CN105331715A

CN105331715A - 用于检测樱桃ssr标记的引物

Info

Publication number: CN105331715A
Application number: CN201510822289.XA
Authority: CN
Inventors: 宗宇; 王月; 李永强; 朱友银; 郭卫东
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2035-11-23
Also published as: CN105331715B

Abstract

本发明提供了一组用于检测樱桃SSR标记的引物，该组引物共有9个引物对，可在检测过程中同时使用，9个引物对的序列如SEQ？ID？NO：1至SEQ？ID？NO：18所示。本发明筛选出9个SSR标记在22个中国樱桃种或品种中有多态性，在22个中国樱桃种或品种中进行的遗传多样性分析与樱桃属植物分类常识基本吻合，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的9个标记应用于更多中国樱桃甚至转移至欧洲甜樱桃上，进行种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种。

Description

用于检测樱桃SSR标记的引物

技术领域

本发明涉及分子生物学DNA标记技术与应用领域，特别涉及用于检测樱桃SSR标记的引物。

背景技术

简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，也称为串联重复序列或微卫星标记，是一种共显性标记，具有多态性高，重复性好，易于检测的优点，被广泛应用于种质资源亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、功能基因的筛选和分子标记辅助育种等工作中。SSR标记的获取通常有3种途径，分别是：利用已公布的表达序列标签、利用已完成测序的基因组序列和利用转录组序列。

中国樱桃(Prunus pseudocerasus)的近缘物种有桃(P.persica)、杏(P.armeniaca)、李(P.salicina)和欧洲甜樱桃(P.avium)等，其中桃的基因组已经完成测序。尽管用于桃遗传图谱构建、功能基因的筛选和分子标记辅助育种的SSR标记比较丰富，而且同科或同属植物SSR标记有一定程度的转移性，但是多数情况下，侧翼序列突变导致SSR标记向近缘物种转移的成功概率很低。截至2015年11月20日，GenBank公布的欧洲甜樱桃表达序列标签(EST)有6496条，中国樱桃仅有185条，但利用EST序列开发中国樱桃SSR标记的研究尚未见报道。显然，由于GenBank登录的欧洲甜樱桃和中国樱桃的表达序列标签数量非常有限，所能开发的SSR标记的数量也是有限的。应用新一代高通量测序平台Illumina HiseqTM 2000能够以较低的价格、较快的速度获得较多的转录组信息，是大量开发中国樱桃SSR标记的有效方法。因此，如能利用EST序列开发中国樱桃SSR标记，增加樱桃属分子标记的数量，势必会对今后的樱桃育种工作带来极大的便利。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中樱桃分子标记数量不足的缺点，提供一组用于检测樱桃属植物SSR标记的引物，增加樱桃属分子标记的数量以应用于今后的育种工作中。

为了解决技术问题，本发明提出了用于检测樱桃SSR标记的引物，该检测引物共有9个引物对，其核苷酸序列如下：

CL2632-F和CL2632-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、2所示；

CL3793-F和CL3793-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示；

CL4400-F和CL4400-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5、6所示；

Unigene13394-F和Unigene13394-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7、8所示；

Unigene13887-F和Unigene13887-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9、10所示；

Unigene16590-F和Unigene16590-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11、12所示；

Unigene19771-F和Unigene19771-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13、14所示；

Unigene8656-F和Unigene8656-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15、16所示；

CL4698-F和CL4698-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17、18所示。

本发明还提出上述用于检测樱桃SSR标记的引物在樱桃遗传多样性分析中的应用。

此外，本发明还提出利用上述用于检测樱桃SSR标记的引物进行樱桃遗传多样性分析的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤Ⅰ，各樱桃材料的DNA提取；

步骤Ⅱ，微卫星分析：

(1)、PCR扩增：以步骤Ⅰ提取的DNA为模板进行PCR扩增；

A：20μL反应体系包含：TaKaRa Premix Taq^TM 10μL、正向引物0.1μL，反向引物0.5μL，荧光修饰的M13引物0.4μL，10ng DNA模板和双蒸水；

B：反应程序：94℃预变性4min；94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环后，改变循环条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸40s，进行8个循环，最后72℃延伸6min；

(2)、电泳检测：

取上述扩增产物5μL，加入1μL 6×Loading buffer；在含有0.5μg/μL EB的1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下拍照记录结果；

