BR112016007410B1

BR112016007410B1 - Conjugados de sn-38 de liberação lenta, formulações farmacêuticas, métodos de preparo do referido conjugado e usos relacionados

Info

Publication number: BR112016007410B1
Application number: BR112016007410-6A
Authority: BR
Inventors: Gary Ashley; Eric L. Schneider
Original assignee: Prolynx Llc
Priority date: 2013-10-04
Filing date: 2014-10-03
Publication date: 2022-07-19
Also published as: MX371201B; AU2014331591B2; JP2016531895A; JP2019104739A; CN106061483B; CA2925132A1; US10342792B2; AU2014331591A1; US20160243106A1; EP3052101B1; SG10201811365RA; EP3052101A1; BR112016007410A8; MX2016004299A; SG11201602258WA; BR112016007410A2; TW201601759A; DK3052101T3; CN106061483A; TWI716342B

Abstract

CONJUGADOS DE SN-38 DE LIBERAÇÃO LENTA, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E USOS DOS CONJUGADOS. Os conjugados de SN-38 que proporcionam taxas de liberação de fármaco ótimas e minimizam a formação do glucuronato correspondente são descritos. Os conjugados liberam SN-38 a partir de um polietilenoglicol através de um mecanismo de (beta)-eliminação

Description

Campo Técnico

[001] A invenção refere-se a sistemas de liberação lenta de um fármaco anticancerígeno, SN-38.

Antecedentes da Técnica

[002] O análogo de camptotecina SN-38 (7-etil-l0- hidróxicamptotecina) é um metabólito ativo do fármaco antitumoral irinotecano. É ~1000x mais ativo do que o irinotecano, ainda não foi terapeuticamente útil devido à solubilidade extremamente pobre aquosa (17 uM) e liberação rápida.

[003] Irinotecano em si é utilizado clinicamente e tem demonstrado atividade em cânceres leucemia, linfoma, colo retal, do pulmão, do ovário, cervical, do pâncreas, do estômago, e da mama. Vários estudos têm indicado que as camptotecinas em geral devem seus efeitos antitumorais à inibição da topoisomerase I, e que a eficácia está relacionada com a manutenção a inibição desta enzima durante períodos prolongados (“tempo durante o alvo”). A fim de manter os níveis eficazes de camptotecinas durante um tempo suficiente, é normalmente necessário que doses bastante elevadas de medicamento sejam administradas para combater a taxa de depuração relativamente rápida do fármaco a partir do sistema. Isto resulta em altas concentrações máximas de fármacos (Cmax) nos primeiros momentos após a administração, que é pensado resultar em toxicidades, tais como a diarreia com risco de vida, que é a toxicidade limitante da dose de irinotecano. Dada à elevada potência de SN-38, seria desejável proporcionar o medicamento como uma infusão prolongada a uma concentração de estado estacionário suficiente para a inibição da topoisomerase I, mas menor do que a concentração tóxica. Ensaios clínicos utilizando infusão prolongada de irinotecano via bombas corroboram esta hipótese, no entanto, esta não é uma estratégia terapêutica viável para SN-38, devido à baixa solubilidade nas formulações de dosagem.

[004] O irinotecano é convertido em SN-38 por carboxiesterase hepática, e, em seguida metabolizado pelo UGT1A hepático ao seu 10-glucuronídeo, SN-38G. Glucuronidação facilita a excreção biliar e glucuronidase bateriana intestinal provoca a reconversão de SN-38G para SN-38. A menos que UGTIA intestinal converta o fármaco de volta para o SN-38G inerte, o SN-38 pode causar efeitos tóxicos sobre o intestino. Assim, SN-38G pode atuar tanto como fonte de SN-38 tóxico e uma proteção contra a diarreia grave causada por SN-38. Em geral, os níveis elevados de SN-38 resultam em aumento da glucuronidação a SN-38G, aumento da excreção de SN-38G para o intestino, e desglucuronidação bacteriana que provoca toxicidade gastrointestinal.

[005] A liberação lenta de SN-38 a partir de, um conjugado circulante de longa duração solúvel em vez de a partir de um pró-fármaco, tais como irinotecano pareceria fornecer uma solução para estes problemas, e várias estratégias de conjugação foram aplicadas a SN-38. A conjugação com poli(etilenoglicol) (PEG), através de um éster de glicinato de oxigênio-20 (Patente US 8.299.089) fornece um conjugado solúvel aquosa que libera SN-38 livre de forma relativamente rápida (t1/2 = 12 h), devido à hidrólise do éster. Outra ligação química de éster a um polímero de poliol com liberação rápida de SN-38 foi descrita (publicação da patente US 2010/0305149 A1) . Conjugação de um copolímero em bloco de poliglutamato-PEG através de ligações de éster a oxigênio-10 proporciona um conjugado micelar que novamente libera SN-38 livre por hidrólise do éster (Publicação PCT WO2004/039869). Devido à instabilidade dos ésteres em meio aquoso, eventualmente acelerada por esterases no plasma, tais estratégias de conjugação à base de éster para SN-38 não são adequadas para suportar uma dose baixa de exposição a longo prazo a SN-38, e os níveis de SN-38 geralmente caem abaixo do nível eficaz entre as dosagens. Os conjugados são administrados tipicamente em níveis elevados, dando elevadas concentrações máximas de SN-38 e resultando na formação de altos níveis de SN-38G.

[006] Os conjugados PEG-SN-38 com taxas de liberação mais controladas foram descritos na Publicação PCT WO2011/140393. Estes conjugados liberam SN-38 através de um mecanismo de eliminação beta, com taxas controláveis através de um vasto intervalo através da seleção do agente de ligação apropriado. O acoplamento de uma macromolécula a este fármaco era por meio de um produto de condensação do azido com um alcino cíclico resultando num conjugado relativamente insolúvel. O subgênero reivindicado neste documento tem uma solubilidade melhorada devido à presença de uma ligação amida simples, e é estável in vitro em tampão a temperatura ambiente. Verificou-se agora, inesperadamente, que através de uma seleção apropriada da taxa de liberação a formação in vivo de SN-38G pode ser reduzida enquanto proporcionando ao mesmo tempo uma exposição a longo prazo a SN-38 ativo. A presente invenção proporciona conjugados que são concebidos para liberar SN- 38 livre através de um mecanismo de eliminação beta não- enzimática em taxas que permitem a baixa dose, regimes de exposição a longo prazo para SN-38 e que reduzem ainda mais a quantidade de SN-38G formado durante a administração.

Descrição da Invenção

[007] A presente invenção proporciona conjugados que são concebidos para liberar SN-38 livre através de um mecanismo de eliminação beta não enzimática às taxas lentas que permitem a baixa dose, regimes de exposição a longo prazo para SN-38 e que reduzem ainda mais a quantidade de SN-38G formada durante a administração. Também são fornecidos métodos para produzir os conjugados e métodos para o seu uso no tratamento de doenças e condições caraterizadas por hiperproliferação celular.

[008] Assim, num aspecto, a invenção proporciona conjugados possuindo a fórmula (I)

em que PEG é um polietilenoglicol com um peso molecular médio entre 20.000 e 60.000 Da (3,32x10-20 e 9, 96x10-20 g), que é linear ou ramificado e em que q é 2-8, de ramificações múltiplas; q = l-8; X é O, NH, (CH2)m, OC(=O) (CH2)m, ou NHC(=O) (CH2U em que m = 1-6; R1 é um grupo CN ou SO2NR22 em que cada R2 é independentemente alquil, aril, heteroaril, alquilalquenil, alquilaril, ou alquilheteroaril, cada um opcionalmente substituídos, ou tomados em conjunto podem formar um anel; Y = COR3 ou SO2R3 em que R3 = OH, alcoxi, ou NR42, em que cada R4 é independentemente, alquil, alquil substituído, ou realizados em conjunto podem formar um anel; e L é (CH2)r ou (CH2CH2O)p(CH2)r, em que r = 1-10 e p = 110.

[009] Num segundo aspecto, a invenção proporciona métodos para a preparação de conjugados de fórmula (I), bem como intermediários para esse fim.

[010] Num terceiro aspecto, a invenção proporciona métodos para a liberação lenta de SN-38 utilizando conjugados de fórmula (I).

[011] Num quarto aspecto, a invenção proporciona métodos para minimizar a quantidade de SN-38 glucuronídeo formado mediante a administração de SN-38 por controle da taxa de liberação de SN-38 a partir de um conjugado.

[012] Num quinto aspecto, a invenção refere-se a uma formulação que solubiliza SN-38 compreendendo PEG e DMSO e métodos para o uso da mesma.

Breve descrição dos Desenhos

[013] A Figura 1 ilustra a liberação de SN-38 livre a partir de conjugados da presente invenção.

