CN105695587A - 鉴定鲁棉研34号品种纯度的ssr分子标记引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组及其应用。该引物组由5对引物组成，分别为：分子标记NAU3995的引物，分子标记MUCS101的引物，分子标记DPL0917的引物，分子标记DPL0528的引物，分子标记NAU4926的引物。本发明通过对杂交种鲁棉研34号及其亲本基因组DNA特征SSR引物进行筛选研究，鉴定得到能够在杂种一代中同时产生具有父、母本特异标记条带，而且带型清晰、重复性好、可靠性强的鲁棉研34号特征SSR引物5对，构成鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组，该引物组可用于快速检测鲁棉研34号品种的种子纯度。

Description

鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组及其应用
技术领域
本发明涉及一种鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组及其应用，利用鲁棉研34号的特征引物组对鲁棉研34号供检样品进行品种纯度鉴定，属于生物技术技术领域。
背景技术
棉花是我国重要的经济作物，在我国国民经济与社会发展中具有重要地位。棉花杂交品种在生活力、生长势、抗逆性和丰产性方面较棉花常规品种有比较明星的优势，因此受到广大棉农的青睐，其推广种植面积基本覆盖长江流域棉区，对提高棉花产量，稳定棉花生产，提高棉农收益起到重要作用。杂交棉品种纯度是保证杂种优势得以发挥的基础，也是衡量杂交棉种子质量的主要指标。由于在棉花杂交制种过程中，人工去雄不彻底或漏去雄，常会出现假杂交种，导致杂交品种杂种优势下降，给生产造成巨大经济损失，同时，在销售环节中一些不法分子或种子经营单位为追求高额利润以劣充好，人为掺假等，导致优良品种纯度受到严重影响，进而影响优良品种的市场销售信誉及其产业化发展。因此，为有效监控优良品种的生产质量，规范优良品种的销售市场，建立一套快速、准确(简便、经济)鉴定鲁棉研34号杂交棉品种纯度的方法是棉花生产经营过程中最为迫切解决的问题之一。
目前我国棉种的品种纯度鉴定主要依靠田间小区种植形态鉴定方法，鉴定所需时间长，成本高，并受季节的限制，近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，以DNA为基础的分子标记技术可有效鉴定品种在分子水平上的遗传差异，与其它分子标记相比，SSR(SimpleSequenceRepeat，简单序列重复)分子标记技术在鉴定杂合位点方面具有独特的优越性：SSR分子标记呈共显性，标记数量丰富，多态性高，遗传稳定，不受环境条件影响。目前SSR标记已广泛应用于遗传连锁图谱的构建、遗传多样性研究和品种资源鉴定等方面，并发挥着越来越重要的作用；很多专家学者对棉花品种纯度鉴定的分子标记技术进行了一定的研究，研究结果表明，利用分子标记进行棉花品种纯度鉴定是可行的。
鲁棉研34号是以自育抗虫棉新品系鲁S157为母本，以从GK12系选的P12为父本配制成的F1代杂交种，2005年获农业部转基因生物安全证书，2008年经第二届国家农作物品种审定委员会第二次会议审定通过。该品种长势强，整齐度好，纺纱均匀指数154，结铃性强，成铃吐絮集中，耐枯萎病，耐黄萎病，是综合性状比较理想的优良品种。为保证该品种的生产质量，提高品种纯度检测效率，非常有必要针对鲁棉研34号品种研发一种经济简便实用的纯度鉴定方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组及其应用。利用该引物组可以实现快速检测鲁棉研34号品种纯度的问题。
本发明技术方案如下：
一种鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组，该引物组由5对引物组成，分别为：
分子标记NAU3995的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
分子标记MUCS101的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
分子标记DPL0917的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
分子标记DPL0528的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；
分子标记NAU4926的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。
上述SSR分子标记引物组在鉴定鲁棉研34号品种纯度中的应用。
上述应用，步骤如下：
(1)将待检测棉花干种子室温条件下浸泡后，去除种皮，浸入裂解缓冲液中，破碎后，在60～70℃水浴15～25min，离心，取上清，然后加入预冷的异丙醇，离心，取沉淀，经洗涤、晾干，加双蒸水溶解后，离心，取上清，制得DNA提取样品；
(2)以步骤(1)制得的DNA提取样品为模板，分别以SSR分子标记引物组中的5对引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)分别对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行电泳检测，经染色后，将染色结果的带型与鲁棉研34号父、母本的染色结果的带型进行对比，同时具有父母双亲本特异条带的种子或单株鉴定为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种，种子纯度按如下方法计算：
种子纯度＝检测到的与鲁棉研34号纯品的带型相同的个数/检测总数×100％。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的浸泡时间为18～24小时；离心条件为：4℃、12000r/min离心8min；所述洗涤为采用体积百分比为70％的乙醇溶液洗涤；所述预冷的异丙醇加入量为0.7倍体积。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的裂解缓冲液中含有如下成分：
