CN105396141B

CN105396141B - iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用

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Publication number: CN105396141B
Application number: CN201510915139.3A
Authority: CN
Inventors: 王杭祥; 陈建美; 李玲玲; 谢海洋; 周琳; 徐骁; 郑树森
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2018-08-24
Anticipated expiration: 2035-12-10
Also published as: CN105396141A

Abstract

本发明公开了一种iRGD‑抗肿瘤药物偶联物及其制备方法和应用，该偶联物是由抗肿瘤药物通过化学键与iRGD连接而成，结构式如式(I)；其中，X₁为喜树碱类和紫杉醇类抗肿瘤药物前体；L为连接桥。本发明的iRGD‑抗肿瘤药物偶联物在水中具有较好的溶解性，可直接静脉注射或加工成其它剂型；本发明的iRGD‑抗肿瘤药物偶联物具有抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的能力，并能较好的抑制肿瘤细胞的生长，为肿瘤治疗研究提供了新的方案。

Description

iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物领域，具体涉及iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用。

背景技术

化学疗法，简称化疗，是一种利用化学药物治疗肿瘤的手段，和手术、放疗一起，并称为癌症的3大治疗手段，但由于化疗药物没有明显的靶向性，在杀灭癌细胞的同时，也会对正常细胞产生损伤，导致其副作用十分显著。

抗体药物偶联物(antibody-drug conjugates,ADCs)由药物分子、抗体以及两者之间的链接分子3部分组成。由于其良好的靶向性、抗癌活性及较低的系统性毒性，ADC药物成为了肿瘤治疗研究的热点。ADC药物以大分子的抗体作为载体，利用抗体特异性识别肿瘤细胞表面抗原的特性，引导药物到达癌细胞表面，通过胞吞作用后药物进入细胞，并在细胞内低pH值环境或溶酶体蛋白酶的作用下发生化学键的断裂，释放出细胞毒药物，从而达到专一性杀死癌细胞而不损伤正常组织细胞的作用。然而，抗体虽然靶向性强，但由于其相对分子量大，难以有效穿透实体瘤，对肿瘤的治疗效果有限。此外，抗体制备困难，成本昂贵，特异性偶联细胞毒性分子更提高了制备成本。抗体偶联药物后可能导致抗体产生免疫原性使ADC药物的临床应用受到限制。因此利用小分子或者多肽片段作为识别肿瘤细胞表面抗原的分子，同时偶联具有细胞毒性的药物构建类似于ADC结构的小分子药物具有非常显著的临床实用价值。

iRGD是一种具有环状结构的穿膜肽，分子量较小，且具有较高的水溶性，其序列为CRGDK/RGPD/EC，其中的RGD序列具有整合素靶向的功能，能够靶向到整合素表达较高的肿瘤血管及组织，而经过肿瘤附近特定酶切割之后的残基片段，则能够与肿瘤表面的神经菌毛素(NRP-1)相互作用，介导发生细胞膜穿透效应(Sugahara KN,Teesalu T,Karmali PP,Kotamraju VR,Agemy L,Girard OM,et al.Tissue-Penetrating Delivery of Compoundsand Nanoparticles into Tumors.Cancer cell.2009；16:510)。因此，iRGD这种多功能的多肽受到广泛的关注和研究。与直接用紫杉醇纳米粒相比，与iRGD联用后的纳米粒药物到达肿瘤部位的药量提高了12倍(Sugahara KN,Teesalu T,Karmali PP,Kotamraju VR,Agemy L,Greenwald DR,et al.Coadministration of a tumor-penetrating peptideenhances the efficacy of cancer drugs.Science.2010；328:1031)。

喜树碱(CPT)是从中国珙桐科植物喜树中提取出的一种吲哚类生物碱，是一种拓扑异构酶I(Topo I)特异性抑制剂。CPT可抑制由Topo I介导的DNA断裂和重新连接反应，导致细胞周期阻滞和细胞凋亡(Hsiang YH,Hertzberg R,Hecht S,Liu LF.CamptothecinInduces Protein-Linked DNA Breaks Via Mammalian DNA Topoisomerase-I.Journalof Biological Chemistry.1985；260:4873)。喜树碱对许多实体瘤具有较好的抗肿瘤活性，临床上可用于多种癌症的治疗，包括肠癌、肺癌、淋巴癌等。

