JP6842479B2 - Ｓｎ−３８の徐放性コンジュゲート - Google Patents

Description

本発明は、抗癌剤ＳＮ−３８の徐放性製剤に関するものである。

カンプトテシンアナログＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）は、抗腫瘍薬イリノテカンの活性代謝産物である。これはイリノテカンよりも約１０００倍の活性があるが、極めて低い水溶性（１７μＭ）と迅速なクリアランスのために治療的に有用ではなかった。

イリノテカン自体は臨床的に使用され、白血病、リンパ腫、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、胃癌、及び乳癌において活性を示している。いくつかの研究から、カンプトテシンの抗腫瘍効果が一般的にはトポイソメラーゼＩの阻害によるものであること、そして当該効果はこの酵素阻害を長期間（「目標到達時間」（ｔｉｍｅ ｏｖｅｒ ｔａｒｇｅｔ））維持することと関連していることが示されている。カンプトテシンの有効なレベルを十分な時間維持するために、典型的には、全身からの該薬物の比較的速やかなクリアランス速度に対抗するため、薬物のかなり高い用量を投与する必要がある。これにより、投与後の初期は高い最大薬物濃度（Ｃ_ｍａｘ）となり、イリノテカンの用量制限毒性となる、生存が危ぶまれる下痢などの毒性をもたらすと考えられる。ＳＮ−３８の高い効力を考えると、トポイソメラーゼＩの阻害にとって十分であるが毒性濃度よりも低い安定した濃度で、長時間注入することにより薬物を供給することが望ましい。ポンプによるイリノテカンの長時間注入を用いた臨床試験はこの仮説を裏付けたが、ＳＮ−３８は投与製剤における溶解性が低いため、この方法はＳＮ−３８には実現可能な治療戦略ではない。

イリノテカンは、肝カルボキシルエステラーゼによってＳＮ−３８に変換され、その後肝ＵＧＴ１Ａによってその１０−グルクロニドであるＳＮ−３８Ｇに代謝される。グルクロン酸抱合は胆汁排泄を促進し、腸内細菌グルクロニダーゼはＳＮ−３８ＧのＳＮ−３８への再変換を引き起こす。腸ＵＧＴ１Ａがこの薬物をもとの不活性型ＳＮ−３８Ｇに変換しない限り、ＳＮ−３８は腸に毒性となる可能性がある。したがって、ＳＮ−３８Ｇは、毒性型ＳＮ−３８の供給源と、さらにＳＮ−３８によって引き起こされる重度の下痢からの保護との、両方の作用を持ち得る。一般的に、高レベルのＳＮ−３８は、ＳＮ−３８Ｇへのグルクロン酸抱合の増加、ＳＮ−３８Ｇの腸への排泄の増加、及び胃腸毒性をもたらす細菌の脱グルクロン酸抱合を生じさせる。

イリノテカンのようなプロドラッグからのＳＮ−３８の放出よりも、可溶性で長寿命の循環コンジュゲートからのＳＮ−３８の徐放の方が上述の問題を解決できると考えられ、多様なコンジュゲーション戦略がＳＮ−３８に適用されてきた。酸素−２０グリシネートエステルを介したポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）へのコンジュゲーション（米国特許第８，２９９，０８９号）により、エステル加水分解により遊離ＳＮ−３８を比較的速やかに（ｔ_１／２＝１２時間）放出する比較的水溶性であるコンジュゲートが提供されている。ＳＮ−３８を迅速に放出するポリオール重合体への別のエステル連結化学も開示されている（米国特許出願公開第２０１０／０３０５１４９Ａ１号）。酸素−１０へのエステル結合を介したポリグルタミン酸−ＰＥＧブロック共重合体へのコンジュゲーションにより、やはりエステル加水分解によって遊離ＳＮ−３８を放出する、ミセルコンジュゲートが提供されている（ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０３９８６９）。水性媒体中でのエステルの不安定性（血漿中ではエステラーゼにより加速され得る）のために、このようなＳＮ−３８のエステルベースのコンジュゲーション戦略は、低用量で長期間ＳＮ−３８へ暴露するのに適切ではなく、通常ＳＮ−３８のレベルは投薬の合間で有効レベルを下回る。これらのコンジュゲートは通常高レベルで投与されることから、ＳＮ−３８の最大濃度は高くなり、かつ高レベルのＳＮ−３８Ｇが形成されることになる。

より制御された放出速度を有するＰＥＧ−ＳＮ−３８コンジュゲートが、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１４０３９３に開示されている。これらのコンジュゲートは、適切なリンカーを選択することにより広範囲にわたって制御可能な速度で、β脱離反応機構を介してＳＮ−３８を放出する。この薬物への高分子のカップリングは、アジドと環状アルキンとの縮合生成物を介して行われ、結果的に比較的不溶性のコンジュゲートをもたらす。本願クレームの亜型は、単純なアミド結合の存在により向上した溶解性を有し、室温、緩衝液中でインビトロの安定性を示す。本発明者らは、予想外にも、放出速度を適切に選択することにより、ＳＮ−３８Ｇのインビボ形成を減少させることができると同時に、活性型ＳＮ−３８に長期間暴露させることができることを見出した。本発明は、ＳＮ−３８の低用量長期暴露レジメンを可能とし、さらに投与期中に形成されるＳＮ−３８Ｇの量を低減させる速度で、非酵素的β脱離反応機構を介して遊離ＳＮ−３８を放出するように設計されたコンジュゲートを提供する。

発明の開示
本発明は、ＳＮ−３８の低用量長期暴露レジメンを可能にし、さらに投与期間中に形成されるＳＮ−３８Ｇの量を低減させる遅い速度で、非酵素的β脱離反応機構を介して遊離ＳＮ−３８を放出するように設計されたコンジュゲートを提供する。また、前記コンジュゲートを製造するための方法、及び細胞の過剰増殖により特徴づけられる疾患及び病状の治療における前記コンジュゲートを使用するための方法も提供する。

したがって、一態様において、本発明は、式（Ｉ）で表されるコンジュゲートを提供する：

［式中、
ＰＥＧは、直鎖状又は分枝状であってよく、ｑが２〜８である場合はマルチアーム型である、平均分子量が２０，０００〜６０，０００Ｄａのポリエチレングリコールであり；
ｑ＝１〜８であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、（ＣＨ_２）_ｍ、ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍ、又はＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍであり、ここでｍ＝１〜６であり；
Ｒ^１は、ＣＮ又はＳＯ_２ＮＲ^２ _２であり、ここで、各Ｒ^２は、独立して、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアルケニル、アルキルアリール、もしくはアルキルヘテロアリールであり、それぞれが任意に置換されていてもよく、又は一緒になって環を形成してもよく；
Ｙ＝ＣＯＲ^３又はＳＯ_２Ｒ^３であり、ここで、Ｒ^３＝ＯＨ、アルコキシ、もしくはＮＲ^４ _２であり、ここで、各Ｒ^４は、独立して、アルキル、置換アルキルであるか、又は一緒になって環を形成してもよく；かつ
Ｌは、（ＣＨ_２）_ｒ又は（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｒであり、ここで、ｒ＝１〜１０であり、かつ、ｐ＝１〜１０である］。

第２の態様において、本発明は、式（Ｉ）のコンジュゲート及びその中間体の製造方法を提供する。

第３の態様において、本発明は、式（Ｉ）のコンジュゲートを用いたＳＮ−３８の徐放方法を提供する。

第４の態様において、本発明は、コンジュゲートからのＳＮ−３８の放出速度を制御することによって、ＳＮ−３８の投与時に形成されるＳＮ−３８グルクロニドの量を最小限化する方法を提供する。

