CN111743861B - 靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束及其制备方法 - Google Patents

靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米药剂技术领域，公开了一种靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束及其制备方法。本发明制备方法首先将偶氮苯基团引入羧基聚乙二醇活性酯的分子链中，得到羧基聚乙二醇偶氮苯，然后通过其与羧基右旋聚乳酸的反应制备得羧基聚乙二醇‑偶氮苯‑右旋聚乳酸嵌段共聚物，再引入氨基修饰的核酸适配体AS1411，制备得AS1411修饰的聚乙二醇‑偶氮苯‑右旋聚乳酸，复合脂溶性抗癌药物后透析，得到本发明胶束。本发明提供的低氧响应手性药物胶束粒径小且分布窄，能够有效的滞留在靶向部位；具有低氧响应性，达到了低氧缓释的效果；能靶向TNBC肿瘤，选择性释放抗癌药物，显著提高了抗肿瘤效果。

Description

靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米药剂技术领域，具体涉及一种靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束及其制备方法。
背景技术
乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，而90％的乳腺癌患者死亡是由肿瘤转移引起的。三阴性乳腺癌(TNBC)作为乳腺癌的一种亚型，肿瘤细胞具有很高的转移性和侵袭性，所以它的生存率最差。同时，TNBC的癌细胞群往往因其高侵袭性和自我更新能力，会产生耐药性。这使得游离的药物治疗效果微乎其微，无法根除癌细胞，也无法阻止肿瘤转移进程。
纳米药物载体是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。小于200nm的纳米药物更容易在肿瘤区域积聚，并且由于在小孔密集的肿瘤内皮细胞中渗透性更强，且因保留(EPR)效应而停留更长时间。越来越多的人在EPR效应而被动靶向给药的基础上，研究了将肿瘤分子靶向配体引入纳米药物，从而达到主动靶向。结合了配体的纳米药物有利于药物的高选择性传递，对癌细胞具有更高的药物毒性，从而达到更好的治疗效果。因而，肿瘤靶向聚合物胶束在治疗TNBC中有广阔的应用前景。其中，寡核苷酸适配子具有高特异性和绑定亲和力，可以与多种分子靶标相结合。而且，与抗体相比，适配体具有体外快速筛选、无细胞化学合成、免疫原性低、体积小等优点。在确定了目标特异性适配体之后，可以进行化学合成、修饰和优化，以适应临床应用。事实上，适配体常常应用于靶向肿瘤给药治疗中，AS1411是其中一种应用较多的DNA aptamer，含有26个碱基的序列(5’GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)。它大量重复的G序列可以自发形成四链体，不易被血清中的核酸外切酶水解，大大延长了在血清中的半衰期。除此之外，它还对核仁素具有特异亲和力，从而抑制细胞生长。已有研究证明，AS1411具有广泛地抑制肿瘤细胞增殖的能力，包括乳腺癌、肺癌等。因此，可以进一步推断，经AS1411修饰的抗肿瘤纳米胶束，可以促进对癌细胞的特异性识别，并通过AS1411与核苷的相互作用促进后续的內吞作用，提高疗效，加入AS1411aptamer的纳米胶束，也可以有效清除TNBC肿瘤细胞，抑制肿瘤转移，进一步提高抗肿瘤效应。
肿瘤组织的迅速生长以及内部血流灌注不足都会造成肿瘤的低氧状况，因而低氧是众多实体肿瘤的共同特征。所以，低氧也是是肿瘤的一个主要的治疗靶点。许多具有低氧响应性的纳米载体被应用肿瘤治疗中，取得了很高的治疗效果。偶氮苯衍生物在低氧条件下通过电子转移过程被还原为苯胺。因此，偶氮键可引入到两亲性聚合物中，用来制备具有低氧响应性的聚合物胶束。但是，目前基于偶氮低氧反应的药物载体研究很少，需要我们设计出有效的基于偶氮低氧反应响应性纳米载体，以应对传统肿瘤治疗中遇到的低氧环境的挑战。
手性在自然界中广泛存在，赋予具有相同元素组成但镜像不能重合的材料不同的生物、化学、机械和光学性质。手性在生物系统中广泛存在，如蛋白中的氨基酸几乎都为L型，而核酸、淀粉、纤维素中的糖几乎都为D型。由于生物系统的功能通常与其物理结构密切相关，手性在纳米医学中也可发挥重要作用。在热力学上，与L-纳米载体相比，D-纳米载体对磷脂和胆固醇组成的脂质层表现出更稳定的粘附。而在体内，D-纳米载体表现出更高的稳定性和更长的生物半衰期。可以认为，在纳米系统中加入D-手性可以增强癌细胞的摄取能力，使药物更容易进入细胞，并延长纳米药物在体内循环的稳定性，从而达到更好的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束及其制备方法，该胶束可以增强癌细胞对药物的摄取能力，提高药物利用率，同时可以靶向三阴性乳腺癌，在肿瘤低氧环境下释放药物。
为了解决以上技术问题，本发明公开一种靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束的制备方法，具体步骤如下：
1)将相对分子质量为1000～5000的羧基聚乙二醇活性酯溶于二氯甲烷内，再加入4,4-偶氮二苯胺，常温避光搅拌反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，再利用冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到式(Ⅰ)所示的羧基聚乙二醇偶氮苯：
Figure BDA0002585447470000021
其中，n为聚合度，16≤n≤83；