现已开发上市的喜树碱类药物主要有拓扑替康、伊立替康(CPT-11)、羟基喜树碱等。其中CPT-11在体内代谢产生7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)。SN38的体外抗肿瘤细胞活性是CPT-11的100-1000倍。直接利用SN38分子，可避开CPT-11体内酶解释放SN38效率低(<8％)的问题，有望提高药物的生物利用率和抗肿瘤效果。但是SN38的水溶性很差，使其在临床上的应用受限。

喜树碱和SN38的结构式分别为：

目前，人们开发了一系列喜树碱类药物的衍生物或新剂型来克服其水溶性问题，如通过化学偶联，在SN38的C10位羟基引入水溶性基团，得到水溶性较大的SN38衍生物，但是这些技术只能提高药物的水溶性，并不能改善药物的靶向性差的问题。通过偶联一些具有肿瘤细胞靶向性的水溶性小分子多肽，如iRGD，制备喜树碱类抗癌药物，不仅能够解决药物的溶解性问题，而且能赋予药物对肿瘤细胞的靶向能力，具有良好的市场前景与临床应用价值。

除喜树碱类抗肿瘤药物外，紫杉烷类药物如紫杉醇(paclitaxel,PTX)、多烯紫杉醇(docetaxel,DTX)和卡巴他赛(cabataxel)也是目前临床上使用最广泛的抗肿瘤药物。DTX是从欧洲红豆杉提取到的非细胞毒性前体化合物10-脱酰基浆果赤霉素Ⅱ经半合成得到的，1998年获美国FDA批准上市。多烯紫杉醇对乳腺癌、非小细胞肺癌等癌症具有明显的治疗效果。但由于紫杉烷类药物的水溶性差(约1～10μg/mL)，临床应用受到了极大的影响。

DTX的结构式为：

目前尚未见有将iRGD与喜树碱类、紫杉醇类抗肿瘤药物联用的相关报道。

发明内容

本发明提供了一种iRGD-抗肿瘤药物偶联物，提高了抗肿瘤药物在水中的溶解性，扩大药物的临床应用范围，并有效提高抗肿瘤药物的靶向性及抗肿瘤效果。

本发明还提供了一种iRGD-抗肿瘤药物偶联物的制备方法，该方法步骤简单，可工业化大批量生产。

本发明还提供了一种iRGD-抗肿瘤药物偶联物在制备抗癌药物中的应用。使用本发明的抗癌药物，能够显著提高药物的生物利用度和减小药物对正常组织和细胞产生毒副作用。另一方面，iRGD具有靶向穿透性，可增强药物靶向肿瘤细胞的能力，在临床用药时可望降低对正常细胞的杀伤力。

一种iRGD-抗癌药物偶联物，是由抗肿瘤药物通过化学键与iRGD连接而成，结构式如式(I)：

其中，X₁为喜树碱类和紫杉醇类抗肿瘤药物前体，L为连接桥。

上述技术方案中，所述化学键为可断裂的双硫键。

作为优选，所述抗肿瘤药物前体选自喜树碱类抗肿瘤药物和紫杉醇类抗肿瘤药物。进一步优选为喜树碱、SN38、多烯紫杉醇等。

作为优选，所述连接桥为如下所示结构：

作为优选，所述iRGD-抗癌药物偶联物的结构为式(I-1)～(I-3)所示化合物之一：

采用上述技术方案，iRGD通过双硫键与抗肿瘤药物偶联(I-1)～(I-3)。双硫键在循环系统中稳定，在胞内还原条件下被分解，可直接释放出抗癌药物，显著提高药物的生物利用度，避免药物在非肿瘤部位释放，减小药物对正常组织和细胞产生毒副作用。

本发明还提供了一种上述iRGD-抗癌药物偶联物的制备方法，包括：抗肿瘤药物前体与连接桥化合物反应，然后再与iRGD反应制备得到所述的iRGD-抗癌药物偶联物。

作为优选，所述连接桥化合物为：

对于有竞争反应的抗肿瘤药物前体，可选择适当的保护剂对不需要反应的竞争基团进行保护，作为进一步优选，在抗肿瘤药物前体与连接桥化合物反应前利用保护基先对抗肿瘤药物前体中的特定羟基保护，在与iRGD反应前将保护基脱除。