[014] A Figura 2 ilustra um método para a preparação de azido-ligante-SN-38 (VII) os intermediários da invenção.

[015] A Figura 3 ilustra um método para a redução do azido-ligante-SN-38 (VII) na amina-ligante-SN-38 (VIII) utilizando trimetilfosfina e ácido acético em THF/água.

[016] A figura 4 ilustra um método para a preparação de conjugados (I) da invenção, em que R1 representa um grupo CN, Y representa CONEt2, q = 4, X é CH2, L é (CH2)5 e PEG é um polietilenoglicol de 4 ramificações tendo um núcleo de pentaeritritol.

[017] A Figura 5 mostra a estrutura detalhada de um conjugado de fórmula geral (I) em que R1 representa um grupo CN, Y representa CONEt2, q = 4, X é CH2 , L é (CH2)Õ, e PEG é um polietilenoglicol de 4 ramificações de peso molecular médio de 40.000 (n ~225).

[018] A Figura 6 mostra a cinética de liberação in vitro de SN-38 a partir do conjugado da invenção, em que R1 representa um grupo CN, o símbolo Y representa CONEt2 , q = 4, X é CH2, L é (CH2H e PEG é um polietilenoglicol de 4 ramificações de peso molecular médio de 40.000. SN-38 tem um pKa de ~8,6, devido à ionização do 10-OH; após formação do fenolato, a absorbância máxima de UV/Vis de SN-38 desloca a 414 nm. Quando conjugado através da 10-OH, SN-38 não mostra nenhuma absorbância a 414 nm. Assim, o aumento na absorbância a 414 nm é uma medida da formação de SN-38 livre a partir do conjugado. A curva indicada foi ajustada aos dados experimentais usando uma constante de velocidade de primeira ordem de 0,00257 min-1 a pH 9,4. Isto traduz-se em t1/2 para liberação de 450 horas a pH 7,4.

[019] A Figura 7 mostra níveis in vivo do conjugado (quadrados) e SN-38 livre (círculos) liberado a partir do conjugado de fórmula (I), em que R1 representa um grupo CN, Y é CON(Et)2 , q = 4, X representa um grupo CH2, L é (CH2)5, e PEG é um polietilenoglicol de 4 ramificações de peso molecular médio de 40.000, após a administração intravenosa de 200 mg/kg de conjugado (7 mg/kg de SN-38) em ratos (média de n = 3). As curvas foram geradas como descrito no Exemplo 5, utilizando uma liberação in vivo t = 400 h.

[020] A Figura 8 mostra níveis in vivo de SN-38 livre (círculos) e SN-38 glucoronídeo (quadrados) formado a partir do conjugado de fórmula geral (I) em que R1 representa um grupo CN, Y é CON(Et)2 , q = 4, X é CH2, G é (CH2)5, e PEG é um polietilenoglicol de 4 ramificações de peso molecular médio de 40.000, após a administração intravenosa de 200 mg/kg de conjugado (7 mg/kg de SN-38) em ratos(média de n = 3).

Modos de Realização da Invenção

[021] Em um aspecto, a invenção proporciona conjugados possuindo a fórmula (I)

ramificada e, quando q é 2-8, de ramificações múltiplas, peso molecular médio entre 20.000 e 60.000 Da (3,32x10-20 e 9,96x10-20 g); q = l-8; X é O, NH, (CH2)m , OC(=O)(CH2)m, ou NHC(=O) (CH2)m em que m = 1-6; R1 representa CN ou SO2NR22, em que cada R2 é independentemente alquil, aril, heteroaril, alquilalquenil, alquilaril, alquilheteroaril ou, cada um opcionalmente substituído, ou tomados em conjunto podem formar um anel; Y = CR3 ou SO2R3 e R3 = OH, alcoxi, ou NR42, em que cada R4 é independentemente alquil, alquil substituído, ou tomados em conjunto podem formar um anel; e L é (CH2)r ou (CH2CH2O)p(CH2)r, em que r = 1-10 e p = 110.

[022] O termo “alquil” é definido como um grupo linear, ramificado, ou um grupo hidrocarboneto cíclico saturado, com 1-8 carbonos, ou em algumas modalidades 1-6 ou 1-4 átomos de carbono.

[023] O termo “alquenil” é definido como um hidrocarboneto não-linear aromático, ramificado, cíclico ou insaturado, de 1-6 ou 1-4C com uma ou mais ligações duplas carbono-carbono.

[024] O termo “alquinil” é definido como um hidrocarboneto não-aromático linear, ramificado, ou insaturado cíclico, de 1-6 ou 1-4C com uma ou mais ligações triplas carbono-carbono.

[025] O termo “alcoxi” é definido como um grupo alquil ligado ao oxigênio, incluindo metoxi, etoxi, isopropoxi, ciclopropoxi, ciclobutoxi, e semelhantes.

[026] O termo “aril” é definido como um grupo hidrocarboneto aromático de 6-18 átomos de carbono, preferencialmente 6-10 átomos de carbono, incluindo grupos tais como fenil, naftil, e antracenil. O termo “heteroaril” é definido como anéis aromáticos compreendendo 3-15 átomos de carbono que contêm pelo menos um átomo N, O ou S, de preferência 3-7 átomos de carbono contendo pelo menos um átomo N, O ou S, incluindo grupos tais como pirrolil, piridil, pirimidinil, imidazolil, oxazolil, isoxazolil, tiazolil, isotiazolil, quinolil, indolil, indenil, e similares.

[027] O termo “halogênio” inclui bromo, flúor, cloro e iodo.

[028] Quando os grupos estão “opcionalmente substituídos”, os substituintes incluem 1-3 substituintes que são os mesmos ou diferentes e podem incluir halogênio, amino, hidróxila, e sulfidrila, bem como os substituintes que contêm grupos carboxila, ou como ésteres, amidas, ou como grupos carboxilas livres. Esta lista não pretende ser abrangente, e qualquer substituinte não interferente pode ser incluído dentre aqueles que são opcionalmente presentes.

[029] Tal como aqui utilizado “um”, “uma”, etc, pretendem significar um ou mais do que um a menos que indicado de outra forma. Além disso, onde os intervalos de números inteiros são fornecidos, todos os inteiros intermédios têm a intenção de serem incluídos como se especificamente estabelecidos.

[030] O PEG pode ser linear, ramificado, ou polietilenoglicol de ramificações múltiplas de peso molecular médio entre 20.000 e 60.000 (isto é, compreendendo desde cerca de 400 a 1500 unidades de óxido de etileno aproximadamente) ou 30.000-50.000, em que pelo menos uma extremidade do polímero pode ser encerrada com uma funcionalidade de carboxilato. Estes PEGs são disponíveis comercialmente, por exemplo, através de NOF e Jenkem Technologies, como os derivados em que o grupo C=O é ativado por reação com aminas como N-hidróxi-succinimida ou ésteres de nitrofenila ou N-hidróxi-succinimidila ou carbonatos de nitrofenila. Estes PEGs de elevado peso molecular são constituídos por uma distribuição Gaussiana de pesos moleculares (isto é, são polidispersos), e, assim, compreendem uma distribuição do número de unidades de óxido de etileno; eles são descritos por um peso molecular médio que é aqui pretendido a englobar a distribuição de pesos moleculares e unidades de óxido de etileno comumente encontradas em materiais fornecidos industrialmente possuindo o peso molecular médio descrito. Índices de polidispersão típicos (PDI) para PEG de 4 ramificações são menos do que ou igual a 1.1, e são calculados como PDI = Mw/Mm, onde MW = massa molar média em peso calculada como ∑Mi2Ni/∑MiN e Mm = massa molar média em número calculada como ∑MiNi/∑Ni, em que M é o peso molecular das espécies i, e N é o número de espécies i na amostra. PDI pode ser medido por técnicas conhecidas na arte, tais como cromatografia de permeação em gel por HPLC ou espectrometria de massa (ver, por exemplo, a Publicação de Patente US 2010/0126866 Al). Os PEGs de multi-ramificações podem ser formados a partir de uma variedade de unidades centrais, incluindo pentaeritritol, hexaglicerol, e tripentaeritritol,

para fornecer uma variedade de configurações, o número total de ramificações. Pelo menos uma ramificação do PEG é terminada com uma funcionalidade de carboxilato através do grupo de ligação X para permitir a ligação do ligante-SN- 38. X serve para fixar a funcionalidade de carboxilato ao PEG e, portanto, pode ser qualquer um dos grupos típicos de conectores incluindo O, NH, (CH2)m, OC(=O) (CH2)m, ou NHC(=O) (CH2)m, em que m = 1-6. Em certas modalidades da invenção, X é O, NH, (CH2)m, ou NHC(=O)(CH2)m. Em uma modalidade da invenção, X é (CH2)m.