2)将相对分子质量为1000～3000的羧基右旋聚乳酸溶于二氯甲烷内，依次加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，常温搅拌反应30min后，加入步骤1)得到的羧基聚乙二醇偶氮苯，在常温避光搅拌下反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，再利用冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到如式(Ⅱ)所示的羧基聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物：
Figure BDA0002585447470000022
其中，n为聚合度，16≤n≤83；m为聚合度，11≤m≤56；
3)将步骤2)得到的羧基聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物溶于二氯甲烷中，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，避光常温搅拌30min后，加入氨基修饰的核酸适配体AS1411，避光反应24h，将反应得到的反应液浓缩，再用冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到如式(III)所示的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物：
Figure BDA0002585447470000023
4)将步骤3)得到的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物与脂溶性抗癌药物溶于二甲基亚砜，在避光磁力搅拌条件下，缓慢滴加纯水，搅拌2h后得混合溶液，再将所述混合溶液转移至透析袋中，纯水透析24h，透析期间换水2-3次，得到靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束。
优选的，步骤1)中所述羧基聚乙二醇活性酯与4,4-偶氮二苯胺的摩尔比为1：1.3。
优选的，步骤2)中所述羧基聚乙二醇偶氮苯、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和羧基右旋聚乳酸摩尔比为1：2：2.3：1.3。
优选的，步骤3)中所述羧基聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和氨基修饰的核酸适配体AS1411的摩尔比为1：2：2.3：1.1。
优选的，步骤4)中所述脂溶性抗癌药物为阿霉素、多西紫杉醇和喜树碱中的一种，所述AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物与所述脂溶性抗癌药物的质量比为4：(0.8～1.5)。
优选的，步骤4)中所述透析袋的截留分子量为3000～4000。
优选的，步骤4)所述混合溶液中：所述AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物与所述纯水的质量体积比为20mg：10mL。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到一种靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束，所述靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束的水合粒径为100～200nm。
本发明靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束的结构示意如图1所示，由图1可知，该聚合物胶束以右旋聚乳酸做为疏水性内核，聚乙二醇分子组成亲水性的外壳，中心包裹有脂溶性抗癌药物，其中聚乙二醇分子和右旋聚乳酸通过偶氮苯分子的偶氮官能团相连接，聚合物胶束的表面连接了具有肿瘤靶向性的核酸适配体AS1411。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明在纳米载药系统中引入右旋聚乳酸(D-手性分子)，增强了癌细胞的摄取能力，使药物更容易进入细胞，并延长了纳米药物在体内循环的稳定性，从而提高药物利用率；另外，本发明还引入偶氮苯基团，让胶束具有了低氧响应性，药物可以在肿瘤低氧环境下释放，达到低氧缓释的效果；引入核酸适配体AS1411，让胶束拥有对癌细胞的特异性识别能力，能够靶向TNBC肿瘤，选择性释放抗癌药物，显著提高抗肿瘤效果。
2、本发明胶束水合粒径为100～200nm，由于粒径小且粒径分布窄，故其能够有效的滞留在靶向部位，延长了药物在血液里的循环时间，提高了药物的生物利用度。
附图说明
图1为本发明靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束的结构示意图；
图2为实施例2提供的空载的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束的粒径图；
图3为实施例3-2提供的负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-AS1411-HR-D-PMs)、实施例3-4提供的负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-AS1411-D-PMs)、实施例3-5提供的负载阿霉素的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-D-PMs)和实施例3-6提供的负载阿霉素的聚乙二醇-左旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-L-PMs)在低氧和常氧条件下的阿霉素释放曲线；
