CN106061483B - Sn-38的缓释结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述一种SN‑38的结合物，其提供最佳药物释放速率并最小化相应葡糖醛酸的形成。所述结合物通过β消去机制从聚乙二醇释放SN‑38。

Description

SN-38的缓释结合物
技术领域
本发明涉及用于抗癌药SN-38的缓释系统。
背景技术
喜树碱类似物SN-38(7-乙基-10-羟基喜树碱)是抗癌药伊立替康(irinotecan)的活性代谢物。其具有比伊立替康强约1000倍的活性，但其因极差水溶性(17uM)和快速清除而尚未具有治疗可用性。
Figure GDA0001162630430000011
伊立替康自身可在临床上使用并且已在白血病、淋巴瘤、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、胰腺癌、胃癌和乳癌中显示活性。若干研究已显示，喜树碱的抗肿瘤作用总体上归功于拓扑异构酶I的抑制，并且功效与保持这种酶的抑制达延长的时间(“抵达标靶时间(time over target)”)有关。为保持喜树碱的有效浓度达足够时间，通常需要投与极高剂量的药物来对抗系统中药物的相对快速清除速率。此导致在投与后早期出现较高的最大药物浓度(Cmax)，其被认为引起毒性，例如作为伊立替康的剂量限制性毒性的威胁生命的腹泻。由于SN-38的高效力，因此需要呈延时输注液形式以足够抑制拓扑异构酶I但低于毒性浓度的稳态浓度提供药物。通过泵使用伊立替康的延时输注液的临床试验已确证了此假说，然而其并非SN-38的可用治疗策略，因为其在给药调配物中的溶解性差。
伊立替康通过肝脏羧酸酯酶转化为SN-38，然后通过肝脏UGT1A代谢成其10-葡糖苷酸SN-38G。葡糖苷酸化作用促进胆汁排泄并且肠内细菌葡糖苷酸酶引起SN-38G重新转化为SN-38。除非肠内UGT1A使药物转化回惰性SN-38G，否则SN-38可对肠造成毒性作用。因此，SN-38G可作为毒性SN-38的来源并且防止由SN-38引起的严重腹泻。总体上，SN-38的高浓度导致转化成SN-38G的葡糖苷酸化作用增加、SN-38G到肠内的排泄增加和导致肠胃毒性的细菌性去葡糖苷酸化。
从可溶性长寿命循环结合物中而非从例如伊立替康等前药中缓释SN-38似乎提供了这些问题的解决方案，并且各种结合策略已应用于SN-38。通过氧-20甘胺酸酯结合到聚(乙二醇)(PEG)(美国专利8,299,089)提供了因酯水解而相对快速地(t1/2＝12h)释放游离SN-38的相对水溶性结合物。已公开另一连接到多元醇聚合物的可快速释放SN-38的酯连接化学物(美国专利公开案2010/0305149 A1)。通过连接到氧-10的酯键结合到聚谷胺酸-PEG嵌段共聚物提供再次通过酯水解释放游离SN-38的胶束结合物(PCT公开案WO2004/039869)。归因于酯在水性介质中的不稳定性，可能受到血浆中的酯酶加速，因此所述用于SN-38的基于酯的结合策略并不适用于支持SN-38的低剂量、长期暴露，并且SN-38的浓度通常低于投药之间的有效浓度。所述结合物通常以高浓度投与，从而得到较高的最大SN-38浓度并且导致高浓度的SN-38G形成。
PCT公开案WO2011/140393已公开具有更可控释放速率的PEG-SN-38结合物。这些结合物通过β消除机制以通过选择适当连接子而在宽范围内可控制的速率释放SN-38。将高分子偶合到此药物是通过叠氮基与环状炔烃的缩合产物，从而产生相对不溶性结合物。本文要求的亚属因简单酰胺键的存在而具有改良的溶解性，并且在室温下在体外缓冲液中稳定。现已出乎预料地发现，通过适当选择释放速率，可降低SN-38G的体内形成，并同时提供活性SN-38的长期暴露。本发明提供了设计成通过非酶促β消除机制以一定速率释放游离SN-38的结合物，所述速率可实现SN-38的低剂量、长期暴露方案并且进一步减少在投与过程中形成的SN-38G量。
发明内容
本发明提供了设计成通过非酶促β消除机制以缓慢速率释放游离SN-38的结合物，所述缓慢速率可实现SN-38的低剂量、长期暴露方案并且进一步减少在投与过程中形成的SN-38G量。本发明还提供了用于制造所述结合物的方法和其用于治疗特征为细胞过度增殖的疾病和病症的方法。
因此在一个方面中，本发明提供了具有式(I)的结合物：
Figure GDA0001162630430000031
其中PEG为平均分子量在20,000Da与60,000Da之间的聚乙二醇，其为直链或分支链，并且当q为2到8时，其为多臂；
q＝1到8；
X为O、NH、(CH2)m、OC(＝O)(CH2)m或NHC(＝O)(CH2)m，其中m＝1到6；
R1为CN或SO2NR2 2，其中各R2独立地为烷基、芳基、杂芳基、烷基烯基、烷基芳基或烷基杂芳基，各者任选经取代，或可连接在一起形成环；
Y＝COR3或SO2R3，其中R3＝OH、烷氧基或NR4 2，其中各R4独立地为烷基、经取代的烷基，或可连接在一起形成环；以及
L为(CH2)r或(CH2CH2O)p(CH2)r，其中r＝1到10并且p＝1到10。
在第二方面中，本发明提供了用于制备式(I)结合物以及其中间物的方法。
在第三方面中，本发明提供了使用式(I)结合物缓释SN-38的方法。
在第四方面中，本发明提供了通过控制从结合物释放SN-38的速率，使在投与SN-38后所形成的SN-38葡糖甘酸的量最少的方法。
在第五方面中，本发明涉及溶解SN-38的包含PEG和DMSO的调配物和其使用方法。
附图说明
图1展示游离SN-38从本发明结合物的释放。
图2展示一种用于制备本发明的叠氮基-连接子-SN-38(VII)中间物的方法。
图3展示一种使用三甲基膦和乙酸在THF/水中使叠氮基-连接子-SN-38(VII)还原成胺-连接子-SN-38(VIII)的方法。
图4展示一种用于制备本发明结合物(I)的方法，其中R1为CN，Y为CONEt2，q＝4，X为CH2，L为(CH2)5，并且PEG为具有季戊四醇核的4臂聚(乙二醇)。
图5显示一种式(I)结合物的详细结构，其中R1为CN，Y为CONEt2，q＝4，X为CH2，L为(CH2)5，并且PEG为平均分子量40,000(n～225)的4臂聚(乙二醇)。
图6显示从本发明结合物释放SN-38的体外释放动力学，其中R1为CN，Y为CONEt2，q＝4，X为CH2，L为(CH2)5，并且PEG为平均分子量40,000的4臂聚(乙二醇)。归因于10-OH的电离作用，SN-38具有pKa～8.6；在形成酚盐后，SN-38的UV/Vis吸光率最大值位移到414nm。当通过10-OH结合时，SN-38在414nm下不显示吸光率。因此，在414nm下的吸光率的增加为从所述结合物形成游离SN-38的量度。使用在pH 9.4时为0.00257min-1的一级速率常数将所指示的曲线与实验数据拟合。此相当于在pH 7.4时释放t1/2为450小时。
