CN109628633B

CN109628633B - 利用ssr分子标记快速鉴定披针叶苔草与矮丛苔草的方法

Info

Publication number: CN109628633B
Application number: CN201910121874.5A
Authority: CN
Inventors: 滕珂; 刘凌云; 范希峰; 武菊英; 滕文军; 岳跃森; 常智慧
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2039-02-19
Also published as: CN109628633A

Abstract

本发明公开了一种利用SSR分子标记快速鉴定披针叶苔草与矮丛苔草的方法。本发明SSR分子标记可以由如SEQ ID NO.1‑2或SEQ ID NO.3‑4所示的引物扩增得到。本发明方法操作简便，费用低，准确度高且通用性好，可以用于快速鉴定外观相近的矮丛苔草和披针叶苔草。

Description

利用SSR分子标记快速鉴定披针叶苔草与矮丛苔草的方法

技术领域

本发明属于植物分子标记辅助种质资源鉴别与育种技术领域，具体涉及一种利用SSR分子标记快速鉴定披针叶苔草与矮丛苔草的方法。

背景技术

近年来，随着分子生物学和基因组学研究的不断深入，DNA分子标记技术的研究与应用得到了迅速的发展。DNA分子标记反映了DNA水平上生物个体间的遗传差异，其技术广泛应用在物种起源、种质鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等，具有数量丰富、多态性高、不受环境影响、检测快速等优点。SSR标记完全符合植物品种鉴别的4个基本准则，即环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异和实验结果的可靠性，其已成为作物种质资源鉴定的一种理想分子标记。SSR分子标记筛选包含SSR的基因片段，然后根据SSR序列片段两端的保守序列进行引物设计，进一步通过PCR扩增反应扩增基因组编码区的SSR序列，将产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析核心序列重复单位数目的多态性。具有重复性好、高丰度、稳定可靠、共显性遗传、操作简单等优点。

苔草属(Carex Linn.)是莎草科中的最大属，是一类分布很广的重要牧草种质资源和优良草坪植被植物。近年来在园林绿化、畜牧业生产等方面也具有举足轻重的作用。该属植物种类多、分布广、数量大，具有返青早、生长持续时间长、耐践踏性强，地下根茎发达等优点。此外，苔草属植物耐干旱、耐痔薄、植株低矮、纤细，观赏性良好，也是一类能够进行开发利用的观赏草。然而在苔草属中，矮丛苔草(Carex humilis)与披针叶苔草(Carexlanceolata)的外观极为相似，都为丛生且不具匍匐枝，均具有叶片狭长、叶色深绿、株型圆润饱满、根状茎密集成丛的特点，单凭肉眼难以辨别。虽然二者在形态学上极为相似，但由于其抗旱、耐荫能力不同而在园林应用中存在较大区别。园林绿化中经常因为无法快速区分这两种苔草而造成植物景观配置不协调，且在种苗交易中易产生价格纠纷等问题，极大的限制了其在园林绿化中的广泛应用。用传统CTAB方法提取DNA速度慢、耗费人力和时间，不便于大规模实验操作。

因此，有必要利用SSR分子标记的方法快速鉴别两种苔草，为园林绿化、苔草种质资源开发等奠定基础。

发明内容

本发明利用苔草SMRT全长转录组数据筛选获得特异性引物，针对现有技术不足为快速鉴别矮丛苔草和披针叶苔草提供有效手段。

本发明通过收集有代表性的披针叶苔草(Carex lanceolata)种质资源与矮丛苔草(Carex humilis)种质资源，寻找特异的SSR位点，然后用筛选出的SSR引物对有代表性的披针叶苔草种质及矮丛苔草进行PCR扩增，从而获得了能区分披针叶苔草(Carexlanceolata)种质与矮丛苔草(Carex humilis)种质的特异性引物对。

具体而言，本发明提供一种利用SSR分子标记快速鉴定披针叶苔草与矮丛苔草的方法，包括以下步骤：

1)提取待鉴定植物种质的基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，用如下一对或两对特异性引物进行PCR扩增反应；

3)分析PCR扩增产物；在扩增产物中，若具有特异条带，则为披针叶苔草，反之，则为矮丛苔草。

其中，所述特异性引物对的核苷酸序列如下所示：

Carexl-F:5’CACTGGAGAACCTAGCGACC 3’；

Carexl-R:5’TTGTACAAGGTCCAGGGAGAA 3’；

Carex2-F:5’CGTTCCCCGTTTTCTTCTCT 3’；

Carex2-R:5’GCCGTCTTCTTTGAAAACCA3’。

一般地，采用上述任一对特异性引物对即可实现对于披针叶苔草和矮丛苔草的鉴定。为进一步提高鉴定结果的准确性和可靠性，优选采用上述二对特异性引物进行鉴定。

具体地说，在引物Carexl的扩增产物中，若具有175bp特异性条带，则为披针叶苔草，反之，则为矮丛苔草；在引物Carex2的扩增产物中，若具有182bp特异性条带，则为披针叶苔草，反之，则为矮丛苔草。