(3)、SSR基因分型和Gene Mapper软件统计：

选取上述在不同樱桃材料中电泳条带粗细、明暗、片段长度变化不一的标记1μL约100ng的PCR产物与12μL变性剂和0.25μL内参混匀，使用EppendorfMastercycler PCR仪在95℃下变性5min，取出立即放置冰上5min，然后使用ABI 3130遗传分析仪进行分析，同时使用Gene Mapper软件读取片段长度；

步骤Ⅲ，遗传多样性分析

将Gene Mapper统计得到的标记长度数据按照标准格式输入GenAlEx6.501，计算樱桃材料的遗传多样性参数，绘制聚类图。

优选的，在上述正向引物的5'端统一加18bp的M13序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。

优选的，所述荧光标识引物为5’端分别使用Fam和Hex两种荧光基团修饰的M13引物，其中M13引物的序列为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。

优选的，所述樱桃材料为中国樱桃材料，来自如下：朱红1、临海地方品种1、朱砂红、山樱1、朱红2、朱红3、山樱2、早红宝石1、朱红4、浙闽樱、早红宝石2、临海地方品种2、诸暨地方品种、朱红5、仙居地方品种、中国樱桃1、中国樱桃2、中国樱桃3、中国樱桃4、大鹰嘴、中国樱桃5、高盆樱桃。

优选的，所述步骤Ⅰ的DNA提取步骤为：(1)配制DNA提取液：2％CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0；DNA溶解缓冲液：10mM Tris；1mM EDTA；PH＝8.0；(2)对中国樱桃材料进行如下处理：

①在10mL离心管中加入4mL的DNA提取液和80μLβ-巯基乙醇，放置在65℃水浴中预热10min；

②取1g中国樱桃材料的新鲜叶片，在研钵放入少许PVP，加入液氮充分研磨；将研磨好的叶片转移至含DNA提取液的离心管中，混匀后放入65℃水浴锅中水浴30min，每隔10min摇匀一次，使叶片细胞充分裂解；

③水浴结束后，取出离心管冷却至室温；加入4mL的预冷V:V＝24:1的氯仿/异戊醇混合溶液，充分混匀后使用离心机在10 000rpm下离心15min；

④用移液器小心吸取上清液，转移至新的10mL离心管中，加入4mL的异丙醇和400μL的3M的醋酸钠溶液，轻轻颠倒混匀，静置10-15min至产生絮状沉淀，然后使用离心机在10 000rpm下离心10min；

⑤离心后弃上清液，将底部白色沉淀即：DNA小心取出，转入1.5mL离心管中，加入700μL 70％的乙醇洗涤两次；

⑥离心后弃上清液，用移液器吸干剩余酒精，将白色沉淀物收集在侧管壁上，尽可能铺平打薄，放入37℃保温箱中烘干；

⑦加入500μL DNA溶解缓冲液将烘干后的DNA重新溶解，完全溶解后加入1μL RNase，用移液器轻轻吸打DNA溶液，混匀后将离心管放入37℃保温箱中保温1h；

⑧取4μL DNA在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测其完整性。

⑨吸取一部分DNA稀释至10-30ng·μL^-1用于后续的PCR反应，剩余部分置于-20℃保存。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明利用本课题组前期开发的中国樱桃“短柄”品种休眠花芽组织的转录组信息寻找SSR位点，经13种中国樱桃品种或地方品种及7个野生中国樱桃共22个不同樱桃基因型筛选，得到9个具有多态性的通用型标记。

本发明筛选出9个SSR标记在22个中国樱桃种或品种中有多态性，在22个中国樱桃种或品种中进行的遗传多样性分析与樱桃属植物分类常识基本吻合，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的9个标记应用于更多中国樱桃甚至转移至欧洲甜樱桃上，进行种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种中。

(2)本发明的9个微卫星标记来自于中国樱桃种品种“短柄樱桃”的休眠花芽组织，这为研究这些标记所可能具有的功能奠定了良好的基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为标记CL4400、Unigene13394、Unigene13887在部分樱桃属材料中的PCR扩增产物电泳结果。其中M为DL500 DNA marker(TaKaRa，大连)，D为短柄樱桃、W为乌皮樱桃、4为高盆樱桃、10为迎春樱、11为浙闽樱、28为诸暨地方品种、36烟台2号、38为朱砂红、41为仙居地方品种1、42为仙居地方品种2、47为早红宝石1号、49为朱红1。

