식 9]
Figure pct00009
이다.
일부 실시형태에 있어서, 「R」은 8개의 폴리머 분지를 가지고, 「R」은 바람직하게는,
[화학식 10]
Figure pct00010
이다.
폴리머, 「POLY」
구조식(I) 중, 「POLY」는 폴리머이며, X와 함께 되어 폴리머 분지를 구성한다. 각 폴리머 분지에서의 POLY는 독립적으로 선택되는 것이며, 바람직하게는 각 폴리머는 동일한 폴리머이며, 보다 바람직하게는 각 구조식(I) 중의 폴리머 분지는 동일하다. 바람직한 폴리머는 수용성이며, 임의의 수용성 폴리머를 본 발명의 콘쥬게이트의 형성에 사용할 수 있다. 본 발명에서 말하는 폴리머는, 임의의 기하학적 형태 또는 형상이라도 된다. 대표적인 폴리머는, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리비닐프로리돈, 폴리(하이드록시알킬메타크릴산 아민), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리사카라이드, 폴리(α-하이드록시산), 폴리아크릴산, 폴리아세트산 비닐, 폴리포스파진, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린) 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
전형적인 화합물로서는, 「POLY」는 폴리에틸렌글리콜이며, 직쇄, 분지, 포크형 등의 임의의 기하학적 형태 또는 형상이라도 된다. 보다 바람직하게는, 「POLY」는 선형 폴리에틸렌글리콜이다. 전형적인 구조는,
[화학식 11]
Figure pct00011
이며, 「
Figure pct00012
」은, 원자의 결합점을 나타내고, 별(*) 표시된 산소 원자는, 유기 중심 「R」과 결합하는 원자이다. 다만, n의 수치 범위는 약 5∼500이며, 가장 바람직하게는 50∼200이며, 바람직하게는 113으로 한다. 평균 분자량는 약 1k∼60kDa아다.
이 분야의 기술자는, 고분자 분야에서는, n이 상기 폴리머의 중합도, 즉, 폴리머의 고분자쇄에 포함되는 반복 단위수의 평균값을 나타내고, 상기 폴리머의 분자량에 의해 결정되며, 예를 들면, n이 113일 때, 평균값이 113을 의미하는 것으로 이해할 수 있을 것이다.
상기 폴리에틸렌글리콜 구조는 통상, 일부의 말단 부분 잔기를 더욱 함유하고, POLY의 말단기에 유사하도록, H, NH2, OH, CO2H, C1-6 알킬기(예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기), C1-6 알콕시기(예를 들면, 메톡시기, 에톡시기), 아실기, 또는 아릴기를 말단으로 할 수 있다. 예를 들면, POLY는,
[화학식 12]
Figure pct00013
라도 된다.
통상의 시판 멀티 암 폴리에틸렌글리콜는, 이와 같은 말단 부분을 가지고, POLY와 X가 폴리머 분지에 연결되었을 때, 예를 들면, 하이드록시기 등의 말단 부분기가 반응하여, 상기 말단 부분 잔기의 형으로 나타난다.
상기 폴리머는 고분지의 폴리머이라도 된다. 전형적인 구조는, 덴드리머(Dendrimer)이다. 이와 같은 폴리머는, 모든 결합이 중앙 수속점 또는 코어로부터 직경 방향으로 연장되고, 분지가 규칙적이며, 또한 각각 이 분지점이 되는 반복 단위를 가지는 구형의 사이즈 단분산(單分散) 폴리머이다. 덴드리머는, 다른 종류의 폴리머에는 관찰되지 않는 독자적인 특성을 주는, 코어 캡슐화 등의 특정한 수상(樹狀) 특성을 나타낸다.
POLY는, 수상(Dendrimer)의 폴리에틸렌글리콜 결합 암이라도 되며, 전형적인 구조는 하기와 같다.
[화학식 13]
Figure pct00014
「
Figure pct00015
」은, 동일하게 수상으로 확산되어 있는 것을 나타낸다.
폴리머 분지의 조성 부분, X
구조식(I) 중, 「X」는 「POLY」와 함께 되어 폴리머 분지를 구성한다. X로서는, 이하의 4개의 형태를 예로 들 수 있다.
① X는, 그 말단에, 비교적 비반응성의 기, 또는 미반응의 기를 1개 가지는 것이다. 이 경우에, 「X」는 아무런 활성제도 포함하지 않고, 반응하기 어려운 기이다. 통상은 알콕시기(-OQ)이며, 단, Q가 통상 탄소수 1∼20의, 가장 바람직하게는 C1-6의 저급 알킬기 또는 페닐기와 같은 유기기이다. 「X」는, 포화 또는 불포화라도 되고, 아릴기, 헤테로 아릴기, 환형 화합물, 헤테로환식 화합물 및 이들 중 어느 하나의 치환형을 포함한다.
② X는, (L)-(T)n'로 표시된다. L은 다가 링커를 나타내고, T는 표적 분자를 나타내고, n'는 1 이상의 정수를 나타낸다. 링커 L은, 서로 공유 결합한 복수의 링커를 포함하고 있어도 된다. 예를 들면, 다가 링커 L은, 1개 이상의 스페이서 링커Ls 및/또는 난분해성 링커 Ln을 함유하고, 서로 접속시킬 수 있다. 난분해성 링커 Ln은 T에 접속된다. 이들 상이한 링커를 선택하고, 임의의 순서로 배열하여, 다가 링커 L을 구축할 수 있다. 예를 들면, 다가 링커 L은, 이하의 1개 이상의 2가 링커로부터 구축될 수 있다.
[화학식 14]
Figure pct00016
식 중, a 및 b는 정수, 예를 들면, 0∼5의 정수이다. 몇 개의 Ls를, 직쇄, 분지, 말단 분지 등에 연결할 수 있다. Ls는 존재하지 않아도 되고, Ln에 의해 POLY와 T를 직접적으로 연결해도 된다.
다가 링커에 의해 POLY와 T를 다양한 구조 배치로 연결할 수 있으며, 하기 예시적인 일반식을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 것은 이해할 수 있을 것이다.
[화학식 15]
Figure pct00017
[화학식 16]
Figure pct00018
[화학식 17]
Figure pct00019
[화학식 18]
Figure pct00020
[화학식 19]
Figure pct00021
[화학식 20]
Figure pct00022
[화학식 21]
Figure pct00023
[화학식 22]
Figure pct00024
[화학식 23]
Figure pct00025
식 중, Ls1, Ls2, Ls3, Ls4는 각각 스페이서 링커이며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. Ln1, Ln2, Ln3, Ln4는 각각 난분해성 링커이며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. T1, T2, T3는 각각 표적 분자이며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있고, 더욱 바람직하게는 T1, T2, T3는 동일한 표적 분자이다.
③ X는 (L)-(D)n'로 표시된다. L은 다가 링커를 나타내고, D는 활성제를 나타내고, n'는 1 이상의 정수를 나타낸다. 다가 링커 L은, 서로 공유 결합한 복수의 링커를 포함해도 된다. 예를 들면, 다가 링커 L은, 1개 이상의 스페이서 링커Ls, 및/또는 분리 가능한 링커 Lr을 함유하고, 서로 연결할 수 있다. 분리 능한 링커 r은 D에 연결된다. 이들 상이한 링커를 선택하고, 임의의 순서로 배열하여, 다가 링커 L을 구축할 수 있다. 예를 들면, 다가 링커 L은, 이하의 1개 이상의 2가 링커로부터 구축될 수 있다.
[화학식 24]
Figure pct00026
식 중, a 및 b는 정수, 예를 들면, 0∼5의 정수이다. 복수의 Ls를, 직쇄, 분지, 말단 분지 등에 연결할 수 있다. Ls는 존재하지 않아도 되며, Lr에 의해 POLY와 D를 직접적으로 연결해도 된다.
다가 링커에 의해 POLY와 D를 다양한 구조 배치로 연결할 수 있고, 하기 예시적인 일반식으로 나타내는 구조를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 것은 이해할 수 있을 것이다.
[화학식 25]
Figure pct00027
[화학식 26]
Figure pct00028
[화학식 27]
Figure pct00029
[화학식 28]
Figure pct00030
[화학식 29]
Figure pct00031
[화학식 30]
Figure pct00032
[화학식 31]
Figure pct00033
[화학식 32]
Figure pct00034
[화학식 33]
Figure pct00035
식 중, Ls1, Ls2, Ls3, Ls4는 각각 스페이서 링커이며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. Lr1, Lr2, Lr3, Lr4는 각각 분리 가능한 링커이며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. D1, D2, D3는 각각 활성제이며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있고, 보다 바람직하게는 D1, D2, D3는 동일한 활성제이다.
④ X는 다가 링커 L, 표적 분자 T, 활성제 D로 이루어진다. 이 형태는 본 발명의 가장 바람직한 형태이다.
이 형태에서는, X는 (T)n'-(L)-(D)n'로 표시된다. L은 다가 링커를 나타내고, D는 활성제를 나타내고, n'는 1 이상의 정수를 나타낸다. 다가 링커 L은, 서로 공유 결합한 복수의 링커를 포함하고 있어도 된다. 예를 들면, 다가 링커 L은, 1개 이상의 스페이서 링커 Ls, 난분해성 링커 Ln, 분리 가능한 링커 Lr을 함유하고, 서로 연결할 수 있다. 난분해성 링커 Ln은 T에 연결되고, 분리 가능한 링커 Lr은 D에 연결된다. 이들 상이한 링커를 선택하고, 임의의 순서로 배열할 수 있다. 복수의 Ls를, 직쇄, 분지, 말단 분지 등에 연결할 수 있다. Ls는 존재하지 않아도 되고, POLY는 Ln 또는 Lr에 의해 T 및 D와 직접적으로 연결해도 된다.
다가 링커에 의해 POLY, T 및 D를 다양한 구조 배치로 연결할 수 있으며, 하기 예시적인 일반식을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 것은 이해할 수 있을 것이다.
[화학식 34]
Figure pct00036
[화학식 35]
Figure pct00037
[화학식 36]
Figure pct00038
[화학식 37]
Figure pct00039
[화학식 38]
Figure pct00040
[화학식 39]
Figure pct00041
[화학식 40]
Figure pct00042
[화학식 41]
Figure pct00043
[화학식 42]
Figure pct00044
식 중, Ls1, Ls2는 각각 스페이서 링커이며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. Lr1, Lr2는 각각 분리 가능한 링커이며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. D1, D2는 각각 활성제이며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있고, 보다 바람직하게는 D1, D2는 동일한 활성제이다. T1, T2는 각각 표적 분자이며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있고, 보다 바람직하게는 T1, T2는 동일한 표적 분자이다. X는, 표적 분자 T를 1∼30 개 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 표적 분자 T를 1∼5 개 포함한다. 또한, 활성제 D를 1∼30 개 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 활성제 D를 1∼5 개 포함한다. T와 D의 개수비는 1∼5:5∼1, 예를 들면, 1:1, 1:2, 1:3, 2:1, 3:1 등이라도 되고, 보다 바람직하게는 T와 D의 개수비는 1:1이다.
이상의 다가 링커에 의해 POLY, T 및 D를 연결하는 형태 중, 가장 바람직한 형태는,
[화학식 43]
Figure pct00045
이다.
이 형태에서는, T와 D의 개수비는 1:1이다.
즉, 본 발명의 가장 바람직한 약물 콘쥬게이트는 하기 식으로 표시된다.
[화학식 44]
Figure pct00046
이하, 가장 바람직한 형태인 식(III)을 예로서, 본 발명의 약물 콘쥬게이트를 상세하게 설명한다.
식(III) 중, Ls, Ln, Lr이 서로 연결하여 다가 링커 L을 형성하고, 예를 들면, 다가 3-티오 또는 3-디티오아릴알콕시카르보닐, 3-티오 또는 3-디티오아릴알킬아미노카르보닐, 다가 3-티오또는 3-디티오알콕시카르보닐 또는 다가 3-티오 또는 3-디티오알킬아미노카르보닐 등이 된다. L과 D는 절단 가능한 결합을 형성하고, L과 T는 가수 분해에 대하여 비교적 안정한 화학적 결합을 형성한다.
이하는 전형적인 다가 링커 L이다.
[화학식 45]
Figure pct00047
[화학식 46]
Figure pct00048
[화학식 47]
Figure pct00049
[화학식 48]
Figure pct00050
[화학식 49]
Figure pct00051
식 중, 기호 「*」는, 다가 링커 L과 표적 분자 T와의 결합점을 나타내고, 「#」은, 다가 링커 L과 활성제 D와의 결합점을 나타내고, 「%」는, 다가 링커 L과 POLY와의 결합점을 나타낸다. m, m'는 각각 1∼20의 임의의 정수이며, l, k는 각각 1∼10의 임의의 정수이다.
그리고, 상기 전형적인 다가 링커에서의 「난분해성 링커」 중, 가수 분해하기 어려운 S-C 결합은, 표적 분자 T와 난분해성 링커 공유 결합이 반응하여 이루어지는 것이며, 전형적인 화합물에서는, 원자 S는 표적 분자 T에 유래한다.
이상의 예시는, 「난분해성 링커」의 전형적인 예에 지나지 않으며, 본 발명의 화합물에서의 난분해성 링커의 선택은 이들로 한정되지 않는다.
이상의 예시는, 「L」의 전형적인 예에 지나지 않으며, 본 발명의 화합물에서의 「L」의 선택은 이들로 한정되지 않는다. 일부 바람직한 실시형태에서는, 「L」은,
[화학식 50]
Figure pct00052
이다.
본 발명에서 일컫는 스페이서 링커 Ls는, 분리 가능한 링커 Lr과 난분해성 링커 Ln을 서로 연결하기 위한 일련의 원자이며, 또한 POLY와의 연결에 사용된다.
하나의 실시형태에서는, 다가 링커 L은, 적어도 1개의, 아미노산으로 이루어지는 펩티드 펩티드 스페이서 링커를 함유한다. 상기 아미노산은, 독립적으로 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로부터 선택된다. 또 하나의 실시형태에서는, 상기 다가 링커 L은, 1∼40 개의 아미노산을 포함하여 이루어지는 펩티드 스페이서 링커를 함유한다. 상기 아미노산은 천연 아미노산인 것이 바람직하다. 또한, 상기다가 링커 L은, 1∼20 개의 아미노산을 포함하여 이루어지는 펩티드 스페이서 링커를 함유하고, 또한 상기 L은, 바람직하게는 10∼15 개의 아미노산을 포함하여 이루어지는 펩티드 스페이서 링커를 함유한다. 또한, L은, 아스파라긴산, 아르기닌, 글리신, 오르니틴, 시스테인, 라이신, 아스파라긴, 아르기닌, 트레오닌, 글루타민산, 세린, 시트룰린, 발린 및 글루타민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산을 함유한다.
또한, 상기 L은, 바람직하게는 1개 또는 복수 개의, 아스파라긴산, 아르기닌, 글리신, 오르니틴, 시스테인, 시트룰린, 발린 및 라이신 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어지는, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 및 도데카펩티드의 스페이서 링커를 함유한다.
본 명세서에서 기재하는 「분리 가능한 링커」는, 절단 가능한 링커라고도 불리우고 있고, 적어도 하나의 생리학적 조건 하에서 절단 가능한 결합(예를 들면, pH 불안정, 산불안정, 산화하기 쉬운 또는 효소 불안정한 결합)을 함유하는 링커를 나타낸다. 결합의 절단을 초래하는 이와 같은 생리학적 조건은, 예를 들면, 생리적 pH에서 발생하는 표준 화학 가수 분해 반응, 또는 세포 소기관, 예를 들면, 세포질 pH보다 낮은 pH를 가지는 엔도솜으로 구획화된 것에 기인하고, 생체 내의 단백질 가수 분해 효소, 에스테라제, 콜린에스테라아제, 포스포모노에스테라제, 뉴클레아제, 술파타아제 등에 의한 가수 분해를 포함한다.
본 명세서에서 기재하는 절단 가능한 결합은, 단독으로 분리 가능한 링커에 존재하는 것이 아니며, 분리 가능한 링커와 활성제 D가 공유 결합한 후의 결합 부분이며, 절단 가능한 결합은, 분리 가능한 링커와 활성제 D의 인접하는 원자를 연결하고, 결합의 절단 후에, 분리 가능한 링커는 2개 또는 복수 개의 단편으로 절단되고, 절단 가능한 결합의 절단 후, 활성제 D가 방출되고, 모체로부터 분리하고, 생리 활성을 발휘하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 기재하는 활성제 D는, 분리 가능한 링커와 공유 결합하여 1개의 절단 가능한 결합을 형성하기에 적합한 활성제를 포함하는 부분인 것으로 이해되어야 한다. 이에 따라, 절단 가능한 결합이 절단된 경우, 활성제 D는 개량되어 있지 않으며, 즉, 공유 결합에 형성되어 있지 않은 형태로 방출된다. D의 선택, 및 콘쥬게이트로 분리 가능한 링커와 절단 가능한 결합을 형성하는 것에 대하여, 이하에 상세하게 설명한다.
절단 가능한 결합은, 생리적 조건 하에서 물과 반응(즉, 가수 분해)할 수 있는 비교적 약한 1개의 결합이다. 1개의 결합이 수중에서 가수 분해하는 경향은, 2개의 중심 원자의 연결 종류뿐인 것으로 정할 수 있는 것이 아니며, 이 중심 원자에 연결된 치환기와도 관계가 있다. 전형적인 가수 분해에 불안정한 연결기는, 카르복시산 에스테르, 인산 에스테르, 무수 화합물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬에스테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 등을 포함한다.
본 명세서에서 기재하는 활성제 「D」는, 비변성 모체 활성제의 일부 또는 약물과, 본 발명의 다가 링커가 공유 결합하여 생성하는 공유 결합쇄(혹 그 활성화 또는 화학 변성의 형태)의 전의 미변성 모체 활성제의 잔기이다. 활성제 부분과 다가 링커의 사이의 연결기가 가수 분해 또는 효소 분해되었을 때, 활성제 자체는 방출된.
본 발명의 목적에 의하면, 기술 용어 「잔기」는, 화합물의 일부이며, 또한 하나의 화합물과 치환 반응한 후의 잔류물인 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 기재하는 활성제, 활성제 「D」는, 캠토테신계 항암제이며, 캠토테신계 약물은, 임상에서 사용되는 토포이소머라아제 I 제해제이며, 고활성이면서, 수용성이 좋지 못하고, 정상 생체 조직으로의 독성 부작용이 큰 등의 결점을 가지므로, 캠토테신계 항암제의 임상 응용이 크게 제한되고 있다.
D는 하기 식으로 표시되는 캠토테신계 약물이다.
[화학식 51]
Figure pct00053
식 중, R1∼R5는 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아실기, 알킬기, 치환 알킬기, 알콕시기, 치환 알콕시기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 하이드록시기, 시아노기, 니트로기, 아지드기, 아미드기, 히드라진, 아민기, 치환 아민기, 하이드록시카르보닐기, 알콕시카르보닐기, 알콕시카르보닐옥시기, 카르바모일옥시기, 아릴술포닐옥시기, 알킬술포닐옥시기 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, R6는, H 또는 OR8이며, R8은, 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 할로겐화 알킬기, 또는 하이드록시알킬기이며, R7은, 분리 가능한 링커의 공유 결합에 연결하는 위치이며, 바람직하게는 하이드록시기이다.
본 명세서에 적합한 캠토테신계 항암제에 대한 유일한 제한은, 화학 반응할 수 있는(즉, 다가 링커와 공유 결합하는) 적어도 1개의 관능기를 가지는 것, 예를 들면, 아미노기, 하이드록시기, 또는 메르캅탄이 구조식(I)의 화합물에 연결하고, 또항 본 명세서에 기재된 구조식(I)의 화합물에 커플링할 때, 생물학적 활성이 유의한 손실을 가지지 않는 것이다.
또한, 활성제 「D」는 캠토테신계 항암제이며, 바람직하게는 이리노테칸, SN-38, 10-하이드록시캠토테신, 루비테칸이다.
그 중, 이리노테칸의 구조는 하기와 같다.
[화학식 52]
Figure pct00054
SN-38의 구조는 하기와 같다.
[화학식 53]
Figure pct00055
10-하이드록시캠토테신의 구조는 하기와 같다.
[화학식 54]
Figure pct00056
루비테칸의 구조는 하기와 같다.
[화학식 55]
Figure pct00057
하이드록시기는, 분리 가능한 링커와 절단 가능한 에스테르 결합을 형성할 수 있다.
본 명세서에서 기재하는 「난분해성 링커」와는, 적어도 1개의 생리학적 조건 하에서, 가수 분해에 대하여 비교적 안정한 화학적 결합, 특히 공유 결합을 가지고, 즉 생리학적 조건 하에서 장기간에 걸쳐서도 현저한 가수 분해가 일체 발생하지 않는 것을 지칭한다. 가수 분해에 안정적인 연결기의 실례는, 탄소-탄소 결합(예를 들면, 지방쇄 중), 탄소-유황 결합, 디술피드 결합, 에스테르 결합, 아미드 결합, 폴리우레탄 및 그의 유사물 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 통상, 가수 분해에 안정적인 결합은, 생리학적 조건 하에서의 가수 분해 속도가 약 1∼2 % 미만이다.
본 발명에서는, 「T」는 표적 분자이며, 의약 용도를 가질 수도 있고 가지지 않을 수도 있다. 상기 표적 분자의 작용은, 상기 콘쥬게이트의 목표 조직에서의 농도를 더욱 높이고, 생리 활성 또는 의약 용도를 향상시키도록, 표적 지향성을 향상시키는 것이다. 「T」는 단기능 표적 분자라도 되고, 다기능 표적 분자라도 된다. 또한, 「T」는, 또한 2개 이상의 표적 분자로 이루어지는 표적 부분이라도 된다. 일부 구체적인 실시형태에 있어서, 「T」는, 「아르기닌-글리신-아스파라긴산」 서열을 포함하는 RGD 펩티드라도 된다. RGD 펩티드는, 인테그린과 그의 수용체 단백질이 상호 작용하는 인식 부위이다. 바람직한 RGD 펩티드로서, iRGD 및 cRGD 등을 예로 들 수 있다.
iRGD의 구조는 하기와 같다.
[화학식 56]
Figure pct00058
cRGD는 일련의 화합물이며, 전형적인 화합물은 하기를 포함한다.
[화학식 57]
Figure pct00059
다른 바람직한 표적 분자로서, tLyp-1, Lyp-1, RPARPAR, Angiopep2, GE11, 또는 엽산을 예로 들 수 있다.
tLyp-1의 구조는 하기와 같다.
[화학식 58]
Figure pct00060
Lyp-1의 구조는 하기와 같다.
[화학식 59]
Figure pct00061
RPARPAR의 폴리펩티드 서열은, 아르기닌-프롤린-알라닌-아르기닌-프롤린-알라닌-아르기닌이다. 그리고, 다가 링커 L과 연결할 필요가 있으므로, 제조 시에, 시스테인을 사용하여 RPARPAR를 L과 연결할 필요가 있다. 따라서, 구체적인 화합물에서는, CRPARPAR로서 나타난다.
Angiopep2의 폴리펩티드 서열은, TFFYGGSRGKRNNFKTEEY이며, 그 구조는 하기와 같다.
[화학식 60]
Figure pct00062
GE11의 폴리펩티드 서열은, YHWYGYTPQNVI이며, 그 구조는 하기와 같다.
[화학식 61]
Figure pct00063
엽산의 구조는 하기와 같다.
[화학식 62]
Figure pct00064
본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 「POLY」는, 선형 폴리에틸렌글리콜 결합 암이며, 즉 본 발명의 콘쥬게이트는, 하기 몇 개의 종류의 화합물을 포함한다.
3암:
[화학식 63]
Figure pct00065
[화학식 64]
Figure pct00066
4암:
[화학식 65]
Figure pct00067
[화학식 66]
Figure pct00068
8암:
[화학식 67]
Figure pct00069
[화학식 68]
Figure pct00070
그리고, 상기 바람직한 실시형태에 있어서, 선형 폴리에틸렌글리콜은,
[화학식 69]
Figure pct00071
이다.
그러나, 본 발명은 상기 선형 폴리에틸렌글리콜로 제한되는 경우가 없으며, 그 대신, 예를 들면, 하기 식으로 표시되는 것 외의 선형 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수도 있다.
[화학식 70]
Figure pct00072
본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, R은, 탄소수 5의
[화학식 71]
Figure pct00073
이며, 즉 본 발명의 콘쥬게이트는 하기와 같다.
[화학식 72]
Figure pct00074
식(IV)에 있어서, n은 5∼500이며, 바람직하게는 5∼500이며, 가장 바람직하게는 113이다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 콘쥬게이트의 표적 부분 「T」는, iRGD, tLyp-1, Lyp-1, RPARPAR, cRGD, Angiopep2, GE11, 또는 엽산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이며, 활성제 「D」는, 이리노테칸, SN-38, 10-하이드록시캠토테신, 루비테칸으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이다.
본 발명의 콘쥬게이트의 어떠한 형상도 본 발명에 포함되어 있고, 이들 형상은 그 중의 활성제, 표적 분자 및 다양한 다가 링커의 결합 형태에 의해 결정된다. 일측면에 있어서, 본 발명의 콘쥬게이트의 전체적인 3차원 형상은 선형이다. 다른 일측면에 있어서, 본 명세서에 기재된 콘쥬게이트는, 3차원 형상이 「X」형 또는 십자형인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, R은, 탄소수 4의
[화학식 73]
Figure pct00075
이며, 즉 본 발명의 콘쥬게이트는 하기와 같다.
[화학식 74]
Figure pct00076
식(V)에 있어서, n은 5∼500이며, 바람직하게는 5∼500이며, 가장 바람직하게는 113이다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 콘쥬게이트의 표적 부분 「T」는, iRGD, tLyp-1, Lyp-1, RPARPAR, cRGD, Angiopep2, GE11, 또는 엽산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이며, 활성제 「D」는, 이리노테칸, SN-38, 10-하이드록시캠토테신, 루비테칸으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이다.
본 발명의 제3의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 콘쥬게이트는 하기와 같다.
[화학식 75]
Figure pct00077
식(V)에 있어서, n은 5∼500이며, 바람직하게는 5∼500이며, 가장 바람직하게는 113이다. 이 분야의 기술자는, 고분자 분야에서는, n이 상기 폴리머의 중합도, 즉 폴리머의 고분자쇄에 포함되는 반복 단위수의 평균값을 나타내고, 상기 폴리머의 분자량에 의해 결정되며, 예를 들면, n이 113일 때, 평균값이 113을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 콘쥬게이트의 표적 부분 「T」는, iRGD, tLyp-1, Lyp-1, RPARPAR, cRGD, Angiopep2, GE11, 또는 엽산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이며, 활성제 「D」는, 이리노테칸, SN-38, 10-하이드록시캠토테신, 루비테칸으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이다.
식(IV), 식(V), 식(VI)에 기초하여, 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 하기와 같다.
화합물 1: D는 이리노테칸이며, T는 iRGD이다.
[화학식 76]
Figure pct00078
화합물 2: D는 이리노테칸이며, T는 tLyp-1이다.
[화학식 77]
Figure pct00079
화합물 3: D는 이리노테칸이며, T는 Lyp-1이다.
[화학식 78]
Figure pct00080
화합물 4: D는 이리노테칸이며, T는 RPARPAR이다.
[화학식 79]
Figure pct00081
화합물 5: D는 이리노테칸이며, T는 cRGD이다.
[화학식 80]
Figure pct00082
화합물 6: D는 SN-38이며, T는 iRGD이다.
[화학식 81]
Figure pct00083
화합물 7: D는 SN-38이며, T는 tLyp-1이다.
[화학식 82]
Figure pct00084
화합물 8: D는 SN-38이며, T는 Lyp-1이다.
[화학식 83]
Figure pct00085
화합물 9: D는 SN-38이며, T는 RPARPAR이다.
[화학식 84]
