CN108358995B - CP-iRGD多肽、iDPP纳米粒、载药复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

CP-iRGD多肽、iDPP纳米粒、载药复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及CP‑iRGD多肽、iRGD‑DOTAP‑mPEG‑PLA纳米粒、载药复合物及其制备方法和应用。本发明所解决的技术问题是提供一种新的修饰手段用以修饰mPEG‑PLA双嵌段共聚物，采用带正电荷的两亲性物质DOTAP和具有肿瘤靶向作用的被修饰过的CP‑iRGD多肽来修饰两亲性的mPEG‑PLA双嵌段共聚物，利用自组装的方法制备出了一种新型的可降解性基因载体的iRGD‑DOTAP‑mPEG‑PLA纳米粒，即iDPP纳米粒。该纳米粒具有良好的DNA结合能力，可有效地将基因质粒导入到肿瘤细胞中，具有转染率高、细胞毒性低等优点。

Description

CP-iRGD多肽、iDPP纳米粒、载药复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及CP-iRGD多肽、iDPP纳米粒、载药复合物及其制备方法和应用。
背景技术
基因导入系统在基因功能研究和基因治疗中有重要应用。目前使用的基因导入系统主要包括两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关载体，可高效地将治疗基因传递到细胞内，但其规模生产难度大，可递送的基因容量小，易引起免疫反应，有潜在的生物安全风险。非病毒基因载体包括脂质体、阳离子纳米粒、无机纳米粒子载体等，具有免疫原性低，安全性较好，易大规模生产等特点，越来越受到国际上的重视。
甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(Methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactide)，简称mPEG-PLA)双嵌段聚合物是一种可降解、生物相容性好的两亲性聚合物，在生物医学领域有重要的应用。在20世纪90年代，含有PEG或PLA传输载体装载的药物已获得了美国FDA的批准应用于临床。mPEG-PLA共聚物含有亲水嵌段PEG和疏水嵌段PLA，可在水溶液中自组装成纳米颗粒，在药物、基因导入系统中有很好的应用前景。目前，mPEG-PLA双嵌段聚合物纳米粒载体包裹的紫杉醇制剂已在韩国和欧洲应用于乳腺癌的临床治疗，在美国也已进入II期临床试验。在将PEG-PLA纳米粒用于基因导入系统时，单纯采用mPEG-PLA纳米粒装载基因的难度大，且转染效率低。进一步对mPEG-PLA纳米粒进行物理或化学修饰，可制备出具有易装载基因、转染效率高、毒性低、可降解的新型纳米粒，在基因导入中有重要的应用，在基因功能研究、基因治疗研究及临床应用中有很好的应用前景。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种新的修饰手段用以修饰mPEG-PLA双嵌段共聚物。发明人采用合适的方法对iRGD进行修饰，从而制备得到了产率高、纯度高、溶解性好的CP-iRGD多肽，再采用CP-iRGD多肽和DOTAP修饰两亲性mPEG-PLA双嵌段共聚物，从而可采用自组装的方法制备出一种新型的靶向可降解性基因载体，即iRGD-DOTAP-mPEG-PLA阳离子纳米粒，简称为iDPP纳米粒。本发明iDPP纳米粒具有良好的DNA结合能力，可有效地将基因质粒导入到肿瘤细胞中，具有转染率高、细胞毒性低等优点。
本发明中所采用的两亲性mPEG-PLA共聚物，化学命名为甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，简称mPEG-PLA。甲氧基聚乙二醇-聚乳酸纳米颗粒具有两亲性、良好的生物可降解性和生物相容性、避免了吞噬细胞吞噬、增加了药物在血液中的循环时间和生物利用度，持续释放和靶向传递从而增加了药效、减小了副作用。mPEG-PLA纳米粒不仅可以作为化学药物、蛋白质和疫苗等的载体，同时也可以作为基因药物的载体。
本发明中所采用的两亲性阳离子物质DOTAP，化学命名为(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵，简称DOTAP。
本发明中所采用的具有两亲性的C18-PEG-iRGD多肽，简称CP-iRGD多肽，是经过修饰的iRGD。CP-iRGD多肽能够靶向肿瘤组织，同时增强肿瘤组织的渗透性，纳米粒经过CP-iRGD多肽的修饰后可提高肿瘤组织对其的摄取能力，增加药物在肿瘤部位的聚集，减少毒副作用；且修饰iRGD所得的CP-iRGD多肽具有两亲性，从而能采用自组装的方式制备目标物。iRGD为现有多肽，结构式如下式Ⅰ：
Figure GDA0003055934260000021
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种CP-iRGD多肽，结构式如下式Ⅱ：
Figure GDA0003055934260000031
本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述CP-iRGD多肽的制备方法。该方法包括以下步骤：
A、以聚乙二醇和硬酯酸为原料反应结束后分离提纯得到C18-PEG-OH；
B、以C18-PEG-OH和Fmoc-苯丙氨酸反应得到C18-PEG-Phe-Fmoc；
C、脱去C18-PEG-Phe-Fmoc保护基Fmoc，得到C18-PEG-Phe-NH2；
D、将C18-PEG-Phe-NH2与3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应得到C18-PEG-BMPS；
E、将C18-PEG-BMPS与iRGD通过马来酰亚胺基团与巯基反应得到目标化合物C18-PEG-iRGD。
优选的，上述制备方法步骤C中，采用1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯脱去C18-PEG-Phe-Fmoc保护基Fmoc。
优选的，上述制备方法步骤E中，所述反应采用的溶剂由pH＝7.3的PBS缓冲液和二甲基亚砜按体积比1﹕1混合而成。
本发明所要解决的第三个问题是采用自组装的方法制备iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒溶液，按照下述配比关系取原料、溶剂进行制备：
原料：mPEG-PLA共聚物、DOTAP与iRGD多肽的质量配比为：mPEG-PLA共聚物70～99份、DOTAP 1～30份、iRGD 1～5份；
溶剂：二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、环己烷等易挥发的溶剂中的至少一种；
水化溶液：双蒸水、去离子水、纯水、生理盐水、葡萄糖溶液中的至少一种；
制备方法：mPEG-PLA共聚物、DOTAP、iRGD多肽分别溶于溶剂中并混匀，然后将溶剂蒸发，加适量水化溶液水化成所需浓度，所得溶液即为iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒水溶液。