上述方法中，待鉴定植物为披针叶苔草(Carex lanceolata)和/或矮丛苔草(Carex humilis)。可以通过现有常规技术进行确定。也就是说，已经确定待鉴定植物为披针叶苔草(Carex lanceolata)或矮丛苔草(Carex humilis)，进一步采用本发明方法将二者进行辨别。

所述披针叶苔草(Carex lanceolata)、矮丛苔草(Carex humilis)包括北京植物园、西安植物园保种种源材料。

具体地，披针叶苔草(Carex lanceolata)品种包括北京市农林科学院自主培育的经北京市审定和国家审定的林木良种(国S-SV-CL-014-2012)。矮丛苔草(Carex humilis)品种包括北京市农林科学院自主培育的经北京市审定和国家审定的林木良种(京S-SV-CH-006-2012)。

具体地，提取基因组DNA方法包括，以待鉴定的植株的幼嫩的叶片为材料，剪取黄豆大小叶片(例如100mg左右)浸泡于30μL无水乙醇中，在1.5mL离心管中放置30min，用玻璃研磨棒磨碎，向离心管中加入70μL ddH₂O，混匀，即得基因组DNA。可吸取2μL液体当模板，进行后续PCR扩增。

所述PCR反应扩增体系10μL：DNA2μL，2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技(北京)有限公司，货号：KT205-02)5μL，上下游引物各0.2μL，灭菌水补齐10μL。

所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共34个循环；最后72℃延伸l0min，4℃保存。

电泳分离：在8％高分辨率非变性PA胶中将PCR扩增产物分离，具体操作步骤如下，220V电压在1×TBE缓冲液中电泳约1h，将电泳后的凝胶在弱碱条件下用硝酸银(0.4mol/L)染色，电泳结束后凝胶在胶片观察灯下观察照相并保存。

本发明提供的鉴定方法可将披针叶苔草(Carex lanceolata)与矮丛苔草(Carexhumilis)种质资源区别开，操作简单、用时短、重现性好、准确度高且通用性好，可有效克服用表型鉴定方法难以区分的缺点，在种质鉴别与分子辅助育种中发挥重要作用。本发明的SSR分子标记还能够作为遗传标记，用于披针叶苔草(Carex lanceolata)的育种或选育，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为矮丛苔草(Carex humilis)和披针叶苔草(Carex lanceolata)的单株对比照片。

图2表示实施例2SSR特异性分子标记鉴定结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

以下所用披针叶苔草(Carex lanceolata)和矮丛苔草(Carex humilis)材料取于北京市农林科学院，分别为自主培育的经国家审定的林木良种(国S-SV-CL-014-2012)和北京市审定和的林木良种(京S-SV-CH-006-2012)、北京植物园和西安植物园保种的种源材料，遗传背景清晰可靠，具有代表性。温室培养取幼叶作为后续实验材料。

实施例1SSR引物的获得

过程简要描述如下：从青绿苔草(Carex breviculmis)已知的引物序列中挑选100对引物进行合成，其中有96对可用于后续研究，通过表型差异较大的12份苔草资源筛选出多态性高的引物对42对，在该42对引物中对获得的披针叶苔草与矮丛苔草的DNA进行特异性扩增，最终筛选出可以直接鉴别两种相似种的引物对。从而获得了用于鉴定披针叶苔草(Carex lanceolata)与矮丛苔草(Carex humilis)种质的SSR分子标记，由核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物或SEQ ID NO.3-4所示的引物PCR扩增获得。