Figure pct00086
화합물 10: D는 SN-38이며, T는 cRGD이다.
[화학식 85]
Figure pct00087
화합물 11: D는 10-하이드록시캠토테신이며, T는 iRGD이다.
[화학식 86]
Figure pct00088
화합물 12: D는 10-하이드록시캠토테신이며, T는 tLyp-1이다.
[화학식 87]
Figure pct00089
화합물 13: D는 10-하이드록시캠토테신이며, T는 Lyp-1이다.
[화학식 88]
Figure pct00090
화합물 14: D는 10-하이드록시캠토테신이며, T는 RPARPAR이다.
[화학식 89]
Figure pct00091
화합물 15: D는 10-하이드록시캠토테신이며, T는 cRGD이다.
[화학식 90]
Figure pct00092
화합물 16: D는 루비테칸이며, T는 iRGD이다.
[화학식 91]
Figure pct00093
화합물 17: D는 루비테칸이며, T는 tLyp-1이다.
[화학식 92]
Figure pct00094
화합물 18: D는 루비테칸이며, T는 Lyp-1이다.
[화학식 93]
Figure pct00095
화합물 19: D는 루비테칸이며, T는 RPARPAR이다.
[화학식 94]
Figure pct00096
화합물 20: D는 루비테칸이며, T는 cRGD이다.
[화학식 95]
Figure pct00097
화합물 21:
[화학식 96]
Figure pct00098
화합물 22:
[화학식 97]
Figure pct00099
화합물 23:
[화학식 98]
Figure pct00100
식 중, R은,
[화학식 99]
Figure pct00101
이다.
화합물 24:
[화학식 100]
Figure pct00102
식 중, R은,
[화학식 101]
Figure pct00103
이다.
화합물 25:
[화학식 102]
Figure pct00104
식 중, R은,
[화학식 103]
Figure pct00105
이다.
화합물 26:
[화학식 104]
Figure pct00106
식 중, R은,
[화학식 105]
Figure pct00107
이다.
화합물 27:
[화학식 106]
Figure pct00108
식 중, R은,
[화학식 107]
Figure pct00109
이다.
화합물 28:
[화학식 108]
Figure pct00110
식 중, R은,
[화학식 109]
Figure pct00111
이다.
화합물 29:
[화학식 110]
Figure pct00112
식 중, R은,
[화학식 111]
Figure pct00113
이다.
화합물 30:
[화학식 112]
Figure pct00114
식 중, R은,
[화학식 113]
Figure pct00115
이다.
화합물 31:
[화학식 114]
Figure pct00116
식 중, R은,
[화학식 115]
Figure pct00117
이다.
화합물 32:
[화학식 116]
Figure pct00118
식 중, R은,
[화학식 117]
Figure pct00119
이다.
화합물 33:
[화학식 118]
Figure pct00120
식 중, R은,
[화학식 119]
Figure pct00121
이다.
화합물 34:
[화학식 120]
Figure pct00122
식 중, R은,
[화학식 121]
Figure pct00123
이다.
화합물 35:
[화학식 122]
Figure pct00124
식 중, R은,
[화학식 123]
Figure pct00125
이다.
화합물 36:
[화학식 124]
Figure pct00126
식 중, R은,
[화학식 125]
Figure pct00127
이다.
화합물 37:
[화학식 126]
Figure pct00128
식 중, R은,
[화학식 127]
Figure pct00129
이다.
화합물 38:
[화학식 128]
Figure pct00130
식 중, R은,
[화학식 129]
Figure pct00131
이다.
화합물 39:
[화학식 130]
Figure pct00132
식 중, R은,
[화학식 131]
Figure pct00133
이다.
화합물 40:
[화학식 132]
Figure pct00134
식 중, R은,
[화학식 133]
Figure pct00135
이다.
화합물 41:
[화학식 134]
Figure pct00136
식 중, R은,
[화학식 135]
Figure pct00137
이다.
화합물 42:
[화학식 136]
Figure pct00138
식 중, R은,
[화학식 137]
Figure pct00139
이다.
화합물 1을 예로서, 본 발명에 대하여 더욱 설명한다.
화합물 1에서는, R은, 탄소수 5의
[화학식 138]
Figure pct00140
이며, POLY는,
[화학식 139]
Figure pct00141
이며, POLY와 R이 함께 되어 하기 활성제의 담체를 구성하고 있다.
[화학식 140]
Figure pct00142
다가 링커 L이 T, D와 연결된 후, 하기와 같이 된다.
[화학식 141]
Figure pct00143
「
Figure pct00144
」에서의 에스테르결합은, 본 발명의 상기 분리 가능한 링커와 활성제 D가 공유 결합하여 형성한 절단 가능한 결합이다. 본 발명의 콘쥬게이트가 표적 세포에 도달한 후, 절단 가능한 결합이 생리학적 조건 하에서 가수 분해 또는 효소 분해되고, 그 후, 콘쥬게이트로부터 활성제 이리노테칸이 방출되고, 이리노테칸이 표적 세포중에서 항암 작용을 발휘한다.
「
Figure pct00145
」에서의 탄소 유황 결합은, 본 발명의 상기 난분해성 링커와 표적 분자 T가 형성하고, 생리학적 조건 하에서 가수 분해에 대하여 비교적 안정한 화학적 결합이며, 그중, 원자 S는 iRGD에 유래하는 것이다. 표적 분자의 표적 지향성에 의해, 본 발명의 콘쥬게이트는 특정한 표적 세포에 도달할 수 있으면서, 표적 분자와 모체가 분리하기 어렵다.
「
Figure pct00146
」은 POLY와의 연결을 의미한다.
다른 일측면에 있어서, 본 발명은 상기콘쥬게이트의 제조 방법을 제공한다. 이와 같은 방법에서는, 하이드록시기 함유 활성제 D는 먼저, 아미노산 또는 아미노산으로 형성된 펩티드와 반응하고, 분리 가능한 링커를 형성한다. 활성제 D의 하이드록시기와 아미노산의 카르복실기는, 절단 가능한 결합-에스테르 결합을 형성한다. 난분해성 링커는, 스페이서 링커와 함께 되어 다가 링커의 나머지 부분을 형성한다. 상기 나머지 부분은, 반응 가능한 카르복실기를 함유하고, 분리 가능한 링커의 아미노기와 반응하고, D-L 부분을 형성한다.
POLY 및 유기 중심 R으로 구성되는 활성제 담체의 제조: POLY 및 유기 중심 R은 실질적으로, 멀티 암 폴리머, 즉
[화학식 142]
Figure pct00147
를 형성하고 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기 멀티 암 폴리머는 멀티 암 폴리에틸렌글리콜이며, 시판 중인 원재료로부터 얻을 수 있고, 예를 들면, 북경 건개(鍵凱) 과기(科技) 유한회사에서 다양한 종류의 4암, 8암 폴리에틸렌글리콜 유도체를 구입할 수 있다. 시판하고 있는 이들 멀티 암 PEG는, 상기 D-L 부분과 직접적으로 반응할 수 있다.
예를 들면, 식(IV)의 콘쥬게이트를 제조할 때, 사용 가능한 4암 폴리에틸렌글리콜은 하기와 같다.
[화학식 143]
Figure pct00148
이 바람직한 4암 폴리에틸렌글리콜은, 4armPEG20K-SCM으로 불리우고 있으며, 그 분자량이 약 20kDa이다.
식(V)의 콘쥬게이트를 제조할 때, 사용 가능한 3암 폴리에틸렌글리콜은 하기와 같다.
[화학식 144]
Figure pct00149
이 바람직한 3암 폴리에틸렌글리콜은, 3armPEG20K-SCM으로 불리우고 있다.
식(VI)의 콘쥬게이트를 제조할 때, 사용 가능한 8암 폴리에틸렌글리콜은 하기와 같다.
[화학식 145]
이 바람직한 8암 폴리에틸렌글리콜은, 8armPEG20K-SCM으로 불리우고 있고, n은 113이다. 예를 들면, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 제조 방법은, 하기 스텝을 포함한다.
[화학식 146]
Figure pct00151
식 중, R은 유기 중심이며, POLY는 폴리머이며, L은 다가 링커이며, T는 표적 분자이며, D는 활성제이며, q는 3∼8이 임의의 정수이며, D는 하기 식으로 표시되는 캠토테신계 약물이다.
[화학식 147]
Figure pct00152
식 중, R1∼R5는 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아실기, 알킬기, 치환 알킬기, 알콕시기, 치환 알콕시기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 하이드록시기, 시아노기, 니트로기, 아지드기, 아미드기, 히드라진, 아민기, 치환 아민기, 하이드록시카르보닐기, 알콕시카르보닐기, 알콕시카르보닐옥시기, 카르바모일옥시기, 아릴술포닐옥시기, 알킬술포닐옥시기로부터 선택되고, R6는, H 또는 OR8이며, R8은, 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 할로겐화 알킬기또는 하이드록시알킬이며, R7은, 하이드록시기이다.
(1) 활성제 D와 다가 링커 L을 연결하여, D-L 부분을 얻는다.
(2) D-L 부분과 멀티 암 폴리머인
[화학식 148]
Figure pct00153
를 연결하여,
[화학식 149]
Figure pct00154
를 얻는다.
(3) 상기에서 얻어진
[화학식 150]
Figure pct00155
와 표적 분자 T를 연결한다.
상기한 제조 방법에 의하면, 바람직하게는, D는 이리노테칸, SN-38, 10-하이드록시캠토테신, 또는 루비테칸이다.
멀티 암 폴리머인
[화학식 151]
Figure pct00156
는, 3armPEG20K-SCM, 4armPEG20K-SCM, 또는 8armPEG20K-SCM이며,
L은,
[화학식 152]
Figure pct00157
이며(기호 「*」는, 다가 링커 L과 표적 분자 T와의 결합점을 나타내고, 「#」은, 다가 링커 L과 활성제 D와의 결합점을 나타내고, 「%」는, 다가 링커 L과 POLY와의 결합점을 나타낸다.),
T는, iRGD, cRGD, tLyp-1, Lyp-1, RPARPAR, Angiopep2, GE11, 또는 엽산이다.
필요에 따라, 본 발명의 멀티 암 폴리에틸렌글리콜의 제조는, 합성에 의해 행할 수도 있다. 예를 들면, 임의의 일정한 수의 적절한 폴리올 코어 재료는 모두 화학품 공급자(supplier)로부터 구입할 수 있다. 폴리올 상의 말단 하이드록시기는 먼저, 이들의 음이온형으로 변환된다. 예를 들면, 강염기로 중합 반응을 여기(勵起)하는 것에 적합한 염기를 제공하고, 이어서, 단일 분자(예를 들면, 에틸렌옥시드)가 중심 상에서 직접적으로 중합한다. 쇄의 형성은, 각 분지가 모두 소정 길이가 될 때까지 계속하고, 그 후, 예를 들면, 퀀칭의 방법에 의해 반응을 종료시킨다.
혹은, 본 발명의 멀티 암 폴리에틸렌글리콜는, 하기 방법에 의해 합성하여 제조될 수도 있다. 먼저, 1개의 필요한 폴리올 코어 재료를 준비하고, 다음으로, 폴리올을 적절한 조건 하에서 적절한 길이를 가지는 헤테로 2관능성 PEG와 메실화 반응시킨다. 그중, 비메실화 PEG는, 폴리올과 반응시키지 않도록, 선택적으로 보호된다.
본 발명에서 제공하는, 활성제 담체로서 바람직한 멀티 암 폴리에틸렌글리콜은 특히, 1개의 말단 관능기, 예를 들면, N-숙신이미드카보네이트(US5281698, US5468478을 참조), 숙신이미드프로피오네이트 및 숙신이미드부티레이트(US5672662를 참조), 숙신산 숙신이미드, 숙신이미드에스테르(US5650234를 참조) 등을 함유한다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 콘쥬게이트 담체(R 및 POLY로 이루어짐)는, 적어도 1개의 표적 분자 및 1개의 활성제와 연결한다. 보다 전형적 및 바람직한 화합물에서는, 고담지 능력을 확보하기 위하여, 본 발명의 콘쥬게이트 담체는 적어도, 3개의 표적 분자 및 3개의 활성제와 연결하고, 바람직하게는 적어도 4개의 표적 분자 및 4개의 활성제와 연결한다.
본 발명의 콘쥬게이트는 전형적인 약물 전구체이며, 가수 분해 작용 또는 효소 분해 작용에 의해, 활성제 D가 방출되고, 모체로부터 분리되어, 생리 활성을 발휘한다.
본 발명의 콘쥬게이트는 고담지 능력을 나타내므로, 총투여량을 저감하여, 예를 들면, 암 등의 특수한 질환을 치료할 수 있다. 즉, 본 발명의 콘쥬게이트 활성제 담체는, 복수 종류의 활성제 분자와 공유 결합에 의해 연결할 수 있고, 일정량의 콘쥬게이트당, 보다 많은 양의 치료제형(즉, 활성제 부분)을 투여하는 것이 허용된다. 본 발명의 콘쥬게이트는, 수용성 폴리머의 수식이 의해, 실질적으로 친수성이 되며, 특히 활성제가 수난용성(水難溶性) 약물인 경우, 콘쥬게이트의 바이오 어베일러빌리티를 향상시킬 수 있다.
커플링되어 있지 않은 약물에 비해, 본 발명의 콘쥬게이트는 보다 강한 작용을 나타내고, 인간 또는 다른 동물의 체내 조직에 풍부하게 존재한다.
본 발명에서의 콘쥬게이트 약물 전구체는, 특히 활성제가 하나의 항암 화합물인 경우, 여러가지 독특한 성질을 가진다. 이와 같은 약물 전구체는, 종양의 증식을 보다 고효율로 억제할 수 있다. 사용하는 이와 같은 소분자는, 항암 특성을 가지는 것으로 알려져 있는 소분자이다. 그러나, 상기한 바와 같이 다분지 폴리머와의 결합에 의해, 그 치료 효과 및 약물 대사 동태학은 상기 소분자(예를 들면, 항암 화합물 자체)에 비해, 크게 개량되었다. 대상이 될 수 있는 고형 종양의 종류로서는, 결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 위암, 글리오마 및 유방, 난소, 결장, 신장, 담관, 폐 및 뇌의 악성 육종, 암 및 림프종을 예로 들 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명은, 1개의 멀티 암 폴리머로 수식된 표적 항암 콘쥬게이트에 관한 것이며, 그 중, 수용성 폴리머에 의한 수식은, 상기 콘쥬게이트의 수용성을 높임으로써 약물 담지량을 높일 수 있고, 표적 분자는 표적 지향성을 높이고, 상기 콘쥬게이트의 목표 조직에서의 농도를 더욱 높이고, L은, 임의의 연결 링커이며, 그 작용이 표적 분자와 항암 약물을 연결한 후, 표적 분자, 항암 약물 및 폴리머 암을 더욱 연결하여, 콘쥬게이트를 1개로 한다.
본 발명의 화합물 1∼42의 약학적으로 허용되는 염은, 바람직하게는 염산염이며, 약화학 분야의 일반 수단에 의해 염을 형성할 수 있고, 또한 트리플루오로 아세트산염, 황산염, 인산염, 아세트산염 등이라도 된다.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다. 그리고, 본 발명은 다양한 다른 형태로 구체화되어도 되고, 본 명세서에 기재된 실시예로 한정되어서는 안된다. 이들 실시예를 기재하는 목적은, 개시 내용을 보다 완전하면서 또한 전면적으로 하기 위해서이다. 사용한 시약 및 원료에 대하여, 제조 방법을 개시한 것 이외는 모두 시판되는 것을 입수한 것이다.
특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에서의 모든 기술 용어는, 청구의 범위에 관한 주제가 속하는 분야의 기술자에게 통상 이해되고 있는 의미와 동일하다.
특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에서의 용어는, 하기 의미이다.
DMF: N,N-디메틸포름아미드
DCM: 디클로로메탄
Boc-Gly-OH:
[화학식 153]
Figure pct00158
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
DCC: 지시클로헥실카르보디이미드
IPA: 이소프로필알코올
TFA: 트리플루오로 아세트산
TBME: tert-부틸메틸에테르
EA: 아세트산 에틸
DME: 에틸렌글리콜디메틸에테르
HOSU: N-숙신이미드카보네이트
THF: 테트라하이드로퓨란
Boc-Lys-OH:
[화학식 154]
Figure pct00159
DIEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DEPC: 시아노포스폰산 디에틸
Pbf:
[화학식 155]
Figure pct00160
HOBT: 1-하이드록시벤조트리아졸
DIC: N,N'-디이소프로필카르보디이미드
MTBE: tert-부틸메틸에테르
EDT: 1,2-에탄디티올
PBS: 인산 완충액
EDC·HCl: 1-에틸(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염
실시예 1 화합물 1의 제작
iRGD의 제작
[화학식 156]
Figure pct00161
10.0g의 Fmoc-Rink MBHA Amide Resin을 준비하고, Fmoc를 제거했다. 커플링제로서 HOBT/DIC를 사용하고, DMF를 반응 용매로 하고, 닌히드린법에 의해 반응을 모니터링하고, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH와 같은 보호된 아미노산을 순서대로 수지에 연결하고, DMF 세정 후, 트리플루오로 아세트산 탈륨(2.0eq)을 가하고 18시간 교반하고, 그 후, DMF로 세정하고, Fmoc를 제거하고, Fmoc-Cys(Trt)-OH를 축합시키고, DMF로 세정하고, Fmoc를 제거하고, 무수 아세트산 피리딘을 가하여 20min 반응시키고, DMF로 세정하고, DCM으로 세정하고, 메탄올 세정 후에 건조시키고, 개열제(開裂劑)로서 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 티오아니솔을 기하고, 빙랭한 MTBE가 침전하고, 세정하고, 조(粗)생성물을 역상 HPLC에 의한 정제, 동결 건조를 거쳐, 백색의 플록(flock)의 iRGD를 1.56g 얻었다.
L 부분의 제작
[화학식 157]
Figure pct00162
1. BP103a01의 제작
질소 분위기 하에서, 1000mL의 3구 플라스크에, 200mL의 피리딘, 120g의 1(1.0eq)을 가하고, 교반하여 0℃까지 강온(降溫)시키고, 151.8g의 TsCl(1.0eq)을 수회에 나누어 첨가하고, 1h 교반하고, 이어서, 실온까지 서서히 승온(昇溫)하고, 3∼4 h 계속해서 교반했다. 반응 종료 후에, 반응액을 빙랭한 희염산 용액에 투입하고, EA를 가하여 추출하고, EA층을 희염산으로 1회 세정하고, 포화 염화수소 나트륨으로 세정하고, 포화 식염수로 세정하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 용매를 감압 하에서 증류 제거하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 제공하여 BP103a01 정제물을 55g 얻었다.
2. BP103a02의 제작
1000mL의 3구 플라스크에, 55g의 BP103a01(1.0eq) 및 160mL의 DMSO를 가하고, 균일하게 교반하고, 이어서, NaN3 23.52g(2.0eq)을 가하고, 50℃로 가열하고 3시간 반응시키고, 실온까지 강온시키고, 반응액을 물에 투입하고, EA로 추출하고, 유기층을 합병하고, 무수 황산 탄산나트륨으로 건조시키고, 농축하여 무색의 액체인 BP103a02를 29.2g 얻었다.
3. BP103a03의 제작
1L의 수소화 반응기에, 29g의 화합물 3, 360mL의 메탄올, 5.0g의 팔라듐 탄소를 가하고, 교반하고, 질소 치환하고, 수소 가스를 도입하여 3∼4 h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 반응액을 여과하고, 여과액을 농축하여 BP103a03의 유상물(油狀物)을 23.5g 얻었다.
4. BP103a04의 제작
1L의 3구 플라스크에, 23.5g의 화합물 BP103a03(1.0eq), 68.6g의 (Boc)2O(2.0eq), 500ml의 메탄올:트리에틸아민(9:1)의 혼합 용액을 가하고, 교반하고 환류할 때까지 승온하고, 1h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 메탄올트리에틸아민을 증류 제거하고, 물을 가하여 용해하고, 디클로로메탄으로 3회 추출하고, 유기층을 합병하고, 1회 수세하고, 무수 황산 탄산나트륨으로 건조시키고, 용매를 증류 제거하고, 건조시켜, 고체의 BP103a04를 34.8g 얻었다.
5. BP103a05의 제작
1000mL의 3구 플라스크에, 34.8g의 화합물 BP103a04(1.0eq), 각각 150ml의 톨루엔 및 THF, 58.2g의 브로모아세트산(3eq)을 가하고, 교반하고, 45∼50 ℃로 가열하고, 또한 33.5g의 수산화 나트륨(6eq)을 가하고, 하룻밤 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 반응액을 증류 제거하고, 물 및 EA를 가하여 추출하고, 수상(水相)을 pH 3으로 조정하고, 디클로로메탄으로 수상을 추출하고, 디클로로메탄층을 합병하고, 무수 황산 탄산나트륨으로 건조시킨 후, 농축하여 유상물 화합물인 BP103a05를 18g 얻었다.
6. BP103a의 제작
250mL의 3구 플라스크에, 18g의 화합물 BP103a05, 100ml의 EA를 가하고, 교반하여 용해한 후에, 0℃까지 강온시키고, 150ml의 EA/HCl(3.5M)을 가하고, 0℃에서 보온하고, TLC로 모니터링하고, 반응이 종료하고, 여과하고, 케이크를 TBME로 세정하여 백색의 고체 BP103a를 10.4g 얻었다.
[화학식 158]
Figure pct00163
2의 제작
100mL의 플라스크에, 3.0g의 BP103a(1.0eq), 4.0g의 화합물 1(1.0eq), 40ml의 DCM, 4.0ml의 DIEA(2.0eq)를 가하고, 실온에서 교반하고, TLC로 모니터링하고, 반응이 종료된 후, 유기 용매를 증류 제거하고, 컬럼 크로마토그래피에 제공하여 6.4g의 유사 유상물 2를 5.2g 얻었다.
3의 제작
200mL의 3구 플라스크에, 9.00g의 화합물 2(1.0eq), 3.96g의 HOSU(1.53eq), 90ml의 DCM, 6.60g의 EDC. HCl(1.53eq)을 가하고, 실온에서 2h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, DCM로 희석하고, 이어서, pH=6.0의 50mmol/L의 인산 이수소칼륨 수용액으로 2회 세정하고, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산 탄산나트륨으로 건조시키고, 농축하여 5.9g의 무색의 유상물인 화합물 3을 얻었다.
4의 제작
200mL의 플라스크에, 2.93g의 화합물 Boc-Lys-OH(1.0eq), 60ml의 물, 2.00g의 NaHCO3(2.0eq)를 가하고, 교반하고, 5.9g의 화합물 3(1.0eq)를 적하(適下)하고 60ml의 DME(에틸렌글리콜 디메틸에테르)의 용액에 용해하고, 60ml의 THF를 추가하고, 교반하여 하룻밤 두었다. TLC로 모니터링하고, 반응이 종료된 후, 유기 용매를 증류 제거하고, 아세트산으로 PH=4로 조정하고, EA로 추출하고, 무수 황산 탄산나트륨으로 건조시키고, 농축하여, 4.50g의 무색의 유상물 화합물 4를 얻었다.
5의 제작
100mL의 플라스크에, 3.81g의 화합물 4(1.0eq), 40ml의 DCM, 1.07g의 HOSU, 1.78g의 EDC. HCl을 가하고, 교반하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응이 종료된 후, DCM로 희석하고, 그 후, 50mM의 인산 이수소칼륨 수용액으로 2회 세정하고, 순수로 1회 세정하고, 포화 식염수로 1회 세정하고, 무수 황산 탄산나트륨으로 건조시키고, 농축하여, 4.1g의 무색의 유상물 화합물 5를 얻었다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 159]
Figure pct00164
7의 제작
250mL의 환저(丸底) 플라스크에, 3.50g의 화합물 6(1.0eq), 52.5ml의 DMF를 가하고, 60℃로 가열하여 용해하고, 5∼10 min 후에 DMF를 감압 하에서 증류 제거하고, 300ml의 n-헵탄을 가하고 감압 하에서 증류하고, 3회 반복하고, 원심 탈수 후, 105ml의 DCM, 1.08g의 Boc-Gly-OH(1.2eq), 63mg의 DMAP(0.1eq)를 가하고, 1.59g의 DCC(1.5eq)를 적하하고 10ml의 DCM의 용액에 용해하고, 20℃에서 4시간 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 여과하고, 나머지가 25% 체적이 될 때까지 농축하고 120ml의 IPA를 가하여, 75%의 용매를 증류 제거하고, 150ml의 n-헵탄을 가하고, 실온에서 1시간 교반하고, 여과하고, n-헵탄으로 2회 세정하고, 건조하여 4.02g의 담황색의 고체인 화합물 7을 얻었다.
8의 제작
100mL의 3구 플라스크에, 4.02g의 화합물 7, 50ml의 DCM을 가하고, 교반 용해 후에 11.6ml의 TFA를 적하하고, 실온에서 2h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 150ml의 아세토니트릴을 가하고, 120ml의 용매를 감압 하에서 증류한 후에 320ml의 TBME 용액에 투입하고, 30min 교반하고, 여과하고, 케이크를 TBME로 세정하여 담황색의 고체 8을 4.00g 얻었다.
9의 제작
200mL의 3구 플라스크에, 2.95g의 화합물 8, 80ml의 DCM, 2.57g(1.05eq)의 화합물 4, 2.16ml의 DIEA(3.0eq), 0.96ml의 DEPC(1.5eq)를 가하여, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, DCM으로 희석하고, 이어서, 2회 수세하고, 포화 식염수로 1회 세정하고, 건조시키고, 농축하고, HPLC 정제 후에 동결 건조하여 담황색의 고체 9를 1.48g 얻었다.
[화학식 160]
Figure pct00165
10의 제작
50mL의 환저 플라스크에, 260mg의 화합물 9, 10ml의 20% TFA/DCM을 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 담황색의 고체 10을 210mg 얻었다.
11의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 51mg의 화합물 10(4.0eq), 2ml의 DCM, 11ul의 TEA(8.0eq), 201mg의 4armPEG20K-SCM(1.0eq)들 가하고, 실온에서 하룻밤 반응시킨 후, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 오프화이트의 고체 11을 240mg 얻었다.
[화학식 161]
Figure pct00166
12의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 50mg의 화합물 11(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 10.6mg의 iRGD를 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 12를 50mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.902(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.328(s, 2H), 5.480(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 2 화합물 2의 제작
[화학식 162]
Figure pct00167
10.0g의 2Cl-Trt Resin을 준비하고, 커플링제로서 HOBT/DIC를 사용하고, DMF를 반응 용매로 하고, 닌히드린법에 의해 반응을 모니터링하고, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH와 같은 보호된 아미노산을 순서대로 수지에 연결하고, 개열제로서 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 티오아니솔을 가하고, 빙랭한 MTBE가 침전하고, 세정하고, 조생성물을 역상 HPLC에 의한 정제, 동결 건조를 거쳐, 백색의 플록을 5.5g 얻었다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 163]
Figure pct00168
14의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 11(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 139mg의 tLyP-1을 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 14를 1.0g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.903(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.332(s, 2H), 5.484(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 3 화합물 3의 제작
Lyp-1의 제작
[화학식 164]
Figure pct00169
