CN111349717B - 甜樱桃砧木资源的ssr标记及其指纹图谱数据库 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甜樱桃砧木资源的SSR标记及其指纹图谱数据库。本发明利用ABI3730荧光SSR电泳方法，从40个甜樱桃SSR中筛选出15可用于鉴定甜樱桃砧木资源的SSR标记。用这15个SSR标记，构建了23个甜樱桃砧木和优系的指纹图谱库。本发明构建的甜樱桃砧木的SSR指纹图谱，可用于甜樱桃砧木的鉴别。

Description

甜樱桃砧木资源的SSR标记及其指纹图谱数据库
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，特别是涉及可用于鉴定甜樱桃砧木资源的SSR标记及其指纹图谱数据库。
背景技术
甜樱桃(Prunus avinum)是北方果树中露地结果最早的水果，经济价值较高，但是甜樱桃自身的根系浅、抗性差，导致死树严重。目前普遍采用甜樱桃的近缘属种，如中国樱桃(P.pseudocerasus)、酸樱桃(P.cerasus)、马哈利(P.mahaleb)、草原樱桃(P.fruticosa)、灰毛叶樱桃(P.canescens)及其杂交种作为甜樱桃的砧木，以提高甜樱桃的对不同土壤环境的适应性(段续伟，李明，谭钺，等.新中国果树科学研究70年--樱桃[J].果树学报,2019(10):1339-1351.)。不仅如此，甜樱桃砧木还会影响接穗的树体大小、早果性和产量等，因此在甜樱桃生产中，选择正确的砧木是非常重要的。但是仅从外形上，很难准确鉴定砧木品种，特别是在嫁接上接穗以后(Turkoglu Z,Koc A,Ercisli S,BilgenerS,Akbulut M,Yildirim N,et al.Genetic relationships among Prunus rootstocksfor sweet cherry(Prunus avium L.)cultivars.Plant Genetic Resources.2012；10(2):1-7.)。改革开放以来，甜樱桃种植业在国内蓬勃发展，甜樱桃砧木育种也逐渐兴起。一批适合我国土壤和气候的甜樱桃砧木正在推向市场，急需发展一种稳定可靠的鉴定甜樱桃砧木的方法。
基于DNA多态性的分子标记不仅可以在植物材料的任何部位检测到，而且具有稳定、可重复的特点，被广泛用于分子标记辅助育种和品种鉴定。在众多的分子标记中，简单序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)分子标记由于其在基因组中分布均匀、多态性高、可以在近源属种中迁移、检测手段成熟稳定，受到了育种家的青睐，被广泛使用。王晶等人利用SSR标记，构建了甜樱桃品种的指纹图谱库并进行了亲缘关系分析(王晶，张开春，张小明等.甜樱桃品种中新多态性SSR的鉴定、指纹图谱构建及聚类分析[J].果树学报，2019，36(12)：1619-1629.)。Turkoglu等人用10个SSR标记区分了184个来自甜樱桃、酸樱桃、马哈利和高山樱的砧木资源和优系(Turkoglu Z,Koc A,Ercisli S,Bilgener S,Akbulut M，Yildirim N，et al.Genetic relationships among Prunus rootstocks for sweetcherry(Prunus avium L.)cultivars.Plant Genetic Resources.2012；10(2):1-7.)。Barac等人用26个SSR鉴定了77个塞尔维亚的甜樱桃砧木资源，分别属于甜樱桃、酸樱桃、草原樱桃(P.fruticosa)、马哈利和山樱花(P.serrulata)(Barac G,Barac G,Ognjanov V,Ognjanov V,Obreht D,Obreht D,et al.Genotypic and Phenotypic Diversity ofCherry Species Collected in Serbia.Plant Molecular Biology Reporter.2014；32(1):92-108.)。Ioannis等人用1个SSR标记可以区分开6个希腊主栽的甜樱桃砧木，它们分别来源于酸樱桃、马哈利、甜樱桃、灰毛叶樱桃、毛樱桃之间的杂交(Ioannis G,Aliki X,Filippos A,Konstantinos K,Athanasios T，Panagiotis M.Microsatellite high-resolution melting(SSR-HRM)analysis for identification of sweet cherryrootstocks in Greece.Plant Genetic Resources.2014；12(1):160-3.)。与国外培育的樱桃砧木不同，国内自育的樱桃砧木中大部分含有中国樱桃(P.pseudocerasus)的遗传背景，国外开发的SSR标记不完全适用于国内甜樱桃砧木的鉴定。