图7显示在对大鼠(平均n＝3)静脉内投与200mg/kg结合物(7mg/kg SN-38)后，结合物(正方形)和从式(I)结合物中释放的游离SN-38(圆形)的体内含量，其中R1为CN，Y为CONEt2，q＝4，X为CH2，L为(CH2)5，并且PEG为平均分子量40,000的4臂聚(乙二醇)。如实例5中描述，使用体内释放t1/2＝400h生成曲线。
图8显示在对大鼠(平均n＝3)静脉内投与200mg/kg结合物(7mg/kg SN-38)后，从式(I)结合物中形成的游离SN-38(圆形)和SN-38葡糖苷酸(正方形)的体内含量，其中R1为CN，Y为CONEt2，q＝4，X为CH2，L为(CH2)5，并且PEG为平均分子量40,000的4臂聚(乙二醇)。
具体实施方式
在一个方面中，本发明提供了具有式(I)的结合物：
Figure GDA0001162630430000041
其中PEG为平均分子量在20,000Da与60,000Da之间的聚乙二醇，为直链或分支链且当q为2到8时为多臂；
q＝1到8；
X为O、NH、(CH2)m、OC(＝O)(CH2)m或NHC(＝O)(CH2)m，其中m＝1到6；
R1为CN或SO2NR2 2，其中各R2独立地为烷基、芳基、杂芳基、烷基烯基、烷基芳基或烷基杂芳基，各者任选经取代，或可连接在一起形成环；
Y＝COR3或SO2R3且R3＝OH、烷氧基或NR4 2，其中各R4独立地为烷基、经取代的烷基，或可连接在一起形成环；以及
L为(CH2)r或(CH2CH2O)p(CH2)r，其中r＝1到10且p＝1到10。
术语「烷基」定义为具有1到8个碳原子，或在一些实施例中具有1到6个或1到4个碳原子的直链、分支链或环状饱和烃基。
术语「烯基」定义为具有1到6个或1到4个C和一或多个碳碳双键的非芳香族直链、分支链或环状不饱和烃。
术语「炔基」定义为具有1到6个或1到4个C和一或多个碳碳三键的非芳香族直链、分支链或环状不饱和烃。
术语「烷氧基」定义为键结到氧的烷基，包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基、环丁氧基和类似基团。
术语「芳基」定义为具有6到18个碳，优选6到10个碳的芳香族烃基，包括例如苯基、萘基和蒽基等基团。术语「杂芳基」定义为含有至少1个N、O或S原子的包含3到15个碳，优选含有至少1个N、O或S原子的3到7个碳的芳香族环，包括例如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基和类似基团。
术语「卤素」包括溴、氟、氯和碘。
当基团「任选经取代」时，所述取代基包括1到3个相同或不同且可包括卤素、氨基、羟基和硫氢基的取代基，以及包含呈酯、酰胺形式或呈游离羧基形式的羧基的取代基。此目录无意涵盖全部，且任何非妨碍性的取代基都可包括在那些已任选存在的取代基中。
如本文使用，除非另作说明，否则「一」、「一个」等意欲指代一者或多于一者。此外，当提供整数的范围时，所有中间整数意欲如同特定描述般包括在内。
PEG可为平均分子量在20,000与60,000(即包括约400到约1500个环氧乙烷单元)之间或30,000到50,000之间的直链、分支链或多臂聚(乙二醇)，其中至少一个聚合物末端可经羧酸酯官能团终止。这些PEG可以衍生物形式购得(例如自NOF和健凯科技有限公司(Jenkem Technologies)购得)，在这些衍生物中，C＝O基团经活化用于与如N-羟基琥珀酰亚胺等胺或硝基苯基酯或N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯或硝基苯基碳酸酯反应。这些高分子量PEG由分子量的高斯分布(即多分散)构成，且因此包含环氧乙烷单元数量的分布；其通过平均分子量描述，平均分子量在本文中意欲涵盖具有所述平均分子量的工业供应物质中常见的分子量和环氧乙烷单元的分布。4臂PEG的典型多分散指数(PDI)小于或等于1.1，并以PDI＝Mw/Mm计算，其中Mw＝重量平均摩尔质量，以ΣMi 2Ni/ΣMiNi计算，Mm＝数量平均摩尔质量，以ΣMiNi/ΣNi计算，其中在样本中M为物质i的分子量并且N为物质i的数量。可通过所属领域中已知的技术，例如凝胶渗透色谱法HPLC或质谱分析(见例如美国专利公开案2010/0126866 A1)测量PDI。多臂PEG可从多种核心单元，包括季戊四醇、六甘油和三季戊四醇开始形成，
Figure GDA0001162630430000061
来提供多种配置和臂总数。PEG的至少一个臂是通过连接基团X由羧酸酯官能团终止以允许连接子-SN-38的连接。X用于将羧酸酯官能团连接到PEG，且因此可为包括O、NH、(CH2)m、OC(＝O)(CH2)m或NHC(＝O)(CH2)m(其中m＝1到6)的典型连接基团中的任一者。在本发明的某些实施例中，X为O、NH、(CH2)m或NHC(＝O)(CH2)m。在本发明的一个实施例中，X为(CH2)m。
在本发明的某些具体实施例中，所述PEG具有40,000±4,000Da(即包含从约800到1000个总环氧乙烷单元)的平均分子量。在一个实施例中，所述PEG为具有季戊四醇核和40,000±4,000Da平均分子量的4臂聚合物，其中各臂因此包含平均225±25个环氧乙烷单元，并由羧酸酯基终止，并具有式(III)。
Figure GDA0001162630430000071
其中n＝200到250且m＝1到6。虽然相关的结合物先前已公开于PCT公开案WO2011/140393中，但我们出乎预料地发现，PEG通过更具亲水性的酰胺键连接到连接子-SN-38时，其所提供的结合物具有比先前公开的结合物(其中PEG通过叠氮化物与二苯并氮杂环辛炔(DBCO或DIBOC)之间的1，3-偶极环加成连接)改善的溶解性和粘度性质。
L为具有式(CH2)r或(CH2CH2O)p(CH2)r的连接基团，其中r＝1到10且p＝1到10。
R1为CN或SO2NR2 2，其中各R2独立地为烷基、芳基、杂芳基、烷基烯基、烷基芳基或烷基杂芳基，各者任选经取代，或可连接在一起形成环。在一些实施例中，各R2独立地为烷基。R1控制结合物释放SN-38的速率，如PCT公开案WO2011/140393和PCT申请案PCT/US12/54293中所述，这些案件以引用的方式并入本文中。为支持低剂量、长期暴露疗程，从结合物释放SN-38的速率应使得体内释放半衰期在约100与约1000小时之间，优选在约300与约800小时之间，最优选为约400到约500小时。应注意，体内释放速率可比在pH 7.4，37℃下测得的相应体外释放速率快达约3倍。在某些实施例中，R1为CN。在这个实施例中，已测得体外和体内(大鼠)释放半衰期为400h。在某些其它实施例中，R1为SO2NR2 2。在某些特定实施例中，R1为SO2NR2 2，其中各R2独立地为甲基、乙基、烯丙基、苄基、2-甲氧基乙基或3-甲氧基丙基，或NR2 2形成吗啉基、2，3-二氢吲哚基或1，2，3，4-四氢喹啉基。
