CN110257549B - 铁线莲属植物通用ssr引物及应用 - Google Patents
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明属于植物SSR引物开发技术领域，具体涉及一种铁线莲属植物通用SSR引物及应用。第1‑10对通用SSR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示。通用SSR引物同时适用于粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲四种种群材料，通用性好，将有助于为今后铁线莲属植物遗传多样性分析、种质资源保护、优异基因定位及遗传育种等方面奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于植物SSR引物开发技术领域，具体涉及一种铁线莲属植物通用SSR引物及应用。
背景技术
铁线莲属(Clematis L.)隶属于毛茛科(Ranunculaceae)，共有300多种植物，铁线莲属植物具有利尿、止痛祛风炎、抑制溃疡肿瘤的作用，且经济价值也很高。另外该属植物具有花色艳丽，花型丰富，姿态优美等特点，所以也可适用于绿化。铁线莲属植物不仅在城市园林上具有潜在的园林观赏价值和应用前景，同时还在医学方面有极高的应用价值，具有广阔的综合应用发展前景。目前，国内对大叶铁线莲的研究主要集中在生物学特性、化学成分分析、种子萌发等方面，分子水平上的研究尚未开展。
简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)也可称为微卫星(microsatellite)，广泛分布于真核生物基因组的编码区和非编码区。SSR分子标记的基本原理是首先根据微卫星重复序列两端的保守序列来设计引物，然后通过PCR扩增反应扩增微卫星片段，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。SSR分子标记具有多态性强，共显性遗传和操作简单等优点，在基因定位、遗传多样性和比较基因组学等方面具有广泛的应用前景。
采用SSR分子标记研究不同地理环境下的铁线莲属植物基因特性及其生理表型特性，对于优良铁线莲属植物品种的市场化应用具有重要价值。然而，由于目前我国的铁线莲属植物品种多，铁线莲属种群间的基因存在诸多差异，所以目前的SSR引物可适用的铁线莲属植物品种数量有限，通用性差。
发明内容
本发明提供了一种铁线莲属植物通用SSR引物及应用，提供的通用SSR引物同时适用于粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲四种种群材料，通用性好。
本发明的第一个目的是提供一种铁线莲属植物通用SSR引物，第1-10对通用SSR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示。
本发明的第二个目的是提供一种上述的铁线莲属植物通用SSR引物在粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲四种种群材料中的应用。
优选的，上述应用中，利用第1-10对通用SSR引物进行PCR反应时，退火温度Tm依次为52℃、53℃、52℃、51℃、53℃、52℃、50℃、51℃、52℃、52℃。
优选的，上述应用中，利用第1-10对通用SSR引物进行PCR反应时，PCR程序如下：95℃5min；94℃50s，Tm 45s，72℃60s，30循环；72℃10min。
优选的，上述应用中，所述铁线莲属植物来源于河南省的新安县青要山、栾川龙峪湾、偃师双龙山、新乡万仙山、栾川鸡冠山、汝阳王坪、栾川老君山、偃师万安山、栾川养子沟。
与现有技术相比，本发明提供的一种铁线莲属植物通用SSR引物及鉴定方法及应用，至少具有以下有益效果：
本发明首先从100对SSR引物中筛选出78对能扩增出目的条带的引物，然后从78对引物中进一步的筛选，得到58对能扩增出多态性的引物，最后从58对引物中继续筛选，得到19对多态性较好的引物，然后研究这19对引物在铁线莲属种群间的通用性，最终获得能同时用于粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲四种种群材料PCR鉴定的通用SSR引物，通用性好。通过开发这些通用性SSR引物，将有助于为今后铁线莲属植物遗传多样性分析、种质资源保护、优异基因定位及遗传育种等方面奠定基础。
附图说明
图1是SSR引物RAD-1在20个铁线莲属个体的通用性PCR电泳结果；
图2是SSR引物RAD-4在20个铁线莲属个体的通用性PCR电泳结果；
图3是SSR引物RAD-5在20个铁线莲属个体的通用性PCR电泳结果；
图4是SSR引物RAD-8在20个铁线莲属个体的通用性PCR电泳结果；
图5是SSR引物RAD-10在20个铁线莲属个体的通用性PCR电泳结果；
图6是SSR引物RAD-12在20个铁线莲属个体的通用性PCR电泳结果；
图7是SSR引物RAD-13在20个铁线莲属个体的通用性PCR电泳结果；
图8是SSR引物RAD-14在20个铁线莲属个体的通用性PCR电泳结果；
图9是SSR引物RAD-16在20个铁线莲属个体的通用性PCR电泳结果；
图10是SSR引物RAD-18在20个铁线莲属个体的通用性PCR电泳结果。
图1-10中，1-5泳道为粗齿铁线莲的5个供试个体材料、6-10泳道为陕西铁线莲5个供试个体材料、11-15泳道为太行铁线莲5个供试个体材料、16-20泳道为大叶铁线莲5个供试个体材料，M泳道为Marker。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。下面各实施例以及上述发明内容中未注明具体条件的试验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行。
本发明提供了10对多态性且通用性均较好的SSR引物，第1-10对SSR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示。我们还提供了另外9对多态性较好的SSR引物，第11-19对SSR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.38所示。19对SSR引物特点如表1所示。