10.0g의 Fmoc-Rink MBHA Amide Resin을 준비하고, Fmoc를 제거했다. 커플링제로서 HOBT/DIC를 사용하고, DMF를 반응 용매로 하고, 닌히드린법에 의해 반응을 모니터링하고, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH와 같은 보호된 아미노산을 순서대로 수지에 연결하고, DMF 세정 후에, 트리플루오로아세트산 탈륨(2.0eq)을 가하고 18시간 교반한 후에 DMF로 세정하고, Fmoc를 제거하고, Fmoc-Cys(Trt)-OH를 축합시키고, DMF로 세정하고, Fmoc를 제거한 후에 건조시키고, 개열제로서 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 티오아니솔을 가하고, 빙랭한 MTBE가 침전하고, 세정하고, 조생성물을 역상 HPLC에 의한 정제, 동결 건조를 거쳐, 백색의 플록인 LyP-1을 765mg 얻었다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 165]
Figure pct00170
13의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 11(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 182mg의 LyP-1을 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 13을 1.05g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.901(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.328(s, 2H), 5.481(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 4 화합물 4의 제작
CPARPAR의 제작
10.0g의 2Cl-TrtResin을 준비하고, 커플링제로서 HOBT/DIC를 사용하고, DMF를 반응 용매로 하고, 닌히드린법에 의해 반응을 모니터링하고, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH와 같은 보호된 아미노산을 순서대로 수지에 연결하고, 개열제로서 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 티오아니솔을 가하고, 빙랭한 MTBE가 침전하고, 세정하고, 조생성물을 역상 HPLC에 의한 정제, 동결 건조를 거쳐, 백색의 플록인 CRPARPAR을 6.1g 얻었다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 166]
Figure pct00171
15의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 11(1.0eq), 20l의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 154mg의 CRPARPAR을 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 15를 1.09g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.905(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.335(s, 2H), 5.486(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 5 화합물 5의 제작
cRGD의 제작
[화학식 167]
Figure pct00172
본 발명에서 사용한 cRGD는, 외부로부터 구입한 것이다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
[화학식 168]
Figure pct00173
16의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 11(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 96.4g의 cRGD를 가하고 4ml의 pH=7, 0.01M의 PBS와 6ml의 메탄올의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 16을 1.06g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.902(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.326(s, 2H), 5.480(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 6 화합물 6의 제작
iRGD의 제작은 실시예 1과 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 169]
Figure pct00174
21의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 5.00g의 화합물 20(1.0eq), 100ml의 DCM, 3.89g의 TEA(3.0eq)를 가하고, 3.50g의 TBDPS-Cl(1.0eq)을 적하하고 20ml의 DCM의 용액에 용해하고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 물로 세정하고, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산 탄산나트륨으로 건조시킨 후에 컬럼 크로마토그래피에 제공하여, 3.62g의 담황색의 고체인 화합물 21을 얻었다.
22의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 4.80g의 화합물 21(1.0eq), 145ml의 DCM, 1.64g의 Boc-Gly-OH(1.2eq), 95mg의 DMAP(0.1eq)를 가하고, 2.41g의 DCC(1.5eq)를 적하하고 10ml의 DCM의 용액에 용해하고, 20℃에서 4시간 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 여과하고, 나머지가 25% 체적이 될 때까지 농축한 시점에서 130ml의 IPA를 가하고, 75%의 용매를 증류 제거하고, 160ml의 n-헵탄을 가하고, 실온에서 1시간 교반하고, 여과하고, n-헵탄으로 2회 세정하고, 건조하여 4.65g의 담황색의 고체인 화합물 22를 얻었다.
23의 제작
100mL의 3구 플라스크에, 4.65g의 화합물 22, 50ml의 DCM을 가하고, 교반 용해 후에 11.6ml의 TFA를 적하하고, 실온에서 2h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 150ml의 아세토니트릴을 가하고, 120ml의 용매를 감압 하에서 증류한 후에 320ml의 TBME 용액에 투입하고, 30min 교반하고, 여과하고, 케이크를 TBME로 세정하여 담황색의 고체 23을 2.48g 얻었다.
24의 제작
200mL의 3구 플라스크에, 2.3g의 화합물 23, 45ml의 DCM, 3.196g(1.05eq) 화합물 5, 1.75ml의 TEA(3.0eq)를 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, DCM으로 희석하고, 이어서, 2회 수세하고, 포화 식염수로 1회 세정하고, 건조시키고, 농축하고, HPLC 정제 후에 동결 건조하여 담황색의 고체 24를 2.20g 얻었다.
25의 제작
200mL의 환저 플라스크에, 2.0g의 화합물 24, 60ml의 20% TFA/DCM을 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 담황색의 고체 25를 1.75g 얻었다.
26의 제작
500mL의 환저 플라스크에, 1.51g의 화합물 25(4.0eq), 140ml의 DCM, 390ul의 TEA(8.0eq), 7.0g의 4armPEG20K-SCM(1.0eq)을 가하고, 실온에서 하룻밤 반응시킨 후, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 오프화이트의 고체 26을 7.9g 얻었다.
[화학식 170]
Figure pct00175
261의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 26(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 188mg의 iRGD를 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 261을 980mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.905(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.333(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 7 화합물 7의 제작
tLyp-1의 제작은 실시예 2와 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 171]
Figure pct00176
263의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 26(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 144mg의 tLyP-1을 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 263을 1.01g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.904(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.335(s, 2H), 5.488(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 8 화합물 8의 제작
Lyp-1의 제작은 실시예 3과 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 172]
Figure pct00177
262의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 26(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 188mg의 LyP-1을 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 262를 1.04g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.902(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.328(s, 2H), 5.481(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 9 화합물 9의 제작
CRPARPAR의 제작은 실시예 4와 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 173]
Figure pct00178
264의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 26(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 159mg의 CRPARPAR을 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 264를 1.04g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.910(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.328(s, 2H), 5.480(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 10 화합물 10의 제작
cRGD의 제작은 실시예 5와 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 174]
Figure pct00179
265의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 26(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 99.5mg의 cRGD를 가하고 4ml의 pH=7, 0.01M의 PBS와 6ml의 메탄올의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 265를 1.03g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.915(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.337(s, 2H), 5.484(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 11 화합물 11의 제작
iRGD의 제작은 실시예 1과 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 175]
Figure pct00180
31의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 6.00g의 화합물 30(1.0eq), 120ml의 DCM, 5.00g의 TEA(3.0eq)를 가하고, 4.53g의 TBDPS-Cl(1.0eq)을 적하하고 20ml의 DCM의 용액에 용해하고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 물로 세정하고, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산 탄산나트륨으로 건조시킨 후에 컬럼 크로마토그래피에 제공하여, 4.32g의 담황색의 고체인 화합물 31을 얻었다.
32의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 5.0g의 화합물 31(1.0eq), 150ml의 DCM, 1.73g의 Boc-Gly-OH(1.2eq), 101mg의 DMAP(0.1eq)를 가하고, 2.55g의 DCC(1.5eq)를 적하하고 10ml의 DCM의 용액에 용해하고, 20℃에서 4시간 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 여과하고, 나머지가 25% 체적이 될 때까지 농축한 시점에서 130ml의 IPA를 가하고, 75%의 용매를 증류 제거하고, 160ml의 n-헵탄을 가하고, 실온에서 1시간 교반하고, 여과하고, n-헵탄으로 2회 세정하고, 건조하여 4.52g의 담황색의 고체인 화합물 32를 얻었다.
33의 제작
100mL의 3구 플라스크에, 4.40g의 화합물 22, 50ml의 DCM을 가하고, 교반 용해 후에 11.6ml의 TFA를 적하하고, 실온에서 2h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 150ml의 아세토니트릴을 가하고, 120ml의 용매를 감압 하에서 증류한 후에 320ml의 TBME 용액에 투입하고, 30min 교반하고, 여과하고, 케이크를 TBME로 세정하여 담황색의 고체 23을 2.32g 얻었다.
[화학식 176]
Figure pct00181
34의 제작
200mL의 3구 플라스크에, 2.3g의 화합물 33, 45ml의 DCM, 2.77g의 (1.05eq) 화합물 5, 1.1g의 TEA(3.0eq)를 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, DCM으로 희석하고, 이어서, 2회 수세하고, 포화 식염수로 1회 세정하고, 건조시키고, 농축하고, HPLC 정제 후에 동결 건조하여 담황색의 고체 34를 2.02g 얻었다.
35의 제작
200mL의 환저 플라스크에, 2.0g의 화합물 34, 60ml의 20% TFA/DCM을 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 담황색의 고체 35를 1.69g 얻었다.
36의 제작
500mL의 환저 플라스크에, 1.50g의 화합물 25(4.0eq), 140ml의 DCM, 390ul의 TEA(8.0eq), 7.0g의 4armPEG20K-SCM(1.0eq)을 가하고, 실온에서 하룻밤 반응시킨 후, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 오프화이트의 고체 36을 7.64g 얻었다.
[화학식 177]
Figure pct00182
361의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 36(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 189mg의 iRGD를 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 361을 1.08g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.909(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.333(s, 2H), 5.481(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 12 화합물 12의 제작
tLyp-1의 제작은 실시예 2와 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 178]
Figure pct00183
363의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 36(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 144mg의 tLyP-1을 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 363을 0.99g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.915(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.340(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 13 화합물 13의 제작
Lyp-1의 제작은 실시예 3과 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 179]
Figure pct00184
362의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 36(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 189mg의 LyP-1을 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 362를 1.06g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.908(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.335(s, 2H), 5.484(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 14 화합물 14의 제작
CRPARPAR의 제작은 실시예 4와 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 180]
Figure pct00185
364의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 36(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 160mg의 CRPARPAR을 가하고 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 364를 1.01g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.910(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.336(s, 2H), 5.485(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 15 화합물 15의 제작
cRGD의 제작은 실시예 5와 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 181]
Figure pct00186
365의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 36(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 100mg의 cRGD를 가하고 4ml의 pH=7, 0.01M의 PBS와 6ml의 메탄올의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 365를 1.05g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.914(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.340(s, 2H), 5.489(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 16 화합물 16의 제작
iRGD의 제작은 실시예 1과 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 182]
Figure pct00187
41의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 5.0g의 화합물 40(1.0eq), 150ml의 DCM, 2.67g의 Boc-Gly-OH(1.2eq), 155mg의 DMAP(0.1eq)를 가하고, 3.93g의 DCC(1.5eq)를 적하하여 15ml의 DCM의 용액에 용해하고, 20℃에서 4시간 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 여과하고, 나머지가 25% 체적이 될 때까지 농축한 시점에서 130ml의 IPA를 가하고, 75%의 용매를 증류 제거하고, 160ml의 n-헵탄을 가하고, 실온에서 1시간 교반하고, 여과하고, n-헵탄으로 2회 세정하고, 건조하여 6.85g의 담황색의 고체인 화합물 41을 얻었다.
42의 제작
100mL의 3구 플라스크에, 4.00g의 화합물 41, 50ml의 DCM을 가하고, 교반 용해 후에 11.6ml의 TFA를 적하하고, 실온에서 2h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 150ml의 아세토니트릴을 가하고, 120ml의 용매를 감압 하에서 증류한 후에 320ml의 TBME 용액에 투입하고, 30min 교반하고, 여과하고, 케이크를 TBME로 세정하여 담황색의 고체 42를 3.54g 얻었다.
[화학식 183]
Figure pct00188
43의 제작
200mL의 3구 플라스크에, 3.00g의 화합물 42, 45ml의 DCM, 3.46g(1.05eq) 화합물 5, 1.38g의 TEA(3.0eq)를 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, DCM으로 희석하고, 이어서, 2회 수세하고, 포화 식염수로 1회 세정하고, 건조시키고, 농축하고, HPLC 정제 후에 동결 건조하여 담황색의 고체 43을 2.68g 얻었다.
44의 제작
200mL의 환저 플라스크에, 2.0g의 화합물 43, 60ml의 20% TFA/DCM을 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 담황색의 고체 44를 1.61g 얻었다.
45의 제작
500mL의 환저 플라스크에, 1.50g의 화합물 44(4.0eq), 140ml의 DCM, 391ul의 TEA(8.0eq), 7.0g의 4armPEG20K-SCM(1.0eq)을 가하고, 실온에서 하룻밤 반응시킨 후, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 오프화이트의 고체 45를 7.61g 얻었다.
[화학식 184]
Figure pct00189
451의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 45(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 188mg의 iRGD를 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 가하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 451을 1.09g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.909(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.335(s, 2H), 5.482(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 17 화합물 17의 제작
tLyp-1의 제작은 실시예 2와 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 185]
Figure pct00190
453의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 45(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 144mg의 tLyP-1을 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 가하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 453을 1.02g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.912(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.336(s, 2H), 5.485(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 18 화합물 18의 제작
Lyp-1의 제작은 실시예 3과 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 186]
Figure pct00191
452의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 45(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 188mg의 LyP-1을 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 가하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 452를 1.06g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.917(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.340(s, 2H), 5.491(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 19 화합물 19의 제작
CRPARPAR의 제작은 실시예 4와 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 187]
Figure pct00192
454의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 45(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 159mg의 CRPARPAR를 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 가하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 454를 1.07g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.911(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.332(s, 2H), 5.480(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 20 화합물 20의 제작
cRGD의 제작은 실시예 5와 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 188]
Figure pct00193
455의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 45(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 99.5mg의 cRGD를 가하고 4ml의 pH=7, 0.01M의 PBS와 6ml의 메탄올의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 455를 1.03g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.909(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.331(s, 2H), 5.478(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 21 화합물 21의 제작
iRGD의 제작은 실시예 1과 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
[화학식 189]
Figure pct00194
