CN113461834B - 一种纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种纳米材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纳米材料及其制备方法和应用，涉及新材料领域，本发明通过将丙烯酰化的壳聚糖与多肽序列在特定条件下反应制备得到一种多肽聚合物纳米材料，该材料具有良好的生物相容性和稳定性，能够与DNA共组装从而长期保持稳定，进而应用至产品防伪中，具有广泛的应用前景。

Description

一种纳米材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及新材料领域，具体涉及一种纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
传统的防伪主要是使用防伪标、防伪卡片、防伪包装等物理方式，依靠鉴定者的直接观察、触摸、号码查询等主观方式，但相关产品一经面世，则极易存在被仿造的风险，从而难以发挥防伪的作用。DNA是一类可以携带大量信息的生物高分子材料，DNA序列信息可以包含的信息量巨大，长度为n的DNA链条，可包含的序列的多样性理论上可以达到4n。天然DNA决定了物种的多样性，而人工合成DNA在种类上则具有无限的可能。作为一种关键的生物分子，DNA已经被广泛应用到不同的领域，在现代科学与技术中的地位极为重要。其中，基于DNA携带的大量信息而设计的新型材料则具有不可比拟的多样性、排它性或独一无二性。在商品防伪领域，利用特定DNA片段具有特异信息的原理，使防伪标识含有某种或几种确定的DNA序列，并且能于常态下长久保存。同时DNA可以与油墨、颜料等各类媒介和材料相结合，可以应用于各行各业，在食品药品行业，DNA分子的生物属性决定了其无毒无害，可放心食用。DNA信息不能通过常规手段获得，只能通过专业的手段解读，不易被破解。同时，DNA序列可以形成密码池，可以灵活地排列组合，实现密码的动态变化，更好的规避仿冒风险，未来有望代替传统的防伪标签、激光防伪、数码防伪和纹理防伪方式。综上可知，如何有效保护或储存DNA，使其具有良好的稳定性，从而广泛应用于包括防伪在内的各项领域中十分关键。
文献：MumperRJ,WangJ,ClaspellJM,etal.Novel polymeric condensingcarriers for gene delivery[J].ControlRel.Bioact.Mater,1995,22(1):178.首次报道了壳聚糖溶液与DNA以聚集的方式沉淀能得到一种复合物，故而初步认定壳聚糖拥有作为基因治疗载体的潜质。而文献：陈郧东,蔡妙颜,张英,等.壳聚糖-DNA复合物形成机理研究[J].药物生物技术,2005,12(5):291-293.则进一步探讨了壳聚糖-DNA复合物的形成机理。基于此，相关研究应用而生，例如专利CN102140171B公开了用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物及其制备和应用，该发明通过以下步骤合成共聚物：1)合成烯丙基修饰的壳聚糖衍生物；2)RAFT合成不同分子量的刷状PEG聚合物链；3)利用自由基偶联法将刷状PEG接枝到壳聚糖骨架上；4)利用EDC/NHS活化法将谷胱甘肽连接到刷状PEG链端。制备得到的得谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物载体材料作为非病毒基因载体，可显著提高与DNA形成的复合纳米粒子的细胞内吞作用，同时改善了进入细胞后DNA从复合物粒子中释放机制，进而得到高转染效率的非病毒载体材料。以及专利CN101048501则公开了通过壳聚糖存储DNA的方法，以及利用该方法的产物，该发明通过将DNA溶液和水溶性壳聚糖溶液混合而制备形成壳聚糖/DNA复合物从而存储DNA，使得在室温下长时间稳定地存储DNA成为可能。但目前为止此类方法通常较为复杂、低效或存储DNA的保存时间不高。