第５の態様において、本発明は、ＰＥＧ及びＤＭＳＯを含有する、ＳＮ−３８を可溶化する製剤、ならびにそれを使用する方法に関する。

図１は、本発明のコンジュゲートからの遊離ＳＮ−３８の放出を示す。 図２は、本発明のアジドリンカー−ＳＮ−３８（ＶＩＩ）中間体を調製するための１つの方法を示す。 図３は、ＴＨＦ／水中でトリメチルホスフィンと酢酸を用いて、アジドリンカー−ＳＮ−３８（ＶＩＩ）をアミンリンカー−ＳＮ−３８（ＶＩＩＩ）に還元するための１つの方法を示す。 図４は、Ｒ^１がＣＮであり、ＹがＣＯＮＥｔ_２であり、ｑ＝４、ＸがＣＨ_２であり、Ｌが（ＣＨ_２）_５であり、かつ、ＰＥＧがペンタエリスリトールコアを有する４−アームポリ（エチレングリコール）である、本発明のコンジュゲート（Ｉ）を調製するための１つの方法を示す。 図５は、Ｒ^１がＣＮであり、ＹがＣＯＮＥｔ_２であり、ｑ＝４、ＸがＣＨ_２であり、Ｌが（ＣＨ_２）_５であり、かつ、ＰＥＧが平均分子量４０，０００（ｎが約２２５）の４−アームポリ（エチレングリコール）である、１種類の式（Ｉ）のコンジュゲートの詳細な構造を示す。 図６は、Ｒ^１がＣＮであり、ＹがＣＯＮＥｔ_２であり、ｑ＝４、ＸがＣＨ_２であり、Ｌが（ＣＨ_２）_５であり、かつ、ＰＥＧが平均分子量４０，０００の４−アームポリ（エチレングリコール）である、本発明のコンジュゲートからのＳＮ−３８のインビトロ放出速度カイネティクスを示す。ＳＮ−３８は１０−ＯＨのイオン化のため約８．６のｐＫ_ａを有する；フェノラートの形成により、ＳＮ−３８のＵＶ／Ｖｉｓ吸収最大は４１４ｎｍにシフトする。１０−ＯＨを介してコンジュゲート化された場合、ＳＮ−３８は４１４ｎｍで吸収をまったく示さない。したがって、４１４ｎｍでの吸収増加は、コンジュゲートからの遊離ＳＮ−３８の形成の指標となる。曲線は、ｐＨ９．４で０．００２５７分^−１の一次速度定数を用いて実験データにフィットさせたものを示す。この曲線から、ｐＨ７．４における放出ｔ_１／２は４５０時間と求められる。 図７は、Ｒ^１がＣＮであり、ＹがＣＯＮ（Ｅｔ）_２であり、ｑ＝４、ＸがＣＨ_２であり、Ｌが（ＣＨ_２）_５であり、かつ、ＰＥＧは平均分子量４０，０００の４−アームポリ（エチレングリコール）である、式（Ｉ）のコンジュゲートを用い、該コンジュゲート２００ｍｇ／ｋｇ（ＳＮ−３８ ７ｍｇ／ｋｇ）をラット（平均ｎ＝３）に静脈内投与した後の生体内における、コンジュゲート（四角）、及び該コンジュゲートから放出された遊離ＳＮ−３８（丸）のレベルを示す。曲線は、インビボ放出ｔ_１／２＝４００時間を用いて、実施例５に記載したように作成した。 図８は、Ｒ^１がＣＮであり、ＹがＣＯＮ（Ｅｔ）_２であり、ｑ＝４、ＸがＣＨ_２であり、Ｌが（ＣＨ_２）_５であり、かつ、ＰＥＧが平均分子量４０，０００の４−アームポリ（エチレングリコール）である、式（Ｉ）のコンジュゲートを用い、該コンジュゲート２００ｍｇ／ｋｇ（ＳＮ−３８ ７ｍｇ／ｋｇ）をラット（平均ｎ＝３）に静脈内投与した後の生体内における、該コンジュゲートから形成された、遊離ＳＮ−３８（丸）及びＳＮ−３８グルクロニド（四角）のレベルを示す。

一態様において、本発明は、式（Ｉ）で表されるコンジュゲートを提供する：

［式中、
ＰＥＧは、直鎖状又は分枝状であってよく、ｑが２〜８である場合はマルチアーム型である、平均分子量が２０，０００〜６０，０００Ｄａのポリエチレングリコールであり；
ｑ＝１〜８であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、（ＣＨ_２）_ｍ、ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍ、又はＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍであり、ここでｍ＝１〜６であり；
Ｒ^１は、ＣＮ又はＳＯ_２ＮＲ^２ _２であり、ここで、各Ｒ^２は、独立して、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアルケニル、アルキルアリール、もしくはアルキルヘテロアリールであり、それぞれが任意に置換されていてもよく、又は一緒になって環を形成してもよく；
Ｙ＝ＣＯＲ^３又はＳＯ_２Ｒ^３であり、ここで、Ｒ^３＝ＯＨ、アルコキシ、もしくはＮＲ^４ _２であり、ここで、各Ｒ^４は、独立して、アルキル、置換アルキルであるか、又は一緒になって環を形成してもよく；かつ
Ｌは、（ＣＨ_２）_ｒ又は（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｒであり、ここで、ｒ＝１〜１０であり、かつ、ｐ＝１〜１０である］。

用語「アルキル」は、１〜８個の炭素原子、いくつかの実施形態では１〜６個もしくは１〜４個の炭素原子の直鎖状、分枝状、又は環状の飽和炭化水素基として定義される。

用語「アルケニル」は、１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する、１〜６個もしくは１〜４個の炭素原子の非芳香族の直鎖状、分枝状、又は環状の不飽和炭化水素として定義される。

用語「アルキニル」は、１つ以上の炭素−炭素三重結合を有する、１〜６個もしくは１〜４個の炭素原子の非芳香族の直鎖状、分枝状、又は環状の不飽和炭化水素として定義される。

用語「アルコキシ」は、酸素原子に結合したアルキル基として定義され、例えば、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、及び同様の基を含む。

用語「アリール」は、６〜１８個の炭素原子、好ましくは６〜１０個の炭素原子の芳香族炭化水素基として定義され、例えば、フェニル、ナフチル、及びアントラセニルなどの基を含む。用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１個のＮ、ＯもしくはＳ原子を含有する３〜１５個の炭素原子を含む芳香族の環、好ましくは、少なくとも１個のＮ、ＯもしくはＳ原子を含有する３〜７個の炭素原子を含む芳香族の環として定義され、例えば、ピロリル、ピリジル、ピリミジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、キノリル、インドリル、インデニル、及び同様の基を含む。

用語「ハロゲン」は、ブロモ、フルオロ、クロロ及びヨードを含む。

基が「任意に置換されていてもよい」場合、その置換基は、同一又は異なる１〜３個の置換基を含み、該置換基としては、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、及びスルフヒドリル、並びに、エステル、アミドとして、又は遊離カルボキシル基としてカルボキシル基を含む置換基を含むことができる。ここに例示したものは、すべてを網羅することを意図したものではなく、非干渉性の置換基であればいかなるものも、任意に存在する置換基の中に含めることができる。

本明細書で使用する「ａ」、「ａｎ」などは、別段の示されていない限り、１つ又は複数を意味することが意図されている。さらに、整数の範囲が示されている場合、すべての中間の整数は、具体的に記載されているのと同様に含むことが意図されている。

ＰＥＧは、直鎖状、分枝状、又はマルチアームの、平均分子量２０，０００〜６０，０００（すなわち、約４００〜約１５００のエチレンオキシド単位を含む）、又は３０，０００〜５０，０００のポリ（エチレングリコール）であってよく、ここで、少なくとも１つのポリマー末端はカルボキシレート官能基で終わっていてもよい。ＰＥＧは、Ｃ＝Ｏ基がアミンとの反応のために活性化された誘導体、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、又はニトロフェニルカーボネートとしてとして、ＮＯＦ社及びＪｅｎｋｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社などから市販されている。これらの高分子量ＰＥＧは、分子量のガウス分布で構成され（すなわち、多分散であり）、したがって、エチレンオキシド単位の数の分布を含む。これらは平均分子量で記載されており、本明細書における平均分子量は、産業的に供給される、表示された平均分子量を有する材料において、通常存在する分子量分布及びエチレンオキシド単位の分布についても包含することが意図される。４−アームＰＥＧの典型的な多分散指数（ＰＤＩ）は１．１以下であり、ＰＤＩ＝Ｍ_ｗ／Ｍ_ｍとして計算される。Ｍ_ｗはΣＭ_ｉ ^２ Ｎ_ｉ／ΣＭ_ｉＮ_ｉとして算出される重量平均モル質量であり、Ｍ_ｍはΣＭ_ｉＮ_ｉ／ΣＮ_ｉとして算出される数平均モル質量であり、ここで、Ｍは化学種ｉの分子量であり、Ｎはサンプル中の化学種ｉの数である。ＰＤＩは、ゲル浸透クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、又は質量分析などの当技術分野で公知の技術により測定することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１２６８６６ Ａ１号参照）。マルチアームＰＥＧは、ペンタエリスリトール、ヘキサグリセロール、及びトリペンタエリスリトールなどの種々のコア単位から出発して形成することにより、さまざまなアーム構成及びアーム総数とすることができる。

ＰＥＧの少なくとも１つのアームは、リンカー−ＳＮ−３８との結合を可能にするために、連結基Ｘを介してカルボキシレート官能基で終端する。Ｘは、カルボキシレート官能基をＰＥＧと結合させる役割を果たし、Ｏ、ＮＨ、（ＣＨ_２）_ｍ、ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍ、又はＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍ（ここで、ｍ＝１〜６）を含む典型的な連結基のいずれであってもよい。本発明のいくつかの実施形態では、ＸはＯ、ＮＨ、（ＣＨ_２）_ｍ、又はＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍである。本発明の一実施形態では、Ｘは（ＣＨ_２）_ｍである。

本発明のある特定の実施形態では、ＰＥＧは４０，０００±４，０００Ｄａの平均分子量を有する（すなわち、全部で約８００〜１０００のエチレンオキシド単位を含む）。一実施形態では、ＰＥＧは、ペンタエリスリトールコアを有し、かつ、平均分子量が４０，０００±４，０００Ｄａである４−アームポリマーであり、ここで、各アームは、平均で２２５±２５のエチレンオキシド単位を含み、かつ、カルボキシレート基で終端しており、かつ、式（ＩＩＩ）を有する：