50의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 52mg의 화합물 10(3.0eq), 2ml의 DCM, 11ul의 TEA(6.0eq), 273mg의 3armPEG20K-SCM(1.0eq)을 가하고, 실온에서 하룻밤 반응시킨 후, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 오프화이트의 고체 50을 310mg 얻었다.
[화학식 190]
Figure pct00195
51의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 50mg의 화합물 50(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 7.2mg의 iRGD를 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 51을 49mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.901(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.328(s, 2H), 5.480(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 22 화합물 22의 제작
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
[화학식 191]
Figure pct00196
52의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 55mg의 화합물 50(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에, 4.2mg의 cRGD를 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS와 1.5ml의 메탄올의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 52를 50mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.901(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.333(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 23 화합물 23의 제작
iRGD의 제작은 실시예 1과 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 192]
Figure pct00197
60의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 476mg의 화합물 10(8.0eq), 15ml의 DCM, 105ul의 TEA(16.0eq), 1.0g의 8armPEG20K-SCM(1.0eq)을 가하고, 실온에서 하룻밤 반응시킨 후, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 오프화이트의 고체 60을 1.37g 얻었다.
[화학식 193]
Figure pct00198
61의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 50mg의 화합물 60(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 14.5mg의 iRGD를 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 61을 54mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.901(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.328(s, 2H), 5.480(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 24 화합물 24의 제작
Lyp-1의 제작은 실시예 3과 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 194]
Figure pct00199
62의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 60mg의 화합물 60(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 17.4mg의 LyP-1을 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 62를 68mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.901(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.329(s, 2H), 5.481(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 25 화합물 25의 제작
[화학식 195]
Figure pct00200
63의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 45mg의 화합물 60(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 10.0mg의 tLyP-1을 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 63을 45mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.901(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.330(s, 2H), 5.482(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 26 화합물 26의 제작
[화학식 196]
Figure pct00201
64의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 55mg의 화합물 60(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 13.5mg의 CRPARPAR을 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 64를 62mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.901(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.331(s, 2H), 5.480(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 27 화합물 27의 제작
[화학식 197]
Figure pct00202
65의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 50mg의 화합물 60(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 7.7mg의 cRGD를 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS와 1.5ml의 메탄올의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 65를 50mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.902(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.328(s, 2H), 5.481(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 28 화합물 28의 제작
iRGD의 제작은 실시예 1과 동일하다.
L 부분의 제작은 실시예 1과 동일하다.
콘쥬게이트의 제작
[화학식 198]
Figure pct00203
[화학식 199]
Figure pct00204
21의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 5.00g의 화합물 20(1.0eq), 100ml의 DCM, 3.87g의 TEA(3.0eq)를 가하여고 3.49g의 TBDPS-Cl(1.0eq)를 적하하여 20ml의 DCM의 용액에 용해하고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 물로 세정하고, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산 탄산나트륨으로 건조시킨 후에 컬럼 크로마토그래피에 제공하고, 3.52g의 담황색의 고체인 화합물 21을 얻었다.
22의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 4.50g의 화합물 21(1.0eq), 135ml의 DCM, 1.5g의 Boc-Gly-OH(1.2eq), 87mg의 DMAP(0.1eq)를 더하여, 2.21g의 DCC(1.5eq)를 적하하고 10ml의 DCM의 용액에 용해하고, 20℃에서 4시간 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 여과하고, 나머지가 25% 체적이 될 때까지 농축한 시점에서 120ml의 IPA를 가하고, 75%의 용매를 증류 제거하고, 150ml의 n-헵탄을 가하고, 실온에서 1시간 교반하고, 여과하고, n-헵탄으로 2회 세정하고, 건조하여 4.95g의 담황색의 고체인 화합물 22를 얻었다.
23의 제작
100mL의 3구 플라스크에, 4.95g의 화합물 22, 55ml의 DCM을 가하고, 교반 용해 후에 13.7ml의 TFA를 적하하고, 실온에서 2h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 150ml의 아세토니트릴을 가하고, 120ml의 용매를 감압 하에서 증류한 후에 320ml의 TBME 용액에 투입하고, 30min 교반하고, 여과하고, 케이크를 TBME로 세정하여 담황색의 고체 23을 2.5g 얻었다.
24의 제작
200mL의 3구 플라스크에, 2.3g의 화합물 23, 45ml의 DCM, 3.9g(1.05eq) 화합물 5, 2.14ml의 TEA(3.0eq)를 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, DCM으로 희석하고, 이어서, 2회 수세하고, 포화 식염수로 1회 세정하고, 건조시키고, 농축하고, HPLC 정제 후에 동결 건조하여 담황색의 고체 24를 2.45g 얻었다.
25의 제작
200mL의 환저 플라스크에, 2.2g의 화합물 24, 65ml의 20% TFA/DCM을 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 담황색의 고체 25를 1.7g 얻었다.
70의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.21g의 화합물 25(8.0eq), 60ml의 DCM, 314ul의 TEA(16.0eq), 3.0g의 4armPEG20K-SCM(1.0eq)를 더하여, 실온에서 하룻밤 반응시킨 후, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 오프화이트의 고체 70을 3.9g 얻었다.
[화학식 200]
Figure pct00205
71의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 50mg의 화합물 70(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 15.3mg의 iRGD를 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 71을 55mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.901(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.335(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 29 화합물 29의 제작
[화학식 201]
Figure pct00206
72의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 60mg의 화합물 70(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 18.3mg의 LyP-1을 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 72를 68mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.902(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.333(s, 2H), 5.486(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 30 화합물 30의 제작
[화학식 202]
Figure pct00207
73의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 55mg의 화합물 70(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 12.8mg의 tLyP-1을 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 73을 55mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.901(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.335(s, 2H), 5.488(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 31 화합물 31의 제작
[화학식 203]
Figure pct00208
74의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 55mg의 화합물 70(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 14.2mg의 CRPARPAR을 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 74를 60mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.902(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.332(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 32 화합물 32의 제작
[화학식 204]
Figure pct00209
75의 제작
10mL의 환저 플라스크에, 60mg의 화합물 70(1.0eq), 1.5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 9.7mg의 cRGD를 가하고 1ml의 pH=7, 0.01M의 PBS와 1.5ml의 메탄올의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 75를 62mg 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.900(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.333(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 33 화합물 33의 제작
[화학식 205]
Figure pct00210
31의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 6.00g의 화합물 30(1.0eq), 120ml의 DCM, 5.00g의 TEA(3.0eq)를 더하여, 4.53g의 TBDPS-Cl(1.0eq)를 적하하여 20ml의 DCM의 용액에 용해하고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 물로 세정하고, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산 탄산나트륨으로 건조시킨 후에 컬럼 크로마토그래피에 제공하여, 4.32g의 담황색의 고체인 화합물 31을 얻었다.
32의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 5.0g의 화합물 31(1.0eq), 150ml의 DCM, 1.73g의 Boc-Gly-OH(1.2eq), 101mg의 DMAP(0.1eq)를 가하고, 2.55g의 DCC(1.5eq)를 적하하고 10ml의 DCM의 용액에 용해하고, 20℃에서 4시간 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 여과하고, 나머지가 25% 체적이 될 때까지 농축한 시점에서 130ml의 IPA를 가하고, 75%의 용매를 증류 제거하고, 160ml의 n-헵탄을 가하고, 실온에서 1시간 교반하고, 여과하고, n-헵탄으로 2회 세정하고, 건조하여 4.52g의 담황색의 고체인 화합물 32를 얻었다.
33의 제작
100mL의 3구 플라스크에, 4.40g의 화합물 22, 50ml의 DCM을 가하고, 교반 용해 후에 11.6ml의 TFA를 적하하고, 실온에서 2h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 150ml의 아세토니트릴을 가하고, 120ml의 용매를 감압 하에서 증류한 후에 320ml의 TBME 용액에 투입하고, 30min 교반하고, 여과하고, 케이크를 TBME로 세정하여 담황색의 고체 23을 2.32g 얻었다.
[화학식 206]
Figure pct00211
34의 제작
200mL의 3구 플라스크에, 2.3g의 화합물 33, 45ml의 DCM, 2.77g의 (1.05eq) 화합물 5, 1.1g의 TEA(3.0eq)를 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, DCM으로 희석하고, 이어서, 2회 수세하고, 포화 식염수로 1회 세정하고, 건조시키고, 농축하고, HPLC 정제 후에 동결 건조하여 담황색의 고체 34를 2.02g 얻었다.
35의 제작
200mL의 환저 플라스크에, 2.0g의 화합물 34, 60ml의 20% TFA/DCM을 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 담황색의 고체 35를 1.69g 얻었다.
80의 제작
500mL의 환저 플라스크에, 2.75g의 화합물 35(8.0eq), 140ml의 DCM, 730ul의 TEA(16.0eq), 7.0g의 8armPEG20K-SCM(1.0eq)을 가하고, 실온에서 하룻밤 반응시킨 후, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 오프화이트의 고체 80을 8.64g 얻었다.
[화학식 207]
Figure pct00212
81의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 80(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 307mg의 iRGD를 가하고 15ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 81을 1.18g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.903(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.334(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 34 화합물 34의 제작
[화학식 208]
Figure pct00213
실시예 35 화합물 35의 제작
[화학식 209]
Figure pct00214
83의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 80(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 235mg의 tLyP-1을 가하고 15ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 83을 1.05g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.904(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.334(s, 2H), 5.489(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 36 화합물 36의 제작
[화학식 300]
Figure pct00215
실시예 37 화합물 37의 제작
[화학식 301]
Figure pct00216
85의 제작
100mL의 환저 플라스크에, 1.0g의 화합물 80(1.0eq), 20ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 163mg의 cRGD를 가하고 6ml의 pH=7, 0.01M의 PBS와 10ml의 메탄올의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 85를 1.00g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.903(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.334(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 38 화합물 38의 제작
[화학식 302]
Figure pct00217
41의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 5.0g의 화합물 40(1.0eq), 150ml의 DCM, 2.67g의 Boc-Gly-OH(1.2eq), 155mg의 DMAP(0.1eq)를 가하고, 3.93g의 DCC(1.5eq)를 적하하고 15ml의 DCM의 용액에 용해하고, 20℃에서 4시간 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 여과하고, 나머지가 25% 체적이 될 때까지 농축한 시점에서 130ml의 IPA를 가하고, 75%의 용매를 증류 제거하고, 160ml의 n-헵탄을 가하고, 실온에서 1시간 교반하고, 여과하고, n-헵탄으로 2회 세정하고, 6.85g의 건조하여 담황색의 고체인 화합물 41을 얻었다.
42의 제작
100mL의 3구 플라스크에, 4.00g의 화합물 41, 50ml의 DCM을 가하고, 교반 용해 후에 11.6ml의 TFA를 적하하고, 실온에서 2h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, 150ml의 아세토니트릴을 가하고, 120ml의 용매를 감압 하에서 증류한 후에 320ml의 TBME 용액에 투입하고, 30min 교반하고, 여과하고, 케이크를 TBME로 세정하여 담황색의 고체 42를 3.54g 얻었다.
[화학식 303]
Figure pct00218
43의 제작
200mL의 3구 플라스크에, 3.00g의 화합물 42, 45ml의 DCM, 3.46g(1.05eq) 화합물 5, 1.38g의 TEA(3.0eq)를 더하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, DCM으로 희석하고, 이어서, 2회 수세하고, 포화 식염수로 1회 세정하고, 건조시키고, 농축하고, HPLC 정제 후에 동결 건조하여 담황색의 고체 43을 2.68g 얻었다.
44의 제작
200mL의 환저 플라스크에, 2.0g의 화합물 43, 60ml의 20% TFA/DCM을 가하고, 실온에서 4h 반응시키고, TLC로 모니터링하고, 반응 종료 후, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 담황색의 고체 44를 1.61g 얻었다.
90의 제작
250mL의 환저 플라스크에, 1.61g의 화합물 44(8.0eq), 80ml의 DCM, 418ul의 TEA(16.0eq), 4.0g의 8armPEG20K-SCM(1.0eq)을 가하고, 실온에서 하룻밤 반응시킨 후, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 오프화이트의 고체 90을 5.15g 얻었다.
[화학식 304]
Figure pct00219
91의 제작
50mL의 환저 플라스크에, 0.5g의 화합물 90(1.0eq), 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 152mg의 iRGD를 5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 가하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 91을 0.53g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.902(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.333(s, 2H), 5.488(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 39 화합물 39의 제작
[화학식 305]
Figure pct00220
92의 제작
0.5g의 화합물 90(1.0eq), 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 50mL의 환저 플라스크에 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 153mg의 LyP-1을 5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 가하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 92를 0.57g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.900(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.332(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 40 화합물 40의 제작
[화학식 306]
Figure pct00221
실시예 41 화합물 41의 제작
[화학식 307]
Figure pct00222
94의 제작
50mL의 환저 플라스크에, 0.5g의 화합물 90(1.0eq), 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 129mg의 CRPARPAR을 5ml의 pH=7, 0.01M의 PBS의 용액에 가하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 94를 0.55g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.901(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.331(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
실시예 42 화합물 42의 제작
[화학식 308]
Figure pct00223
95의 제작
50mL의 환저 플라스크에, 0.5g의 화합물 90(1.0eq), 10ml의 pH=7, 0.01M의 PBS를 가하고, 용해하여 투명하게 된 후에 80.8mg의 cRGD를 가하고 4ml의 pH=7, 0.01M의 PBS와 6ml의 메탄올의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후에 투석하고, 농축하고, 메탄올로 조생성물을 용해하고, HCl/EA 용액을 가하고, 농축하고, TBME에 투입하고, 원심 분리하고, 건조하여 황색의 고체 95를 0.50g 얻었다.
1HNMR(DMSO＋D2O): δ 0.903(t, CH2CH3), 3.5(brmPEG), 5.330(s, 2H), 5.487(s, 2H), 7.0-8.5(mNH)
화합물 23∼42의 제작에서는, R은,
[화학식 309]
Figure pct00224
이다.
실시예 43 인간 결장암 HT-29의 누드마우스 이식 종양 모델에서의 종양의 생체내 증식에 대한 억제 작용.
1. 실험 목적
화합물 1∼42의, 인간 결장암 HT-29의 누드마우스 이식 종양 모델에서의 종양의 생체내 증식에 대한 억제 작용을 측정한다.
2. 실험 재료
2.1 시료
이리노테칸(원약), nktr-102(원약)은 구입품이며, 화합물 1∼42는 모두 브라이트진 바이오-메디컬테크놀로지컴퍼니리미티드티드에 의해 제공되는 것이다.
2.2 시약
McCoy's5A 배양액, 우태아 혈청(FBS), 트립신, 페니실린-스트렙토마이신 이중특이성 항체, 주사용수, 락트산, 소르비톨.
2.3 실험 동물
웅성(雄性) BALB/c 누드마우스(마리수: 300마리; 주령(週齡): 5∼7 주)를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.로부터 구입하고, 온도 20∼25 ℃, 상대 습도 40%∼70%, 12시간 명(明), 12시간 암(暗)의 조명 조건, 동물이 자유롭게 물·먹이를 섭취하는 SPF 동물 사육실에서 사육하였다. 사육하고 약 1주일 후, 수의사에 의한 검사로 신체 상황이 양호한 것으로 판단된 마우스를 금번의 실험용 마우스로 했다. 군을 분류하기 전에 마커에 의해 동물의 꼬리의 밑둥치에 표시하고, 군 분류 후에 각 동물을 이어(ear) 컷의 방법에 의해 표시했다.
2.4 가이식성(可移植性) 종양주