[031] Em certas modalidades específicas da invenção, o PEG tem um peso molecular médio de 40000 ± 4000 Da (6, 64x10-20 ± 6,64x10-21 g) (isto é, que compreende de cerca de 800 a 1000 unidades totais de óxido de etileno) . Numa modalidade, o PEG é um polímero de 4 ramificações, com um núcleo de pentaeritritol e um peso molecular médio de 40.000 ± 4.000 Da (6, 64x10-20 ± 6,64x10-21 g), em que cada ramificação compreende, assim, de 225 ± 25 unidades de óxido de etileno, em média, e é terminado por um grupo carboxilato, e tendo a fórmula (III) .

em que n = 200-250 e m = 1-6. Embora os conjugados relacionados foram anteriormente descritos na Publicação PCT WO2011/140393, nós verificamos inesperadamente que a ligação do PEG ao ligante-SN-38 através de uma ligação amida mais hidrofílica proporciona conjugados com melhores propriedades de solubilidade e viscosidade ao longo dos conjugados anteriormente descritos em que o PEG foi ligado através de uma cicloadição 1,3-dipolar entre uma azida e uma dibenzoazaciclooctina (DBCO ou DIBOC).

[032] L é um grupo de ligação que tem a fórmula (CH2)r ou (CH2CH2O )p(CH2)r, em que r = 1-10 e p = 1-10.

[033] R1 representa CN ou SO2NR22, em que cada R2 é independentemente alquil, aril, heteroaril, alquilalquenil, alquilaril, ou alquilheteroaril, cada um opcionalmente substituído, ou tomados em conjunto podem formar um anel. Em algumas modalidades, cada R2 representa, independentemente, alquil. R1 controla a taxa de liberação de SN-38 a partir do conjugado, tal como descrito na publicação PCT WO2011/140393 e Pedido de Patente PCT PCT/US12/54293, que são aqui incorporados por referência. Para apoiar a baixa dose, os regimes de exposição a longo prazo, a taxa de liberação de SN-38 a partir dos conjugados deve ser tal que a meia-vida in vivo da liberação está entre cerca de 100 e cerca de 1.000 horas, de preferência entre cerca de 300 e cerca de 800 horas, e ainda mais preferivelmente cerca de 400 a 500 horas. É notado que as taxas de liberação in vivo podem ser de até cerca de 3x mais rápidas do que as taxas de liberação in vitro correspondentes, medidas a pH 7,4, 37 °C. Em certas modalidades, R1 representa um CN. Nesta modalidade, a meia- vida de liberação in vitro e in vivo (rato) foi medida como 400 h. Em certas outras modalidades, R1 é SO2NR22. Em certas modalidades específicas, R1 é SO2NR22 em que cada R2 representa, independentemente, metil, etil, alil, benzil, 2-metoxietil ou 3-metoxipropil, ou NR2 forma morfolino, 2,3-dihidroindolil, ou 1,2,3,4- tetrahidroquinolil.

[034] Y é um substituinte de remoção de elétrons que estabiliza o conjugado contra a liberação prematura. Em certas modalidades, Y é COR3 ou SO2R3, em que R3 = OH, OR4 ou NR42, em que cada R4 é independentemente alquil, alquil substituído, ou ambos os R4 tomados em conjunto podem formar um anel. Em algumas modalidades, Y está na posição para. Y serve para estabilizar a ligação N-CH2-O a SN-38, minimizando assim a velocidade de clivagem espontânea do fármaco a partir do conjugado. Em certas modalidades, Y é CONR42 e, em certas modalidades específicas Y é CON(CH2CH3)2, CON(CH2CH2)2O, SO2N(CH2CH2)2O em que (CH2CH2HO combinado com N é morfolino. Os p- aminobenzoatos e p-aminosulfonamidas resultantes a partir de beta-eliminação e liberação de SN-38 são geralmente considerados de baixa toxicidade.

[035] Numa modalidade específica da invenção, um conjugado de fórmula geral (I) com a estrutura (II) é Fornecido

em que m = 1-6 e n = 100-375 (isto é, um PEG de peso molecular médio entre 20.000 e 60.000 Da (3,32x10-20 e 9,96x10-20 g), ou 30.000-50.000 Da (4,98x10-20 e 8,30x10-20 g). Numa modalidade mais específica da invenção, um conjugado possuindo fórmula (II) é proporcionado, em que m = 1-3. Numa modalidade ainda mais específica da invenção, m = 1 e n = 200-250 ou ~225 de tal modo que o peso médio molecular de PEG é de cerca de 40.000.

[036] Em outro aspecto da invenção, métodos para a preparação dos conjugados da fórmula (I) são fornecidos. Um método para a preparação do intermediário azido-ligante-SN- 38, previamente revelado na Publicação PCT WO2011/140393, é ilustrado na Figura 2. Assim, um azido-álcool (IV) é convertido no carbamato (V), por exemplo, por conversão do intermediário para o cloroformato utilizando fosfogênio ou um equivalente de fosfogênio, tal como trifosfogênio, na presença de uma base suave tal como piridina, seguida de reação com a anilina NH2-CeH4-Y. Alternativamente, (V) pode ser formado diretamente por tratamento de (IV) com isocianato de OCN-C6H4-Y. O carbamato (V) é em seguida N- clorometilado utilizando uma modificação do método descrito por Majumdar (“N-alkyl-N-alkyloxycarbonylaminomethyl (NANAOCAM) pró-drugs of caboxylic acid containing drugs,” Bioorg Med Chem Letts (2007) 17: 1447-1450), em que o carbamato (V) e paraformaldeído são postos em contato numa mistura de clorotrimetilsilano e de um solvente inerte tal como tetra-hidrofurano, 1,2-dicloroetano, dioxano, ou tolueno. Numa modalidade preferida, o solvente inerte é tolueno. O catalisador clorotrimetilsilano está presente num excesso molar de 1-10 vezes em relação a (V) , preferivelmente num excesso molar de 4 vezes. A reação pode ser realizada a temperaturas entre 20 e 100 °C, de preferência entre 40 e 60 °C, e mais preferencialmente a 50 °C, sob atmosfera inerte, e o progresso da reação pode ser monitorado por conversão do N-(clorometil)carbamato reativo (VI) em espécies estáveis, por exemplo, por diluição de uma alíquota da mistura de reação em etanol contendo base de trialquilamina suficiente para neutralizar o cloro-trimetilsilano, seguido por análise de HPLC do N- (etoximetil)carbamato resultante.

[037] SN-38 é alquilado no OH fenólico por N- (clorometil)carbamato (VI) para produzir o azido-ligante- SN-38 (VII), ilustrado na Figura 2. Uma variedade de bases pode ser usada para desprotonar o fenol e, assim, efetuar a alquilação, incluindo alcóxidos, tais como terc-butóxido de potássio (KOtBu) , amidas de metais, tais como bis(trimetilsililamida) de lítio (LiHMDS), hidretos de metais tais como NaH, amidinas, tais como l,8- diazabiciclo[5.4.0]-undec-7-eno (DBU), e bases de fosfazeno. Em modalidades preferenciais, a base é KOtBu. SN-38, num solvente apropriado é primeiro contatado com a base a uma temperatura entre -20 e 25 °C, de preferência entre -20 e 5 °C, e mais preferencialmente a 4 °C, de modo a produzir o sal fenolato. O fenolato é então contatado com N-(clorometil)-carbamato (VI) a uma temperatura entre -20 e 25 °C, de preferência entre -20 e 5 °C, e mais preferencialmente a 4 °C, de modo a produzir uma solução de do azido-ligante-SN-38 (VII). Os solventes apropriados incluem THF, DMF e suas misturas.

[038] Tal como ilustrado na Figura 3, o azido-ligante- SN-38 (VII) é convertido no amino-ligante-SN-38 (VIII) por redução da azida. Esta redução pode ser realizada por uma série de meios, incluindo a catalítica na presença de um catalisador metálico tal como paládio ou platina; redução de Staudinger utilizando uma fosfina, tal como uma trialquilfosfina ou triarilfosfina; ou redução de índio, na presença de um silano. Quando trialquilfosfinas significativamente básicas, tais como trimetilfosfina são utilizadas, o ácido é adicionado suficiente para moderar a basicidade da reação e, assim, evitar a clivagem prematura do agente de ligação de beta-eliminação. Numa modalidade preferida, o ácido trimetilfosfina-acético em THF/água é utilizado para converter (VII) para (VIII).