［式中、ｎ＝２００〜２５０であり、かつ、ｍ＝１〜６である］。関連するコンジュゲートは以前にＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１４０３９３で開示されているが、本発明者らは、予期せざることに、以前に開示された、アジドとジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ又はＤＩＢＯＣ）との間の１，３−双極子付加環化によりＰＥＧが連結されたコンジュゲートと比較して、より親水性のアミド結合を介してＰＥＧがリンカー−ＳＮ−３８に連結することで、改善された溶解性及び粘度特性を有するコンジュゲートが得られることを見出した。

Ｌは、式（ＣＨ_２）_ｒ又は（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｒ（ここで、ｒ＝１〜１０であり、かつｐ＝１〜１０である）を有する連結基である。

Ｒ^１は、ＣＮ又はＳＯ_２ＮＲ^２ _２であり、ここで、各Ｒ^２は、独立して、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアルケニル、アルキルアリール、もしくはアルキルヘテロアリールであり、それぞれが任意に置換されていてもよく、又は一緒になって環を形成してもよい。いくつかの実施形態では、各Ｒ^２は独立してアルキルである。Ｒ^１が、コンジュゲートからのＳＮ−３８の放出速度を制御することは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１４０３９３及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／５４２９３（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載の通りである。低用量の長期暴露レジメンを実施するために、コンジュゲートからのＳＮ−３８の放出速度は、放出のインビボ半減期として、約１００〜約１０００時間であり、好ましくは約３００〜約８００時間、最も好ましくは約４００〜５００時間でなければならない。インビボ放出速度は、ｐＨ７．４、３７℃で測定された対応するインビトロ放出速度よりも最大で約３倍速い可能性がある。ある実施形態では、Ｒ^１はＣＮである。この実施形態では、放出のインビトロ及びインビボ（ラット）半減期は４００時間として測定されている。ある他の実施形態では、Ｒ^１はＳＯ_２ＮＲ^２ _２である。ある特定の実施形態では、Ｒ^１はＳＯ_２ＮＲ^２ _２であり、ここで、各Ｒ^２は、独立して、メチル、エチル、アリル、ベンジル、２−メトキシエチル、又は３−メトキシプロピルであるか、あるいは、ＮＲ^２ _２は、モルホリノ、２，３−ジヒドロインドリル、又は１，２，３，４−テトラヒドロキノリルを形成する。

Ｙは、早期の放出に対してコンジュゲートを安定化させる電子求引性の置換基である。ある実施形態では、Ｙは、ＣＯＲ^３又はＳＯ_２Ｒ^３であり、ここで、Ｒ^３は、ＯＨ、ＯＲ^４、も又はＮＲ^４ _２であり、ここで、各Ｒ^４は、独立して、アルキル、又は置換アルキルであるか、あるいは、両方のＲ^４が一緒になって環を形成していてもよい。いくつかの実施形態では、Ｙはパラ位にある。ＹはＳＮ−３８へのＮ−ＣＨ_２−Ｏ結合を安定化するのに役立ち、よって、薬物が自発的にコンジュゲートから切断される速度を最小限にする。ある実施形態では、ＹはＣＯＮＲ^４ _２であり、ある特定の実施形態では、ＹはＣＯＮ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２、ＣＯＮ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２Ｏ、又はＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２Ｏであり、ここでＮと組み合わされた（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２Ｏはモルホリノ基である。β脱離及びＳＮ−３８の放出から生じるｐ−アミノ安息香酸類及びｐ−アミノスルホンアミド類は、一般的に毒性が低いと考えられる。

本発明の具体的な実施形態では、構造（ＩＩ）を有する式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される：

［式中、ｍは１〜６であり、かつｎは１００〜３７５（すなわち、２０，０００〜６０，０００Ｄａ、又は３０，０００〜５０，０００Ｄａの平均分子量のＰＥＧ）である］。本発明のより具体的な実施形態では、ｍが１〜３である、式（ＩＩ）を有するコンジュゲートが提供される。本発明のさらに具体的な実施形態では、ＰＥＧの平均分子量が約４０，０００となるように、ｍが１であり、かつｎが２００〜２５０又は約２２５である。

本発明の別の態様においては、式（Ｉ）のコンジュゲートを調製するための方法が提供される。以前にＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１４０３９３で開示された、アジドリンカー−ＳＮ−３８中間体の製造方法の１つを図２に示す。このようにして、例えば、ピリジンなどの弱塩基の存在下、ホスゲン又はホスゲン等価物（トリホスゲンなど）を用いて中間体をクロロホルメートに変換し、続いてアニリンＮＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４−Ｙと反応させることにより、アジドアルコール（ＩＶ）をカルバメート（Ｖ）に変換する。あるいは、（Ｖ）は、（ＩＶ）をイソシアネートＯＣＮ−Ｃ_６Ｈ_４−Ｙで処理することにより、直接形成させることができる。その後、カルバメート（Ｖ）は、Ｍａｊｕｍｄａｒの方法（「カルボン酸含有薬物のＮ−アルキル−Ｎ−アルキルオキシカルボニルアミノメチル（ＮＡＮＡＯＣＡＭ）プロドラッグ」，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔｓ（２００７）１７：１４４７−１４５０）の変法を用いてＮ−クロロメチル化し、本方法では、クロロトリメチルシランと不活性溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、１，２−ジクロロエタン、ジオキサン、又はトルエンなど）の混合物中でカルバメート（Ｖ）とパラホルムアルデヒドを接触させる。好ましい実施形態では、不活性溶媒はトルエンである。触媒クロロトリメチルシランは、（Ｖ）よりも１〜１０倍モル過剰、好ましくは４倍モル過剰に存在する。本反応は２０〜１００℃、好ましくは４０〜６０℃、最も好ましくは５０℃の温度で、不活性雰囲気下に実施することができ、反応の進行は、反応性のＮ−（クロロメチル）カルバメート（ＶＩ）を安定した化学種に変換することによって、例えば、反応混合物のアリコートを、クロロトリメチルシランを中和するのに十分なトリアルキルアミン塩基を含有するエタノール中で希釈し、続いて得られたＮ−（エトキシメチル）カルバメートをＨＰＬＣで分析することによって、モニターすることができる。

図２に示す通り、Ｎ−（クロロメチル）カルバメート（ＶＩ）によりＳＮ−３８のフェノール性ＯＨがアルキル化され、アジドリンカー−ＳＮ−３８（ＶＩＩ）が生成する。フェノールを脱プロトン化してアルキル化させるために種々の塩基を使用することができ、例えば、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ＫＯ^ｔＢｕ）などのアルコキシド、リチウムビス（トリメチルシリルアミド）（ＬｉＨＭＤＳ）などの金属アミド、ＮａＨなどの金属水素化物、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）などのアミジン、及びホスファゼン塩基が使用される。好ましい実施形態では、塩基はＫＯ^ｔＢｕである。まず、適切な溶媒中のＳＮ−３８を、−２０〜２５℃、好ましくは−２０〜５℃、最も好ましくは４℃の温度で塩基と接触させて、フェノラート塩を生成させる。次に、該フェノラートを、−２０〜２５℃、好ましくは−２０〜５℃、最も好ましくは４℃の温度でＮ−（クロロメチル）カルバメート（ＶＩ）と接触させて、アジドリンカー−ＳＮ−３８（ＶＩＩ）溶液を生成させる。適切な溶媒としては、ＴＨＦ、ＤＭＦ、及びこれらの混合物が挙げられる。

図３に示されるように、アジドリンカー−ＳＮ−３８（ＶＩＩ）は、アジドを還元することによってアミノリンカー−ＳＮ−３８（ＶＩＩＩ）に変換される。還元はいくつかの手段によって達成することができ、例えば、パラジウムもしくは白金などの金属触媒の存在下での触媒水素化分解；トリアルキルホスフィンもしくはトリアリールホスフィンなどのホスフィンを使用するシュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）還元；又はシランの存在下でのインジウム還元が挙げられる。トリメチルホスフィンのような著しく塩基性のトリアルキルホスフィンを使用する場合、適切な酸を添加して反応の塩基性度を緩和し、β脱離リンカーの早期切断を防止する。好ましい実施形態では、ＴＨＦ／水中でトリメチルホスフィン−酢酸を使用して（ＶＩＩ）を（ＶＩＩＩ）に変換する。