作为进一步优选，上述制备方法包括：

(1)可选择的，对抗肿瘤药物前体的特定基团进行保护基保护；例如对于7-乙基-10-羟基喜树碱，需要在7-乙基-10-羟基喜树碱的C10位羟基上引入保护基，避免其参与步骤(2)和(3)的反应；

(2)将不需要保护基保护的抗肿瘤药物前体或步骤(1)产物与三光气在二甲基氨基吡啶的催化作用下，制得对应的衍生物；对于不需要保护基保护的抗肿瘤药物前体，可以直接进入该步骤，例如对于喜树碱、多烯紫杉醇等；

(3)将步骤(2)产物与式(b)所示的化合物反应，得到接上连接桥的化合物；

(4)可选择的，脱去步骤(3)产物中的保护基；

(5)步骤(3)不需要脱保护基产物或步骤(4)产物与iRGD反应，获得式(I)所示的化合物。

作为优选，步骤(1)中采用的保护剂为二碳酸二叔丁酯；所述抗肿瘤药物前体选自喜树碱类抗肿瘤药物和紫杉醇类抗肿瘤药物。进一步优选为喜树碱、SN38、多烯紫杉醇等。

下面分别针对具体的化合物，进一步说明其制备方法：

1、式(I-1)所示的iRGD-SN38偶联物的制备方法，包括：

(1)在7-乙基-10-羟基喜树碱的C10位羟基上引入保护基；

(2)将步骤(1)产物与三光气在二甲基氨基吡啶的催化作用下，制得式(a)所示结构的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物；

(3)将步骤(2)产物(a)与式(b)所示的化合物反应，得到式(c)所示结构的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物；

(4)脱去上述式(c)所示结构中的保护基；

(5)将步骤(4)产物与iRGD反应，获得结构式如式(I-1)所示的iRGD-SN38偶联物；

上述制备方法中：

步骤(1)中，所述7-乙基-10-羟基喜树碱与采用的保护剂的摩尔比为1:1.1～2。采用的反应溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷等。步骤(2)中，步骤(1)产物与三光气和二甲基氨基的摩尔比为1:(0.3～0.5):(3～4)；步骤(2)采用的溶剂一般为二氯甲烷、三氯甲烷等。步骤(3)中，所述式(b)所示的化合物可采用现有的方法制备得到，比如可通过3-巯基-1-丙醇、2.2-二硫二吡啶制备得到。步骤(4)中，脱保护可采用TFA，反应溶剂可采用二氯甲烷等。步骤(5)中，步骤(4)产物与iRGD和TEA的摩尔比为1:(1～1.1):(1.5～2.5)，进一步优选为1:1:2。上述各步骤均可在室温下进行。

2、式(I-2)所示的iRGD-喜树碱偶联物的制备方法，包括：

(1)将喜树碱与三光气在二甲基氨基吡啶的催化作用下，制得式(d)所示结构的喜树碱衍生物；

(2)将步骤(1)产物(d)与式(b)所示的化合物反应，得到式(e)结构的喜树碱衍生物；

(3)步骤(2)制得的喜树碱衍生物(e)与iRGD反应，获得结构式如式(I-2)所示的iRGD-喜树碱偶联物；

该制备方法中，反应条件和反应摩尔比与式(I-2)所示的iRGD-SN38偶联物的制备方法相似。

3、式(I-3)所示的iRGD-多烯紫杉醇偶联物的制备方法，包括：

(1)将多烯紫杉醇与三光气在二甲基氨基吡啶的催化作用下，得到式(f)所示的中间产物，进一步与(b)所示的化合物反应制得式(g)所示结构的紫杉醇碱衍生物；

该步骤中：多烯紫杉醇与三光气和二甲基氨基吡啶的摩尔比为1:(0.3～0.5):(3～6)，反应溶剂可采用二氯甲烷等。

(2)将步骤(1)产物(g)与iRGD反应，获得结构式如式(I-3)所示的iRGD-多烯紫杉醇偶联物；该步骤中，步骤(1)产物(g)与iRGD和TEA的摩尔比为1:(1～1.1):(1.5～2.5)，进一步优选为1:1:2。上述各步骤均可在室温下进行。

本发明中的iRGD-抗肿瘤药物偶联物通过在抗肿瘤药物分子上连接水溶性靶向穿透肽iRGD，使抗肿瘤药物的水溶性和肿瘤靶向性大大提高，使用时，只需要用水溶解即可，不需要有机助溶剂，大大降低了药物使用过程中产生的毒性。