进一步的，上述自组装的方法制备iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒溶液，按照下述配比关系取原料进行制备：
原料：mPEG-PLA共聚物、DOTAP与iRGD多肽的质量配比为：mPEG-PLA共聚物85～95份、DOTAP 5～15份、iRGD 1～5份。
上述技术方案中，溶剂用量以能够溶解原料即可。
本发明还提供了由上述自组装的方法制备得到的iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒溶液。
本发明还提供了iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒水溶液干燥即得iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒。
本发明所得iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒的平均粒径为139.16±1.56nm，平均电位为43.1±6.8mV，具备良好的DNA结合能力。与金标转染材料PEI 25K相比，iDPP纳米粒具有更高的转染能力和较低的细胞毒性；与DOTAP-mPEG-PLA(简称DPP)纳米粒相比，iDPP纳米粒具有更高的转染效率和肿瘤细胞靶向性。
本发明所得iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒可用于包载活性成分，尤其是基因、化学药物、蛋白质或疫苗，得到iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒复合物。
优选的，iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒包载DNA的质量比为25﹕1。
iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒属生物可降解性阳离子纳米粒，是一种新型基因导入系统非病毒载体。该纳米粒能通过静电相互作用结合DNA，与DNA结合的纳米粒成电中性，具有长循环作用。通过静脉注射的给药方式，可有效地将目的基因或化学药物、蛋白质和疫苗等活性成分靶向导入肿瘤细胞中，其本身具有细胞毒性低、转染率高等特征。
如，可以采用iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒传递水泡口炎病毒基质蛋白(VSVMP)基因质粒，即采用iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒包载VSVMP得到iDPP/VSVMP复合物。
本发明iDPP/VSVMP复合物，包括下述配比关系的原料及辅料：
原料：iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒1～99份，VSVMP 1～10份；
渗透压调节剂适量，用量以配制所得VSVMP/iDPP复合物达到生理渗透压即可；
溶剂：注射用水、双蒸水、去离子水、纯水或生理盐水中的至少一种；
制备方法如下：
将上述原料及溶剂按照渗透压调节剂、溶剂、iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒和VSVMP依次混合即得iDPP/VSVMP复合物溶液，所得溶液达到生理渗透压。
进一步的，本发明iDPP/VSVMP复合物按照下述配比关系取原料进行制备：iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒与VSVMP质量配比为iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒90～99份，VSVMP1～10份。
发明人发现利用iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒传递VSVMP基因质粒可应用于体外和体内治疗黑色素瘤：
在体外，发明人用MTT法检测iDPP/VSVMP复合物对B16-F10黑色素瘤细胞生长的抑制作用，并用流式细胞术检测iDPP/VSVMP复合物诱导细胞凋亡情况。发明人发现利用iDPP纳米粒介导VSVMP基因质粒进入B16-F10黑色素瘤细胞中，iDPP/VSVMP复合物通过诱导凋亡可以明显抑制B16-F10黑色素瘤细胞的生长。
在体内，发明人建立黑色素皮下种植瘤模型和黑色素瘤肺转移模型，比较各组肿瘤体积和重量，肺转移比较肿瘤结节数。发明人发现iDPP/VSVMP复合物可以显著地减少小鼠肿瘤的负荷和肺转移的产生。体外体内治疗数据表明，iDPP纳米粒传递VSVMP基因可以在体外和体内有效抑制B16-F10黑色素瘤细胞的生长。
所以，本发明还提供了上述iDPP/VSVMP复合物在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
本发明选择了一种合适的方法对iRGD进行修饰，得到了产率、纯度均较高的CP-iRGD多肽，该CP-iRGD多肽溶解性好，从而可以通过自组装的方法制备可降解阳离子纳米粒iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒。该纳米粒可通过静电相互作用结合DNA，结合基因的纳米呈电中性，通过静脉注射的给药方式，可有效地将基因导入到肿瘤细胞中，具有基因转染率高、细胞毒性低等特点，在基因导入中有重要的应用，在基因功能研究、基因治疗研究及临床应用中有很好的应用前景。iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒可介导基因等活性成分发挥疗效，如iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒介导VSVMP基因可以在体外和体内有效抑制B16-F10黑色素瘤细胞的生长。iDPP纳米粒是一种相对安全的可降解性非病毒基因载体，制备所得iDPP/VSVMP复合物为治疗黑色素瘤提供了一种新的思路和潜在的选择。
附图说明
图1(A)PEG-PLA的分子结构式；(B)DOTAP的分子结构式；(C)C18-PEG-iRGD的合成路线图
图2iDPP纳米粒的结构示意图
图3iDPP纳米粒的粒径及电位分布图：(A)iDPP纳米粒的粒径分布图；(B)iDPP纳米粒的电位分布图；(C)iDPP纳米粒的扫描透射电镜照片；(D)iDPP纳米粒凝胶阻滞分析：当iDPP与DNA的质量之比为20﹕1时，iDPP纳米粒可以完全结合DNA质粒。
图4iDPP/VSVMP复合物的粒径及电位分布图：(A)iDPP/VSVMP复合物的粒径分布图；(B)iDPP/VSVMP复合物的电位分布图；(C)iDPP/VSVMP复合物的扫描透射电镜照片；(D)iDPP/VSVMP复合物基因梯度电位图。