중국 과학원 전형 배양물 보존 위원회 세포 뱅크(CAS, 본 실험실에서는 액화 질소 중에 동결 보존)로부터 입수한 인간 결장암 세포 HT-29.
3 실험 방법
3.1 HT-29 세포 배양
5% CO2, 37℃의 배양 조건 하에서, HT-29 세포를, 10% 우태아 혈청 함유McCoy's5A 배양액 중에서 통상의 세포　배양을 행하고, 0.25% 트립신 소화법에 의해 계대(繼代)했다. 세포의 증식 상황에 따라, 계대를 주에 2∼3 회 행하고, 계대 비율을 1:3∼1:8로 했다.
3.2 동물 모델의 구축
지수 증식기의 HT-29 세포를 채취하고, 세포수 계측 후에 무혈청 McCoy's5A 배지에 재현탁하고, 세포 농도를 6×107세포/mL로 조정하고, 피펫으로 세포를 풀고, 균일하게 분산시킨 후에 50mL의 원심관에 넣고, 원심관을 아이스박스에 넣었다. 세포 현탁액을 1mL의 시린지로 채취하고, 누드마우스의 우측 전방 겨드랑이 피하에 주사를 놓고, 각 동물에 100μL(6×106세포/마리) 접종하여, HT-29의 누드마우스 이식 종양 모델을 구축했다. 접종 후에 정기적으로 동물의 상태 및 종양의 증식 상태를 관찰하고, 전자 디지매틱 캘리퍼스를 사용하여 종양 직경을 측정하고, 데이터를 직접적으로 Excel표에 입력하고, 종양 체적을 계산했다. 종양 체적이 100∼300 mm3가 된 후에, 건강 상태가 양호하며, 종양 체적이 비슷한 동물을 225마리 선택하고, 무작위 블록에 의해 45조로 나누었다(n=5). 실험 개시 후에 종양 직경을 주 2회 측정하고, 종양 체적을 계산하고, 동시에 동물 체중을 칭량(秤量)하여 기록했다.
종양 체적(TV)의 계산 공식은 하기와 같다.
TV(mm3)=l×w2/2
식 중, l은 종양 장경(長徑)(mm)을 나타내고, w는 종양 단경(短徑)(mm)을 나타낸다.
3.3 용매의 조제
0.5g의 소르비톨을 칭량하여 50mL의 원심관에 넣고, 원심관에 50mL의 주사용수를 가하고, 고형물이 완전히 용해할 때까지 선회(旋回) 진동하여, 농도 1%의 소르비톨 수용액(w/v)을 조제하고, 4℃의 냉장고에 보존해 두었다.
3.4 투여 제제의 조제
3.4.1 이리노테칸 투여 제제의 조제
12.0mg의 이리노테칸을 칭량하고, 0.15ml의 1% 락트산을 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하고, 2.85ml의 1% 소르비톨 수용액을 각각 가하고, 선회 진동하여 균일하게 혼합하고, 용액 중의 1% 락트산, 1% 소르비톨 수용액의 비율을 약 5:95(v/v)로 했다. 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.2 nktr-102 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 88.55mg의 nktr-102를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.3 화합물 1∼5 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.85mg의 화합물 1을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.80mg의 화합물 2를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.88mg의 화합물 3을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 111.24mg의 화합물 4를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.78mg의 화합물 5를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.4 화합물 6∼10투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.09mg의 화합물 6을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.05mg의 화합물 7을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.12mg의 화합물 8을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.48mg의 화합물 9를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.02mg의 화합물 10을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.5 화합물 11∼15 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 112.98mg의 화합물 11을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 108.94mg의 화합물 12를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.01mg의 화합물 13을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.37mg의 화합물 14를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 104.91mg의 화합물 15를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.6 화합물 16∼20 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.09mg의 화합물 11을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.05mg의 화합물 12를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.12mg의 화합물 13을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.48mg의 화합물 14를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.02mg의 화합물 15를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.7 화합물 21∼42 투여 제제의 조제
조제 방법은 상기와 동일하며, 용액 중의 활성제의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.5 동물의 군분류 및 투여
동물의 군분류 및 투여 태양은 표 1과 같다.
활성제가 이리노테칸인 군(군1∼8). 군분류한 날 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제1 군은 용매 대조군이며, 미정맥 주사에 의해 블랭크 용매를 4일에 1회, 합계하여 3회(Q4D×3) 투여했다. 제2∼제8 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 이리노테칸, nktr-102, 화합물 1∼5를, 모두 40mg·kg-1(이리노테칸 함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여했다.
활성제가 SN-38인 군(군 9∼군 13). 군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제9∼제13 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 화합물 6∼10을, 모두 40mg·kg-1(SN-38 함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여했다.
활성제가 10-하이드록시캠토테신인 군(군 14∼군 18). 군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제14∼제18 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 화합물 11∼15를, 모두 40mg·kg-1(10-하이드록시캠토테신함유량 기준으로)의 투여량에서, Q4D×3으로 투여했다.
활성제가 루비테칸인 군(군 19∼군 23). 군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제19∼제23 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 화합물 16∼20을, 모두 40mg·kg-1(루비테칸 함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여했다.
군 24∼군 45의 투여 태양은 상기와 같다.
[표 1]
Figure pct00225
3.6 실험 종료
실험의 최종일에, 체중을 칭량하고, 종양 직경을 측정한 후에 동물을 안락사시켰다(CO2). 종양 조직을 추출하고, 칭량하고 촬영하고(촬영 시에 이하의 조합으로 각각 촬영), 종양 중량 억제율을 계산했다. 동물에 대하여 육안 해부를 행하고, 내장 기관에 이상(異常)이 있는지를 육안으로 관찰했다.
4 데이터 기록, 계산 공식
상대(相對) 종양 체적(RTV)의 계산 공식은 하기와 같다.
RTV=TVt/TVinitial
식 중, TVinitial은 군분류하고 투여했을 때 측정한 종양 체적이며, TVt는 투여 기간 동안 각 측정 시의 종양 체적이다.
상대 종양 증식율(%T/C)의 계산 공식은 하기와 같다.
%T/C=100%×(RTVT/RTVC)
식 중, RTVT는 치료군의 RTV를 나타내고, RTVC은 용매 대조군의 RTV를 나타낸다.
종양 증식 억제율 TGI(%)의 계산 공식은 하기와 같다.
TGI=100%×[1-(TVt (T)-TVinitial (T)/ (TVt (C)-TVinitial (C)]
식 중, TVt(T)는 치료군의 각 측정 시의 종양 체적을 나타내고, TVinitial(T)는 군분류하고 투여했을 때의 치료군의 종양 체적을 나타내고, TVt(C)는 용매 대조군의 각 측정 시의 종양 체적을 나타내고, TVinitial(C)는 군분류하고 투여했을 때의 용매 대조군의 종양 체적을 나타낸다.
동물의 체중 저감율의 계산 공식은 하기와 같다.
동물의 체중 저감율=100%×(BWinitial-BWt)/BWinitial
식 중, BWt는 투여 기간 동안 각 측정 시의 동물 체중을 나타내고, BWinitial은 군분류하고 투여했을 때의 동물 체중을 나타낸다.
종양 중량 억제율 IR(%)의 계산 공식은 하기와 같다.
IR(%)=100%×(WC-WT)/WC
식 중, WC는 대조군의 종양 중량을 나타내고, WT는 치료군의 종양 중량을 나타낸다.
5 통계적 분석 방법
Microsoft Office Excel 2007 소프트웨어를 사용하여 실험 자료를 계산하고, 및 관련 통계 처리를 행하였다. 데이터는 특별히 한정되지 않는 한, 평균값±표준 오차(Mean±SE)로서 표시하고, 2군의 비교는 t 검정으로 행하였다.
6 실험 관찰
실험 중, 실험자 및 수의사는 실험 동물의 징후 및 건강 상태를 계속해서 관찰하지 않으면 안된다. 동통(疼痛), 우울증, 활동 저하 등 동물의 어떠한 이상 증상도 실험 노트에 기록할 필요가 있다. 실험 동물의 이상 상황이 IACUC 관련 동물 복지법규의 규정과 일치하지 않는 경우, 수의사는 실험 정지의 여부를 판단하고, 동시에 실험 책임자에게 통지할 수 있다.
7 결과
인간 암 이종(異種) 이식 종양 모델에 대하여, 실험 평가 지표로서 상대 종양 증식율 T/C(%)를 권장한다. 증식율이 낮을수록, 종양 억제 효과가 양호한 것은 표 2에 나타내고 있다.
[표 2]
Figure pct00226
실험 결과에 의하면, 본 발명의 화합물은, 인간 결장암 HT-29의 누드마우스 이식 종양 모델에서의 종양의 생체내 증식에 대하여 양호한 억제 작용을 가지고, 또한 이리노테칸 및 nktr-102보다 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 44 인간 유방암 MDA-MB-231의 누드마우스 이종 이식 모델에서의 억제 작용
1. 실험 목적
본 연구는, 인간 유방암 MDA-MB-231의 누드마우스 이식 종양 모델을 사용하고, 화합물 1∼42의 생체 내에서의 항종양 활성을 평가한다.
2. 실험 동물
2.1 동물 종류
마우스.
2.2 품종
BALB/c 누드마우스.
2.3 성별
웅성.
2.4 수
320마리 접종하고, 실험에서 225마리를 사용했다.
2.5 연령
6∼8 주.
2.6 체중
20∼22 g±20% 체중 평균값.
2.7 동물 자원(공급자(supplier))
상해 서보(西普)-필개(必凱) 실험동물 유한공사(BK), 허가증번호 SCXK(호) 2008-0016.
2.8 실험 동물 관리
모든 실험 동물을 SPF 레벨의 실험실에서 사육하였다. 실험자는 일상의 케어 및 실험 연구를 담당했다.
2.8.1 동물 신분의 식별 방법
각 케이지에 실험 번호, 실험군별, 실험자 이름, 마우스 품종 및 성별 등의 정보가 기재되어 있는 신분 카드가 부착되어 있고, 마우스는 이어링에 의해 마킹했다.
2.8.2 랜덤한 군분류
종양 체적이 150∼200 mm3으로 된 후에, 각 군에 마우스 5마리, 각 군 내의 종양 체적 및 마우스 체중이 균일하도록, 난괴법(andomized block design)에 의해 군분류했다. 각 군의 종양 체적의 평균값의, 모든 실험 동물의 종양 체적의 평균값과의 차가 ±10% 이하였다.
2.8.3 조작 관리 규칙
모든 실험 동물의 조작 및 관리는, 동물 사용 및 관리 가이드라인에 엄격하게 따른다.
2.8.4 사육 조건
거주 조건: IVC 시스템, 각 케이지에 5마리
온도: 20℃∼26℃
습도: 40%±70%
광조사: 12시간의 밤낮 교대
2.8.5 사료
북경 과옥(科澳) 협력 사료 유한공사에서 구입한 조사(照射) 래트·마우스 사료. 자유롭게 섭취시켰다.
2.8.6 음수(飮水)
도시 수도수. 여과하고 고압 멸균하여 음수시켰다.
2.8.7 까는 재료
상해 무생(茂生) 유도체 과기 유한공사에서 구입한 옥수숫대(corn cob). 고압 멸균하여 사용했다. 주에 2회 까는 재료를 교환했다.
2.8.8 적응 기간
실험 전에 마우스에 적어도 1주일의 환경 적응 기간을 주었다.
3. 실험 재료
3.1 실험 대상 의약품
이리노테칸(원약), nktr-102(원약)은 구입품이며, 화합물 1∼42는 모두 브라이트진바이오-메디컬테크놀로지컴퍼니리미티드티드에 의해 제공되는 것이다.
3.2 그 외의 화학 시약 및 재료
3.2.1 생리식염수
상해 화원(華源)장당(長富)약업(집단)유한공사에서 구입한 생리식염수.
3.2.2 무균 시린지
상해 강덕래(康德萊) 기업 발전 집단 고훈 유한공사(상해, 중국)로부터 구입한 1ml의 무균 시린지.
3.2.3 세포주
상해 중국 과학원 세포생물연구소에서 구입한 인간 유방암 MDA-MB-231.
MDA-MB-231을, 10% 우태아 혈청 FBS(GIBCO, USA)를 포함하는 DMEM 배지(GIBCO, USA)에서 배양하고, 5% CO2를 포함하는 37℃의 인큐베이터에서 배양했다.
3.2.4 메트리젤(BD Matrigel)
미국 BD사에서 구입한 메트리젤 Matrigel.
3.3 설비
ESCO로부터 구입한 생물학적 안전 캐비넷(형식번호: AC2-6E1),
Thermo Scientific Forma로부터 구입한 CO2 수밀성(水密性) 인큐베이터(형식번호: 3111),
Olympus로부터 구입한 도립(倒立) 현미경(형식번호: CKX41SF),
상해의료기계공업(집단)유한공사에서 구입한 전기 흡인 장치(형식번호: YX930D),
METTLER TOLEDO로부터 구입한 천평(METTLER TOLEDO AB135-S),
북경 뢰발이(雷勃爾) 원심기 유한공사로부터 구입한 저속 원심기(형식번호: LD5-2A),
계림 광륙수자측공(廣陸數字測控) 고훈 유한공사에서 구입한 전자 디지털 디지매틱 캘리퍼스(형식번호: SF2000).
4. 실험 설계
인간 유방암 MDA-MB-231의 누드마우스 피하 이식 종양 모델을 구축하고, 각 마리에 대하여 1×106개의 세포를 접종했다.
금회의 실험은 이하(표)의 투여량 및 투여 태양을 설계했다(표 3).
[표 3]
Figure pct00227
5. 화합물의 조제
조제 방법은 브라이트진바이오-메디컬테크놀로지컴퍼니리미티드티드에 의해 제공되는 것이다.
단회 투여에 필요한 용량:
20g(body weight)x10(animals)x10mL/kg/1000x1.5=3mL
5.1 이리노테칸 투여 제제의 조제
12.0mg의 이리노테칸을 칭량하고, 0.15ml의 1% 락트산을 가하여, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하고, 2.85ml의 1% 소르비톨 수용액을 더욱 가하고, 선회 진동하여 균일하게 혼합하고, 용액 중의 1% 락트산, 1% 소르비톨 수용액의 비율을 약 5:95(v/v)로 했다. 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
5.2 nktr-102 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 88.55mg의 nktr-102를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
5.3 화합물 1∼5 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.85mg의 화합물 1을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.80mg의 화합물 2를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.88mg의 화합물 3을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 111.24mg의 화합물 4를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.78mg의 화합물 5를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
5.4 화합물 6∼10 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.09mg의 화합물 6을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.05mg의 화합물 7을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.12mg의 화합물 8을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.48mg의 화합물 9를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.02mg의 화합물 10을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
5.4 화합물 11∼15 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 112.98mg의 화합물 11을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 108.94mg의 화합물 12를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.01mg의 화합물 13을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.37mg의 화합물 14를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 104.91mg의 화합물 15를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
5.5 화합물 16∼20 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.09mg의 화합물 11을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.05mg의 화합물 12를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.12mg의 화합물 13을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.48mg의 화합물 14를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.02mg의 화합물 15를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
5.6 화합물 21∼42 투여 제제의 조제
조제 방법은 상기와 동일하며, 용액 중의 활성제의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
6. 실험 방법
MDA-MB-231 세포를, 10% 우태아 혈청 FBS(GIBCO, USA)를 포함하는 DMEM 배지에서 배양했다. 세포를 5% CO2를 포함하는 37℃의 인큐베이터에서 배양했다.
세포 접종법에 의한 종양 누드마우스 피하 이식 모델의 구축: 지수 증식기의 종양 세포를 채취하고, 세포수 계측 후에 1×PBS에 재현탁하고, 세포 농도를 1×107/ml로 조정하였다. 1mL의 시린지(침 No.4)로 누드마우스 우배부(右背部) 피하에 종양 세포를, 1×106/0.1ml/마우스로 접종했다.
종양 체적이 100∼200 mm3로 된 시점에서, 각 군의 종양의 차가 평균값의 10% 미만이 되도록, 각 군에 마우스 5마리로 난괴법에 의해 동물을 랜덤으로 군분류했다. 군분류하는 날을 Day 0으로 하고, 군분류하는 날에 투여했다.
실험 기간을 3주일로 하고, 실험 기간 중, 동물 체중 및 종양 사이즈를 주에 2회 측정했다. 매일 임상 증상을 관찰하여 기록했다. 실험의 최종일에, 동물을 죽이고, 체중을 칭량하고, 종양을 추출하고, 칭량하고 촬영하고 기록했다.
모든 동물 실험 조작은, 동물 사용 및 관리 규칙에 엄격하게 따른다. 종양 관련 파라미터의 계산은, 중국 CFDA에 의한 『세포 상해성 항종양 약물의 비임상 연구 기술을 위한 가이드라인』을 참조하였다.
종양 체적(Tumor volume, TV)의 계산 공식은 TV=a×b2/2이다. 식 중, a, b는 각각 측정된 종양의 길이 및 폭을 나타낸다. 상대 종양 체적(relative Tumor volume, RTV)의 계산 공식은 RTV=Vt/V0이다. 식 중, V0는 군분류하고 투여했을 때의 종양 체적을 나타내고, Vt는 측정 시의 종양 체적을 나타낸다. 항종양 활성의 평가 지표로서 상대 종양 증식율 T/C(%) 및 종양 억제율(%)을 사용하고, 계산 공식은 각각 T/C(%)=(TRTV/CRTV)×100%이다. TRTV는 치료군의 RTV를 나타내고, CRTV는 음성 대조군의 RTV를 나타낸다. 종양 억제율(%)=(음성 대조군의 평균종양 중량-투여군의 평균 종양 중량)/음성 대조군의 평균종양 중량×100%.
종양 담지 동물의 체중 변화(%)의 계산은 하기와 같다. (측정 시의 체중-군분류 시의 체중)/군분류 시의 체중×100.
7. 자료 분석
Microsoft Office Excel 2007 소프트웨어를 사용하여 실험 자료를 계산하고, 및 관련 통계 처리를 행하였다. 데이터는 특별히 한정되지 않는 한, 평균값±표준 오차(Mean±SE)로서 표시하고, 2군의 비교는 t 검정으로 행하였다.
8. 결과 및 보고서
중국 CFDA에 의한 『세 포상해성 항종양 약물의 비임상 연구 기술을 위한 가이드라인』(2006년 11월)에 기초하여, T/C(%)≤40%, 또한 통계학 분석에 의해 p<0.05의 것이 유효한 것은, 표 4에 나타나 있다.
[표 4]
Figure pct00228
실험 결과에 의하면, 본 발명의 화합물은, 인간 유방암 MDA-MB-231의 누드마우스 이식 종양에 대하여 양호한 억제 작용을 가지고, 또한 이리노테칸 및 nktr-102보다 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 45 인간 췌장암 MIA Paca-2의 누드마우스 이종 이식 모델에서의 억제 작용
1. 실험 목적
본 연구는, 인간 췌장암 MIA Paca-2의 누드마우스 이식 종양 모델을 사용하고, 화합물 1∼42의 생체 내에서의 항종양 활성을 평가한다.
2. 실험 동물
2.1 동물 종류
마우스.
2.2 품종
BALB/c-nu/nu 누드마우스.
2.3 성별
웅성.
2.4 수
300.
2.5 연령
6∼8 주.
2.6 체중
20-22 g±20% 체중 평균값.
2.7 동물 자원(공급자)
상해 서보(西普)-필개(必凱) 실험동물 유한공사(BK), 허가증번호 SCXK(호) 2008-0016.
2.8 실험 동물 관리
모든 실험 동물을 SPF 레벨의 실험실에서 사육하였다.
2.8.1 동물 신분의 식별 방법
각 케이지에 실험 번호, 실험군별, 실험자 이름, 마우스 품종 및 성별 등의 정보가 기재되어 있는 신분 카드가 부착되어 있고, 마우스는 이어링에 의해 마킹했다.
2.8.2 랜덤한 군분류
종양 체적이 150∼200 mm3로 된 후에, 각 군에 마우스 5마리, 각 군 내의 종양 체적 및 마우스 체중이 균일하도록, 난괴법에 의해 군분류했다. 각 군의 종양체 곱의 평균값의, 모든 실험 동물의 종양 체적의 평균값과의 차가 ±10% 이하였다.
2.8.3조작 관리 규칙
모든 실험 동물의 조작 및 관리는, 실험 동물 사용 및 관리 가이드라인에 엄격하게 따른다.
2.8.4 사육 조건
거주 조건: IVC 시스템, 각 케이지에 5마리
온도: 25℃±1℃
습도: 65%±10%
광조사: 12시간의 밤낮 교대
2.8.5 사료
북경 과옥(科澳) 협력 사료 유한공사로부터 구입한 조사 래트·마우스 사료.
자유롭게 섭취시켰다.
2.8.6 음수
도시 수도수.
여과하고 고압 멸균하여 음수시켰다.
2.8.7 까는 재료
상해 무생(茂生) 유도체 과기 유한공사로부터 구입한 옥수숫대. 고압 멸균하여 사용했다. 주에 2회 까는 재료를 교환했다.
2.8.8 적응 기간
실험 전에 마우스에 적어도 1주일의 환경 적응 기간을 주었다.
3. 실험 재료
3.1 실험 대상 의약품
이리노테칸(원약), nktr-102(원약)은 구입품이며, 화합물 1∼42는 모두 브라이트진바이오-메디컬테크놀로지컴퍼니리미티드티드에 의해 제공되는 것이다.
3.2 그 외의 화학 시약 및 재료
3.2.1 생리식염수
상해 화원(華源)장당(長富)약업(집단)유한공사로부터 구입한 생리식염수(상해, 중국).
3.2.2 무균 시린지
상해 강덕래(康德萊) 기업 발전 집단 고훈 유한공사(상해, 중국)로부터 구입한 1ml의 무균 시린지.
3.2.3 세포주
인간 췌장암 MIA Paca-2는 상해 중국 과학원 세포 생물 연구소로부터 구입했다.
MIA Paca-2를, 10% 우태아 혈청 FBS(GIBCO, USA) 및 2.5% HS를 포함하는 DMEM 배지(GIBCO, USA)에서 배양하고, 5% CO2를 포함하는 37℃의 인큐베이터에서 배양했다.
3.2.4 메트리젤(BD Matrigel)
미국 BD사에서 구입한 메트리젤 Matrigel.
3.3 설비
ESCO로부터 구입한 생물학적 안전 캐비넷(형식번호: AC2-6E1),
Thermo Scientific Forma로부터 구입한 CO2 수밀성 인큐베이터(형식번호: 3111),
Olympus로부터 구입한 도립 현미경(형식번호: CKX41SF),
상해의료기계공업(집단)유한공사로부터 구입한 전기 흡인 장치(형식번호: YX930D),
METTLER TOLEDO로부터 구입한 천평(METTLER TOLEDO AB135-S),
북경 뢰발이(雷勃爾) 원심기 유한공사로부터 구입한 저속 원심기(형식번호: LD5-2A),
계림 광목수자측공(廣陸數字測控) 고훈 유한공사로부터 구입한 전자 디지털 디지매틱 캘리퍼스(형식번호: SF2000).
4. 실험 설계
인간 췌장암 MIA Paca-2의 누드마우스 피하 이식 종양 모델을 구축하고, 각 마리에 대하여 3×106개 세포를 접종했다.
금회의 실험은 이하(표 6)의 투여량 및 투여 태양을 설계했다.
[표 5]
Figure pct00229
5. 화합물의 조제
조제 방법은 브라이트진바이오-메디컬테크놀로지컴퍼니리미티드티드에 의해 제공되는 것이다.
단회 투여에 필요한 용량:
20g(body weight)x10(animals)x10mL/kg/1000x1.5=3mL
5.1 이리노테칸 투여 제제의 조제
12.0mg의 이리노테칸을 칭량하고, 0.15ml의 1% 락트산을 가하여, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하고, 2.85ml의 1% 소르비톨 수용액을 더욱 가하고, 선회 진동하여 균일하게 혼합하고, 용액 중의 1% 락트산, 1% 소르비톨 수용액의 비율을 약 5:95(v/v)로 했다.
용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
5.2 nktr-102투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 88.55mg의 nktr-102를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
5.3 화합물 1∼5 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.85mg의 화합물 1을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.80mg의 화합물 2를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.88mg의 화합물 3을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 111.24mg의 화합물 4를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.78mg의 화합물 5를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