[039] A amina-ligante-SN-38 (VIII) é ligado a um PEG ativado para proporcionar o conjugado (I) tal como ilustrado na Figura 4. Os PEGs apropriadamente ativados têm cadeias poliméricas terminadas por um grupo funcional reativo com amina, tal como um éster de N- hidróxissuccinimida (NHS), um éster pentahalofenil, ou um éster de nitrofenila para produzir conjugados de fórmula (I) em que X está ausente, e um carbonato de N-hidróxi- succinimidila, carbonato de pentahalofenila, ou carbonato de nitrofenila para produzir conjugados de fórmula (I) em que X é O. Alternativamente, um PEG, em que as cadeias de polímero são terminadas com um ácido carboxílico pode ser utilizado na presença de um agente de acoplamento peptídico tal como uma carbodiimida como DCC ou EDCI ou um reagente de fosfônio como BOP ou PyBOP, ou reagente de urônio como HATU ou HBTU. O acoplamento é realizado em condições anidras ou aquosas, de um modo preferido anidro num solvente adequado tal como acetonitrila, THF, DMF ou diclorometano. Numa modalidade preferida, um PEG ativado possuindo as cadeias de polímeros terminadas com um éster NHS é usado solvente em THF a temperaturas entre 0 e 25 °C.

[040] Os conjugados resultantes podem ser purificados utilizando métodos conhecidos na arte. Por exemplo, o conjugado pode ser precipitado a partir da mistura de reação por adição de um solvente etéreo tal como éter etílico ou éter metil terc-butílico (MTBE). O conjugado pode também ser purificado por diálise ou por cromatografia de exclusão de tamanho.

[041] Num terceiro aspecto, a invenção proporciona métodos para a liberação lenta de SN-38 utilizando conjugados de fórmula (I). Numa modalidade, a meia-vida para a liberação de SN-38 a partir do conjugado é entre 100 e 1000 horas, de preferência entre 300 e 500 horas, e mais preferivelmente cerca de 400 horas.

[042] Numa outra modalidade da invenção, um método para proporcionar a exposição contínua, de baixa dose para SN-38 a um paciente em necessidade de tal exposição, compreendendo a administração ao paciente de um conjugado da invenção é fornecido. Numa modalidade mais específica, um método em que a concentração de SN-38 livre é mantida entre 15 e 5 nM, entre as administrações uma vez por semana, é fornecido.

[043] Numa outra modalidade da invenção, um método para controlar a proporção de Cmax/Cmin de SN-38 observada entre as administrações de um conjugado é fornecido. A proporção de Cmax/Cmin resultante é inferior ou igual a 10, entre as administrações semanais, uma vez mais preferencialmente inferior ou igual a 5, e mais preferencialmente cerca de 2,5.

[044] Como se mostra na Figura 6, o conjugado de fórmula (II) em que PEG é um polietilenoglicol de 4 ramificações (núcleo pentaeritritol) de peso molecular médio de 40.000 [isto é, fórmula (I) em que q = 4; X é CH2; R1 é CN; Y = CONEt2, o PEG é um poli(etilenoglicol) de 4 ramificações de peso molecular médio de 40.000; e L é (CH2)S] quando colocado em tampão de pH 9,4 a 37 °C, SN-38 liberado livre num processo de primeira ordem com uma meia- vida de 4,5 horas. Demonstrou-se que os ligantes de eliminação beta aqui utilizados mostram uma dependência da taxa de liberação de primeira ordem do pH, de tal modo que a meia-vida correspondente para a liberação a um pH fisiológico (7,4) pode ser calculada como sendo de 450 horas.

[045] Como se mostra na Figura 7, quando o mesmo conjugado foi administrado a ratos por injeção intravenosa, SN-38 livre foi libertado e seguiu uma concentração versus perfil de tempo paralela à do conjugado, com uma meia-vida terminal de cerca de 51 h. Isto compara-se com a administração intravenosa direta de SN-38, que mostra uma meia-vida terminal de entre 7 e 34 minutos em ratos (Atsumi, et al, “Pharmacokinetics of SN-38 [(+)-(4S)- 4 , l l-diethyl-4,9-dihydroxy-lH-pyrano[3',4':6,7]- indolizino[l,2-b]quinoline-3,14(4H,12H)-dione], an active metabolite of irinotecan, after a single intravenous dosing of 14C-SN-38 to rats,” Biol. Pharm. Bull. (1995) 18: 11141119; Kato, et al., “Panipenem Does Not Alter the Pharmacokinetics of the Active Metabolite of Irinotecan SN- 38 and Inactive Metabolite SN-38 Glucuronide (SN-38G) in Rats,” Anticancer Res. (2011) 31:2915-2922). Assim, os conjugados da presente invenção prolongam significativamente a meia-vida in vivo de SN-38.

[046] Os níveis e a meia-vida terminal observada de um fármaco liberado a partir de um conjugado são o resultado da combinação dos parâmetros farmacocinéticos do conjugado e do fármaco, com a meia-vida terminal sendo a soma da eliminação do conjugado e as taxas de liberação do fármaco em um modelo simples de um compartimento (Santi, et al., “Predictable and Tunable Half-life Extension of Therapeutic Agents by Controlled Chemical Release from Macromolecular Conjugates,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2012) 109:62116216). A fim de determinar estes parâmetros, os dados foram analisados utilizando um modelo farmacocinético em que o conjugado é distribuído entre dois compartimentos e pode liberar SN-38 livre, antes de ser apagado. Para estabelecer a taxa de depuração do próprio conjugado (kel), o conjugado estável análogo (fórmula (II) em que CH2CN está ausente) foi administrado intravenosa a ratos e os parâmetros farmacocinéticos foram obtidos utilizando um modelo de dois compartimentos.

[047] Como se mostra na Figura 7, a concentração versus dados de tempo são consistentes com o conjugado (II), liberando SN-38 livre in vivo com uma meia-vida de cerca de 400 h. Depois de uma injeção única de conjugado (II) em ratos com doses de 200 mg/kg (que compreende de 7 mg/kg de SN-38), os níveis plasmáticos de SN-38 foram observados para abranger 210-20 nM durante 7 dias (ou seja, Cmax/Cmin = 10). A meia-vida terminal do conjugado e, correspondentemente, o SN-38 livre é limitado pela taxa de eliminação relativamente rápida do conjugado no rato. A taxa de eliminação de um conjugado de PEG é dependente da espécie devido a taxas diferenciais de filtração renal, com a meia-vida terminal de 40.000 Da (6, 64x10-20 g) PEG sendo de aproximadamente 12 horas no camundongo, 24-48 h em ratos, e 72-120 h em humanos. Além disso, é normalmente o caso em que as taxas de eliminação de fármacos são mais lentas em pacientes humanos do que em ratos (ver, por exemplo, Caldwell, et al., “Allometric scaling of pharmacokinetic parameters in drug discovery: can human CL, Vss and tl/2 be predicted from in-vivo rat data?,” Eur J Drug Metab Pharmacokinet. (2004) 29: 133- 143) . Assim, é esperado que a meia-vida terminal de SN-38 liberado a partir de um conjugado de fórmula geral (I) deverá ser substancialmente superior em humanos do que em roedores, embora seja esperado que a taxa de liberação do fármaco a partir do conjugado a ser relativamente independente da espécie devido à consistência dos valores de pH do sangue. Enquanto os parâmetros reais farmacocinéticos para os conjugados da invenção e de SN-38 livre em pacientes humanos são desconhecidos, a estimação desses valores usando escala alométrica fornece uma estimativa de Cmax/Cmin ~ 2,5 em pacientes humanos, como descrito abaixo no Exemplo 5. A infusão prolongada do pró-fármaco SN-38 irinotecano em pacientes humanos indicou que a eficácia máxima pode ser obtida se os níveis plasmáticos de SN-38 são mantidos entre cerca de 5 e 15 nM para períodos prolongados. Os dados farmacocinéticos do rato prevê, assim, que os conjugados da presente invenção permitem a liberação de níveis contínuos baixos, eficazes de SN-38.

[048] Surpreendentemente, os níveis de SN-38G observados após o tratamento de ratos com o conjugado de fórmula (II) eram extremamente baixos, com SN-36G/SN-38 <0,1 em Cmáx. Isto contrasta com o tratamento com conjugados de irinotecano ligados a éster (SN-38G/SN-38 ~15 em Cmax;. Eldon, et al. , “Population Pharmacokinetics of NKTR- 102, a Topoisomerase Inhibitor-Polymer Conjugate in Patients With Advanced Solid Tumors,” American Society of Clinical Oncology Poster 8E (2011)), ou com conjugados SN- 38 ligados a éster (SN-38G/SN-38 ~1 a Cmax; Patnaik, et al, “EZN-2208, a novel anticancer agent, in patients with advanced malignancies: a Phase 1 dose-escalation study,” American Association for Cancer Research Poster C221(2009)). Assim, parece que o SN-38 é menos eficaz glucoronisado quando liberado muito lentamente. De acordo com esta hipótese, quando um conjugado com R1 = PhSO2 foi examinado em ratos, a liberação mais rápida de SN-38 (ti/2 = 10 h), foi observada como esperado, concomitante com níveis iniciais elevados de SN-38 livre e um SN-38G/SN-38 = 0,2 maior em Cmáx.