本发明还提供了一种上述任一技术方案所述iRGD-抗癌药物偶联物在制备抗癌药物中的应用。特别是在抗肠癌药物、抗肝癌药物或抗肺癌药物中的应用。

体外细胞毒性试验显示，与肿瘤细胞共培养48小时后，iRGD-SN38偶联物1对五种肿瘤细胞的存活率都有一定的影响。其中，iRGD-SN38偶联物1对肺癌细胞系A549的IC₅₀值为0.97μM，其抗肿瘤细胞活性分别是CPT-11的33倍；对肝癌细胞系LM3、HepG2和BEL-7402的IC₅₀值分别为15.92、2.17和3.16μM，其抗肿瘤细胞活性分别为CPT-11的5、14和65倍；对肠癌细胞系HT-29的IC₅₀值为0.94μM，其抗肿瘤细胞活性是CPT-11的19倍。与肿瘤细胞共培养72小时后，iRGD-SN38偶联物1对五种肿瘤细胞的存活率影响更明显。其中，iRGD-SN38偶联物1对肺癌细胞系A549的IC₅₀值为0.04μM，其抗肿瘤细胞活性分别是CPT-11的247倍；对肝癌细胞系LM3、HepG2和BEL-7402的IC₅₀值分别为4.12、0.13和4.12μM，其抗肿瘤细胞活性分别为CPT-11的7、85和8倍；对肠癌细胞系HT-29的IC₅₀值为0.94μM，其抗肿瘤细胞活性是CPT-11的90 倍。

细胞毒性实验表明，iRGD-SN38偶联物1具有比临床用药CPT-11更明显的诱导肿瘤细胞凋亡的能力，具有与SN38相类似的抗瘤效果。证实iRGD-SN38偶联物1具有广阔的抗肿瘤应用前景。

本发明的iRGD-抗肿瘤药物偶联物在水中具有较好的溶解性，可直接静脉注射或加工成其它剂型；本发明的iRGD-抗肿瘤药物偶联物具有抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的能力，并能较好的抑制肿瘤细胞的生长，为肿瘤治疗研究提供了新的方案。

附图说明

图1为iRGD-SN38偶联物1的合成路线图；

图2为iRGD-SN38偶联物1的高效液相色谱；

图3为iRGD-DTX偶联物2的合成路线图；

图4为iRGD-DTX偶联物2的高效液相色谱；

图5为iRGD-SN38偶联物1及iRGD-DTX偶联物2的水解速率图；黑色线和灰色线分别表示iRGD-SN38偶联物1和iRGD-DTX偶联物2的水解速率，实线和虚线分别表示偶联物在有或没有10mM谷胱甘肽条件下的水解速率；

图6为iRGD-SN38偶联物1抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)迁移的结果图；

图7为iRGD-SN38偶联物1抑制人肝癌细胞LM3迁移的结果图；

图8为iRGD-SN38偶联物1抑制HUVEC侵袭的结果图；

图9为iRGD-SN38偶联物1抑制HCC-LM3侵袭的结果图；

图中，Pyridine表示吡啶，DCM表示二氯甲烷，TFA表示三氟乙酸，DMAP表示4-二甲基吡啶，Boc₂O表示二碳酸二叔丁酯，DMF表示N,N-2甲基甲酰胺，MeOH表示甲醇，CPT-11表示伊立替康，SN38表示7-乙基-10-羟基喜树碱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明并不受其限制。

实施例1iRGD-SN38偶联物1的制备

合成路线如图1所示。

取Boc₂O(361.5mg，1.66mmol)，SN38(500mg，1.28mmol)溶于8mL DCM，加入吡啶2mL，室温过夜，依次用HCl(0.3M)水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂；固体用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝100:1)，得到目标产物4(510mg，收率81％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):1.03-1.06(q,3H),1.39-1.42(q,3H),1.60-1.62(q,9H),1.86-1.94(m,2H),3.14-3.19(q,2H),3.78-3.79(d,1H,J＝2.0),5.27-5.34(m,3H),5.74-5.78(q,1H),7.65-7.68(t,2H),7.90(s,1H),8.23-8.26(q,1H).

