CN102260356B - 一种用作基因载体的壳聚糖衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物及其制备方法和用途。所述壳聚糖衍生物是通过将N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化铵基团引入到壳聚糖的6位上而合成，其结构式如下。其中，n为壳聚糖衍生物重复单元的个数。本发明的壳聚糖衍生物既保留了2位氨基在基因输送过程中的功效，保留了壳聚糖无毒、生物相容性高的特性，又大大提高壳聚糖的水溶性，提高壳聚糖的基因转染效率，用该壳聚糖衍生物制备的基因非病毒载体具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。

Description

一种用作基因载体的壳聚糖衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖衍生物及其制备方法和用途，具体涉及一种用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物及其制备方法和用途，还涉及由该壳聚糖衍生物与核酸所构成的纳米复合物及其制备方法和用途。

背景技术

随着生物工程技术的发展，近年来越来越多的生物大分子药物(如蛋白质、多肽和核酸等)都应用于临床。该类药物生物活性强，剂量小，治疗指数高，已经成为临床上十分重要的一类药物。特别是用于基因治疗的核酸类药物，不仅具有高效、长疗、副作用少的特点，而且能使治疗基因在细胞内长期稳定表达治疗蛋白。

目前，基因药物载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体(如各种逆转录病毒、腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等)，虽然转染效率高，但存在着对外源基因的容纳量少(约4.5-30kbp)、稳定性差、会引起安全性问题等诸多缺点。而非病毒载体因其安全可靠、稳定、对外源基因的容纳量大、不会引起免疫系统反应及易于生产等优势而备受关注。遗憾的是，非病毒载体的转染效率比病毒载体的低得多，而且基因表达时间短。因此，寻找新型的高转染效率的基因非病毒载体已成为基因治疗研究领域最为迫切并具挑战性的课题之一。

壳聚糖(化学名：β-(1，4)-2-氨基-2-脱氧氨基-D-葡萄糖)是甲壳素的脱乙酰产物，也是目前发现的唯一一种天然碱性多糖。它既可生物合成，又可生物降解，与动物的器官组织及细胞有良好的生物相容性，无毒，降解过程中产生的低分子寡聚糖在体内不积累，几乎无免疫原性。近十多年来，研究表明，壳聚糖具有多种生物活性，在医药领域具有广阔的应用前景，如其能在粘膜表面打开细胞间紧密连接的接口；并且由于其本身带有正电，能和带负电的细胞膜发生静电作用，从而增强药物对小肠上皮细胞的渗透性，进而用作多肽和蛋白类药物鼻腔或粘膜给药的渗透促进剂；壳聚糖分子中的氨基、羟基还可与粘液中的糖蛋白形成氢键而产生粘附作用，从而延长药物在体内特定区域的滞留时间，提高药物的生物利用度，因此可用作疫苗给药的粘附剂；此外，壳聚糖还可制备成微粒制剂、混合胶体和包衣制剂或形成自身聚集体，这些形式都能在一定程度上避免胃肠道pH环境和酶对生物大分子药物的降解，提高生物利用度，用作蛋白多肽类药物的载体；特别是由于肿瘤细胞表面带负电，带正电的壳聚糖纳米粒能吸附到肿瘤细胞表面使电荷中和，作为抗肿瘤药物载体则更利于抑制肿瘤细胞的生长。

随着对壳聚糖应用研究的不断深入和发展，壳聚糖作为基因载体的有效性逐渐得到了肯定，壳聚糖与DNA形成纳米复合物后容易进入细胞内，且对DNA有保护作用。但用没有任何修饰的壳聚糖，转染效率非常低，而且高分子量的壳聚糖水溶性差，不利于提高转染效率，所以要对其进行一定的化学修饰。在壳聚糖结构的2位上有活泼的氨基，易于化学修饰，因此目前绝大多数文献均采用在壳聚糖2位氨基上引入多功能基团的办法来提高壳聚糖的水溶性，增加其转染效果。但壳聚糖的2位氨基在基因输送过程中发挥着极其重要的作用，因此需要既能保留壳聚糖的2位氨基，又能对壳聚糖进行结构修饰，提高壳聚糖转染效果。

2001年，诺贝尔化学奖获得者Sharpless提出“Click”化学反应。其中最为典型的反应之一就是将末端带有炔基和叠氮基团的单体通过高选择性环合耦联后形成带有三唑环结构的化合物。该反应快速、高效且具有高选择性，已被广泛用于合成各种材料。