图4为实施例3-2提供的负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-AS1411-HR-D-PMs)、实施例3-4提供的负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-AS1411-D-PMs)、实施例3-5提供的负载阿霉素的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-D-PMs)和实施例3-6提供的负载阿霉素的聚乙二醇-左旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-L-PMs)分别与4T-1细胞共孵育2小时后，4T-1细胞的Dox平均荧光强度的统计图；
图5为利用PBS和游离Dox与实施例3-2提供的负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-AS1411-HR-D-PMs)，实施例3-4提供的负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-AS1411-D-PMs)，实施例3-5提供的负载阿霉素的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-D-PMs)和实施例3-6提供的负载阿霉素的聚乙二醇-左旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-L-PMs)来对患有原位自发性乳腺癌转移小鼠进行治疗的小鼠肿瘤体积生长图；
图6为利用PBS和游离Dox与实施例3-2提供的负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-AS1411-HR-D-PMs)，实施例3-4提供的负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-AS1411-D-PMs)，实施例3-5提供的负载阿霉素的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-D-PMs)和实施例3-6提供的负载阿霉素的聚乙二醇-左旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-L-PMs)对患有原位自发性乳腺癌转移小鼠进行治疗的小鼠生存率曲线图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明一种靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物聚合物胶束及其制备方法进行具体描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
实施例1-1
AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物的制备：
(1)将50mg(1当量)羧基聚乙二醇活性酯(COOH-PEG-NHS，MW＝1000)溶于6mL二氯甲烷中，加入6.8mg(1.3当量)的4,4-偶氮二苯胺(AZO)，常温避光搅拌下反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，加入25mL冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到羧基聚乙二醇偶氮苯(COOH-PEG-AZO-NH2)；
(2)取50mg(1.3当量)羧基右旋聚乳酸(COOH-PDLA，MW＝2000)溶于5mL二氯甲烷，依次加入8mg(2当量)二环己基碳二亚胺(DCC)和5mg(2.3当量)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，常温搅拌下反应30min后，再加入41mg(1当量)羧基聚乙二醇偶氮苯(COOH-PEG-AZO-NH2)，常温避光搅拌下反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，加入25mL冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到羧基聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物(COOH-PEG-AZO-PDLA)；
(3)取50mg(1当量)步骤(2)得到的羧基聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物(COOH-PEG-AZO-PDLA)溶于5mL二氯甲烷中，依次加入4.6mg(2当量)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和3.2mg(2.3当量)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，常温避光反应30min，再加入13uL的浓度为0.1mmol/mL(1.1当量)的氨基修饰的核酸适配体AS1411(5’-NH2-AS1411)，常温避光反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，再加入25mL冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物(AS1411-PEG-AZO-PDLA)。
实施例1-2
AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物的制备：
将实施例1-1的步骤(1)中羧基聚乙二醇活性酯(COOH-PEG-NHS，MW＝1000)替换为羧基聚乙二醇活性酯(COOH-PEG-NHS，MW＝2000)，再根据实施例1-1的步骤(2)和步骤(3)制备得到AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物(AS1411-PEG-AZO-PDLA)。