图2为ABI 3130基因分型结果。图2-a及图2-b表示以SSR特异性引物(即表1中的引物序列)为前30个循环的反应引物进行PCR扩增，然后分别以反向引物和经过5’-Hex或5’-Fam荧光标记的M13通用引物为后面8个循环的引物进行PCR扩增，扩增结束后对PCR产物进行基因分型得到的峰型图。显示标记CL4698(图2-a)和CL2632(图2-b)在临海地方品种1和龙泉地方品种1两种樱桃材料中的扩增结果，图中纵坐标分别表示Hex(图2-a)和Fam(图2-b)的荧光值，横坐标下面对应的“al”表示基因分型软件自动对片段大小读取整数的数值，“sz”数字表示PCR产物大小，“ar”表示PCR产物的荧光值的峰面积。

图3为基于9个微卫星标记构建的22份樱桃属植物Neighbour-joining聚类图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明9个由中国樱桃“短柄樱桃”转录组开发的SSR标记是通过下述方法得到的：

(1)利用本课题组前期开发的中国樱桃“短柄樱桃”休眠花芽的转录组序列(Genbank登录号：SRX695147)和MISA软件寻找SSR位点，每条SSR序列产生5条引物。使用软件BatchPrimer3设计引物，引物筛选条件如下：引物长度18-28bp，Tm值55-65℃，预期扩增产物长度80-300bp。随机挑选并合成160条引物，使用“短柄樱桃”对160条引物进行PCR扩增验证，选取条带清晰、大小吻合的引物用作后续分析。在设计好的正向引物的5’端统一加18bp的通用序列(M13-TGTAAAACGACGGCCAGT)，另外合成5'端使用Fam和Hex两种荧光基团修饰的M13引物(序列为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)。引物委托上海英潍捷基贸易有限公司合成；

(2)使用改良CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecy trimethylammonium bromide)法提取中国樱桃材料的基因组DNA(即后续具体做法中的DNA提取)；

(3)对所选SSR进行初步筛选：以短柄樱桃和乌皮樱桃2个中国樱桃材料基因组DNA为模板进行PCR扩增：在20μL反应体系中分别加入TaKaRa PremixTaq^TM 10μL、正向引物0.1μL，反向引物0.5μL，荧光修饰的M13引物0.4μL，10ng DNA模板。使用Eppendorf Mastercycler进行PCR扩增，具体步骤为：94℃预变性4min；94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环后，改变循环条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸40s，进行8个循环，最后72℃延伸6min。将5μL PCR产物与1μL 6×Loading buffer混匀后在含有0.5μg/μL EB的1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外灯下拍照记录结果。

(4)根据琼脂糖凝胶电泳所得条带的多少、片段大小、产物浓度，选择多态性丰富的9个标记在22个不同基因型中国樱桃上进行扩增，取1μL PCR产物将约100ng的PCR产物与12μL变性剂和0.25μL内参混匀，使用EppendorfMastercycler PCR仪在95℃下变性5min，取出立即放置冰上5min，然后放入ABI 3130遗传分析仪进行分析，使用Gene Mapper version 4.0统计数据，使用GenAlEx 6.501进行遗传多样性分析，利用Dendroscope 3绘制聚类树。

实施例1，

本发明中，用中国樱桃“短柄樱桃”转录组开发的SSR标记的具体做法是：

一、DNA提取

(1)配制DNA提取液：2％CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0；DNA溶解缓冲液(即TE缓冲液)：10mM Tris；1mM EDTA；PH＝8.0。

(2)对中国樱桃材料进行如下处理：

②取1g的新鲜叶片，在研钵放入少许PVP，加入液氮充分研磨；将研磨好的叶片转移至含提取液的离心管中，混匀后放入65℃水浴锅中水浴30min，每隔10min摇匀一次，使叶片细胞充分裂解；

③水浴结束后，取出离心管冷却至室温；加入等体积(4mL)预冷的氯仿/异戊醇混合溶液(V:V＝24:1)，充分混匀后使用离心机在10 000rpm下离心15min；

④用移液器小心吸取上清液，转移至新的10mL离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇(4mL)和1/10体积的3M的醋酸钠溶液(400μL，pH＝5.2)，轻轻颠倒混匀，静置10～15min至产生絮状沉淀，然后使用离心机在10 000rpm下离心10min；