HR-ESI Qq-LTMS:计算值：[C₂₇H₂₈N₂O₇]⁺[M+H]⁺＝493.1970；检测值：493.1890。

取3-巯基-1-丙醇(300mg，3.26mmol)，2.2-二硫二吡啶(2.15g，9.78mmol)溶于10mL乙醇，室温搅拌2小时，除去溶剂，用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝100:1)，得到目标产物3(537mg，收率82％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):1.93-1.99(m,2H),2.96-2.99(t,2H),3.79-3.82(t,2H),7.64(s,3H),8.48(s,1H).

HR-ESI Qq-LTMS:计算值：[C₈H₁₁NOS₂]⁺[M+H]⁺＝202.0355；检测值：202.0356。

取化合物4(500mg，1.02mmol)，三光气(112mg，0.38mmol)，DMAP(397mg，3.25mmol)溶于10mL DCM中，室温下搅拌0.5h，加入化合物3(99mg，0.81mmol)，继续搅拌1h，依次用水，饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂；固体用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝100:1)，得到目标产物5(300mg，收率52％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):0.98-1.02(t,3H),1.38-1.42(t,3H),1.62(s,9H),2.07-2.13(m,2H),2.15-2.28(m,2H),2.88-2.91(t,2H),3.15-3.20(q,2H), 4.26-4.28(t,2H),5.29-5.42(t,3H),5.68-5.73(d,1H,J＝17.2),7.34(s,1H),7.68-7.71(q,1H),7.80-7.86(q,3H),7.92-7.95(q,1H),8.25-8.27(d,1H,J＝9.6),8.55(s,1H).

HR-ESI Qq-LTMS:计算值：[C₃₆H₃₇N₃O₉S₂]⁺[M+H]⁺＝720.2044；检测值：720.2040

将化合物5(300mg，0.42mmol)溶于3mL DCM中，加入3mL TFA,室温搅拌0.5小时，甲苯共沸除TFA后，得到目标产物6(213mg，收率83％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):0.88-0.92(t,3H),1.27-1.31(t,3H),1.95-1.98(t,2H),2.12-2.18(m,2H),2.86-2.89(t,2H),3.06-3.11(q,2H),4.18-4.21(t,2H),5.30(s,2H),5.51(s,2H),6.94(s,1H),7.19-7.22(t,1H),7.40-7.41(d,2H,J＝5.6),7.67-7.69(d,1H,J＝8.0),7.72-7.76(t,1H),8.01-8.03(t,1H),8.41-8.42(d,1H,J＝4.4),10.35(s,1H).

HR-ESI Qq-LTMS:计算值：[C₃₁H₂₉N₃O₇S₂]⁺[M+H]⁺＝620.1520；检测值：620.1527

将化合物6(50mg，0.08mmol)溶于DMF中，加入iRGD(84.8mg,0.08mmol)和TEA(22.5μL,0.16mmol)，25℃搅拌7h，高效液相分离，得到目标产物1(25mg，收率20％)。

HR-ESI Qq-LTMS:计算值：[C₆₄H₈₆N₁₆O₂₂S₄]⁺[M+H]⁺＝1559.1479；检测值：1559.0680.

iRGD-SN38偶联物1的高效液相色谱如图2所示。

实施例2iRGD-DTX偶联物2的制备

合成路线如图3所示。

取多烯紫杉醇(500mg，0.62mmol)，三光气(68mg，0.23mmol)，DMAP(397mg，3.25mmol)溶于10mL DCM中，室温下搅拌0.5h，加入化合物3(60mg，0.49mmol)，继续搅拌1h，依次用水，饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂；固体用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝80:1)，得到目标产物7(249mg，收率39％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):1.13(s,3H),1.23(s,3H),1.34(s,9H),1.64 (s,9H),1.77(s,3H),1.91(s,3H),2.04-2.12(m,2H),2.56-2.63(m,1H),2.82-2.86(t,2H),3.91-3.93(d,1H,J＝7.2),4.17-4.21(m,2H),4.24(s,1H),4.96-4.98(d,2H,J＝6.8),5.20(s,1H),5.68-5.70(d,1H,J＝6.8),6.21(s,1H),7.09-7.13(m,1H),7.30-7.32(t,3H),7.38-7.41(t,2H),7.48-7.52(t,2H),7.59-7.63(t,1H),7.66-7.72(m,2H),8.10-8.12(d,2H,J＝6.8),8.43-8.44(d,1H,J＝4.4).