図４に示されるように、アミノリンカー−ＳＮ−３８（ＶＩＩＩ）を活性化ＰＥＧに連結してコンジュゲート（Ｉ）を得る。適切に活性化されたＰＥＧは、アミン反応性の官能基で終端したポリマー鎖を有する。前記アミン反応性の官能基は、例えば、Ｘが存在しない式（Ｉ）のコンジュゲートを生成する場合には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタハロフェニルエステル、又はニトロフェニルエステルなどであり、ＸがＯである式（Ｉ）のコンジュゲートを生成するに場合には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、ペンタハロフェニルカーボネート、又はニトロフェニルカーボネートなどである。あるいは、ポリマー鎖がカルボン酸で終端しているＰＥＧは、ペプチドカップリング剤の存在下で使用することができ、このようなペプチドカップリング剤としては、ＤＣＣもしくはＥＤＣＩのようなカルボジイミド、ＢＯＰもしくはＰｙＢＯＰのようなホスホニウム試薬、又はＨＡＴＵもしくはＨＢＴＵのようなウロニウム試薬が挙げられる。カップリングは水性又は無水条件下で行われ、好ましくは、アセトニトリル、ＴＨＦ、ＤＭＦ、又はジクロロメタンなどの適切な溶媒中、無水条件にて行う。好ましい実施形態では、ＮＨＳエステルで終端したポリマー鎖を有する活性化ＰＥＧをＴＨＦ溶媒中、０〜２５℃の温度で使用する。

得られたコンジュゲートは、当技術分野で公知の方法を用いて精製することができる。例えば、エチルエーテル又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）などのエーテル溶媒を添加することによって、反応混合物からコンジュゲートを沈殿させることができる。また、透析又はサイズ排除クロマトグラフィーによってコンジュゲートを精製することもできる。

第３の態様において、本発明は、式（Ｉ）のコンジュゲートを用いたＳＮ−３８の徐放方法を提供する。一実施形態では、コンジュゲートからＳＮ−３８を放出させる半減期は１００〜１０００時間、好ましくは３００〜５００時間、より好ましくは約４００時間である。

本発明の別の実施形態では、ＳＮ−３８への連続的な低用量暴露を必要とする患者に本発明のコンジュゲートを投与することを含む、該患者を連続的に低用量のＳＮ−３８で暴露する方法が提供される。より具体的な実施形態では、遊離ＳＮ−３８の濃度は、週１回投与の投与間（投与と投与の間）に１５〜５ｎＭに維持される方法が提供される。

本発明の別の実施形態では、コンジュゲートの投与間（投与と投与の間）に観察されるＳＮ−３８のＣ_ｍａｘ／Ｃ_ｍｉｎ比を制御する方法が提供される。生じるＣ_ｍａｘ／Ｃ_ｍｉｎ比は、週１回投与の投与間において１０以下、より好ましくは５以下、より好ましくは約２．５である。

図６に示されるように、ＰＥＧが、平均分子量４０，０００の４−アーム型ポリエチレングリコール（ペンタエリスリトールコア）である式（ＩＩ）のコンジュゲート［すなわち、ｑが４であり；ＸがＣＨ_２であり；Ｒ^１がＣＮであり；ＹがＣＯＮＥｔ_２であり；ＰＥＧが平均分子量４０，０００の４−アーム型ポリ（エチレングリコール）；及びＬが（ＣＨ_２）_５である式（Ｉ）］は、３７℃、ｐＨ９．４の緩衝液中に置かれたとき、４．５時間の半減期を有する一次反応で遊離ＳＮ−３８を放出した。本明細書において使用するβ脱離リンカーはｐＨ依存性の一次放出速度を示すことを実証しており、生理的ｐＨ（７．４）での対応する放出半減期は４５０時間であると算出することができる。

図７に示されるように、同じコンジュゲートを静脈内注射でラットに投与すると遊離ＳＮ−３８が放出され、この遊離ＳＮ−３８は該コンジュゲートとパラレルな濃度対時間プロファイルをたどり、約５１時間の最終半減期を示した。この結果は、ＳＮ−３８の直接静脈内投与が、ラットにおいて７〜３４分の最終半減期を示す（Ａｔｓｕｍｉ，ｅｔ ａｌ．，「ラットへの１４Ｃ−ＳＮ−３８の単回静脈内投与後の、イリノテカンの活性代謝産物ＳＮ−３８ ［（＋）−（４Ｓ）−４，１１−ジエチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］−シンドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン］の薬物動態」，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９９５）１８：１１１４−１１１９；Ｋａｔｏ，ｅｔ ａｌ．，「パニペネムはラットにおいてイリノテカンの活性代謝産物ＳＮ−３８及び不活性代謝産物ＳＮ−３８グルクロニド（ＳＮ−３８Ｇ）の薬物動態を変化させない」，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１１）３１：２９１５−２９２２）ことと比較される。したがって、本発明のコンジュゲートはＳＮ−３８のインビボ半減期を大幅に延長する。

コンジュゲートから放出された薬物のレベル及び観察された最終半減期は、コンジュゲートと薬物の薬物動態パラメータを組み合わせた結果であり、最終半減期は単純な１−コンパートメントモデルにおけるコンジュゲート消失速度と薬物放出速度の和である（Ｓａｎｔｉ，ｅｔ ａｌ．，「高分子コンジュゲートからの制御された化学物質放出による治療薬の予測可能かつ調整可能な半減期延長」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１２）１０９：６２１１−６２１６）。これらのパラメータを決定するために、コンジュゲートが２つのコンパートメント間に分散していて、クリアランスされる前に遊離ＳＮ−３８を放出できる薬物動態モデルを用いてデータを分析した。コンジュゲート自体のクリアランス速度（ｋ_ｅｌ）を確立するため、同様の安定したコンジュゲート（ＣＨ_２ＣＮが存在しない式（ＩＩ））をラットに静脈内投与して、２−コンパートメントモデルを用いて薬物動態パラメータを取得した。

図７に示されるように、濃度対時間データは、インビボで遊離ＳＮ−３８を約４００時間の半減期で放出するコンジュゲート（ＩＩ）と一致する。ラットにコンジュゲート（ＩＩ）を２００ｍｇ／ｋｇ（７ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８を含む）で単回注射した後に、ＳＮ−３８の血漿レベルは７日間にわたって２１０〜２０ｎＭに及ぶことが観察された（すなわち、Ｃ_ｍａｘ／Ｃ_ｍｉｎ＝１０）。コンジュゲート及び対応して遊離ＳＮ−３８の最終半減期は、ラットにおけるコンジュゲートの比較的速い消失速度によって制限される。ＰＥＧコンジュゲートの消失速度は、腎臓ろ過の速度の差により種依存性となり、４０，０００−Ｄａ ＰＥＧの最終半減期は、マウスでは約１２時間、ラットでは２４〜４８時間、ヒトでは７２〜１２０時間である。さらに、薬物の消失速度はラットと比べてヒト患者において遅いことが一般的である（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，「創薬における薬物動態パラメータのアロメトリック・スケーリング：ヒトＣＬ、Ｖｓｓ及びｔ１／２は生体内ラットデータから予測できるか？」，Ｅｕｒ Ｊ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．（２００４）２９：１３３−１４３参照）。よって、コンジュゲートからの薬物放出速度が血液ｐＨ値の不変性により比較的種非依存的であると予想されるとしても、式（Ｉ）のコンジュゲートから放出されるＳＮ−３８の最終半減期は、げっ歯類と比べてヒトでは実質的に長いことが期待される。ヒト患者における本発明のコンジュゲート及び遊離ＳＮ−３８の実際の薬物動態パラメータは不明であるが、実施例５で後述するように、アロメトリック・スケーリングを用いたこれらの値の推定値は、ヒト患者においてＣ_ｍａｘ／Ｃ_ｍｉｎ約２．５と推定される。ＳＮ−３８プロドラッグであるイリノテカンのヒト患者への持続注入から、ＳＮ−３８の血漿レベルを約５〜１５ｎＭで長期間維持すると最大限の効力が得られることが示されている。したがって、ラットの薬物動態データは、本発明のコンジュゲートがＳＮ−３８を有効な低レベルで持続的に放出するできることを予測させる。

驚くべきことに、ラットを式（ＩＩ）のコンジュゲートで治療する際に観察されるＳＮ−３８Ｇのレベルは極めて低く、Ｃ_ｍａｘでＳＮ−３８Ｇ／ＳＮ−３８≦０．１であった。これは、エステル結合したイリノテカンコンジュゲート（Ｃ_ｍａｘでＳＮ−３８Ｇ／ＳＮ−３８が約１５である；Ｅｌｄｏｎ，ｅｔ ａｌ．，「進行性固形腫瘍の患者におけるトポイソメラーゼ阻害剤−ポリマーコンジュゲートＮＫＴＲ−１０２の母集団薬物動態」，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｓｔｅｒ ８Ｅ（２０１１））、又はエステル結合したＳＮ−３８コンジュゲート（Ｃ_ｍａｘでＳＮ−３８Ｇ／ＳＮ−３８が約１である；Ｐａｔｎａｉｋ，ｅｔ ａｌ．，「進行性悪性腫瘍の患者における新規抗癌剤ＥＺＮ−２２０８：フェーズＩ用量漸増試験）」，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｏｓｔｅｒ Ｃ２２１（２００９））を用いた治療とは対照的である。したがって、ＳＮ−３８は、非常にゆっくりと放出された場合、効果的にグルクロン酸抱合されないと思われる。この仮説と一致して、Ｒ^１＝ＰｈＳＯ_２を有するコンジュゲートをラットで試験した場合、予想通りＳＮ−３８がより速く放出され（ｔ_１／２＝１０時間）、遊離ＳＮ−３８の初期レベルがより高くなり、かつＣ_ｍａｘでＳＮ−３８Ｇ／ＳＮ−３８＝０．２とより高くなることが観察された。