5.4 화합물 6∼10 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.09mg의 화합물 6을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.05mg의 화합물 7을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.12mg의 화합물 8을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.48mg의 화합물 9를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.02mg의 화합물 10을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
5.5 화합물 11∼15 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 112.98mg의 화합물 11을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 108.94mg의 화합물 12를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.01mg의 화합물 13을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.37mg의 화합물 14를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 104.91mg의 화합물 15를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
5.6 화합물 16∼20 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.09mg의 화합물 11을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.05mg의 화합물 12를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.12mg의 화합물 13을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.48mg의 화합물 14를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.02mg의 화합물 15를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
5.7 화합물 21∼42 투여 제제의 조제
조제 방법은 상기와 동일하며, 용액 중의 활성제의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
6. 실험 방법
MIA Paca-2 세포를, 10% 우태아 혈청 FBS(GIBCO, USA) 및 2.5% HS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양했다. 세포를 5% CO2를 포함하는 37℃의 인큐베이터에서 배양했다.
세포 접종법에 의한 종양 누드마우스 피하 이식 모델의 구축: 지수 증식기의 종양 세포를 채취하고, 세포수 계측 후에 1×PBS에 재현탁하고, 세포 농도를 3×107/ml로 조정했다. 1mL의 시린지(침 No.4)로 누드마우스 우배부 피하에 종양 세포를, 3×106/0.1ml/마우스로 접종했다.
종양 체적이 100∼200 mm3로 된 시점에서, 각 군의 종양의 차가 평균값의 10% 미만이 되도록, 각 군에 마우스 5마리로 난괴법에 의해 동물을 랜덤으로 군분류했다. 군분류하는 날을 Day1으로 하고, 군분류하는 날에 투여했다.
실험 기간을 3주일로 하고, 실험 기간 중, 동물 체중 및 종양 사이즈를 주에 2회 측정했다. 매일 임상 증상을 관찰하고 기록했다. 실험의 최종일에, 동물을 죽이고, 체중을 칭량하고, 종양을 추출하고, 칭량하고 촬영하고 기록했다.
모든 동물 실험 조작은, 동물 사용 및 관리 규칙에 엄격하게 따른다. 종양 관련 파라미터의 계산은, 중국 SFDA에 의한 『세포 상해성 항종양 약물의 비임상 연구 기술을 위한 가이드라인』을 참조한다.
종양 체적(Tumor volume, TV)의 계산 공식은 TV=a×b2/2이다. 식 중, a, b는 각각 측정된 종양의 길이 및 폭을 나타낸다. 상대 종양 체적(relative Tumor volume, RTV)의 계산 공식은 RTV=Vt/V0이다. 식 중, V0는 군분류하고 투여했을 때의 종양 체적을 나타내고, Vt는 측정 시의 종양 체적을 나타낸다. 항종양 활성의 평가 지표로서 상대 종양 증식율 T/C(%) 및 종양 억제율(%)을 사용하고, 계산 공식은 각각 T/C(%)=(TRTV/CRTV)×100%이다. TRTV는 치료군의 RTV를 나타내고, CRTV는 음성 대조군의 RTV를 나타낸다. 종양 억제율(%)=(음성 대조군의 평균 종양 중량-투여군의 평균 종양 중량)/음성 대조군의 평균 종양 중량×100%.
종양 담지 동물의 체중 변화(%)의 계산은 하기와 같다. (측정 시의 체중-군분류 시의 체중)/군분류 시의 체중×100.
중국 SFDA에 의한 『세포 상해성 항종양 약물의 비임상 연구 기술을 위한 가이드라인』(2006년 11월)에 기초하여, T/C(%)≤40%, 또한 통계학 분석에 의해 P <0.05의 것이 유효하다.
7. 자료 분석
Microsoft Office Excel 2007 소프트웨어를 사용하여 실험 자료를 계산하고, 및 관련 통계 처리를 행하였다. 데이터는 특별히 한정되지 않는 한, 평균값±표준 오차(Mean±SE)로서 표시하고, 군끼리의 비교는 t-검정으로 행하고, P<0.05인 경우에 유의차 있음으로 인정된다.
8. 결과 및 보고서
중국 CFDA에 의한 『세포 상해성 항종양 약물의 비임상 연구 기술을 위한 가이드라인』(2006년 11월)에 기초하여, T/C(%)≤40%, 또한 통계학 분석에 의해 P <0.05의 것이 유효한 것은, 표 6에 나타나 있다.
[표 6]
Figure pct00230
실험 결과에 의하면, 본 발명의 화합물은, 인간 췌장암 MIA Paca-2의 누드마우스 이식 종양에 대하여 양호한 억제 작용을 가지고, 또한 이리노테칸 및 nktr-102보다 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 46 인간 위암 NCI-N87 세포주의 누드마우스 이식 종양 모델에서의 종양의 생체내 증식에 대한 억제 작용
1. 실험 목적
공시 약물인 화합물 1∼42의, 인간 위암 NCI-N87 세포주의 누드마우스 이식 종양 모델에서의 종양의 생체내 증식에 대한 억제 작용을 평가한다.
2. 실험 재료
2.1 시료
이리노테칸(원약), SN-38, 10-하이드록시캠토테신, 루비테칸, nktr-102는 구입품이며, 화합물 1∼42는 모두 브라이트진바이오-메디컬테크놀로지컴퍼니리미티드티드에 의해 제공되는 것이다.
2.2 시약
RPMI-1640 배양액, 우태아 혈청(FBS), 트립신, 페니실린-스트렙토마이신, 생리식염수.
2.3 실험 동물
웅성 BALB/c 누드마우스(마리수: 150마리; 주령: 6∼8주)를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.로부터 구입하고, 온도 20∼25 ℃, 상대 습도 40% ∼70%, 12시간 명, 12시간 암의 조명 조건, 동물이 자유롭게 물·먹이를 섭취하는 소주성소(聖蘇)신약개발유한공사의 SPF 동물 사육실에서 사육하였다. 사육하고 약 1주일 후, 수의사에 의한 검사로 신체 상황이 양호한 것으로 판단된 마우스를 금회의 실험용 마우스로 했다. 군할당에 마커에 의해 동물의 꼬리의 밑둥치에 표시하고, 군분류 후에 각 동물을 이어컷의 방법에 의해 표시했다.
2.4가 이식성 종양주
중국 과학원 전형 배양물 보존 위원회 세포 뱅크(CAS, 본 실험실에서는 액화 질소 중에 동결 보존)로부터 입수한 인간 위암 세포NCI-N87.
3 실험 방법
3.1 NCI-N87 세포　배양
5% CO2, 37℃의 배양 조건 하에서, NCI-N87 세포를, 10% 우태아 혈청 함유RPMI-1640 배양액 중에서 통상의 세포　배양을 행하고, 0.25% 트립신 소화법에 의해 계대했다. 세포의 증식 상황에 따라, 계대를 주에 1∼2 회 행하고, 계대 비율을 1:2∼1:6으로 했다.
3.2 동물 모델의 구축
지수 증식기의 NCI-N87 세포를 채취하고, 세포수 계측 후에 무혈청 RPMI-1640 배지에 재현탁하고, 세포 농도를 5×107세포/mL로 조정하고, 피펫으로 세포를 풀고, 균일하게 분산시킨 후에 50mL의 원심관에 넣고, 원심관을 아이스박스에 넣었다. 세포현탁액을 1mL의 시린지로 채취하고, 누드마우스의 우측 전방 겨드랑이 피하에 주사를 놓고, 각 동물에 100μL(5×106세포/마리) 접종하여, NCI-N87의 누드마우스 이식 종양 모델을 구축했다. 접종 후에 정기적으로 동물의 상태 및 종양의 증식 상태를 관찰하고, 전자 디지매틱 캘리퍼스를 사용하여 종양 직경을 측정하고, 데이터를 직접적으로 Excel표에 입력하고, 종양 체적을 계산했다. 종양 체적이 100∼300 mm3로 된 후에, 건강 상태가 양호하며, 종양 체적이 비슷한 동물을 225마리 선택하고, 난괴법에 의해 45조로 나누었다(n=5). 실험 개시 후에 종양 직경을 주에 2회 측정하고, 종양 체적을 계산하고, 또한 동물 체중을 칭량하고 기록했다.
종양 체적(TV)의 계산 공식은 하기와 같다.
TV(mm3)=l×w2/2
식 중, l은 종양 장경(mm)을 나타내고, w는 종양 단경(mm)을 나타낸다.
3.3 용매의 조제
0.5g의 소르비톨을 칭량하여 50mL의 원심관에 넣고, 원심관에 50mL의 주사용수를 가하고, 고형물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 농도 1%의 소르비톨 수용액(w/v)을 조제하고, 4℃의 냉장고에 보존해 두었다.
3.4 투여 제제의 조제
3.4.1 이리노테칸 투여 제제의 조제
12.0mg의 이리노테칸을 칭량하고, 0.15ml의 1% 락트산을 가하여, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하고, 2.85ml의 1% 소르비톨 수용액을 더욱 가하고, 선회 진동하여 균일하게 혼합하고, 용액 중의 1% 락트산, 1% 소르비톨 수용액의 비율을 약 5:95(v/v)로 했다. 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.2 nktr-102투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 88.55mg의 nktr-102를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.3 화합물 1∼5 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.85mg의 화합물 1을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.80mg의 화합물 2를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.88mg의 화합물 3을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 111.24mg의 화합물 4를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.78mg의 화합물 5를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.4 화합물 6∼10 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.09mg의 화합물 6을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.05mg의 화합물 7을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.12mg의 화합물 8을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.48mg의 화합물 9를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.02mg의 화합물 10을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.5 화합물 11∼15 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 112.98mg의 화합물 11을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 108.94mg의 화합물 12를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.01mg의 화합물 13을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.37mg의 화합물 14를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 104.91mg의 화합물 15를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.6 화합물 16∼20 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.09mg의 화합물 11을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.05mg의 화합물 12를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.12mg의 화합물 13을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.48mg의 화합물 14를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.02mg의 화합물 15를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.4.7 화합물 21∼42 투여 제제의 조제
조제 방법은 상기와 동일하며, 용액 중의 활성제의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.5 동물의 군분류 및 투여
동물의 군분류 및 투여 태양은 표 7과 같다.
활성제가 이리노테칸인 군(군 1∼군 8). 군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제1 군은 용매 대조군이며, 미정맥 주사에 의해 블랭크 용매를 4일에 1회, 합계하여 3회(Q4D×3) 투여했다. 제2∼제8 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 이리노테칸, nktr-102, 화합물 1∼5를, 모두 40mg·kg-1(이리노테칸 함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여하였다.
활성제가 SN-38인 군(군 9∼군 13).
군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제9∼제13 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 화합물 6∼10을, 모두 40mg·kg-1(SN-38 함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여했다.
활성제가 10-하이드록시캠토테신인 군(군 14∼군 18). 군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제14∼제18 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 화합물 11∼15를, 모두 40mg·kg-1(10-하이드록시캠토테신함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여했다.
활성제가 루비테칸인 군(군 19∼군 23). 군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제19∼제23 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 화합물 16∼20을, 모두 40mg·kg-1(루비테칸 함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여했다.
군 24∼군 45의 투여 태양은 상기와 같다.
[표 7]
Figure pct00231
3.6 실험 종료
실험 종료 후, 체중을 칭량하고, 종양 직경을 측정한 후에 동물을 안락사시켰다(CO2). 종양 조직을 추출하여 칭량하고, 종양 중량 억제율을 계산했다. 종양 조직 칭량 후에, 앞으로의 분석을 위하여, -70℃ 미만의 냉장고에 옮겨서 보존했다.
4. 데이터 기록, 계산 공식
상대 종양 체적(RTV)의 계산 공식은 하기와 같다.
RTV=TVt/TVinitial
식 중, TVinitial은 군분류하고 투여했을 때 측정한 종양 체적이며, TVt는 투여 기간 동안 각 측정 시의 종양 체적이다.
상대 종양 증식율(%T/C)의 계산 공식은 하기와 같다.
%T/C=100%×(RTVT/RTVC)
식 중, RTVT는 치료군의 RTV를 나타내고, RTVC은 용매 대조군의 RTV를 나타낸다.
종양 증식 억제율TGI(%)의 계산 공식은 하기와 같다.
TGI=100% ×[1-(TVt (T)-TVinitial (T)/(TVt (C)-TVinitial (C)]
식 중, TVt(T)는 치료군의 각 측정 시의 종양 체적을 나타내고, TVinitial(T)는 군분류하고 투여했을 때의 치료군의 종양 체적을 나타내고, TVt(C)는 용매 대조군의 각 측정 시의 종양 체적을 나타내고, TVinitial(C)는 군분류하고 투여했을 때의 용매 대조군의 종양 체적을 나타낸다.
동물의 체중 저감율의 계산 공식은 하기와 같다.
동물의 체중 저감율=100% ×(BWinitial-BWt)/BWinitial
식 중, BWt는 투여 기간 동안 각 측정 시의 동물 체중을 나타내고, BWinitial은 군분류하고 투여했을 때의 동물 체중을 나타낸다.
종양 중량 억제율IR(%)의 계산 공식은 하기와 같다.
IR(%)=100% ×(WC-WT)/WC
식 중, WC는 대조군의 종양 중량을 나타내고, WT는 치료군의 종양 중량을 나타낸다.
5. 통계적 분석 방법
Microsoft Office Excel 2007 소프트웨어를 사용하여 실험 자료를 계산하고, 및 관련 통계 처리를 행하였다. 데이터는 특별히 한정되지 않는 한, 평균값±표준 오차(Mean±SE)로서 표시하고, 2군의 비교는 t-검정으로 행하였다.
6. 실험 관찰
실험 중, 실험자 및 수의사는 실험 동물의 징후 및 건강 상태를 계속해서 관찰하지 않으면 안된다. 동통, 우울증, 활동 저하 등 동물의 어떠한 이상 증상도 실험 노트에 기록할 필요가 있다. 실험 동물의 이상 상황이 IACUC 관련 동물 복지 법규의 규정에 일치하지 않는 경우, 수의사는 실험 정지의 여부를 판단하고, 또한 실험 책임자에게 통지할 수 있다.
7. 결과
인간 암 이종 이식 종양 모델에 대하여, 실험 평가 지표로서 상대 종양 증식율 T/C(%)를 권장한다. 증식비가 낮을수록, 종양 억제 효과가 양호한 것은 표 8에 나타나 있다.
[표 8]
Figure pct00232
실험 결과에 의하면, 본 발명의 화합물은, 인간 위암 NCI-N87 세포주의 누드마우스 이식 종양 모델에서의 종양의 증식에 대하여 양호한 억제 작용을 가지고, 또한 이리노테칸 및 nktr-102보다 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 47 동소성 U87MG 누드마우스 뇌글리오마 모델 생존율에 대한 영향
1. 실험 목적
공시 약물인 화합물 1∼42의, 동소성 U87MG 누드마우스 뇌글리오마 모델 생존율에 대한 영향을 평가한다.
2. 실험 재료
2.1 시료
이리노테칸(원약), nktr-102(원약)은 구입품이며, 화합물 1∼42는 모두 브라이트진바이오-메디컬테크놀로지컴퍼니리미티드티드에 의해 제공되는 것이다.
2.2 시약
RPMI-1640 배양액, 트립신, 페니실린-스트렙토마이신, 생리식염수.
2.3 실험 동물
웅성 BALB/c 누드마우스(마리수: 300마리; 주령: 6∼8주)를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.로부터 구입하고, 온도 20∼25 ℃, 상대 습도 40% ∼70%, 12시간 명, 12시간 암의 조명 조건, 동물이 자유롭게 물·먹이를 섭취하는 SPF 동물 사육실에서 사육하였다. 사육하고 약 1주일 후, 수의사에 의한 검사로 신체 상황이 양호로 판단된 마우스를 금회의 실험용 마우스로 했다. 군할당에 마커에 의해 동물의 꼬리의 밑둥치에 표시하고, 군분류 후의 각 동물을 이어컷의 방법에 의해 표시했다.
2.4 가이식성 종양주
중국 과학원 전형 배양물 보존 위원회 세포 뱅크(CAS, 본 실험실에서는 액화 질소 중에 동결 보존)로부터 입수한 글리오마 세포 U87MG.
3. 실험 방법
NCI-N87 세포　배양
5% CO2, 37℃의 배양 조건 하에서, NCI-N87 세포를 RPMI-1640 배양액 중에서 통상의 세포　배양을 행하고, 0.25% 트립신 소화법에 의해 계대했다. 세포의 증식 상황에 따라, 계대를 주에 1∼2 회 행하고, 계대 비율을 1:2∼1:6으로 했다.
3.1 동물 모델의 구축
지수 증식기의 NCI-N87 세포를 채취하고, 세포수 계측 후에 무혈청 RPMI-1640 배지에 재현탁하고, 세포 농도를 1×108세포/mL로 조정하고, 피펫으로 세포를 풀고, 균일하게 분산시킨 후에 50mL의 원심관에 넣고, 원심관을 아이스박스에 넣었다. 세포 현탁액을 1mL의 시린지로 채취하고, 동물 뇌 정위 고정 장치의 보조에 의해, 마이크로인젝션법으로 인간 글리오마 세포 U87MG 세포 1μL(1×105세포/마리)를 생체외에서 배양하고, 동소성 U87MG 뇌글리오마 모델을 구축하고, 접종 후에 정기적으로 동물의 상태를 관찰했다. 접종 후 12일째에, 동물을 225마리 선택하고, 난괴법에 의해 45조로 나누었다(n=5).
3.2 투여 제제의 조제
3.2.1 이리노테칸 투여 제제의 조제
12.0mg의 이리노테칸을 칭량하고, 0.15ml의 1% 락트산을 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하고, 2.85ml의 1% 소르비톨 수용액을 더욱 가하고, 선회 진동하여 균일하게 혼합하고, 용액 중의 1% 락트산, 1% 소르비톨 수용액의 비율을 약 5:95(v/v)으로 했다. 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
3.2.2 nktr-102 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 88.55mg의 nktr-102를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
3.2.3 화합물 1∼5 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.85mg의 화합물 1을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.80mg의 화합물 2를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.88mg의 화합물 3을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 111.24mg의 화합물 4를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.78mg의 화합물 5를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 이리노테칸의 유리형의 농도를 약 4.0mg·mL-1로 했다.
3.2.4 화합물 6∼10 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.09mg의 화합물 6을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.05mg의 화합물 7을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.12mg의 화합물 8을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.48mg의 화합물 9를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.02mg의 화합물 10을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 SN-38의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.2.5 화합물 11∼15 투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 112.98mg의 화합물 11을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 108.94mg의 화합물 12를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.01mg의 화합물 13을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.37mg의 화합물 14를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 104.91mg의 화합물 15를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 10-하이드록시캠토테신의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.2.6 화합물 16∼20투여 제제의 조제
매회의 투여에 앞서, 113.09mg의 화합물 11을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 109.05mg의 화합물 12를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 113.12mg의 화합물 13을 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 110.48mg의 화합물 14를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
매회의 투여에 앞서, 105.02mg의 화합물 15를 정확하게 칭량하고, 2.3ml의 생리식염수를 가하고, 약물이 완전히 용해할 때까지 선회 진동하여, 용액 중의 루비테칸의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.2.7 화합물 21∼42 투여 제제의 조제
조제 방법은 상기와 동일하며, 용액 중의 활성제의 유리형의 농도를 4.0mg·mL-1로 했다.
3.3 동물의 군분류 및 투여
동물의 군분류 및 투여 태양은 표 9와 같다.
활성제가 이리노테칸인 군(군 1∼군 8).
군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제1 군은 용매 대조군이며, 미정맥 주사에 의해 블랭크 용매를 4일에 1회, 합계하여 3회(Q4D×3) 투여했다. 제2∼제8 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 이리노테칸, nktr-102, 화합물 1∼5를, 모두 40mg·kg-1(이리노테칸 함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여했다.
활성제가 SN-38인 군(군 9∼군 13).
군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제 9∼제13 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 화합물 6∼10을, 모두 40mg·kg-1(SN-38 함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여했다.
활성제가 10-하이드록시캠토테신인 군(군 14∼군 18).
군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제14∼제18 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 화합물 11∼15를, 모두 40mg·kg-1(10-하이드록시캠토테신함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여했다.
활성제가 루비테칸인 군(군 19∼군 23).
군분류하는 날에 초회의 투여를 시작하고, 21일 후에 실험을 종료시키고, 투여 용량을 모두 10mL·kg-1로 했다. 제19∼제23 군은 각각 미정맥 주사에 의해 공시 시료인 화합물 16∼20을, 모두 40mg·kg-1(루비테칸 함유량 기준으로)의 투여량으로, Q4D×3으로 투여했다.
군 24∼군 45의 투여 태양은 상기와 같다.
[표 9]
Figure pct00233
4. 데이터 기록, 계산 공식
동물의 생존 시간을 기록했다.
5. 통계 분석 방법
Microsoft Office Excel 2007 소프트웨어를 사용하여 실험 자료를 계산하고, 및 관련 통계 처리를 행하였다. 2군의 비교는 t 검정으로 행하였다.
6. 결과
표 10에 나타내고 있다.
[표 10]
Figure pct00234
실험 결과에 의하면, 본 발명의 화합물은, 글리오마에 대하여 양호한 억제 작용을 가지고, 또한 이리노테칸 및 nktr-102보다 우수한 것을 알 수 있다.