针对现有技术中DNA存在的复杂、低效以及保存时间短等问题，亟需寻找一种具有良好的生物相容性和稳定性，能够简单、高效地与DNA共组装从而长期保持稳定的材料。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种纳米材料及其制备方法和应用，该纳米材料具有良好的生物相容性和稳定性，能够与DNA共组装从而长期保持稳定，进而通过把DNA序列信息作为密码，运用DNA测序的手段进行密码解读来实现防伪。基于密码的扩展、更新和动态组合，实现不同层级的动态防伪，该应用防伪能力极高，适应范围广，具有广泛的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种多肽聚合物纳米材料，其特征在于：所述多肽聚合物纳米材料具有如下式I所示的结构：
式I：
Figure BDA0003155433610000021
其中，R1为端头是氨基酸的可与DNA组装的多肽序列1，R2为端头为氨基酸的可调控聚合物组装的多肽序列2；
其中，n为5-1000的整数，x、a均为大于0且小于n整数。
进一步地，所述多肽聚合物纳米材料的原料包括具有式II所示结构的丙烯酰化的壳聚糖：
式II：
Figure BDA0003155433610000031
式II中侧链碳碳双键是与巯基的反应位点。
优选地，R1为赖氨酸Lysn或组氨酸Hisn，其中，n＝1-18。
优选地，R2为巯基苯丙氨酸-甘氨酸，PhenGylm，其中，n＝1-4，m＝1-8。
本发明还提供了上述的多肽聚合物纳米材料的制备方法，包括以下步骤：将壳聚糖溶于去离子水并加热，搅拌下保持30-60min，冷却至室温，加入三乙胺，冰浴下缓慢加入丙烯酰氯，反应后透析、冻干得到丙烯酰化的壳聚糖；将丙烯酰化的壳聚糖与R1和R2反应得到多肽聚合物纳米材料。
进一步地，所述R1和R2的总的物质的量与丙烯酰化的壳聚糖的物质的量之比为2-5:1，R1与R2的物质的量之比为10:1-1:10。
本发明还提供了上述的多肽聚合物纳米材料在保存和识别DNA中的应用。
进一步地，所述的应用包括以下步骤：
(1)将多肽聚合物纳米材料溶于水中，得到多肽纳米聚合物材料溶液；
(2)向步骤(1)得到的多肽聚合物纳米材料溶液中加入DNA溶液和染料溶液，混合即得纳米颗粒。
进一步地，步骤(1)中所述多肽纳米聚合物材料溶液的浓度为10-200g·mL-1。
进一步地，步骤(2)中多肽聚合物纳米材料与DNA的重量比为1-3:3-1。
进一步地，步骤(2)所述纳米颗粒的形成在超声条件下进行，所述超声的时间为0-12h。
进一步地，所述染料包括尼罗红、罗丹明或荧光素。
进一步地，步骤(2)中所述多肽聚合物纳米材料自组装为纳米球。
本发明中的纳米颗粒能够应用在DNA防伪中，具体包括以下步骤：
S1：DNA密码的设计与制备；
S2：防伪材料的制备：即步骤(2)中纳米颗粒的制备，该纳米颗粒制备过程中的DNA溶液为步骤S1的得到的DNA扩增溶液；
S3：DNA密码库的构建与管理：所述DNA密码库包含有步骤(2)中DNA的序列；
S4：将涂覆或混合有防伪材料的产品与DNA密码库进行序列比对。
其中，DNA密码的设计与制备：
1.DNA序列片段密码序列信息已知，存储于DNA密码库中。
2.每个DNA序列片段密码与一对特异的引物相关联，运用该引物可以DNA材料为模板通过PCR扩增而获得大量的对应片段。若不知晓对应的引物序列，则无法有效扩增出足够检测的核酸。
3.DNA序列密码可以通过人工合成，也可以通过在天然DNA材料上经过PCR扩增获得。
4.DNA密码的设计遵循以下原则：序列长度：30～50nt；GC含量：40％～60％；二级结构序列短于3bp。