Y为使结合物稳定以对抗过早释放的吸电子取代基。在某些实施例中，Y为COR3或SO2R3，其中R3＝OH、OR4或NR4 2，其中各R4独立地为烷基、经取代的烷基，或两个R4可连接在一起形成环。在一些实施例中，Y在对位。Y用于稳定连接到SN-38的N-CH2-O，因此使药物从所述结合物自发裂解的速率降到最低。在某些实施例中，Y为CONR4 2，且在某些特定实施例中Y为CON(CH2CH3)2、CON(CH2CH2)2O或SO2N(CH2CH2)2O，其中(CH2CH2)2O与N组合为吗啉基。从β消除作用和SN-38释放得到的对氨基苯甲酸酯和对氨基磺酰胺通常认为具有低毒性。
在本发明的特定实施例中，提供具有结构(II)的式(I)结合物：
Figure GDA0001162630430000081
其中m＝1到6且n＝100到375(即平均分子量在20,000Da与60,000Da或30,000Da到50,000Da之间的PEG)。在本发明的更特定实施例中，提供具有式(II)的结合物，其中m＝1到3。在本发明的甚至更特定实施例中，m＝1且n＝200到250或～225，使得平均PEG分子量为约40,000。
在本发明的另一方面中，提供用于制备式(I)结合物的方法。一种先前在PCT公开案WO2011/140393中公开的用于制备叠氮基-连接子-SN-38中间物的方法展示于图2中。因此，例如通过使用光气或光气等效物，例如三光气，在例如吡啶等温和碱的存在下使中间物转化成氯甲酸酯，随后与苯胺NH2-C6H4-Y反应，将叠氮醇(IV)转化成氨基甲酸酯(V)。或者，(V)可通过利用异氰酸酯OCN-C6H4-Y处理(IV)来直接形成。随后使用由玛朱姆巴(Majumdar)(“含羧酸药物的N-烷基-N-烷氧基羰基氨基甲基(NANAOCAM)前药”，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg Med Chem Letts)(2007)17：1447-1450)所公开的方法的修改，使氨基甲酸酯(V)进行N-氯甲基化，其中使氨基甲酸酯(V)与多聚甲醛在三甲基氯硅烷和例如四氢呋喃、1，2-二氯乙烷、二噁烷或甲苯等惰性溶剂的混合物中接触。在一优选实施例中，所述惰性溶剂为甲苯。催化剂三甲基氯硅烷以超过(V)1到10倍摩尔超量，优选4倍摩尔超量存在。所述反应可在20℃与100℃之间，优选40℃与60℃之间，更优选50℃的温度下，在惰性氛围下进行，且所述反应进程可通过反应性N-(氯甲基)氨基甲酸酯(VI)转化为稳定物质而监控，例如通过将反应混合物的等分式样稀释到包含足量三烷胺碱的乙醇中以中和三甲基氯硅烷，随后用HPLC分析所得N-(乙氧基甲基)-氨基甲酸酯。
通过N-(氯甲基)氨基甲酸酯(VI)使SN-38的酚系OH烷基化以产生叠氮基-连接子-SN-38(VII)，展示于图2中。可使用多种碱以使所述酚去质子化并且因此实现烷基化，包括烷氧化物，例如第三丁醇钾(KOtBu)；金属酰胺，例如双(三甲基硅烷基酰胺)锂(LiHMDS)；金属氢化物；例如NaH；脒，例如1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)；和磷腈碱。在优选实施例中，所述碱为KOtBu。首先使含于合适溶剂中的SN-38与碱在-20℃与25℃之间，优选-20℃与5℃之间，更优选4℃的温度下接触，以产生酚盐。随后使所述酚盐与N-(氯甲基)氨基甲酸酯(VI)在-20℃与25℃之间，优选-20℃与5℃之间，更优选4℃的温度下接触，以产生叠氮基-连接子-SN-38(VII)的溶液。合适的溶剂包括THF、DMF和其混合物。
如图3中所示，通过使叠氮化物还原，叠氮基-连接子-SN-38(VII)转化为氨基-连接子-SN-38(VIII)。此还原可通过许多方法达成，包括在例如钯或铂等金属催化剂的存在下的催化氢解作用；使用膦，例如三烷基膦或三芳基膦的施陶丁格(Staudinger)还原；或在硅烷存在下的铟还原作用。当使用强碱性三烷基膦，例如三甲基膦时，加入足量酸以缓和所述反应的碱度，且因此避免β消去连接子过早裂解。在一优选实施例中，使用含于THF/水中的三甲基膦-乙酸使(VII)转化为(VIII)。
如图4中所示，使胺-连接子-SN-38(VIII)连接到活化的PEG以提供结合物(I)。适当活化的PEG具有经胺反应性官能团，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、五卤代苯基酯或硝基苯酯终止的聚合物链以产生其中X不存在的式(I)结合物，和经N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、碳酸五卤代苯基酯或碳酸硝基苯基酯终止的聚合物链以产生其中X为O的式(I)结合物。或者，在肽偶合剂(例如碳化二亚胺(如DCC或EDCI)或鏻试剂(如BOP或PyBOP)或脲鎓试剂(如HATU或HBTU))的存在下，可使用其中聚合物链由羧酸终止的PEG。偶合是在水性或无水条件下(优选无水)在例如乙腈、THF、DMF或二氯甲烷等合适溶剂中进行。在一优选实施例中，在0与25℃之间的温度下，于THF溶剂中，使用具有由NHS酯终止的聚合物链的活化PEG。
可使用所属领域中已知的方法纯化所得结合物。例如，可通过加入醚性溶剂，例如乙醚或甲基叔丁醚(MTBE)从反应混合物中沉淀所得结合物。还可通过透析或通过尺寸排阻色谱法纯化所得结合物。
在第三方面中，本发明提供了使用式(I)结合物缓释SN-38的方法。在一个实施例中，从所述结合物中释放SN-38的半衰期是在100与1000小时之间，优选在300与500小时之间，且更优选在约400小时。
在本发明的另一实施例中，提供了提供SN-38的连续、低剂量暴露给需要此暴露的患者的方法，所述方法包括对所述患者投与本发明结合物。在一更特定实施例中，提供了一种其中保持游离SN-38的浓度在每周一次投与之间落于15nM与5nM之间的方法。
在本发明的另一实施例中，提供了一种用于控制在结合物投与之间观测到的SN-38的Cmax/Cmin比率的方法。所得的Cmax/Cmin比率在每周一次投与之间小于或等于10，更优选小于或等于5，且更优选约2.5。