したがって、第４の態様において、本発明は、コンジュゲートからのＳＮ−３８の放出速度を制御することにより、ＳＮ−３８の投与時に形成されるＳＮ−３８グルクロニドの量を最小化させる方法を提供する。本発明の一実施形態は、ＳＮ−３８の投与時に形成されるＳＮ−３８グルクロニドの量を最小化させる方法であって、ＳＮ−３８放出の半減期が１００時間を超えることにより特徴づけられるコンジュゲートが用いられる方法である。より具体的な実施形態では、ＳＮ−３８放出の半減期は１００〜１０００時間である。好ましい実施形態では、ＳＮ−３８放出の半減期は３００〜５００時間である。さらにより好ましい実施形態では、ＳＮ−３８放出の半減期は約４００時間である。

本発明のコンジュゲートは、当技術分野で公知の薬学的に許容される種々の賦形剤を用いて製剤化することができ、また、コンジュゲートの安定性に最適なｐＨを有する水性緩衝液中に都合よく製剤化することができる。本発明の一実施形態では、コンジュゲートはｐＨ値４〜６の水性緩衝液中に製剤化される。予想外にも、式（Ｉ）のコンジュゲートは、ＷＯ２０１１／１４０３９３に開示された関連コンジュゲートよりも水性緩衝液中に顕著に可溶性であることが見出され（以下の実施例２参照）、よって、これらの化合物による治療を必要とする患者へのより広い投薬範囲が可能とする。

本発明のコンジュゲートは、ＳＮ−３８又はＳＮ−３８プロドラッグ、例えばイリノテカンが有用性を有するあらゆる状況において、有用性があることが期待される。現在では、イリノテカンは、白血病、リンパ腫、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、胃癌、及び乳癌を含む種々の癌の治療に使用されており、よって、本発明のコンジュゲートは同様に使用され得ることが想定される。

実施例６に示した別の実施形態では、ＳＮ−３８製剤は、賦形剤がＰＥＧとＤＭＳＯを含む場合に可溶化形態となる。これは、例えば、持続注入のために特に有用である。ＰＥＧとＤＭＳＯの比は、９０：１０から１０：９０までの範囲で変化するが、７５：２５、２５：７５、もしくは５０：５０、又はその中間値であってもよい。有用なＰＥＧ成分は、凡そＰＥＧ１００（１００）〜ＰＥＧ（６００）の範囲である。

別段示されていない限り、すべての参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一般的方法：ＨＰＬＣは、ダイオードアレイ検出を備えた島津ＨＰＬＣシステムを用いて行った。逆相には、４０℃に自動温度調節したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｊｕｐｉｔｅｒ ５μｍ ３００Å ４．６×１５０ｍｍカラムを使用し、０．１％のＴＦＡを含有する水中の２０〜１００％アセトニトリル勾配を１．０ｍＬ／分の流速で用いた。サイズ排除ＨＰＬＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ＢｉｏＳｅｐ（商標）Ｓ−２０００カラムを、４０℃で、５０：５０アセトニトリル／水／０．１％ＴＦＡをランニングして使用した。ＳＮ−３８を含有する溶液は、ｅ＝２２，５００Ｍ^−１ｃｍ^−１を用いて、アセトニトリル中の３６３ｎｍにおけるＵＶ吸光度により定量した。ＳＮ−３８はＨａｏｒｕｉ社（中国）から購入した。

調製Ａ
６−アジド−１−ヘキサノール

水４００ｍＬ中の６−クロロ−１−ヘキサノール（５０．０ｇ，３６６ｍｍｏｌ）とアジ化ナトリウム（６５．０ｇ，１０００ｍｍｏｌ）の混合物を１９時間穏やかに加熱還流した。周囲温度に冷却した後、この混合物を３×２００ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。抽出物を１×１００ｍＬの水、１×１００ｍＬの飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させることにより無色のオイル４４．９ｇ（８６％）が得られた。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ３．６６（２Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），３．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．５５−１．６６（ｍ，４Ｈ），１．３８−１．４４（ｍ，２Ｈ）。

調製Ｂ
６−アジドヘキサナール

トリクロロイソシアヌル酸（１２．２ｇ，５２．５ｍｍｏｌ）を、氷上で冷却したジクロロメタン１００ｍＬ中の６−アジド−１−ヘキサノール（７．２ｇ，５０．０ｍｍｏｌ）の強撹拌溶液に添加した。得られた懸濁液に、ジクロロメタン２ｍＬ中のＴＥＭＰＯ（０．０８０ｇ，０．５１ｍｍｏｌ）溶液を滴下した。４℃で１０分後、この懸濁液を周囲温度まで温め、さらに３０分間撹拌した。ＴＬＣ分析（３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は完全な反応を示した。この懸濁液を、ジクロロメタンを用いて１ｃｍのセライトパッドを通してろ過した。ろ液を２×１００ｍＬの１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３、１×１００ｍＬの水、１×１００ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ、及び１×１００ｍＬの飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させることによりオレンジ色のオイル９．８ｇが得られた。これを少容量のジクロロメタン中に溶解し、０〜２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配を用いてＳｉＯ_２（８０ｇ）のクロマトグラフィーにかけることにより、アルデヒド生成物６．６７ｇ（４７．３ｍｍｏｌ；９５％）を無色のオイルとして得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ９．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），３．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．４７（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．６，７．６Ｈｚ），１．５９−１．７１（ｍ，４Ｈ），１．３８−１．４６（ｍ，２Ｈ）。

調製Ｃ
７−アジド−１−シアノ−２−ヘプタノール

ヘキサン中の１．６Ｍ ｎ−ブチルリチウム溶液（３５ｍＬ，４９ｍｍｏｌ）をＮ_２下、−７８℃で、無水ＴＨＦ１００ｍＬに添加した。アセトニトリル（３．１４ｍＬ，６０ｍｍｏｌ）を強撹拌しながら高速流で加え、白色の懸濁液を形成させた。１５分後、この懸濁液を１時間以上にわたって−２０℃に温めた。再び−７８℃に冷却した後、６−アジドヘキサナール（６．６７ｇ，４７ｍｍｏｌ）を添加し、黄色の溶液を得た。これをさらに１５分間撹拌し、次いで−２０℃まで温め、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液２０ｍＬを添加してクエンチした。ＥｔＯＡｃで希釈した後、この混合物を水、１Ｎ ＨＣｌ、水、及び飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、次にＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させることにより、黄色のオイル８．０ｇを得た。これを少容量のジクロロメタン中に溶解し、０〜４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配を用いてＳｉＯ_２（８０ｇ）のクロマトグラフィーにかけることにより、生成物６．０ｇ（２１．６ｍｍｏｌ；８４％）が無色のオイルとして得られた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）：δ ５．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．６９（１Ｈ，ｍ），３．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），２．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８，１６．４Ｈｚ），２．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，１６．４Ｈｚ），１．５５（２Ｈ，ｍ），１．４２（２Ｈ，ｍ），１．３０（４Ｈ，ｍ）。

調製Ｄ
Ｎ，Ｎ−ジエチル ４−ニトロベンズアミド

アセトニトリル１００ｍＬ中の塩化４−ニトロベンゾイル（１８．６ｇ，１００ｍｍｏｌ）溶液を、水１５０ｍＬ中のジエチルアミン（１５．５ｍＬ，１５０ｍｍｏｌ）と水酸化ナトリウム（６．０ｇ，１５０ｍｍｏｌ）の撹拌氷冷溶液に３０分かけて滴下した。滴下終了後、この混合物を周囲温度まで温めて、さらに１時間撹拌した。この混合物を３×１００ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、合わせた抽出物を１×１００ｍＬの水、１×１００ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ、及びブラインで洗浄した。ＭｇＳＯ_４で乾燥させた後、この混合物をろ過し、蒸発乾固させて結晶塊を得た。ヘキサン／酢酸エチル＝８０／２０から再結晶し、生成物２０．０ｇを淡黄色の結晶として得た（９０％）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ８．２７（２Ｈ，ｍ），７．５４（２Ｈ，ｍ），３．５７（２Ｈ，ｂｒ ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．２１（２Ｈ，ｂｒ ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．２７（３Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．１２（３Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。

調製Ｅ
４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルカルボキサミド）アニリン

ギ酸アンモニウム（２０．０ｇ，３１７ｍｍｏｌ）を、氷上で冷却したメタノール４００ｍＬ中のＮ，Ｎ−ジエチル ４−ニトロベンズアミド（２０．０ｇ，９０ｍｍｏｌ）と１０％パラジウム／活性炭１．０ｇの強撹拌混合物に添加した。この反応物は活発なガスの発生を伴って温かくなる。１時間後、ＴＬＣ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝６０／４０）が出発物質の完全な変換を示した。この混合物をセライトパッドによりろ過し、蒸発させて結晶性の固体を得た。これを水中に懸濁させ、真空ろ過により回収した。この生成物を水から再結晶して乾燥させることにより、白色結晶１４．１４ｇ（８３％）が得られた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．２２（２Ｈ，ｍ），６．６５（２Ｈ，ｍ），３．８１（２Ｈ，ｂｒ ｓ），３．４２（４Ｈ，ｂｒ ｓ），１．１７（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。

