KR102320753B1 - Sn-38 서방성 컨쥬게이트 - Google Patents

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프로린크스 엘엘시
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Abstract

최적의 약물 방출 속도를 제공하고 대응하는 글루커로네이트 형성을 최소화하는 SN-38의 컨쥬게이트가 개시된다. 상기 컨쥬게이트는 베타-제거 메커니즘을 통하여 폴리에틸렌 글라이콜로부터 SN-38을 방출한다.

Description

SN-38 서방성 컨쥬게이트 {SLOW-RELEASE CONJUGATES OF SN-38}
[0001] 본 발명은 항암 약물, SN-38에 대한 서방성 시스템에 관한 것이다.
[0002] 캄프토테신 유사체 SN-38 (7-에틸-10-하이드록시캄프토테신)은 항암 약물 이리노테칸의 활성 대사물이다. 이것은 이리노테칸보다 ~1000x 활성이지만 극도로 열악한 수용성 (17 uM)와 빠른 제거로 인하여 치료적으로 유용하지는 않았다.
Figure 112016043182784-pct00001
[0003] 이리노테칸 자체는 임상적으로 사용되며, 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암, 난소암, 자궁 경부암, 췌장암, 위암 및 유방암에서 활성을 보여왔다. 몇몇 연구는 캄프토테신이 일반적으로 토포이소머레이즈 I의 억제에 대한 고유의 항종양 효과를 가지며, 효능은 장기간 동안 이 효소의 억제를 유지하는 것과 관련되어 있다는 것을 밝혔다 ("표적 도달 시간 (time over target)").충분한 시간 동안 캄프토테신의 효과적인 수준을 유지하기 위해, 일반적으로 상당히 높은 투여량의 약물이 투여되어, 비교적 빠른 시스템으로부터의 그 약물의 제거에 대응하게 된다. 이는 투여 후 초기에 높은 최대치의 약물 농도 (Cmax)를 초래하고, 이는 이리노테칸에 대한 투여량-제한 독성인, 예컨대 생명을 위협하는 설사와 같은 독성을 야기하는 것으로 여겨진다. SN-38의 높은 효능으로부터, 토포이소머레이즈 I 억제에 충분한 지속-상태 농도이지만 상기 독성 농도보다는 낮은 농도로 장기간 투입으로서 그 약물을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 펌프를 통한 이리노테칸의 장기간 투여를 이용한 임상 시험은 이러한 가설을 뒷받침하여 왔지만, 이는 SN-38에 대하여는 가능한 치료 전략일 수 없는데, 투여 제제 내에서 그 열악한 용해성 때문이다.
[0004] 이리노테칸은 간 카복시에스터레이즈에 의하여 SN-38로 전환된 후, 간 UGT1A에 의하여 그 10-글루커로나이드인 SN-38G로 대사된다. 글루커로나이드화는 담즙 분비를 촉진하고 장내 세균 글루커로니데이즈는 SN-38G의 SN-38로의 재전환을 불러 일으킨다. 장의 UGT1A이 상기 약물을 불활성 SN-38G로 도로 전환하지 않는다면, SN-38은 장에서 독성 효과를 야기할 수 있다. 따라서, SN-38G는 독성 SN-38의 제공원으로서 및 SN-38에 의하여 야기되는 중증 설사에 대한 방어 양자 모두로서 작용할 수 있다. 일반적으로, SN-38의 높은 수준은 SN-38G로의 글루커로나이드화 증가, 장 내로의 SN-38G의 분비 증가, 및 위장관 독성을 일으키는 세균 디글루커로나이드화를 결과한다.
[0005] 이리노테칸과 같은 전구약물로부터 보다는 용해성의, 장시간 순환하는 컨쥬게이트로부터의 SN-38의 느린 방출이 이러한 문제들에 대한 해법을 제공하는 것으로 보이고, 다양한 컨쥬게이션 전략들이 SN-38에 적용되어 왔다. 산소-20 글리시네이트 에스테르를 통한 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG)로의 컨쥬게이션은 (US 특허 8,299,089) 에스테르 가수분해로 인하여 비교적 빨리 (t1/2　=　12 h) 유리 SN-38을 방출하는, 상대적으로 수용성인 컨쥬게이트를 제공한다. SN-38이 신속히 방출되는, 폴리올 고분자로의 다른 에스테르-가교 화학 반응이 개시되었다 (미국 특허 공개 2010/0305149　A1). 산소-10에의 에스테르 결합을 통한 폴리글루타메이트-PEG 블록 공중합체로의 컨쥬게이션은 에스테르 가수분해에 의하여 다시 유리 SN-38을 방출하는 미셀 컨쥬게이트를 제공한다 (PCT 공개 WO2004/039869). 아마도 혈장 중의 에스터레이즈에 의하여 가속화되는, 수성 매질 중의 에스테르의 불안정성으로 인하여, SN-38에 대한 이러한 에스테르-기반 컨쥬게이션 전략은 SN-38에 대한 낮은-투여량의, 장기간 노출을 뒷받침하기에 적절치 않고, SN-38의 수준은 통상 투여 주기간 효과적인 수준 아래로 떨어진다. 컨쥬게이트는 통상 높은 수준으로 투여되어, 높은 최대치 농도의 SN-38을 제공하고, 높은 수준의 SN-38G 형성을 일으킨다.
[0006] 더욱 제어된 방출 속도를 갖는 PEG-SN-38 컨쥬게이트들이 PCT 공개 WO2011/140393에 개시되었다. 이들 컨쥬게이트는 적절한 링커의 선택을 통하여 광범위하게 조절가능한 속도로, 베타-제거 메커니즘을 통하여 SN-38을 방출한다. 이 약물에 거대 분자를 커플링시키는 것은 시클릭 알카인과 아지도의 축합 산물을 통해서였고, 비교적 불용성인 컨쥬게이트라는 결과를 낳았다. 여기서 종속적 청구 대상은 간단한 아마이드 결합의 존재로 인하여 용해도가 향상되었고, 실온의 완충액에서 시험관내 (in vitro) 안정하다. 본 발명의 발명자들은 방출 속도의 적절한 선택을 통하여 활성 SN-38로의 장기간 노출을 제공하는 동시에 생체내 (in vivo) SN-38G의 형성이 저감될 수 있다는 것을 예기치 않게 알아내었다. 본 발명은 SN-38에 대한 저투여량, 장기간 노출 용법을 가능하게 하는 속도로 비효소적 베타-제거 메커니즘을 통하여 유리 SN-38을 방출하도록 설계되고, 또한 투여 중에 형성되는 SN-38G의 양도 저감시키는 컨쥬게이트를 제공한다.
발명의 설명
[0007] 본 발명은 SN-38에 대한 저투여량, 장기간 노출 용법을 가능하게 하는 속도로 비효소적 베타-제거 메커니즘을 통하여 유리 SN-38을 방출하도록 설계되고, 또한 투여 중에 형성되는 SN-38G의 양도 저감시키는 컨쥬게이트를 제공한다. 또한, 상기 컨쥬게이트를 제조하는 방법 및 세포 과증식으로 특징지워지는 질병 및 질환의 치료에 그들을 사용하는 방법이 제공된다.
[0008] 따라서, 일 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 (I)을 갖는 컨쥬게이트를 제공하고,
Figure 112019095538363-pct00030
(I)
삭제
식 중, PEG는 선형이거나 분지형이고 q가 2-8일 때 다지형인 평균 분자량 20,000 내지 60,000 Da의 폴리에틸렌 글라이콜;
q= 1-8;
X는 O, NH, (CH2)m, OC(=O)(CH2)m, 또는 NHC(=O)(CH2)m인데, 여기서 m　=　1-6;
R1은 CN 또는 SO2NR2 2인데, 여기서 R2 각각은 독립적으로, 각각 필요에 따라 치환되는 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬알케닐, 알킬아릴, 또는 알킬헤테로아릴이거나, 또는 함께 고리를 형성할 수 있고;
Y　=　COR3 또는 SO2R3인데, 여기서 R3　=　OH, 알콕시 또는 NR4 2이고, 여기서 R4 각각은 독립적으로 알킬, 치환된 알킬이거나 또는 함께 고리를 형성할 수 있고;　및
L은 (CH2)r 또는 (CH2CH2O)p(CH2)r인데, 여기서 r　=　1-10이고 p　=　1-10이다.
[0009] 제2 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 (I)의 컨쥬게이트 및 그 중간물질의 제조 방법을 제공한다.
[0010] 제3 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 이용하는 SN-38의 지연 방출 방법을 제공한다.
[0011] 제4 측면에 있어서, 본 발명은 컨쥬게이트로부터 SN-38의 방출 속도를 조절함으로써 SN-38의 투여에 따라 형성되는 SN-38 글루커로나이드의 양을 최소화하는 방법을 제공한다.
[0012] 제5 측면에 있어서, 본 발명은 PEG 및 DMSO를 포함하는 SN-38을 용해시키는 제제 및 그 사용 방법에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
[0013] 도 1은 본 발명의 컨쥬게이트로부터 유리 SN-38의 방출을 보여준다.
[0014] 도 2는 본 발명의 아지도-링커-SN-38 (VII) 중간물질의 한 가지 제조방법을 보여준다.
[0015] 도 3은 THF/물 중의 트리메틸포스핀 및 아세트산을 이용한, 아지도-링커-SN-38 (VII)의 아민-링커-SN-38 (VIII)로의 한 가지 환원방법을 보여준다.
[0016] 도 4는, 식 중 R1은 CN, Y는 CONEt2, q　=　4, X는 CH2, L은 (CH2)5, 및 PEG는 펜타에리스리톨 코어를 갖는 4-지 폴리(에틸렌 글라이콜)인, 본 발명의 컨쥬게이트 (I)의 한 가지 제조방법을 보여준다.