⑤离心后弃上清液，将底部白色沉淀(DNA)小心取出，转入1.5mL离心管中，加入700μL 70％的乙醇洗涤两次。

⑦加入500μL TE溶液将烘干后的DNA重新溶解，完全溶解后加入1μLRNase，用移液器轻轻吸打DNA溶液，将其混匀后将离心管放入37℃保温箱中保温1h；

⑧取4μL DNA在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测其完整性。

二、微卫星分析：

1、PCR扩增

(1)20μL反应体系包含：

TaKaRa Premix Taq^TM 10μL、正向引物0.1μL，反向引物0.5μL，荧光修饰的M13引物0.4μL，10ng DNA模板(通过上述DNA提取方法提取的中国樱桃材料的DNA)和双蒸水。

(2)反应程序：

94℃预变性4min；94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环后，改变循环条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸40s，进行8个循环，最后72℃延伸6min。

2、电泳检测：

取上述扩增产物5μL，加入1μL 6×Loading buffer；在含有0.5μg/μL EB的1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下拍照记录结果。

3、SSR基因分型和Gene Mapper软件统计：

选取上述在不同中国樱桃材料中电泳条带粗细、明暗、片段长度变化不一的标记的PCR产物进行基因分型。

具体方法为：将约100ng的PCR产物与12μL变性剂和0.25μL内参混匀，使用Eppendorf Mastercycler PCR仪在95℃下变性5min，取出立即放置冰上5min，然后放入ABI 3130遗传分析仪进行分析，同时使用Gene Mapper软件读取片段长度。

三、遗传多样性分析

将Gene Mapper统计得到的标记长度数据按照标准格式输入GenAlEx6.501，计算22个樱桃材料的遗传多样性。

试验结果：本发明共发现9个引物对在22个不同樱桃基因型上表现多态性。引物序列具体见表1。

表1引物序列

图1为标记CL4400、Unigene13394、Unigene13887在部分樱桃属材料中的PCR扩增产物电泳结果。

参考图3，聚类树表明这9个标记能将22个不同基因型的樱桃植物材料分为I，II，III，IV和V共5组，其中I、II两组中的樱桃材料均为地方品种，短柄樱桃位于II组。III、IV和V三组中均有其他种聚在其中。高盆樱桃以较低的自检支持率与临海地方品种2、早红宝石2、中国樱桃2和朱红5聚在一起，初步推测这几种地方品种的形成可能有高盆樱桃的参与；IV组中仅有4种樱桃材料，其中包括山樱和中国樱桃品种“大鹰嘴”，山樱以较高的支持率与2个龙泉地方品种聚在一起，说明龙泉地方品种的特殊性，以及该地方品种的形成过程中山樱扮演了比较重要的角色。浙闽樱与乌皮樱桃、中国樱桃1、中国樱桃5及早红宝石1聚在一起形成V组，这种聚类结果暗示乌皮樱桃和地方品种早红宝石1存在部分浙闽樱的血缘。这种分类与樱桃经典的形态学分类并不吻合，但聚类结果清晰的划分出不同组别，呈现出一定亲缘关系，暗示种间杂交在地方品种形成过程中发挥着重要作用，也说明这9对引物可以用于樱桃地方品种种质资源遗传多样性分析和亲缘关系研究中。

需要特别说明的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江师范大学

<120> 用于检测樱桃SSR标记的引物

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aggacttgtt tggatttgga ttt 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttcttctcc ttccttttgc ttt 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accccataat ttacgacaat gtt 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcatcattt cgtcaaccaa tct 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttcaataatt gccttcttct cca 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaggaagcta cagatttctc gtg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catgagatgt gtttggtttt tga 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacgtaaacc ttgaagacga cct 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caaagacaaa gacaaagacg aca 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

attgagcatg ttctcatctc agg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

taaatctact gcagtgctcg ttg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcaaaagtaa attccctcac gaa 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cattgagatg caaactatct ggc 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aatggtggtg agagccttct act 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cttccctttg agtttagctt tcc 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aacaggacaa tctagtgaca cgg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agacaataat caaaagccac cct 23

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtagcagaac ttggtgttgg tg 22

Claims

1.用于检测樱桃SSR标记的引物，其特征在于，该检测引物共有9个引物对，其核苷酸序列如下：

CL2632-F和CL2632-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、2所示；

CL3793-F和CL3793-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示；

CL4400-F和CL4400-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5、6所示；

CL4698-F和CL4698-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17、18所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测樱桃SSR标记的引物在樱桃遗传多样性分析中的应用。

3.利用权利要求1所述的用于检测樱桃SSR标记的引物进行樱桃遗传多样性分析的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤Ⅰ，各樱桃材料的DNA提取；