5.人工合成DNA序列密码的制备包括以下步骤：序列密码设计、序列合成、PCR扩增检测、测序验证。
6.天然DNA模板扩增密码的制备包括以下步骤(待补充)：总DNA提取、随机测序、生物信息学分析筛选密码片段、PCR扩增。
7.以微生物为核酸载体的密码，每种微生物的基因组序列信息已知，全基因组信息存储于密码数据库。
8.微生物核酸密码的制备包括以下步骤：微生物培养、全基因组测序、微生物冻干粉。
DNA密码库的构建与管理：
1.DNA密码库的存储信息包括以下几个部分：DNA密码与对应引物，每批次产品中密码的构成等。
2.DNA密码库分为基础密码库和专属密码库。
3.DNA密码库中包含的密码，数量上可通过设计新的密码进行填充而更新和扩展。
4.DNA密码库中包含的密码，在使用时可以进行组合。
5.以上3、4记载的密码特征，可以赋予产品携带密码的动态性。
6.以上3～5记载的密码特征，使得密码的破译极难实现。
DNA的提取、扩增与密码的解读：
1.材料中DNA的提取遵循以下步骤：含有密码的标签成分的分离、核酸提取(根据介质不同采用不同的方法)。
2.对于片段密码，核酸的扩增运用PCR的方法，引物序列根据产品对应信息在数据库中查询获得。
3.对于片段密码，根据能否有效扩增出已知长度的核酸序列，初步判断真伪。
4.对于片段密码，对扩增出的核酸序列，在一代测序仪上进行测序，根据序列信息比对(blast)最终确定真伪。通过序列比对，若序列一致，则为真，若序列不一致，则为假。
5.对于以微生物为核酸载体的样品，对提取的DNA进行高通量测序，通过生物信息学分析确定序列信息来源，从而判断真伪。通过序列比对，若来源一致，则为真，若来源不一致，则为假。
本发明所取得的技术效果是：
本发明的多肽聚合物具有良好的生物相容性和稳定性，能够简单而高效地与DNA共组装从而长期保持稳定，进而应用至产品防伪中，具有以下优势：①DNA序列包含的信息量巨大，密码复杂度高。长度为n的密码，复杂度4n；②不易破译：若不知晓密码的初始信息，无法有效扩增出可供检测的核酸，无法破译；③天然材料，安全性高、适用范围广；④密码管理模式更加适合目前商品的流通模式。密码原始信息以数据库的形式保存在加密服务器中，密码的使用及对应产品的跟踪信息可以和区块链信息接驳，实现数字化管理和跟踪。该应用防伪能力极高，适应范围广，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是实施例1制备的丙酰化壳聚糖核磁图(包含局部放大图)；
图2是实施例1制备的多肽聚合物核磁图(包含局部放大图)；
图3是实施例1制备多肽聚合物与DNA组装的纳米颗粒TEM图；
图4是实施例1制备多肽聚合物与DNA、荧光素的组装纳米颗粒TEM图；
图5是实施例1制备多肽聚合物与DNA、荧光素的组装纳米颗粒荧光光谱图；
其中，图1中的“*”标记为ppm＝5.8-6.3处的核磁峰的双键特征峰。
具体实施方式
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。本发明中使用的DNA溶液具体获得方式为将奇球菌培养至饱和期，离心收集，制备为冻干粉，与水混合后即得。本发明中的DNA溶液来源不限于奇球菌，还可以源为其他菌种、动植物的相关DNA。
实施例1
一种多肽聚合物纳米材料，制备方法包括以下步骤：将1mmol壳聚糖溶于去2mL离子水中加热至50℃，搅拌下保持50min，再冷却至室温，加入6mmol三乙胺，冰浴下缓慢加入4mmol丙烯酰氯，反应18小时，透析、冻干得到丙烯酰化的壳聚糖；最后将0.1mmol丙烯酰化的壳聚糖与摩尔比为1:1的R1和R2(其物质的量总和满足0.3mmol)通过Michael加成方法制备得到多功能的多肽聚合物纳米材料。其中，R1为赖氨酸，R2为苯丙氨酸-甘氨酸。
其中，丙烯酰化的壳聚糖结构如下式所示：
Figure BDA0003155433610000061