調製Ｆ
１−シアノ−７−アジド−２−ヘプチル ４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルカルボキサミド）フェニルカルバメート

ピリジン（４．０ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）を、氷上で冷却した無水ＴＨＦ ２００ｍＬ中の１−シアノ−７−アジド−２−ヘプタノール（４．６０ｇ，２５ｍｍｏｌ）とトリホスゲン（１２．５ｇ，４２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に不活性雰囲気下で滴下した。白色の懸濁液を氷上で１５分間撹拌し、次いで周囲温度まで温めて、さらに３０分撹拌した。ＴＬＣ分析（ヘキサン／酢酸エチル＝６０／４０）は、出発物質が、高Ｒ_ｆ生成物へと完全に変換したことを示した。この懸濁液をろ過して蒸発させ、残留物を１００ｍＬの乾燥エーテル中に移してろ過し、蒸発させることにより、粗クロロホルメート（４．５４ｇ，７４％）が褐色のオイルとして得られた。トリエチルアミン（３．５ｍＬ，２５ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２ １００ｍＬ中のクロロホルメート（１８．６ｍｍｏｌ）と４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルカルボキサミド）アニリン（３．８５ｇ，２０ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。１時間撹拌した後、この混合物を１Ｎ ＨＣｌで２回、水で２回、ブラインで１回洗浄し、次いでＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させてオイルを得、これを放置することで結晶化させた。この結晶塊をヘキサン／酢酸エチル＝６０／４０で洗浄した。洗浄液を濃縮し、０〜８０％酢酸エチル／ヘキサン勾配を用いてシリカのクロマトグラフィーにかけた。生成物画分を濃縮し、最初の結晶物質と一緒にした。合わせた生成物を１／１の酢酸エチル／ヘキサンから再結晶することにより、カルバメートを白色の結晶性固体（４．４ｇ， ２工程で４４％）として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：δ ７．４５−７．３５（４Ｈ，ｍ），６．８８８（１Ｈ，ｂｒ ｓ），５．０００（１Ｈ，ｍ），３．５２（４Ｈ，ｂｒ），３．２８８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．８４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１７Ｈｚ），２．３２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，１７Ｈｚ），１．８８（１Ｈ，ｍ），１．７５（１Ｈ，ｍ），１．６３（２Ｈ，ｍ），１．４５（４Ｈ，ｍ），１．１８（６Ｈ，ｂｒ）。

調製Ｇ
Ｎ−（クロロメチル）カルバメート

７−アジド−１−シアノ−２−ヘキシル Ｎ−（クロロメチル）−４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルカルボキサミド）−フェニルカルバメート（２．００ｇ，５．０ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（２２５ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ，１．５当量）、クロロトリメチルシラン（２．５ｍＬ，２０．０ｍｍｏｌ，４．０当量）、及び、無水トルエン２５ｍＬの懸濁液を、Ｎ_２雰囲気下に、磁気撹拌棒を備えた５０ｍＬ ＲＢＦに入れて、ラバーセプタムキャップで密閉した。密封したフラスコを５０℃の油浴中で２４時間加熱したところ、この時点で透明な黄色の溶液が得られた。この溶液を周囲温度まで冷却して蒸発させた。残留物を乾燥トルエン１０ｍＬに再溶解し、ろ過し、蒸発させることにより、粗Ｎ−（クロロメチル）−カルバメートが残留トルエンを含む不安定な黄色のオイルとして得られた（２．６８ｇ，予測値の１１９％）。この物質を無水ＴＨＦ１０ｍＬに溶解して、Ｎ_２下に保存した。Ｎ−（クロロメチル）カルバメートの形成は、エタノール中の４ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１．０ｍＬへ５μＬ添加した後、逆相ＨＰＬＣ分析（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ３００Å ４．６×１５０ｍｍ Ｃ_１８；１．０ｍＬ／分；１０分かけて２０〜１００％ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡの勾配）により確認した。出発カルバメートは８．４２分で溶出し、λ_ｍａｘ ２４３ｎｍを示す；生成物Ｎ−（エトキシメチル）−カルバメートは８．５２分で溶出し、λ_ｍａｘ ２３１ｎｍを示す；未知の不純物は８．０４分で溶出し、λ_ｍａｘ ２４５ｎｍを示す。２４０ｎｍでのピーク積分は、約８９％のＮ−（エトキシメチル）−カルバメートを示した。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．３９（４Ｈ，ｍ），５．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ），５．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｍ），３．５１（４Ｈ，ｂｒ），３．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．７９（１Ｈ，ｍ），２．６３（１Ｈ，ｍ），１．８５（１Ｈ，ｍ），１．７３（１Ｈ，ｍ），１．６０（２Ｈ，ｍ），１．４３（４Ｈ，ｍ），１．１６（６Ｈ，ｂｒ）。

調製Ｈ
アジドリンカー−ＳＮ−３８

ＳＮ−３８（１．００ｇ，２．５５ｍｍｏｌ；Ｈａｏｒｕｉ社）を無水ピリジン１０ｍＬに懸濁し、次いで真空下で濃縮乾固した（浴温５０℃）。これを無水ＴＨＦ１０ｍＬで繰り返した。得られた淡黄色固体を無水ＴＨＦ５０ｍＬと無水ＤＭＦ５０ｍＬ中、Ｎ_２雰囲気下で溶解し、その後氷上で冷却した。ＴＨＦ中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドの１．０Ｍ溶液（２．５５ｍＬ，２．５５ｍｍｏｌ）を添加したところ、最初に暗緑色を発色し、これは濃いオレンジ色の懸濁液に変化した。１５分後、Ｎ−（クロロメチル）−カルバメート（７．５ｍＬ，２．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を添加した。４℃で１５分後、明るいオレンジ色の混合物を周囲温度まで温めた。１時間後、ＨＰＬＣ分析（５μＬのサンプル＋１ｍＬのアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）により、８６／１４の生成物／ＳＮ−３８が示された。淡黄色の混合物を酢酸エチル２００ｍＬで希釈し、２×１００ｍＬの水、１００ｍＬの飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。オイル状残留物を水でトリチュレーションすることによって過剰のＤＭＦを除去し、その残留物をアセトニトリル５０ｍＬに溶解し、ろ過し、蒸発させて、黄色のガラス２．９６ｇを得た。この残留物を、それぞれ２００ｍＬの、ヘキサン、ヘキサン中の２０％、４０％、６０％、８０％、及び１００％アセトンの段階的勾配を用いてＳｉＯ_２（８０ｇ）でクロマトグラフィーにかけ、精製されたアジドリンカー−ＳＮ−３８（１．６６ｇ，８１％）を得た。この物質をアセトン５０ｍＬに溶解し、０．１％酢酸水溶液４５ｍＬをこの混合物が濁るまで撹拌しながら滴下した。撹拌時に、固形物が分離した。その後、追加の０．１％酢酸水溶液５ｍＬを添加して沈殿を完了させた。２時間撹拌した後、その固形物を真空濾過によって回収し、水で洗浄し、乾燥させて淡黄色粉末１．４４ｇ（７０％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：ｄ ８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．６０（１Ｈ，ｓ），７．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，９Ｈｚ），７．４０（４Ｈ，ｍ），７．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２），５．７５（２Ｈ，ｂｒ），５．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ），５．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ），５．２２（２Ｈ，ｓ），４．９９（１Ｈ，ｍ），３．８４（１Ｈ，ｓ），３．５３（２Ｈ，ｂｒ），３．５３（２Ｈ，ｂｒ），３．１７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），３．１２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ），２．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１，１７Ｈｚ），２．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５，１７），１．８６（２Ｈ，ｍ），１．６（１Ｈ，ｍ），１．４６（１Ｈ，ｍ），１．３７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．２５（６Ｈ，ｍ），１．１２（４Ｈ，ｍ），１．０２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。ＬＣ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝８０５．３（Ｃ_４４Ｈ_５１Ｎ_８Ｏ_８の計算値＝８０５．３）。

実施例１
アミノリンカー−ＳＮ−３８酢酸塩

ＴＨＦ中のトリメチルホスフィンの１Ｍ溶液（２．９ｍＬ，２．９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ１０ｍＬ中のアジドリンカー−ＳＮ−３８（１．１３ｇ，１．４ｍｍｏｌ）と酢酸（０．１９ｍＬ，３．３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。ガスが徐々に放出された。２時間撹拌した後、水（１．０ｍＬ）を添加し、この混合物をさらに１時間撹拌した。この残留物をエーテルと水とに分配した。水相を酢酸エチルで１回洗浄し、得られた透明な黄色の水相を蒸発させて黄色の泡状物８００ｍｇを得た。これをＴＨＦに溶解し、ろ過し、ＵＶ吸光度により定量して、１．２μｍｏｌ（８６％）の生成物を含有する溶液が得られた。Ｃ_１８ ＨＰＬＣは単一のピークを示し、ＬＣ−ＭＳは［Ｍ＋Ｈ］^＋＝７７９．３（予測値７７９．４）を示した。