图5iDPP纳米粒细胞毒性检测，与PEI 25K对B16-F10细胞的转染率：(A)在B16-F10细胞中，iDPP纳米粒的细胞毒性低于PEI 25K。(B)iDPP纳米粒转染B16-F10细胞的绿色荧光图与同一视野的白光图，iDPP纳米粒对B16-F10细胞的转染率明显高于DPP纳米粒和PEI25K，iDPP纳米粒、DPP纳米粒和PEI 25K与pGFP质粒的质量之比为分别为25﹕1、25﹕1和1﹕1(C)iDPP纳米粒、DPP纳米粒与PEI 25K对B16-F10细胞转染的流式图统计。
图6iDPP/VSVMP复合物体外对B16-F10细胞的抗肿瘤能力：(A)iDPP/VSVMP复合物可以明显抑制肿瘤细胞的生长；(B)iDPP/VSVMP复合物细胞凋亡流式图，iDPP/VSVMP复合物是通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的生长。
图7瘤内注射iDPP/VSVMP复合物的抗肿瘤活性：(A)iDPP/VSVMP复合物治疗组的肿瘤体积变化明显低于其他四组，**：P<0.01,差异具有统计学意义；(B)iDPP/VSVMP复合物治疗组的肿瘤重量明显少于其他四组，*：P<0.05,差异具有统计学意义。
图8静脉注射iDPP/VSVMP复合物的抗肿瘤活性：(C)尾静脉注射iDPP/VSVMP复合物可显著抑制黑色素瘤肺转移；(D)静脉注射iDPP/VSVMP复合物治疗组的肺的重量。(A)静脉注射iDPP/VSVMP复合物可靶向治疗B16-F10皮下瘤，(B)iDPP/VSVMP复合物治疗组重量明显小于其他四组。
具体实施方式
由于单纯采用mPEG-PLA纳米粒装载基因的难度大，且转染效率低。本发明进一步对mPEG-PLA纳米粒进行物理或化学修饰，预制备出具有易装载基因、转染效率高、毒性低、可降解的新型纳米粒，从而能够在基因功能研究、基因治疗研究及临床应用得到很好的应用。
发明人经过实验研究发现可采用两亲性阳离子物质DOTAP和具有靶向能力的iRGD对mPEG-PLA进行修改，然而通过自组装的方法并不能制备得到iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒。发明人又经过大量试验研究对iRGD进行结构修饰，采用了合适的方法，特别是步骤E中马来酰亚胺基团与巯基选择了合适的溶剂最后合成了产率高、纯度高、溶解性好的具有两亲性的C18-PEG-iRGD多肽，简称CP-iRGD多肽。该CP-iRGD多肽与原料DOTAP、mPEG-PLA能够通过自组装制备得到iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒，不仅制备方法简单易操作，而且制备得到的iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒具有良好的DNA结合能力，可有效地将基因质粒导入到肿瘤细胞中，具有转染率高、细胞毒性低等优点。
本发明首先提供了一种CP-iRGD多肽，结构式如下式Ⅱ：
Figure GDA0003055934260000071
本发明还提供了上述CP-iRGD多肽的制备方法，包括以下步骤：
A、以聚乙二醇和硬酯酸为原料反应结束后分离提纯得到C18-PEG-OH；
B、以C18-PEG-OH和Fmoc-苯丙氨酸反应得到C18-PEG-Phe-Fmoc；
C、脱去C18-PEG-Phe-Fmoc保护基Fmoc，得到C18-PEG-Phe-NH2；
D、将C18-PEG-Phe-NH2与3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应得到C18-PEG-BMPS；
E、将C18-PEG-BMPS与iRGD通过马来酰亚胺基团与巯基反应得到目标化合物C18-PEG-iRGD。
优选的，上述制备方法步骤C中，采用1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯脱去C18-PEG-Phe-Fmoc保护基Fmoc。
优选的，上述制备方法步骤E中，所述反应采用的溶剂由pH＝7.3的PBS缓冲液和二甲基亚砜按体积比1﹕1混合而成。
具体的，上述CP-iRGD多肽的制备方法，包括以下步骤：
第一步：以聚乙二醇(PEG)和硬酯酸(C17COOH)为原料制备得到CH2(CH2)nCOO-PEG-OH(化合物1)；以聚乙二醇(PEG，Mw＝1000，2000，4000，8000等各个分子量)和直链羧酸(CH2(CH2)nCOOH)为原料制备得到CH2(CH2)nCO-PEG-OH(化合物1)；本步骤所得产物纯度≥90％，产率70％；
聚乙二醇上的末端羟基与直链羧酸在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的催化下进行缩合反应；
具体步骤：取聚乙二醇(1.1mmol)、硬酯酸(C17COOH)(1mmol)溶于二氯甲烷，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，3mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS,0.3mmol)，室温搅拌过夜，依次用1N HCl溶液、水溶液及饱和食盐水水洗3次，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、收集滤液后减压除去溶剂固体用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷﹕甲醇＝20﹕1)，得到化合物1；
反应溶剂：二氯甲烷、氯仿、丙酮等有机溶剂皆可；
反应条件：室温，搅拌，12h；
其中，聚乙二醇(PEG)分子量可以是Mw＝1000，2000，4000，8000等各个不同分子量，直链羧酸(CH2(CH2)nCOOH)中n等于10～17。
由聚乙二醇(PEG)与硬脂酸(C17COOH)的反应机理可知，PEG两端都含有羟基，与硬脂酸发生反应时会生成两种化合物，分别为C18-PEG-C18和C18-PEG-OH。由于本发明仅需要C18-PEG-OH，故要分离纯化得到单端羟基的C18-PEG-OH。C18-PEG-OH的羟基并非指PEG上接入了一个羟基，而是为了更加直观形象将PEG上的羟基表示了出来。
优选的，上述制备方法A中，所述分离提纯采用二氯甲烷﹕甲醇＝20﹕1。
第二步：C18-PEG-OH(化合物1)和Fmoc-苯丙氨酸反应得到C18-PEG-Phe-Fmoc(化合物2)；本步骤产物纯度＞90％，产率90％；
由于氨基的反应活性比羟基高，因此预先在C18-PEG-OH(化合物1)的末端羟基上接上一个氨基，以此提高与3-Maleimidopropionic acidNHS(简称BMPS)的反应效率。即在化合物1末端接上Fmoc-苯丙氨酸，得到化合物2，然后第三步再脱除保护基Fmoc，从而得到具有末端氨基的化合物3；
化合物1上的末端羟基与Fmoc-苯丙氨酸中的羧基在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下进行酯化反应。
具体步骤为：取化合物1(500mg)和Fmoc-L-苯丙氨酸(142mg)溶于二氯甲烷，加入EDC·HCl(140mg)和DMAP(9mg)，室温搅拌过夜，依次用1N HCl溶液、水溶液及饱和食盐水洗,有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、收集滤液后减压除去溶剂固体用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷﹕甲醇＝20﹕1)，得到化合物2。