HR-ESI Qq-LTMS:计算值：[C₅₂H₆₂N₂O₁₆S₂]⁺[M+H]⁺＝1035.3619；检测值：1035.3615.

将化合物7(90mg，0.02mmol)溶于DMF中，加入iRGD(20.3mg,0.02mmol)和TEA(5.5μl,0.04mmol)，搅拌16小时，高效液相分离，得到目标产物2(14mg，收率37％)。

HR-ESI Qq-LTMS:计算值：[C₈₅H₁₁₉N₁₅O₃₁S₄]⁺[M+H]⁺＝1975.3554；检测值：1975.7203.

iRGD-DTX偶联物2的高效液相色谱如图4所示。

实施例3实施例1中iRGD-SN38偶联物1和实施例2中iRGD-DTX偶联物2在不同条件下的水解

考察实施例1中iRGD-SN38偶联物1和实施例2中iRGD-DTX偶联物2在含有或不含有10mM谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液(PBS)pH 7.4条件下的稳定性。具体方法如下：

将实施例1中制备的iRGD-SN38偶联物1分别溶解在50mL含有或不含10mM谷胱甘肽的PBS缓冲液中(iRGD-SN38配置浓度为0.5mg/mL)，置于恒温摇床，在预先设定的时间点，取出500μL，并补充等量的新鲜液体。采用高效液相色谱法(HPLC)于378nm处检测药物中SN38含量，计算iRGD-SN38偶联物在不同环境下的水解速率。

图5显示iRGD-SN38偶联物1和iRGD-DTX偶联物2在不同条件下的水解结果，在10mM谷胱甘肽存在的条件下，iRGD-SN38偶联物1和iRGD-DTX偶联物2水解速度较快，2小时后释放达到90％，而在没有谷胱甘肽的环境中，iRGD-SN38偶联物1和iRGD-DTX偶联物2水解速度较快，孵育2小时后释放不到18％。实验结果证实，iRGD-SN38偶联物1 和iRGD-DTX偶联物2在血液中循环时可保持稳定，而含有较高浓度的谷胱甘肽的肿瘤细胞内可快速水解，从而达到较高的肿瘤抑制作用。

实施例4iRGD-SN38偶联物1体外细胞毒性评价

考察实施例1中iRGD-SN38偶联物1对肿瘤细胞增长的抑制作用，具体方法如下：

取对数生长期细胞，接种于96孔培养板(5000个细胞/孔)。放入在37℃细胞培养箱中恒温培养24小时后，加入iRGD-SN38，取相同的7个浓度梯度(0；0.026；0.064；0.32；1.07；3.2；6.4；12.8μM，以SN38的量计算)，以伊立替康(40；20；10；5；2.5；1.25；0.417μM)和SN38(溶于DMSO，0；0.026；0.064；0.32；1.07；3.2；6.4；12.8μM)作为对照组，每种药每个浓度4个重复值，加完药后将96孔细胞板放入细胞培养箱中培养48或72小时后，在96孔板的每孔内加入30μL的四甲基偶氮唑蓝(MTT)，继续放入细胞培养箱中培养4小时后，吸弃培养基，每孔加入100μL二甲亚砜(DMSO)，用酶标仪检测490nm处的吸光值。计算细胞存活率，绘制出细胞存活曲线，得到药物对细胞生长的IC₅₀(半数抑制浓度)。

iRGD-SN38偶联物1对各种肿瘤细胞的体外毒性结果见表1。

表1各试验药物的体外细胞毒性评价结果(μM)

表1结果显示，与肿瘤细胞共培养48小时后，iRGD-SN38偶联物1对五种肿瘤细胞的存活率都有一定的影响。其中，iRGD-SN38偶联物1对肺癌细胞系A549的IC₅₀值为0.97μM，其抗肿瘤细胞活性分别是CPT-11的33倍；对肝癌细胞系LM3、HepG2和BEL-7402的IC₅₀值分别为15.92、 2.17和3.16μM，其抗肿瘤细胞活性分别为CPT-11的5、14和65倍；对肠癌细胞系HT-29的IC₅₀值为0.94μM，其抗肿瘤细胞活性是CPT-11的19倍。与肿瘤细胞共培养72小时后，iRGD-SN38偶联物1对五种肿瘤细胞的存活率影响更明显。其中，iRGD-SN38偶联物1对肺癌细胞系A549的IC₅₀值为0.04μM，其抗肿瘤细胞活性分别是CPT-11的247倍；对肝癌细胞系LM3、HepG2和BEL-7402的IC₅₀值分别为4.12、0.13和4.12μM，其抗肿瘤细胞活性分别为CPT-11的7、85和8倍；对肠癌细胞系HT-29的IC₅₀值为0.94μM，其抗肿瘤细胞活性是CPT-11的90倍。