发明内容

基于上述研究背景，本发明人利用“Click”反应将N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化铵基团选择性地引入到壳聚糖(Chitosan，Cs)的6位上，合成N，N，N-三甲基三唑壳聚糖(TCs)。本发明的壳聚糖衍生物既能保留Cs的2位氨基的功能，又能增加Cs的溶解性，提高Cs的正电性，从而增加Cs的DNA压缩功能，提高Cs转染效率。此外，由Click反应产生的三唑基团跟DNA具有强结合能力，可提高壳聚糖衍生物/DNA纳米复合物的稳定性。

因此，本发明的目的在于提供一种高效低毒的用作非病毒基因载体的新型壳聚糖衍生物及其制备方法和用途。本发明的另一目的在于提供由该壳聚糖衍生物与DNA所构成的纳米复合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物，其结构式如下：

式中，n为壳聚糖衍生物的重复单元的个数。

本发明的壳聚糖衍生物可以通过以下方法制备，反应式如下：

其中，n为壳聚糖衍生物的重复单元的个数；

R为氨基的保护基，可为邻苯二甲酰基；

反应式中，1为壳聚糖的结构式；2为氨基保护的壳聚糖；3为溴化的氨基保护的壳聚糖；4为叠氮化的氨基保护的壳聚糖；5为氨基保护的N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化铵基团取代的壳聚糖；6为N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化铵基团取代的壳聚糖。

本发明的壳聚糖衍生物的合成方法，包括如下步骤：

步骤(a)：称取壳聚糖1，对其氨基进行保护，得到氨基保护的壳聚糖产物2；

步骤(b)：将(a)步骤所得的产物2的6位羟基进行溴代反应(例如1～5小时)，得到产物3；

步骤(c)：将(b)步骤所得的产物3的6位溴进行叠氮基取代，得到产物4；

步骤(d)：将(c)步骤所得的产物4与炔丙基N，N，N-三甲基溴化铵在无水CuSO₄和维生素C钠盐催化下进行Click反应，得到产物5；其中炔丙基N，N，N-三甲基溴化铵由三甲胺和丙炔溴反应得到；

步骤(e)：将(d)步骤所得的产物5进行氨基的脱保护，得到产物6。

本发明中，作为用于合成新型壳聚糖衍生物的原料的Cs的重均分子量为10-1000千道尔顿。

更具体地，本发明的壳聚糖衍生物的合成方法如下：

步骤(a)：称取壳聚糖1，在二甲基甲酰胺(DMF)中溶胀过夜；过滤，滤饼复分散于DMF中，加入邻苯二甲酸酐，120℃反应，反应完毕后，在冰水中析出浅黄色沉淀物，过滤，滤饼冲洗，干燥，得到产物2；

步骤(b)：将(a)步骤所得的产物2溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)和三苯基膦(TPP)，80℃反应，反应完毕后，在冰水中析出褐色沉淀物，过滤，滤饼冲洗，干燥，得到产物3；

步骤(c)：将(b)步骤所得的产物3溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，加入叠氮钠，80℃反应，反应完毕后，在冰乙醇中析出褐色沉淀物，过滤，滤饼冲洗，干燥，得到产物4；

步骤(d)：将(c)步骤所得的产物4溶于DMF中，加入炔丙基N，N，N-三甲基溴化铵，将无水CuSO₄溶于水中，混合两溶液，放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中，充N₂保护，放入50℃油浴中，边搅拌边用逐滴加入溶于水的维生素C钠盐，50℃恒温反应过夜；反应完毕后，在冰乙醇中析出褐色沉淀，离心分离，用洗涤，离心，干燥，得到产物5；其中炔丙基N，N，N-三甲基溴化铵由三甲胺和丙炔溴反应得到；

步骤(e)：将(d)步骤所得的产物5分散于一水合肼/水混合溶剂中，100℃反应，反应完毕后，在冰乙醇中析出黄色沉淀，离心分离，洗涤，离心，干燥，得到产物6。

本发明中，所述的用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物的重均分子量为5-1000千道尔顿。

本发明中，所述的用作非病毒型基因载体的新型壳聚糖衍生物中，所述N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化铵基团的取代度为10％～100％。