发明内容
针对上述领域中的不足，本发明提供SSR标记，其可用于鉴定含有中国樱桃、酸樱桃、草原樱桃、甜樱桃、马哈利、灰毛叶樱桃遗传背景的甜樱桃砧木资源。
本发明还提供该SSR在部分甜樱桃砧木资源中的指纹图谱数据库，可以用于这些甜樱桃砧木资源的分子检测鉴定。
一种甜樱桃砧木资源的SSR分子标记鉴定方法，其单一扩增体系中含有下述SSR引物对中的一对或多对：
Figure BDA0002479430920000021
所述扩增体系中的待测DNA提取自甜樱桃砧木资源的叶片。
甜樱桃砧木资源的SSR标记指纹图谱数据库的构建方法，包括如下步骤：
(1)从现有的李属SSR中选取多个SSR分子标记，设计相应的特异性SSR引物对；
(2)用选取的多个SSR标记，在有代表性的甜樱桃砧木资源中进行各自独立的PCR扩增，有代表性甜樱桃砧木资源包括国内常见甜樱桃砧木品种或者杂交亲本，最大的倍性为四倍体；
(3)扩增产物用荧光毛细管电泳系统分离并判定扩增片段大小和等位基因数量；统计分析并去掉那些在有代表性的甜樱桃砧木资源中等位基因数量大于4个的SSR标记，进一步排除在所有有代表性的甜樱桃砧木资源中扩增产物大小都一样的SSR标记，筛选具有多态性而且扩增带不超过4个的SSR标记，
(4)将筛选得到的SSR标记对更多的甜樱桃砧木样本扩增，获得每个样本的特征扩增带，用扩增带大小代表相应的等位基因，建立甜樱桃砧木资源的SSR指纹图谱数据库。
所述多个SSR分子标记为如下40个SSR分子标记，其特异性SSR引物对如下所示：
Figure BDA0002479430920000031
Figure BDA0002479430920000041
其中上游引物的5’端加上6-FAM荧光。
所述有代表性的甜樱桃砧木品种为马哈利、CAB(酸樱桃)、対樱(中国樱桃)、草原樱桃、吉塞拉6号和R041(甜樱桃)。
所述筛选得到的SSR标记及其引物对如下：
Figure BDA0002479430920000042
根据上述方法得到的甜樱桃砧木资源的SSR标记指纹图谱数据库。
上述甜樱桃砧木资源的SSR标记指纹图谱数据库在甜樱桃砧木品种鉴别中的应用。
本发明从现有的李属SSR中选取40个未用作鉴定甜樱桃砧木的分子标记SSR分子标记，在6个代表样本(马哈利、CAB、対樱、草原樱桃、吉塞拉6、R041)中扩增，筛选得到15个具有多态性而且扩增带不超过4个的SSR标记；用筛选出的15对多态性SSR引物在23个樱桃砧木DNA中扩增，ABI3730XL平台检测，SSR analyser软件确定等位基因大小，建立甜樱桃砧木资源的SSR指纹图谱数据库。
本发明筛选得到的15个甜樱桃砧木资源的SSR标记，以及建立的甜樱桃砧木资源的SSR指纹图谱数据库，均可以用于甜樱桃砧木品种鉴别，以适应甜樱桃砧木育种需求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。本实施例不是用于限定本发明，而是用于详细说明本发明的方法。
实施例1
1材料和方法
1.1材料
从北京市通州区于家务乡西垡村樱桃基地和北京市海淀区香山瑞王坟樱桃基地选择23个樱桃砧木和优系(表1)，每个品种选择1-3个单株，共计62个单株作为试材。这些品种按照株行距2×4m定植，常规田间管理。
表1樱桃砧木指纹图谱构建所用材料
Figure BDA0002479430920000051
1.2 DNA提取
每个品种选择1-3株采集叶片，用CTAB法提取叶片总DNA，具体方法见文献[WANGJ，ZHANG K C，ZHANG X M，YAN G H,ZHOU Y，FENG L B，NI Y，DUAN X W.Construction ofcommercial sweet cherry linkage maps and QTL analysis for trunk diameter[J].PLoS ONE,2015,10(10):e0141261.]。
1.3多态SSR引物筛选
从现有的李属SSR中选取40个未用作鉴定甜樱桃砧木的分子标记SSR分子标记，设计40对SSR引物，并在其上游引物的5’端加上6-FAM荧光，在6个代表样本(马哈利、CAB、対樱、草原樱桃、吉塞拉6、R041)中扩增，用ABI3730XL检测(电泳和仪器操作方法按照使用说明进行)，LIZ 500作标记，SSR analyser软件[王凤格，李欣，杨扬，易红梅，江彬，张宪晨，霍永学，朱丽，葛建镕，王蕊，任洁，王璐，田红丽，赵久然.植物品种SSR指纹分析专用软件SSRAnalyser的研发[J].中国农业科学，2018,51(12):2248–2262.]分析，去掉那些在有代表性的甜樱桃砧木资源中等位基因数量大于4个的SSR标记，进一步排除在所有有代表性的甜樱桃砧木资源中扩增产物大小都一样的SSR标记。筛选具有多态性而且扩增带不超过4个的SSR标记，所述多个SSR分子标记、其特异性SSR引物对如下表2所示：