实施例2本发明分子标记鉴定苔草种质的应用

1.材料与方法

1.1植物材料：矮丛苔草(Carex humilis)和披针叶苔草(Carexlanceolata)。单株对比照片见图1。

1.2基因组DNA的快速提取

剪取健康生长的苔草幼嫩的叶片100mg，浸泡于30μL无水乙醇中，放置30min，用研磨棒磨碎；向离心管中加入70μL ddH₂O，混匀提取基因组DNA。

1.3SSR分析

利用筛选得到的两对可以用于矮丛苔草和披针叶苔草鉴定的SSR标记引物：

Carexl-F:5’CACTGGAGAACCTAGCGACC 3’，

Carexl-R:5’TTGTACAAGGTCCAGGGAGAA3’；

Carex2-F:5’CGTTCCCCGTTTTCTTCTCT 3’，

Carex2-R:5’GCCGTCTTCTTTGAAAACCA3’；

进行品种鉴定；

1.3.1PCR反应扩增体系10μL如下：

DNA2μL，

2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技(北京)有限公司，货号：KT205-02)5μL，

上下游引物各0.2μL，

灭菌水补齐10μL；

1.3.2SSR PCR反应程序如下：

94℃预变性3min；

94℃变性30s，

53℃退火30s，

72℃延伸1min，共34个循环；

72℃延伸10min，4℃保存。

1.3.3聚丙烯酰胺凝胶的制备步骤如下：

清洗玻璃板：将平板和凹板清洗干净，自然晾干，保证板的干净。将平板放平，玻璃板对齐用夹子固定好，开始灌胶。

灌胶：量取8mL 40％丙烯酰胺胶储存液，4mL 10×TBE缓冲液，28mL纯水，加入40μLTEMED(四甲基乙二胺)和200μL 20％的APS(过硫酸铵)溶液(一组玻璃板的量)，充分混匀后，立即用沿凹板上沿的一侧均匀地灌胶，将梳子有齿的一侧插入，凝固30-40min。

清理玻璃板及胶面：胶凝固后，拔出梳子，将玻璃板外壁和水平胶面上的碎胶及未凝固的胶液清理干净。去掉固定在玻璃板的夹子，将玻璃板固定到垂直电泳槽(DYCZ-26型)上，准备电泳。

1.3.4电泳分离的步骤如下：

固定装置：把电泳槽、胶板固定好，在槽中各加入l X TBE缓冲液没过凹板，用移液针清理胶面上的杂质。

预电泳：盖好电泳槽盖，接好电源线后预电泳20min。

点样：用枪头依次把PCR扩增产物点入点样孔中。

电泳：在电泳仪(DYY-6C型)电压220V、电流200mA、功率35W条件下电泳l h。

1.3.5弱碱法快速银染检测的步骤如下：

银染：(0.6g硝酸银+800mL水)染色约13min，弃银染液。

漂洗：加入800mL蒸馏水漂洗2-3次，平均每次30s。

显色：(8g NaOH+800mL蒸馏水+8mL甲醛)振荡显影。

统计带型：胶片用自封袋或保鲜膜覆盖并照相或扫描。

2.结果与分析

SSR特异性分子标记鉴定结果见图2，其中泳道1、3、5、7、9、11为矮丛苔草SSR分子标记鉴定结果，泳道2、4、6、8、10、12为披针叶苔草SSR分子标记鉴定结果。为确保实验结果，每对引物分别进行三次重复。

2.1在引物Carexl的扩增产物中，若具有175bp特异性条带，则为披针叶苔草，反之，则为矮丛苔草；在引物Carex2的扩增产物中，若具有182bp特异性条带，则为披针叶苔草，反之，则为矮丛苔草。

2.2上述两对引物可组合对矮丛苔草和披针叶苔草进行鉴定，也可分别对两种苔草进行鉴定，结果与传统分类方法相一致，通过DNA的快速提取、SSR分析、品种鉴定能快速准确鉴定两种苔草。

2.3本方法克服了传统CTAB法提取DNA耗时长、操作复杂的缺点，可快速提取苔草的DNA，在传统的基础上改善银染方法，使其快速高效染色。总体上具有操作简便，费用低，准确度高且通用性好的特点，可以用于快速鉴定外观相近的矮丛苔草和披针叶苔草。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 利用SSR分子标记快速鉴定披针叶苔草与矮丛苔草的方法

<130> KHP181119112.5

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cactggagaa cctagcgacc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgtacaagg tccagggaga a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgttccccgt tttcttctct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccgtcttct ttgaaaacca 20

Claims

1.一种利用SSR分子标记快速鉴定披针叶苔草与矮丛苔草的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待鉴定植物种质的基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，用如下一对或两对特异性引物对进行PCR扩增反应；

3)分析PCR扩增产物；在引物对1的扩增产物中，若具有175 bp特异性条带，则为披针叶苔草，反之，则为矮丛苔草；和/或在引物对2的扩增产物中，若具有182 bp特异性条带，则为披针叶苔草，反之，则为矮丛苔草，

其中，所述引物对1的核苷酸序列如下所示：

Carexl -F :5’ CACTGGAGAACCTAGCGACC 3’ ；

Carexl -R :5’ TTGTACAAGGTCCAGGGAGAA 3’ ；

所述引物对2的核苷酸序列如下所示：

Carex2 -F :5’ CGTTCCCCGTTTTCTTCTCT 3’ ；

Carex2 -R :5’ GCCGTCTTCTTTGAAAACCA3’ ；

所述待鉴定植物种质为披针叶苔草（Carex lanceolata）和/或矮丛苔草（Carex humilis）。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将待鉴定植物种质确定为披针叶苔草（Carex lanceolata）或矮丛苔草（Carex humilis）的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述披针叶苔草（Carex lanceolata）品种为国S-SV-CL-014-2012；所述矮丛苔草（Carex humilis）品种为京S-SV-CH-006-2012。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，共34个循环；最后72℃延伸l0min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，扩增产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳技术及快速银染法检测。