第三步：用1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(简称DBU)脱去C18-PEG-Phe-Fmoc(化合物2)，得到C18-PEG-Phe-NH2(化合物3)；
由于Fmoc对酸稳定，较易通过简单的胺脱保护，被游离的胺以游离碱析出。此步骤中我们选用具有碱性的DBU来脱保护基Fmoc，能快速有效的脱去Fmoc，使氨基裸露在末端，以便参与下一步反应。
具体步骤为：将化合物2(500mg)溶于二氯甲烷，缓慢加入DBU(120uL)，常温，搅拌，反应4h，依次用1N HCl溶液、水溶液及饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂固体用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷﹕甲醇＝25﹕1)，得到化合物3。
第四步：将C18-PEG-Phe-NH2(化合物3)与3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(简称BMPS)反应得到C18-PEG-Phe-BMPS(化合物4)；本步骤产物纯度>90％，产率68％；
预通过马来酰亚胺基团和iRGD上的巯基化学键和得到目标产物(化合物5)，此步反应目的意在化合物3上连接一个马来酰亚胺基团。利用化合物3与BMPS进行迈克加成反应得到C18-PEG-Phe-BMPS。该反应中C18-PEG-Phe-NH2作为稳定的碳负离子(给体)与BMPS作为α，β-不饱和羰基化合物(称为受体)进行共轭加成。
具体步骤为：取化合物3(200mg)和BMPS(49mg)溶解于二氯甲烷，加入0.2％的三乙胺，常温，搅拌，反应12h，依次用1N HCl溶液、水溶液及饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、收集滤液后减压除去溶剂固体用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷﹕甲醇＝20﹕1)，得到化合物4。
第五步：将C18-PEG-Phe-BMPS(化合物4)与iRGD通过马来酰亚胺基团与巯基反应得到目标化合物C18-PEG-iRGD(化合物5)；所述反应采用的溶剂由pH＝7.3的PBS缓冲液和二甲基亚砜按体积比1﹕1混合而成；
根据迈克加成原理(如第四步所述)将iRGD上的巯基与C18-PEG-Phe-BMPS上的马来酰亚胺基团进行1,5加成，将iRGD连接在C18-PEG-Phe-BMPS上。
在此反应中，三乙胺的量很大程度上影响反应的效率，碱加的偏多，会使反应的效率提高，但也不宜过多，0.2％即可。
C18-PEG-Phe-BMPS与原料C18-PEG-Phe的极性非常接近，所以在初步判断反应是否进行的时候最好把两个化合物在硅胶板上的斑点用茚三酮显色。因为C18-PEG-Phe中带有氨基，氨基在茚三酮作用下变粉色，而C18-PEG-BMPS没有这个现象。
由于马来酰亚胺官能团与巯基的反应对pH极其敏感，当溶剂体系pH在7左右时，反应活性最高，所以我们改用PBS缓冲液(PH＝7.3)和二甲基亚砜按体积比1﹕1混合溶剂。
具体步骤为：将C18-PEG-Phe-BMPS(300mg)溶于丙酮，将iRGD(150mg)溶于水，将iRGD溶于PBS缓冲液(PH＝7.3)和二甲基亚砜的混合溶液，再与C18-PEG-Phe-BMPS溶液混溶，滴加0.2％三乙胺，室温，真空、氮气保护，反应过夜。透析(Mw＝2000)2天，冻干，4℃密封保存，备用；(纯度>90％，产率68％)。
该步反应中溶剂体系的选取对反应的效率影响较大，反应可选取二甲基亚砜、四氢呋喃，丙酮与水混合溶剂等常规溶剂作为反应溶剂，但反应效率非常低，达到40％左右。经过筛选发现以PBS缓冲液(PH＝7.3)和二甲基亚砜作为混合溶剂时反应效率最高，得到的产物纯度最高，溶解性最好，所以优选采用由pH＝7.3的PBS缓冲液和二甲基亚砜按体积比1﹕1混合溶剂。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。
mPEG-PLA、DOTAP分子结构式和CP-iRGD的合成线路图见图1，iDPP纳米粒通过mPEG-PLA、DOTAP和CP-iRGD自组装的方法制备而成，结构示意图见图2。
1、实验方法
1.1制备合成C18-PEG-iRGD化合物
1.1.1制备合成C18-PEG-OH(以下简称化合物1)
取聚乙二醇(1.1mmol)、硬酯酸(C17COOH)(1mmol)溶于二氯甲烷，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，3mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS,0.3mmol)，室温搅拌过夜，依次用1N HCl溶液、水溶液及饱和食盐水水洗3次,有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、收集滤液后减压除去溶剂固体用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷﹕甲醇＝20﹕1)，得到化合物1；
1.1.2制备合成C18-PEG-Phe-Fmoc(简称化合物2)
取化合物1(500mg)和Fmoc-L-苯丙氨酸(142mg)溶于二氯甲烷，加入EDC·HCl(140mg)和DMAP(9mg)，室温过夜，依次用1N HCl溶液、水溶液及饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂固体用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷﹕甲醇＝20﹕1)，得到化合物2。
1.1.3制备合成C18-PEG-Phe-NH2(简称化合物3)：
考虑DBU脱去Fmoc的效率很高，该反应中DBU的量不要加太多；其次该反应的反应时间不宜过长。将化合物2(500mg)溶于二氯甲烷，缓慢加入DBU(100uL)，常温，搅拌，反应3h。依次用1N HCl溶液、水溶液及饱和食盐水洗,有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂固体用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷﹕甲醇＝25﹕1)，得到化合物3。
1.1.4制备合成C18-PEG-Maleimide(简称化合物4)：
取化合物3(200mg)和BMPS(49mg)溶解于二氯甲烷，加入0.2％的三乙胺，常温，搅拌，反应12h。依次用1N HCl溶液、水溶液及饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂固体用柱层析色谱分离纯化(二氯甲烷﹕甲醇＝20﹕1)，得到化合物4。
1.1.5制备合成目标化合物C18-PEG-iRGD(简称化合物5)：