表2 40个SSR分子标记、其特异性SSR引物对
名称 上游引物序列 下游引物序列
1 PMS30 CTGTCGAAAGTTTGCCTATGC ATGAATGCTGTGTACATGAGGC
2 SC19 TGTGCTAATGCCAAAAATACC ACATGCATTTCAACCCACTC
3 UDAp-461 ACGGTTTCAAGAGGTTGGTG AGTGCACGTGTGACCCTGTA
4 MA007a GTGCATCGTTAGGAACTGCC GCCCCTGAGATACAACTGCA
5 MA0021a TGAGCTCCGATCATTATAGA CACAGGATGGGCGTATCTTT
6 M5a CAACAACCAAGCTCAGCTCA GCTTTACCCCCTTTGAATTG
7 EPPCU3664 ACAAACAAACTTCTCTGATGA GAAACCAGAGGAAACTACCAC
8 MA073a GCGAGACCTTGTGAGAGCTA TTATTTTTTGGTGTTGCTGATTT
9 MA068a GCAACAAGGAGCACACAGTAAA GAACCTTCATCATAAATCCACCA
10 Pav12 AGCCACCCGTTAAGGAGATT AATCACCCTCTTTGGAACCC
11 Pav510 GAACCTTGTGTGGCTTGGAT TATGAACGGTGACGATGGAA
12 Pav612 CCTCCGTCTCGCTATTTCAC TTGCAGGCTAGTGAGCTGAA
13 Pav62 CCAGCAATTGATGAGGTGAA CTCTCTGCCCACTCAGCTCT
14 Pav64 TCCACTGGAGAAGGAACCAC GGACCACGCTTCTCACTCTC
15 Pav78 TGGAGGCTTCTTCCTTTCAA AGACGGGACCTATGCCCTAT
16 Pav812 GTTCCATACCACAACCCACC GCAAATTGGTCCACCGTTAC
17 Pav82 CTGGGCCGTGATTTACTTGT TTGATCATGAAACAGCCAGC
18 Pav89 CCGCCCATGAACCTTATTTA TGAGTGCGCAATTCACTTTC
19 BPPCT034 CAATGGAGAATGGGGTGC CTACCTGAAATAAGCAGAGCCAT
20 BPPCT037 CATGGAAGAGGATCAAGTGC CTTGAAGGTAGTGCCAAAGC
21 CPPCT006 AATTAACTCCAACAGCTCCA ATGGTTGCTTAATTCAATGG
22 EMPA001 GCTCTGCTGCTTCAACCATT TTTCCCAACACACTTACCCC
23 EMPA002 TGACAGGTCATCATACCATTTG CAGGATTAAGCATTGCAAATTA
24 EMPA003 AGCCATTCTGAAAAGGTGGA GCATTCAGCCAACAAAATCA
25 EMPA004 TACGGTAGGCTTCTGCAAGG TTGGCAGGTTCTGTTCACAT
26 EMPA007 CAACCTCAAGGGCATATTGG ACCAATGCAAAGCATTCTCC
27 EMPA018 TCCAAGAACAAAGCCAAAATC AATTTCAATGCATTCTGGATAG
28 EMPaS01 CAAAATCAACAAAATCTAAACC CAAGAATCTTCTAGCTCAAACC
29 EMPaS02 CTACTTCCATGATTGCCTCAC AACATCCAGAACATCAACACAC
30 EMPaS06 AAGCGGAAAGCACAGGTAG TTGCTAGCATAGAAAAGAATTGTAG
31 EMPaS11 ACCACTTTGAGGAACTTGGG CTGCCTGGAAGAGCAATAAC
32 EMPaS12 TGTGCTAATGCCAAAAATACC ACATGCATTTCAACCCACTC
33 PceGA25 GCAATTCGAGCTGTATTTCAG CAGTTGGCGGCTATCATGTCTTAC
34 PMS02 CACTGTCTCCCAGGTTAAACT CCTGAGCTTTTGACACATGC
35 PMS03 TGGACTTCACTCATTTCAGAGA ACTGCAGAGAATTTCACAACCA
36 PMS40 TCACTTTCGTCCATTTTCCC TCATTTTGGTCTTTGAGCTCG