表1 19对SSR引物特点
为了检测19对多态性较好的SSR引物的种间通用性，我们进行了19对SSR引物的种间通用性检测实验，实验过程及结果如下：
1.供试材料：
我们从铁线莲属中选取粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲四种材料，每个种群分别选取5个个体。粗齿铁线莲(Clematis argentilucida)：为毛茛科铁线莲属植物，叶片为卵形或椭圆状卵形，且叶片边缘有粗大的锯齿状牙齿，另外，其藤茎入药，能杀虫解毒。陕西铁线莲(Clematis shensiensis)：为毛茛科铁线莲属植物，有纵条纹和短柔毛，花瓣为白色，耐寒、耐旱。另外，因其花大色艳,具有独特的风格，因此常被用来点缀围墙、假山、栅栏等。太行铁线莲(Clematis kirilowii)：为毛莨科铁线莲属野生植物，其茎有短小的柔毛，花瓣为白色。另外，该植物的根茎能起到祛风湿和活血通络的作用。大叶铁线莲(Clematis heracleifolia)：为多年生草本或灌木，隶属于毛茛科(Ranunculaceae)铁线莲属(Clematis L.)，具有明显的主根，且主根粗大，具有膨大的结节。大叶铁线莲具有叶对生、被毛和花瓣为蓝紫色等特点，另外其花序有很强的观赏性，具有较强的耐荫能力。
供试材料20个铁线莲属个体的来源见表2。
表2铁线莲属供试材料的信息
2.实验方法
2.1DNA的提取
本实验提取粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲的叶片DNA时采用的是改良的CTAB法。
首先在CTAB溶液中提前加入β-巯基乙醇，并使巯基乙醇的最终体积分数为1％，两者混合摇匀，然后将其放入65℃的水浴锅中预热，预热时间为10min。CTAB总用量＝700μL×需要提取的DNA样品个数，巯基乙醇总用量＝7μL×需要提取的DNA样品个数。
单个DNA样品提取步骤如下：
(1)取100mg干重材料(拇指盖大小)加入至2mL EP管中，并在EP管中放入2个钢珠，然后用SCIENTZ-48型高通量组织研磨器充分研磨，研磨时间通常为90s，研磨至粉末状，随后加入预热好的CTAB溶液700μL，充分震荡。
(2)将上述EP管放置在水浴锅中预热30min，每5min拿起来摇晃一次。
(3)预热完成后，从水浴锅中取出EP管，每个管中加入氯仿-异戊醇(24:1，v/v)溶液700μL，充分震荡。
(4)将EP管放入离心机中，12000r离心5min，随后吸取上清液并将其转移至新的EP管，注意吸取上清液时不能吸出下层溶液。
(5)重复(3)、(4)步骤一次。
(6)每管加入100μL 3moL/L的NaAC溶液和相当于上清液两倍体积(1000μL)的无水乙醇，无水乙醇提前放置在-20℃预冷，将其混匀低温放置30min。
(7)12000r离心3min，移去上清液，保留DNA沉淀，沉淀为白色。
(8)将沉淀用枪头挑出，然后转移至1.5mL EP管中，再加入500μL体积分数75％乙醇清洗沉淀两次，倒掉溶液。
(9)倒扣离心管，常温下干燥DNA30min；或者将上一步得到的离心管放入烘箱60℃干燥5～10min。
(10)加入50μL ddH2O溶解DNA，用涡旋仪涡旋3min左右使DNA充分溶解，得到DNA样品，放入低温条件下备用。
2.2DNA的检测
用K5500-超微量分光光度计，检测DNA样品的浓度和纯度，DNA样品中DNA质量合格后保存在-20℃的冰箱中备用。
2.3PCR扩增
取出提取成功的20个DNA样品，利用筛选出的19对SSR引物进行PCR扩增。PCR的扩增体系见下表3，PCR扩增的反应程序见表4，然后将PCR完成后的产物放进冰箱中进行保存。
表3PCR扩增体系
表4铁线莲属SSR引物扩增程序
具体的Tm值根据引物的不同而有所不同，不同引物对对应的Tm值参照表1，由于引物较多，且退火温度之间具有一定的差值，因此需分批次进行PCR扩增。
2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)用60mL1％TBE及0.6g琼脂糖配制1％的琼脂糖溶液，加热溶解后，倒入放玻璃板的长槽中，将两两配对的玻璃板用夹子夹上放入长槽中，凝胶时间约30min左右。
(2)配制聚丙烯酰胺凝胶工作液，然后将其缓缓倒入两层玻璃板的缝隙，最后插入梳子，静置50min。
(3)取出玻璃板，放入放玻璃板的装置中，然后把电泳槽中1×TAE倒出1000mL备用，把上述装置放入电泳槽中，把倒出的TAE倒入两玻璃板之间，直至淹没玻璃板最短的那一面。
(4)静置5min之后，取下梳子进行点样。
(5)点样完成后，设置电压400V，电流150mA进行电泳2h。
2.5银染检测
(1)取出并分离玻璃板，将凝胶小心揭下，放入染色盘中并用清水冲洗3次。
(2)用1g硝酸银+500mL蒸馏水配制染色液，在染色盘中倒入200mL左右染色液，然后放在摇床上匀速染色10min。
(3)将染色后的凝胶用清水冲洗3次，倒入显影液(0.2g碳酸钠，6g氢氧化钠，2mL甲醛，500mL蒸馏水)，然后在摇床上摇约6min左右。
(4)待条带显现后，将凝胶放在胶片观察灯上观察并用手机拍照留档。
2.6数据处理
根据电泳结果，利用Quantity one软件对扩增产物进行标记，确定产物长度，并统计数据，然后计算铁线莲属引物在粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲材料中的通用性和多态性比率。
3结果分析
3.1SSR引物扩增多态性分析
利用表1的19对引物进行PCR扩增分析，结果参见表5。由表5可以看出：19对引物中有16对引物在5个粗齿铁线莲个体中可扩增出目的条带，13对引物具有多态性，所以引物多态性比率为81.25％，平均每对引物可扩增出4.7条谱带；有12对引物在5个陕西铁线莲个体中可扩增出目的条带，10对引物具有多态性，所以引物多态性比率为83.33％，平均每对引物可扩增出4条谱带；有11对引物在5个太行铁线莲个体中可扩增出目的条带，9对引物具有多态性，所以引物多态性比率为81.82％，平均每对引物可扩增出3.9条谱带；有19对引物在5个大叶铁线莲个体中有扩增，9对引物具有多态性，所以引物多态性比率为89.5％，平均每对引物可扩增出6.7条谱带。由此可见，19对SSR引物在粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲中可扩增率较高，且扩增产物有一定的多态性。