将C18-PEG-Phe-BMPS(300mg)溶于丙酮，将iRGD(150mg)溶于水，将iRGD溶于PBS缓冲液(PH＝7.3)和二甲基亚砜的混合溶剂溶液，再与C18-PEG-Phe-BMPS溶液混溶，滴加0.2％三乙胺，室温，真空、氮气保护，反应过夜。透析(Mw＝2000)2天，冻干，4℃密封保存，备用。
1.2iDPP纳米粒及iDPP/VSVMP复合物制备方法
1.2.1iDPP纳米粒的制备
iDPP纳米粒通过自组装的方法制备而成。简单地说，首先将mPEG-PLA共聚物(45mg)、DOTAP(2～6mg)和iRGD 0.5～2.5mg分别溶于4mL二氯甲烷溶液中，再转入烧瓶中混匀；然后连接旋蒸器，将混合溶液置于60℃水浴锅中，真空条件下旋蒸30分钟，使二氯甲烷蒸发完全，在圆底烧瓶底部形成一层透明薄膜。加适量双蒸水水化成所需浓度，60℃水浴轻轻振荡，直到完全溶解，所得溶液即为iDPP纳米粒水溶液，置于4℃冰箱保存备用。将所得iDPP纳米粒水溶液干燥即得iDPP纳米粒。
1.2.2iDPP/VSVMP复合物制备方法
原料：VSVMP 5μg；iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒100μg～125μg；50％葡萄糖；
溶剂：双蒸水
制备方法如下：
将上述原料及溶剂按照葡萄糖、双蒸水、iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒、和VSVMP先后顺序混合在一起，且复合物最终葡萄糖浓度为5％。
1.3iDPP纳米粒的粒径、电位和形态学研究
1.3.1iDPP纳米粒的粒径、电位
iDPP纳米粒的粒径和电位大小使用Zetasizer Nano ZS马尔文粒度仪(MalvernInstruments，Worcestershire，英国)检测，检测温度为25℃，检测前平衡2分钟。结果取3次测量的平均值。
1.3.2iDPP纳米粒的形态学研究
iDPP纳米粒的形态学通过扫描透射电子显微镜(scanning transmissionelectron microsope,STEM)来观察。用毛细吸管吸取制备好的iDPP纳米粒溶液滴在铜网膜上，经3-5分钟后，用滤纸吸去余水，然后将铜膜置于扫描透射电子显微镜下进行观察形态，并摄取照片。
1.4iDPP纳米粒与DNA结合能力的研究
用凝胶阻滞分析实验来检测iDPP纳米粒的DNA结合能力。首先把不同质量比例(1﹕1,5﹕1,10﹕1,15﹕1,20﹕1,25﹕1)的iDPP纳米粒和空载质粒(pVAX)混合，质粒的质量为0.3μg，总体积为5ul，用加样枪轻轻吹打混合均匀，室温静置孵育30分钟，上样前加入1ul DNAloading dye。然后配制1％的琼脂糖凝胶，配胶过程中加入一定量的溴化乙锭染色剂。待琼脂糖凝胶形成后将静置完成后，上样，在100V电压下电泳30分钟。最后取出电泳条带在紫外灯的照射下进行观察并取图。
1.5iDPP/VSVMP复合物的粒径、电位和形态学研究
1.5.1iDPP纳米粒的粒径、电位
iDPP纳米粒的粒径和电位大小使用Zetasizer Nano ZS马尔文粒度仪(MalvernInstruments，Worcestershire，英国)检测，检测温度为25℃，检测前平衡2分钟。结果取3次测量的平均值。
1.5.2iDPP纳米粒的形态学研究
iDPP纳米粒的形态学通过扫描透射电子显微镜(scanning transmissionelectron microsope,STEM)来观察。用毛细吸管吸取制备好的iDPP纳米粒溶液滴在铜网膜上，经3-5分钟后，用滤纸吸去余水，然后将铜膜置于扫描透射电子显微镜下进行观察形态，并摄取照片。
1.6iDPP纳米粒与DNA结合后，电位变化情况
首先把不同质量比例(5﹕1,10﹕1,15﹕1,20﹕1,25﹕1,30﹕1,35﹕1)的空载质粒(pVAX)与iDPP混合，iDPP纳米粒的体积为400ul。
(1)将不同质量的质粒pVAX分别稀释于400μl去离子水中，轻轻混匀。
(3)取制备好的iDPP纳米粒400ul稀释于400μl去离子水中，轻轻混匀。
(4)分别混合稀释的pVAX质粒和iDPP纳米粒，注意将稀释的基因质粒加入到稀释的材料中，室温静置孵育30分钟。
使用ZetasizerNano ZS马尔文粒度仪(Malvern Instruments，Worcestershire，英国)检测其电位变化，检测温度为25℃，检测前平衡2分钟。结果取3次测量的平均值。
1.7iDPP纳米粒的细胞毒性检测
iDPP纳米粒对293T细胞的毒性作用通过细胞活力分析来检测。，
(1)加药前一天，取对数期生长的293T细胞，胰酶消化细胞制成细胞悬液，计数细胞，以5×103个细胞/孔接种于96孔板，每孔加样100μl细胞悬浮液，放入37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中孵育24小时。
(2)配制100μl一系列浓度(0μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)的DPP纳米粒溶液和PEI 25K溶液，然后加入到96孔板中，每个浓度设6个复孔。加药完成后在37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中继续孵育48小时。
(3)孵育完成后，每孔加入MTT试剂(5mg/ml)20μl，将细胞放入37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中避光孵育3-4小时后取出细胞，在倒置显微镜下观察细胞内紫蓝色结晶紫，颜色越深细胞活力越大。
(4)最后弃掉培养基后，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，将96孔板置于摇床上振荡15分钟，振荡完成后将96孔板于酶标仪上在570nm波长处读取光吸收值(OD570)。
1.8iDPP纳米粒转染B16-F10细胞
(1)转染前一天，取对数期生长的B16-F10细胞，胰酶消化细胞制成细胞悬液，计数细胞，细胞密度为2-3×105/孔，将B16-F10细胞接种于6孔板中，每孔加细胞悬浮液2ml。
(2)将2μg绿色荧光蛋白质粒(pGFP)稀释于50μl无血清无抗生素的1640培养基中，轻轻混匀。
(3)取制备好的iDPP纳米粒、DPP纳米粒40μg～50μg分别稀释于50μl无血清无抗生素的1640培养基中，轻轻混匀。取2μgPEI 25K溶液(1μg/μl)稀释于50μl无血清无抗生素的1640培养基中，轻轻混匀。
(4)分别混合稀释的pGFP质粒和iDPP纳米粒、DPP纳米粒、PEI 25K(总体积为130μl)，注意将稀释的基因质粒加入到稀释的材料中，室温静置孵育30分钟。
(5)将6孔板中的培养基吸出，用PBS洗涤细胞2次，加无血清无抗生素的1640培养基800ul。
(6)将pGFP/iDPP复合物、pGFP/DPP复合物、pGFP/PEI 25K复合物加到孔板中，然后前后左右晃动混匀。
(7)将6孔板放入37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中孵育4～8小时后，移去无血清无抗生素培养基，换成有血清有抗生素的1640培养基2ml，放入孵箱继续培养40小时。