实施例5iRGD-DTX偶联物2体外细胞毒性评价

考察实施例2中iRGD-DTX偶联物2对肿瘤细胞增长的抑制作用，具体方法如下：

取对数生长期细胞，接种于96孔培养板(5000个细胞/孔)。放入在37℃细胞培养箱中恒温培养24小时后，加入不同浓度iRGD-DTX偶联物2，iRGD浓度梯度及DTX。每种药每个浓度4个重复值，加完药后将96孔细胞板放入细胞培养箱中培养48或72小时后，在96孔板的每孔内加入30μL的四甲基偶氮唑蓝(MTT)，继续放入细胞培养箱中培养4h后，吸弃培养基，每孔加入100μL二甲亚砜(DMSO)，用酶标仪检测490nm处的吸光值。计算细胞存活率，绘制出细胞存活曲线，得到药物对细胞生长的IC₅₀(半数抑制浓度)。

iRGD-DTX偶联物2对各种肿瘤细胞的体外毒性结果见表2。

表2各试验药物的体外细胞毒性评价结果(μM)

表1结果显示，与肿瘤细胞共培养48h后，iRGD-DTX偶联物2对两种肿瘤细胞的存活率都有一定的影响。其中，iRGD-DTX偶联物2对肝癌细胞系BEL-7402和肠癌细胞系HT-29的IC₅₀值分别为0.013和0.004μM，具有较强的肿瘤细胞毒性。

实施例6iRGD-SN38偶联物1对HUVEC细胞迁移能力影响的评价

取对数生长期HUVEC细胞，按2×10⁵个细胞/孔的密度接种至6孔培养板，均匀摇晃使细胞分布均匀，将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，至细胞长至80-90％进行下一步操作。每孔分别用1mL枪头垂直在底部细胞表面画出一条无细胞划痕，确保划痕宽度相同，用PBS漂洗3次，除去脱落的细胞。加入含有药物的培养基，iRGD(5μM)、SN38(2μM)、iRGD-SN38偶联物1(2μM)，以不加药物的培养基作空白对照组，每组3个复孔。将细胞培养板置于显微镜下拍照，并测量划痕宽度(0h)。然后将培养板置于培养箱中培养，分时段(24、48h)拍照，比较划痕宽度。

结果如图6所示，iRGD-SN38偶联物1组HUVEC细胞迁移得到明显抑制，24h，iRGD-SN38偶联物1组对HUVEC细胞迁移率为29％，而SN38组的胞迁移抑制率为39％，空白组细胞迁移率为49％。48h，iRGD-SN38偶联物1组对HUVEC细胞迁移率为41％，而SN38组的胞迁移率为49％，空白组细胞迁移率为73％。这一结果表明iRGD-SN38偶联物1接上多肽iRGD，当药物作用于肿瘤细胞时，有效地抑制了肿瘤细胞的迁移。

实施例7iRGD-SN38偶联物1对LM3细胞迁移能力影响的评价

取对数生长期LM3细胞，按2×10⁵个细胞/孔的密度接种至6孔培养板，均匀摇晃使细胞分布均匀，将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，至细胞长至80-90％进行下一步操作。每孔分别用200μL枪头垂直在底部细胞表面画出一条无细胞划痕，确保划痕宽度相同，用PBS漂洗3次，除去脱落的细胞。加入含有药物的培养基，iRGD(5μM)、SN38(2μM)、iRGD-SN38偶联物1(2μM)，以不加药物的培养基作空白对照组，每组3个复孔。将细胞培养板置于显微镜下拍照，并测量划痕宽度(0h)。然后将培养板置于培养箱中培养，72h后拍照，比较划痕宽度。

结果如图7所示，iRGD-SN38偶联物1组LM3细胞的迁移得到明显抑制，72h，iRGD-SN38偶联物1组对HUVEC细胞迁移率为30％，而SN38组的胞迁移抑制率为39％，空白组细胞迁移率为49％。