3.2铁线莲属通用性引物分析
从表5可以看出，有10对引物，即RAD-1、RAD-4、RAD-5、RAD-8、RAD-10、RAD-12、RAD-13、RAD-14、RAD-16和RAD-18在粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲这4种种群中都能扩增出目的条带，引物通用率为100％，这10对SSR引物可同时适用于粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲这4种种群扩增，且引物通用性良好。其中有7对引物在粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲这4种种群扩增出的多态性条带数均≥2，说明这7对引物的多态性也较好。当这10对SSR引物均对同一种种群进行PCR扩增时，可以多重分析该种群的PCR结果，如果10对引物均有扩增条带，则说明结果可靠性非常高。
从表5还可以看出，有2对引物，即RAD-2、RAD-6在2种种群中都能扩增出目的条带，引物通用率为75％；有5对引物，即RAD-3、RAD-11、RAD-15、RAD-17、RAD-19在2种种群中都能扩增出目的条带，引物通用率为50％；有2对引物，即RAD-7、RAD-9在1种种群中都能扩增出目的条带，引物通用率为25％。
由此可看出，本发明提供的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示10对SSR引物在这粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲四种种群中的通用率较高，本实验研究结果可为今后开发铁线莲属引物种间通用的功能基因标记，种质资源评价鉴定、遗传多样性分析以及高密度连锁图谱构建等奠定基础。
表5 19对SSR引物扩增结果
注：“-”表示无扩增产物，多态性条带数≥2则表示该引物具有多态性。
表5的多态性比率计算公式如下：
多态性比率＝100％×(具有多态性引物数量/能扩增出目的条带引物数量)。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 洛阳师范学院
<120> 铁线莲属植物通用SSR引物及应用
<160> 38
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
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caatccttga ccagaagag 19
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<211> 20
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<400> 31
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tggttcatat agtgcatggt 20
<210> 33
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 35
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<400> 37
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<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acttatcaat gaggtgcctt 20
Claims (5)
1.一种铁线莲属植物通用SSR引物，其特征在于，第1-10对通用SSR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示，所述铁线莲属植物为粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲四种种群材料。
2.根据权利要求1所述的铁线莲属植物通用SSR引物在区分粗齿铁线莲、陕西铁线莲、太行铁线莲和大叶铁线莲四种种群材料中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用第1-10对通用SSR引物进行PCR反应时，退火温度Tm在48-55℃。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用第1-10对通用SSR引物进行PCR反应时，PCR程序如下：95℃5min；94℃50s，Tm 45s，72℃60s，30循环；72℃10min。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述铁线莲属植物来源于河南省的新安县青要山、栾川龙峪湾、偃师双龙山、新乡万仙山、栾川鸡冠山、汝阳王坪、栾川老君山、偃师万安山、栾川养子沟。
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2019
- 2019-07-29 CN CN201910689031.5A patent/CN110257549B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Characterization of new microsatellite markers based on the transcriptome sequencing of Clematis finetiana;Zhigao Liu等;《Hereditas》;20180515;第155卷(第23期);第1-9页 * |
| 铁线莲属植物叶绿体微卫星引物开发及其遗传分析;陈文超等;《浙江农业学报》;20171231;第29卷(第12期);摘要，材料与方法部分，表3 * |
Also Published As
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| CN110257549A (zh) | 2019-09-20 |
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