实施例1-3
AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物的制备：
将实施例1-1的步骤(1)中羧基聚乙二醇活性酯(COOH-PEG-NHS，MW＝1000)替换为羧基聚乙二醇活性酯(COOH-PEG-NHS，MW＝5000)，再根据实施例1-1的步骤(2)和步骤(3)制备得到AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物(AS1411-PEG-AZO-PDLA)。
实施例2
空载的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束的制备：
取20mg实施例1-1得到的AS1411-PEG-AZO-PDLA溶于2mL的二甲基亚砜，在避光磁力搅拌条件下，缓慢滴加10mL纯水，搅拌2h后得混合溶液，再将混合溶液转移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析24h(期间换水2-3次)，得到空载的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束(AS1411-HR-D-PMs)。
测试得到的空载的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束的粒径，结果如图2所示，由图2可知，该聚合物胶束的粒径在100～200纳米之间，聚合物胶束构建成功。
实施例3-1
负载多西他赛的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束的制备：
取20mg实施例1-1得到的AS1411-PEG-AZO-PDLA，混合4mg多西他赛溶于2mL的二甲基亚砜，在避光磁力搅拌条件下，缓慢滴加10mL纯水，搅拌2h后得混合溶液，再将混合溶液转移至透析袋(MW＝4000)中，纯水透析24h(期间换水2-3次)，得到负载多西他赛的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束(DTX-AS1411-HR-D-PMs)。
实施例3-2
负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束的制备：
取20mg实施例1-1得到的AS1411-PEG-AZO-PDLA，混合6mg阿霉素溶于2mL的二甲基亚砜，在避光磁力搅拌条件下，缓慢滴加10mL纯水，搅拌2h后得混合溶液，再将混合溶液转移至透析袋(MW＝4000)中，纯水透析24h(期间换水2-3次)，得到负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-AS1411-HR-D-PMs)。
实施例3-3
负载喜树碱的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束的制备：
取20mg实施例1-1得到的AS1411-PEG-AZO-PDLA，混合7.5mg喜树碱溶于2mL的二甲基亚砜，在避光磁力搅拌条件下，缓慢滴加10mL纯水，搅拌2h后得混合溶液，再将混合溶液转移至透析袋(MW＝4000)中，纯水透析24h(期间换水2-3次)，得到负载喜树碱的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸聚合物胶束(CPT-AS1411-HR-D-PMs)。
实施例3-4
负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束的制备：
(1)将50mg(1.3当量)羧基右旋聚乳酸(COOH-PDLA，MW＝2000)溶于5mL二氯甲烷，依次加入8mg(2当量)二环己基碳二亚胺(DCC)和5mg(2.3当量)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，常温搅拌下反应30min后，再加入41mg(1当量)羧基聚乙二醇氨基(COOH-PEG-NH2)，常温避光搅拌下反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，再加入25mL冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到羧基聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物(COOH-PEG-PDLA)；
(2)取50mg(1当量)步骤(1)得到的羧基聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物(COOH-PEG-PDLA)溶于5mL二氯甲烷中，依次加入4.8mg(2当量)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和3.3mg(2.3当量)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，常温避光反应30min，再加入14uL的浓度为0.1mmol/mL的氨基修饰的核酸适配体AS1411(5’-NH2-AS1411)，常温避光反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，加入25mL冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到AS1411修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物(AS1411-PEG-PDLA)；