实施例8iRGD-SN38偶联物1对HUVEC细胞侵袭能力影响的评价

取对数生长期HUVEC细胞，按2×10⁵个细胞/孔的密度接种至铺有30μL Matrigel的Transwell小室的上室，下室加入700μL培养基，均匀摇晃使细胞分布均匀，将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，24小时，细胞贴壁后进行下一步操作。取出上室培养基，加入200μL含有药物的培养基，药物浓度iRGD(5μM)、SN38(2μM)、iRGD-SN38偶联物1(2μM)，下室加入700μL含20％胎牛血清的培养基，培养24h后，取出上室培养基，补入新鲜不含血清培养基，继续培养48h。弃上室培养基，PBS清洗两次，甲醇固定，结晶紫染色，用棉签擦去上室胶和细胞，显微镜下观察穿透上室的细胞，拍照，计数。

结果如图8所示，iRGD-SN38偶联物1组HUVEC细胞的侵袭得到明显抑制，iRGD-SN38偶联物1组中HUVEC细胞侵袭数目623个，而SN38组中HUVEC细胞侵袭数目946个，两者具有极显著性差异(p<0.001)。结果证实iRGD-SN38偶联物1具有较好的抑制肿瘤细胞侵袭的能力。

实施例9iRGD-SN38偶联物1对LM3细胞侵袭能力影响的评价

取对数生长期LM3细胞，按2×10⁵个细胞/孔的密度接种至铺有30μLMatrigel的Transwell小室的上室，下室加入700μL培养基，均匀摇晃使细胞分布均匀，将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，24小时，细胞贴壁后进行下一步操作。取出上室培养基，加入200μL含有药物的培养基，药物浓度iRGD(2μM)、SN38(0.5μM)、iRGD-SN38偶联物1(0.5μM)，下室加入700μL含20％胎牛血清的培养基，培养24h后，取出上室培养基，补入新鲜不含血清培养基，继续培养48h。弃上室培养基，PBS清洗两次，甲醇固定，结晶紫染色，用棉签擦去上室胶和细胞，显微镜下观察穿透上室的细胞，拍照，计数。

结果如图9所示，iRGD-SN38偶联物1组HUVEC细胞的侵袭得到明显抑制，iRGD-SN38偶联物1组中HUVEC细胞侵袭数目156个，而SN38组中HUVEC细胞侵袭数目427个。两者具有非常显著性差异(p<0.01) 。

Claims

1.一种iRGD-抗癌药物偶联物，其特征在于，是由抗肿瘤药物通过化学键与iRGD连接而成，结构式如式(I)：

其中，X₁为喜树碱类和紫杉醇类抗肿瘤药物前体；L为连接桥所述连接桥为如下所示结构：

所述的iRGD-抗癌药物偶联物的制备方法，包括：抗肿瘤药物前体与连接桥化合物反应，然后再与iRGD反应制备得到所述的iRGD-抗癌药物偶联物。

2.根据权利要求1所述的iRGD-抗癌药物偶联物，其特征在于，所述iRGD-抗癌药物偶联物的结构为式(I-1)～(I-3)所示化合物之一：

3.根据权利要求1所述的iRGD-抗癌药物偶联物，其特征在于，所述连接桥化合物为：

4.根据权利要求1所述的iRGD-抗癌药物偶联物，其特征在于，在抗肿瘤药物前体与连接桥化合物反应前利用保护基先对抗肿瘤药物前体中的特定羟基保护，在与iRGD反应前将保护基脱除。

5.根据权利要求1所述的iRGD-抗癌药物偶联物，其特征在于，包括：

(1)可选择的，对抗肿瘤药物前体的特定基团进行保护基保护；

(2)将不需要保护基保护的抗肿瘤药物前体或步骤(1)产物与三光气在二甲基氨基吡啶的催化作用下，制得对应的化合物；

(4)可选择的，脱去步骤(3)产物中的保护基；

6.根据权利要求5所述的iRGD-抗癌药物偶联物，其特征在于，步骤(1)中采用的保护剂为二碳酸二叔丁酯；所述的抗肿瘤药物前体为喜树碱类抗肿瘤药物SN38。

7.一种权利要求1所述iRGD-抗癌药物偶联物在制备抗癌药物中的应用。