[0017] 도 5는, 식 중 R1은 CN, Y는 CONEt2, q　=　4, X는 CH2, L은 (CH2)5, 및 PEG는 평균 분쟈량 40,000 (n　~　225)인 4-지 폴리(에틸렌 글라이콜)인, 화학식 (I)의 한 가지 컨쥬게이트의 상세 구조를 보여준다.
[0018] 도 6은, 식 중 R1은 CN, Y는 CONEt2, q　=　4, X는 CH2, L은 (CH2)5, 및 PEG는 평균 분자량 40,000인 4-지 폴리(에틸렌 글라이콜)인, 본 발명의 컨쥬게이트로부터 SN-38의 시험관내 방출 동력학을 보여준다. SN-38은 10-OH의 이온화로 인하여 pKa　~　8.6이고; 페놀레이트의 형성으로, SN-38의 UV/Vis 최대 흡광은 414　nm로 이동한다. 10-OH를 통하여 컨쥬게이션되는 경우, SN-38은 414　nm에서 어떠한 흡광을 보이지 않는다. 따라서, 414　nm에서의 흡광 증가는 상기 컨쥬게이트로부터 유리 SN-38의 형성의 척도이다. 표시되는 곡선은 pH 9.4에서 1차 속도 상수 0.00257　min-1를 이용한 실험 데이터와 일치하였다. 이것은 pH 7.4에서 450 시간 방출에 대한 t1/2 로 변환된다.
[0019] 도 7은 래트 (평균 n=3)로의 200 mg/kg의 컨쥬게이트 정맥 투여 (7 mg/kg의 SN-38) 후, 식 중 R1은 CN, Y는 CON(Et)2, q　=　4, X는 CH2, L은 (CH2)5, 및 PEG는 평균 분자량 40,000의 4-지 폴리(에틸렌 글라이콜)인, 화학식 (I)의 컨쥬게이트로부터 방출되는 유리 SN-38 (원) 및 그 컨쥬게이트 (사각형)의 생체내 수준을 보여준다. 곡선은 생체내 방출 t1/2　=　400　h을 이용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 만들어졌다.
[0020] 도 8은 래트 (평균 n=3)로의 200 mg/kg의 컨쥬게이트 정맥 투여 (7 mg/kg의 SN-38) 후, 식 중 R1은 CN, Y는 CON(Et)2, q　=　4, X는 CH2, L은 (CH2)5, 및 PEG는 평균 분자량 40,000의 4-지 폴리(에틸렌 글라이콜)인, 화학식 (I)의 컨쥬게이트로부터 형성되는 유리 SN-38 (원) 및 SN-38 글루커로나이드 (사각형)의 생체내 수준을 보여준다.
발명을 수행하는 모드
[0021] 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 (I)을 갖는 컨쥬게이트를 제공하고,
Figure 112019095538363-pct00031
(I)
식 중, PEG는 선형이거나 분지형이고 q가 2-8일 때 다지형인 평균 분자량 20,000 내지 60,000 Da의 폴리에틸렌 글라이콜;
q= 1-8;
X는 O, NH, (CH2)m, OC(=O)(CH2)m, 또는 NHC(=O)(CH2)m인데, 여기서 m　=　1-6;
R1은 CN 또는 SO2NR2 2인데, 여기서 R2 각각은 독립적으로, 각각 필요에 따라 치환되는 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬알케닐, 알킬아릴, 또는 알킬헤테로아릴이거나, 또는 함께 고리를 형성할 수 있고;
Y　=　COR3 또는 SO2R3인데, 여기서 R3　=　OH, 알콕시 또는 NR4 2이고, 여기서 R4 각각은 독립적으로 알킬, 치환된 알킬이거나 또는 함께 고리를 형성할 수 있고;　및
L은 (CH2)r 또는 (CH2CH2O)p(CH2)r인데, 여기서 r　=　1-10이고 p　=　1-10이다.
[0022] "알킬"이라는 용어는 1-8개의 탄소로 이루어진, 또는 몇 가지 구현예에 있어서는 1-6 또는 1-4개의 탄소 원자로 이루어진 선형, 분지형 또는 시클릭 포화 탄화수소기로 정의된다.
[0023] "알케닐"이라는 용어는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 1-6 또는 1-4C로 이루어지는 비-방향족 선형, 분지형 또는 시클릭 불포화 탄화수소로서 정의된다.
[0024] "알키닐"이라는 용어는 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 1-6 또는 1-4C로 이루어지는 비-방향족 선형, 분지형 또는 시클릭 불포화 탄화수소로서 정의된다.
[0025] "알콕시"라는 용어는 산소에 결합된 알킬기로서 정의되고, 예컨대 메톡시, 에톡시, 이소프로폭시, 시클로프로폭시, 시클로부톡시 등등이다.
[0026] "아릴"이라는 용어는 6-18개 탄소, 좋기로는 6-10개의 탄소로 이루어지는 방향족 탄화수소기로서 정의되는데, 예컨대 페닐, 나프틸 및 안트라세닐과 같은 기능기이다. "헤테로아릴"이라는 용어는 하나 이상의 N. O 또는 S 원자를 함유하는 3-15개의 탄소를 포함하는, 좋기로는 하나 이상의 N, O 또는 S 원자를 함유하는 3-7개의 탄소를 포함하는 방향족 고리로서 정의되는데, 예컨대 피롤릴, 피리딜, 피리미디닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 퀴놀릴, 인돌릴, 인데닐, 등등이다.
[0027] "할로겐"이라는 용어는 브로모, 플루오로, 클로로 및 요오도를 포함하낟.
[0028] 기능기들이 "필요에 따라 치환되는" 경우, 그 치환체는 1-3개의 동일하거나 상이하고, 할로겐, 아미노, 하이드록실 및 술프하이드릴을 포함할 수 있는 치환체 뿐 아니라, 에스테르, 아마이드 또는 유리 카복시기 중 하나로서 카복실기를 함유하는 치환체를 포함한다. 이러한 열거는 모두를 포함하는 것을 의도하지 않으며, 필요에 따라 존재하는 것들 중에는 임의의 불간섭 치환체들이 포함될 수 있다.
[0029] 본 명세서에서 사용되는 "하나 (a, an)" 등은 달리 표시되지 않으면 하나 또는 하나 이상을 의미하도록 의도된다. 또한, 정수 범위가 주어지는 경우, 모든 사이 정수들은 구체적으로 설명된 것과 같이 포함되는 것으로 의도된다.
[0030] PEG는 평균 분자량 20,000 내지 60,000 (즉, 대략 400 내지 대략 1500 산화에틸렌 단위를 포함) 또는 30,000-50,000인 선형, 분지형 또는 다지형 폴리(에틸렌 글라이콜)일 수 있고, 여기서 하나 이상의 고분자 말단은 카복실레이트 관능성으로 종결될 수 있다. 이들 PEG는 시판되는데, 예컨대 NOF 및 Jenkem Technologies를 통하여, 그 C=O기는 아민과의 반응을 위하여 활성화된 유도체로서, N-하이드록실숙신이미드 또는 나이트로페닐 에스테르 또는 N-하이드록시숙시니미딜 또는 나이트로페닐 카보네이트로서 시판 중이다. 이들 고분자량 PEG는 분자량 가우시안 분포로 이루어지고 (즉, 다분산이다), 따라서 산화에틸렌 단위 수의 분포를 포함하며; 이들은 그 기재된 평균 분자량을 갖는 공업적으로 공급되는 물질에서 흔히 알려진 분자량 및 산화에틸렌 단위 분포를 아우르는 것으로 본 명세서에서 의도되는 평균 분자량에 의하여 기재된다. 4-지 PEG에 대한 전형적인 다분산지수 (PDI)는 1.1 이하이고, PDI　=　Mw/Mm로 계산되는데, 여기서 Mw　=　∑Mi 2 Ni/∑MiNi 로서 계산되는 중량-평균 분자 질량이고, Mm　=　∑MiNi/∑Ni,로서 계산되는 수-평균 분자 질량이며, M은 종 i의 분자량이고, N은 그 시료 중 종 i의 수이다. PDI는 겔 투과 크로마토그래피 HPLC 또는 질량 분석과 같은 이 기술 분야에 알려진 방법에 의하여 측정될 수 있다 (예컨대 US 특허 공개 2010/0126866　A1 참조). 다지형 PEG는 다양한 코어 단위, 예컨대 펜타에리스리톨, 헥사글라이세롤 및 트리펜타에리스리톨 등으로부터 출발하여 형성되어 다양한 배향 및 총 가지 (arm) 수를 제공할 수 있다.
Figure 112016043182784-pct00004
펜타에리스리톨,
Figure 112016043182784-pct00005
헥사글라이세롤,
Figure 112016043182784-pct00006
트리펜타에리스리톨
PEG의 가지 하나 이상은 링커-SN-38의 부착이 가능하도록 연결기 X를 통하여 카복실레이트 관능성을 갖게 말단화된다. X는 카복실레이트 관능성을 PEG에 부착시키는 일을 하므로, O, NH, (CH2)m, OC(=O)(CH2)m, 또는 NHC(=O)(CH2)m 를 포함하는 임의의 전형적인 연결기일 수 있으며, 여기서 m　=　1-6이다. 본 발명의 특정 구현예에 있어서, X는 O, NH, (CH2)m, 또는 NHC(=O)(CH2)m이다. 본 발명의 한 가지 구현예에 있어서, X는　(CH2)m이다.