本发明中，所述壳聚糖衍生物可以与核酸自组装形成纳米复合物，所述的核酸可以是含有编码遗传标记的质粒DNA序列，所述的遗传标记可为绿色荧光蛋白基因。

此外，本发明提供了一种高效低毒的由所述壳聚糖衍生物和DNA所构成的纳米复合物及其制备方法。该方法包括：将本发明的壳聚糖衍生物和质粒DNA分别用去离子水溶解，混合，室温静置，壳聚糖衍生物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。具体步骤为：将本发明的壳聚糖衍生物用去离子水溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液；将质粒DNA用去离子水溶解，配成0.1～0.2毫克/毫升的溶液；按壳聚糖衍生物与质粒DNA溶液体积比1∶1在涡旋混合仪上混合30秒，室温静置0.5～1小时，壳聚糖衍生物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。

本发明的壳聚糖衍生物/核酸纳米复合物可用于将核酸递送到细胞中。

本发明的用作非病毒基因载体壳聚糖衍生物与核酸形成的纳米复合物体外转染细胞的方法步骤为：将制备好的纳米复合物转染人胚肾细胞(HumanEpidermal Kidney)HEK 293或人乳腺癌细胞MDA-MB-468，细胞培养48小时后，在荧光显微镜下观察转染结果，若细胞发出绿色荧光，即为转染成功。

本发明通过凝胶阻滞实验验证了载体(即，本发明的壳聚糖衍生物)对质粒DNA的包载效果。

本发明测试了载体(即，本发明的壳聚糖衍生物)的细胞毒性。用MTT法测定载体的细胞毒性。

本发明所述的新型壳聚糖衍生物，2位含有伯胺基团，带有正电荷，能有效压缩DNA；6位上含有N，N，N-三甲基基团，能有效增加壳聚糖的水溶性，并且进一步提高壳聚糖的正电荷，能更有效压缩DNA；6位上的三唑基团与DNA具有强结合能力，可提高壳聚糖衍生物/DNA纳米复合物的稳定性；壳聚糖本身主链结构中含有糖苷键能在生理环境下水解，具有很好的生物相容性。因此，本发明的壳聚糖衍生物既保留了2位氨基在基因输送过程中的功效，保留了壳聚糖无毒、生物相容性高的特性，又大大提高壳聚糖的水溶性，提高壳聚糖的基因转染效率，用该壳聚糖衍生物制备的基因非病毒载体具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。

附图说明

图1为本发明实施例3中凝胶阻滞实验电泳图片；

图2为本发明实施例4中细胞毒性实验结果示意图；以及

图3为本发明实施例5中体外转染实验结果照片。

具体实施方式

下面，将通过实施例，对本发明进行进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例，在本发明权利要求所阐明的范围内，可进行各种改变或等同替换。

实施例1壳聚糖衍生物的合成方法

壳聚糖(Cs)原料购自上海伯奥生物科技有限公司，分子量为60千道尔顿，脱乙酰化度为90％。具体合成方法为：

步骤(a)：称取Cs 2.5克，在250毫升二甲基甲酰胺(DMF)中溶胀过夜。过滤，滤饼复分散于100毫升DMF中，加入7克邻苯二甲酸酐，120℃反应10小时至反应液完全澄清。反应完毕后，将反应液倒入冰水中析出浅黄色沉淀物，过滤，滤饼用乙醚冲洗，干燥，得到产物(¹³C NMR：δ22.5，57.8，61.5，71.3，75.9，83.0，101.0，131.4，168.08ppm.)。

步骤(b)：称取(a)步骤所得的产物1克，溶于100毫升N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，加入6.5克N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)和9.5克三苯基膦(TPP)，80℃反应1小时。Cs的6位羟基溴化程度随反应时间增加而上升。反应完毕后，在冰水中析出褐色沉淀物，过滤，滤饼用乙醇、丙酮冲洗，干燥，得到产物(¹³C NMR：δ33.5，57.2，67.5，71.6，79.0，95.9，123.0，131.2，134.3，167.6.)。

步骤(c)：称取(b)步骤所得的产物1克溶于NMP中，加入叠氮钠1.8克，80℃反应4小时，反应完毕后，在冰乙醇中析出褐色沉淀物，过滤，滤饼用乙醇、水冲洗，干燥，得到产物(¹³C NMR：δ50.1，57.2，68.0，72.5，77.9，96.5，122.8，131.1，134.3，167.5.)。

步骤(d)：称取(c)步骤所得的产物150毫克，溶于DMF中，加入172毫克炔丙基N，N，N-三甲基溴化铵，将16毫克无水CuSO₄溶于水中，混合两溶液，放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中，充N₂保护，放入50℃油浴中，边搅拌边用一细针筒逐滴加入40毫克溶于水的维生素C钠盐，50℃恒温反应过夜。反应完毕后，在冰乙醇中析出褐色沉淀，离心分离，用乙醇、水洗涤，离心，干燥，得到产物。