37 PMS67 AGTCTCTCACAGTCAGTTTCT TTAACTTAACCCCTCTCCCTCC
38 UCD-CH12 AGACAAAGGGATTGTGGGC TTTCTGCCACAAACCTAATGG
39 UCD-CH31 TCCGCTTCTCTGTGAGTGTG CGATAGTTTCCTTCCCAGACC
40 UPD98-412 AGGGAAAGTTTCTGCTGCAC GCTGAAGACGACGATGATGA
1.4樱桃砧木指纹图谱构建及聚类分析
用筛选出的15对多态性SSR引物在62份樱桃砧木DNA中扩增，ABI3730XL平台检测，SSR analyser软件确定等位基因大小(方法同1.3)。分析同一品种不同单株之间的SSR结果，剔除基因型占少数的单株。最后每个品种选择1株进行后续分析。SSR在甜樱桃品种中的等位基因直接用峰值大小表示，只有1个峰的视为纯合。用Power maker v3.25软件分析SSR的等位基因频率、多态性指数(PIC)，计算频次(Frequency)。
2结果
2.1多态性SSR引物筛选
用马哈利、CAB、対樱、草原樱桃、吉塞拉6号、R041从40个SSR中筛选出15个可用于甜樱桃砧木鉴定的SSR(表3)。用这15个SSR在23个樱桃砧木中扩增，统计出这15个SSR在23个樱桃砧木中等位基因片段大小及频率(表3)，并获得了23个樱桃砧木的指纹图谱库(表4)。
表3可用于甜樱桃砧木鉴定的SSR的等位基因大小及其在23个甜樱桃砧木中的基因频率
Figure BDA0002479430920000071
Figure BDA0002479430920000081
Figure BDA0002479430920000091
该指纹图谱数据库可用于鉴定甜樱桃砧木资源。
表4用15个SSR构建的23个甜樱桃砧木资源的指纹图谱数据库
Figure BDA0002479430920000101

Claims (6)

1.一种甜樱桃砧木资源的SSR分子标记鉴定方法，包含下述15个SSR标记，其单一扩增体系中含有下述SSR引物对中的一对：
Figure FDA0003529651080000011
所述扩增得到SSR的等位基因片段大小及频率如下：
Figure FDA0003529651080000012
Figure FDA0003529651080000021
Figure FDA0003529651080000031
所述甜樱桃砧木资源见下表所示，
Figure FDA0003529651080000032
Figure FDA0003529651080000041
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，所述扩增体系中的待测DNA提取自甜樱桃砧木资源的叶片。
3.甜樱桃砧木资源的SSR标记指纹图谱数据库，采用下述步骤方法构建得到：
(1)从现有的李属SSR中选取多个SSR分子标记，设计相应的特异性SSR引物对；
(2)用选取的多个SSR标记，在有代表性的甜樱桃砧木资源中进行各自独立的PCR扩增，有代表性甜樱桃砧木资源包括国内常见甜樱桃砧木品种或者杂交亲本，最大的倍性为四倍体；
(3)扩增产物用荧光毛细管电泳系统分离并判定扩增片段大小和等位基因数量；统计分析并去掉那些在有代表性的甜樱桃砧木资源中等位基因数量大于4个的SSR标记，进一步排除在所有有代表性的甜樱桃砧木资源中扩增产物大小都一样的SSR标记，筛选具有多态性而且扩增带不超过4个的SSR标记，
(4)将筛选得到的SSR标记对现有的甜樱桃砧木样本扩增，获得每个样本的特征扩增带，用扩增带大小代表相应的等位基因，建立甜樱桃砧木资源的SSR指纹图谱数据库；
所述多个SSR分子标记为如下40个SSR分子标记，其特异性SSR引物对如下所示：
Figure FDA0003529651080000042
Figure FDA0003529651080000051
所述有代表性的甜樱桃砧木品种为马哈利、CAB、対樱、草原樱桃、吉塞拉6、R041，
所述筛选得到的SSR标记及其引物对如下：
Figure FDA0003529651080000052
4.根据权利要求3所述的甜樱桃砧木资源的SSR标记指纹图谱数据库，其中上游引物的5’端加上6-FAM荧光。
5.根据权利要求3所述的甜樱桃砧木资源的SSR标记指纹图谱数据库，如下表如示：
Figure FDA0003529651080000061
6.权利要求3-5任一所述甜樱桃砧木资源的SSR标记指纹图谱数据库在甜樱桃砧木品种鉴别中的应用，所述甜樱桃砧木品种见下表所示：
Figure FDA0003529651080000062
Figure FDA0003529651080000071
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