(8)转染完成后将6孔板置于倒置荧光显微镜下观察转染后细胞内绿色荧光蛋白表达情况，并取图。
(9)收集细胞，行流式细胞术检测，确定转染率。
1.9检测iDPP/VSVMP复合物在体外对B16-F10细胞的抗肿瘤活性
在体外主要用两种方法检测iDPP/VSVMP复合物对B16-F10细胞的抗肿瘤活性：MTT法和流式细胞术。
1.9.1用MTT法检测iDPP/VSVMP复合物对B16-F10细胞生长的抑制作用
(1)B16-F10细胞接种96孔板方法详见1.6(1)
(2)取1μg VSVMP质粒和空载pVAX质粒分别稀释于25μl无血清无抗生素的1640培养基中，轻轻混匀。
(3)取20μg～25μg制备好的iDPP纳米粒稀释于25μl无血清无抗生素的1640培养基中，轻轻混匀。
(4)分别混合稀释的VSVMP质粒、pVAX质粒和iDPP纳米粒(总体积65μl)，注意将稀释的基因加入到稀释的材料中，室温静置孵育30min。
(5)将96孔板中的培养基吸出，用PBS洗涤细胞2次，加无血清无抗生素的1640培养基100μl。
(6)将65μl的IDPP/VSVMP复合物、iDPP/pVAX复合物加到孔板中，同时将65μl体积的iDPP材料和无血清无抗生素的1640培养基也加到孔板中，每组设6个复孔，然后混匀。
(7)将96孔板放入37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中孵育4～8小时后，移去孔板中的培养基，换成有血清有抗生素的1640培养基200μl，放入孵箱继续孵育40小时。
(8)孵育完成后，每孔加入MTT试剂(5mg/ml)20μl，将细胞放入37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中避光孵育3-4小时，在倒置显微镜下观察细胞内紫蓝色结晶紫。
(9)最后弃掉培养基后，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，将96孔板置于摇床上振荡15分钟，振荡完成后将96孔板于酶标仪上在570nm波长处读取光吸收值(OD570)。
1.9.2用流式细胞术检测iDPP/VSVMP复合物诱导B16-F10细胞的凋亡情况
(1)B16-F10细胞接种6孔板方法详见1.7.1
(2)取2μg VSVMP质粒和空载pVAX质粒分别稀释于50μl无血清无抗生素的1640培养基中，轻轻混匀。
(3)取40μg～50μg制备好的iDPP纳米粒稀释于50μl无血清无抗生素的1640培养基中，轻轻混匀。
(4)分别混合稀释的VSVMP质粒、pVAX质粒和iDPP纳米粒(总体积约130μl)，注意将稀释的基因加入到稀释的材料中，室温静置孵育30分钟。
(5)将6孔板中的培养基吸出，PBS洗涤细胞2次，加无血清无抗生素的1640培养基1ml。
(6)将130μl的iDPP/VSVMP复合物、iDPP/pVAX复合物加到孔板中，同时将130μl体积的iDPP材料和无血清无抗生素的1640培养基也加到孔板中，混匀。
(7)换液孵育的方法详见1.7.7
(8)转染完成后，将细胞收集于流式管中，用冷的PBS洗2遍，1500rpm 3min离心，然后用100μl结合缓冲液(bindingbuffer)重悬细胞。
(9)在100μl细胞悬浮液中，加入5μl annexin V-FITC，再加入5μl PI试剂，用枪轻轻混匀，避光孵育15分钟(参照Biolegend公司annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明书进行)。
(10)孵育完成后，行流式细胞术检测治疗组、空载组、材料组和生理盐水组的B16-F10细胞的凋亡情况。
1.10检测iDPP纳米粒、iDPP/VSVMP复合物的肿瘤靶向性
(1)B16-F10黑色素皮下种植瘤模型的建立：购买6-8周龄的雌性C57小鼠12只，饲养在本实验室SPF级动物房中。收集对数期生长的B16-F10细胞，用无血清无抗生素的1640培养基洗2遍，进行细胞计数，计数完成后用无血清无培养基的1640培养基制成细胞悬浮液。每只小鼠接种细胞量为2×105细胞，皮下注射细胞悬浮液100μl。
(2)接种两周后，制备含香豆素-6的iDPP纳米粒50mg，首先将mPEG-PLA共聚物(45mg)、DOTAP(2～6mg)、iRGD 0.5～2.5mg和香豆素-60.05～0.25mg分别溶于4ml二氯甲烷溶液中，再转入烧瓶中混匀；然后连接旋蒸器，将混合溶液置于60℃水浴锅中，真空条件下旋蒸30分钟(避光)，使二氯甲烷蒸发完全，在圆底烧瓶底部形成一层透明薄膜。加适量双蒸水水化成所需浓度，60℃水浴轻轻振荡，直到完全溶解，所得溶液即为iDPP-C6纳米粒水溶液,置于4℃冰箱保存备用。
(3)按时间点设计1h，2h，4h，8h，24h五个时间点尾静脉注射含iDPP/VSVMP-C6纳米粒水溶液200ul。
1.11检测iDPP/VSVMP复合物体内抗肿瘤能力
1.11.1瘤内注射iDPP/VSVMP复合物及其抗肿瘤机制的研究
(1)B16-F10黑色素皮下种植瘤模型的建立：购买6-8周龄的雌性C57小鼠25只，饲养在本实验室SPF级动物房中。收集对数期生长的B16-F10细胞，用无血清无抗生素的1640培养基洗2遍，进行细胞计数，计数完成后用无血清无培养基的1640培养基制成细胞悬浮液。每只小鼠接种细胞量为2×105细胞，皮下注射细胞悬浮液100μl。
(2)随机分组：接种后的第3天，将C57小鼠随机分为5组，每组5只。
(3)瘤内给药：分别取5μgVSVMP质粒和pVAX空载质粒稀释于50％的葡萄糖溶液中(最终浓度为5％)，然后将稀释的VSVMP质粒和pVAX质粒加入到制备好的iDPP纳米粒溶液和DPP纳米粒溶液中，分别为iDPP/VSVMP复合物溶液、DPP/VSVMP复合物溶液、iDPP/pVAX复合物溶液、iDPP纳米粒溶液和5％葡萄糖溶液，给药体系为200μl，混匀。
(4)每2天给药一次，用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，并记录，共治疗4次。
(5)治疗完成后1周，用颈椎脱位法将小鼠处死，解剖小鼠腹腔，收集肿瘤和小鼠心肝脾肺肾，称量瘤重。
1.11.2静脉注射iDPP/VSVMP复合物及其抗肿瘤效果的研究
(1)B16-F10黑色素皮下种植瘤模型的建立：方法参考1.10.1(1)
(2)随机分组：接种后的第3天，将C57小鼠随机分为5组，每组5只。
(3)静脉给药：分别取5μgVSVMP质粒和pVAX空载质粒稀释于50％的葡萄糖溶液中(最终浓度为5％)，然后将稀释的VSVMP质粒和pVAX质粒加入到制备好的iDPP纳米粒溶液中，分别为iDPP/VSVMP复合物溶液、VSVMP/DPP复合物溶液、iDPP/pVAX复合物溶液、iDPP纳米粒溶液和5％葡萄糖溶液，给药体系为200μl，混匀，小鼠尾静脉注射。
(4)每2天给药一次，并用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，共治疗7次。
(5)治疗完成后1周，用颈椎脱位法将小鼠处死，解剖小鼠腹腔，收集肿瘤和小鼠心肝脾肺肾，称量瘤重。