如图6中所示，其中PEG为平均分子量40,000的4臂聚乙二醇(季戊四醇核)的式(II)结合物[即其中q＝4；X为CH2；R1为CN；Y＝CONEt2；PEG为平均分子量40,000的4臂聚(乙二醇)；L为(CH2)5的式(I)]在37℃下置于pH 9.4的缓冲液中时，以具有4.5小时半衰期的一级过程释放SN-38。已证实，本文使用的β消除连接子显示依赖pH的一级释放速率，从而在生理pH(7.4)下释放的相应半衰期可计算为450小时。
如图7中所示，当通过静脉内注射对大鼠投与相同结合物时，游离SN-38释放，且浓度对时间曲线与具有约51小时的终末半衰期的结合物的浓度对时间曲线平行。比较其与直接静脉内投与SN-38，直接静脉内投与SN-38显示在大鼠中7与34分钟之间的终末半衰期(渥美(Atsumi)等人，“在对大鼠单一静脉内给与14C-SN-38后，SN-38[(+)-(4S)-4，11-二乙基-4，9-二羟基-1H-哌喃并[3′，4′：6，7]-吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮](伊立替康的活性代谢物)的药代动力学”，生物医药公告(Biol.Pharm.Bull.)(1995)18：1114-1119；加藤(Kato)等人，“帕尼培南(Panipenem)不改变伊立替康的活性代谢物SN-38和非活性代谢物SN-38葡糖苷酸(SN-38G)在大鼠中的药代动力学”，抗癌研究(Anticancer Res.)(2011)31：2915-2922)。因此，本发明结合物显著延长SN-38的体内半衰期。
从结合物释放的药物的含量和观测到的终末半衰期为所述结合物和药物的药代动力学参数的组合的结果，终末半衰期为在简单一室模型中的结合物消除速率和药物释放速率的总和(桑蒂(Santi)等人，“通过控制从高分子结合物的化学释放延长治疗剂的可预测且可调整半衰期”，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(2012)109：6211-6216)。为测定这些参数，使用其中所述结合物分布在两室之间并可在被清除前释放游离SN-38的药代动力学模型分析数据。为建立结合物自身的清除速率(kel)，对大鼠静脉内投与类似的稳定结合物(其中不存在CH2CN的式(II))，并使用两室模型得到药代动力学参数。
如图7中所示，浓度对时间数据与结合物(II)以约400小时半衰期体内释放游离SN-38一致。在给大鼠单一注射200mg/kg(包含7mg/kg SN-38)的结合物(II)后，观测到在7天内，SN-38的血浆含量跨度为210到20nM(即Cmax/Cmin＝10)。所述结合物和相应游离SN-38的终末半衰期受到所述结合物于大鼠中的相对快速消除速率的限制。PEG结合物的消除速率为物种依赖性，此归因于肾脏过滤的差异速率，在小鼠中，40,000-Da PEG的终末半衰期为约12小时，在大鼠中为24到48小时，在人体内为72到120小时。此外，通常药物消除速率在人类患者中比在大鼠中慢(见例如卡德维尔(Caldwell)等人，“药物发现中药代动力学参数的异速生长比例：能否从体内大鼠数据预测人类CL、Vss和t1/2？”，欧洲药物代谢与药代动力学杂志(Eur J Drug Metab Pharmacokinet.)(2004)29：133-143)。因此，预期从式(I)结合物释放的SN-38的终末半衰期在人类中比在啮齿动物中大体上更长，尽管归因于血液pH值的稠度，预期药物从结合物的释放速率相对不依赖于物种。虽然本发明结合物和游离SN-38于人类患者中的实际药代动力学参数未知，但使用异速生长比例估算这些值提供了在人类患者中Cmax/Cmin～2.5的估算值，如以下实例5中所述。SN-38前药伊立替康于人类患者中的延时输注已指示，如果SN-38的血浆含量保持在约5nM与15nM之间达延长的时间，那么可得到最大的功效。因此大鼠药代动力学数据预示本发明结合物可实现连续低量、有效浓度的SN-38的释放。
意外地，用式(II)结合物处理大鼠后观测到的SN-38G含量极低，Cmax下SN-38G/SN-38≤0.1。这与酯连接的伊立替康结合物处理(Cmax下SN-38G/SN-38～15；埃尔顿(Eldon)等人，“NKTR-102(拓扑异构酶抑制剂-聚合物结合物)于罹患晚期实体肿瘤患者中的群体药代动力学”，美国临床肿瘤学会学报(American Society of Clinical Oncology Poster)8E(2011))形成对比，或与酯连接的SN-38结合物处理(在Cmax下SN-38G/SN-38～1；帕特奈克(Patnaik)等人，“EZN-2208(新型抗癌剂)于罹患晚期恶性肿瘤患者中：1期剂量递增研究”，美国癌症研究学会学报(American Association for Cancer Research Poster)C221(2009))形成对比。因此看来，当释放极缓慢时，SN-38葡糖醛酸化效率较低。依照此假设，当在大鼠中检测具有R1＝PhSO2的结合物时，如预期般观测到SN-38的较快释放(t1/2＝10h)，并伴随较高起始浓度的游离SN-38和较高的Cmax下SN-38G/SN-38＝0.2。
因此，在第四方面中，本发明提供了用于通过控制SN-38从结合物释放的速率，使投与SN-38后所形成的SN-38葡糖苷酸的量最少的方法。在本发明的一个实施例中，提供了用于使投与SN-38后所形成的SN-38葡糖苷酸的量最少的方法，其中提供了特征为SN-38释放半衰期超过100小时的结合物。在一更特定实施例中，SN-38释放半衰期在100与1000小时之间。在一优选实施例中，SN-38释放半衰期在300与500小时之间。在一更优选实施例中，SN-38释放半衰期约为400小时。
本发明结合物可使用多种所属领域中已知的医药上可接受的赋形剂加以调配，并可便捷地在具有最适用于结合物稳定性的pH值的水性缓冲液中调配。在本发明的一实施例中，所述结合物在pH值在4到6之间的水性缓冲液中调配。已出乎预料地发现，所述式(I)结合物比公开于WO2011/140393中的相关结合物在水性缓冲液中明显更可溶(见以下实例2)，因此可对需要这些化合物治疗的患者实现更大范围的给药。
预期本发明结合物可用于SN-38或SN-38的前药(例如伊立替康)具有可用性的任何情况。目前，伊立替康用于治疗多种癌症，包括白血病、淋巴瘤、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、胰腺癌、胃癌和乳癌，因此可预期本发明结合物可同样使用。
在展示于实例6中的一替代实施例中，当赋形剂包括PEG和DMSO时，SN-38的调配物提供溶解形式。其尤其适用于例如连续输注。PEG对DMSO的比率从90∶10到10∶90变化，但也可为75∶25、25∶75或50∶50或其中间值。可用的PEG组分范围为约PEG100(100)到PEG(600)。