2wt％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，0.02mol/LEDTA(四乙酸二氨基乙烷)，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl，2wt％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，1wt％β-巯基乙醇。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下(10μL)：
10×PCRBuffer1μL，10mMdNTPMix0.2μL，10μmol/L的正向引物0.6μL、10μmol/L的反向引物0.6μL，5UTaqDNA聚合酶0.1μL，20～200ng/μL的待测样品DNA2μL，ddH2O5.5μL。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR反应程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，循环32次；72℃延伸5min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，所述电泳为采用8wt％非变性聚丙烯酰胺电泳。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，染色步骤如下：
用0.1wt％的AgNO3溶液染色10min，再用含2wt％NaOH和0.4wt％甲醛的水溶液显影至带型清晰。
有益效果
1、本发明通过对杂交种鲁棉研34号及其亲本基因组DNA特征SSR引物进行筛选研究，鉴定得到能够在杂种一代中同时产生具有父、母本特异标记条带，而且带型清晰、重复性好、可靠性强的鲁棉研34号特征SSR引物5对，构成鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组，该引物组可用于快速检测鲁棉研34号品种的种子纯度；
2、本发明通过采用了适用于上述引物组的检测方法，通过对DNA提取方法等步骤进行改进，获得了效果好、检测速度快、检测结果准确、经济简便、稳定可靠、不受环境条件及发育时期影响的优点，适用于快速检测鲁棉研34号品种的种子纯度；
3、本发明直接采用种子提取DNA，省略了苯酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质步骤，不使用有毒试剂，有利于大规模快速提取DNA；
4、本发明简化了染色步骤，大大提高了电泳检测效率。
附图说明
图1为鲁棉研34号父本、母本及F1品种特异SSR分子标记引物组的标准电泳图谱；
其中:M为分子量标准，P1为鲁棉研34号父本，P2为鲁棉研34号母本，F1为鲁棉研34号F1杂交种；
图2所示为特征引物对NAU3995对鲁棉研34号商品样品种子的纯度检测结果；
其中:M为分子量标准，1：“鲁棉研34号”母本；2：“鲁棉研34号”父本；3：“鲁棉研34号标准品种”F1杂交种；4-23号为鲁棉研34号商品种子；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不用来限制本发明的保护范围。
生物来源
实施例中所述的鲁棉研34号商品种子购自山东鲁壹棉业科技有限公司。
实施例1
提取DNA，采用SSR分子标记进行PCR扩增，将扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，统计结果并筛选特征性引物。
1.棉花基因组DNA提取
本实施例的实验材料为鲁棉研34号品种和鲁棉研34号父母本(购自山东鲁壹棉业科技有限公司)。
将棉花干种子室温条件下浸泡20小时左右，剥掉种皮，将萌动的种仁放入2ml离心管中，加入700μl裂解缓冲液(组成成分：2wt％CTAB，0.02mol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl，2wt％PVP，1wt％β-巯基乙醇)，用组织研磨仪将种子打碎。65℃水浴20min，间隔10min左右轻摇一次。12000r/min离心8min(15℃)，取500μl上清液，加入0.7倍体积预冷的异丙醇，沉淀DNA，70％乙醇洗涤DNA沉淀1次，无水乙醇洗涤DNA沉淀1次，倒置晾干，加入200μl双蒸水充分溶解DNA沉淀，离心，取150μl上清液，上清液即为DNA提取样品。
2.分子标记分析
SSR-PCR扩增反应体系为10μL，其中10×PCRBuffer1μL，10mMdNTPMix0.2μL，特异SSR正、反向引物(10μmol/L)各0.6μL，5UTaqDNA聚合酶0.1μL，待测样品DNA(20-200ng/μL)2μL，ddH2O5.6μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，循环32次；72℃延伸5min；4℃保存。
PCR扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，260V恒压电泳至指示剂(二甲苯青)接近胶板的底部时，结束电泳。电泳结束后，进行AgNO3溶液染色，在可见灯箱下观察拍照，记录结果。
3.鲁棉研34号特征引物的确定
以鲁棉研34号品种和其父母本为筛选材料，利用2200对SSR引物，对鲁棉研34号及其父、母本的DNA进行多态性筛选，筛选出能够在一代杂种中同时产生父、母本特异标记条带，而且带型清晰、重复性好、可靠性强的SSR引物5对(NAU3995、MUCS101、DPL0917、DPL0528和NAU4926)，这5对SSR引物的碱基序列见表1：
表1鲁棉研34号特征引物名单
这些引物构成鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记特征引物组(如表1所示)，该引物组均能鉴定出鲁棉研34号父母双亲的特异互补条带(见图1)。
实施例2
利用实施例1筛选出来中5个SSR分子标记特征引物进行鲁棉研34号商品种子的纯度鉴定，步骤如下：
1、DNA提取
棉花基因组DNA提取方法同实施例1。
2、SSR-PCR扩增
选用实施例1中的SSR分子标记引物组分别进行PCR扩增，反应体系：