1.11.3静脉注射iDPP/VSVMP复合物及其抑制黑色素瘤肺转移的研究
(1)B16-F10黑色素瘤肺转移模型的建立：购买6-8周龄的雌性C57小鼠25只，饲养在本实验室SPF级动物房中。收集对数期生长的B16-F10细胞，用无血清无抗生素的1640培养基洗2遍，进行细胞计数，计数完成后用无血清无培养基的1640培养基制成细胞悬浮液。每只小鼠接种细胞量为1×105细胞，小鼠尾静脉注射细胞悬浮液100μl。
(2)随机分组：接种后的第3天，将C57小鼠随机分为5组，每组5只。
(3)静脉给药：方法参考1.10.2(3)
(4)每2天给药一次，共治疗7次。
(5)治疗完成后1周，用颈椎脱位法将小鼠处死，解剖小鼠腹腔，小鼠心肝脾肺肾，称量肺的重量。
1.12统计分析
实验数据以平均数±标准误来表示(mean±SD)，用SPSS17.0统计软件进行数据分析，主要运用求均值、t检验进行均数比较分析。P<0.05统计学有差异。
2结果
2.1iDPP纳米粒的特征
2.1.1iDPP纳米粒的粒径、电位和形态学
制备好的iDPP纳米粒在扫描透射电镜下观察形态学。在扫描透射电镜下，iDPP纳米粒是大小较为均一的球型颗粒，直径大小约50m(图3C)。iDPP纳米粒的平均粒径为139±1.5nm，平均电位为+43±3.9mV。纳米粒的粒径分布和电位分布(图3A、3B)。
2.2iDPP纳米粒与DNA的结合能力
我们用凝胶阻滞分析实验检测了iDPP纳米粒的DNA结合能力(图3D)。当iDPP与DNA的质量之比为20﹕1的时候，DNA质粒可以被iDPP纳米粒完全结合。通过静电相互作用，带负电荷的DNA质粒被吸附在iDPP纳米粒的表面，形成iDPP/DNA复合物。由于表面带强大的正电荷，所以iDPP纳米粒可以有效地结合DNA质粒。所以，当iDPP与DNA的质量之比为25﹕1时，iDPP纳米粒可以完全结合DNA(图3D)。
2.3iDPP/VSVMP复合物的特征
2.3.1iDPP/VSVMP复合物的粒径、电位和形态学
制备好的iDPP/VSVMP复合物在扫描透射电镜下观察形态学。在扫描透射电镜下，iDPP纳米粒是大小较为均一的球型颗粒，直径大小约54m(图4C)。iDPP纳米粒的平均粒径为143±3.9nm，平均电位为+2.39±3mV。纳米粒的粒径分布和电位分布(图4A、3B)。
2.3.2iDPP/VSVMP复合物梯度电位变化
制备好不同比例的iDPP/VSVMP复合物，电位变化。由+43±3.9mV转变为-19.7±0.62mV(图4D)。
2.4iDPP纳米粒的细胞毒性检测
为了检测iDPP纳米粒的细胞毒性，我们将其与金标准转染材料PEI 25K的细胞毒性进行比较。在293T细胞中，PEI 25K细胞的毒性都很大，IC50<10μg/mL。而iDPP纳米载体对细胞的毒性要小很多，IC50>200μg/mL(图5A)。
2.5iDPP纳米粒转染B16-F10细胞
同样，我们用iDPP纳米粒转染了B16-F10细胞，并与DPP、PEI 25K进行了比较，选取绿色荧光蛋白质粒(pGFP)作为报告基因。
将转染后的B16-F10细胞置于倒置荧光显微镜下观察，可以看出大部分细胞发出了较强的绿色荧光，表明iDPP纳米粒成功地将GFP质粒传递到了这些细胞中(图5B)。然后将细胞收起行流式细胞术检测，从流式图和统计结果中均可以看出iDPP纳米粒的转染率明显高于DPP的转染率(68.43％±4.87％VS16.43％±5.21％)(图5C)。从这些数据中可以看出，iDPP纳米粒是一种新型靶向非病毒基因载体，具有可降解性、细胞毒性低且转染率高的特征，在基因治疗中有潜在的应用前景。
2.6iDPP/VSVMP复合物在体外对B16-F10细胞的抗肿瘤能力
为了检测iDPP/VSVMP复合物在体外对B16-F10细胞的抗肿瘤能力，我们首先用MTT法检测iDPP/VSVMP复合物是否抑制B16-F10细胞生长(图6A)，可以看出iDPP/VSVMP复合物可以明显抑制肿瘤细胞的生长。当iDPP/VSVMP复合物转染B16-F10细胞48小时后，我们用annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂来检测iDPP/VSVMP复合物是否是通过诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤细胞的生长，通过流式细胞术检测结果，结果见图6B，可以看出在B16-F10细胞中，iDPP/VSVMP实验组、DPP/VSVMP组、iDPP/pVAX空载组、iDPP纳米粒材料组、生理盐水组诱导凋亡细胞百分比分别是36.3％、11.2％、5.3％、4.6％、3.1％，iDPP/VSVMP复合物诱导凋亡细胞数明显高于其他四组(DPP组、空载组、材料组和生理盐水组)。从体外抗肿瘤活性结果可以看出，iDPP纳米粒可以有效地将VSVMP基因质粒有效转染到B16-F10细胞中，通过诱导凋亡从而抑制肿瘤细胞的增殖。
2.7iDPP/VSVMP复合物在体内对B16-F10细胞的抗肿瘤作用
2.7.1iDPP/VSVMP复合物瘤内注射抑制皮下移植瘤的生长
在小鼠B16-F10皮下瘤种植瘤模型中，经瘤内注射进行治疗，并记录肿瘤体积(图7A)，肿瘤体积增长缓慢，能显著抑制肿瘤生长。达到预期实验期间后，将老鼠处死。我们将小鼠皮下瘤取下，并进行肿瘤称重(图7B)。iDPP/VSVMP实验组、DPP/VSVMP组、iDPP/pVAX空载组、iDPP纳米粒材料组、生理盐水组五个组的平均肿瘤重量分别是0.107±0.061g、0.254±0.081、1.018±0.381、0.961±0.329g、1.004±0.308g，实验组的平均肿瘤重量明显低于空载质粒组、材料组和对照组。
2.7.2iDPP/VSVMP复合物尾静脉注射抑制皮下移植瘤的生长
在小鼠B16-F10皮下瘤种植瘤模型中，经小鼠尾静脉注射进行治疗，并记录肿瘤体积。达到预期实验期间后，将老鼠处死。我们将小鼠皮下瘤取下并拍照(图8A)，并进行肿瘤称重(图8B)，静脉注射iDPP/VSVMP复合物可靶向治疗B16-F10皮下瘤，抑制肿瘤生长。
2.7.2iDPP/VSVMP复合物尾静脉注射抑制黑色瘤肺转移
在小鼠B16-F10肺转移肿瘤模型中，经小鼠尾静脉注射进行治疗，达到预期实验期间后，将老鼠处死。我们将小鼠肺取下取下并拍照(图8C)，尾静脉注射iDPP/VSVMP复合物可显著抑制黑色素瘤肺转移，并进行称重(图8D)。
3.前期筛选试验：
3.1在前期的实验过程中，发明人对水溶性iRGD进行修饰
3.1.在前期实验过程中，发明人将mPEG-PLA与DOTAP的重量比定为：99﹕1，90﹕10，85﹕15，80﹕20，70﹕30，60﹕40，iRGD与mPEG-PLA、DOTAP的重量比定为1﹕100，5﹕100，10﹕100，10﹕100，20﹕100制备iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒。然后对这些纳米粒进行细胞转染实验，发现iRGD-DOTAP-mPEG-PLA的原料mPEG-PLA共聚物70～99份、DOTAP 1～30份、CP-iRGD多肽1～10份的比例范围内有较好的转染效率。在此基础上进一步将比例缩小至mPEG-PLA共聚物85～95份、DOTAP 5～15份、CP-iRGD 1～5份比例范围，然后进行细胞转染实验发现在此范围内有更高的转染效率。