除非另外指示，否则所有参考文献均以全文引用的方式并入本文中。
实例
综述：使用具有二极管阵列检测的岛津(Shimadzu)HPLC系统实施HPLC。反相使用恒温在40℃的
Figure GDA0001162630430000121
Jupiter 5um 300A 4.6×150mm柱，和在1.0mL/min的流动速率下乙腈于含有0.1％TFA的水中的20％到100％梯度。尺寸排阻HPLC使用在40℃下以50∶50的乙腈/水/0.1％TFA运行的
Figure GDA0001162630430000122
BioSepTM S-2000柱。使用e＝22，500M-1cm-1通过在乙腈中363nm下UV吸光率，定量含有SN-38的溶液。SN-38从浩瑞(Haorui)(中国)购得。
制法A
6-叠氮基-1-己醇
Figure GDA0001162630430000123
在温和回流下加热6-氯-1-己醇(50.0g，366mmol)和叠氮化钠(65.0g，1000mmol)于400ml水中的混合物，历时19小时。冷却到周围温度后，用EtOAc 3×200ml萃取混合物。用1×100mL水、1×100mL饱和NaCl水溶液洗涤萃取物，然后用MgSO4干燥，过滤，并蒸发，产生44.9g(86％)无色油。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.66(2H，br t，J＝6Hz)，3.27(2H，t，J＝7.2Hz)，1.55-1.66(m，4H)，1.38-1.44(m，2H)。
制法B
6-叠氮基己醛
Figure GDA0001162630430000131
向经强力搅拌的在冰上冷却的6-叠氮基-1-己醇(7.2g，50.0mmol)于100mL二氯甲烷中的溶液中加入三氯异氰尿酸(12.2g，52.5mmol)。向所得的悬浮液中滴加TEMPO(0.080g，0.51mmol)于2mL二氯甲烷中的溶液。在4℃下10分钟后，使悬浮液升温到周围温度并再搅拌30分钟。TLC分析(30％EtOAc/己烷)指示完全反应。使用二氯甲烷使悬浮液滤过1cm硅藻土垫。用2×100mL 1M Na2CO3、1×100mL水、1×100mL 1N HCl和1×100mL饱和NaCl水溶液洗涤滤液，然后用MgSO4干燥，过滤，并蒸发以产生9.8g淡橘色油状物。将其溶解于小份体积的二氯甲烷中，并使用0到20％EtOAc/己烷梯度在SiO2(80g)上进行色谱分析，得到6.67g(47.3mmol；95％)呈无色油状的醛。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.78(1H，t，J＝1.6Hz)，3.29(2H，t，J＝6.8Hz)，2.47(2H，dt，J＝1.6，7.6Hz)，1.59-1.71(m，4H)，1.38-1.46(m，2H)。
制法C
7-叠氮基-1-氰基-2-庚醇
Figure GDA0001162630430000132
在N2下于-78℃下，向100mL无水THF中加入1.6M正丁基锂于己烷中的溶液(35mL，49mmol)。在急流中加入乙腈(3.14mL，60mmol)并强力搅拌，导致形成白色悬浮液。15分钟后，使悬浮液升温到-20℃，历时超过1小时。冷却回-78℃后，加入6-叠氮基己醛(6.67g，47mmol)，得到黄色溶液。将其再搅拌15分钟，然后使其升温到-20℃并通过添加20mL饱和NH4Cl水溶液中止。用EtOAc稀释后，用水、1N HCl、水和饱和NaCl水溶液依次洗涤混合物，然后用MgSO4干燥，过滤，并蒸发，产生8.0g黄色油状物。将其溶解于小份体积的二氯甲烷中，并使用0到40％EtOAc/己烷梯度在SiO2(80g)上进行色谱分析，得到6.0g(21.6mmol；84％)呈无色油状的产物。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ5.18(1H，d，J＝5Hz)，3.69(1H，m)，3.32(2H，t，J＝6Hz)，2.60(1H，dd，J＝4.8，16.4Hz)，2.51(1H，dd，J＝6.4，16.4Hz)，1.55(2H，m)，1.42(2H，m)，1.30(4H，m)。
制法D
N，N-二乙基4-硝基苯甲酰胺
Figure GDA0001162630430000141
于30分钟内，向经搅拌的冰冷的二乙胺(15.5mL，150mmol)和氢氧化钠(6.0g，150mmol)于150mL水中的溶液中滴加4-硝基苯甲酰氯(18.6g，100mmol)于100mL乙腈中的溶液。加入完成后，待混合物升温到周围温度并再搅拌1小时。用3×100mL CH2Cl2萃取混合物，并用1×100mL水、1×100mL 1N HCl和盐水洗涤组合的萃取物。用MgSO4干燥后，过滤混合物并蒸发至干，得到结晶块体。从80/20己烷/乙酸乙酯的再结晶得到20.0g呈淡黄色晶体状的产物(90％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.27(2H，m)，7.54(2H，m)，3.57(2H，br q，J＝6.8Hz)，3.21 2H，br q，J＝6.8Hz)，1.27(3H，br t，J＝6.8Hz)，1.12(3H，br t，J＝6.8Hz)。
制法E
4-(N，N-二乙基甲酰胺基)苯胺
Figure GDA0001162630430000142
向经强力搅拌的在冰上冷却的N，N-二乙基4-硝基苯甲酰胺(20.0g，90mmol)和1.0g10％钯/木炭于400mL甲醇中的混合物中加入甲酸铵(20.0g，317mmol)。所述反应升温并伴随剧烈气体逸出。1小时后，TLC(60/40己烷/EtOAc)指示起始物质完全转化。使混合物滤过硅藻土垫并蒸发，得到结晶固体。将其悬浮于水中并通过真空过滤收集。使产物自水再结晶并干燥，得到14.14g(83％)白色晶体。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.22(2H，m)，6.65(2H，m)，3.81(2H，br s)，3.42(4H，br s)，1.17(6H，t，J＝6.8Hz)。
制法F
4-(N，N-二乙基甲酰胺基)苯基氨基甲酸1-氰基-7-叠氮基-2-庚酯
Figure GDA0001162630430000151