[0031] 본 발명의 특정 구현예에 있어서, PEG는 평균 분자량 40,000 ± 4,000 Da (즉, 대략 800-1000 총 산화에틸렌 단위를 포함)을 갖는다. 한 가지 구현예에 있어서, PEG는 펜타에리스리톨 코어 및 평균 분자량 40,000 ± 4,000 Da을 갖는 4-지 고분자이고, 여기서 각 가지는 평균적으로 225 ± 25 산화에틸렌 단위를 포함하고 카복실레이트기로 말단화되며, 화학식 (III)을 갖고, 여기서 n　=　200-250이고 m　=　1-6이다.
Figure 112016043182784-pct00007
관련 컨쥬게이트가 이전에 PCT 공개 WO2011/140393에 개시되었기는 하지만, 본 발명의 발명자들은 보다 친수성인 아마이드 연결을 통하여 링커-SN-38에 PEG를 결합하면, 상기 이미 개시된 컨쥬게이트보다 컨쥬게이트에 개선된 용해성 및 점성 특성을 부여한다는 것을 예기치 않게 밝혔으며, 여기서 PEG는 아자이드 및 디벤조아자시클로옥타인 (DBCO 또는 DIBOC) 간의 1,3-이극성 시클로첨가를 통하여 결합되었다.
[0032] L은 화학식 (CH2)r 또는 (CH2CH2O)p(CH2)r을 갖는 연결기이고, 여기서 r　=　1-10이고 p　=　1-10이다.
[0033] R1은 CN 또는 SO2NR2 2인데, 여기서 R2 각각은 독립적으로, 각각 필요에 따라 치환되는 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬알케닐, 알킬아릴, 또는 알킬헤테로아릴이거나, 또는 함께 고리를 형성할 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, R2 각각은 독립적으로, 알킬이다. R1은, 본 발명에 참조로서 포함되는 PCT 공개 WO2011/140393 및 PCT 출원 PCT/US12/54293에 개시되는 바와 같이, 컨쥬게이트로부터 SN-38의 방출 속도를 조절한다. 저투여량, 장기간 노출 요법을 지지하기 위하여는, 상기 SN-38의 컨쥬게이트로부터의 방출 속도는 방출의 생체내 반감기가 대략 100 내지 대략 1000 시간 사이, 좋기로는 대략 300 내지 대략 800 시간, 가장 좋기로는 대략 400 내지 500 시간이어야 한다. 생체내 방출 속도는 pH 7.4, 37℃에서 대응하는 시험관내 방출 속도보다 대략 최대 3x 더 빠를 수 있다는 것에 주목한다. 특정 구현예에 있어서, R1은 CN이다. 이 구현예에 있어서, (래트) 시험관내 및 생체내 방출 반감기는 400　h로 측정되었다. 다른 특정 구현예에 있어서, R1은 SO2NR2 2이다. 특정 구현예에 있어서, R1은 SO2NR2 2인데, 여기서 R2 각각은 독립적으로, 메틸, 에틸, 알릴, 벤질, 2-메톡시에틸, 또는 3-메톡시프로필이거나, 또는 NR2 2는 모르폴리노, 2,3-디하이드로인돌릴, 또는 1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀릴을 형성한다.
[0034] Y는 컨쥬게이트를 미성숙 방출에 대비하여 안정화시키는 전자-끌개 치환체이다. 특정 구현예에 있어서, Y는 COR3 또는 SO2R3인데, 여기서 R3　=　OH, OR4, 또는 NR4 2, 여기서 각각의 R4는 독립적으로 알킬, 치환된 알킬이거나, 또는 R4 양자 모두가 함께 고리를 형성할 수 있다. 몇몇 구현예에 있어서, Y는 파라 위치에 있다. Y는 SN-38로의 N-CH2-O 연결을 안정화하여 컨쥬게이트로부터 약물의 자발적 분해율을 최소화하기 위하여 작용한다. 특정 구현예에 있어서, Y는 CONR4 2이고, 특정 구현예에 있어서, Y는 CON(CH2CH3)2, CON(CH2CH2)2O 또는 N과 결합된 (CH2CH2)2O는 모르폴리노인 SO2N(CH2CH2)2O이다. 베타-제거 및 SN-38의 방출로부터 결과하는 p-아미노벤조에이트 및 p-아미노술폰아마이드는 일반적으로 저독성을 갖는 것으로 여겨진다.
[0035] 본 발명의 특정 구현예에 있어서, 구조 (II)를 갖는 화학식 (I)의 컨쥬게이트가 제공되는데,
Figure 112016043182784-pct00008
식 중, m　=　1-6 이고 n　=　100-375이다 (즉, 평균 분자량 20,000 내지 60,000　Da, 또는 30,000-50,000　Da의 PEG). 본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 화학식 (II)를 갖는 컨쥬게이트가 제공되는데, 식 중, m　=　1-3이다. 더더욱 구체적인 본 발명의 구현예에 있어서, m　=　1이고 n　=　200-250 또는 ~225로서, 평균 PEG 분자량은 약　40,000이다.
[0036] 본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 화학식 (I)의 컨쥬게이트의 제조 방법이 제공된다. PCT 공개 WO2011/140393에 이미 개시된 아지도-링커-SN-38 중간물질의 한 가지 제조 방법이 도 2에 도시된다. 따라서, 아지도 알코올 (IV)이 카바메이트 (V)로 전환되는데, 예컨대 피리딘과 같은 약한 염기의 존재 하에서 트리포스젠과 같은 포스젠 또는 포스젠 균등물을 이용한 클로로포메이트로의 중간물질 전환에 의하며, 아닐린 NH2-C6H4-Y과의 반응이 이어진다. 또는, (V)는 (IV)를 이소시아네이트 OCN-C6H4-Y로 처리함으로써 직접 형성될 수 있다. 카바메이트 (V)는 그 후, 문헌 [Majumdar ("N-Alkyl-N-alkyloxycarbonylaminomethyl (NANAOCAM) prodrugs of carboxylic acid containing drugs," Bioorg Med Chem Letts (2007) 17:1447-1450)]에 개시된 방법의 개질을 이용하여 N-클로로메틸화되는데, 여기서 카바메이트 (V) 및 파라포름알데하이드는 클로로트리메틸실란과 불활성 용매, 예컨대 테트라하이드로퓨란, 1,2-디클로로에탄, 디옥산 또는 톨루엔의 혼합물 내에서 접촉한다. 촉매 클로로트리메틸실란은 (V)에 대하여 1-10 배 몰 과량으로 존재하며, 좋기로는 4 배 몰 과량으로 존재한다. 상기 반응은 불활성 환경 하에서, 20 내지 100℃, 좋기로는 40 내지 60℃, 가장 좋기로는 50℃에서 수행될 수 있고, 그 반응 진행은 반응성 N-(클로로메틸)카바메이트 (VI)의 안정한 종으로의 전환에 의하여 모니터링될 수 있는데, 예컨대 클로로-트리메틸실란을 중화시키기에 충분한 트리알킬아민 염기를 함유하는 에탄올 내로 상기 반응 혼합물 앨리쿼트를 희석한 후, 결과하는 N-(에톡시메틸)-카바메이트의 HPLC 분석에 의한다.
[0037] 도 2에 도시되는 바, SN-38은 N-(클로로메틸)카바메이트 (VI)에 의하여 페놀 OH에서 알킬화되어 아지도-링커-SN-38 (VII)를 생성한다. 다양한 염기가 페놀을 탈양성자화 (deprotonated)함으로써 알킬화시키는데 사용될 수 있는데, 예컨대 포타슘 tert-부톡사이드 (KOtBu)와 같은 알콕사이드, 리튬 비스(트리메틸실릴아마이드)(LiHMDS)와 같은 금속 아마이드, NaH와 같은 금속 하이드라이드, 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]운덱-7-엔 (DBU)과 같은 아마이딘, 및 포스파젠 염기 등이다. 양호한 구현예에 있어서, 상기 염기는 KOtBu이다. 적절한 용매 내 SN-38은 우선 -20 내지 25℃의 온도, 좋기로는 -20 내지 5℃, 가장 좋기로는 4℃에서 염기와 접촉하여, 페놀레이트 염을 생성한다. 페놀레이트는 그 후 -20 내지 25℃의 온도, 좋기로는 -20 내지 5℃, 가장 좋기로는 4℃에서 N-(클로로메틸)-카바메이트 (VI)와 접촉하여 아지도-링커-SN-38 (VII) 용액을 생성한다. 적절한 용매로는 THF, DMF, 및 이들의 혼합물을 들 수 있다.
[0038] 도 3에 도시된 바, 아지도-링커-SN-38 (VII)은 아자이드의 환원에 의하여 아미노-링커-SN-38 (VIII)로 전환된다. 이러한 환원은 다양한 방법에 의하여 달성될 수 있는데, 예컨대 팔라듐 또는 플래티늄과 같은 금속 촉매의 존재하에서 촉매적 수소첨가분해 (hydrogenolysis); 트리알킬포스핀 또는 트리아릴포스핀과 같은 포스핀을 이용한 Staudinger 환원; 또는 실란 존재하의 인듐 환원에 의할 수 있다. 트리메틸포스핀과 같은 상당히 염기성인 트리알킬포스핀이 사용되는 경우, 충분량의 산을 첨가하여 반응의 염기도를 중화시킴으로써 베타-제거 링커의 조기 분해를 방지한다. 양호한 구현예에 있어서, (VII)를 (VIII)으로 전환시키는데 THF/물 중의 트리메틸포스핀-아세트산이 사용된다.