步骤Ⅱ，微卫星分析：

（1）、PCR扩增：以步骤Ⅰ提取的DNA为模板进行PCR扩增；

A：20μL反应体系包含：TaKaRa Premix Taq™ 10 μL、正向引物0.1 μL，反向引物0.5 μL，荧光修饰的M13引物0.4 μL，10 ng DNA模板和双蒸水；

B：反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30个循环后，改变循环条件为94 ℃变性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，进行8个循环，最后72 ℃延伸 6 min；

（2）、电泳检测：

取上述扩增产物5 μL，加入 1μL 6× Loading buffer；在含有0.5μg/ μL 溴化乙锭（EB）的1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下拍照记录结果；

（3）、SSR基因分型和Gene Mapper软件统计：

选取上述在不同樱桃材料中电泳条带粗细、明暗、片段长度变化不一的标记1μL约100 ng的PCR产物与12 μL变性剂和0.25 μL内参混匀，使用Eppendorf Mastercycler PCR仪在95 °C下变性5min，取出立即放置冰上5 min，然后放入ABI 3130遗传分析仪进行分析，同时使用Gene Mapper软件读取片段长度；

步骤Ⅲ，遗传多样性分析：

将Gene Mapper统计得到的标记长度数据按照标准格式输入GenAlEx 6.501，计算樱桃材料间的遗传多样性，绘制聚类图。

4.根据权利要求3所述的樱桃遗传多样性分析的方法，其特征在于，在上述正向引物的5'端统一加18 bp的M13序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。

5.根据权利要求3所述的樱桃遗传多样性分析的方法，其特征在于，所述荧光修饰的M13引物为5’端分别使用Fam和Hex两种荧光基团修饰的M13引物，其中M13引物的序列为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。

6.根据权利要求4所述的樱桃遗传多样性分析的方法，其特征在于，所述樱桃材料为中国樱桃材料，来自如下：朱红1、临海地方品种1、朱砂红、山樱1、朱红2、朱红3、山樱2、早红宝石1、朱红4、浙闽樱、早红宝石2、临海地方品种2、诸暨地方品种、朱红5、仙居地方品种、中国樱桃1、中国樱桃2、中国樱桃3、中国樱桃4、大鹰嘴、中国樱桃5、高盆樱桃。

7.根据权利要求5所述的樱桃遗传多样性分析的方法，其特征在于，

所述步骤Ⅰ的DNA提取步骤为：

（1）配制DNA提取液：2% CTAB，0.1 M Tris，20 mM EDTA，1.4 M NaCl，pH 8.0；DNA溶解缓冲液：10 mM Tris；1 mM EDTA；PH=8.0；

（2）对中国樱桃材料进行如下处理：

①在10 mL离心管中加入4 mL的DNA提取液和80 μL β-巯基乙醇，放置在65 °C水浴中预热 10 min；

②取1 g中国樱桃材料的新鲜叶片，在研钵放入少许PVP，加入液氮充分研磨；将研磨好的叶片转移至含DNA提取液的离心管中，混匀后放入65 °C水浴锅中水浴30 min，每隔10 min摇匀一次，使叶片细胞充分裂解；

③水浴结束后，取出离心管冷却至室温；加入4 mL预冷的V : V = 24 : 1的氯仿/异戊醇混合溶液，充分混匀后使用离心机在10 000 rpm下离心15 min；

④用移液器小心吸取上清液，转移至新的10 mL离心管中，加入4mL的异丙醇和400μL的3M的醋酸钠溶液，轻轻颠倒混匀，静置10 - 15 min至产生絮状沉淀，然后使用离心机在10 000 rpm下离心10 min；

⑤离心后弃上清液，将底部白色沉淀即粗提DNA小心取出，转入1.5 mL离心管中，加入700 μL 70%的乙醇洗涤两次；

⑥离心后弃上清液，用移液器吸干剩余酒精，将白色沉淀物收集在侧管壁上，尽可能铺平打薄，放入37 °C保温箱中烘干；

⑦加入500 μL DNA溶解缓冲液将烘干后的DNA重新溶解，完全溶解后加入1 μL RNase，用移液器轻轻吸打DNA溶液，混匀后将离心管放入37 °C保温箱中保温1 h；

⑧取4 μL DNA在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测其完整性；

⑨吸取一部分DNA稀释至10 - 30 ng·μL^-1用于后续的PCR反应，剩余部分置于-20 °C保存。