在惰性氛围下，向经搅拌的在冰上冷却的1-氰基-7-叠氮基-2-庚醇(4.60g，25mmol)和三光气(12.5g，42mmol)于200mL无水THF中的溶液中滴加吡啶(4.0mL，50mmol)。在冰上搅拌白色悬浮液，历时15分钟，然后待其升温到周围温度并再搅拌30分钟。TLC分析(60∶40己烷/乙酸乙酯)指示起始物质完全转化成高-Rf产物。过滤并蒸发悬浮液，且用100mL无水乙醚溶解残余物，过滤并蒸发，得到呈棕色油状的粗制氯甲酸酯(4.54g，74％)。向氯甲酸酯(18.6mmol)和4-(N，N-二乙基甲酰胺基)苯胺(3.85g，20mmol)于100mL无水CH2Cl2中的溶液中加入三乙胺(3.5mL，25mmol)。搅拌1小时后，用1N HCl(2×)、水(2×)和盐水(1×)洗涤混合物，然后用MgSO4干燥，过滤并蒸发得到油状物，其在静置时结晶。用60/40己烷/乙酸乙酯洗涤结晶块体。浓缩洗涤物，并使用0到80％乙酸乙酯/己烷梯度在二氧化硅上进行色谱分析。浓缩产物洗脱液，并与初始结晶物质组合。使组合的产物自1∶1的乙酸乙酯/己烷再结晶以得到呈白色结晶固体状的氨基甲酸酯(4.4g，2步骤44％)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.45-7.35(4H，m)，6.888(1H，br s)，5.000(1H，m)，3.52(4H，br)，3.288(2H，t，J＝6.8Hz)，2.841(1H，dd，J＝5.2，17Hz)，2.327(1H，dd，J＝4.4，17Hz)，1.88(1H，m)，1.75(1H，m)，1.63(2H，m)，1.45(4H，m)，1.18(6H，br)。
制法G
N-(氯甲基)氨基甲酸酯
Figure GDA0001162630430000152
在N2氛围下，将N-(氯甲基)-4-(N，N-二乙基甲酰胺基)-苯基氨基甲酸7-叠氮基-1-氰基-2-庚酯(2.00g，5.0mmol)、多聚甲醛(225mg，5.5mmol，1.5当量)、三甲基氯硅烷(2.5mL，20.0mmol，4.0当量)和25mL无水甲苯的悬浮液置于配备磁力搅拌棒并用橡胶隔膜帽密封的50mL RBF中。在50℃油浴中加热所述密封烧瓶，历时24小时，此时可得到澄清的黄色溶液。使溶液冷却到周围温度并蒸发。将残余物再溶解于10mL无水甲苯中，过滤并蒸发，得到包含残余甲苯的呈不稳定黄色油状的粗制N-(氯甲基)-氨基甲酸酯(预期2.68g，119％)。将此物质溶解于10mL无水THF中并在N2下储存。通过加入5uL到1.0mL于乙醇中的4mM N，N-二异丙基乙胺，随后用反相HPLC分析(Phenomenex Jupiter 300A 4.6×150mmC18；1.0mL/min；于10分钟内从20％到100％CH3CN/H2O/0.1％TFA梯度)可证实N-(氯甲基)氨基甲酸酯的形成。起始氨基甲酸酯在第8.42分钟时洗脱，并显示λmax243nm；产物N-(乙氧基甲基)-氨基甲酸酯在第8.52分钟时洗脱并显示λmax231nm；未知杂质在第8.04分钟时洗脱并显示λmax245nm。在240nm下的峰值积分指示约89％的N-(乙氧基甲基)-氨基甲酸酯。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.39(4H，m)，5.54(1H，d，J＝12Hz)，5.48(1H，d，J＝12Hz)，4.99(1H，m)，3.51(4H，br)，3.26(2H，t，J＝6.8Hz)，2.79(1H，m)，2.63(1H，m)，1.85(1H，m)，1.73(1H，m)，1.60(2H，m)，1.43(4H，m)，1.16(6H，br)。
制法H
叠氮基-连接子-SN-38
Figure GDA0001162630430000161
将SN-38(1.00g，2.55mmol；浩瑞)悬浮于10mL无水吡啶中，然后在真空下浓缩至干(浴温50℃)。用10mL无水THF重复此步骤。在N2氛围下，将所得淡黄色固体溶解于50mL无水THF和50mL无水DMF中，然后在冰上冷却。加入1.0M第三丁醇钾的THF溶液(2.55mL，2.55mmol)，形成初始为深绿色然后变为浓稠橘色悬浮液。15分钟后，加入N-(氯甲基)-氨基甲酸酯(7.5mL，2.8mmol)的THF溶液。在4℃下15分钟后，待淡橘色混合物升温到周围温度。1小时后，HPLC分析(5uL的样本+1mL的乙腈/0.1％TFA)指示86/14产物/SN-38。用200mL乙酸乙酯稀释淡黄色混合物，用2×100mL水、100mL饱和NaCl水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过用水湿磨油状残余物来除去过量DMF，并将残余物溶解于50mL乙腈中，过滤并蒸发，得到2.96g黄色玻璃状物。使用各200mL的己烷、己烷中20％、40％、60％、80％和100％丙酮的分级梯度在SiO2(80g)上对残余物进行色谱分析，得到经纯化的叠氮基-连接子-SN-38(1.66g，81％)。将所述物质溶解于50mL丙酮中，并搅拌滴加45mL 0.1％乙酸的水溶液，直到混合物变得浑浊。搅拌后，分离出固体物质。然后加入另外5mL 0.1％乙酸的水溶液以完全沉淀。搅拌2小时后，通过真空过滤收集固体，用水洗涤，并干燥，得到1.44g(70％)的淡黄色粉末。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.15(1H，d，J＝9.2Hz)，7.60(1H，s)，7.48(1H，dd，J＝2，9Hz)，7.40(4H，m)，7.25(1H，d，J＝2)，5.75(2H，br)，5.73(1H，d，J＝16Hz)，5.28(1H，d，J＝16Hz)，5.22(2H，s)，4.99(1H，m)，3.84(1H，s)，3.53(2H，br)，3.53(2H，br)，3.17(2H，t，J＝7Hz)，3.12(2H，q，J＝7Hz)，2.74(1H，dd，J＝1，17Hz)，2.54(1H，dd，J＝5，17)，1.86(2H，m)，1.6(1H，m)，1.46(1H，m)，1.37(3H，t，J＝7Hz)，1.25(6H，m)，1.12(4H，m)，1.02(3H，t，J＝7.3Hz)。LC-MS：[M+H]+＝805.3(C44H51N8O8的计算值＝805.3)。
实例1
氨基-连接子-SN-38乙酸盐
Figure GDA0001162630430000181
向叠氮基-连接子-SN-38(1.13g，1.4mmol)和乙酸(0.19mL，3.3mmol)于10mL THF中的溶液中加入1M三甲基膦的THF溶液(2.9mL，2.9mmol)。气体缓慢逸出。搅拌2小时后，加入水(1.0mL)并再搅拌混合物1小时。将残余物分配在乙醚与水之间。用乙酸乙酯洗涤水相1次，并蒸发所得的澄清黄色水相，得到800mg黄色泡沫。将其溶解于THF中，过滤，并通过UV吸光率定量，得到包含1.2μmol(86％)产物的溶液。Cl8 HPLC显示单峰，且LC-MS显示[M+H]+＝779.3(预期值779.4)。