[049] Assim, num quarto aspecto, a invenção proporciona métodos para minimizar a quantidade de glucoronídeo SN-38 formado quando da administração de SN-38 por controle da taxa de liberação de SN-38 a partir de um conjugado. Em uma modalidade da invenção, um método para minimizar a quantidade de SN-38 glucoronídeo formado quando a administração de SN-38 é proporcionada, em que um conjugado caraterizado por uma meia-vida para liberação de SN- 38 maior do que 100 horas é fornecido. Numa modalidade mais específica, a meia-vida para liberação de SN-38 é entre 100 e 1000 horas. Numa modalidade preferida, a meia-vida para liberação de SN-38 está entre 300 e 500 horas. Numa modalidade ainda mais preferida, a meia-vida para a liberação de SN-38 é de aproximadamente 400 horas.

[050] Os conjugados da invenção podem ser formulados usando uma variedade de excipientes farmaceuticamente aceitáveis conhecidos na técnica, e são convenientemente formulados em tampão aquoso que tem um pH ótimo para a estabilidade do conjugado. Em uma modalidade da invenção, os conjugados são formulados em tampão aquoso a um valor de pH entre 4 e 6. Verificou-se, inesperadamente, que os conjugados de fórmula (I) são significativamente mais solúveis em tampão aquoso do que os conjugados relacionados revelados em WO2011/140393 (ver Exemplo 2 abaixo), permitindo assim um maior intervalo de dosagem a pacientes em necessidade de terapia com estes compostos.

[051] Os conjugados da invenção encontram utilidade em qualquer situação em que SN-38 ou um pró-fármaco de SN-38, por exemplo, irinotecano, têm utilidade. Atualmente, o irinotecano é utilizado no tratamento de vários cânceres, incluindo cânceres leucemia, linfoma, colo-retal, do pulmão, do ovário, cervical, do pâncreas, do estômago, e da mama, e é, portanto, previsto que os conjugados da presente invenção podem ser utilizados de forma semelhante.

[052] Numa modalidade alternativa ilustrada no Exemplo 6, uma formulação de SN-38 proporciona uma forma solubilizada quando os excipientes incluem PEG e DMSO. Isto é particularmente útil para infusão contínua, por exemplo. A proporção de PEG para DMSO varia de 90:10 - 10:90, mas também pode ser 75:25, 25:75 ou 50:50 ou valores intermediários destes. Os componentes de PEG úteis variam de cerca de PEG100(100)-PEG(600).

[053] Salvo indicação ao contrário, todas as referências são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

EXEMPLO

[054] Geral: HPLC foi realizada usando um sistema HPLC Shimadzu, com um detector de matriz de diodos. A fase inversa utilizou uma coluna Phenomenex® Jupiter 5 um 300A 4,6x150 mm termostatizada a 40 °C, com um gradiente de 20100% de acetonitrila em água contendo 0,1% de TFA a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. HPLC de exclusão de tamanho utilizou uma coluna Phenomenex® BioSep™ S-2000 correndo a 50:50 de acetonitrila/água/TFA a 0,1% a 40 °C. Soluções contendo SN-38 foram quantificadas por absorbância de UV a 363 nm, em acetonitrila utilizando e = 22.500 M-1 cm-1. SN- 38 foi adquirido a partir de Haorui (China). Preparação A 6-azido-l-hexanol

[055] Uma mistura de 6-cloro-1-hexanol (50,0 g, 366 mmol) e azida de sódio (65,0 g, 1.000 mmol) em 400 mL de água foi aquecida a um refluxo suave durante 19 h. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura foi extraída com 3x com 200 mL de EtOAc. O extrato foi lavado 1x com 100 mL de água, 1x com 100 mL de sat. aq. de NaCl, em seguida, seco sobre MgSO4, filtrado, e evaporado para produzir 44,9 g (86%) de um óleo incolor.1H-RMN (400 MHz, CDCla ): δ 3,66 (2H, H, br, J = 6 Hz) , 3,27 (2H, t, J = 7,2 Hz), 1,55-1,66 (m, 4H), 1,38-1,44 (m, 2H). Preparação B 6-azidohexanal

[056] O ácido tricloroisocianúrico (12,2 g, 52,5 mmol) foi adicionado a uma solução vigorosamente agitada de 6- azido-l-hexanol (7,2 g, 50,0 mmol) em 100 mL de diclorometano arrefecido em gelo. Uma solução de TEMPO (0, 080 g, 0,51 mmol) em 2 mL de diclorometano foi adicionada gota a gota à suspensão resultante. Depois de 10 min a 4 °C, a suspensão foi deixada a aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante um adicional de 30 min. A análise por TLC (30% EtOAc/hexano) indicou reação completa. A suspensão foi filtrada através de 1 cm de Celite usando diclorometano. O filtrado foi lavado 2x100 mL de 1 M de Na2CO3 , 1x com 100 mL de água, 1x com 100 mL de HCl 1 N e 1x com 100 mL de solução sat. aq. de NaCl, em seguida, seco sobre MgSO4 , filtrado, e evaporado para produzir 9,8 g de um óleo alaranjado. Este foi dissolvido num pequeno volume de diclorometano e cromatografado sobre SiO2 (80 g) utilizando um gradiente de 0 - 20% de EtOAc/hexanos para proporcionar 6,67 g (47,3 mmol; 95%) do aldeído sob a forma de um óleo incolor. 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): δ 9,78 (1H, t, J = 1,6 Hz), 3,29 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,47 (2H, dt, J = 1,6, 7,6 Hz), 1,59-1,71 (m, 4H), 1,38-1,46 (m, 2H). Preparação C 7-azido-1-ciano-2-heptanol

[057] Uma solução 1,6 M de n-butil-lítio em hexano (35 mL, 49 mmol) foi adicionada a 100 mL de THF anidro sob atmosfera de N2 a -78 °C. Acetonitrila (3,14 mL, 60 mmol) foi adicionada numa corrente rápida, com agitação vigorosa, resultando na formação de uma suspensão branca. Após 15 min, a suspensão foi deixada a aquecer até -20 °C por mais de 1 h. Após arrefecimento de novo a -78 °C, 6-azidohexanal (6,67 g, 47 mmol) foi adicionada resultando numa solução amarela. Esta foi agitada durante um adicional de 15 min, em seguida deixada aquecer até -20 °C e extinguiu-se por adição de 20 mL de solução sat. aq. de NH4Cl. Após diluição com EtOAc, a mistura foi lavada sequencialmente com água, HCl 1 N, água, e NaCl at. aq., em seguida, seca sobre MgSO4 , filtrada, e evaporada para produzir 8,0 g de um óleo amarelo. Este foi dissolvido num pequeno volume de diclorometano e cromatografado sobre SiO2 (80 g) utilizando um gradiente de 0-40% de EtOAc/hexanos para fornecer 6,0 g (21,6 mmol; 84%) do produto como um óleo incolor. 1H-RMN (400 MHz, de-DMSO): δ 5,18 (1H, d, J = 5 Hz), 3,69 (1H, m), 3,32 (2H, t, J = 6 Hz), 2,60 (1H, dd , J = 4,8, 16,4 Hz), 2,51 (1H, dd, J = 6,4, 16,4 Hz), 1,55 (2H, m) , 1,42 (2H, m), 1,30 (4H, m). Preparação D N,N-dietil-4-ni trobenzamida

[058] Uma solução de cloreto de 4-nitrobenzoíla (18,6 g, 100 mmol) em 100 mL de acetonitrila foi adicionada gota a gota ao longo de 30 min a uma solução agitada arrefecida em gelo de dietilamina (15,5 mL, 150 mmol) e hidróxido de sódio (6,0 g, 150 mmol) em 150 mL de água. Depois de completada a adição, a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante um adicional de 1 h. A mistura foi extraída 3x com 100 mL de CH2Cl2, e o extrato combinado foi lavado 1x com 100 mL de água, 1x com 100 mL de HCl 1 N, e salmoura. Após secagem sobre MgSO4, a mistura foi filtrada e evaporada até à secura para dar uma massa cristalina. A recristalização a partir de 80/20 hexano/acetato de etila proporcionou 20,0 g do produto como cristais amarelo pálido (90%) . 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) : δ 8,27 (2H, m), 7,54 (2H, m), 3,57 (2H, br q, J = 6,8 Hz), 3,21 2H, br q, J = 6,8 Hz) , 1,27 (3H, br t, J = 6,8 Hz), 1,12 (3H, br t, J = 6,8 Hz). Preparação E 4-(N,N-dietilcarboxamido)anilina