実施例２
化合物（ＩＩＩ）（式中ｍ＝１及びｎ約２２５）とのＳＮ−３８コンジュゲート
４０ｋＤａ ４−アームテトラ−（スクシンイミジル−カルボキシメチル）−ＰＥＧ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；１０．０ｇ，１．０ｍｍｏｌ ＨＳＥ）、実施例１のアミノリンカー−ＳＮ−３８酢酸塩（１．２ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２１ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ ７５ｍＬ中の混合物を周囲温度に保持した。カップリングの進行をＨＰＬＣでモニターし、９０分までに反応の完了が示された。合計２時間後、この混合物を撹拌したＭＴＢＥ ５００ｍＬ中にろ過した。沈殿物を真空ろ過により回収し、ＭＴＢＥで洗浄し、真空下で乾燥させて、コンジュゲートをワックス状の淡黄色固体（１０．１ｇ，９５％）として得た。水１．０ｍＬ中の２．０ｍｇサンプルの吸光光度分析は、０．１７ｍＭのＳＮ−３８を示した；重量により予測された０．１７５ｍＭ ＳＮ−３８の計算値に基づくと、これは９６％のコンジュゲートローディングを示す。Ｃ_１８−ＨＰＬＣ分析は、単一の主要ピーク（３６３ｎｍで全ピーク面積の９８％、２５６ｎｍで９７％）を、０．６ｍｏｌ％の遊離ＳＮ−３８と共に示した。

このコンジュゲートは、ｐＨ５．０、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中に１．９ｍＭ（８５ｍｇ／ｍＬ）まで溶解した。対照的に、調製Ｈのアジドリンカー−ＳＮ−３８をＰＥＧ_４０ｋＤ−（ＤＢＣＯ）_４にトリアゾール結合を介して連結させた、対応するコンジュゲート（ＷＯ２０１１／１４０３９３）は、０．７ｍＭ（３２ｍｇ／ｍＬ）しか溶解しなかった。また、実施例２のコンジュゲートの溶解度を、ｐＨ４及びｐＨ５の０．２Ｎ酢酸塩緩衝液中、並びに、ｐＨ６、ｐＨ７及びｐＨ８の０．２Ｎリン酸塩緩衝液中にて試験した。その溶解度はこれら全てのｐＨにおいて＞３００ｍｇ／ｍｌであった。しかし、ｐＨは、コンジュゲートを溶解したときにわずかに変化し、一般的にはもとの値よりも上昇した。よって、３００ｍｇ／ｍｌのコンジュゲートをｐＨ４の緩衝液中に溶解させた場合、ｐＨは４．５となり；ｐＨ５の緩衝液中では、ｐＨが５．４となり；ｐＨ６の緩衝液中では、ｐＨが６．２となり；ｐＨ７の緩衝液中では、ｐＨが７．２となり；かつ、ｐＨ８の緩衝液中では、ｐＨが７．７となった。

１０ｍｇ／ｍｌのコンジュゲートをｐＨ４〜ｐＨ８の緩衝液及び水中に室温で溶解させて７日間室温に保持した時の安定性も試験した。各種緩衝液中のコンジュゲートの純度は、ＨＰＬＣで測定した。

典型的には、０日目の純度は１００％をやや下回って測定され、一般的には約９７％であった。水中で試験したどのｐＨでも７日間にわたって測定した純度の変化は、観察されてもわずかであった。

実施例３
インビトロ放出反応カイネティクス
０．１Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ９．４中の実施例２のコンジュゲートの溶液を、密閉したＵＶキュベット内に３７℃で保持した。遊離ＳＮ−３８フェノキシドの形成による４１４ｎｍでの吸光度の増加を経時的にモニターした。単一指数関数Ａ_ｍａｘ＊（１−ｅ^−ｋｔ）（ここで、Ａ_ｍａｘは完全な反応での吸光度である）へのデータのフィッティングにより、ｐＨ９．４におけるコンジュゲートからのＳＮ−３８の放出の速度定数ｋを求めた。図６に示されるように、ｐＨ９．４における遊離ＳＮ−３８の形成は、ｋ＝０．００２５７ｍｉｎ^−１（ｔ_１／２＝２７０分）で一次反応速度論に従った。これらのリンカーの放出速度はヒドロキシドでは一次であることが知られているので、他のｐＨ値での放出速度は、ｋ（ｐＨ）＝ｋ_９．_４＊１０^{（ｐＨ−９．４）}として計算することができる。よって、ｐＨ７．４におけるＳＮ−３８の放出速度は、ｐＨ７．４、３７℃で２．５７×１０^−５ｍｉｎ^−１、又はｔ_１／２＝４５０時間であると算出される。

実施例４
インビボ薬物動態
ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の実施例２のコンジュゲートの４５ｍｇ／ｍＬ溶液を滅菌ろ過し、カニューレを挿入した雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝３）に２００ｍｇ／ｋｇで注入し、血液サンプル（０．３ｍＬ）を定期的に採取し、直ちにｐＨ４．５の１Ｍクエン酸塩／０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８溶液３０μＬに添加してサンプルのｐＨを低下させ、凝固させて、残存する完全な（ｉｎｔａｃｔ）コンジュゲートを安定化させた。このサンプルを２〜８℃、約１，５００×ｇ（遠心力）で１０分間遠心分離し、赤血球を除去して約１５０μＬの血漿を得た。その血漿を２つのアリコートに分割し、極低温バイアルに移して、分析前に−８０℃の冷凍庫内で保存した。

分析のため、サンプルを氷上で解凍し、内部標準として８ｎｇ／ｍＬのカンプトテシンを含有するアセトニトリル／０．５％酢酸の２倍容量と混合した。４℃、１，６０００×ｇで１０分間遠心分離して、沈殿したタンパク質を除去した。サンプル上清（２０μＬ）は、４０℃に自動温度調節したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）３００Å Ｊｕｐｉｔｅｒ ５μｍ １５０×４．６ｍｍ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムを使用して、ｐＨ４．０の１００ｍＭリン酸ナトリウム、３ｍＭへプタンスルホン酸塩（緩衝液Ａ）及び７５％アセトニトリル水溶液（緩衝液Ｂ）の勾配を１．０ｍＬ／分で用いて分析した。勾配は、５％のＢで３分間のアイソクラティック、２０％のＢで３分間のアイソクラチック、５分間かけて２０〜４０％のＢの直線勾配、２分間かけて４０〜１００％のＢの直線勾配、１００％のＢで３分間のアイソクラチック、５％のＢで３分間のアイソクラチックとした。サンプルの溶出は、ダイオードアレイ検出器と蛍光検出器を用いて、最初の９分間は励起を３７０ｎｍに、発光を４７０ｎｍに設定した後、最後の１０分間は発光を５３４ｎｍに設定して検出した。濃度は、ピーク面積を、コンジュゲート（吸光度３８０ｎｍ）及びＳＮ−３８（蛍光励起：３７０ｎｍ；発光：５３４ｎｍ）の標準曲線と比較することによって算出した。次の保持時間が観察された：ＳＮ−３８、１２．７分；カンプトテシン、１３．２分；及びコンジュゲート、１４．５分。定量下限は、蛍光検出によるシグナル対ノイズ比の１０倍のピーク高さとして決定された。ＳＮ−３８：２０μＬ注入のアセトニトリル処理血漿中０．０７ピコモル（アセトニトリル処理血漿中３．３ｎＭ、もとの血漿サンプル中１０ｎＭ）。コンジュゲート：アセトニトリル処理血漿では２０μＬ注入のアセトニトリル処理血漿（１００ｎＭのコンジュゲート；４００ｎＭのＳＮ−３８）中２．１ピコモルのコンジュゲート（８．４ピコモルのＳＮ−３８）、もとの血漿サンプル中３００ｎＭ（１２００ｎＭのＳＮ−３８）。

血漿からの完全なコンジュゲートのクリアランスに関する情報を取得するために、同様の安定なコンジュゲート（ＣＨ_２ＣＮが存在しない式（ＩＩ））を２２ｍｇ／ｋｇで用いて類似の実験を行った。

ＳＮ−３８グルクロニドのレベルは、Ｐｏｕｊｏｌ，ｅｔ ａｌ．，「ヒト血漿及び唾液中のイリノテカン及び４種の主要代謝産物のための高感度ＨＰＬＣ−蛍光法：薬物動態試験への応用」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３）４９：１９００−１９０８に記載の方法に従って測定した。