丙酰化壳聚糖核磁图如图1所示，在图1中，ppm＝5.8-6.3处的核磁峰的双键特征峰。
多肽聚合物纳米材料的结构如下式所示：
Figure BDA0003155433610000071
上式中K12即12个赖氨酸，F2G8即2个苯丙氨酸8个甘氨酸。
对本实施例合成的多肽聚合物纳米材料进行核磁表征，结果如图2所示，由该图可知，ppm＝5.8-6.3处的核磁峰的双键特征峰消失，表明反应完全，同时，通过积分面积推断出所出现的核磁峰满足材料分子的分子量的特征峰，而且通过积分面积计算推断材料分子是按照1/1反应进行的。
上述多肽聚合物纳米材料能够应用于在保存和识别DNA中，具体包括以下步骤：
(1)将多肽聚合物纳米材料溶于水中，得到多肽纳米聚合物材料溶液；
(2)向步骤(1)得到的多肽聚合物纳米材料溶液中加入DNA溶液和染料溶液，在此过程中进行超声6h，混合即得纳米颗粒。详见图3-5。
其中，多肽纳米聚合物材料溶液的浓度为100g·mL-1，多肽聚合物纳米材料与DNA的重量比为2:1，染料为适量荧光素。
实施例2
一种多肽聚合物纳米材料，制备方法包括以下步骤：将1mmol壳聚糖溶于去2mL离子水中加热至50℃，搅拌下保持30min，再冷却至室温，加入5mmol三乙胺，冰浴下缓慢加入3mmol丙烯酰氯，反应12小时，透析、冻干得到丙烯酰化的壳聚糖；最后将0.1mmol丙烯酰化的壳聚糖与摩尔比为10:1的R1和R2(其物质的量总和满足0.2mmol)通过Michael加成方法制备得到多功能的多肽聚合物纳米材料。其中R1为K12，即12个赖氨酸，R2为G10，即10个甘氨酸。
上述多肽聚合物纳米材料应用于在保存和识别DNA中，得到纳米颗粒的步骤，同实施例1。
所得的多肽聚合物纳米材料的结构如下式所示：
Figure BDA0003155433610000081
实施例3
一种多肽聚合物纳米材料，制备方法包括以下步骤：将1mmol壳聚糖溶于去2mL离子水中加热至50℃，搅拌下保持30min，再冷却至室温，加入10mmol三乙胺，冰浴下缓慢加入5mmol丙烯酰氯，反应24小时，透析、冻干得到丙烯酰化的壳聚糖；最后将0.1mmol丙烯酰化的壳聚糖与摩尔比为1:10的R1和R2(其物质的量总和满足0.5mmol)通过Michael加成方法制备得到多功能的多肽聚合物纳米材料。其中R1为H12，即12个组氨酸，R2为F2G8，即2个苯丙氨酸8个甘氨酸。
上述多肽聚合物纳米材料能够应用于在保存和识别DNA中，得到纳米颗粒的步骤，同实施例1。
所得的多肽聚合物纳米材料的结构如下式所示：
Figure BDA0003155433610000082
对比例1
与实施例1的区别仅在于，R1和R2的总的物质的量与丙烯酰化的壳聚糖的物质的量之比为6:1(三者的总的物质的量与实施例1一致，R1和R2的物质的量之比与实施例1一致)。
对比例2
与实施例1的区别仅在于，将和多肽聚合物纳米材料等量的壳聚糖与DNA溶液和染料溶液混合，即得。
应用实施例
将实施例1制备得到的纳米颗粒与普通涂料掺混后，涂抹于滤纸上制成防伪标签，将标签贴到相应产品上即可实现防伪功能。通过在暗处紫外灯照射可以实现荧光防伪，通过提取DNA并进行PCR扩增、分离后，形成目标条带实现DNA防伪。
多肽聚合物纳米材料保存DNA试验：
试验1：
试验方法：
(1)将各实例中的纳米颗粒以及空白对照组的DNA溶液(不进行任何处理)置于-50℃存储1个月；
(2)每个实例设置5组，每组分别向其中添加5μL脱氧核糖核酸酶(1单位/1浓度添加量)，加蒸馏水至100μL，而后在37℃条件下分别反应30min、40min、50min、60min和70min，反应结束后加入种植溶液灭活脱氧核糖核酸酶。向各组中均加入缓冲液混合，60℃放置24h。加入150μL苯酚并迅速混合，室温条件离心5min，取上清液抽提，再加入300μL无水乙醇溶液和3mol/L醋酸铵溶液，-70℃静置20min，而后在4℃、12000rpm条件下离心20min，弃去液体。使用体积分数为70％的乙醇洗涤沉淀物，干燥后溶于20μL蒸馏水，将最终产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，考察不同实例中DNA的裂解时间，将结果统计至表1中。