3.2.在前期纳米基因药物的制备过程中，将基因在基因药物中的含量定为1％～50％，进行凝胶阻滞分析和细胞转染实验发现，在这个比例范围内基因能够有效结合iDPP纳米粒并有较好的转染效率。
3.3.在前期的基础上，进一步将基因含量缩小至1％～10％，再次进行凝胶阻滞分析和细胞转染实验发现，在这个比例范围内基因能够高效的结合iDPP纳米粒并有更好的转染效率。
3.4.制备纳米粒时，考察了溶解mPEG-PLA、DOTAP和CP-iRGD多肽的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、环己烷等易挥发的溶剂，发现均可使mPEG-PLA、DOTAP和CP-iRGD多肽完全溶解。
3.5.用于水化mPEG-PLA、DOTAP和CP-iRGD多肽混合物的水化溶液可以为双蒸水、去离子水，纯水，生理盐水等，最终均可得到iDPP纳米粒溶液。但优选采用双蒸水为水化溶液。
3.6.制备iDPP纳米粒所需的mPEG-PLA共聚物中，PEG和PLA的分子量比例为1:1，mPEG-PLA的总分子量范围为4000Da～8000Da。
综上，本发明提供了一种新的修饰手段用以修饰mPEG-PLA双嵌段共聚物，发明人采用带正电荷的两亲性物质DOTAP和具有肿瘤靶向作用的CP-iRGD修饰两亲性mPEG-PLA双嵌段共聚物，利用自组装的方法制备出了一种新型的靶向可降解性基因载体，即iRGD-DOTAP-mPEG-PLA阳离子纳米粒。该纳米粒具有良好的DNA结合能力，结合DNA后的iDPP纳米粒成电中性，通过静脉注射的给药方式，可有效地将基因质粒靶向导入到肿瘤细胞中，具有转染率高、细胞毒性低的优点。由iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒制备的iDPP/VSVMP复合物可以显著地抑制肿瘤生长和肿瘤的肺转移。体外体内治疗数据表明，iDPP纳米粒传递VSVMP基因可以在体外和体内有效抑制B16-F10黑色素瘤细胞的生长。在体外和体内有效抑制黑色素瘤细胞的生长。iDPP纳米粒是一种相对安全的可降解性非病毒基因载体，制备所得iDPP/VSVMP复合物为靶向治疗黑色素瘤提供了一种新的思路和潜在的选择。

Claims (10)

1.iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒溶液，其特征在于：按照下述配比关系取原料、溶剂进行制备：
原料：mPEG-PLA共聚物、DOTAP与CP-iRGD多肽的质量配比为：mPEG-PLA共聚物70～99份、DOTAP 1～30份、CP-iRGD 1～5份；
溶剂：二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、环己烷中的至少一种；
水化溶液：双蒸水、去离子水、纯水、生理盐水、葡萄糖溶液中的至少一种；
制备方法：mPEG-PLA共聚物、DOTAP、CP-iRGD多肽分别溶于溶剂中并混匀，然后将溶剂蒸发，加水化溶液水化成所需浓度，所得溶液即为iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒水溶液；
其中，CP-iRGD多肽，结构式如下式Ⅱ：
Figure FDA0003016433730000011
2.根据权利要求1所述的iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒溶液，其特征在于：所述CP-iRGD多肽的制备方法包括以下步骤：
A、以聚乙二醇和硬酯酸为原料反应结束后分离提纯得到C18-PEG-OH；
B、以C18-PEG-OH和Fmoc-苯丙氨酸反应得到C18-PEG-Phe-Fmoc；
C、脱去C18-PEG-Phe-Fmoc保护基Fmoc，得到C18-PEG-Phe-NH2；
D、将C18-PEG-Phe-NH2与3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应得到C18-PEG-BMPS；
E、将C18-PEG-BMPS与iRGD通过马来酰亚胺基团与巯基反应得到目标化合物C18-PEG-iRGD。
3.根据权利要求1或2所述的iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒溶液，其特征在于：mPEG-PLA共聚物、DOTAP与CP-iRGD多肽的质量配比为：mPEG-PLA共聚物85～95份、DOTAP 5～15份、CP-iRGD 1～5份。
4.权利要求1～3任一项所述的iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒溶液的制备方法，其特征在于：mPEG-PLA共聚物、DOTAP、CP-iRGD多肽分别溶于溶剂中并混匀，然后将溶剂蒸发，加水化溶液水化成所需浓度，所得溶液即为iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒水溶液。
5.iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒，其特征在于：由权利要求1～3任一项所述的iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒水溶液干燥得到。
6.iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒复合物，其特征在于：由权利要求5所述的iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒负载基因、化学药物、蛋白质或疫苗得到。
7.iDPP/VSVMP复合物，其特征在于：由权利要求5所述的iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒负载水泡口炎病毒基质蛋白基因质粒得到。
8.权利要求7所述的iDPP/VSVMP复合物的制备方法，其特征在于：包括下述配比关系的原料及辅料：
原料质量配比为：iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒1～99份，VSVMP 1～10份；
渗透压调节剂适量；
溶剂：注射用水、双蒸水、去离子水、纯水或生理盐水中的至少一种；
制备方法如下：
将上述原料及溶剂按照渗透压调节剂、溶剂、iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒和VSVMP依次混合即得iDPP/VSVMP复合物溶液，所得溶液达到生理渗透压。
9.根据权利要求8所述的iDPP/VSVMP复合物的制备方法，其特征在于：原料质量配比为iRGD-DOTAP-mPEG-PLA纳米粒90～99份，VSVMP 1～10份。
10.权利要求7所述的iDPP/VSVMP复合物在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
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