[059] O formiato de amônio (20,0 g, 317 mmol) foi adicionado a uma mistura vigorosamente agitada de N,N- dietil 4-nitrobenzamida (20,0 g, 90 mmol) e 1,0 g de 10% de paládio/carvão em 400 mL de metanol arrefecido no gelo. A reação aquece com evolução vigorosa de gás. Após 1 h, TLC (60/40 hexano/EtOAc) indicou uma conversão completa do material de partida. A mistura foi filtrada através de uma almofada de Celite e evaporou-se para proporcionar um sólido cristalino. Este foi suspenso em água e recolhido por filtração sob vácuo. O produto foi recristalizado a partir de água e secou-se para proporcionar 14,14 g (83%) de cristais brancos. 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) : δ 7,22 (2H, m), 6,65 (2H, m), 3,81 (2H, br s), 3,42 (4H, br s), 1,17 (6H, t, J = 6,8 Hz). Preparação F 1-ciano-7-azido-2-heptil-4-(N,N- dietilcarboxamido)fenilcarbamato

[060] Piridina (4,0 mL, 50 mmol) foi adicionada gota a gota sob a atmosfera inerte a uma solução agitada de l- ciano-7-azido-2-heptanol (4,60 g, 25 mmol) e trifosgênio (12,5 g, 42 mmol) em 200 mL de THF anidro arrefecido em gelo. A suspensão branca foi agitada durante 15 min em gelo, em seguida, deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante mais 30 min. A análise por TLC (60:40 de hexano/acetato de etila) indicou conversão completa do material de partida com um produto Rf elevado. A suspensão foi filtrada e evaporada, e o resíduo foi retomado em 100 mL de éter seco, filtrado e evaporado para dar o cloroformato em bruto (4,54 g, 74%) como um óleo castanho. Adicionou-se trietilamina (3,5 mL, 25 mmol) a uma solução do cloroformato (18,6 mmol) e 4-(N,N- dietilcarboxamido)anilina (3,85 g, 20 mmol) em 100 mL de CH2Cl2 seco. Depois de se agitar durante 1 hora, a mistura foi lavada 2x com HCl 1 N, 2x com água, 1x com salmoura e, em seguida, seca sobre MgSO4 , filtrada, e evaporada até um óleo que cristalizou em repouso. A massa cristalina foi lavada com 60/40 hexano/acetato de etila. As lavagens foram concentradas e cromatografadas sobre gel de sílica utilizando um gradiente de 0-80% de acetato de etila/hexano. As frações de produto foram concentradas e combinadas com o material cristalino inicial. O produto combinado foi recristalizado a partir de 1:1 de acetato de etila/hexano para se obter o carbamato como um sólido branco cristalino (4,4 g, 44% para 2 etapas). 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): δ 7,45-7,35 (4H, m), 6, 888 (1H, s largo), 5, 000 (1H, m), 3,52 (4H, lg), 3,288 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,841 (1H, dd, J = 5,2, 17 Hz), 2,327 (1H, dd, J = 4,4, 17 Hz), 1,88 (1H, m), 1,75 (1H, m), 1,63 (2H, m), 1,45 (4H, m) , 1,18 (6H, br) . Preparação G N-(clorometil)carbamato

[061] Uma suspensão de 7-azido-1-ciano-2-hexil N- (clorometil)-4-(N,N-dietilcarboxamido)-fenilcarbamato (2,00 g, 5,0 mmol), paraformaldeído (225 mg, 5,5 mmol, 1,5 eq), clorotrimetilsilano (2,5 mL, 20,0 mmol, 4,0 eq), e 25 mL de tolueno anidro foi colocada sob atmosfera de N2 num RBF de 50 mL equipado com uma barra de agitação magnética e fechada com uma tampa de borracha do septo. O frasco selado foi aquecido num banho de óleo a 50 °C durante 24 h, até o momento em que uma solução amarela clara foi obtida. A solução foi arrefecida até à temperatura ambiente e evaporada. O resíduo foi redissolvido em 10 mL de tolueno anidro, filtrado e evaporado para proporcionar o N- (clorometil)-carbamato cru como um óleo amarelo instável contendo tolueno residual (2,68 g, 119% do previsto). Este material foi dissolvido em 10 mL de THF anidro e armazenado sob atmosfera de N2. A formação de N-(clorometil)carbamato foi confirmada pela adição de 5 μL a 1,0 mL de 4 mM N,N- diisopropiletilamina em etanol, seguido por análise de HPLC de fase reversa (Phenomenex Jupiter 300A 4,6x150 mm C18; 1,0 mL/min; gradiente de 20-100% de CH3CN/H2O/0,1% de TFA ao longo de 10 min). O carbamato de início elui aos 8,42 minutos e mostra Àmax de 243 nm; o produto N-(etoximetil)- carbamato elui a 8,52 min e mostra Àmax de 231 nm; uma impureza desconhecida elui a 8,04 min e mostra Àmax de 245 nm. A integração dos picos a 240 nm, indicou cerca de 89% de N-(etoximetil)carbamato.1H-RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,39 (4H, m), 5,54 (1H, d, J = 12 Hz), 5,48 (1H, d, J = 12 Hz), 4,99 (1H, m), 3,51 (4H, br), 3,26 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,79 (1H, m), 2,63 (1H, m), 1,85 (1H, m), 1,73 (1H, m), 1,60 (2H , m), 1,43 (4H, m), 1,16 (6H, br). Preparação H Azido-ligante-SN-38

Formula química; C43H4BNBOB Pese mutecular. 804.93

[062] SN-38 (1,00 g, 2,55 mmol; Haorui) foi suspenso em 10 mL de piridina anidra, e, em seguida, concentrado até à secura sob vácuo (temperatura do banho 50 °C) . Isto foi repetido com 10 mL de THF anidro. O sólido amarelo claro resultante foi dissolvido em 50 mL de THF anidro e 50 mL de DMF anidro sob atmosfera de N2amarela, e, em seguida, arrefecido em gelo. Uma solução de 1,0 M de terc-butóxido de potássio em THF (2,55 mL, 2,55 mmol) foi adicionada formando uma cor verde escura inicial que mudou para uma suspensão cor de laranja espessa. Após 15 min, uma solução de THF de N-(clorometil)-carbamato (7,5 mL, 2,8 mmol) foi adicionada. Depois de 15 min a 4 °C, a mistura cor de laranja clara foi deixada a aquecer até à temperatura ambiente. Após 1 h, a análise por HPLC (5 μL de amostra + 1 mL de acetonitrila/0,1% de TFA) indicou 86/14 de produto/SN-38. A mistura amarela pálida foi diluída com 200 mL de acetato de etila, lavado 2x com 100 mL de água, 100 mL de solução sat. aq. de NaCl, seca sobre MgSO4, filtrada, e evaporada. O excesso de DMF foi removido por trituração do resíduo oleoso com água, e o resíduo foi dissolvido em 50 mL de acetonitrila, filtrado e evaporado para se obter 2,96 g de vidro amarelo. O resíduo foi cromatografado em SiO2 (80 g) utilizando um gradiente de etapa de 200 mL de cada um de hexano, 20%, 40%, 60%, 80%, e 100% de acetona em hexano, proporcionando o azido-ligante-SN-38 purificado (1,66 g, 81%) . Este material foi dissolvido em 50 mL de acetona, e 45 mL de ácido acético 0,1% em água foi adicionado gota a gota com agitação até a mistura se tornar turva. Após agitação, um material sólido foi separado. Um adicional de 5 mL de ácido acético a 0,1% em água foi então adicionado para completar a precipitação. Depois de se agitar durante 2 h, o sólido foi recolhido por filtração sob vácuo, lavado com água, e seco para proporcionar 1,44 g (70%) de um pó amarelo pálido. 1H-RMN (400 MHz, CDCla) : δ 8,15 (1H, d, J = 9,2 Hz), 7,60 (1H, s), 7,48 (1H, dd, J = 2,9 Hz), 7,40 (4H, m ), 7,25 (1H, d, J = 2), 5,75 (2H, br), 5,73 (1H, d, J = 16 Hz), 5,28 (1H, d, J = 16 Hz), 5,22 (2H, s) , 4,99 (1H, m), 3,84 (1H, s), 3,53 (2H, br) , 3,53 (2H, br), 3,17 (2H, t, J = 7 Hz), 3,12 (2H, q, J = 7 Hz), 2,74 (1H, dd, J = 1, 17 Hz), 2,54 (1H, dd, J = 5, 17), 1,86 (2H, m), 1,6 (1H, m), 1,46 (1H, m) , 1,37 (3H, t, J = 7 Hz), 1,25 (6 H, m), 1,12 (4H, m), 1,02 (3H, t, J = 7,3 Hz). LC- MS: [M+H]+ = 805, 3 (calculado para C44H51N8O8 = 805, 3). Exemplo 1 Sal de acetato de amino-ligante-SN-38