表1
实例 时间(min)
空白对照组 30
实施例1 70
实施例2 60
实施例3 70
对比例1 60
对比例2 50
由表1可知，未添加壳聚糖的DNA在低温存储后1个月再进行脱氧核糖核酸酶裂解试验中30min即已经裂解，而经过本发明多肽聚合物纳米材料进行包裹的DNA在60-70min时仍未裂解，而仅进行壳聚糖存储的DNA尽管也有一定的保护存储效果，整体裂解时间相较于空白对照组有所延长，但整体仍短于本发明中的保护存储方式。
试验2：
取6支试管，分别加入50μL各实例中的纳米颗粒以及空白对照组的DNA溶液(不进行任何处理)，室温条件下保存，在5d、10d、15d以及20d时，检测时取适量待测液稀释64倍，检测OD值，由于各组中待测液中所含物质不同，OD值受相关因素的影响，因此仅比较单组不同时间计算得出的变异系数CV值，用以考察DNA溶液的保存情况，将结果统计至表2中。
表2
实例 CV值(％)
空白对照组 6.23
实施例1 1.51
实施例2 2.56
实施例3 1.74
对比例1 3.49
对比例2 5.08
由表2可知，本发明中各实施例的CV值在5％以内，甚至达到3％以内，可见随着时间的延长，DNA的整体情况变化不大，而对于空白对照组以及对比例组而言，CV值明显较高。由此可见本发明中的方法对于DNA有着良好的保存作用。
最后应当说明的是，本发明通过上述实施例来说明本发明的多肽聚合物纳米材料及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (6)

1.一种多肽聚合物纳米材料，其特征在于：所述多肽聚合物纳米材料具有如下式I所示的结构：
式I：
Figure 577583DEST_PATH_IMAGE001
；
其中，n为5-1000的整数，x、a均为大于0且小于n整数；K12为12个赖氨酸，F2G8为2个苯丙氨酸8个甘氨酸。
2.根据权利要求1所述的多肽聚合物纳米材料，其特征在于：所述多肽聚合物纳米材料的原料包括具有式II所示结构的丙烯酰化的壳聚糖：
式II：
Figure 419637DEST_PATH_IMAGE002
；
式II中侧链碳碳双键是与巯基的反应位点。
3.如权利要求1或2所述的多肽聚合物纳米材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将壳聚糖溶于去离子水并加热，搅拌下保持30-60min，冷却至室温，加入三乙胺，冰浴下缓慢加入丙烯酰氯，反应后透析、冻干得到丙烯酰化的壳聚糖；将丙烯酰化的壳聚糖与巯基-R1和巯基-R2反应得到多肽聚合物纳米材料；
所述巯基-R1和巯基-R2的总的物质的量与丙烯酰化的壳聚糖的物质的量之比为2-5:1；巯基-R1与巯基-R2的物质的量之比为10:1-1:10；
其中R1为12个赖氨酸，R2为2个苯丙氨酸8个甘氨酸。
4.如权利要求3所述的多肽聚合物纳米材料在保存和识别DNA中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将多肽聚合物纳米材料溶于水中，得到多肽纳米聚合物材料溶液；
（2）向步骤（1）得到的多肽聚合物纳米材料溶液中加入DNA溶液和染料溶液，混合即得纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述纳米颗粒应用在DNA防伪中。
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