[0039] 아민-링커-SN-38 (VIII)은 활성화된 PEG에 연결되어 도 4에 도시된 바와 같이 컨쥬게이트 (I)을 제공한다. 적절히 활성화된 PEG는 아민-반응성 관능기로 말단화된 고분자쇄, 예컨대 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르, 펜타할로페닐 에스테르 또는 나이트로페닐 에스테르를 갖고, 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 생성하는데, 여기서 X는 없고 (absent), N-하이드록시숙신이미들 카보네이트, 펜타할로페닐 카보네이트 또는 나이트로페닐 카보네이트를 갖고 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 생성하는데, 여기서 X는 O이다. 또는, 그 고분자쇄가 카복실산으로 말단화된 PEG가 펩타이드 커플링제의 존재 하에서 사용될 수 있는데, 예컨대 DCC 또는 EDCI와 같은 카보디이미드 또는 BOP 또는 PyBOP와 같은 포스포늄 제제, 또는 HATU 또는 HBTU와 같은 우로늄 제제이다. 커플링은 수성 또는 무수 조건, 좋기로는 아세토나이트릴, THF, DMF, 또는 디클로로메탄과 같은 적절한 용매 중에서 무수로 수행된다. 양호한 구현예에 잇어서, NHS 에스테르로 말단화된 고분자괘를 갖는 활성화 PEG가 0 내지 25℃ 온도에서 THF 용매 내에서 사용된다.
[0040] 결과물 컨쥬게이트는 이 기술 분야의 공지된 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 예컨대, 에틸 에테르 또는 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE)와 같은 에테르 용매 (ethereal solvent)의 첨가에 의하여 반응 혼합물로부터 침전될 수 있다. 또한, 컨쥬게이트는 투석 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있다.
[0041] 제3 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 이용하여 SN-38의 지연 방출 방법을 제공한다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 컨쥬게이트로부터 SN-38의 방출 반감기는 100 내지 1000 시간 사이, 좋기로는 300 내지 500 시간 사이, 더욱 좋기로는 대략 400 시간이다.
[0042] 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 컨쥬게이트를 환자에게 제공하는 것을 포함하는, SN-38에의 연속적, 저투여량 노출을, 그러한 노출을 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법이 제공된다. 보다 구체적인 구현예에 있어서, 주 1회 투여 사이에 유리 SN-38의 농도가 15 내지 5 nM로 유지되는 방법이 제공된다.
[0043] 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 컨쥬게이트의 투여 사이 관찰되는 SN-38의 Cmax/Cmin 비를 조절하는 방법이 제공된다. 결과적인 Cmax/Cmin 비는 주 1회 투여 사이에 10 이하, 더욱 좋기로는 5 이하, 더더욱 좋기로는 대략 2.5이다.
[0044] 도 6에 보여지는 바, PEG가 평균 분자량 40,000의 4-가지 폴리에틸렌 글라이콜 (펜타에리스리톨 코어)인 화학식 (II)의 컨쥬게이트 [즉, q　=　4; X는 CH2; R1은 CN; Y　=　CONEt2, PEG는 평균 분자량 40,000의 4-가지 폴리에틸렌 글라이콜; 및 L은 (CH2)5인 화학식 (I)]는 37℃에서 pH 9.4 완충액 중에 놓여지는 경우 반감기 4.5 시간을 갖는 1차 반응으로 SN-38을 방출하였다. 본 발명에서 사용되는 베타-제거 링커들은 pH에 대하여 1차 방출 속도 의존성을 나타낸다는 것이 입증되었고, 그로써 생리적 pH (7.4)에서 대응하는 방출 반감기는 450 시간으로 계산될 수 있다.
[0045] 도 7에서 보여지는 바, 동일한 컨쥬게이트를 정맥 주입으로 래트에 투여한 경우 유리 SN-38은 방출되어 대략 51 시간의 종국적 반감기를 갖는 컨쥬게이트의 그것과 평행한 농도 대 시간 프로파일을 따랐다. 이는 SN-38의 직접적인 정맥 투여와 비견되는데, 이러한 투여는 래트에서 7 내지 34 분의 종국적인 반감기를 보여준다 (문헌 [Atsumi, et al., "Pharmacokinetics of SN-38 [(+)-(4S)-4,11-diethyl-4,9-dihydroxy-1H-pyrano[3',4':6,7]-indolizino[1,2-b]quinoline-3,14(4H,12H)-dione], an active metabolite of irinotecan, after a single intravenous dosing of 14C-SN-38 to rats," Biol . Pharm . Bull. (1995) 18:1114-1119]; [Kato, et al., "Panipenem Does Not Alter the Pharmacokinetics of the Active Metabolite of Irinotecan SN-38 and Inactive Metabolite SN-38 Glucuronide (SN-38G) in Rats," Anticancer Res . (2011) 31:2915-2922]). 따라서, 본 발명의 컨쥬게이트는 SN-38의 생체내 반감기를 크게 연장한다.
[0046] 컨쥬게이트로부터 방출되는 약물의 수준 및 관찰되는 종국적 반감기는 그 컨쥬게이트와 약물의 약물동태학적 파라미터들의 조합의 결과로서, 상기 종국적인 반감기는 단순한 1-컴파트먼트 모델에서 컨쥬게이트 제거 및 약물 방출 속도의 합이다 (Santi, et al., "Predictable and Tunable Half-life Extension of Therapeutic Agents by Controlled Chemical Release from Macromolecular Conjugates," Proc . Natl . Acad . Sci . USA (2012) 109:6211-6216). 이들 파라미터를 결정하기 위하여, 상기 컨쥬게이트가 2 개의 컴파트먼트 간 분배되고 완전 제거되기 전에 유리 SN-38을 방출할 수 있는 약물동태학적 모델을 이용하여 데이터를 분석하였다. 컨쥬게이트 자체의 제거 속도 (kel)를 구축하기 위하여, 안정한 유사 컨쥬게이트 (CH2CN이 없는 화학식 (II))를 래트에 정맥 투입하고 2-컴파트먼트 모델을 이용하여 약물동력학적 파라미터를 얻었다.
[0047] 도 7에 보여지듯이, 농도 대 시간 데이터는 대략 400 시간의 반감기로 생체내 유리 SN-38을 방출하는 컨쥬게이트 (II)와 일치한다. 래트에서 200　mg/kg (7　mg/kg SN-38 포함)으로 컨쥬게이트 (II)의 1회 주입 후, SN-38의 혈장 수준은 7 일에 걸쳐 210-20 nM에 이르는 것으로 관찰되었다 (즉, Cmax/Cmin　=　10). 상기 컨쥬게이트 및 그에 따른 유리 SN-38의 종국적 반감기는 래트에서 상대적으로 빠른 컨쥬게이트 제거 속도에 의하여 제한된다. PEG 컨쥬게이트의 제거 속도는 신장 여과의 차등적 속도로 인하여 종-의존적인데, 40,000-Da PEG의 종국적 반감기는 마우스에서 대략 12 시간, 래트에서 24-48 시간, 및 인간에서 72-120 시간이다. 또한, 약물의 제거 속도가 래트에서보다 인간 환자에 있어서 더 느리다는 것이 통상적이다 (예컨대, 문헌 [Caldwell, et al., "Allometric scaling of pharmacokinetic parameters in drug discovery: can human CL, Vss and t1/2 be predicted from in-vivo rat data," Eur J Drug Metab Pharmacokinet. (2004) 29:133-143)] 참조). 따라서, 화학식 (I)의 컨쥬게이트로부터 방출되는 SN-38의 종국적인 반감기는, 혈액 pH 값의 일치로 인하여 비록 상기 컨쥬게이트로부터의 약물 방출 속도가 비교적 종-독립적으로 예측된다고 하여도 설치류에서보다 인간에게서 실질적으로 더 길 것으로 예측된다. 인간 환자에서 본 발명의 컨쥬게이트와 유리 SN-38에 대한 실제 약물동태학적 파라미터들은 미지이지만, 상대성장척도 (allometric scaling)를 이용한 이들 값의 추정은 하기 실시예 5에서 개시되는 바와 같이 인간 환자에서 Cmax/Cmin　~　2.5라는 추정을 준다. 인간 환자에서 SN-38 전구약물 이리노테칸의 장시간 주입은 SN-38의 혈장 수준이 장시간 동안 약 5 내지 15 nM 사이로 유지된다면 최대 효능을 얻을 수 있을 것을 나타내었다. 따라서, 래트 약물동태학적 데이터는 본 발명의 컨쥬게이트가 연속적인, 저농도의 효과적 수준의 SN-38의 방출을 가능하게 한다는 것을 예측한다.
[0048] 놀랍게도, 화학식 (II)의 컨쥬게이트로 래트 치료시 관찰된 SN-38G의 수준은 대단히 낮아서, Cmax에서 SN-36G/SN-38 ≤ 0.1이었다. 이는 에스테르-연결된 이리노테칸 컨쥬게이트를 이용한 치료 (Cmax에서 SN-38G/SN-38　~　15; 문헌 [Eldon, et al., "Population Pharmacokinetics of NKTR-102, a Topoisomerase Inhibitor-Polymer Conjugate in Patients With Advanced Solid Tumors," American Society of Clinical Oncology Poster 8E (2011)]), 또는 에스테르-연결된 SN-38 컨쥬게이트를 이용한 치료 (Cmax에서 SN-38G/SN-38　~　1; 문헌 [Patnaik, et al., "EZN-2208, a novel anticancer agent, in patients with advanced malignancies: a Phase　1 dose-escalation study," American Association f 또는 Cancer Research Poster C221 (2009)])와는 대조적이다. 따라서, 매우 천천히 방출될 시에, SN-38은 덜 효과적으로 글루커로나이드화되는 것으로 보인다. 이러한 가설과 부합하여, R1　=　PhSO2인 컨쥬게이트를 래트에서 조사한 경우, 예상한 바와 같이 SN-38 (t1/2　=　10　h)의 빠른 방출이 관찰되었고, 동시에 유리 SN-38의 높은 초기 수준 및 Cmax에서 높은 SN-38G/SN-38　=　0.2가 관찰되었다.