(3)取20mg步骤(2)得到的AS1411-PEG-PDLA，混合4mg阿霉素溶于2mL的二甲基亚砜，在避光磁力搅拌条件下，缓慢滴加10mL纯水，搅拌2h后得混合溶液，再将混合溶液转移至透析袋(MW＝4000)中，纯水透析24h(期间换水2-3次)，得到负载阿霉素的AS1411修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-AS1411-D-PMs)。
实施例3-5
负载阿霉素的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束的制备：
(1)将50mg(1.3当量)羧基右旋聚乳酸(COOH-PDLA，MW＝2000)溶于6mL二氯甲烷，依次加入8mg(2当量)二环己基碳二亚胺(DCC)和5mg(2.3当量)甲苯磺酸盐(DPTS)，室温磁力搅拌30min后，加入39mg(1当量)羟基聚乙二醇(PEG-OH，MW＝2000)，常温搅拌下反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，再加入25mL冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物(PEG-PDLA)。
(2)取20mg步骤(1)得到的PEG-PDLA，混合6mg阿霉素溶于2mL的二甲基亚砜，在避光磁力搅拌条件下，缓慢滴加10mL纯水，搅拌2h后得混合溶液，再将混合溶液转移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析24h(期间换水2-3次)，得到负载阿霉素的聚乙二醇-右旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-D-PMs)。
实施例3-6
负载阿霉素的聚乙二醇-左旋聚乳酸聚合物胶束的制备：
(1)将50mg(1.3当量)羧基左旋聚乳酸(COOH-PLLA，MW＝2000)溶于6mL二氯甲烷中，依次加入8mg(2当量)二环己基碳二亚胺(DCC)和5mg(2.3当量)甲苯磺酸盐(DPTS)，室温下磁力搅拌30min后，加入39mg(1当量)羟基聚乙二醇(PEG-OH，MW＝2000)，常温搅拌下反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，再加入25mL冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到聚乙二醇-左旋聚乳酸嵌段共聚物(Dox-L-PMs)。
(2)取20mg步骤(1)得到的PEG-PLLA，混合7.5mg阿霉素溶于2mL的二甲基亚砜，在避光磁力搅拌条件下，缓慢滴加10mL纯水，搅拌2h后得混合溶液，再将混合溶液转移至透析袋(MW＝3000)中，纯水透析24h(期间换水2-3次)，得到负载阿霉素的聚乙二醇-左旋聚乳酸聚合物胶束(Dox-L-PMs)。
实施例4
Dox-AS1411-HR-D-PMs，Dox-AS1411-D-PMs，Dox-D-PMs和Dox-L-PMs分别在常氧和低氧条件下的药物释放曲线测定：
分别以实施例3-2得到的Dox-AS1411-HR-D-PMs、实施例3-4得到的Dox-AS1411-D-PMs、实施例3-5得到的Dox-D-PMs和实施例3-6得到的Dox-L-PMs作为溶质，利用0.01M PBS配制Dox浓度为100ug/mL的药物溶液共4组(每组有2份药物溶液，每份药物溶液有10mL)，再分别于每组药物溶液中加入1ug Na2S2O4混匀后，分别转移至试管内，每组的一份药物溶液置于低氧条件(37℃，5％CO2，1％O2)下静置，另一份药物溶液置于常氧条件(37℃，5％CO2，20％O2)下静置，在静置时间为0.5h，1h，2h，4h，6h，12h和24h时，取出各试管内的上清液200uL，每次取出200uL的上清液的同时，补充200uL的0.01M PBS溶液，使整个试管内的体积保持不变。然后用HPLC测上清液中Dox的含量，计算出DOX释放的累积百分数，并作出Dox释放的曲线图。Dox释放曲线图如图3所示，根据图3可以发现，在低氧条件下，加入Na2S2O4后，含有AZO的Dox-AS1411-HR-D-PMs的药物释放量明显高于其在常氧下的药物释放量，表明低氧条件下AZO被还原，Dox-AS1411-HR-D-PMs具有低氧响应性，药物能够有效释放。然而不含有AZO的Dox-AS1411-D-PMs、Dox-D-PMs和Dox-L-PMs，不论是在常氧还是低氧的条件下，Dox的释放量并没有明显变化，不具有低氧响应性。
实施例5
利用共聚焦显微镜观察4T-1细胞对实施例3-2得到的Dox-AS1411-HR-D-PMs、实施例3-4得到的Dox-AS1411-D-PMs、实施例3-5得到的Dox-D-PMs和实施例3-6得到的Dox-L-PMs的摄取的差异：
在4个玻底小皿中都分别接种1.5×105个4T-1细胞(其中玻底培养液为2mL)，轻振摇晃，使细胞均匀铺满皿底，观察玻璃皿底，待细胞铺满皿底百分之八十左右后，吸出培养液，用PBS洗涤三次玻底小皿后，再分别加入以0.01M PBS为溶剂配制的Dox浓度为5ug/mL的Dox-AS1411-HR-D-PMs、Dox-AS1411-D-PMs、Dox-D-PMs和Dox-L-PMs药物溶液2mL，共孵育2h后，吸出药物溶液，用PBS洗涤三次玻底小皿后，加入培养基，共聚焦显微镜下观察玻璃皿底。在相同参数设置下，每个玻底拍摄五个不同Dox细胞摄取区域，利用Image J软件计算Dox平均荧光强度，然后再利用软件GraphPad Prism 7.0进行统计分析比较，并作出图4。由图4可知，Dox-D-PMs比Dox-L-PMs表现出了更高的荧光强度，说明了D-手性可以增强癌细胞的摄取能力；同时Dox-AS1411-HR-D-PMs和Dox-AS1411-D-PMs的荧光强度更强，说明这两种聚合物胶束对肿瘤细胞有靶向性，能进一步促进药物靶向释放，具有更好的抗癌疗效。
实施例6
利用实施例3-2得到的Dox-AS1411-HR-D-PMs、实施例3-4得到的Dox-AS1411-D-PMs、实施例3-5得到的Dox-D-PMs和实施例3-6得到的Dox-L-PMs来对患有原位自发性乳腺癌转移小鼠进行治疗，具体实施方案如下：