実施例５
薬物動態モデリング
コンジュゲートの血漿濃度対時間データは、２相モデルＣ（ｔ）＝Ａ＊ｅｘｐ（−αｔ）＋Ｂ＊ｅｘｐ（−βｔ）（ここでＡ＋Ｂ＝用量／Ｖｄ）を用いて分析した。非線形回帰分析（ネルダー・ミードの滑降シンプレックス（Ｎｅｌｄｅｒ−Ｍｅａｄ ｄｏｗｎｈｉｌｌ ｓｉｍｐｌｅｘ））を用いてデータをフィッティングさせ、その後、コンパートメント間の移動速度（ｋ_１２及びｋ_２１）と中心コンパートメントからのコンジュゲートの消失速度（ｋ_ｅｌ）の推定値を得るために、確立された手法に従ってパラメータをデコンボリューションした。実施例２のコンジュゲート及び対応する安定なコンジュゲート（ＣＨ_２ＣＮがＨで置換されたもの）のデータ分析から、表１のデータが得られた。

これらのパラメータを用いて、次に遊離ＳＮ−３８の濃度データをモデルに基づいてフィッティングさせた。このモデルでは、コンジュゲートが速度定数ｋ_１で遊離ＳＮ−３８を放出し、Ｋ_ｄｉｓｔ＝Ｖ_ｄ／Ｖ_ｃで第２コンパートメントと平衡化する。モデル曲線は、以下の微分方程式を用いた数値積分法により作成した：
Δ［Ｃ_ｃ］＝（−ｋ_１［Ｃ_ｃ］−ｋ_１２［Ｃ_ｃ］−ｋ_ｅｌ［Ｃ_ｃ］＋ｋ_２１［Ｃ_ｐ］）Δｔ
Δ［Ｃ_ｐ］＝（ｋ_１２［Ｃ_ｃ］−ｋ_２１［Ｃ_ｐ］）Δｔ
Δ［Ｄ_ｃ］＝（ｋ_１［Ｃ_ｃ］−ｋ_ｃｌ［Ｄ_ｃ］）／（１＋Ｋ_ｄｉｓｔ）Δｔ
Ｋ_ｄｉｓｔ＝Ｖ_ｄ／Ｖ_ｃ

ここで、［Ｃ_ｃ］及び［Ｃ_ｐ］は、それぞれ、中心コンパートメント及び末梢コンパートメント中のコンジュゲート化ＳＮ−３８の濃度であり、［Ｄ_ｃ］は中心コンパートメント中の遊離ＳＮ−３８の濃度であり、速度定数は上記の通りである；ｋ_ｃｌは、血漿からの遊離ＳＮ−３８の消失速度定数であり、このパラメータについて報告された範囲内（１．４〜３．５ｈ^−１）で変化させた。数値積分は、初期条件［Ｃ_ｃ］＝Ｃ_ｍａｘ、［Ｃ_ｐ］＝０、及び［Ｄ_ｃ］＝０を用いて１２０時間のタイムスパン（Δｔ＝０．１２時間）について１０００ステップ以上行った。ＳＮ−３８の容積分布Ｖ_ｄは報告された０．１８Ｌ／ｋｇの値に設定し、一方Ｖ_ｃはコンジュゲートのＶ_ｄとして設定した。

この方法を用いて、コンジュゲート化ＳＮ−３８及びコンジュゲートから放出された遊離ＳＮ−３８についての濃度対時間データを、図７に示すようにフィッティングさせた。血漿からの遊離ＳＮ−３８の消失を十分に報告された範囲内であるｋ_ｃｌ＝２．７７ｈ^−１（ｔ_１／２＝０．２５時間）とした場合、及びｋ_１をインビトロの測定値である０．００１７３ｈ^−１（コンジュゲートからのＳＮ−３８切断のためのｔ_１／２＝４００時間）に設定した場合、実験データとの良好な一致が得られた。

このモデルを使用すると、これらの種でのｋ_ｅｌ及びｋ_ｃｌの値が与えられれば、他の種におけるコンジュゲートの挙動を予測することが可能である。ヒトでは、ＰＥＧ（ｋ_ｅｌ）及びＳＮ−３８（ｋ_ｃｌ）の消失ならびに分布容積の値は報告されていないが、アロメトリック・スケーリングを用いて、おおよそｋ_ｅｌ＝０．００８７ ^−１（ｔ_１／２＝８０時間）、ｋ_ｃｌ＝０．７ｈ^−１（ｔ_１／２＝１時間）、及びＶ_ｓｓ＝０．１５Ｌ／ｋｇであると推定することができる（創薬における薬物動態パラメータのアロメトリック・スケーリング：ヒトＣＬ、Ｖｓｓ及びｔ１／２はインビボでのラットデータから予測できるか？」，Ｅｕｒ Ｊ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．（２００４）２９：１３３−１４３）。薬物動態モデルでこれらの値を使用することにより遊離ＳＮ−３８の推定上の濃度範囲が、Ｃ_ｍａｘ／Ｃ_ｍｉｎが約２．５として得られた。

実施例６
持続注入用のＳＮ−３８の製剤
ＳＮ−３８の治療的投与は、この薬物の低い水溶性（水に７ｍｇ／Ｌ、１８μＭ）により制限されてきた。この制限を克服するための製剤が開発された。さまざまな製剤中のＳＮ−３８の溶解性を調べるために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のＳＮ−３８の１１５ｍＭ溶液を希釈して、各種製剤中の１５、１０、５、及び２ｍＭの目標濃度を得た（表２）。周囲温度で１６時間放置した後、沈殿したＳＮ−３８を１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して除去した。上清をｐＨ１０．０、１００ｍＭホウ酸塩中に１：２００で希釈し、ＳＮ−３８の濃度を、ε_４１４＝２２，５００Ｍ^−１ｃｍ^−１を用いて４１４ｎｍにおける分光光度法により測定した。結果を表２に示す。

製剤Ｅ及びＦ中のＳＮ−３８は、試験した最高濃度で完全に可溶性のままであった。ＰＥＧ３００以外のポリエチレングリコールは、同様に有利に使用することができると予想される。さらに、これらの薬学的製剤は、該製剤を持続注入により投与することで、ＳＮ−３８への暴露を必要とする患者へのＳＮ−３８への連続的暴露を維持するために使用できることが期待される。このような持続注入は、医療分野で公知の方法のいずれかにより、例えば注入ポンプの使用により、又は静脈内点滴により、実施することができる。

Claims (11)

1. 式（Ｉ）で表されるコンジュゲート：
   ［式中、
   ＰＥＧは、直鎖状又は分枝状であってよく、ｑが２〜８である場合はマルチアーム型である、ポリエチレングリコールであり；
   Ｘは、Ｏ、ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍ、又はＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍであり、ここでｍ＝１〜６であり；
   Ｌは、（ＣＨ_２）_ｒ又は（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｒであり、ここで、ｒ＝１〜１０であり、かつ、ｐ＝１〜１０であり；
   Ｒ^１は、ＣＮ又はＳＯ_２ＮＲ^２ _２であり、ここで、各Ｒ^２は、独立して、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアルケニル、アルキルアリール、もしくはアルキルヘテロアリールであり、それぞれが任意に置換されていてもよく、又は２個のＲ^２が一緒になって環を形成してもよく；
   Ｙは、ＣＯＲ^３又はＳＯ_２Ｒ^３であり、ここで、Ｒ^３は、ＯＨ、アルコキシ、もしくはＮＲ^４ _２であり、ここで、各Ｒ^４は、独立して、アルキル、置換アルキルであるか、又は２個のＲ^４が一緒になって環を形成してもよく；かつ
   ｑ＝１〜８である］。
2. ＸがＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍ又はＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｍである、請求項１に記載のコンジュゲート。
3. ＰＥＧが、平均分子量３０，０００〜５０，０００Ｄａのポリエチレングリコールである、請求項１に記載のコンジュゲート。
4. ｑが４である、請求項１に記載のコンジュゲート。
5. Ｒ^１がＣＮである、請求項１に記載のコンジュゲート。
6. ＰＥＧが、平均分子量３０，０００〜５０，０００Ｄａのマルチアーム型ポリエチレングリコールであり；Ｌが（ＣＨ_２）_ｒであり；Ｒ^１がＣＮであり；ＹがＣＯＮＥｔ_２であり；かつ、ｑが４である、請求項１に記載のコンジュゲート。
7. ｍが１である、請求項１に記載のコンジュゲート。
8. 請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤と共に含む薬学的製剤。
9. 前記製剤のｐＨが４．０〜６．０である、請求項８に記載の製剤。
10. 請求項１に記載のコンジュゲートを製造するための方法であって、以下のステップ：
    （ａ） 式（ＶＩＩ）のアジドリンカー−ＳＮ−３８を還元してアミノリンカー−ＳＮ−３８を生成させること；
    （ｂ） アミノリンカー−ＳＮ−３８を活性化ＰＥＧと接触させて請求項１に記載のコンジュゲートを生成させること；及び
    （ｃ） 必要に応じて、該コンジュゲートを単離すること；
    を含んでなる方法。
11. 請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含有するＳＮ−３８の持続放出用製剤。