[0049] 따라서, 제4 측면에 있어서, 본 발명은 컨쥬게이트로부터 SN-38의 방출 속도를 조절함으로써 SN-38의 투여에 따라 형성되는 SN-38 글루커로나이드의 양을 최소화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 가지 구현예에 있어서, SN-38의 투여에 따라 형성되는 SN-38 글루커로나이드의 양을 최소화하는 방법은 SN-38 방출의 반감기가 100 시간보다 큰 것으로 특징지워지는 컨쥬게이트를 제공하는 것인 방법으로 제공된다. 보다 구체적인 구현예에 있어서, SN-38 방출에 대한 상기 반감기는 100 내지 1000 시간 사이이다. 양호한 구현예에 있어서, SN-38 방출에 대한 상기 반감기는 300 내지 500 시간 사이이다. 보다 양호한 구현예에 있어서, SN-38 방출에 대한 상기 반감기는 대략 400 시간이다.
[0050] 본 발명의 컨쥬게이트는 이 기술 분야에 알려진 다양한 약학적 허용 부형제들을 이용하여 제제화될 수 있고, 컨쥬게이트 안정성을 위하여 최적의 pH를 갖는 수성 왕충액에서 편리하게 제제화된다. 본 발명의 한 가지 구현예에 있어서, 컨쥬게이트는 pH 값 4 내지 6에서, 수성 완충액 내에서 제제화된다. 화학식 (I)의 컨쥬게이트가 WO2011/140393에 개시된 관련 컨쥬게이트보다 수성 완충액에서 현저히 더욱 가용성이므로 (하기 실시예 2 참고), 이들 화합물을 이용한 치료가 필요한 환자들에게 더 많은 양의 투여를 가능하게 한다는 것이 예기치 않게 밝혀졌다.
[0051] 본 발명의 컨쥬게이트는 SN-38 또는 SN-38의 전구약물, 예컨대 이리노테칸이 이용되는 어떠한 상황에서도 그 이용성을 찾을 수 있을 것으로 예상된다. 현재, 이리노테칸은 다양한 암, 예컨대 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 위암 및 유방암의 치료에 이용되며, 따라서 본 발명의 컨쥬게이트가 유사하게 이용될 수 있다고 예상된다.
[0052] 실시예 6에 설명되는 택일적 구현예에 있어서, SN-38의 제제는 그 부형제가 PEG 및 DMSO를 포함하는 경우 가용화 형태를 제공한다. 이는, 예컨대 특히 연속적 주입에 유용하다. PEG 대 DMSO 비는 90:10 - 10:90로 가변하지만, 75:25, 25:75 또는 50:50 또는 그 중간 값일 수 있다. 유용한 PEG 성분은 대략 PEG100 (100)-PEG(600) 범위이다.
[0053] 달리 표시되지 않는 한, 모든 참고문헌들은 그 전체로서 본 발명에 포함된다.
실시예
[0054] 일반: 다이오드-어레이 검출을 이용하는 Shimadzu HPLC 시스템을 이용하여 HPLC를 수행하였다. 역상은 1.0　mL/min의 유속으로, 0.1% TFA를 함유하는 물 중의 20-100% 아세토나이트릴 구배로, 40℃ 온도조절장치 구비 Phenomenex® Jupiter 5　um 300A 4.6x150　mm 컬럼을 이용하였다. 크기-배제 HPLC는 40℃에서 50:50 아세토나이트릴/물/0.1% TFA 동작하는 Phenomenex® BioSepTM S-2000 컬럼을 이용하였다. SN-38 함유 용액을 e　=　22,500 M-1cm-1를 이용하여 아세토나이트릴 중에서 363　nm에서의 UV 흡광으로 정량하였다. SN-38은 Haorui (China)에서 구입하였다.
제조 A
6- 아지도 -1- 헥산올
Figure 112016043182784-pct00009
[0055] 6-클로로-1-헥산올 (50.0　g, 366　mmol) 및 소듐 아자이드 (65.0　g, 1000　mmol)의 400　mL 물 중의 혼합물을 19 h 동안 약하게 환류 가열하였다. 실온까지 식힌 후, 혼합물을 3x200　mL EtOAc로 추출하였다. 추출물을 1x100　mL 물, 1x100　mL의 포화 NaCl 수용액으로 수세한 후 MgSO4 상에서 건조, 여과하고 증발시켜 무색 오일 44.9　g (86%)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.66 (2H,br　t, J　=　6 Hz), 3.27 (2H, t, J　=　7.2 Hz), 1.55-1.66 (m, 4H), 1.38-1.44 (m, 2H).
제조 B
6- 아지도헥산알
Figure 112016043182784-pct00010
[0056] 트리클로로이소시아누르산 (12.2　g, 52.5　mmol)을, 격렬히 교반되는 100　mL 디클로로메탄 중 6-아지도-1-헥산올 (7.2　g, 50.0　mmol) 용액에 첨가하고 얼음에서 냉각하였다. 2　mL 디클로로메탄 중의 TEMPO (0.080　g, 0.51　mmol) 용액을 상기 결과 현탁액에 적가하였다. 10 분 후 4℃에서, 상기 현탁액을 실온까지 덥혀 30 분간 추가 교반하였다. TLC 분석 (30% EtOAc/헥산)은 반응 완결을 표시하였다. 디클로로메탄을 이용하여 1 cm Celite 패드를 통하여 현탁액을 여과하였다. ㅇ여역여과물을 2x100　mL 1 M Na2CO3, 1x100　mL 물, 1x100　mL 1　N　HCl, 및 1x100　mL 포화 NaCl 수용액으로 수세한 후, MgSO4 상에서 건조, 여과, 및 증발시켜 9.8　g의 오렌지색 오일을 수득하였다. 이것을 소량 부피의 디클로로메탄에 녹여 0-20% EtOAc/헥산 구배를 이용하여 SiO2 (80　g) 상에서 크로마토그래피하고, 6.67　g (47.3　mmol; 95%)의 무색 오일 알데하이드를 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.78 (1H,t, J　=　1.6 Hz), 3.29 (2H, t, J　=　6.8 Hz), 2.47 (2H, dt, J　=　1.6, 7.6 Hz), 1.59-1.71 (m, 4H), 1.38-1.46 (m, 2H).
제조 C
7- 아지도 -1- 시아노 -2- 헵탄올
Figure 112016043182784-pct00011
[0057] 헥산 중의 1.6 M n-부틸리튬 용액 (35　mL, 49　mmol)을 -78℃, N2 하에서 100　mL 무수 THF에 첨가하였다. 격렬히 교반하면서 아세토나이트릴 (3.14　mL, 60　mmol)을 빠른 유량 내로 첨가하여, 백색 현탁액 형성이라는 결과를 얻었다. 15 분 후, 1 시간 또는 그 이상으로, 현탁액을 -20℃까지 덥혔다. 다시 -78℃로 냉각한 후, 6-아지도헥산알 (6.67　g, 47　mmol)을 첨가하여 황색 용액을 얻었다. 추가 15 분 동안 이를 교반한 후, -20℃로 덥혀지게 하고 20　mL 포화 NH4Cl 수용액을 첨가하여 반응 종결시켰다. EtOAc로 희석한 후, 혼합물을 순차적으로 물, 1　N HCl, 물, 및 포화 NaCl 수용액으로 수세한 후, MgSO4 상에서 건조, 여과 및 증발시켜 8.0　g 황색 오일을 얻었다. 이를 소량 부피의 디클로로메탄에 용해시켜 0-40% EtOAc/헥산 구배를 이용하여 SiO2 (80　g) 상에서 크로마토그래피하여 무색 오일로서의 산물 6.0　g (21.6　mmol; 84%)을 얻었다. 1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 5.18 (1H, d, J　=　5 Hz), 3.69 (1H, m), 3.32 (2H, t, J　=　6 Hz), 2.60 (1H, dd, J　=　4.8, 16.4 Hz), 2.51 (1H, dd, J　=　6.4, 16.4 Hz), 1.55 (2H, m), 1.42 (2H, m), 1.30 (4H, m).
제조 D
N,N-디에틸 4-나이트로벤즈아마이드
Figure 112016043182784-pct00012
[0058] 100　mL 아세토나이트릴 중의 4-나이트로벤조일 클로라이드 (18.6　g, 100　mmol) 용액을 30 분에 걸쳐 교반되는 150　mL 물 중의 디에틸아민 (15.5　mL, 150　mmol) 및 소듐 하이드록사이드 (6.0　g, 150　mmol) 빙냉 용액에 적가하였다. 첨가 완료 후, 혼합물을 실온까지 덥혀지도록 하고 추가 1 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 3x 100　mL CH2Cl2,로 추출하고 배합된 추출물을 1x 100　mL 물, 1x 100　mL 1 N HCl, 및 브라인으로 수세하였다. MgSO4 상에서 건조한 후, 혼합물을 여과 및 건조까지 증발시켜 결정 매쓰를 얻었다. 80/20 헥산/에틸 아세테이트로부터의 재결정화는 연한 황색 결정으로서의 산물 20.0　g을 얻도록 하였다 (90%). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.27 (2H, m), 7.54 (2H, m), 3.57 (2H, br q, J　=　6.8 Hz), 3.21 2H, br q, J　=　6.8 Hz), 1.27 (3H, br t, J　=　6.8 Hz), 1.12 (3H, br t, J　=　6.8 Hz).
제조 E
4-(N,N- 디에틸카복스아미도 )아닐린
Figure 112016043182784-pct00013
[0059] 암모늄 포르메이트 (20.0　g, 317　mmol)를 격렬히 교반되는 얼음에서 냉각된 400　mL 메탄올 중의 N,N-디에틸 4-나이트로벤즈아마이드 (20.0　g, 90　mmol) 및 1.0　g 10% 팔라듐/차콜 혼합물에 첨가하였다. 격렬한 가스 에볼루션 (gas evolution)을 이용하여 반응물을 덥힌다. 1 시간 후, TLC (60/40 헥산/EtOAc)는 개시 물질의 완전한 전환을 표시하였다. 혼합물을 Celite 패드를 통하여 여과하고 결정 고체가 되도록 증발시켰다. 이것을 물에 현탁하고 진공 여과를 통하여 수집하였다. 물로부터 산물을 재결정화하고 건조하여 백색 결정 14.14　g (83%)을 얻었다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.22 (2H, m), 6.65 (2H, m), 3.81 (2H, br s), 3.42 (4H, br s), 1.17 (6H, t, J　=　6.8 Hz).