其中，炔丙基N，N，N-三甲基溴化铵的合成步骤为：将2毫升三甲胺和1.13克丙炔溴在乙腈中-20℃反应2小时后常温反应过夜，反应完毕后减压除乙腈，即得。¹H NMR：4.76-4.81(m，2H)，4.38(bs，1H)，3.29(s，9H)。

步骤(e)：将(d)步骤所得的产物100毫克分散于一水合肼/水混合溶剂(4毫升，V/V为1∶1)中，100℃反应10小时，反应完毕后，在冰乙醇中析出黄色沉淀，离心分离，用乙醇洗涤，离心，干燥，得到产物(¹H NMR：8.5(s，2H)，4.7-4.9(m，8H)，4.7(s，2H)，3.5-3.9(m，32H)3.2(s，9H)，2.78(s，7H)，2.1(s，1H)。

本发明的壳聚糖衍生物的重均分子量随壳聚糖原料重均分子量改变而改变。

根据步骤(b)中的溴代反应时间，可调节壳聚糖衍生物的溴化程度，进而调节N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化铵基团的取代度。N，N，N-三甲基三唑基团的取代度随溴化反应时间的变化趋势见表1。溴化程度通过反应步骤(b)所得各产物的¹³C NMR谱图峰面积进行计算，N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化铵基团取代度通过终产物的¹H NMR谱图峰面积进行计算。

表1 N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化铵基团取代度变化趋势表

从表1可以看出，随着溴化反应时间延长，壳聚糖6位羟基被溴代程度增加，当反应时间经4小时后，6位羟基可完全被溴代。

实施例2壳聚糖衍生物/核酸纳米复合物的制备

将壳聚糖衍生物(由实施例1制备得到(取代度12.5％))用去离子水溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液；质粒DNA(为含有绿色荧光蛋白基因的质粒DNA，质粒编号为pEGFP-N1 vector，GenBank Accession#U55762)用去离子水溶解，得到浓度为0.2毫克/毫升的DNA溶液；按壳聚糖衍生物与质粒DNA溶液体积比1∶1在涡旋混合仪上混合30秒，室温静置0.5～1小时，壳聚糖衍生物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。

实施例3凝胶阻滞实验

按实施例2的方法，制得一系列不同N/P比的壳聚糖衍生物(取代度12.5％)和质粒DNA纳米复合物。分别取每种配比的样品20微升，用10微升纯质粒作参照，1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，经凝胶成像系统(UVP公司Bioimaging Systems)拍摄。结果如图1所示。

图1中，第一电泳道为纯质粒对照，第二到第七道分别为壳聚糖衍生物与质粒DNA的N/P比为0.5、0.8、1.2、5、10、20。从图1中可以看出，壳聚糖衍生物可以很好地压缩DNA，在N/P大于1时即可完全阻滞DNA的迁移。

实施例4 细胞毒性实验

以人胚肾细胞HEK 293细胞和人乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞为测试细胞系(细胞购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))。

HEK 293细胞培养方法：取出液氮中冻存的细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入15mL离心管中，加5mL 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入2mL DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加6mL DMEM完全培养液，将培养皿置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。

MDA-MB-468细胞培养方法：取出液氮中冻存的细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入15mL离心管中，加5mL 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入2mL 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加6mL 1640完全培养液，将培养皿置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。

细胞毒性实验：将HEK 293细胞或MDA-MB-468细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中，培养24h后，更换培养液为新鲜血清培养液，并加入不同浓度的由实施例1得到的壳聚糖衍生物(取代度12.5％)或由实施例2得到的N/P比为10的纳米复合物，不加的孔设为空白对照。孵育24h后，吸弃孔中溶液，用PBS洗涤3遍，加入新鲜培养液180μL，同时每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续在37℃、5％CO₂(相对湿度90％)培养箱中培养4h后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO，避光振荡10min使结晶物充分溶解。以酶标仪检测570nm处的吸收度(A)，按照以下公式计算：细胞存活率％＝(试验组平均A值/空白对照组平均A值)×100％。

细胞毒性结果如图2所示。从图2中可以看出，壳聚糖衍生物对细胞毒性很小，在100微克/毫升浓度下，细胞存活率依然能高达70％左右。其中，圆形代表壳聚糖衍生物对HEK293细胞的毒性；三角形代表纳米复合物对HEK293细胞的毒性；正方形代表壳聚糖衍生物对MDA-MB-468细胞的毒性；菱形代表纳米复合物对MDA-MB-468细胞的毒性。