Claims (14)

  1. 하기 구조식(III)을 가지는, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    [화학식 1]
    Figure pct00235

    (상기 구조식(III)) 중에서, R은 유기 중심이며, POLY는 폴리머이며, L은 다가 링커이며, T는 표적 분자이며, D는 활성제이며, q는 3∼8이 임의의 정수이며, 다만, D는 하기 식으로 표시되는 캠토테신계 약물이며;
    [화학식 2]
    Figure pct00236

    (식 중, R1∼R5는 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아실기, 알킬기, 치환 알킬기, 알콕시기, 치환 알콕시기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 하이드록시기, 시아노기, 니트로기, 아지드기, 아미드기, 히드라진, 아민기, 치환 아민기, 하이드록시카르보닐기, 알콕시카르보닐기, 알콕시카르보닐옥시기, 카르바모일옥시기, 아릴술포닐옥시기, 알킬술포닐옥시기로부터 선택되고, R6는, H 또는 OR8이며, R8은, 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 할로겐화 알킬기, 또는 하이드록시알킬기이며, R7은, 하이드록시기임)).
  2. 제1항에 있어서,
    D는 이리노테칸, SN-38, 10-하이드록시캠토테신 또는 루비테칸인, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    POLY는, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리비닐프로리돈, 폴리(하이드록시알킬메타크릴산 아민), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리사카라이드, 폴리(α-하이드록시산), 폴리아크릴산, 폴리아세트산 비닐, 폴리포스파진, 폴리옥사졸린 또는 폴리(N-아크릴로일모르폴린)인, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    POLY는,
    [화학식 3]
    Figure pct00237