제조 F
1- 시아노 -7- 아지도 -2- 헵틸 4-(N,N- 디에틸카복스아미도 ) 페닐카바메이트
Figure 112016043182784-pct00014
[0060] 불활성 조건 하에서, 얼음에서 냉각된 200　mL 무수 THF 중의 1-시아노-7-아지도-2-헵탄올 (4.60　g, 25　mmol) 및 트리포스젠 (12.5　g, 42　mmol) 교반 중인 용액에 피리딘 (4.0　mL, 50　mmol)을 적가하였다. 백색 현탁액을 15 분간 얼음 상에서 교반한 후, 실온으로 덥혀지게 하여 추가 30 분간 교반하였다. TLC 분석 (60:40 헥산/에틸 아세테이트)은 개시 물질의 하이-Rf 산물로의 완전한 전환을 확인시켰다. 현탁액을 여과 및 증발시켜 잔여물을 100　mL 건조 에테르에 취하고, 여과, 및 증발시켜 갈색 오일로서의 크루드 클로로포르메이트 (4.54　g, 74%)를 얻었다. 트리에틸아민 (3.5　mL, 25　mmol)을 100　mL 건조 CH2Cl2 중의 클로로포르메이트 (18.6　mmol) 및 4-(N,N-디에틸카복스아미도)아닐린 (3.85　g, 20　mmol) 용액에 첨가하였다. 1 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 2x 1 N HCl, 2x 물, 및 1x 브라인으로 수세한 후 MgSO4 상에서 건조, 여과하고 증발시켜 결정화되면서 오일을 얻었다. 결정 매쓰를 60/40 헥산/에틸 아세테이트로 수세하였다. 수세물을 농축하고 0-80% 에틸 아세테이트/헥산 구배를 이용하여 실리카 상에서 크로마토그래피하였다. 산물 분획을 농축하고, 최초 결정 물질과 배합하였다. 배합된 산물을 1:1 에틸 아세테이트/헥산으로부터 재결정화하여 백색 결정 고체로서의 카바메이트 (4.4　g, 44%, 2 단계용)를 얻었다. 1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.45-7.35 (4H, m), 6.888 (1H, br s), 5.000 (1H, m), 3.52 (4H, br), 3.288 (2H, t, J　=　6.8 Hz), 2.841 (1H, dd, J　=　5.2, 17 Hz), 2.327 (1H, dd, J　=　4.4, 17 Hz), 1.88 (1H, m), 1.75 (1H, m), 1.63 (2H, m), 1.45 (4H, m), 1.18 (6H, br).
제조 G
N-( 클로로메틸 ) 카바메이트
Figure 112016043182784-pct00015
[0061] 7-아지도-1-시아노-2-헥실 N-(클로로메틸)-4-(N,N-디에틸카복스아미도)-페닐카바메이트 (2.00　g, 5.0　mmol), 파라포름알데하이드 (225 mg, 5.5　mmol, 1.5 Eq), 클로로트리메틸실란 (2.5　mL, 20.0　mmol, 4.0 Eq), 및 25　mL 무수 톨루엔을, N2 조건 하에서, 마그네틱 교반 막대를 구비한 50-mL RBF에 넣고 고무 격막 마개로 막았다. 밀봉된 플라스크를 50℃ 오일 배쓰에서 24 시간 동안 가열하였는데, 그때 맑은 황색의 용액이 얻어졌다. 용액을 실온까지 냉각하고 증발시켰다. 잔류물을 10　mL 건조 톨루엔에 용해시키고, 여과 및 증발시켜 잔여 톨루엔 (2.68　g, 예상치의 119%)을 함유하는 불안정한 황색 오일로서 크루드 N-(클로로메틸)-카바메이트를 얻었다. 이 물질을 10　mL 무수 THF에 용해시키고 N2하에 저장하였다. N-(클로로메틸)카바메이트의 형성은 에탄올 중의 5　uL 내지 1.0　mL 4　mM N,N-디이소프로필에틸아민의 첨가 및 후속하는 역상 HPLC 분석 (Phenomenex Jupiter 300A 4.6x150 mm C18; 1.0　mL/min; 10 분에 걸친 20-100% CH3CN/H2O/0.1% TFA 구배)로 확인되었다. 개시물 카바메이트는 8.42 분에 용리되어 λmax 243　nm을 보이고; 산물 N-(에톡시메틸)-카바메이트는 8.52　분에 용리되어 λmax 231　nm를 나타내며; 미지의 불순물이 8.04 분에 용리되어 λmax 245　nm를 보인다. 240　nm에서 피크 누적은 대략 89% N-(에톡시메틸)-카바메이트를 확인하여 주었다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.39 (4H, m), 5.54 (1H, d, J　=　12 Hz), 5.48 (1H, d, J　=　12 Hz), 4.99 (1H, m), 3.51 (4H, br), 3.26 (2H, t, J　=　6.8 Hz), 2.79 (1H, m), 2.63 (1H, m), 1.85 (1H, m), 1.73 (1H, m), 1.60 (2H, m), 1.43 (4H, m), 1.16 (6H, br).
제조 H
아지도 -링커- SN -38
Figure 112016043182784-pct00016
[0062] SN-38 (1.00　g, 2.55　mmol; Haorui)를 10　mL 무수 피리딘에 현탁한 후, 건조될 때까지 진공 하에서 농축하였다 (욕 온도 50℃). 10　mL 무수 THF로 이를 반복하였다. 결과물 연한 황색의 고체를 50　mL 무수 THF 및 50　mL 무수 DMF에 N2 조건에서 용해시키고, 그 후 얼음에서 냉각시켰다. THF 중의 1.0　M 포타슘 tert-부톡사이드 (2.55　mL, 2.55　mmol)를 첨가하여 최초에 진한 녹색을 형성하다 진한 오렌지색으로 변하는 현탁액이 되었다. 15 분 후, N-(클로로메틸)-카바메이트 THF 용액 (7.5　mL, 2.8　mmol)을 첨가하였다. 15 분 후 4℃에서, 밝은 오렌지 혼합물을 실온까지 덥혀지게 두었다. 1 시간 후, HPLC 분석 (5　uL 시료 + 1　mL 아세토나이트릴/0.1% TFA)은 86/14 산물/SN-38을 확인시켜 주었다. 연한 황색 혼합물을 200　mL 에틸 아세테이트로 희석, 2x100　mL 물, 100　mL 포화 NaCl 수용액으로 수세, MgSO4 상에서 건조, 여과 및 증발시켰다. 오일리한 잔여물을 물로 저작하여 과량의 DMF를 제거하고, 잔여물을 50　mL 아세토나이트릴에 용해시켜, 여과 및 증발시켜 황색 유리질 2.96　g을 얻었다. 각각 헥산, 20%, 40%, 60%, 80%, 및 100% 헥산 중의 아세톤 200　mL의 단계 구배를 이용하여 SiO2 (80　g) 상에서 잔여물을 크로마토그래피하여, 정제된 아지도-링커-SN-38을 얻었다 (1.66　g, 81%). 이 물질을 50　mL 아세톤에 용해시키고, 45　mL 0.1% 물 중의 아세트산을 혼합물이 구름처럼 될 때까지 교반하면서 적가하였다. 교반하면서, 고체 물질을 분리하였다. 그 후, 추가 5　mL 물 중의 0.1% 아세트산을 첨가하여 침전반응을 완료하였다. 2 시간 동안 교반한 후, 고체를 진공 여과로 수집, 물로 수세, 및 건조하여 연한 황색 분말 1.44　g (70%)을 얻었다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.15 (1H, d, J　=　9.2 Hz), 7.60 (1H, s), 7.48 (1H, dd, J　=　2,9 Hz), 7.40 (4H, m), 7.25 (1H, d, J　=　2), 5.75 (2H, br), 5.73 (1H, d, J　=　16 Hz), 5.28 (1H, d, J　=　16 Hz), 5.22 (2H, s), 4.99 (1H, m), 3.84 (1H, s), 3.53 (2H, br), 3.53 (2H, br), 3.17 (2H, t, J　=　7 Hz), 3.12 (2H, q, J　=　7 Hz), 2.74 (1H, dd, J　=　1, 17 Hz), 2.54 (1H, dd, J　=　5, 17), 1.86 (2H, m), 1.6 (1H, m), 1.46 (1H, m), 1.37 (3H, t, J　=　7 Hz), 1.25 (6 H, m), 1.12 (4 H, m), 1.02 (3H, t, J　=　7.3 Hz). LC-MS: [M+H]+　=　805.3 (계산값 C44H51N8O8　=　805.3).
실시예 1
아미노-링커- SN -38 아세테이트 염
Figure 112016043182784-pct00017
[0063] THF 중의 1 M 트리메틸포스핀 용액 (2.9　mL, 2.9　mmol)을 10　mL THF 중의 아지도-링커-SN-38 (1.13　g, 1.4　mmol) 및 아세트산 (0.19　mL, 3.3　mmol) 용액에 첨가하였다. 서서히 가스를 발생시켰다. 2 시간 교반 후, 물 (1.0　mL)을 첨가하고 혼합물을 추가 1 시간 동안 교반하였다. 잔류물을 에테르와 물로 분리하였다. 수상을 에틸 아세테이트로 일단 수세하고 결과하는 맑은 황색 수상을 증발시켜 800 mg의 황색 포말을 얻었다. 이를 THF에 용해, 여과 및 UV 흡광 정량하여 1.2 μmol (86%) 산물을 함유하는 용액을 얻었다. C18 HPLC는 단일 피크를 보였고, LC-MS는 [M+H]+　=　779.3를 보였다 (예측　779.4).