实施例5体外转染实验

以人胚肾细胞HEK 293细胞和人乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞为测试细胞系。

HEK 293细胞培养方法：取出液氮中冻存的细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入15mL离心管中，加5mL 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入2mL DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加6mL DMEM完全培养液，将培养皿置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。

MDA-MB-468细胞培养方法：取出液氮中冻存的细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入15mL离心管中，加5mL 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入2mL 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加6mL 1640完全培养液，将培养皿置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。

纳米复合物制备方法：参照实施例2的方法，制备N/P比为5、10和20的壳聚糖衍生物(取代度12.5％)/DNA的纳米复合物和壳聚糖/DNA的纳米复合物。

转染方法：将细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种到24孔培养板中，置5％CO₂，37℃培养箱中。培养24h后，更换新鲜完全培养基，分别加入纳米复合物，孵育24h后，吸弃孔中溶液，加入新鲜完全培养基，继续培养24h。以w/w 3∶1的PEI/DNA纳米粒(PENs)作为阳性对照，在无血清条件下培养2h后换新鲜完全培养基。培养结束后，荧光显微镜(Olympus公司IX71型)观察并拍照。

图3中，(A)和(B)分别为各样品最优化配比在HEK293细胞(A)和MDA-MB-468细胞(B)中的转染结果图片。(a)为裸DNA在HEK 293细胞中的转染。(b)为N/P比为10的壳聚糖纳米复合物在HEK 293细胞中的转染。(c)N/P比为10的壳聚糖衍生物纳米复合物在HEK 293细胞中的转染。(d)为阳性对照PENs在HEK 293细胞中的转染。(e)为裸DNA在MDA-MB-468细胞中的转染。(f)为N/P比为10的壳聚糖纳米复合物在MDA-MB-468细胞中的转染。(g)N/P比为10的壳聚糖衍生物纳米复合物在MDA-MB-468细胞中的转染。(h)为阳性对照PENs在MDA-MB-468细胞中的转染。

从图3中可以看出，壳聚糖衍生物在最优化配比下均能有效转染HEK293和MDA-MB-468两种细胞株，与壳聚糖原料相比，转染效率大大提高，与阳性对照PEI的转染效果相当。

综上所述，本发明的壳聚糖衍生物既保留了壳聚糖无毒、生物相容性高的特性，又大大提高了壳聚糖的基因转染效率，用该壳聚糖衍生物制备的基因非病毒载体具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。

Claims (8)

1.一种壳聚糖衍生物，其结构式如下：

其中，n为壳聚糖衍生物的重复单元的个数，以及

其中，所述壳聚糖衍生物的重均分子量为5-1000千道尔顿。

2.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其中，所述N，N，N-三甲基-(1,2,3-三唑-4-)甲基溴化铵基团的取代度为10%~100%。

3.权利要求1所述的壳聚糖衍生物的制备方法，该方法包括以下步骤：

其中，n为壳聚糖衍生物的重复单元的个数，R为氨基的保护基；

步骤（a）：称取壳聚糖1，对其氨基进行保护，得到氨基保护的壳聚糖产物2；

步骤（b）：将（a）步骤所得的产物2的6位羟基进行溴代反应，得到产物3；

步骤（c）：将（b）步骤所得的产物3的6位溴进行叠氮基取代，得到产物4；

步骤（d）：将（c）步骤所得的产物4与炔丙基N,N,N-三甲基溴化铵在无水CuSO₄和维生素C钠盐催化下进行Click反应，得到产物5；其中炔丙基N,N,N-三甲基溴化铵由三甲胺和丙炔溴反应得到；

步骤（e）：将（d）步骤所得的产物5进行氨基的脱保护，得到产物6。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述壳聚糖1的重均分子量为10-1000千道尔顿。

5.一种由根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物与核酸所构成的纳米复合物。

6.权利要求5所述的纳米复合物的制备方法，其包括以下步骤：将权利要求1中所述的壳聚糖衍生物和质粒DNA分别用去离子水溶解，混合，室温静置，壳聚糖衍生物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。

7.权利要求1所述的壳聚糖衍生物在制备用于将核酸递送到细胞中的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述核酸为含有编码遗传标记的质粒DNA序列，所述遗传标记为绿色荧光蛋白基因。

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