    이며, 식 중, n은 5∼500이며, 바람직하게는 5∼200이며, 가장 바람직하게는 113인, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    다가 링커 L은 하기 식으로 표시되는 것인, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    [화학식 4]
    Figure pct00238

    (식 중, 기호 「*」는 다가 링커 L과 표적 분자 T와의 결합점을 나타내고, 「#」은 다가 링커 L과 활성제 D와의 결합점을 나타내고, 「%」는 다가 링커 L과 POLY와의 결합점을 나타내며, m, m'는 각각 1∼20의 임의의 정수이며, l, k는 각각 1∼10의 임의의 정수임).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    다가 링커 L은 하기 식으로 표시되는 것인, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    [화학식 5]
    Figure pct00239
    .
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    T는, 「아르기닌-글리신-아스파라긴산」 서열을 포함하는 RGD 펩티드, tLyp-1, Lyp-1, RPARPAR, Angiopep2, GE11 또는 엽산인, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    T는 iRGD 또는 cRGD인, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다분지 약물 콘쥬게이트는, 하기 구조식(IV), 구조식(V) 또는 구조식(VI)으로 표시되는 구조를 가지는, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    [화학식 6]
    Figure pct00240

    [화학식 7]
    Figure pct00241

    [화학식 8]
    Figure pct00242

    (식 중, n은 5∼500이며, 바람직하게는 5∼200이며, 가장 바람직하게는 113임).
  10. 하기 구조를 가지는, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    화합물 1:
    [화학식 9]
    Figure pct00243

    화합물 2:
    [화학식 10]
    Figure pct00244

    화합물 3:
    [화학식 11]
    Figure pct00245

    화합물 4:
    [화학식 12]
    Figure pct00246

    화합물 5:
    [화학식 13]
    Figure pct00247

    화합물 6:
    [화학식 14]
    Figure pct00248

    화합물 7:
    [화학식 15]
    Figure pct00249

    화합물 8:
    [화학식 16]
    Figure pct00250

    화합물 9:
    [화학식 17]
    Figure pct00251

    화합물 10:
    [화학식 18]
    Figure pct00252

    화합물 11:
    [화학식 19]
    Figure pct00253

    화합물 12:
    [화학식 20]
    Figure pct00254

    화합물 13:
    [화학식 21]
    Figure pct00255

    화합물 14:
    [화학식 22]
    Figure pct00256

    화합물 15:
    [화학식 23]
    Figure pct00257

    화합물 16:
    [화학식 24]
    Figure pct00258

    화합물 17:
    [화학식 25]
    Figure pct00259

    화합물 18:
    [화학식 26]
    Figure pct00260

    화합물 19:
    [화학식 27]
    Figure pct00261

    화합물 20:
    [화학식 28]
    Figure pct00262

    화합물 21:
    [화학식 29]
    Figure pct00263

    화합물 22:
    [화학식 30]
    Figure pct00264

    화합물 23:
    [화학식 31]
    Figure pct00265

    (식 중, R은,
    [화학식 32]
    Figure pct00266

    임)
    화합물 24:
    [화학식 33]
    Figure pct00267

    (식 중, R은,
    [화학식 34]
    Figure pct00268

    임)
    화합물 25:
    [화학식 35]
    Figure pct00269

    (식 중, R은,
    [화학식 36]
    Figure pct00270

    임)
    화합물 26:
    [화학식 37]
    Figure pct00271

    (식 중, R은,
    [화학식 38]
    Figure pct00272

    임)
    화합물 27:
    [화학식 39]
    Figure pct00273

    (식 중, R은,
    [화학식 40]
    Figure pct00274

    임)
    화합물 28:
    [화학식 41]
    Figure pct00275

    (식 중, R은,
    [화학식 42]
    Figure pct00276

    임)
    화합물 29:
    [화학식 43]
    Figure pct00277

    (식 중, R은,
    [화학식 44]
    Figure pct00278

    임)
    화합물 30:
    [화학식 45]
    Figure pct00279

    (식 중, R은,
    [화학식 46]
    Figure pct00280

    임)
    화합물 31:
    [화학식 47]
    Figure pct00281

    (식 중, R은,
    [화학식 48]
    Figure pct00282

    임)
    화합물 32:
    [화학식 49]
    Figure pct00283

    (식 중, R은,
    [화학식 50]
    Figure pct00284

    임)
    화합물 33:
    [화학식 51]
    Figure pct00285

    (식 중, R은,
    [화학식 52]
    Figure pct00286

    임)
    화합물 34:
    [화학식 53]
    Figure pct00287

    (식 중, R은,
    [화학식 54]
    Figure pct00288

    임)
    화합물 35:
    [화학식 55]
    Figure pct00289

    (식 중, R은,
    [화학식 56]
    Figure pct00290

    임)
    화합물 36:
    [화학식 57]
    Figure pct00291

    (식 중, R은,
    [화학식 58]
    Figure pct00292

    임)
    화합물 37:
    [화학식 59]
    Figure pct00293

    (식 중, R은,
    [화학식 60]
    Figure pct00294

    임)
    화합물 38:
    [화학식 61]
    Figure pct00295

    (식 중, R은,
    [화학식 62]
    Figure pct00296

    임)
    화합물 39:
    [화학식 63]
    Figure pct00297

    (식 중, R은,
    [화학식 64]
    Figure pct00298

    임)
    화합물 40:
    [화학식 65]
    Figure pct00299

    (식 중, R은,
    [화학식 66]
    Figure pct00300

    임)
    화합물 41:
    [화학식 67]
    Figure pct00301

    (식 중, R은,
    [화학식 68]
    Figure pct00302

    임)
    화합물 42:
    [화학식 69]
    Figure pct00303

    (식 중, R은,
    [화학식 70]
    Figure pct00304

    임).
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염과, 약학적으로 허용되는 부형제(賦形劑)를 포함하는, 약물 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의, 결장암, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 위암, 글리오마, 및, 유방, 난소, 결장, 신장, 담관, 폐 및 뇌의 악성 육종, 암 및 림프종을 치료하기 위한 약물의 제조를 위한 사용.
  13. 하기 식으로 표시되는 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 제조 방법으로서,
    [화학식 71]
    Figure pct00305

    (식 중, R은 유기 중심이며, POLY는 폴리머이며, L은 다가 링커이며, T는 표적 분자이며, D는 활성제이며, q는 3∼8이 임의의 정수이며, D는 하기 식으로 표시되는 캠토테신계 약물이며,
    [화학식 72]
    Figure pct00306

    (식 중, R1∼R5는 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아실기, 알킬기, 치환 알킬기, 알콕시기, 치환 알콕시기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 하이드록시기, 시아노기, 니트로기, 아지드기, 아미드기, 히드라진, 아민기, 치환 아민기, 하이드록시카르보닐기, 알콕시카르보닐기, 알콕시카르보닐옥시기, 카르바모일옥시기, 아릴술포닐옥시기, 알킬술포닐옥시기로부터 선택되고, R6는, H 또는 OR8이며, R8은, 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 할로겐화 알킬기, 또는 하이드록시알킬기이며, R7은, 하이드록시기임))
    (1) 활성제 D와 다가 링커 L을 연결하여, D-L 부분을 얻는 스텝,
    (2) D-L 부분과 멀티 암 폴리머인
    [화학식 73]
    Figure pct00307

    을 연결하여,
    [화학식 74]
    Figure pct00308

    를 얻는 스텝 및
    (3) 상기 스텝에서 얻어진
    [화학식 75]
    Figure pct00309

    와 표적 분자 T를 연결하는 스텝을 포함하는, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    D는, 이리노테칸, SN-38, 10-하이드록시캠토테신, 또는 루비테칸이며,
    멀티 암 폴리머인
    [화학식 76]
    Figure pct00310

    는, 3armPEG20K-SCM, 4armPEG20K-SCM, 또는 8armPEG20K-SCM이며,
    L은,
    [화학식 77]
    Figure pct00311

    이며(식 중, 기호 「*」는 다가 링커 L과 표적 분자 T와의 결합점을 나타내고, 「#」은 다가 링커 L과 활성제 D와의 결합점을 나타내고, 「%」는 다가 링커 L과 POLY와의 결합점을 나타냄),
    T는, iRGD, cRGD, tLyp-1, Lyp-1, RPARPAR, Angiopep2, GE11 또는 엽산인, 다분지 약물 콘쥬게이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 제조 방법.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11191843B2 (en) 2017-04-21 2021-12-07 Brightgene Bio-Medical Technology Co., Ltd. Multi-arm targeting anti-cancer conjugate
WO2019096096A1 (zh) * 2017-11-14 2019-05-23 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 多臂靶向偶联物
CN110256533B (zh) * 2018-03-12 2022-05-10 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 一种高纯度的多臂抗癌偶联物的提取方法
AU2019344783A1 (en) 2018-09-17 2021-04-08 The Children's Hospital Of Philadelphia Polymer-based macromolecular prodrugs
WO2021113643A2 (en) * 2019-12-04 2021-06-10 Dantari, Inc. Methods and compositions for synthesis of therapeutic nanoparticles
CN115443134A (zh) * 2020-06-19 2022-12-06 杭州多禧生物科技有限公司 细胞结合分子与喜树碱类似物的偶联物
CN114989415B (zh) * 2022-08-04 2022-10-21 北京鑫开元医药科技有限公司 主动靶向性磷脂及其合成工艺

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005028539A2 (en) 2003-09-17 2005-03-31 Nektar Therapeutics Al, Corporation Multi-arm polymer prodrugs
WO2009126349A2 (en) 2008-01-18 2009-10-15 Burnham Institute For Medical Research Methods and compositions related to internalizing rgd peptides
WO2010019233A1 (en) 2008-08-11 2010-02-18 Nektar Therapeutics Multi-arm polymeric alkanoate conjugates
WO2011063156A2 (en) 2009-11-18 2011-05-26 Nektar Therapeutics Acid salt forms of polymer-drug conjugates and alkoxylation methods
CN105396141A (zh) * 2015-12-10 2016-03-16 浙江大学 iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
RU2009114154A (ru) * 2006-09-15 2010-10-20 Энзон Фармасьютикалз, Инк. (Us) Полимерные пролекарства с направленной доставкой, содержащие полифункциональные линкеры
KR102320753B1 (ko) 2013-10-04 2021-11-02 프로린크스 엘엘시 Sn-38 서방성 컨쥬게이트
CN104784699B (zh) * 2014-01-20 2019-05-03 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 叶酸受体结合配体-药物偶联物
CA2951049C (en) 2014-06-03 2023-01-03 Jiarui Biopharmaceuticals, Ltd. Peptide-drug conjugates
CA2958495C (en) * 2014-08-22 2023-04-18 Yafei Shanghai Biolog Medicine Science & Technology Co., Ltd. Small molecule conjugates specifically activated in tumor microenvironment for targeting and use thereof
US11191843B2 (en) 2017-04-21 2021-12-07 Brightgene Bio-Medical Technology Co., Ltd. Multi-arm targeting anti-cancer conjugate

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005028539A2 (en) 2003-09-17 2005-03-31 Nektar Therapeutics Al, Corporation Multi-arm polymer prodrugs
WO2009126349A2 (en) 2008-01-18 2009-10-15 Burnham Institute For Medical Research Methods and compositions related to internalizing rgd peptides
WO2010019233A1 (en) 2008-08-11 2010-02-18 Nektar Therapeutics Multi-arm polymeric alkanoate conjugates
WO2011063156A2 (en) 2009-11-18 2011-05-26 Nektar Therapeutics Acid salt forms of polymer-drug conjugates and alkoxylation methods
WO2011063158A1 (en) 2009-11-18 2011-05-26 Nektar Therapeutics Salt form of a multi-arm polymer-drug conjugate
CN105396141A (zh) * 2015-12-10 2016-03-16 浙江大学 iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用

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