실시예 2
m=1 및 n~225인 화학식 (III)의 화합물을 갖는 SN-38 컨쥬게이트
[0064] 75　mL THF 중의, 40 kDa 4-가지 테트라-(숙신이미딜-카복시메틸)-PEG (JenKem Technology; 10.0　g, 1.0　mmol HSE), 실시예 1의 아미노-링커-SN-38 아세테이트 염 (1.2　mmol), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.21　mL, 1.2　mmol)의 혼합물을 실온에 유지시켰다. 커플링 반응을 HPLC로 모니터링하였는데, 이는 90 분에 반응 완결을 확인시켜 주었다. 총 2 시간 후, 혼합물을 500　mL 교반 MTBE 내로 여과하였다. 진공 여과로 침전을 수집, MTBE로 수세, 및 진공 하에서 건조하여 왁시한 연한 황색 고체로서의 컨쥬게이트를 얻었다 (10.1　g, 95%). 1.0　mL 물 중의 2.0 mg 시료에 대한 분광 분석은 0.17　mM SN-38을 확인시켰고; 질량으로 기대된 계산된 0.175　mM SN-38에 기초하여, 이는 96%의 컨쥬게이트 로딩을 나타낸다. C18-HPLC 분석은 단일의 주요 피크를 나타냈고 (363　nm에서 총 피크 면적의 98%; 256　nm에서 97%), 0.6 mol% 유리 SN-38였다.
[0065] 이 컨쥬게이트는 pH　5.0의 10　mM 소듐 아세테이트 완충액에서 1.9　mM (85　mg/mL)로 가용성이었다. 반대로, 제조 H의 아지도-링커-SN-38가 트리아졸 연결을 통하여 PEG40 　 kD-(DBCO)4 에 연결되었던 상응하는 컨쥬게이트 (WO2011/140393)는 오로지 0.7　mM (32 mg/mL)로 가용성이었다. 실시예 2의 컨쥬게이트의 용해도 역시 pH　4 및 pH　5에서, 0.2　N 아세테이트 완충액에서 시험되었고, pH　6, pH　7 및　pH　8의 0.2　N 포스페이트 완충액에서도 시험되었다. 모든 이들 pH에서 용해도는 >300　mg/ml였다. 그러나, pH는 컨쥬게이트가 용해될 때 약간 변화하였고 일반적으로 원래 수치보다 상승하였다. 따라서, 300　mg/ml의 컨쥬게이트가 pH　4 완충액에 용해되었을 때, pH는 4.5가 되었고; pH　5 완충액에서는, pH가 5.4가 되었으며; pH　6 완충액에서는, pH가 6.2; pH 7 완충액에서는, pH 7.2 및 pH　8 완충액에서는, pH　7.7이 되었다.
[0066] 7 일간 10 mg/ml의 컨쥬게이트가 실온에서 pH 47-8에서 용해되는 경우, 및 물에서 및 실온에서 유지되는 경우 안정성 역시 시험되었다. 다양한 완충액에서 컨쥬게이트의 순도는 HPLC로 결정되었다.
[0067] 통상적으로 제0일의 순도는 100%보다 약간 낮게 측정되어, 통상 약 97%였다. 물 중의 어떠한 시험 pH에서도 7 일간 측정된 순도에 있어서 어떠한 변화가 있다면, 거의 변화가 없었다.
실시예 3
시험관내 방출 동태학
[0068] pH　9.4, 0.1 M 소듐 보레이트 중 실시예 2의 컨쥬게이트 용액을 37℃에서 밀폐된 UV 큐벳에 보관하였다. 유리 SN-38 페녹사이드의 형성에 기인한 414　nm에서의 흡광도 증가를 시간에 따라 모니터링하였다. 데이터를 단일 지수 Amax*(1　-　e-kt)에 적용하여 pH　9.4에서 상기 컨쥬게이트로부터 SN-38 방출에 대한 속도 상수, k를 얻었고, 여기서 Amax는 반응 완결시 흡광도이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 유리 SN-38의 형성은 pH 9.4에서 k　=　0.00257 min-1 (t1 /2　=　270 min)인 1차 동태학을 따랐다. 이들 링커들의 방출 속도는 하이드록사이드에서 1차인 것으로 알려져 있기 때문에, 다른 pH 값에서의 방출 속도는 k(pH)　=　k9.4 * 10(pH - 9.4)로 계산될 수 있다. 따라서, pH　7.4에서 SN-38의 속도는 2.57 x 10-5 min-1이거나, 또는 37℃, pH 7.4에서 t1 /2　=　450 h이다.
실시예 4
생체내 약물동태학
[0069] pH　5.0의 10　mM 소듐 아세테이트 완충액 중 실시예 2의 컨쥬게이트 용액 45 mg/mL을 멸균 여과하고 삽관 암컷 Sprague-Dawley 래트 (n　=　3)에 200 mg/kg로 주입하고, 혈액 시료 (0.3　mL)를 주기적으로 채취하여, 시료의 pH, 응고를 낮추고, 남아있는 온전한 컨쥬게이트를 안정화시키기 위하여 즉시 30 μl pH　4.5인 1 M 시트레이트/0.1% Pluronic® F68 용액에 첨가하였다. 시료를 대략 1,500 x　g (힘)으로 10 분간 2 내지 8℃에서 원심분리하여 적혈구를 제거하고 ~　150　uL 혈장을 얻었다. 혈장을 2개의 앨리쿼트로 나누고 크라이요제닉 바이알로 옮겨 분석 전에 -80℃에서 냉동고에서 보관하였다.
[0070] 분석을 위하여, 시료는 얼음에서 녹이고 내부 표준으로서 8 ng/ml의 캄프토테신을 포함하는 2 부피의 아세토나이트릴/0.5% 아세트산과 혼합하였다. 4℃에서 10 분간 16,000 xg로 원심분리하여 침전된 단백질을 제고하였다. 시료 상층액 (20 uL)을 1.0　mL/min으로 100　mM 소듐 포스페이트, 3　mM 헵탄 술포네이트, pH　4.0 (완충액 A) 및 물 중의 75% 아세토나이트릴 (완충액 B)의 구배를 이용하여 40℃에서 온도조절장치 구비된 Phenomenex® 300Å Jupiter 5 um 150 x 4.6 mm C18 HPLC 컬럼을 이용하여 분석하였다. 구배는 3 분간 5% B 등용매, 3 분간 20% B 등용매, 5 분간 선형 구배 20-40% B, 2 분간 선형 구배 40-100% B, 3 분간 100% B 등용매, 3 분간 5% B 등용매로 구성되었다. 시료 용리 후 다이오드 어레이 검출기 및 최초 9 분 동안 370　nm에서 여기 및 470　nm에서 방출한 후 최종 10 분간 534　nm에서 방출하는 형광 검출기가 후속하였다. 컨쥬게이트 (380　nm 흡광도), 및 SN-38 (형광 Ex: 370　nm; Em: 534　nm)의 표준 곡선에 대한 피크 면적의 비교에 의하여 농도가 계산되었다. 뒤따르는 머무름 시간은: SN-38, 12.7　min; 캄프토테신, 13.2 min; 및 컨쥬게이트, 14.5 min으로 관찰되었다. 정량의 하한은 형광 검출에 의한 신호 대 잡음비 10배 피크 높이에서 결정되어 SN-38: 아세토나이트릴 처리 혈장 20 μl 주입시 0.07 pmoles (아세토나이트릴 처리 혈장에서 3.3 nM, 본래 혈장 시료에서 10 nM). 컨쥬게이트: 아세토나이트릴 처리 혈장20 μl 주입시 2.1 pmoles 컨쥬게이트 (8.4　pmoles SN-38) 아세토나이트릴 처리 혈장에서 (100 nM 컨쥬게이트; 400 nM SN-38), 본래 혈장 시료에서 300 nM (1200 nM SN-38).
[0071] 혈장으로부터 온전한 컨쥬게이트의 제거에 대한 정보를 얻기 위하여, 안정한 유사체 컨쥬게이트 (CH2CN이 없는 화학식 (II))를 이용하여 22 mg/kg로 유사한 실험이 수행되었다.
[0072] SN-38 글루커로나이드의 수준은 문헌 [Poujol, et al., "Sensitive HPLC-Fluorescence Method for Irinotecan and Four Major Metabolites in Human Plasma and Saliva: Application to Pharmacokinetic Studies," Clinical Chemistry (2003)　49:1900-1908]의 방법에 따라 결정되었다.
실시예 5
약물동태학 모델링
[0073] 컨쥬게이트에 대한 혈장 농도 대 시간 데이터를 2-상 모델을 이용하여 분석하였는데, 여기서 C(t)　=　A*exp(-αt) + B*exp(-βt)이고, 여기서 A + B　=　투여량/Vd이다. 데이터를 비선형 회귀 분석 (Nelder-Mead 다운힐 심플렉스)을 이용하여 맞춘 후, 구축되어진 과정에 따라 파라미터들을 디콘볼루션하여 (deconvoluted) 컴파트먼트 (k12 및 k21) 간 이동 속도 및 중앙 컴파트먼트 (kel)로부터의 컨쥬게이트 제거 속도에 대한 추정치를 얻었다. 실시예 2의 컨쥬게이트 및 상응하는 안정한 컨쥬게이트 (여기서, CH2CN은 H로 대체)에 대한 데이터 분석은 표 1에 나타나 있다.