实例2
具有m＝1且n～225的化合物(III)的SN-38结合物
将40kDa 4臂四-(琥珀酰亚胺基-羧甲基)-PEG(健凯科技有限公司；10.0g，1.0mmolHSE)、实例1的氨基-连接子-SN-38乙酸盐(1.2mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.21mL，1.2mmol)于75mL THF中的混合物保持在周围温度下。通过HPLC监测偶合进程，其显示到90分钟，反应完成。在总计2小时后，将混合物过滤到500mL经搅拌MTBE中。通过真空过滤收集沉淀物，用MTBE洗涤，并在真空下干燥，得到呈蜡状淡黄色固体状的结合物(10.1g，95％)。2.0mg样本于1.0mL水中的分光亮度分析显示0.17mM的SN-38，其基于以重量计的计算值0.175mM SN-38，此指示96％的结合物负载。C18-HPLC分析指示单一主峰(在363nm处98％的总峰面积；在256nm处97％)，和0.6mol％游离SN-38。
所述结合物在10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中可溶解到1.9mM(85mg/mL)。相反，其中制法H的叠氮基-连接子-SN-38已通过三唑键连接到PEG40kD-(DBCO)4的相应结合物(WO2011/140393)仅可溶解到0.7mM(32mg/mL)。实例2结合物的溶解度还在0.2N乙酸盐缓冲液中在pH 4和pH 5下以及在0.2N磷酸盐缓冲液中在pH 6、pH 7和pH 8下测试。在所有这些pH下，发现溶解度＞300mg/ml。然而，当结合物溶解时，pH值会轻微改变，且通常上升高过原始值。因此，当300mg/ml的结合物溶解于pH 4的缓冲液中时，pH变为4.5；溶解于pH 5的缓冲液中时，pH变为5.4；溶解于pH 6的缓冲液中时，pH变为6.2；溶解于pH 7的缓冲液中时，pH变为7.2；溶解于pH 8的缓冲液中时，pH变为7.7。
当在室温下将10mg/ml结合物溶解于pH 4到pH 8的缓冲液中和水中并在室温下保持7天时，测试稳定性。通过HPLC测试多种缓冲液中的结合物纯度。
通常，测得第0天的纯度稍小于100％，一般在97％左右。如果在水中在任何测试的pH下于7天内的测量纯度发生任何变化，那么变化很小。
实例3
体外释放动力学
在37℃下，将实例2的结合物于0.1M硼酸钠(pH 9.4)中的溶液保存于密封的UV比色皿中。随时间监测因形成游离SN-38酚盐所致的在414nm下的吸光率增加。数据与单一指数Amax*(1-e-kt)拟合提供了结合物在pH 9.4下释放SN-38的速率常数k，其中Amax为在完全反应时的吸光率。如图6中显示，游离SN-38的形成遵循在pH 9.4下k＝0.00257min-1(t1/2＝270min)的一级动力学。由于已知这些连接子的释放速率在氢氧化物中为一级，因此在其它pH值下的释放速率可计算为k(pH)＝k9.4*10(PH-9.4)。因此，SN-38在pH 7.4下的速率计算为2.57×10-5min-1，或在pH 7.4、37℃下t1/2＝450h。
实例4
体内药代动力学
将45mg/ml实例2的结合物于10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中的溶液无菌过滤并以200mg/kg注射到插管的雌性斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠(n＝3)中，并定期抽取血液样本(0.3mL)并立即将其加入到30μL的1M柠檬酸盐/0.1％
Figure GDA0001162630430000191
F68溶液pH4.5中以降低样本pH，凝结并稳定剩余的完整结合物。在2到8℃下以约1,500×g(力)离心这些样本，历时10分钟以除去红细胞并得到约150uL血浆。将血浆分成2个等分试样并转移到低温小瓶并在分析前储存于-80℃的冷冻箱中。
为分析，在冰上解冻样本并与包含8ng/mL喜树碱作为内标的2份体积乙腈/0.5％乙酸混合。通过在4℃下，以16,000×g离心10分钟除去沉淀的蛋白质。使用40℃恒温的
Figure GDA0001162630430000201
Figure GDA0001162630430000202
Jupiter 5um 150×4.6mm C18HPLC柱，在1.0mL/min下使用100mM磷酸钠、3mM庚烷磺酸盐pH 4.0(缓冲液A)和75％乙腈的水溶液(缓冲液B)的梯度分析样本上澄液(20uL)。所述梯度由以下组成：5％B等浓度持续3min、20％B等浓度持续3min、自20％到40％B的线性梯度历时5min、自40％到100％B的线性梯度历时2min、100％B等浓度持续3min、5％B等浓度持续3min。样本洗脱后为二极管阵列检测器和荧光检测器，激发设置在370nm和对于前9分钟发射设置在470nm，随后对于最后10分钟发射设置在534nm。通过将结合物(吸光率380nm)和SN-38(荧光Ex：370nm，Em：534nm)的峰面积与标准曲线对比计算浓度。观测以下保留时间：SN-38，12.7分钟；喜树碱，13.2分钟；和结合物，14.5分钟。定量的下限是在10倍信噪比的峰高度下通过荧光检测而确定为SN-38：在20μl经乙腈处理的血浆注射液中0.07pmol(经乙腈处理的血浆中3.3nM，原血浆样本中10nM)。结合物：在20μl经乙腈处理的血浆注射液中2.1pmol结合物(8.4pmol SN-38)(在经乙腈处理的血浆中为100nM结合物；400nM SN-38，在原始的血浆样本中为300nM(1200nM SN-38))。
为获得完整结合物自血浆的清除率的信息，使用类似的稳定结合物(其中不存在CH2CN的式(II))以22mg/kg实施相似实验。
依照普约尔(Poujol)等人，“用于人类血浆和唾液中伊立替康和四种主要代谢物的灵敏HPLC-荧光方法：药代动力学研究应用”，临床化学(Clinical Chemistry)(2003)49：1900-1908的方法测定SN-38葡糖苷酸的浓度。
实例5
药代动力学模型化