[063] Uma solução 1 M de trimetilfosfina em THF (2,9 mL, 2,9 mmol) foi adicionada a uma solução do azido- ligante-SN-38 (1,13 g, 1,4 mmol) e ácido acético (0,19 mL, 3,3 mmol) em 10 mL de THF. Gás foi lentamente expandido. Depois de se agitar durante 2 h, foi adicionada água (1,0 mL) e a mistura foi agitada durante um adicional de 1 h. O resíduo foi repartido entre éter e água. A fase aquosa foi lavada uma vez com acetato de etila, e a fase aquosa amarela clara resultante foi evaporada para fornecer 800 mg de espuma amarela. Isto foi dissolvida em THF, filtrado, e quantificado por absorvência de UV para proporcionar uma solução contendo 1,2 μmol (86%) de produto. C18 de HPLC mostrou um único pico, e LC-MS mostrou [M+H] + = 779,3 (esperado 779,4). Exemplo 2 Conjugado SN-38 com o Composto (III), em que m = l e n ~225

[064] Uma mistura de 40 kDa (6, 64x10-20 g) de 4-membros tetra-(succinimidil-carboximetil)-PEG (jenkem Tecnologia; 10,0 g, 1,0 mmol HSE), o sal de acetato de amino-ligante- SN-38 do Exemplo 1 (1,2 mmol), e N,N-diisopropiletilamina (0,21 mL, 1,2 mmol) em 75 mL de THF foi mantido à temperatura ambiente. O progresso de acoplamento foi monitorado por HPLC, o que indicou a conclusão da reação por 90 minutos. Após um total de 2 h, a mistura foi filtrada em 500 mL de MTBE agitado. O precipitado foi recolhido por filtração sob vácuo, lavado com MTBE, e seco sob vácuo, para proporcionar o conjugado como um sólido ceroso amarelo pálido (10,1 g, 95%). A análise espectrofotométrica de uma amostra de 2,0 mg em 1,0 mL de água indicou 0,17 mM de SN-38; com base no SN-38 de 0,175 mM calculado esperado em peso, isto indica um carregamento de conjugado de 96%. A análise de C18-HPLC indicou um único pico maior (98% da área total do pico a 363 nm; 97% a 256 nm), com 0,6 mol% do SN-38 livre.

[065] Este conjugado era solúvel a 1,9 mM (85 mg/mL) em tampão de acetato de sódio 10 mM, pH 5,0. Em contraste, o conjugado correspondente, em que o azido-ligante-SN-38 da Preparação H tinha sido ligado a PEG40KD- (DBCO) 4 através de uma ligação triazol (WO2011/140393) era solúvel a apenas 0,7 mM (32 mg/mL). A solubilidade do conjugado do exemplo 2 foi também testada a pH 4 e pH 5 em 0,2 N de tampão de acetato a pH 6, pH 7 e pH 8 em tampão de fosfato de 0,2 N. A solubilidade foi encontrada para ser > 300 mg/mL, em todos estes valores de pH. O pH, no entanto, foi ligeiramente modificado quando o conjugado foi dissolvido e, em geral aumentado em relação ao valor inicial. Assim, quando 300 mg/mL do conjugado foi dissolvido em solução tampão de pH 4, o pH tornou-se 4,5; em tampão de pH 5, o pH transformou-se em 5,4; em tampão de pH 6, o pH tornou-se 6.2; em tampão de pH 7, o pH tornou-se 7,2 e em tampão de pH 8, o pH tornou-se de 7,7.

[066] A estabilidade também foi testada quando 10 mg/mL do conjugado foi dissolvido à temperatura ambiente em tampões de pH 47 a pH 8 e em água e mantido a temperatura ambiente durante sete dias. A pureza do conjugado nos vários tampões foi determinada por HPLC.

[067] Normalmente, a pureza no dia 0 foi medida a um nível ligeiramente inferior a 100%, normalmente em torno de 97%. Havia pouca ou nenhuma alteração na pureza medida ao longo de sete dias, em qualquer pH testado em água.

Exemplo 3 Cinética de Liberação In vitro

[068] Uma solução do conjugado do Exemplo 2 em borato de sódio 0,1 M, pH 9,4, foi mantida numa cuveta de UV selada a 37 °C. O aumento da absorbância a 414 nm devido à formação de SN-38 fenóxido livre foi monitorado com o tempo. Montagem dos dados para um único exponencial Amax* (1 - e-kt) forneceu a constante de velocidade para a liberação de SN-38, K, a partir do conjugado a um pH de 9,4, em que Amax representa a absorbância a reação completa, como mostrado. Na Figura 6, a formação de SN-38 livre seguiu a cinética de primeira ordem com k = 0, 00257 min-1 (t1/2 = 270 min) a um pH de 9,4. Como a taxa de liberação destes ligantes é conhecida por ser de primeira ordem em hidróxido, a taxa de liberação em outros valores de pH pode ser calculada como k(pH) = kg,4 * 10(pH - 9,4). Assim, a taxa de SN-38, a pH 7,4 é calculada como sendo de 2,57 x 105 min-1 , ou t1/2 = 450 h a pH 7,4, 37 °C.

Exemplo 4 Farmacocinética in vivo

[069] Uma solução de 45 mg/mL do conjugado do Exemplo 2 em tampão acetato de sódio 10 mM, pH 5,0, foi esterilizada por filtração e injetada em ratas fêmeas canulada Sprague- Dawley (n = 3) a 200 mg/kg, e o sangue as amostras (0,3 mL) foi tirado periodicamente e imediatamente adicionado a 30 uL de uma solução de 1 M de citrato/0,1% de solução de F68 Pluronic®, pH 4,5 para reduzir o pH da amostra, coagular, e estabilizar o conjugado que permanece intacto. As amostras foram centrifugadas a aproximadamente 1500 x g (força) durante 10 minutos a 2-8 °C para remover os glóbulos vermelhos e obter-se ~150 μL de plasma. O plasma foi dividido em 2 alíquotas e transferido para frascos criogênicos e armazenado num congelador a -80 °C antes da análise.

[070] Para a análise, as amostras foram descongeladas em gelo e misturadas com 2 volumes de acetonitrila/0,5% de ácido acético contendo 8 ng/mL de camptotecina como padrão interno. A proteína precipitada foi removida por centrifugação a 16000 x g durante 10 min a 4 °C. Os sobrenadantes das amostras (20 μL) foram analisados utilizando uma coluna de C18 HPLC Phenomenex® Júpiter 300A 5 um 150 x 4,6 mm com o termostato a 40 °C, utilizando um gradiente de fosfato de sódio 100 mM, 3 mM de sulfonato de heptano, pH 4,0 (Tampão A) e 75% de acetonitrila em água (tampão B) a 1,0 mL/min. O gradiente consistiu em 5% de B isocrático durante 3 min, 20% de B isocrático durante 3 min, gradiente linear de 20-40% de B ao longo de 5 min, gradiente linear de 40-100% de B ao longo de 2 min, 100% de B isocrático durante 3 min, 5% de B isocrático durante 3 min. A eluição da amostra foi seguida com um detector de conjunto diodo e um detector de fluorescência com excitação configurada a 370 nm e a emissão a 470 nm definida pelos primeiros 9 min, seguido por emissão a 534 nm para os 10 min finais. As concentrações foram calculadas por comparação das áreas dos picos para as curvas padrão do conjugado (absorbância de 380 nm), e SN-38 (fluorescência Ex: 370 nm; Em: 534 nm) . Foram observados os seguintes tempos de retenção: SN-38, 12,7 min; camptotecina, 13,2 min; e conjugado, 14,5 min. Os limites inferiores de quantificação foram determinados a uma altura de pico de 10 vezes a razão sinal-ruído através da detecção de fluorescência para ser SN-38: 0,07 pmol em 20 de injeção de plasma tratado com acetonitrila (3,3 nM em plasma tratado com acetonitrila, 10 nM na amostra de plasma inicial). Conjugado: 2,1 pmoles de conjugado (8,4 pmoles de SN-38) em injeção de 20 μL de plasma tratado com acetonitrila (100 nM do conjugado; 400 nM de SN-38) em plasma tratado com acetonitrila, 300 nM (1200 nM de SN-38) em amostras de plasma inicial.