표 1
Figure 112016043182784-pct00018
[0074] 이들 파라미터를 이용하여, 그 후 유리 SN-38 농도 데이터를, 상기 컨쥬게이트가 유리 SN-38을 속도 상수 k1으로 방출하고 제2 컴파트먼트와 Kdist　=　Vd/Vc로 평형을 이루는 모델을 기초로 맞추었다. 모델 곡선은 하기의 미분 방정식을 이용하여 수치 적분에 의하여 생성되었다:
Δ[Cc]　=　 (-k1[Cc] - k12[Cc] - kel[Cc] + k21[Cp])Δt
Δ[Cp]　=　 (k12[Cc] - k21[Cp])Δt
Δ[Dc]　=　 (k1[Cc] - kcl[Dc])/(1 + Kdist)Δt
Kdist 　=　 Vd/Vc
[0075] [Cc] 및 [Cp]가 각각 중앙 및 말단 컴파트먼트에서 컨쥬게이션된 SN-38의 농도인 경우, [Dc]은 중앙 컴파트먼트에서의 유리 SN-38의 농도이고, 속도 상수는 상술한 바와 같으며; kcl 은 혈장으로부터 유리 SN-38의 제거에 대한 속도 상수이고, 이 파라미터에 대하여 보고된 범위 내에서 변화하도록 두었다 (1.4-3.5 h-1). 수치 적분은 최초 조건 [Cc]　=　Cmax, [Cp]　=　0, 및 [Dc]　=　0으로 시간 영역 120 h (Δt　=　0.12 h) 동안 1000 단계에 걸쳐 수행되었다. SN-38에 대한 분포 용적 Vd는 보고된 수치 0.18 L/kg으로 세팅되었지만, Vc는 컨쥬게이트에 대한 Vd로 세팅되었다.
[0076] 이러한 방법을 이용하여, 컨쥬게이션된 SN-38과 그 컨쥬게이트로부터 방출되는 유리 SN-38에 대한 농도 대 시간 데이터를 도 7에 나타낸 바와 같이 맞추었다. 혈장으로부터 유리 SN-38의 제거에 대하여, 보고된 범위 내에 잘 부합하는 kcl　=　2.77 h-1 (t1 /2　=　0.25 h)일 때, 그리고 k1은 0.00173 h-1일 때, 시험관내 측정된 값과 실험 데이터가 잘 일치하였다 (컨쥬게이트로부터 SN-38의 분해에 대한 t1/2　=　400 h).
[0077] 이러한 방법을 이용하여, 다른 종들의 kel 및 kcl 값을 전제로, 그들 종에서의 상기 컨쥬게이트의 행동 양상을 예측할 수 있다. 인간에서, PEG (kel) 및 SN-38 (kcl) 제거에 대한 값 및 분포 용적은 보고되어 있지 않지만, 상대성장 ㅊ처척도를 이용하여 대략 kel　=　0.0087 h-1 (t1 /2 80 h) 및 kcl　=　0.7　h-1 (t1 /2 1 h), 및 Vss　=　 0.15 L/kg을 산정할 수 있다 (Caldwell et al., "Allometric scaling of pharmacokinetic parameters in drug discovery: can human CL, Vss and t1/2 be predicted from in-vivo rat data," Eur J Drug Metab Pharmacokinet . (2004) 29:133-143.) 약물동태학적 모델에서 이들 값을 이용하여 산정된 유리 SN-38의 농도 범위는 Cmax/Cmin　~　2.5이다.
실시예 6
지속적 주입을 위한 SN -38 제제
[0078] SN-38의 치료적 투여는 이 약물의 열악한 수용해성에 의하여 제한되어 왔다 (물에서 7　mg/L, 18　uM). 이러한 한계를 극복하기 위한 제제가 개발되었다. 다양한 제제에서 SN-38의 용해도를 측정하기 위하여, 다양한 제제에서 디메틸 술폭사이드 (DMSO) 중의 115　mM SN-38 용액을 희석하여 15, 10, 5, 및 2　mM 표적 농도를 만들었다 (표 2). 실온에서 16 시간 동안 둔 후, 침전된 SN-38을 30 분간의 14,000　rpm의 원심분리에 의하여 제거하였다. 상층액을 100　mM 보레이트, pH　10.0 내로 1:200 희석하고, SN-38의 농도를 ε414　=　22,500　M-1cm- 1를 이용하여 414　nm에서 분광분석 측정하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2
제제 중 부피 백분율 부형제
Figure 112016043182784-pct00019
[0079] 제제 E 및 F 중의 SN-38은 시험된 가장 높은 농도에서 완전히 용해성으로 남아있었다. PEG300 외 폴리에틸렌 글라이콜이 유사한 장점으로 사용될 수 있음이 예상된다. 또한, 이들 약학적 제제들이, 그 약학 제제를 지속 주입에 의하여 투여함으로써 SN-38에 대한 노출을 필요로 하는 환자에게 지속적인 SN-38에의 노출을 유지하기 위하여 사용될 수 있을 것이 예상된다. 이러한 지속 주입은 의약 분야에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 예컨대 주입 펌프 또는 정맥투여 드립 (i.v. drip)에 의하여 수행될 수 있다.

Claims (20)

  1. 화학식 (I)의 컨쥬게이트:
    Figure 112021088420560-pct00032
    (I)
    식 중, PEG는 선형이거나 분지형이고, q가 2-8일 때 다지형인 폴리에틸렌 글라이콜;
    X는 O, NH, (CH2)m, OC(=O)(CH2)m, 또는 NHC(=O)(CH2)m인데, 여기서 m　=　1-6;
    L은 (CH2)r 또는 (CH2CH2O)p(CH2)r인데, 여기서 r　=　1-10이고 p　=　1-10;
    R1은 CN 또는 SO2NR2 2인데, 여기서 R2 각각은 독립적으로, 그 각각이 동일하거나 상이한 1-3개의 치환체로 치환되거나 비치환된, 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬알케닐, 알킬아릴, 또는 알킬헤테로아릴이거나, 또는 두 R2가 함께 고리를 형성할 수 있고;
    Y　=　COR3 또는 SO2R3인데, 여기서 R3　=　OH, 알콕시 또는 NR4 2이고, 여기서 R4 각각은 독립적으로 알킬, 치환된 알킬이거나 또는 두 R4가 함께 고리를 형성할 수 있고;　및
    q= 1-8이고; 및
    상기 치환체는 할로겐, 아미노, 하이드록실, 술프하이드릴 중에서 선택되거나, 또는 에스테르, 아마이드 또는 유리 카복실기로서의 카복실기를 함유하는 치환체이다.
  2. 제1항에 있어서, X는 (CH2)m인 것인 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, PEG는 평균 분자량 30,000-50,000　Da의 폴리에틸렌 글라이콜인 것인 컨쥬게이트.
  4. 제1항에 있어서, q= 4인 것인 컨쥬게이트.
  5. 제1항에 있어서, R1　=　CN인 것인 컨쥬게이트.
  6. 제1항에 있어서, PEG는 평균 분자량 30,000-50,000　Da의 다지형 폴리에틸렌 글라이콜이고; X는 CH2; L은 (CH2)6; R1은 CN; Y는 CONEt2;　및 q　=　4인 것인 컨쥬게이트.
  7. 제1항에 있어서, 화학식
    Figure 112016043182784-pct00021

    을 갖고, 식 중, m　=　1-6 이고 n은 200-250인 것인 컨쥬게이트.
  8. 제7항에 있어서, m은 1이고 n은 대략　225인 것인 컨쥬게이트.
  9. 약학적 허용 부형제와 함께, 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 컨쥬게이트를 포함하는 항암 약학 제제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제제의 pH는 4.0 내지 6.0인 것인 제제.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 컨쥬게이트의 제조 방법으로서,
    (a) 아미노-링커-SN-38을 생성하기 위하여 화학식 (VII)의 아지도-링커-SN-38을 환원시키는 단계:
    Figure 112021088420560-pct00033
    ;
    (b) 제1항에 기재된 컨쥬게이트를 생성하기 위하여 단계 (a)의 상기 아미노-링커-SN-38을 활성화된 PEG와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 필요에 따라 상기 컨쥬게이트를 단리하는 단계
    를 포함하고,
    SN-38은 7-에틸-10-하이드록시캄프토테신을 나타내고,
    PEG 및 화학식 (VII)에서 L, R1은 및 Y는 제1항에서와 같이 정의되는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    SN-38에 대한 노출을 필요로 하는 환자에게 SN-38에의 지속적, 저투여량 노출을 제공하는 방법에서 사용하기 위한 것이며,
    상기 방법은 상기 환자에게 상기 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함하는 것이고,
    SN-38은 7-에틸-10-하이드록시캄프토테신을 나타내는 것인, 컨쥬게이트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 방법에서 유리 SN-38의 농도는 주1회 투여 사이에 15 내지 5 nM을 유지하는 것인 컨쥬게이트.
  14. 제12항에 있어서, 투여 사이에 관찰되는 Cmax/Cmin는 주1회 투여 사이에 10 이하인 것인 컨쥬게이트.
  15. 제14항에 있어서, 투여 사이에 관찰되는 Cmax/Cmin는 주1회 투여 사이에 5 이하인 것인 컨쥬게이트.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    SN-38을 이용하는 치료를 필요로 하는 환자의 혈장에서 SN-38 글루커로나이드의 수준을 조절하는 방법에 사용하기 위한 것이며,
    상기 방법은 상기 컨쥬게이트를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하고,
    결과하는 SN-38G/SN-38 비는 0.2 미만이고,
    SN-38은 7-에틸-10-하이드록시캄프토테신을 나타내고, SN-38G는 SN-38 10-글루커로나이드를 나타내는 것인, 컨쥬게이트.
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