10×PCRBuffer1μL，10mMdNTPMix0.2μL，特异SSR正、反向引物(10μmol/L)各0.6μL，5UTaqDNA聚合酶0.1μL，待测样品DNA(20～200ng/μL)2μL，ddH2O5.6μL。
反应程序：
94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，循环32次；72℃延伸5min；4℃保存。
3、电泳检测
取1.2μLPCR扩增产物在8wt％非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳检测，电泳结束后，用0.1wt％的AgNO3溶液染色10min，再用含2wt％NaOH和0.4wt％甲醛的水溶液显影至带型清晰。
4、结果分析
只有同时具有父母双亲本特异条带的种子才是真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种。5个特征SSR引物均能鉴定出鲁棉研34号父母双亲的特异互补条带(见图1)。使用选自NAU3995、MUCS101、DPL0917、DPL0528和NAU4926中的一个或多个特征引物对杂交种种子的标记基因型进行分析，统计代表各种基因型的数量，即可计算出待测种子样品鲁棉研34号商品种子的纯度百分率(种子纯度＝检测到的与鲁棉研34号纯品的带型相同的个数/检测总数×100％)。多个特征引物同时使用，取平均值即为待测商品种纯度。5个SSR标记引物在多次重复中表现稳定，5个标记分析结果可以相互验证。
参照鲁棉研34号父本、母本及F1标准电泳图谱(见图1)，确定代表父本带型，母本带型，其它杂株带型及F1带型的各种基因型。
图2所示为特征引物NAU3995对鲁棉研34号商品种子的纯度检测结果。其中M为分子量标准，1：“鲁棉研34号”母本；2：“鲁棉研34号”父本；3：“鲁棉研34号标准品种”F1杂交种；4-23号为鲁棉研34号商品种子。
对照图1中所示的“鲁棉研34号”母本、父本及其F1的标准电泳普带可知：4-23号鲁棉研34号商品种子中，6号、14号和22号是母本带型，其余的种子都是真实的杂交种带型，因此这份鲁棉研34号商品种子样品的种子纯度为85％(种子纯度＝17/20×100％＝85％)。

Claims (8)

1.一种鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组，该引物组由5对引物组成，分别为：
分子标记NAU3995的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
分子标记MUCS101的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
分子标记DPL0917的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
分子标记DPL0528的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；
分子标记NAU4926的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。
2.权利要求1所述SSR分子标记引物组在鉴定鲁棉研34号品种纯度中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)将待检测棉花干种子室温条件下浸泡后，去除种皮，浸入裂解缓冲液中，破碎后，在60～70℃水浴15～25min，离心，取上清，然后加入预冷的异丙醇，离心，取沉淀，经洗涤、晾干，加双蒸水溶解后，离心，取上清，制得DNA提取样品；
(2)以步骤(1)制得的DNA提取样品为模板，分别以SSR分子标记引物组中的5对引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)分别对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行电泳检测，经染色后，将染色结果的带型与鲁棉研34号父、母本的染色结果的带型进行对比，同时具有父母双亲本特异条带的种子或单株鉴定为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种，种子纯度按如下方法计算：
种子纯度＝检测到的与鲁棉研34号纯品的带型相同的个数/检测总数×100％。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的浸泡时间为18～24小时；离心条件为：4℃、12000r/min离心8min；所述洗涤为采用体积百分比为70％的乙醇溶液洗涤；所述预冷的异丙醇加入量为0.7倍体积。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的裂解缓冲液中含有如下成分：
2wt％十六烷基三甲基溴化铵，0.02mol/L四乙酸二氨基乙烷，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl，2wt％聚乙烯吡咯烷酮，1wt％β-巯基乙醇。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下，总体系体积10μL：
10×PCRBuffer1μL，10mMdNTPMix0.2μL，10μmol/L的正向引物0.6μL、10μmol/L的反向引物0.6μL，5UTaqDNA聚合酶0.1μL，20～200ng/μL的待测样品DNA2μL，ddH2O5.5μL。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR反应程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，循环32次；72℃延伸5min。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，所述电泳为采用8wt％非变性聚丙烯酰胺电泳。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，染色步骤如下：
用0.1wt％的AgNO3溶液染色10min，再用含2wt％NaOH和0.4wt％甲醛的水溶液显影至带型清晰。
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