使用两相模型(其中C(t)＝A*exp(-αt)+B*exp(-βt)，其中A+B＝剂量/Vd)分析结合物的血浆浓度对时间的数据。使用非线性回归分析(奈尔德-米德下坡单向法(Nelder-Mead downhill simplex))拟合数据，然后依照已建立的程序将参数去卷积以提供室之间转移的速率(k12和k21)和结合物从中心室消除的速率(kel)的估算值。实例2的结合物和相应稳定结合物(其中CH2CN被H置换)的数据分析得到表1中的数据。
表1
Figure GDA0001162630430000203
Figure GDA0001162630430000211
使用这些参数，然后基于一种模型(其中结合物以速率常数k1释放游离SN-38，并以Kdist＝Vd/Vc与第二室达成平衡)拟合游离SN-38的浓度数据。使用以下微分方程通过数值积分生成模型曲线：
Δ[Cc]＝(-k1[Cc]-k12[Cc]-kel[Cc]+k21[Cp])Δt
Δ[Cp]＝(k12[Cc]-k21[Cp])Δt
Δ[Dc]＝(k1[Cc]-kc1[Dc])/(1+Kdist)Δt
Kdist＝Vd/Vc
其中[Cc]和[Cp]分别为中心室和外围室中结合的SN-38的浓度，[Dc]为中心室中游离SN-38的浓度，且速率常数如上所述；Kc1为从血浆消除游离SN-38的速率常数，并允许其在针对此参数所报告的范围内变化(1.4-3.5h-1)。对于120h的时间跨度(Δt＝0.12h)和初始条件[Cc]＝Cmax、[Cp]＝0和[Dc]＝0，实施超过1000步的数值积分。SN-38的分布体积Vd设置为报告值0.18L/kg，而对于结合物Vc设置为Vd。
如图7中所示，使用这种方法，拟合结合的SN-38和从结合物释放的游离SN-38的浓度对时间数据。当自血浆消除游离SN-38的kc1＝2.77h-1(t1/2＝0.25h)时，与实验数据相当一致，完全在所报告范围内，且当k1设定在0.00173h-1时，于体外测量所述值(对于SN-38自结合物的裂解t1/2＝400h)。
使用这种模型，结合物在其它物种中的行为可在给定在那些物种中kel和kcl的值下来预测。在人类中，还未报告PEG(kel)和SN-38(kc1)消除的值以及分布体积，但可使用异速生长比例估算其约为kel＝0.0087h-1(t1/280h)和kc1＝0.7h-1(t1/21h)和Vss＝0.15L/kg(卡德维尔等人，“药物发现中药代动力学参数的异速生长比例：能否从体内大鼠数据预测人类CL、Vss和t1/2？”，欧洲药物代谢与药代动力学杂志(2004)29：133-143.)。在药代动力学模型中使用这些值提供了在给定Cmax/Cmin～2.5下游离SN-38的估算浓度范围。
实例6
用于连续输注的SN-38的调配物
SN-38的治疗投与因这种药物的水溶解性差(在水中7mg/L，18uM)而受到限制。研发一种调配物以克服此限制。为测定SN-38在多种调配物中的溶解度，稀释115mMSN-38的二甲基亚砜(DMSO)溶液以在多种调配物中得到15mM、10mM、5mM和2mM的目标浓度(表2)。在周围温度下静置16小时后，通过以14,000rpm离心30分钟除去沉淀的SN-38。以1∶200将上清液稀释到100mM硼酸盐(pH 10.0)中，并使用ε414＝22,500M-1cm-1在414nm下用分光亮度法测定SN-38的浓度。结果于表2中给出。
表2
调配物中赋形剂体积百分数
Figure GDA0001162630430000221
在测试的最高浓度下，调配物E和F中的SN-38保持完全可溶。预期可使用除PEG300以外的聚乙二醇得到相似优点。另外预期，可使用这些医药调配物以通过连续输注投与医药调配物，保持SN-38连续暴露于需要此种暴露的患者。可通过任何医药领域中已知的方法进行这些连续输注，例如通过使用输注泵或通过静脉滴注。

Claims (15)

1.一种式(I)结合物，
Figure FDA0002698567170000011
其中
PEG为直链或分支链且当q为2到8时为多臂的聚乙二醇；
X为(CH2)m，其中m＝1到6；
L为(CH2)r或(CH2CH2O)p(CH2)r，其中r＝1到10且p＝1到10；
R1为CN或SO2NR2 2，其中各R2独立地为烷基、芳基、杂芳基、烷基烯基、烷基芳基或烷基杂芳基，各者可任选经取代，或两个R2可连接在一起形成环；
Y为COR3或SO2R3，其中R3＝OH、烷氧基或NR4 2，其中各R4独立地为烷基、经取代的烷基，或两个R4可连接在一起形成环；以及
q＝1到8。
2.根据权利要求1所述的结合物，其中PEG为平均分子量30,000Da到50,000Da的聚乙二醇。
3.根据权利要求1所述的结合物，其中q＝4。
4.根据权利要求1所述的结合物，其中R1＝CN。
5.根据权利要求1所述的结合物，其中PEG为平均分子量30,000Da到50,000Da的多臂聚乙二醇；L为(CH2)6；R1为CN；Y为CONEt2；且q＝4。
6.根据权利要求1所述的结合物，其具有下式：
Figure FDA0002698567170000021
其中m＝1到6且n为200到250。
7.根据权利要求6所述的结合物，其中m为1且n为225。
8.一种医药调配物，其包含根据权利要求1到7中任一权利要求所述的结合物与医药上可接受的赋形剂。
9.根据权利要求8所述的调配物，其中所述调配物的pH值在4.0与6.0之间。
10.一种制备根据权利要求1到7中任一权利要求所述的结合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使式(VII)的叠氮-连接子-SN-38还原以产生氨基-连接子-SN-38；
(b)使所述氨基-连接子-SN-38与活化的PEG接触以产生根据权利要求1所述的结合物；和
(c)任选分离所述结合物。
11.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的结合物，其用于提供SN-38的连续、低剂量暴露给需要此类暴露的患者的方法中，所述方法包括对所述患者投与所述结合物。
12.根据权利要求11所述的结合物，其中在所述方法中，游离SN-38的浓度在每周一次投药之间保持15nM与5nM之间。
13.根据权利要求11所述的结合物，其中在投药之间观测到的Cmax/Cmin在每周一次投药之间小于或等于10。
14.根据权利要求13所述的结合物，其中在投药之间观测到的Cmax/Cmin在每周一次投药之间小于或等于5。
15.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的结合物，其用于控制需要SN-38治疗的患者的血浆中SN-38葡糖苷酸含量的方法中，所述方法包括对所述患者投与所述结合物，其中所得的SN-38G/SN-38比率小于0.2。
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