[071] Para obter informações sobre a depuração do conjugado intacto a partir do plasma, uma experiência semelhante foi realizada utilizando o conjugado de análogo estável (fórmula (II) em que CH2CN está ausente) a 22 mg/kg.

[072] Os níveis de SN-38 glucuronídeo foram determinados de acordo com o método de Poujol, et al., “Sensitive HPLC-Fluorescence Method for Irinotecan and Four Major Metabolites in Human Plasma and Saliva: Application to Pharmacokinetics Studies,” Clinical Chemistry (2003 ) 49: 1900-1908.

Exemplo 5 Modelagem farmacocinética

[073] A concentração plasmática versus dados de tempo para o conjugado foi analisada usando um modelo de duas fases em que C(t) = A*exp(-αt) + B*exp(-βt) em que A + B = dose/Vd. Os dados foram ajustados por análise de regressão não-linear (Nelder-Mead downhill simplex) , em seguida, os parâmetros foram deconvoluídos de acordo com os procedimentos estabelecidos para fornecer estimativas para as taxas de transferência entre os compartimentos (ki2 e k21) e a taxa de eliminação conjugado a partir do compartimento central (kel) . Análise dos dados para o conjugado do Exemplo 2 e o conjugado estável correspondente (em que o CH2CN é substituído por H) produziu os dados na Tabela 1.

Tabela 1

[074] Usando estes parâmetros, os dados da concentração de SN-38 livres foram em seguida, ajustados com base em um modelo em que o conjugado libera SN-38 livre com uma taxa de K1 constante e equilibra-se com um segundo compartimento com Kdist = Vd/Vc. Curvas de modelo foram geradas por integração numérica, utilizando as seguintes equações diferenciais:

[075] Onde [CC] e [CP] são as concentrações de SN-38 conjugado nos compartimentos centrais e periféricos, respectivamente, [DC] é a concentração de SN-38 livre no compartimento central, e as constantes de taxa são conforme descritas acima; kcl é a constante de velocidade de eliminação de SN-38 livre a partir do plasma, e foi deixada a variar dentro do intervalo descrito para este parâmetro (1,4-3,5 h-1). A integração numérica foi realizada ao longo de 1000 etapas para um intervalo de tempo de 120 h (Δt = 0,12 h), com as condições iniciais [CC] = Cmáx, [CP] = 0, e [DC] = 0. O volume de distribuição Vd para SN-38 foi fixado ao valor relatado de 0,18 L/kg, enquanto que VC foi definido como Vd para o conjugado.

[076] Usando este método, a concentração versus dados de tempo para SN-38 conjugado e SN-38 livre liberado a partir do conjugado foram ajustadas como mostrado na Figura 7. Obteve-se uma boa concordância com os dados experimentais quando Kcl = 2,77 h-1 (t1/2 = 0,25 h) para a eliminação de SN-38 livre a partir do plasma, bem dentro do intervalo referido, e quando k1 foi fixado em 0, 00173 h-1, o valor medido in vitro (t1/2 = 400 h para clivagem de SN-38 a partir do conjugado).

[077] Usando este modelo, o comportamento do conjugado em outras espécies pode ser previsto dado os valores para kel e kcl nessas espécies. No ser humano, os valores para PEG (kel) e eliminação de SN-38 (kd), bem como o volume de distribuição foram relatados, mas podem ser estimados usando escala alométrica para ser de aproximadamente ke1 = 0, 0087 h-1 (t1/2 de 80 h) e kc1 = 0,7 h-1 (t1/2 1 h) e Vss = 0,15 L/kg (Caldwell et al., “Allometric scaling of pharmacokinetic parameters in drug discovery: can human CL, Vss and tl/2 be predicted from in-vivo rat data?,” Eur J Drug Metab Pharmacokinet. (2004) 29: 133-143.) Usando esses valores no modelo farmacocinético fornece faixas de concentração estimadas de SN-38 livre dando Cmáx/Cmin ~2,5.

Exemplo 6 Formulação de SN-38 para infusão contínua

[078] A administração terapêutica de SN-38 tem sido limitada pela baixa solubilidade aquosa deste fármaco (7 mg/L em água, 18 uM). Uma formulação foi desenvolvida para ultrapassar esta limitação. Para determinar a solubilidade do SN-38 em várias formulações, uma solução de 115 mM de SN-38 em sulfóxido de dimetila (DMSO) foi diluída para dar concentrações alvo de 15, 10, 5, e 2 mM em várias formulações (Tabela 2) . Depois de repousar durante 16 h à temperatura ambiente, SN-38 precipitado foi removido por centrifugação a 14.000 rpm durante 30 min. O sobrenadante foi diluído em 1:200 em borato 100 mM, pH 10,0, e a concentração de SN-38 foi determinada espectrofotometricamente a 414 nm utilizando ε414 = 22500 M1 cm-1 . Os resultados são apresentados na Tabela 2. Tabela 2 Porcentagem de Excipientes Por Volume em Formulações

[079] SN-38 nas formulações E e F permaneceu completamente solúvel nas concentrações mais elevadas testadas. Espera-se que, além de polietileno glicóis outros além de PEG300 podem ser utilizados para vantagem semelhante. Além disso, é esperado que estas formulações farmacêuticas possam ser usadas para manter uma exposição contínua a SN-38 a um paciente em necessidade de tal exposição, por administração da formulação farmacêutica, por infusão contínua. Tais infusões contínuas podem ser realizadas por qualquer um dos métodos conhecidos nas artes médicas, por exemplo, por utilização de uma bomba de infusão ou por gotejamento intravenoso.

Claims

1. Conjugado caracterizado pelo fato de ser de fórmula (I)

em que PEG é linear ou ramificado e, quando q é 2-8, é um polietilenoglicol de ramificações múltiplas; X é O, NH, (CH2)m, OC(=O) (CH2U ou NHC(=O) (CH2U em que m = 1-6; L é (CH2)r ou (CH2CH2OMCH2K, em que r = 1-10 e p = 110; R1 é CN ou SO2NR22, em que cada R2 é independentemente alquil, aril, heteroaril, alquilalquenil, alquilaril, ou alquilheteroaril, cada um opcionalmente substituído, ou dois R2 tomados em conjunto podem formar um anel; Y é COR3 ou SO2R3, em que R3 = OH, alcóxi, ou NR42, em que cada R4 é independentemente alquil, alquil substituído, ou dois R4 tomados em conjunto podem formar um anel; e q é 1-8.

2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X é (CH2)m.

3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que PEG é um polietilenoglicol de peso molecular médio de 30.000-50.000 Da.

4. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que q=4.

5. Conjugado, fato de de que acordo q=4 . com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1 = CN.

6. Conjugado, fato de de que acordo R1 = CN. com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que PEG é polietilenoglicol de ramificações múltiplas de peso molecular médio de 30.000 - 50.000 Da; X é CH2; L é (CH2)6; R1 é CN; Y é CONEt2; e q=4 .

7. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que possui a fórmula

em que m = 1-6 e n é 200-250.

8. Conjugado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que m é 1 e n é aproximadamente 225.

9. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

10. Formulação, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o pH da formulação está entre 4,0 e 6,0.

11. Método para a preparação de um conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, o referido método caracterizado por compreender as etapas de: (a) reduzir uma azida-ligante-SN-38 de fórmula (VII)

de modo a produzir um amino-ligante-SN-38; (b) contatar o amino-ligante-SN-38 com um PEG ativado de modo a produzir um conjugado, conforme definido em na reivindicação 1; e (c) opcionalmente, isolar o conjugado.

12. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser para uso em um método de proporcionar a exposição contínua, de baixa dose à SN-38 a um paciente em necessidade de tal exposição, o referido método compreendendo a administração ao paciente do referido conjugado.

13. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicação 12, caracterizado por no referido método a concentração de SN-38 livre ser mantida entre 15 e 5 nM entre administrações uma vez por semana.

14. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicação 12, caracterizado por a Cmax/Cmin observada entre as administrações é menor ou igual a 10 entre as administrações uma vez por semana ou em que a Cmax/Cmin observada entre as administrações é menor ou igual a 5 entre as administrações uma vez por semana.

15. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser para uso em um método de controle do nível de glucuronídeo SN-38 no plasma de um paciente que requer tratamento com SN-38, em que a razão resultante entre SN-38G/SN-38 é inferior a 0,2.

16. Uso do conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser na preparação de uma formulação farmacêutica para proporcionar exposição contínua de baixa dose à SN-38 ou exposição contínua à SN- 38 a um paciente em necessidade de tal exposição.

17. Uso do conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser na preparação de uma formulação farmacêutica para controlar o nível de glucoronídeo SN-38 no plasma de um paciente requerendo tratamento com SB-38, em que a razão resultante SN-38G/SN- 38 é menor do que 0,2.