利用BALB/c小鼠建造原位自发性乳腺癌转移的小鼠模型：4T1细胞用胰蛋白酶消化后，用0.01M PBS配置成2x107cells/mL的细胞悬液，放置冰上备用。将小鼠用10％水合氯醛麻醉后，固定小鼠，用酒精擦拭小鼠乳腺脂肪垫的位置，然后在小鼠乳腺脂肪垫下注射200uL准备好的细胞悬液，再将小鼠放回笼内，进行观察，当小鼠在乳腺位置长出凸块，可视为造模成功。
将造模成功的原位自发性乳腺癌转移小鼠随机分为5组，每组6只，造模第7天各组分别以5mg Dox/kg体重的给药剂量尾静脉注射以下药物溶液：PBS、Dox、Dox-AS1411-HR-D-PMs、Dox-AS1411-D-PMs，Dox-D-PMs和Dox-L-PMs；每4天给药一次。通过每五天监测小鼠的肿瘤体积来评估不同剂型的治疗效果，并且观察不同治疗组小鼠生存情况来进一步验证疗效，小鼠肿瘤体积生长情况见图5，小鼠生存情况见图6。由图5可知，给予原位自发性乳腺癌转移小鼠不同药物治疗后，采用Dox-AS1411-HR-D-PMs治疗的肿瘤生长最为缓慢，说明其抗肿瘤效果最好。由图6的生存率曲线图可发现，采用Dox-AS1411-HR-D-PMs治疗的小鼠生存率最高。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将相对分子质量为1000～5000的羧基聚乙二醇活性酯溶于二氯甲烷内，再加入4,4-偶氮二苯胺，常温避光搅拌反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，再利用冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到式(Ⅰ)所示的羧基聚乙二醇偶氮苯：
Figure FDA0002585447460000011
其中，n为聚合度，16≤n≤83；
2)将相对分子质量为1000～3000的羧基右旋聚乳酸溶于二氯甲烷内，依次加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，常温搅拌反应30min后，加入步骤1)得到的羧基聚乙二醇偶氮苯，在常温避光搅拌下反应24h后，将反应得到的反应液浓缩，再利用冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到如式(Ⅱ)所示的羧基聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物：
Figure FDA0002585447460000012
其中，n为聚合度，16≤n≤83；m为聚合度，11≤m≤56；
3)将步骤2)得到的羧基聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物溶于二氯甲烷中，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，避光常温搅拌30min后，加入氨基修饰的核酸适配体AS1411，避光反应24h，将反应得到的反应液浓缩，再用冰乙醚提纯，静置过夜后离心，将离心得到的沉淀干燥，得到如式(III)所示的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物：
Figure FDA0002585447460000013
4)将步骤3)得到的AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物与脂溶性抗癌药物溶于二甲基亚砜，在避光磁力搅拌条件下，缓慢滴加纯水，搅拌2h后得混合溶液，再将所述混合溶液转移至透析袋中，纯水透析24h，透析期间换水2-3次，得到靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述羧基聚乙二醇活性酯与4,4-偶氮二苯胺的摩尔比为1：1.3。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述羧基聚乙二醇偶氮苯、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和羧基右旋聚乳酸摩尔比为1：2：2.3：1.3。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述羧基聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和氨基修饰的核酸适配体AS1411的摩尔比为1：2：2.3：1.1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述脂溶性抗癌药物为阿霉素、多西紫杉醇和喜树碱中的一种，所述AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物与所述脂溶性抗癌药物的质量比为4：(0.8～1.5)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述透析袋的截留分子量为3000～4000。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述混合溶液中：所述AS1411修饰的聚乙二醇-偶氮苯-右旋聚乳酸嵌段共聚物与所述纯水的质量体积比为20mg：10mL。
8.根据权利要求1～7任意一项所述制备方法制备得到的 一种靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束，其特征在于，所述靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束的水合粒径为100～200nm。
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